TW202417609A - 藉由使用胺甲酸激酶來製造胍基乙酸（ｇａａ）的改良之生物技術方法 - Google Patents
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Abstract
本發明關於經轉形以能夠製造胍基乙酸(GAA)之微生物，其業經藉由使用胺甲酸激酶而改善；以及使用此微生物來發酵製造GAA之方法。本發明亦關於發酵製造肌酸之方法。
Description
胍基乙酸(GAA)是一種無色結晶有機化合物，其可用以作為動物飼料添加劑(例如WO 2005120246 A1及US 2011257075 A1)。GAA是肌酸的天然前體(例如Humm等人，Biochem.J.(1997)322, 771-776)。因此，增補GAA可使生物獲得最佳肌酸供應。
本發明關於經轉形以能夠製造胍基乙酸(GAA)之微生物以及使用此微生物來發酵製造GAA之方法。本發明亦關於發酵製造肌酸之方法。
在生物系統中，GAA及鳥胺酸係從精胺酸及甘胺酸作為起始原料、藉由L-精胺酸：甘胺酸-脒基轉移酶(AGAT; EC 2.1.4.1)的催化作用來形成。該反應也是肌酸生物合成的第一步。
Guthmiller等人(J Biol Chem. 1994 Jul 1;269(26)：17556-60)藉由在大腸桿菌(
E. coli)中選殖及異源性表現大鼠腎臟AGAT來特徵分析該酵素。Muenchhoff等人(FEBS Journal 277(2010)3844-3860)首次報導來自原核生物的AGAT的特徵分析，也是藉由在大腸桿菌中選殖及異源性表現該酵素。
Fan Wenchao揭示一種藉由諸如麩胺酸棒狀桿菌(
Corynebacterium glutamicum)之非病原微生物發酵來製造肌酸之方法(CN 106065411 A)。該微生物具有下列生物轉化(biotransformation)功能：葡萄糖轉化為L-麩胺酸；L-麩胺酸轉化為N-乙醯基-L-麩胺酸；N-乙醯基-L-麩胺酸轉化為N-乙醯基-L-麩胺酸半醛；N-乙醯基-L-麩胺酸半醛轉化為N-乙醯基-L-鳥胺酸；N-乙醯基-L-鳥胺酸轉化為L-鳥胺酸；L-鳥胺酸轉化為L-瓜胺酸；L-瓜胺酸轉化為精胺琥珀酸；精胺琥珀酸轉化為L-精胺酸；L-精胺酸轉化為胍基乙酸；以及最後，胍基乙酸轉化為肌酸。Fan Wenchao提出，該微生物過量表現一種或多種選自由下列所組成之群組之酵素：N-乙醯基麩胺酸合成酶、N-乙醯基鳥胺酸-δ-胺基轉移酶、N-乙醯基鳥胺酸酶、鳥胺酸-胺甲醯基轉移酶、精胺琥珀酸合成酶、甘胺酸脒基轉移酶(EC：2.1. 4.1)及胍基乙酸N-甲基轉移酶(EC：2.1.1.2)。較佳的是該微生物過量表現甘胺酸胺基轉移酶(L-精胺酸：甘胺酸脒基轉移酶)及胍基乙酸N-甲基轉移酶。
Zhang等人發表一種能夠製造胍基乙酸(GAA)之微生物(ACS Synth. Biol. 2020, 9, 2066-275)。他們藉由將來自不同物種(例如智人、(柱孢藻
Cylindrospermopsis raciborskii)、(莫氏藍綠菌(
Moorea producens))的異源性AGAT引入以及藉由瓜胺酸合成模組(例如
carAB、
argF及
argI的過度表現)及精胺酸合成模組(例如
argG、
argH的過度表現；
aspA的引入)引入至大腸桿菌中，設計重建大腸桿菌中的鳥胺酸循環。
Schneider及Jankowitsch(WO 2021122400 A1)提出一種使用微生物製造GAA之方法，該微生物具有編碼具有L-精胺酸：甘胺酸脒基轉移酶功能的蛋白質之基因，且胺甲醯磷酸酯合成酶(carbamolyphosphate synthase)增加。胺甲醯磷酸酯(carbamoyl phosphate)不僅是GAA、也是L-精胺酸及其他化合物的重要前驅物。
亦從文獻已知數種提高微生物(特別是細菌)GAA合成中的起始原料之一(即L-精胺酸)的製造之方法。Park等人提供用於L-精胺酸製造的麩胺酸棒狀桿菌(
C. glutamicum)的代謝工程之概述(NATURE COMMUNICATIONS | DOI：10.1038/ncomms5618)。Yim等人(J Ind Microbiol Biotechnol (2011)38：1911-1920)可顯示，藉由破壞麩胺酸棒狀桿菌的染色體
argR基因來去活化
argR(編碼控制L-精胺酸生物合成路徑的中心抑制蛋白ArgR之基因)，導致精胺酸製造菌株之改善。Ginesy等人(Microbial Cell Factories(2015) 14：29)報導成功工程化大腸桿菌以用於增強精胺酸製造。其中，他們提議刪除
argR抑制蛋白基因。
Wang等人(Applied Microbiology and Biotechnology, 2021, vol. 105, pp. 3265-3276;https://doi.org/10.1007/s00253-021-11242-w)強調，在棒狀桿菌屬(
Corynebacterium sp.)中，胺甲醯磷酸酯對於L-精胺酸的製造也是至關重要的。他們指出，其中，過量表現編碼胺甲醯磷酸酯合成酶的
carAB基因及引入編碼催化從無機氨、碳酸氫鹽及ATP合成胺甲醯磷酸酯的胺甲酸激酶(CK)之異源性基因(來自糞腸球菌(
Enterococcus faecalis))，可導致L-精胺酸製造的提高。使用胺甲酸激酶的優點在於此酵素利用無機銨作為氮源。相較於使用麩醯胺酸作為氮源的胺甲醯磷酸酯合成酶，胺甲酸激酶容許胺甲醯磷酸酯形成的總能量需求之減少。Yan等人(Fermentation 2022, vol. 8, no. 3, 7 March 2022, p. 116; doi：10.3390/fermentation8030116)揭示藉由引入異源性AGAT基因至枯草桿菌(
B. subtilis)中、最佳化AGAT基因的表現量、最佳化天然鳥胺酸循環、及剔除甘胺酸降解路徑的第一個基因(即甘胺酸去氫酶基因
gcvP)的枯草桿菌(
Bacillus subtilis)全細胞催化(whole-cell catalysis)之GAA生物合成。
Schneider及Jankowitsch(WO 2022008276 A1)提出使用重組微生物製造GAA，該重組微生物包含編碼L-精胺酸：甘胺酸脒基轉移酶(AGAT)的基因，以及為了增加起始原料之一、即甘胺酸的製造而包含經減少或經刪除的蘋果酸合成酶基因及視需要過度表現編碼乙醛酸胺基轉移酶的基因。他們亦揭示，胺甲酸激酶(CK)可能有助於精胺酸製造。
為了增加使用微生物的GAA之製造，細胞內高量的起始原料精胺酸及/或甘胺酸是必須的。同時，AGAT反應的副產物、即鳥胺酸，必須有效地回收成為精胺酸，以防止碳及能量的損失。
本發明所要解決的問題是提供經轉形以能夠製造胍基乙酸(GAA)之微生物，特別是具有經改善之能力以藉由有效回收鳥胺酸來提供L-精胺酸作為GAA生物合成起始原料之微生物，以及使用此微生物發酵製造GAA之方法。
該問題藉由一種微生物，其包含至少一個編碼具有L-精胺酸：甘胺酸脒基轉移酶(AGAT，例如EC2.1.4.1)功能的蛋白質之異源性基因，以及包含至少一個編碼具有胺甲酸激酶(CK，例如EC 2.7.2.2)功能的蛋白質之基因，且進一步包含至少一個編碼具有NADH依賴性胺基酸去氫酶功能的蛋白質之基因而解決。
異源性基因意指基因業經插入至天然未有此基因的宿主生物體中。在宿主中的異源性基因之插入是藉由重組DNA技術來進行。已經歷重組DNA技術之微生物被稱為基因轉殖微生物、經基因修飾之微生物、或重組體。異源性蛋白質意指不是天然存在於該微生物中之蛋白質。同源性或內源性基因意指該基因(包括其功能)或該基因的核苷酸序列係天然存在於該微生物中或係"原生(native)"於該微生物中。同源性或原生性蛋白質意指天然存在於該微生物中之蛋白質。
在根據本發明之微生物中，具有L-精胺酸：甘胺酸脒基轉移酶(AGAT)功能之蛋白質包含與根據SEQ ID NO：9的胺基酸序列至少80%相同之胺基酸序列。
在根據本發明之微生物中，該至少一個編碼具有胺甲酸激酶(CK，例如EC 2.7.2.2)功能的蛋白質之基因可為異源性。
在根據本發明之微生物中，相較於野生型微生物中的各個相應活性，該至少一個具有胺甲酸激酶功能的蛋白質之活性係增加的。
通常，微生物中的經增加之酵素活性可例如藉由對應的內源性基因之突變來達成。增加酵素活性的進一步措施可為穩定化編碼該等酵素之mRNA。微生物中的經增加之酵素活性亦可藉由過量表現編碼各個相應酵素之基因來達成。
根據本發明之微生物可包含至少一個編碼具有胺甲酸激酶功能的蛋白質之異源性基因。在本發明之微生物中，該至少一個具有胺甲酸激酶酵素活性的蛋白質可包含與根據SEQ ID NO：6的胺基酸序列至少80%相同之胺基酸序列。
基因的過度表現通常是藉由增加基因的拷貝數及/或藉由將基因與強啟動子功能性連接及/或藉由增強核糖體結合位點及/或藉由起始密碼子或整個基因的密碼子使用最佳化或包含選擇上述所有方法之組合來達成。
啟動子是由約40至50個鹼基對組成的DNA序列，且它構成RNA聚合酶全酵素的結合位點及轉錄起始點，從而可影響受控多核苷酸或基因的表現強度。通常，可藉由選擇強啟動子來實現細菌中基因的過度表現或增加基因的表現，例如藉由將強的原生啟動子(最初分配給其他基因)取代原始啟動子，或藉由將給定的原生啟動子的某些區域(例如所謂的-10及-35區域)修改為共通序列，例如M. Patek等人(Microbial Biotechnology 6(2013), 103-117)針對麩胺酸棒狀桿菌所教示者。“強”啟動子的實例是超氧化物歧化酶(
sod)啟動子(“Psod”; Z. Wang等人，Eng. Life Sci. 2015, 15, 73-82)。所謂"功能性連接(functional linkage)"係理解為意指啟動子與基因的順序排列，其導致基因的轉錄。
在本發明的一具體實施態樣中，該編碼具有胺甲酸激酶功能的蛋白質之基因係與強啟動子功能性連接。較佳的是，啟動子為超氧化物歧化酶(
sod)啟動子(“Psod”)。
在根據本發明之微生物中，該具有NADH依賴性胺基酸去氫酶功能的蛋白質可為異源性蛋白質。
NADH依賴性胺基酸去氫酶(AaDH)催化酮酸至L-胺基酸的胺化反應；NADH依賴性胺基酸去氫酶對細胞中的銨的同化或異化是重要的。
由於多數胺基酸去氫酶可使用不同的a-酮酸作為受質，因此它們常被標註以不同的EC編號。不過，所有這些胺基酸去氫酶有共同點，即它們同化銨，或者，在逆反應的情況中，能異化銨。
不同胺基酸去氫酶的實例如下：
反應EC 1.4.1.1：丙胺酸去氫酶：
丙酮酸+NH3+NADH+H+＜-＞L-丙胺酸+H2O+NAD+
反應EC 1.4.1.10：甘胺酸去氫酶：
乙醛酸+NH3+NADH+H+＜-＞甘胺酸+H2O+NAD+
反應EC 1.4.1.21：天冬胺酸去氫酶：
草醯乙酸+NH3+NADH+H+＜-＞L-天冬胺酸+H2O+NAD+
文獻中已知有幾種NADH依賴性胺基酸去氫酶(AaDH)蛋白質，它們能接受廣泛範圍受質，且可因此常將幾種不同的酮酸胺化為對應的胺基酸。(Fernandes等人，Protein Engineering, Design & Selection, 2015, vol. 28 no. 2, pp. 29-35; Giffin等人，Journal of Bacteriology , 2012, vol. 194 no. 5, pp. 1045-1054; Phogosee等人，Archives of Microbiology, 2018 vol. 200 pp. 719-727; Schuffenhauer等人，1999, vol.171, pp 417-423; Vancura等人，Eur J Biochem 1989, vol. 179, pp. 221 - 227; Yoshida及Freese, Biochim. Biophys. Acta, 1965, vol. 96, pp 248-262)
因此，反應與EC編號未存有明確的關聯。表1顯示一些實例：
在根據本發明之微生物中，該至少一個具有NADH依賴性胺基酸去氫酶功能的蛋白質可為選自由下列者所組成的群組：丙胺酸去氫酶(EC 1.4.1.1)、甘胺酸去氫酶(EC 1.4.1.10)及天冬胺酸去氫酶(EC 1.4.1.21)。
在本發明之微生物中，相較於野生型微生物中的各個相應活性，該至少一個NADH依賴性胺基酸去氫酶之活性可為增加的。
該至少一個具有NADH依賴性胺基酸去氫酶功能的蛋白質較佳的是異源性的。
包含在根據本發明之微生物中的該至少一個NADH依賴性胺基酸去氫酶可為選自由下列者所組成的群組：丙胺酸去氫酶(EC 1.4.1.1)、甘胺酸去氫酶(EC 1.4.1.10)及天冬胺酸去氫酶(EC 1.4.1.21)。
在本發明之微生物中，該具有NADH依賴性胺基酸去氫酶功能的蛋白質可包含與根據SEQ ID NO：13、根據SEQ ID NO：21、根據SEQ ID NO：22、根據SEQ ID NO：23或根據SEQ ID NO：24的胺基酸序列至少80%相同之胺基酸序列。
本發明之微生物可進一步包含至少一個編碼具有乙醛酸胺基轉移酶功能的蛋白質之基因。
數種乙醛酸胺基轉移酶係已知者，且對胺基供體的受質特異性各異(參見例如Kameya等人，FEBS Journal 277 (2010) 1876-1885; Liepman及Olsen, Plant Physiol. Vol. 131, 2003, 215-227; Sakuraba等人，JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 2004, p. 5513-5518; Takada及Noguchi, Biochem. J. (1985) 231, 157-163)。由於多數這些乙醛酸胺基轉移酶可使用不同胺基酸作為胺基供體，因此它們常被標註以不同的EC編號。然而，所有這些胺基轉移酶有共同點，即它們使用乙醛酸作為受體分子，或者，在逆反應的情況中，使用甘胺酸作為供體分子。具有乙醛酸胺基轉移酶功能的蛋白質之實例如下：
甘胺酸轉胺酶(EC 2.6.1.4)催化的反應：
L-麩胺酸+乙醛酸＜=＞α-酮戊二酸+甘胺酸。
甘胺酸：草醯乙酸轉胺酶(EC 2.6.1.35)催化的反應：
L-天冬胺酸+乙醛酸＜=＞草醯乙酸+甘胺酸。
丙胺酸：乙醛酸轉胺酶(EC 2.6.1.44)催化的反應：
L-丙胺酸+乙醛酸＜=＞丙酮酸+甘胺酸。
絲胺酸：乙醛酸轉胺酶(EC 2.6.1.45)催化的反應：
L-絲胺酸+乙醛酸＜=＞3-羥基-丙酮酸+甘胺酸。
甲硫胺酸：乙醛酸轉胺酶(EC 2.6.1.73)催化的反應：
L-甲硫胺酸+乙醛酸＜=＞4-(甲基氫硫基)-2-酮-丁酸+甘胺酸。
芳族胺基酸：乙醛酸轉胺酶(EC 2.6.1.60)催化的反應：
芳族胺基酸+醛酸＜=＞芳族酮酸+甘胺酸。
犬尿胺酸：乙醛酸轉胺酶(EC 2.6.1.63)催化的反應：
犬尿胺酸+乙醛酸＜=＞4-(2-胺基苯基)-2,4-二酮-丁酸+甘胺酸。
(S)-脲基-甘胺酸：乙醛酸轉胺酶(EC 2.6.1.112)催化的反應：
(S)-脲基-甘胺酸+乙醛酸＜=＞N-胺甲醯基-2-酮-甘胺酸+甘胺酸。
在本發明之一進一步實施態樣中，相較於野生型微生物中的各個相應酵素活性，該至少一個具有乙醛酸胺基轉移酶功能的蛋白質之酵素活性係增加的。
該至少一個具有乙醛酸胺基轉移酶功能的蛋白質較佳的是異源性的。
在本發明之一具體實施態樣中，該至少一個具有乙醛酸胺基轉移酶功能的蛋白質係甘胺酸：乙醛酸胺基轉移酶。
在本發明之微生物中，該具有乙醛酸胺基轉移酶酵素活性的蛋白質可包含與根據SEQ ID NO：16、根據SEQ ID NO：19或根據SEQ ID NO：20的胺基酸序列至少80%相同之胺基酸序列。
相較於野生型微生物之能力，根據本發明之微生物可具有經增加的從L-鳥胺酸製造L-精胺酸之能力。
在本發明之情境中，具有經增加的製造L-精胺酸之能力的微生物意指製造L-精胺酸超過其自身需要的微生物。此等製造L-精胺酸微生物之實例係例如麩胺酸棒狀桿菌ATCC 21831或Park等人(NATURE COMMUNICATIONS | DOI：10.1038/ncomms5618)或Ginesy等人(Microbial Cell Factories (2015) 14：29)所揭示者。與先前所描述的具有經增加的製造L-精胺酸的能力之微生物相比，在用於GAA製造的菌株中，L-精胺酸排泄是非必要的，因為在本發明之框架中，精胺酸在細胞中被利用於GAA製造。
在根據本發明之微生物之一進一步實施態樣中，相較於在野生型微生物中的
argR基因之表現，編碼精胺酸反應抑制蛋白ArgR的
argR基因之表現係經減弱的。或者，
argR基因係經刪除。
本發明之微生物可屬於棒狀桿菌屬(
Corynebacterium)、芽孢桿菌屬(
Bacillus)(Yan, K.等人，(2022)"Biosynthesis of Guanidinoacetate by Bacillus subtilis Whole-Cell Catalysis." Fermentation 8(3)：116)、腸桿菌屬(
Enterobacteriaceae)或假單胞菌屬(
Pseudomonas)。
在本發明之一具體實施態樣中，該微生物係麩胺酸棒狀桿菌(
C. glutamicum)或大腸桿菌(
E. coli)。
本發明進一步關於發酵製造胍基乙酸(GAA)之方法，其包含以下步驟：a) 在培養基中培養根據本發明之微生物；以及b) 在培養基中累積GAA以形成含有GAA之發酵液。
較佳的是，該方法進一步包含從該含有GAA之發酵液分離GAA。
在一具體實施態樣中，本發明之微生物進一步包含編碼具有胍基乙酸N-甲基轉移酶活性的酵素之基因。該編碼具有胍基乙酸N-甲基轉移酶活性的酵素之基因可被過度表現。
本發明亦關於發酵製造肌酸之方法，其包含以下步驟：a) 在適合的條件下，在適合的培養基中培養根據本發明之微生物，該微生物進一步包含編碼具有胍基乙酸N-甲基轉移酶活性的酵素之基因；b) 在培養基中累積肌酸以形成含有肌酸之發酵液。
較佳的是，該方法進一步包含從含有肌酸之發酵液中分離肌酸。肌酸可藉由等電點法及/或離子交換法從發酵液萃取。或者，肌酸可進一步藉由在水中再結晶之方法來純化。
A) 材料及方法 化學品來自康黴素鏈黴菌(
Streptomyces kanamyceticus)之康黴素溶液係購自Sigma Aldrich(St. Louis, USA, Cat. no. K0254)。若未另外提到，則所有其他化學品係購自Merck (Darmstadt, Germany)、Sigma Aldrich(St. Louis, USA)或Carl-Roth(Karlsruhe, Germany)的分析級純度者。
細胞增生之培養若未另外提到，則培養/培育程序係如下列者來進行：
a. LB培養液(MILLER)，來自Merck(Darmstadt, Germany；產品目錄編號110285)，係用於在液態培養基中培養大腸桿菌菌株。液體培養物(每100 ml的具有3個擋板的錐形瓶中含10 ml液態培養基)係於來自Infors GmbH (Bottmingen, Switzerland)的Infors HT Multitron標準培養箱振盪器中以30℃及200 rpm下來培育。
b. LB瓊脂(MILLER)，來自Merck(Darmstadt, Germany，產品目錄編號110283)，係用於在瓊脂平板上培養大腸桿菌菌株。瓊脂平板係於來自VWR(Radnor, USA)的INCU-Line®迷你培養箱中在30℃下培育。
c. 腦心浸出培養液(BHI)，來自Merck(Darmstadt, Germany，產品目錄編號110493)，係用於在液態培養基中培養麩胺酸棒狀桿菌菌株。液體培養物(每100 ml的具有3個擋板的錐形瓶中含10 ml液態培養基)係於來自Infors GmbH(Bottmingen, Switzerland)的Infors HT Multitron標準培養箱振盪器中以30℃及200 rpm下來培育。
d. 腦心瓊脂(BHI洋菜)，來自Merck(Darmstadt, Germany，產品目錄編號113825)，係用於在瓊脂平板上培養麩胺酸棒狀桿菌菌株。瓊脂平板在帶有Kelvitron®溫度控制器(Hanau, Germany)的Heraeus儀器中在30℃下培育。
e. 針對在電穿孔後培養麩胺酸棒狀桿菌，BHI瓊脂(Merck, Darmstadt, Germany，產品目錄編號113825)經增補以134 g/l的山梨糖醇(Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe, Germany)、2.5 g/l的酵母萃取物(Oxoid/ ThermoFisher Scientific, Waltham, USA，產品目錄編號LP0021)及25 mg/l的康黴素。瓊脂平板在帶有Kelvitron®溫度控制器(Hanau, Germany)的Heraeus儀器中在30℃下培育。
判定細菌懸浮液之光學密度a. 搖瓶培養物中細菌懸浮液的光學密度係使用來自Eppendorf AG(Hamburg, Germany)的Bio-Photometer在600 nm (OD600)下來判定。
b. 在Wouter Duetz(WDS)微型發酵系統(24孔平盤)中所製造的細菌懸浮液的光學密度係以來自Tecan Group AG (Männedorf, Switzerland)的GENios™讀盤儀在660 nm (OD660)下來判定。
離心a. 最大體積2 ml的細菌懸浮液係使用Eppendorf 5417 R實驗臺離心機(5 min，在13.000 rpm下)在1.5 ml或2 ml反應管(例如Eppendorf Tubes® 3810X)中來離心。
b. 最大體積50 ml的細菌懸浮液係使用Eppendorf 5810 R實驗臺離心機在15 ml或50 ml離心管(例如FalconTM 50 ml Conical Centrifuge Tubes)中在4.000 rpm下離心10 min。
DNA 分離來自大腸桿菌細胞的質體DNA，係根據製造商的使用說明，使用來自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep Kit (Hilden, Germany，產品目錄編號27106)來分離。
聚合酶連鎖反應 (PCR)使用具有校讀(高保真)聚合酶的PCR以擴增所欲DNA片段，以供定序或DNA組合選殖(DNA assembly cloning)。非校讀聚合酶套組係用於直接從大腸桿菌或麩胺酸棒狀桿菌菌落判定所欲DNA片段的存在與否。
a. 來自New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA，產品目錄編號M0530)的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase Kit (Phusion Kit)，根據製造商的使用說明，用於選定的DNA區域之模板正確擴增(template-correct amplification)(參見表2)。
b. 使用來自Qiagen(Hilden, Germany, Cat. No.201203) 的Taq PCR Core Kit (Taq Kit)擴增所欲DNA片段以確認其存在。該套組係根據製造商的使用說明來使用(參見表3)。
c. 根據製造商的使用說明，使用來自Takara Bio Inc (Takara Bio Europe S.A.S., Saint-Germain-en-Laye, France, Cat. No. RR350A/B)的SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Sapphire Mix)作為替代以確認從大腸桿菌或麩胺酸棒狀桿菌菌落取到的細胞中存在所欲DNA片段(參見表4)。
d. 所有寡核苷酸引子均由Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)合成。
e. 作為PCR模板，使用經適當稀釋的分離質體DNA之溶液或從液體培養物所分離的總DNA之溶液、抑或細菌菌落中所含有的總DNA溶液(菌落PCR)。針對菌落PCR，模板係藉由以無菌牙籤從瓊脂平板上的菌落取得細胞材料且將細胞材料直接置入PCR反應管中來製備。細胞材料係在來自SEVERIN Elektrogeräte GmbH(Sundern, Germany)的Mikrowave & Grill型微波爐中以800 W來加熱10 sec，並接著將PCR試劑加入在PCR反應管中的模板。
f. 所有PCR反應均在來自Eppendorf AG(Hamburg, Germany)的Mastercycler型或Mastercycler nexus gradient型的PCR循環儀中進行。
DNA 的限制酶消化限制酶消化係使用"FastDigest限制性核酸內切酶(FD)"(ThermoFisher Scientific, Waltham, USA)抑或來自New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA)限制性核酸內切酶。反應係根據製造商手冊的使用說明來進行。
判定 DNA 片段大小a. 小DNA片段(＜1000 bps)的大小係通常藉由使用來自Qiagen(Hilden, Germany)的QIAxcel的自動化毛細管電泳來判定。
b. 如果需要分離DNA片段或DNA片段係＞1000 bps，則DNA係藉由TAE瓊脂糖凝膠電泳來分離，並以GelRed® Nucleic Acid Gel Stain(Biotium, Inc., Fremont, Canada)來染色。經染色之DNA在302 nm下係可見。
PCR 擴增物及限制片段之純化PCR擴增物及限制片段係使用來自Qiagen的QIAquick PCR Purification Kit(Hilden, Germany；產品目錄編號28106)根據製造商的使用說明來淨化。DNA係以30 µl的10 mMTris*HCl(pH 8.5)來沖提。
判定 DNA 濃度DNA濃度係使用來自PEQLAB Biotechnologie GmbH、2015年後為VWR品牌(Erlangen, Germany)的NanoDrop Spectrophotometer ND-1000來測量。
組合選殖質體載體係使用購自New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA, Cat. No. E5520)的“NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit”來組裝。含有線性載體及至少一個DNA插入物的反應混合物係在50℃下培育60 min。每次轉形實驗使用0.5 µl的組合混合物。
大腸桿菌之化學轉形為了質體選殖，根據製造商操作方案，將化學性勝任細胞"NEB® Stable Competent
E. coli(High Efficiency) "(New England BioLabs Inc., Ipswich, USA，產品目錄編號C3040)轉形。成功轉形的細胞係在增補25 mg/l的康黴素的LB瓊脂上篩選。
麩胺酸棒狀桿菌之轉形如Ruan等人(2015)所述，以質體DNA轉形麩胺酸棒狀桿菌係使用"Gene Pulser Xcell"(Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Germany)經由電穿孔來進行。電穿孔係在1 mm電穿孔光析管(Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Germany)中於1.8 kV下進行，固定時間常數設定為5 ms。轉形細胞係在含有134 g/l的山梨糖醇、2.5 g/l的酵母萃取物及25 mg/l的康黴素的BHI瓊脂上篩選。
判定核苷酸序列DNA分子的核苷酸序列係由Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)採用Sanger等人的雙去氧鏈終止(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463-5467, 1977)進行循環定序來判定。來自Scientific & Educational Software(Denver, USA)的Clonemanager Professional 9軟體係用於序列的可視化及評估，以及用於序列的電腦模擬(
in silico)組裝。
大腸桿菌及麩胺酸棒狀桿菌菌株之甘油儲液為長期儲存大腸桿菌和麩胺酸棒狀桿菌菌株，製備甘油儲備液。選定的大腸桿菌選殖株在經增補2 g/l的葡萄糖的10 ml的LB培養基中培養。選定的麩胺酸棒狀桿菌選殖株在經增補2 g/l的葡萄糖的10 ml的二倍濃縮BHI培養基中培養。用於生長含有質體的大腸桿菌及麩胺酸棒狀桿菌菌株的培養基係經增補25 mg/l的康黴素。培養基裝在100 ml的具有3個擋板的錐形瓶中。接種一圈從菌落中取得的細胞。接著，在30℃及200 rpm下培育18 h。培育期後，向培養物加入1.2 ml的85%(v/v)無菌甘油。接著，將獲得的含甘油的細胞懸浮液按2 ml的份量等分並保存在-80℃下。
毫升級培養的 GAA 製造根據Duetz(2007)，使用毫升級培養系統以評估菌株的GAA製造。為此目的，使用來自EnzyScreen BV的24孔深孔微孔盤(24孔WDS盤)(Heemstede, Netherlands，產品目錄編號CR1424)，每孔填以2.5 ml的培養基。
菌株的預培養係在10 ml種菌培養基(seed medium)(SM)中進行。培養基裝在具有3個擋板的100 ml錐形瓶中。接種100 µl的甘油儲液培養物，且培養物係在30℃及200 rpm下培育24 h。種菌培養基(SM)的組成示於表5中。
培養期結束後，判定預培養物的光學密度OD600。從預培養物中取樣接種2.5 ml的製造用培養基(production medium)(PM)至OD600為0.1所需的體積，離心(8000 g下1 min)並棄去上清液。接著，將細胞重懸浮於100 µl的製造用培養基中。
將每100 µl來自預培養的經重懸浮之細胞接種到含有2.4 ml的製造用培養基(PM)的24孔WDS孔盤中，開始主培養。製造用培養基(PM)的組成示於表6中。
主培養物在來自Infors GmbH(Bottmingen, Switzerland)的Infors HT Multitron標準培養箱振盪器中在30℃及225 rpm下培育72 h，直至完全消耗葡萄糖。懸浮液中的葡萄糖濃度用來自LifeScan(Johnson & Johnson Medical GmbH, Neuss, Germany)的血糖儀OneTouch Vita®來分析。
培養後，將培養懸浮液轉移到深孔微孔板。將一部分培養懸浮液適當稀釋，以測量OD600。將另一部分培養物離心，且上清液中GAA的濃度分析如下說明。
B) 實施例 實施例 1 ：用於基因體刪除麩胺酸棒狀桿菌基因 argR 的質體 pK18mobsacB_DargR 之選殖為了提高細胞內L-精胺酸形成及從L-鳥胺酸回收L-精胺酸，欲刪除編碼控制L-精胺酸生物合成路徑的中心抑制蛋白ArgR之基因
argR。因此，構築質體pK18mobsacB_DargR如下。
使用限制性核酸內切酶
XbaI消化質體pK18mobsacB (Schäfer, 1994; Genbank登錄號FJ437239)，並使用"QIAquick Gel Extraction Kit"純化經線性化之載體DNA(5721 bps)。
為了構築插入物，二個DNA片段係以下列引子藉由高保真PCR(以ATCC13032的DNA為模板)來產生：
DargR_lf(SEQ ID NO：1),+DargR_lr(SEQ ID NO：2)
= 左同源臂(983 bps)
DargR_rf(SEQ ID NO：3),+DargR_rr(SEQ ID NO：4)
= 左同源臂(984 bps)
使用"QIAquick PCR Purification Kit"純化PCR產物。
使用"NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit"，將經線性化之質體及PCR產物組合。將組合產物轉形至"NEB Stable Competent E. coli(High Efficiency)"中，且細胞係生長在含有25 mg/l的康黴素的LB瓊脂上。適當的質體選殖係藉由限制性消化及DNA定序來鑑定。所得的質體命名為pK18mobsacB_DargR。
實施例 2 ： ATCC13032 中的基因 argR 之染色體刪除麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032(Kinoshita S, Udaka S, Shimono M., J. Gen. Appl. Microbiol. 1957; 3(3)：193-205)，為麩胺酸棒狀桿菌類型菌株/野生型，係在American Type Culture Collection(ATCC)或在DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH寄存編號DSM 20300商業上可獲得。
為了刪除
argR基因，質體pK18mobsacB_DargR係藉由電穿孔轉形至麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032中。在經增補134 g/l的山梨糖醇、2.5 g/l的酵母萃取物及25 mg/l的康黴素的BHI瓊脂上平板培養，篩選染色體嵌入(源自第一次重組事件)。將瓊脂平板在33℃下培育48 h。
將單個菌落轉移到新鮮的瓊脂平板(具有25 mg/l的康黴素)上，並在33℃下培育24 h。這些選殖株的液態培養物於裝在100 ml的具有3個擋板的錐形瓶的10 ml的BHI培養基中於33℃下培養24 h。為了分離出已經歷第二次重組事件的選殖株，從各液態培養物中取等分，經適當稀釋，且將100 µl平板培養在經增補10%蔗糖的BHI瓊脂上。將瓊脂平板在33℃下培育48 h。接著，檢驗在含有蔗糖的瓊脂平板上生長的菌落對康黴素的敏感性。為此，用牙籤從菌落移出細胞物質，並將其轉移到含有25 mg/l康黴素的BHI瓊脂上及含有10%蔗糖的BHI瓊脂上。將瓊脂平板在33℃下培育60 h。對康黴素敏感而對蔗糖具抗性的選殖株係藉由PCR及DNA定序來檢驗。所得的具有經刪除之
argR基因之菌株命名為ATCC13032_DargR。
實施例 3 ：用於將源自糞腸球菌 ATCC 29212 的胺甲酸激酶 (CK ， EC 2.7.2.2) 基因基因體嵌入至麩胺酸棒狀桿菌的質體 pK18mobsacB_CK 之選殖糞腸球菌ATCC 29212的編碼序列
arcC編碼胺甲酸激酶(Marina等人，Eur J Biochem. 1998 Apr 1;253(1)：280-91. doi：10.1046/j.1432-1327.1998.2530280.x; Genbank登錄號AJ223332, SEQ ID NO：5)。SEQ ID NO：6顯示來源胺基酸序列(Genbank登錄號CAA11271)。
使用軟體工具"Codon Optimization Tool"(Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, Iowa, USA)，編碼序列係針對麩胺酸棒狀桿菌的密碼子使用來最佳化。所得的經最佳化之編碼序列命名為CK。
有了經最佳化之編碼序列，設計用於麩胺酸棒狀桿菌基因體嵌入在基因NCgl0291與NCgl0292之間的DNA片段。它由以下元件組成：
BsaI限制位點、用於組合選殖到pK18mobsacB(Schäfer, 1994; Genbank登錄號FJ437239)的同源性序列、用於嵌入NCgl0291下游的左同源臂、來自麩胺酸棒狀桿菌的強sod啟動子、經最佳化之CK基因、BioBricks Terminator BBa_B1006、用於基因體嵌入的右同源臂、第二個用於組合選殖的同源性序列及
BsaI位點。所得的DNA序列命名為CK-insert(SEQ ID NO：7)。它是從Invitrogen/Geneart(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)訂購以供基因合成，且它提供作為具有安比西林抗性基因的選殖質體的一部分。
含有CK-insert的選殖質體係使用限制性核酸內切酶
BsaI來消化，且DNA係以"QIAquick PCR Purification Kit"來純化。
質體pK18mobsacB係使用限制性核酸內切酶
SmaI來消化，且DNA係以"QIAquick PCR Purification Kit"來純化。
將兩個經消化之質體的DNA連接，並使用“NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit”組合匹配的序列末端。將組合產物轉形至"NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)"中，且細胞係生長在含有25 mg/l的康黴素的LB瓊脂上。適當的質體選殖係藉由限制性消化及DNA定序來鑑定。所得的質體命名為pK18mobsacB_CK。
實施例 4 ：胺甲酸激酶基因 CK 嵌入至麩胺酸棒狀桿菌基因體為了將胺甲酸激酶基因CK基因體嵌入至麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032及ATCC13032_DargR中，菌株係使用電穿孔由質體pK18mobsacB_CK來轉形。在經增補134 g/l的山梨糖醇、2.5 g/l的酵母萃取物及25 mg/l的康黴素的BHI瓊脂上平板培養來篩選染色體嵌入(源自第一次重組事件)。將瓊脂平板在33℃下培育48 h。
將單個菌落轉移到新鮮的瓊脂平板(具有25 mg/l的康黴素)上，並在33℃下培育24 h。這些選殖株的液態培養物於裝在100 ml的具有3個擋板的錐形瓶的10 ml的BHI培養基中於33℃下培養24 h。為了分離出已經歷第二次重組事件的選殖株，從各液態培養物中取等分，經適當稀釋，且將100 µl平板培養在經增補10%蔗糖的BHI瓊脂上。將瓊脂平板在33℃下培育48 h。接著，檢驗在含有蔗糖的瓊脂平板上生長的菌落對康黴素的敏感性。為此，用牙籤從菌落移出細胞物質，並將其轉移到含有25 mg/l康黴素的BHI瓊脂上及含有10%蔗糖的BHI瓊脂上。將瓊脂平板在33℃下培育60 h。對康黴素敏感而對蔗糖具抗性的選殖株係藉由PCR及DNA定序來檢驗CK基因的適當嵌入。得到的菌株分別命名為ATCC13032_CK及ATCC13032_DargR_CK。
實施例 5 ：選殖編碼源自莫氏藍綠菌的 L- 精胺酸：甘胺酸脒基轉移酶 (AGAT ， EC 2.1.4.1) 的基因 AGAT-Mp
莫氏藍綠菌係絲狀藍綠菌。莫氏藍綠菌菌株PAL-8-15-08-1之基因體係由Leao等人發表(Leao T, Castelão G, Korobeynikov A, Monroe EA, Podell S, Glukhov E, Allen EE, Gerwick WH, Gerwick L, Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Mar 21;114(12)：3198-3203. doi：10.1073/pnas. 1618556114; Genbank登錄號CP017599.1)。它含有開讀框，其編碼L-精胺酸：甘胺酸脒基轉移酶(AGAT，EC 2.1.4.1; locus_tag BJP34_00300顯示於SEQ ID NO：8中)。SEQ ID NO：9顯示來源胺基酸序列(Genbank登錄號WP_070390602)。
使用軟體工具"Optimizer"(http://genomes.urv.es/ OPTIMIZER/)，胺基酸序列係轉譯回成DNA序列，其針對麩胺酸棒狀桿菌的密碼子使用來最佳化。經最佳化的基因的5'-端擴展了
BsaI限制位點、用於組合選殖的5'-UTR序列及核糖體結合位點。在3'-端，加入第二個終止密碼子、用於組合選殖的序列及
BsaI位點。所得的DNA序列命名為AGAT-Mp-insert(SEQ ID NO：10)。它是從Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)訂購以供基因合成，且它提供作為具有安比西林抗性基因的選殖質體的一部分。
含有AGAT-Mp-insert的選殖質體係使用限制性核酸內切酶
BsaI來消化，且DNA係以"QIAquick PCR Purification Kit"來純化。
大腸桿菌-麩胺酸棒狀桿菌穿梭質體pLIB_P由來自pBL1複製起點(用於麩胺酸棒狀桿菌)、pSC101複製起點(用於大腸桿菌)及康黴素抗性基因組成。在獨特
NotI限制位點之後，它有強啟動子、二個反向的
BsaI位點及BioBricks Terminator BBa_B1006(SEQ ID NO：11)。
pLIB_P係使用限制性核酸內切酶
BsaI來消化，且DNA係以"QIAquick PCR Purification Kit"來純化。
將兩個經
BsaI消化之質體的DNA溶液結合，並使用“NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit”組合匹配的序列末端。將產物轉形至"NEB Stable Competent
E. coli(High Efficiency)"中，且細胞係生長在含有25 mg/l的康黴素的LB瓊脂上。適當的質體選殖係藉由限制性消化及DNA定序來鑑定。所得的質體命名為pLIB_P_AGAT-Mp。
實施例 6 ：合成編碼源自結核分枝桿菌 H37Ra 的 NADH 依賴性 AaDH 之基因 AaDH-Mt結核分枝桿菌H37Ra的開讀框MRA_2804推測為編碼NADH依賴性胺基酸去氫酶(Genbank登錄號CP000611 locus_tag="MRA_2804"，SEQ ID NO：12)。SEQ ID NO：13顯示來源胺基酸序列。
使用軟體工具"Codon Optimization Tool"(Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, Iowa, USA)，開讀框係針對麩胺酸棒狀桿菌的密碼子使用來最佳化。所得的序列擴展了5'-UTR，其由
BsaI限制位點、用於組合選殖的同源區域、強Pg3N3啟動子及核糖體結合位點組成。此外，3'端擴展了隨機間隔子序列、用於組合選殖的同源區域及
BsaI限制位點。所得的DNA序列命名為AaDH-Mt-insert(SEQ ID NO：14)。它是從Invitrogen/Geneart (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)訂購以供基因合成，且它提供作為具有安比西林抗性基因的選殖質體的一部分。經最佳化之基因命名為AaDH-Mt。
實施例 7 ：編碼源自阿拉伯芥的乙醛酸胺基轉移酶的基因 AtGGT1 之合成阿拉伯芥的GGT1基因(Genbank登錄號NM_102180，SEQ ID NO：15)編碼麩胺酸：乙醛酸胺基轉移酶(Genbank登錄號NP_564192，SEQ ID NO：16)。該蛋白質業經顯示催化以下反應：乙醛酸+L-丙胺酸=甘胺酸+丙酮酸(EC 2.6.1.44)、2-側氧基戊二酸+L-丙胺酸=L-麩胺酸+丙酮酸(EC 2.6.1.2)、及2-側氧基戊二酸+甘胺酸=乙醛酸+L-麩胺酸(EC 2.6.1.4; Liepman AH, Olsen LJ., Plant Physiol. 2003 Jan;131(1)：215-27. doi：10.1104/pp.011460)。
使用軟體工具"Codon Optimization Tool"(Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, Iowa, USA)，GGT1蛋白質的胺基酸序列係轉譯回成DNA序列，其針對麩胺酸棒狀桿菌的密碼子使用來最佳化。所得的序列擴展了5'-UTR，其由BsaI限制位點、用於組合選殖的同源區域及核糖體結合位點組成。此外，3'-端擴展了用於組合選殖的同源區域及BsaI限制位點。所得的DNA序列命名為AtGGT1-insert(SEQ ID NO：17)。它是從Invitrogen/Geneart (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)訂購以供基因合成，且它提供作為具有安比西林抗性基因的選殖質體的一部分。經最佳化之基因命名為AtGGT1。
實施例 8 ：用於共同表現 AGAT-Mp 及 AaDH-Mt 的質體之選殖為了合併表現AGAT-Mp及AaDH-Mt，將合成基因AaDH-Mt經選殖至質體pLIB_P_AGAT-Mp中。
質體pLIB_P_AGAT-Mp係使用限制性核酸內切酶
NotI來消化，且DNA以"QIAquick PCR Purification Kit"來純化。含有合成序列AaDH-Mt-insert(SEQ ID NO：14)的質體係使用限制性核酸內切酶
BsaI來消化，且所得的DNA係以"QIAquick PCR Purification Kit"來純化。
設計假擬DNA，其具有用於組合選殖的相容末端。它命名為dummy-insert(SEQ ID NO：18)，且它是從Invitrogen /Geneart(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)訂購以供基因合成，為線性雙股DNA片段。
使用“NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit”，將經
NotI消化的pLIB_P_AGAT-Mp的DNA與經
BsaI消化的含有AaDH-Mt-insert及dummy-insert的質體連接。將產物轉形至"NEB Stable Competent E. coli(High Efficiency)"(New England Biolabs, Ipswich, USA)中，且細胞係生長在含有25 mg/l的康黴素的LB瓊脂上。適當的質體選殖係藉由限制性消化及DNA定序來鑑定。所得的質體命名為pLIB_AaDH-Mt_AGAT-Mp。
實施例 9 ：用於共同表現 AGAT-Mp 、 AaDH-Mt 及 AtGGT1 的質體之選殖為了合併表現AGAT-Mp、AaDH-Mt及AtGGT1，將合成基因AaDH-Mt及AtGGT1經選殖至質體pLIB_P_AGAT-Mp中。
質體pLIB_P_AGAT-Mp係使用限制性核酸內切酶
NotI來消化，且DNA以"QIAquick PCR Purification Kit"來純化。含有合成序列AaDH-Mt-insert(SEQ ID NO：14)的質體使用限制性核酸內切酶
BsaI消化，且所得的DNA以"QIAquick PCR Purification Kit"來純化。含有合成序列AtGGT1-insert(SEQ ID NO：17)的質體係使用限制性核酸內切酶
BsaI來消化，且所得的DNA係以"QIAquick PCR Purification Kit"來純化。
使用“NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit”，將經
NotI消化的pLIB_P_AGAT-Mp的DNA與經
BsaI消化的含有AaDH-Mt-insert的質體以及與經
BsaI消化的含有AtGGT1-insert的質體連接。將產物轉形至"NEB Stable Competent E. coli(High Efficiency)"中，且細胞係生長在含有25 mg/l的康黴素的LB瓊脂上。適當的質體選殖係藉由限制性消化及DNA定序來鑑定。所得的質體命名為pLIB_AaDH-Mt_AtGGT1_AGAT-Mp。
實施例 10 ：用於共同表現 AGAT-Mp 及 AtGGT1 的質體之選殖為了合併表現AGAT-Mp及AtGGT1，將基因AaDH-Mt從質體pLIB_AaDH-Mt_AtGGT1_AGAT-Mp刪除。
質體pLIB_AaDH-Mt_AtGGT1_AGAT-Mp係使用限制性核酸內切酶
SacI及
SalI來消化，且DNA係以"QIAquick PCR Purification Kit"來純化。線性DNA末端係使用Fast DNA End Repair Kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)來鈍化，並純化DNA。使用Rapid Ligation Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)將DNA予以自連接。將經連接之產物轉形至"NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)"中，且細胞係生長在含有25 mg/l的康黴素的LB瓊脂上。適當的質體選殖以限制性消化來鑑定，且所得的質體命名為pLIB_AtGGT1_AGAT-Mp。
實施例 11 ：以各種質體轉形麩胺酸棒狀桿菌下列麩胺酸棒狀桿菌的菌株係藉由電穿孔以各種質體來轉形(表8)。含有質體的細胞係以25 mg/l的康黴素來篩選。
• 麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032：常使用的野生型菌株(Kinoshita等人，J. Gen. Appl. Microbiol. 1957; 3(3)：193-205)
• 麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032_DargR：麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體刪除
argR• 麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032_CK：麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體插入CK基因在NCgl0291與NCgl0292之間
• 麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032_DargR_CK：麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體刪除
argR及染色體插入CK基因在NCgl0291與NCgl0292之間
實施例 12 ： L- 精胺酸：甘胺酸脒基轉移酶基因對 GAA 製造的影響為了評估L-精胺酸：甘胺酸脒基轉移酶基因(AGAT-Mp)對GAA製造的影響，菌株ATCC13032/pLIB_P及ATCC13032/pLIB_P_AGAT-Mp係在製造用培養基中於Wouter Duetz系統來培養，且所得的GAA滴定量係如上所述來判定。
相較於缺少L-精胺酸：甘胺酸脒基轉移酶基因的菌株，培養具有L-精胺酸：甘胺酸脒基轉移酶基因的菌株導致GAA製造(參見表9)。結論是，異源性L-精胺酸：甘胺酸脒基轉移酶基因的存在能製造GAA。
實施例 13 ：胺甲酸激酶基因對 GAA 製造的影響為了評估胺甲酸激酶基因對GAA製造的影響，菌株ATCC13032/pLIB_P_AGAT-Mp及ATCC13032_CK/pLIB_P_ AGAT-Mp係在製造用培養基中於Wouter Duetz系統來培養，且所得的GAA滴定量係如上所述來判定。
相較於缺少胺甲酸激酶基因的菌株，培養具有胺甲酸激酶基因的菌株導致較高的GAA滴定量(參見表10)。結論是，胺甲酸激酶基因的存在改善GAA的製造。
實施例 14 ：胺甲酸激酶基因及乙醛酸胺基轉移酶基因合併存在對 GAA 製造的影響為了評估胺甲酸激酶基因(CK)及乙醛酸胺基轉移酶基因(AtGGT1)合併存在對GAA製造的影響，菌株ATCC13032_CK/pLIB_P_AGAT-Mp及ATCC13032_CK/ pLIB_AtGGT1_AGAT-Mp係在製造用培養基中於Wouter Duetz系統來培養，且所得的GAA滴定量係如上所述來判定。
相較於缺少乙醛酸胺基轉移酶基因的菌株，培養具有胺甲酸激酶基因及乙醛酸胺基轉移酶基因的菌株導致較高的GAA滴定量(參見表11)。結論是，胺甲酸激酶基因及乙醛酸胺基轉移酶基因合併存在改善GAA之製造。
實施例 15 ：胺甲酸激酶基因及 NADH 依賴性胺基酸去氫酶基因合併存在對 GAA 製造的影響為了評估胺甲酸激酶基因(CK)和NADH依賴性胺基酸去氫酶基因(AaDH-Mt)合併存在對GAA製造的影響，菌株ATCC13032_CK/pLIB_P_AGAT-Mp及ATCC13032_CK/ pLIB _AaDH-Mt_AGAT-Mp係在製造用培養基中於Wouter Duetz系統來培養，且所得的GAA滴定量係如上所述來判定。
相較於缺少NADH依賴性胺基酸去氫酶基因的菌株，培養具有胺甲酸激酶基因及NADH依賴性胺基酸去氫酶基因的菌株導致較高的GAA滴定量(參見表12)。結論是，胺甲酸激酶基因及NADH依賴性胺基酸去氫酶基因合併存在改善GAA之製造。
實施例 16 ：胺甲酸激酶基因、 NADH 依賴性胺基酸去氫酶基因及乙醛酸胺基轉移酶基因合併存在對 GAA 製造的影響為了評估胺甲酸激酶基因(CK)、乙醛酸胺基轉移酶基因(AtGGT1)及NADH依賴性胺基酸去氫酶基因(AaDH-Mt)合併存在對GAA製造的影響，菌株ATCC13032_CK/ pLIB_AtGGT1_AGAT-Mp、ATCC13032_CK/pLIB_AaDH-Mt_AGAT-Mp及ATCC13032_CK/pLIB_AaDH-Mt_AtGGT1 _AGAT-Mp係在製造用培養基中於Wouter Duetz系統來培養，且所得的GAA滴定量係如上所述來判定。
相較於缺少NADH依賴性胺基酸去氫酶基因抑或乙醛酸胺基轉移酶基因的菌株，培養具有胺甲酸激酶基因、NADH依賴性胺基酸去氫酶基因及乙醛酸胺基轉移酶基因組合的菌株導致較高的GAA滴定量(參見表13)。結論是，胺甲酸激酶基因、NADH依賴性胺基酸去氫酶基因及乙醛酸胺基轉移酶基因合併存在改善GAA之製造。
實施例 17 ： argR 基因的刪除併以胺甲酸激酶基因、 NADH 依賴性胺基酸去氫酶基因及乙醛酸胺基轉移酶基因的存在對 GAA 製造的影響為了評估
argR基因的刪除(DargR)併以胺甲酸激酶基因(CK)、乙醛酸胺基轉移酶基因(AtGGT1)及NADH依賴性胺基酸去氫酶基因(AaDH-Mt)的存在對GAA製造的影響，菌株ATCC13032/pLIB_AaDH-Mt_AtGGT1_AGAT-Mp、ATCC13032_DargR/pLIB_AaDH-Mt_AtGGT1_AGAT-Mp及ATCC13032_DargR_CK/pLIB_AaDH-Mt_AtGGT1_AGAT-Mp係在製造用培養基中於Wouter Duetz系統來培養，且所得的GAA滴定量係如上所述來判定。
相較於具有野生型
argR基因的菌株，培養具有經刪除之
argR基因併以乙醛酸胺基轉移酶基因及NADH依賴性胺基酸去氫酶基因的存在的菌株導致較高的GAA滴定量(參見表14)。
相較於兩者缺少胺甲酸激酶基因的菌株，培養具有經刪除之
argR基因併以胺甲酸激酶基因、乙醛酸胺基轉移酶基因及NADH依賴性胺基酸去氫酶基因的存在的菌株導致較高的GAA滴定量(參見表14)。
結論是，
argR基因的刪除併以胺甲酸激酶基因、乙醛酸胺基轉移酶基因及NADH依賴性胺基酸去氫酶基因的存在改善GAA之製造。
TW202417609A_112120264_SEQL.xml
Claims (15)
- 一種微生物，其包含至少一個編碼具有L-精胺酸：甘胺酸脒基轉移酶功能的蛋白質之異源性基因，以及包含至少一個編碼具有胺甲酸激酶功能的蛋白質之基因，且進一步包含至少一個編碼具有NADH依賴性胺基酸去氫酶功能的蛋白質之基因。
- 如請求項1之微生物，其中，相較於野生型微生物中的各個相應活性，該至少一個具有胺甲酸激酶功能的蛋白質之活性係增加的。
- 如請求項1或請求項2之微生物，其包含至少一個編碼具有胺甲酸激酶功能的蛋白質之異源性基因。
- 如請求項1之微生物，其中，相較於野生型微生物中的各個相應活性，該具有NADH依賴性胺基酸去氫酶功能的蛋白質之活性係增加的。
- 如前述請求項中任一項之微生物，其中該具有NADH依賴性胺基酸去氫酶功能的蛋白質係異源性蛋白質。
- 如前述請求項中任一項之微生物，其進一步包含至少一個編碼具有乙醛酸胺基轉移酶功能的蛋白質之基因。
- 如前述請求項中任一項之微生物，其中，相較於野生型微生物之能力，該微生物具有經增加的從L-鳥胺酸製造L-精胺酸之能力。
- 如請求項7之微生物，其中，相較於在野生型微生物中的 argR基因之表現，編碼精胺酸反應抑制蛋白ArgR的 argR基因之表現係經減弱的，或其中該 argR基因係經刪除。
- 如前述請求項中任一項之微生物，其中該微生物屬於棒狀桿菌( Corynebacterium)屬、芽孢桿菌( Bacillus)屬、腸桿菌( Enterobacteriaceae)屬或假單胞菌( Pseudomonas)屬。
- 一種發酵製造胍基乙酸(GAA)之方法，其包含以下步驟：a) 在培養基中培養如前述請求項中任一項所定義之微生物；以及b) 在該培養基中累積GAA以形成含有GAA之發酵液。
- 如請求項10之方法，其進一步包含從該含有GAA之發酵液分離GAA。
- 如請求項1至9中任一項之微生物，其進一步包含編碼具有胍基乙酸N-甲基轉移酶活性的酵素之基因。
- 如請求項12之微生物，其中該編碼具有胍基乙酸N-甲基轉移酶活性的酵素之基因係過度表現。
- 一種發酵製造肌酸之方法，其包含以下步驟：a) 培養如請求項12或13中任一項所定義之微生物；以及b) 在培養基中累積肌酸以形成含有肌酸之發酵液。
- 如請求項14之方法，其進一步包含從該含有肌酸之發酵液分離肌酸。
Applications Claiming Priority (1)
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| EP22177256.9 | 2022-06-03 |
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| TW202417609A true TW202417609A (zh) | 2024-05-01 |
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