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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren für die mikrobielle Herstellung
von Substanzen, insbesondere aromatische Aminosäuren, nach den Ansprüchen 1–23, 36
und 37, Genstrukturen nach den Ansprüchen 24–29 und transformierte Zellen
nach den Ansprüchen
30–35.
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Mikrobiell
hergestellte Substanzen, wie Feinchemikalien, insbesondere aromatische
Aminosäuren, sind
von großem
wirtschaftlichen Interesse, wobei der Bedarf von, zum Beispiel Aminosäuren, ständig ansteigt.
So wird L-Phenylalanin zum Beispiel für die Herstellung von Medikamenten
verwendet und insbesondere auch in der Herstellung des Süßstoffs
Aspartam (α-L-Aspartyl-L-Phenylalaninmethylester).
L-Tryptophan wird als ein Medikament und als ein Zusatzstoff für Tierfutter
benötigt; ähnlich besteht
ein Bedarf an L-Tyrosin als ein Medikament und auch als ein Rohmaterial
in der pharmazeutischen Industrie. Zusätzlich zu der Isolierung aus
natürlichen
Materialien ist die biotechnologische Herstellung ein sehr wichtiges
Verfahren zum Erhalten von Aminosäuren in der gewünschten
optisch aktiven Form unter ökonomisch
zu rechtfertigenden Bedingungen. Die biotechnologische Herstellung
wird entweder unter Verwendung von Enzymen oder unter Verwendung
von Mikroorganismen durchgeführt.
Die zuletzt genannte mikrobielle Herstellung erfreut sich des Vorteils, dass
einfache und billige Rohmaterialien verwendet werden können. Weil
die Biosynthese von Aminosäuren in
der Zelle jedoch in einer großen
Vielzahl von Wegen kontrolliert wird, wurde bereits eine große Anzahl
von Versuchen unternommen, um die Erzeugnisbildung zu steigern.
So wurden zum Beispiel Aminosäureanaloga verwendet,
um die Regulation der Biosynthese abzuschalten. Es wurden zum Beispiel
Mutanten von Escherichia coli, die eine gesteigerte Herstellung
von L-Phenylalanin
erlauben, durch Selektieren auf Resistenz gegenüber Phenylalaninanaloga (GB-2,053,906)
erhalten. Eine ähnliche
Strategie führte
auch zu überexprimierenden
Stämmen
von Corynebacterium (JP-19037/1976 und JP-39517/1978) und Bacillus (EP-0,138,526). Darüber hinaus
sind Mikroorganismen bekannt, die unter Verwendung von rekombinanten
DNA-Techniken konstruiert wurden, in denen die Regulation der Biosynthese
ebenso aufgehoben wurde, wobei die Gene, die Schlüsselenzyme
kodieren, die nicht länger
der Feedback Inhibierung unterworfen sind, kloniert und exprimiert wurden.
Als ein Prototyp beschreibt die EP-0,077,196 ein Verfahren zur Herstellung
von aromatischen Aminosäuren,
in dem eine 3-Desoxy-D-arabinoseheptulosonat-7-phosphatsynthase (DAHP Synthase), die
nicht länger
der Feedback Inhibierung unterworfen ist, in E. coli überexprimiert
wird. Die EP-0,145,156 beschreibt einen E. coli Stamm, in dem Chorismatmutase/Prephenatdehydratase
zusätzlich
zum Zweck der Herstellung von L-Phenylalanin überexprimiert werden.
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Ein
gemeinsames Merkmal der oben genannten Strategien ist, dass das
Eingreifen zur Verbesserung der Herstellung auf den Biosyntheseweg
beschränkt
ist, der spezifisch für
aromatische Aminosäuren
ist. Um jedoch die Herstellung noch weiter zu steigern, müssen Anstrengungen
unternommen werden, um das Bereitstellen der primären Metaboliten,
Phosphoenolpyruvat (PEP) und Erythrose 4-Phosphat (Ery4P) zu verbessern,
die für
die Herstellung von aromatischen Aminosäuren benötigt werden.
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PEP
ist ein aktivierter Vorläufer
des Glykolyseerzeugnisses Pyruvat; Ery4P ist ein Zwischenprodukt
im Pentosephosphatweg.
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Es
wurden verschiedene Versuche unternommen, um eine spezifische Verbesserung
in der Bereitstellung des primären
Metaboliten Ery4P zu erreichen. Es wurde ein gesteigerter Fluss
von Kohlenstoff durch den Pentosephosphatweg in E. coli durch Ausschalten
des Enzyms Phosphoglucoseisomerase erreicht; dies führte dazu,
dass Tryptophan gebildet wurde (Mascarenhas D. et al., Appl. Environ.
Microbiol. 57 (1991) 2995–99). Die
US-A-5,168,056 offenbart, dass die Überexpression einer Transketolase,
die durch rekombinante DNA Techniken erreicht wurde, es möglich macht,
eine gesteigerte Bereitstellung von Ery4P und, als eine Folge, eine
Verbesserung in der Bildung von L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin
als Erzeugnisse zu erhalten. Sowohl Draths K.M. et al. (J. Am. Chem.
Soc. 114 (1992) 3956–62)
als auch Flores N. et al. (Nat. Biotechnol. 14 (1996) 6203) zeigten
dieselbe Wirkung. Wie jedoch Feldmann gezeigt hat, führt das
einfache Steigern der Aktivität
von Transketolase in Zymomonas mobilis Stämmen, denen Transaldolase Aktivität fehlt,
zu der Anreicherung von Metaboliten des Pentosephosphatwegs in den
Zellen und, als eine Folge, zu negativen Wirkungen auf das Zellwachstum
(Feldmann S.D. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 (1992) 354–61 ). Diese physiologische
Wirkung kann möglicherweise
einer übermäßigen intrazellulären Konzentration
an Sedoheptulose-7-Phosphat zugeschrieben werden. Die Erfinder haben
auch eine entsprechende Inhibierung von Biomassenwachstum als eine
Folge von Transketolase Überexpression
im Fall von E. coli tal+ Stämmen gefunden.
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Die
Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, ein alternatives Verfahren
zur Herstellung von Substanzen, insbesondere aromatischen Aminosäuren bereitzustellen,
wobei das Verfahren sich durch ein gesteigertes Bereitstellen in
intrazellulären
metabolischen Zwischenprodukten für die Synthese dieser Substanzen
unterscheidet, ohne an den oben beschriebenen Nachteilen der Verfahren
zu leiden, wobei die Nachteile die Folge nur der Steigerung der
Aktivität
der Transketolase sind.
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Überraschenderweise
wird dieses Ziel erfindungsgemäß durch
das Bereitstellen eines Verfahrens für die mikrobielle Herstellung
von Substanzen erreicht, wobei in dem Verfahren die Aktivität einer
Transaldolase in einem die Substanzen erzeugenden Mikroorganismus
erhöht
ist, wobei die Aktivität
eines Phosphoenolpyruvat (PEP)-abhängigen Zucker-Aufnahme-Systems
in diesem Mikroorganismus anwesend, reduziert oder abwesend ist.
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Dieses
Ergebnis ist insbesondere dahingehend überraschend, dass es in keiner
Weise selbstverständlich
ist, dass Transaldolasen eine wichtige Rolle im Wachstum von Mikroorganismen
und in der Herstellung von Substanzen spielen. Dies trifft insbesondere
auf den Fall des Wachstums auf Hexosen zu. So sind zum Beispiel
Hefestämme
bekannt, die immer noch in der Lage sind, auf Glucose zu wachsen,
obwohl sie eine Mutation in dem Transaldolasegen aufweisen (Schaaff
L. et al., Eur. J. Biochem. 188 (1990) 597–603). Demzufolge sollte eine
Transaldolase keinen wesentlichen Einfluss auf Zellwachstum ausüben. Dies
wird unterstützt
durch die Tatsache, dass auch bakterielle Spezies bekannt sind,
die in der Lage sind, in der Abwesenheit einer Transaldolase zu
wachsen (Feldmann S.D. et al., Appl. Mikrobiol. Biotechnol. 38 (1992)
354–62).
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Darüber hinaus
können
Hexosen, wie Glucose, im Gegensatz zu Xylose und anderen Pentosen,
auch durch Degradationswege, die von dem Pentosephosphatweg verschieden
sind, metabolisiert werden. Es ist deshalb keinesfalls selbstverständlich,
dass eine Transaldolase eine essentielle Funktion in der Glucosedegradation
aufweist.
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Es
kann auch bemerkt werden, dass ein gesteigerter Fluss der Enzyme
des Pentosephosphatwegs in vitro in Extrakten von Saccharomyces
cerevisiae Zellen, in denen die Aktivität einer Transaldolase gesteigert war,
gemessen wurde (Senac T. et al., Appl. Environ. Microbiol. 57 (1991)
1701–6).
Jedoch erlauben die experimentellen Bedingungen, die in dieser Studie
gewählt
wurden, keine Übertragung
der Ergebnisse auf die natürlichen
Phänomene
von metabolischer Physiologie, die in lebenden Mikroorganismen,
insbesondere Bakterien, auftreten. Zusätzlich kann bemerkt werden,
dass Liao J.C. et al. (Biotechn. Bioeng. 52 (1996) 129–140 gezeigt
haben, dass, wenn die Aktivitäten
einer Transaldolase und AroG gleichzeitig gesteigert werden, die DAHP
Bildung ansteigt. Diese Wirkung wird hauptsächlich der gesteigerten AroG
Aktivität
zugeschrieben. Eine Steigerung in der Herstellung von Substanzen
als ein Ergebnis eines Anstiegs der Transaldolase Aktivität als solche
wird nicht offenbart oder angegeben. Es konnte deshalb in keinem
Fall erwartet werden, dass es eine kausale Beziehung zwischen einem
Anstieg in der Transaldolase Aktivität in Mikroorganismen und dem
Bereitstellen von Ery4P für
die verbesserte Herstellung von Substanzen gibt.
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Die
Steigerung der Aktivität
(Überexpression)
einer Transaldolase in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung stellt ein alternatives Verfahren
zum Implementieren eines gesteigerten Flusses von Kohlenstoff durch
den Pentosephosphatweg bereit und bewirkt folglich eine verbesserte
Bereitstellung des primären
Metaboliten Ery4P. Folglich steht eine gesteigerte Menge an Ery4P
für die
mikrobielle Synthese von Substanzen bereit, in dessen Synthese mindestens
ein Zwischenprodukt des Pentosephosphatwegs, und insbesondere Ery4P,
involviert ist. Die Erfinder haben gezeigt, dass die verbesserte
Verfügbarkeit
von Ery4P sowohl in Mikroorganismen auftritt, in denen die Aktivität eines
PEP-abhängigen
Zucker-Aufnahme-Systems anwesend oder reduziert ist, als auch in
Mikroorganismen, in denen eine solche Aktivität abwesend ist. So können erfindungsgemäß nicht
nur Organismen, die noch aktive Phosphotransferasesysteme (PTS)
oder Phosphotransferasesysteme mit reduzierter Aktivität (pts+ Stämme)
aufweisen, verwendet werden, sondern auch Organismen, in denen das
PTS ausgeschaltet wurde (pts- Stämme).
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Innerhalb
der Bedeutung der Erfindung werden unter Substanzen zum Beispiel
Feinchemikalien, wie aromatische Aminosäuren, Indigo, Indolessigsäure, Adipinsäure, Melanin,
Chinone und Benzoesäure
und auch ihre möglichen
Derivate und sekundären
Erzeugnisse – oder
in einer allgemeinen Weise, sekundäre Erzeugnisse von Zwischenprodukten
des Pentosephosphatwegs verstanden. Jedoch sollte dies auch all
die Verbindungen, zum Beispiel Pyridoxin und seine Derivate, einschließen, deren
biochemische Synthese durch das Bereitstellen von Erythrose-4-Phosphat
gefördert
werden. Innerhalb des Zusammenhangs dieser Erfindung werden all
diese Substanzen auch als Substanzen aus dem aromatischen Metabolismus
bzw. Aromaten-Metabolismus erachtet. Es kann in diesem Zusammenhang
bemerkt werden, dass weitere genetische Veränderungen an den Substanz erzeugenden
Mikroorganismen zusätzlich
zu den neuen Eingriffen zur Herstellung von Indigo, Adipinsäure und
anderen unnatürlichen
sekundären
Produkten benötigt
werden. Dieses erfindungsgemäße Verfahren
ist insbesondere für
die Herstellung von Substanzen in Mikroorganismen geeignet, die
vor der Erhöhung
der Transaldolase Aktivität nicht
als Stämme
mit einem ausgeschalteten Phosphotransferasesystem (pts- Stämme) aus
Stämmen,
die zuvor ein Phosphotransferasesystem (pts+ Stämme) beinhaltet haben,
selektiert wurden. In diesem Zusammenhang kann angemerkt werden,
dass die nicht vorveröffentlichte Patentbeschreibung
WO-96/34961 eine solche Selektion von zuvor pts+ Stämmen beschreibt,
aber in dieser Studie geht diese Selektion der Erhöhung der
Transketolase oder Transaldolase Aktivität voran.
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Bezüglich der
Erhöhung
der Aktivität
einer Transaldolase wird der Erhöhung
der Aktivität
einer Escherichia coli Transaldolase der Vorzug gegeben, und insbesondere
der Aktivität
von Escherichia coli Transaldolase B (TalB). Wenn das entsprechende
talB Gen verwendet wird, stammt dieses Gen vorzugsweise von Escherichia
coli K12 oder von einem Stamm, der davon abgeleitet ist. Neben diesem
ist jedoch irgendein Gen ebenfalls geeignet, dessen Genprodukt eine
Reaktion katalysiert, die jener von Transaldolase entspricht, dies ist
die Umwandlung von Sedoheptulose 7-Phosphat plus Glycerinaldehyd-3-Phosphat
in Ery4P und Fructose-6-Phosphat.
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In
einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist
die Aktivität
einer Transketolase zusätzlich
zu der erhöhten
Aktivität
der Transaldolase erhöht.
Bei Anwesenheit von Pentosen führt
die Expression eines eigenen Transketolasegens zu der Bildung von
Metaboliten im Pentosephosphatweg (Feldmann S.D., Appl. Microbiol.
Biotechnol. 38 (1992) 354-61). Dies besitzt eine schädliche Wirkung
auf die Zelle und die Ergebnisse, inter alia, dahingehend, dass
die transformierten Zellen mit verminderter Geschwindigkeit wachsen.
Die Erfinder beobachteten auch eine identische Wirkung im Fall eines
Escherichia coli Stammes, der auf Glucose wuchs und der erhöhte Transketolase
Aktivität
zeigte. Jedoch wurde gefunden, dass die gleichzeitige Erhöhung der
Aktivität
einer Transketolase zusammen mit einer Transaldolase sehr vorteilhaft
für das
Bereitstellen von Ery4P ist und nicht die negativen Nebenwirkungen
einer alleinigen Überexpression
einer Transketolase zeigt. Die Anreicherung von Metaboliten des
Pentophosphatwegs, die auftritt, wenn die Aktivität einer Transketolase
erhöht
ist, zeigt sich folglich als ein Ergebnis der Erhöhung der
Aktivität
einer Transaldolase nicht, als dessen Ergebnis die Beeinträchtigung
im Wachstum der Zellen nicht nur gestoppt sondern sogar in eine
Wachstumserhöhung
umgewandelt wird. Es zeigt sich deshalb, dass die Erhöhung der
Aktivität
einer Transketolase insbesondere in Stämmen mit einer erhöhten Aktivität einer
Transaldolase erfindungsgemäß eine sinnvolle
Maßnahme
ist.
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Bezüglich der
Erhöhung
der Aktivität
einer Transketolase ist es bevorzugt, die Aktivität einer
Escherichia coli Transketolase und insbesondere die Aktivität von Escherichia
coli Transketolase A (TktA) zu erhöhen. Wenn das entsprechende
tktA Gen verwendet wird, stammt dieses Gen vorzugsweise von Escherichia
coli K12 oder von einem Stamm, der davon abgeleitet ist. Zusätzlich dazu
ist jedoch jedes Gen ebenso geeignet, dessen Genprodukt eine Reaktion
katalysiert, die jener einer Transketolase entspricht, dies bedeutet
die Umwandlung von Ribose-5-Phosphat
plus Xylulose-5-Phosphat in Sedoheptulose-7-Phosphat plus Glycerinaldehyd-3-Phosphat
oder die Umwandlung von Xylulose-5-Phosphat plus Ery4P in Fructose-6-Phosphat
plus Glycerinaldehyd-3-Phosphat.
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In
einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist/sind
die Aktivität
eines Transportproteins für
PEP-unabhängige
Aufnahme eines Zuckers und/oder die Aktivität einer Kinase, welche den
entsprechenden Zucker phosphoryliert, zusätzlich zu der Erhöhung der
Aktivität
einer Transaldolase oder der Erhöhung
der Aktivität
einer Transaldolase und einer Transketolase erhöht. Im Fall des Transportproteins wird
die Aktivität
dieses Proteins als die Protein vermittelte Aufnahmerate verstanden.
Die zusätzliche
Erhöhung
der Aktivität
eines dieser zuletzt genannten Proteine, d.h. des Transportproteins
und der Kinase, oder von beiden Protein, macht es möglich, eine
noch höhere
Bildung von Substanzen zu erreichen, insbesondere aromatische Aminosäuren, aufgrund
der Tatsache, dass PEP in erhöhter
Menge für
die Kondensation mit Ery4P bereitgestellt wird, um die primären Metaboliten
des allgemeinen Wegs für
die Biosynthese von aromatischen Verbindungen, d.h. Desoxy-D-Arabinoseheptulosonat-7-Phosphat
(DAHP) zu bilden.
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Es
ist ratsam, einen Förderer
als das Transportprotein für
die PEP-unabhängige
Aufnahme eines Zuckers zu verwenden, das heisst ein Transportprotein,
das in Übereinstimmung
mit dem Prinzip der Protein vermittelten erleichterten Diffusion
wirkt. Insbesondere ist es geeignet, das Glucosefördererprotein
(Glf) von Zymomonas mobilis zu verwenden. Wenn das zuletzt genannte
verwendet wird, wird das Protein kodierende Gen, glf, zum Beispiel
aus Z. mobilis ATCC 10988, ATCC 29191 oder ATCC 31821 erhalten.
Jedoch sind auch andere bakterielle Zucker-Transport-Gene, deren
Genprodukte zum Beispiel Glucose, Fructose oder Sucrose transportieren,
und wenn sie dies tun, kein PEP verwenden, zum Beispiel das GalP
System aus Escherichia coli, für
das neue Verfahren geeignet. Gene für Zucker-Transport-Systeme,
wie HXT1 bis HXT7 aus eukaryonten Mikroorganismen, wie Saccharomyces
cerevisiae, Pichia stipitis oder Kluyveromyces lactis oder Zucker-Transport-Gene
allgemein von anderen Organismen können auch verwendet werden,
vorausgesetzt dass sie in einer funktionellen Weise in den Mikroorganismen
exprimiert werden können
und dass die Genprodukte in diesem Zusammenhang ohne die Verwendung
von PEP für
den Transport der Zucker wirken. Es ist für sie insbesondere ratsam,
dass es ihnen möglich
ist, die Zucker-Transport-Gene in Aminosäure bildenden Mikroorganismen
(Aminosäurebilder)
zu exprimieren.
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Es
ist deshalb besonders geeignet, das Förderergen glf, isoliert aus
Z. mobilis ATCC 31821, zur Aufnahme von Zuckern, wie Glucose, Fructose
oder Mannose zu verwenden, wenn aromatische Aminosäuren in Übereinstimmung
mit dem neuen Verfahren hergestellt werden (Parker C. et al., Mol.
Microbiol. 15 (1995) 795–802;
Weisser P. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 3351–4). Das erfindungsgemäße Verfahren
ist insbesondere für
die Herstellung von aromatischen Aminosäuren in Mikroorganismen geeignet,
in denen das PTS System eine verringerte Aktivität aufweist oder vollständig abwesend
ist. In solchen Fällen
kann das PTS System verringert oder ausgeschaltet sein, bevor, aber
auch nachdem die Transaldolase Aktivität erhöht wurde.
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Insbesondere
das glf Gen sollte insbesondere in einer geringen Genkopienzahl
eingebaut werden, um schädliche
Wirkungen auf die Zelle aufgrund von übermäßiger Expression von Membranproteinen
zu vermeiden. Deshalb ist eine Genkopienzahl von 2 bis 5 zum Beispiel
für das
glf Gen bevorzugt. Es ist insbesondere vorteilhaft, das glf Gen
in eines der Gene des ptsHI-crr Operons einzubauen, zum Beispiel
in das ptsI Gen.
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Wenn
eine Zucker phosphorylierende Kinase verwendet wird, ist es ratsam
eine Hexose phosphorylierende Kinase, vorzugsweise eine Kinase,
insbesondere Glucokinase (Glk) aus Zymomonas mobilis zu verwenden.
Wenn die zuletzt genannte verwendet wird, stammt das Protein kodierende
Gen, glk, zum Beispiel aus Z. mobilis ATCC 10988, ATCC 29191 oder
ATCC 31821. Andere Gene für
Hexose phosphorylierende Kinasen aus Bakterien, deren Genprodukte
Hexosen phosphorylieren während
sie ATP verbrauchen, wie eine Fructokinase oder eine Mannokinase
sind ebenso für
das neue Verfahren geeignet. Darüber
hinaus sind Gene für
zum Beispiel Kinasen aus eukaryonten Mikroorganismen, wie Saccharomyces
cerevisiae oder in einer allgemeinen Weise, Gene für Zucker
phosphorylierende Kinasen aus anderen Organismen, ebenso geeignet, vorausgesetzt
sie können
in einer funktionellen Weise in den Mikroorganismen, insbesondere
Aminosäurebildnern
exprimiert werden und können
ohne PEP zu verwenden wirken, um Zucker zu phosphorylieren. Das
Glucokinasegen, glk, zur Phosphorylierung von Glucose, wobei dieses
Gen aus Z. mobilis ATCC 29191 isoliert wird, ist besonders für die Herstellung
von aromatischen Aminosäuren
in Übereinstimmung
mit den neuen Verfahren geeignet.
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Die
Verfügbarkeit
von PEP zur Herstellung des ersten Zwischenprodukts des aromatischen
Aminosäure
Metabolismus kann in Mikroorganismen beschränkt sein, in denen der Materialfluss
in Richtung Ery4P erhöht
ist. In diesen Fällen
kann es vorteilhaft sein, andere PEP verbrauchende Reaktionen im
Metabolismus zu verringern oder vollständig auszuschalten, wie die
Reaktion des PEP:Zucker-Phosphotransferase-Systems (PTS),
das eine PEP abhängige
Zuckeraufnahme katalysiert, wenn dieses System anwesend ist. Erfindungsgemäß können beide
Organismen, die noch aktive PTS Gene besitzen (pts+ Stämme) und,
für die
weitere Verbesserung des Verfahrens, pts Mutanten, in denen die
Aktivität
des pts verringert ist (im vorliegenden Fall auch als pts+ erachtet) oder in denen das pts ausgeschaltet
wurde (pts- Stämme), verwendet werden. Eine
Verringerung dieser Natur kann entweder auf der enzymatischen Ebene
oder durch Verwendung genetischer Verfahren, zum Beispiel durch
Einbauen eines glf und/oder eines glk Gens in das Chromosom und
insbesondere in den Locus des ptsI Gens, einem Verfahren das gleichzeitig
die rekombinante DNA im Chromosom stabilisiert (Segregationsstabilität) und folglich
bedeutet, dass die Verwendung eines Vektors entbehrlich ist, bewirkt
werden. Die Erfahrungen der Erfinder haben gezeigt, dass die Verringerung
oder das Ausschalten der Aktivität
des PTS vorzugsweise nicht stattfinden sollte bevor die Aktivität der Transaldolase
erhöht
ist.
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Innerhalb
der Bedeutung der Erfindung werden Maßnahmen zur Erhöhung der
Aktivität
verstanden als alle Maßnahmen,
die zur Erhöhung
der Aktivität
der Transaldolase, der Transketolase, des Transportproteins und
der Kinase geeignet sind. Die folgenden Maßnahmen sind insbesondere für diesen
Zweck geeignet:
- – Einführen von Genen, zum Beispiel
unter Verwendung von Vektoren oder temperenten Phagen;
- – Erhöhen der
Genkopienzahl, zum Beispiel unter Verwendung von Plasmiden mit dem
Ziel des Einführens der
erfindungsgemäßen Gene
in die Mikroorganismen mit einer erhöhten Kopienzahl, dies bedeutet
einer Kopienzahl, die geringfügig
(z.B. von 2 bis 5 fach) erhöht
bis stark (z.B. von 15 bis 50 fach) erhöht ist;
- – Erhöhen der
Genexpression, zum Beispiel durch Erhöhen der Transkriptionsgeschwindigkeit,
zum Beispiel unter Verwendung von Promotorelementen, wie Ptac, Ptet
oder anderen regulatorischen Nukleotidsequenzen und/oder durch
Erhöhen
der Translationsgeschwindigkeit, zum Beispiel unter Verwendung einer
Konsensus Ribosomenbindestelle;
- – Erhöhen der
endogenen Aktivität
von Enzymen, die anwesend sind, zum Beispiel durch Mutationen, die einer
zufälligen
Weise durch herkömmliche
Verfahren gebildet werden, zum Beispiel unter Verwendung von UV
Strahlung oder mutationsauslösenden
Chemikalien, oder durch Mutationen, wie Deletion(en), Insertionen)
und/oder Nukleotidaustausch(e), die in einer spezifischen Weise
unter Verwendung von Genetic Engineering Verfahren gebildet werden;
- – Erhöhen der
Aktivität
von Enzymen durch Verändern
der Struktur von Enzymen, zum Beispiel durch Mutagenese unter Verwendung
von physikalischen, chemischen oder molekularbiologischen oder anderen
mikrobiologischen Verfahren;
- – Verwenden
deregulierter Enzyme, zum Beispiele Enzyme, die nicht länger einer
Feedback Inhibierung unterworfen sind;
- – Einführen von
korrespondierenden Genen, welche die deregulierten Enzyme kodieren.
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Kombinationen
der oben genannten Verfahren und andere analoge Verfahren können ebenfalls
für die Erhöhung der
Aktivität
eingesetzt werden. Die endogene oder eingeführte Aktivität von Transportproteinen kann
zum Beispiel durch Klonieren des Gens unter Verwendung zum Beispiel
der oben genannten Verfahren oder durch Selektieren von Mutanten,
die einen erhöhten
Transport von Substraten zeigen, erhöht werden.
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Vorzugsweise
wird die Aktivität
durch Integrieren des Gens oder der Gene in eine Genstruktur oder
in mehrere Genstrukturen erhöht,
wobei jedes Gen oder die Gene in die Genstruktur als (eine) einzelne
Kopie(n) oder in einer erhöhten
Kopienzahl eingebaut werden.
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Innerhalb
der Bedeutung der Erfindung wird unter einer Genstruktur ein Gen
oder irgendeine andere Nukleotidsequenz verstanden, die erfindungsgemäße Gene
trägt.
Geeignete Nukleotidsequenzen können zum
Beispiel Plasmide, Vektoren, Chromosomen, Phagen oder andere Nukleotidsequenzen
sein, die nicht geschlossen zirkulär sind.
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Ein
Chromosom innerhalb der Bedeutung der Erfindung ist ein Chromosom,
in das mindestens ein erfindungsgemäßes Gen eingeführt wurde,
wobei die resultierende Nukleinsäuresequenz
mindestens ein Gen oder eine Genkopie mehr enthält als natürlich in diesem Chromosom enthalten
ist. Andererseits führt
zum Beispiel homologe Rekombination innerhalb eines Genlocus zu
einem Chromosom, das sich nicht notwendigerweise von der natürlichen
Form unterscheiden muss. Die Chromosomen, die durch homologe Rekombination hergestellt
werden, werden deshalb nicht als in Übereinstimmung mit der Erfindung
erachtet, wenn die natürliche
Zahl von homologen Genen nicht überschritten
wird.
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Innerhalb
der Bedeutung der Erfindung wird unter einer Genstruktur auch eine
Kombination der oben genannten Genträger, wie Vektoren, Chromosomen
und temperente Phagen verstanden, auf welche die erfindungsgemäßen Gene
verteilt sind. Zum Beispiel können
zwei tal Gene in die Zelle auf einem Vektor eingeführt werden,
oder zwei tal Gene können
in ein Chromosom eingebaut werden. Zusätzlich kann ein weiteres Gen zum
Beispiel in die Zelle unter Verwendung eines Phagen eingeführt werden.
Dasselbe gilt für
die anderen erfindungsgemäßen Gene.
Diese Beispiele sollen andere Kombinationen von Genverteilungen
von der Erfindung nicht ausschließen. In jedem Fall ist es wesentlich,
dass die Zahl der Gene, die in dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus enthalten
sind, die natürliche
Zahl der entsprechenden Gene überschreitet.
Vorzugsweise wird die Zahl der glf Gene zum Beispiel durch einen
Faktor von 2 bis 5 erhöht
sein, um die erfindungsgemäße Aktivitätserhöhung zu
erreichen. Bei diesen Konzentrationen wird keine zelltoxische Wirkung
auftreten. Jedoch ist es auch vorgesehen, die erfindungsgemäßen Gene
in die Mikroorganismen in einer höheren Kopienzahl von bis 50
Genkopien in einer Form mit demselben Effekt einzuführen.
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In
dem neuen Verfahren zur Herstellung von Substanzen, wird der Verwendung
von Mikroorganismen der Vorzug eingeräumt, in denen eines oder mehrere
Enzyme, die zusätzlich
in die Synthese von Substanzen involviert sind, dereguliert ist/sind
und/oder eine erhöhte
Aktivität
aufweist/aufweisen.
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Diese
Enzyme sind insbesondere die Enzyme des aromatischen Aminosäure Metabolismus
und insbesondere DAHP Synthase, Shikimatkinase und Chorismatmutase/Prephenatdehydratase,
und auch alle anderen Enzyme, die in die Synthese von Zwischenprodukten
des aromatischen Metabolismus und ihrer sekundären Produkte involviert sind.
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Neben
den erfindungsgemäßen Enzymen
ist die Deregulierung und Überexpression
von DAHP Synthase insbesondere wichtig für die Herstellung von Substanzen,
wie Adipinsäure,
Gallensäure
und Chinonverbindungen und ihrer Derivate. Zusätzlich sollte Shikimatkinase
dereguliert und ihre Aktivität
erhöht
sein, um eine noch weiter gesteigerte Synthese von zum Beispiel
Tryptophan, Tyrosin, Indigo und Derivaten von Hydroxybenzoesäure und
Aminobenzoesäure
und Naphthochinonen und Anthrachinonen und auch ihrer sekundären Produkte
zu erreichen. Deregulierte und überexprimierte
Chorismatmutase/Prephenatdehydratase ist zusätzlich von besonderer Wichtigkeit
für die
wirksame Herstellung von Phenylalanin und Phenylbrenztraubensäure und
ihren Derivaten. Jedoch ist es beabsichtigt, dass sie alle anderen
Enzyme umfassen, deren Aktivitäten
zu der biochemischen Synthese von Substanzen beitragen, dies bedeutet
Verbindungen, deren Herstellung durch die Bereitstellung von Erythrose-4-Phosphat
gefördert
wird, zum Beispiel Pyridoxin und seine Derivate. Es kann angemerkt
werden, dass weitere genetische Veränderungen an den Substanz bildenden
Organismen, zusätzlich
zu dem neuen Eingreifen, benötigt
werden zum Zweck der Herstellung von Indigo, Adipinsäure und
anderen unnatürlichen
sekundären
Produkten.
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Das
neue Verfahren ist insbesondere für die Herstellung von aromatischen
Aminosäuren,
insbesondere Phenylalanin geeignet. In dem zuletzt genannten Fall
ist die Genexpression und/oder die Enzymaktivität einer deregulierten DHAP
Synthase (z.B. in E. coli AroF oder AroH) und/oder einer genauso
deregulierten Chorismatmutase/Prephenatdehydratase (PheA) vorzugsweise
erhöht.
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Escherichia
Spezies und auch Mikroorganismen der Genera Serratia, Bacillus,
Corynebacterium oder Brevibacterium und andere Stämme, die
von herkömmlichen
Aminosäure
Verfahren bekannt sind, sind zur Verwendung als Herstellungsorganismen
geeignet. Escherichia coli ist besonders geeignet.
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Es
ist eine andere Aufgabe der Erfindung, geeignete Genstrukturen und
transformierte Zellen, die diese Genstrukturen tragen, bereitzustellen,
die es erlauben, das Verfahren in einer besonders erfolgreichen
Weise auszuführen.
Innerhalb des Zusammenhangs der Erfindung werden jetzt neue Genstrukturen
bereitgestellt, wobei die Genstrukturen in rekombinanter Form a)
ein Gen kodierend eine Transaldolase oder ein Gen kodierend eine
Transaldolase und ein Gen kodierend eine Transketolase, und b) mindestens
ein Gen kodierend ein Transportprotein für die PEP-unabhängige Aufnahme
eines Zuckers oder kodierend eine Kinase, die einen Zucker phosphoryliert,
enthalten. In diesen Genstrukturen ist es bevorzugt, dass das Gen
für das
Transportprotein einen Förderer
kodiert und dass das Gen für
die Kinase eine Hexose phosphorylierende Kinase kodiert. Insbesondere
stammen die Gene für
die Transaldolase und die Transketolase von Escherichia coli, und
die Gene für
das Transportprotein und die Kinase stammen von Zymomonas mobilis.
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Genstrukturen
sind besonders vorteilhaft, in denen das Gen für die Transaldolase Escherichia
coli talB und das Gen für
Transketolase Escherichia coli tktA ist, während das Gen für das Transportprotein
Zymomonas mobilis glf und das Gen für die Kinase Zymomonas mobilis
glk ist.
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Die
geeigneten Gene werden isoliert, und die Zellen werden transformiert,
in Übereinstimmung
mit gegenwärtigen
Verfahren: die vollständigen
Nukleotidsequenzen der taB und tktA Gene von Escherichia coli K12 sind
bekannt (Yura T. et al., Nucl. Acid Res. 20 (1992) 3305-8; Sprenger
G.A., Biochim. Biophys. Acta 1216 (1993) 307–10; Sprenger G.A. et al.,
J. Bacteriol. 177 (1995) 5930–9)
und in Datenbanken, wie jener des EMBL in Heidelberg hinterlegt.
Wenn das Escherichia coli talB Gen kloniert wird, ist das Verfahren
der Polymerase Kettenreaktion (PCR) zum Beispiel geeignet, um das
Gen spezifisch unter Verwendung von chromosomaler DNA aus Escherichia
coli K12 Stämmen
zu amplifizieren (Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 5930–9). Die
homologe Komplementierung einer Transketolase defizienten Mutante
ist zum Beispiel geeignet, wenn das Escherichia coli tktA Gen kloniert
wird (Sprenger G.A. in: Bisswanger N. et al., Biochemistry and physiology
of thiamine diphosphate enzymes, VCH (1991) 322–6).
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Wenn
zum Beispiel das Zymomonas mobilis Transportgen glf oder das Zymomonas
mobilis Glucokinase Gen glk kloniert wird, ist zum Beispiel die
PCR für
das spezifische Amplifizieren des Gens unter Verwendung von chromosomaler
DNA aus Zymomonas mobilis Stämmen
ATCC 29191 oder ATCC 31821 geeignet, ebenso wie die heterologe Komplementierung
von Escherichia coli Mutanten, die in PTS Funktionen defizient sind
und die deshalb nicht in der Lage sind, zum Beispiel Glucose zu
transportieren (Snoep J.L. et al., J. Bacteriol. 174 (1994) 1707–8; Parker
C. et al., Mol. Microbiol. 15 (1995) 795-82; Weisser P. et al.,
J. Bacteriol. 177 (1995) 3351–4).
Nach dem Isolieren der Gene und ihrer in vitro Rekombination mit
Vektoren mit niedriger Kopienzahl, wie pACYC184, pACYC177, pSC101
oder pZY507 (Weisser P. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 3351–4) wird
die Wirtszelle unter Verwendung chemischer Verfahren, Elektroporation,
Konjugation oder Transduktion transformiert.
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Das
isolierte Transaldolase Gen kann zusammen mit einem oder mehreren
der Gene, die innerhalb des Zusammenhangs der Erfindung beschrieben
wurden, in irgendeiner Kombination in eine Genstruktur oder in mehrere
Genstrukturen integriert werden. Ohne die exakte Allokation der
Genstrukturen zu betrachten, führt dies
zu Kombinationen wie taB, taB + tktA, taB + glf, taB + glk, taB
+ glf + glk, talB + tktA + glf, taB + tktA + glk oder talB + tktA
+ glf + glk.
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Genstrukturen
sind vorteilhaft, die mindestens eine regulatorische Gensequenz
enthalten, die einem der Gene zugewiesen ist. Somit kann die Wiederherstellung
von regulatorischen Elementen vorzugsweise auf der Ebene der Transkription
durch insbesondere Wiederherstellen der Transkriptionssignale bewirkt
werden. Dies kann zum Beispiel durch Erhöhen der Aktivität des Promotors
oder der Promotoren durch Verändern
der Promotorsequenzen, die oberhalb der Strukturgene angeordnet
sind oder durch vollständiges
Austauschen der Promotoren gegen wirksamere Promotoren bewirkt werden.
Die Transkription kann auch wiederhergestellt werden durch das Ausüben eines
entsprechenden Einflusses auf ein regulatorisches Gen, das den Genen
zugewiesen ist; zusätzlich
dazu ist es jedoch auch möglich,
die Translation durch zum Beispiel das Verbessern der Stabilität der Messenger
RNA (mRNA) wiederherzustellen.
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Die
geeignetesten Genstrukturen sind jene, in denen mindestens eines
der beschriebenen Gene derart eingebaut ist, dass es unter der Kontrolle
eines induzierbaren Promotors steht. Wenn die Gene in einer erfindungsgemäßen Genstruktur
angeordnet sind, kann ein Promotor oberhalb eines Gens angeordnet
sein, oder er kann als ein gemeinsamer Promotor oberhalb von mehreren
Genen angeordnet sein, oder zwei entgegengesetzte Promotoren können verwendet
werden, zwischen denen die Gene derart angeordnet sind, dass sie
in entgegengesetzten Richtungen gelesen werden. In diesem Zusammenhang
kann zum Beispiel das glf Gen oberhalb eines relativ schwachen Promotors
(z.B. Ptet) angeordnet sein, und andere Gene können unter der Kontrolle des
tac Promotors stehen. Eine oder mehrere DNA Sequenzen können oberhalb
und/oder unterhalb der Gene, die in einer Genstruktur enthalten
sind, mit oder ohne einem oberhalb gelegenen Promotor oder mit oder
ohne einem zugeordneten regulatorischen Gen, angeordnet sein. Durch
die Verwendung von induzierbaren Promotorelementen, z.B. lacIq/Ptac, ist es möglich, neue Funktionen (Induktion von
Enzymsynthese) zum Beispiel durch das Hinzufügen von chemischen Auslösern, wie
Isopropylthiogalactosid (IPTG) anzuschalten.
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Das
Ziel der Erfindung wird auch durch das Bereitstellen transformierter
Zellen erreicht, die eine erfindungsgemäße Genstruktur in replizierbarer
Form enthalten.
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Innerhalb
der Bedeutung der Erfindung wird unter einer transformierten Zelle
ein Mikroorganismus verstanden, der eine erfindungsgemäße Genstruktur
trägt,
wobei die Genstruktur der Zelle die erhöhte Bildung von Substanzen
verleiht. Die Wirtszellen können
durch chemische Verfahren transformiert werden (Hanahan D., J. Mol.
Biol. 166 (1983) 557–580)
und auch durch Elektroporation, Konjugation oder Transduktion.
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Für die Transformation
ist es vorteilhaft, Wirtszellen zu verwenden, in denen eine oder
mehrere Enzyme, die zusätzlich
in die Synthese der Substanzen involviert ist/sind, dereguliert
ist/sind und/oder eine erhöhte Aktivität besitzt/besitzen.
Ein Mikroorganismusstamm, insbesondere Escherichia coli, der eine
aromatische Aminosäure
und eine andere erfindungsgemäße Substanz
bildet, wird mit der Genstruktur transformiert, welche die relevanten
Gene enthält.
Für die
Transformation mit den Genstrukturen ist es vorteilhaft, Wirtszellen zu
verwenden, in denen die Aktivität
des PEP-abhängigen
Zucker-Aufnahme-Systems, wenn es anwesend ist, verringert oder ausgeschaltet
ist.
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Insbesondere
werden transformierte Zellen bereitgestellt, die in der Lage sind,
eine aromatische Aminosäure
bereitzustellen, wobei die aromatische Aminosäure vorzugsweise L-Phenylalanin
ist.
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Unter
Verwendung des neuen Verfahrens und des Mikroorganismus, der in Übereinstimmung
mit der Lehre der Erfindung transformiert wurde, kann ein breites
Spektrum von Substraten für
die Herstellung von Substanzen eingesetzt werden. Innerhalb des
Zusammenhangs der Erfindung wird folglich auch ein Verfahren für die mikrobielle
Herstellung von Substanzen bereitgestellt, in dem Zellen, die in Übereinstimmung
mit der Erfindung transformiert wurden und in denen eine Genstruktur
anwesend ist, die mindestens eine regulatorische Gensequenz enthält, die
einem der Gene zugewiesen ist, kultiviert werden, wobei die Enzymsynthese
in dem Mikroorganismus nach mindestens zwei Zellteilungen induziert
wird (am Beginn der exponentiellen Wachstumsphase). Folglich kann
die Herstellung der Mikroorganismen unabhängig von ihrem Wachstum erhöht werden.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des neuen Verfahrens werden transformierte Zellen verwendet, die
zusätzlich
zu den Zwischenprodukten des Pentosephosphatwegs auch eine erhöhte Verfügbarkeit
von anderen Metaboliten des zentralen Metabolismus enthalten. Diese
Metabolite schließen
zum Beispiel Pyruvat aus der Glykolyse oder Gluconeogenese oder
Oxalacetat aus dem Zitronensäurezyklus
ein. Darüber hinaus
kann die relevante Verbindung oder ihre Vorläufer, dies sind die Vorläufer von
Pyruvat oder von Metaboliten des Zitronensäurezyklus, wie Fumarat oder
Malat den wachsenden Zellen durch Füttern zur Verfügung gestellt
werden.
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Die
Erfindung wird unten detaillierter mit der Hilfe von wenigen Einführungsbeispielen
beschrieben. Die folgenden Stämme
wurden bei DSM unter den Bedingungen des Budapester Abkommens hinterlegt:
DSM
11210 Escherichia coli AT2471/pZYTT7tal
DSM 11209 Escherichia
coli AT2471/pZY557tkttal
DSM 11206 Escherichia coli AT2471
GP704glfint PTS+
DSM 11205 Escherichia
coli AT2471 glfint PTS-
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Der
verwendete Wirtsorganismus, d.h. AT2471 wurde von Taylor und Trotter
(Bacteriol. Rev. 13 (1967) 332–353)
in der CGSC unter der Nummer 4510 hinterlegt und ist frei zugänglich.
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Die
Merkmale und die Herkunft aller im Zusammenhang mit dieser Patentanmeldung
verwendeter Organismen sind detailliert in Tabelle 1 beschrieben.
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Der
folgende Text beabsichtigt, die verwendeten Materialien und Verfahren
anzugeben und die Erfindung mit experimentellen Beispielen und Vergleichsbeispielen
zu unterstützen:
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Allgemeine
Verfahren
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In
den genetischen Studien wurden Stämme von E. coli, außer es ist
anders angegeben, auf LB Medium bestehend aus Difco Bactotrypton
(10 g·l-1), Difco Hexeextrakt (5 g·l-1) und NaCl (10 g·l-1)
kultiviert. In Abhängigkeit
von Resistenzeigenschaften der verwendeten Stämme wurde/wurden Carbenicillin
(20–100
mg·l-1) und/oder Chloramphenicol (17 – 34 mg·l-1) zu dem Medium, falls notwendig, hinzufügt. Hierfür wurde
Carbenicillin zunächst
in Wasser gelöst,
und Chloramphenicol in Ethanol, und die Lösungen wurden, nachdem sie durch
Filtration sterilisiert wurden, zu dem zuvor autoklavierten Medium
hinzugefügt.
Difco Bactoagar (1,5%) wurde zu dem LB Medium zur Herstellung von
Agarplatten hinzugefügt.
Plasmid DNA wurde aus E. coli mittels alkalischer Lyse unter Verwendung
eines kommerziell verfügbaren
Systems (Qiagen, Hilden) isoliert. Chromosomale DNA wurde aus E.
coli und Z. mobilis, wie von Chen und Kuo beschrieben, isoliert
(Nucl. Acid Res. 21 (1993) 2260).
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Restriktionsenzyme,
DNA Polymerase I, alkalische Phosphatase, RNase und T4 DNA Ligase
wurden gemäß den Angaben
der Hersteller (Boehringer, Mannheim, Deutschland oder Promega,
Heidelberg, Deutschland) verwendet. Für die Restriktionsanalyse wurden
die DNA Fragmente in Agarosegelen (0,8%) aufgetrennt und aus der
Agarose durch Extraktion unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Systems
isoliert (Jetsorb Genomed, Bad Oeynhausen, Deutschland).
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Für die Southern
Analysen wurde chromosomale DNA (10 μg) mit Restriktionsenzymen gespalten, nach
der Größe durch
Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Nylonmembran (Nytran
13, Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) mittels Vakuum
vermittelter Diffusion transferiert (VacuGene System, Pharmacia,
Freiburg, Deutschland). Geeignete DNA Fragmente wurden isoliert,
mit Digoxigenin-dUTP markiert und als Sonden verwendet. Die Markierung,
Hybridisierung, Waschverfahren und der Nachweis wurden mit Hilfe eines
kommerziell verfügbaren
Markierungs- und Nachweissystems durchgeführt (Boehringer, Mannheim, Deutschland).
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Für die Transformation
wurden die Zellen bei 37°C
und 200 rpm für
2,5–3
h in LB Medium (5 ml Röhrchen)
inkubiert. Bei einer optischen Dichte (620 nm) von ungefähr 0,4 wurden
die Zellen abzentrifugiert und in einem Zehntel des Volumens in
TSS (LB Medium enthaltend 10% (w/v) PEG 8000, 5% (v/v) DMSO und
50 mM MgCl2) aufgenommen. Nach einer 30
Minuten Inkubation bei 4°C
mit von 0,1 bis 100 ng DNA und anschließender Inkubation bei 37°C für 1 h wurden
die Zellen auf LB Medium enthaltend ein geeignetes Antibiotikum ausplattiert.
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Beispiel 1
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Herstellung von pZY557tal,
pBM20tal und pZY557tkttal als Prototypen von erfindungsgemäßen Plasmid
basierten Genstrukturen, und von pZY557tkt
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Das
Plasmid pZY507 (Weisser et al. 1995 J. Bacteriol. 177:3351–3345) wurde
unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI und HindIII geöffnet, und
das größere Fragment
(10,1 kB der DNA) wurde isoliert. Ein Teil der multiplen Klonierungsstelle
wurde aus dem Vektor pUCBM20 (Boehringer, Mannheim, Deutschland)
unter Verwendung von BamHI und HindIII ausgeschnitten und in das
größere pZY5078amHI/HindIII Fragment
ligiert, was zu dem Vektor pZY557 führte, der dem Vektor pZY507
gleicht, mit Ausnahme der anderen Restriktionsschnittstellen. Das
talB Gen wurde aus dem Vektor pGSJ451 (Sprenger G.A. et al., J.
Bacteriol. 177 (1995) 5930–36)
mit Hilfe von PCR amplifiziert. Hierfür wurde das Oligonukleotid
I: 5' CCGATGCTGTTTAAAGAGAAATA
3' (die hier unterstrichenen
Basenpaare entsprechen den Basenpaaren 84 bis 101 der talB Sequenz
aus Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 5930–6), das
mit einer Schnittstelle für
das Restriktionsenzym SphI versehen war, und der kommerziell erhältliche
M13/pUC Sequenzierprimer (Nr. 1010093, Boehringer Mannheim, Deutschland)
als Oligonukleotid II verwendet. Das resultierende amplifizierte
DNA Fragment enthält
eine Schnittstelle für
SphI an jedem Ende und wurde mit dem Restriktionsenzym SphI gespalten.
Dieses Fragment wurde anschließend
jeweils in die Vektoren pZY557 und pUCBM20 ligiert, wobei die Vektoren
auch mit SphI linearisiert wurden. Jeweils die rekombinanten Plasmide
pZY557tal und pBM20tal wurden nach dem Transformieren von E. coli
mit den zwei Ligationslösungen
und dem Klonieren der Transformanten erhalten. Das tktA Gen wurde
durch PCR aus dem Vektor pGSJ427 (Sprenger G.A. et al., Eur. J.
Biochem. 230 (1995) 525–32)
amplifiziert, wobei eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym NotI
an dem 5' Ende und eine
Schnittstelle für
das Enzym SphI an dem 3' Ende
eingeführt
wurde. In diesem Fall wurde das Oligonukleotid III verwendet: 5' TTAGCGGCCGCCCTTCATCATCCGATCT
3' (die hier unterstrichenen
Basenpaare entsprechen den Basenpaaren 126 bis 146 der tktA Sequenz
aus Sprenger G.A., Biochim. Biophys. Acta. 1216 (1993) 307–10), das
mit einer Schnittstelle für
das Restriktionsenzym NotI versehen war, und IV: 5' ATAGCATGCTAATTACAGCAGTTC
3' (die hier unterstrichenen
Basenpaare entsprechen den Basenpaaren 2018–2036 der tktA Sequenz aus
Sprenger G.A., Biochim. Biophys. Acta. 1216 (1993) 307–10), das
mit einer Schnittstelle für
SphI versehen wurde. Das resultierende PCR Fragment wurde mit NotI
und SphI gespalten und in den Vektor pZY557tkt ligiert, der in derselben
Weise behandelt wurde, was zu dem Vektor pZY557tkt führte. pZY557tkt
wurde anschließend
mit SphI geöffnet
und mit dem SphI gespaltenen PCR Fragment enthaltend taB ligiert.
Nach dem Transformieren von E. coli und dem Klonieren der Transformanten
(siehe oben) wurden Plasmide erhalten, die das tktA Gen und das
talB Gen in derselben Richtung orientiert unterhalb des tac Promotors
enthielten und die anschließend
als Genstruktur pZY557tkttal verwendet wurden.
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Die
resultierenden Transformanten wurden bei -80°C auf LB Medium in der Form
von Glycerolkulturen (30%) gelagert. Wenn sie benötigt wurden,
wurden die Glycerolkulturen direkt vor der Verwendung aufgetaut.
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Beispiel 2
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Wirkung der erhöhten Aktivität einer
Transaldolase auf das Wachstum von Stämmen, in denen Transketolase Aktivität auch erhöht ist
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Das
Wachstum der E. coli Stämme
AT2471, AT2471/pZY557tkt, AT2471/pZT557tal und AT2471/pZY557tkttal
auf Glucose wurde in Mineralmedium untersucht. Dieses bestand aus
Na Citrat·3H2O(1,0 g·l-1),
MgSO4·7H2O(0,3 g·l-1),
KH2PO4(3,0 g·l-1), K2HPO4(12,0 g·1-1),
NaCl(0,1 g·1-1), (NH4)2SO4(5,0 g·l-1), CaCl2·2H2O(15,0 mg·l-1),
FeSO4·7H2O(0,75 g·l-1)
und L-Tyrosin (0,04 g·l-1). Zusätzliche
Mineralien wurden in der Form von Spurenelementlösung (1 ml·l-1)
hinzugefügt,
die aus Al2(SO4)3·18H2O(2,0 g·l-1), CoSO4·6H2O(0,7 g·l-1),
CuSO4·5H2O(2,5 g·l-1),
H3BO3(0,5 g·l-1), MnCl2· 4H2O(20,0 g·l-1),
Na2MoO4·2H2O(3,0 g·l-1),
NiSO4·3H2O(2,0 g·l-1)
und ZnSO4·7H2O(15,0
g·l-1) zusammengesetzt war. Vitamin B1(5,0 mg·l-1) wurde in Wasser gelöst und, nachdem es durch Filtration
sterilisiert wurde, zu dem Medium hinzugefügt, nachdem das zuletzt genannte
autoklaviert wurde, ebenso wie Carbenicillin und/oder Carbenicillin
und Chloramphenicol, wenn die Notwendigkeit bestand. Glucose (30
g·l-1) wurde getrennt autoklaviert und in gleicher
Weise zu dem Medium hinzugefügt,
nachdem das zuletzt genannte autoklaviert worden war.
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Für die Experimente
wurden Schüttelflaschen
(1000 ml enthaltend 100 ml Minimalmedium) mit 2 ml Glycerolkultur
inokuliert und bei 37°C
und 150 rpm für
72 h auf einem Überkopfschüttler inkubiert.
Nachdem eine optische Dichte (620 nm) von ≈ 1 erreicht war, wurden die Zellen
durch Hinzufügen
von 15–100 μM IPTG induziert.
Die optische Dichte der Kultur wurde in regelmäßigen Intervallen bis zu diesem
Punkt gemessen. Unter den oben beschriebenen Bedingungen erreichte
der Wirtsorganismus E. coli AT2471 eine optische Dichte von 1,2
nach 7,25 h. Die Erhöhung
in der Aktivität
der Transketolase in mutantem AT2471/pZY557tkt führte zu einer merklichen Reduktion
der Wachstumsgeschwindigkeit; während
er eine identische optische Dichte zu Beginn des Experiments aufwies,
erreichte dieser Stamm nur eine optische Dichte von 0,49 nach 7,25
h. Die wachstumsinhibierende Wirkung ist wahrscheinlich der Synthese
von inhibitorischen Konzentrationen von metabolischen Zwischenprodukten
des Pentosephatwegs zuzuweisen.
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Die
Erhöhung
in der Aktivität
der Transaldolase in der Mutante AT2471/pZY557tal führte auch
zu einer spürbaren
Reduktion (fast genauso spürbar
wie im Fall der Transketolase) in der Wachstumsgeschwindigkeit; eine
optische Dichte von 0,52 wurde nach 7,25 h erreicht. Es war möglich, eine
optische Dichte von 1,1 nach 7,25 h durch Erhöhen der Aktivität der Transaldolase
zusätzlich
zu jener der Transketolase zu erreichen, wie in E. coli AT2471/pZY557tkttal
bewirkt wurde. Dieses Ergebnis macht deutlich, dass das zusätzliche
Erhöhen der
Aktivität
einer Transaldolase in einem Stamm mit einer erhöhten Aktivität an Transketolase
die negative Wirkung der alleinigen Erhöhung der Aktivität der Transketolase
zunichte macht und nahezu ungehindertes Wachstum erlaubt.
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Beispiel 3
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Bestimmung
der Enzymaktivitäten
der Transaldolase
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Um
die Aktivität
der Transaldolase zu bestimmen, wurden Zellen von E. coli AT2471,
AT2471/pZY507, AT2471/pZY557tal und AT2471/pZY557tkttal wie oben
beschrieben kultiviert, wobei jedoch 3-(Morpholin)propan-sulfonsäure (MOPS,
16,7 g·l-1) zu dem Medium hinzugefügt und die
Phosphat Konzentration auf ein Zehntel der Konzentration erniedrigt
wurde, die in den Wachstumsexperimenten verwendet wurde. Um die
Induktion der Zellen zu überprüfen, wurden
parallele experimentelle Mischungen aufgestellt, von denen eine
Mischung durch Hinzufügen
von IPTG (20 μM)
nach 7 Zellteilungen (OD ≈ 1)
induziert wurde. 20 ml der Kulturbrühe wurde von all den Mischungen
direkt vor dem Hinzufügen
des Induktors zu den relevanten Flaschen entfernt, und 3 Stunden
nach der Induktionszeit wurden die Zellen bei 6000 g für 10 min.
bei 4°C
sedimentiert.
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Die
geernteten Zellen wurden in 50 mM Glycylglycin Puffer, pH 8,5 enthaltend
1 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl2 und 0,5
mM Thiamindisphosphat gewaschen. Die Zellen in dem Sediment wurden
durch Ultraschallbehandlung (Branson 250 Sonifier, ausgestattet
mit einer Mikrospitze) in einem Schallzyklus von 25% und bei einer
Intensität
von 40 Watt für
4 min. pro ml Zellsuspension zerstört. Nach dem Zentrifugieren
bei 18.000 g für
30 min. bei 4°C
wurde der Überstand
(Rohextrakt) zum Messen der Aktivität der Transaldolase verwendet.
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Die
Transaldolase Aktivität
in dem Rohextrakt wurde unter Verwendung eines enzymatischen Tests bestimmt,
der optisch mit der Bildung von NAD gekoppelt war. Hierfür wurde
der Rohextrakt in einem Gesamtvolumen von 1 ml enthaltend 0,8 mM
Fructose-6-Phosphat, 6 mM Erythrose-4-Phosphat und 0,4 mM NADH im
Puffer (50 mM Glycylglycerin, pH 8,5, 1 mM Dithiothreitol, 10 mM
MgCl2 und 0,5 mM Thiamindisphosphat) inkubiert.
Das resultierende Glycerinaldehyd-3-Phosphat wurde mit den Enzymen
Triosephosphat Isomerase (9 U) und Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase (3 U), wobei
die Enzyme auch hinzugefügt
wurden, unter der Bildung von NAD umgesetzt. Die Oxidation von NADH
wurde spektrophotometrisch bei 350 nm (ε = 6,3·103l·mol-1·cm-1) überwacht,
wobei die Umwandlung von 1 μmol
NADH äquivalent
ist zu dem Verbrauch von 1 μmol
Fructose-6-Phosphat. Der Umsatz von 1 μmol NADH pro Minute wurde als
1 U definiert.
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Die
Protein Konzentration in Rohextrakten wurde wie bei Bradford (Anal.
Biochem. 72 (1976) 248–254)
beschrieben unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen
Farbreagenzes bestimmt. Rinderserumalbumin wurde als der Standard
verwendet.
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Tabelle
2 zeigt die Ergebnisse der Enzymmessungen, wenn der Wirtsstamm E.
coli AT2471 und seine Mutanten, die eines der Plasmide pZY557, pZY557tal
oder pZY557tkttal tragen, verwendet werden. Am Zeitpunkt der Induktion
wurde gefunden, dass der Wirtsstamm und der Stamm, der den Vektor
pZY557 trägt,
eine Transketolase Aktivität
von ungefähr
0,65 U·(mg
Protein)-1 aufweist. Wie für E. coli
AT2471/pZY557 gezeigt wurde, stieg der Wert in drei Stunden als
das Ergebnis von physiologischem Wachstum auf 0,8 U·(mg Protein)-1. Aufgrund der Abwesenheit des tal Gens
in dem verwendeten Vektor wurde nicht erwartet, dass die Induktion,
die in diesem Experiment durchgeführt wurde, irgendeine Wirkung
besitzen würde.
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In
parallelen experimentellen Mischungen wurde gefunden, dass E. coli
AT2471/pZY557tal Transketolase Aktivitäten von jeweils 0,53 und 0,61
U·(mg
Protein)-1 zum Zeitpunkt der Induktion aufwies.
Während
der Wert für
die Transaldolase Aktivität
in 3 h auf nur 0,6 U·(mg
Protein)-1 anstieg, wenn die Kultur nicht
induziert wurde, erreichte die Transaldolase Aktivität einen
Wert von 1,06 U·(mg
Protein)-1 als ein Ergebnis der Induktion.
In anderen experimentellen Mischungen wurde E. coli AT2471/pZY557tkttal
verwendet, was ansonsten identische Experimente waren; in diesem
Fall war die Transaldolase Aktivität in den ersten 3 h nach dem
Induzieren der Zellen von 0,8 auf 1,16 U·(mg Protein)-1 gestiegen,
was einer Verdopplung der Aktivität im Vergleich zu den entsprechenden
Experimenten unter Verwendung des Wirtsstamms entsprach.
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Beispiel 4
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Herstellung
von Substanzen unter Verwendung von Stämmen die eine erhöhte Transketolase
Aktivität
zusätzlich
zu der erhöhten
Transaldolase Aktivität
zeigen
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Das
Medium, das für
die Wachstumsexperimente eingesetzt wurde, wurde verwendet, um die
synthetische Leistung zu bestimmen. Die Kulturen von E. coli AT2471
und AT2471/pZY557tkttal wurden bei einer optischen Dichte von 1
induziert, und der Zeitraum der Kultur wurde auf 72 h ausgedehnt.
Nach 24 und 48 h wurde der pH-Wert der Kulturen gemessen und falls
notwendig auf den Ausgangswert von 7,2 durch Hinzufügen von
KOH (45%) zurückgebracht.
Zusätzlich
wurden Proben (2 ml) nach 24, 48 und 72 h zum Bestimmen der optischen
Dichte ebenso wie der Konzentrationen von Glucose und L-Phenylalanin entnommen.
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Die
Phenylalanin Konzentration wurde mittels Hochdruckflüssigchromatographie
(HPLC, Hewlett Packard, München,
Deutschland) in Kombination mit Fluoreszenznachweis (Extinktion
335 nm, Emission 570 nm) bestimmt. Eine Nukleosil-120-8-C18 Säule (250·4,6 mm)
wurde als die feste Phase verwendet; die Säule wurde unter Verwendung
eines Gradienten eluiert (Elutionsmittel A: 90 50 mM Phosphorsäure, 10%
Methanol, pH 2,5; Elutionsmittel B: 20% 50 mM Phosphorsäure, 80%
Methanol, pH 2,5; Gradient: 0–8
min. 100% A, 8–13 min.
0% A, 13–19
min. 100% A). Die Elutionsgeschwindigkeit wurde auf 1,0 ml·min-1 eingestellt; die Säulentemperatur wurde auf 40°C eingestellt.
Es wurde eine Postsäulenderivatisierung
unter Verwendung von o-Phthaldialdehyd in einer Reaktionskapillare
(14 m·0,35
mm) bei Raumtemperatur durchgeführt.
Es wurde gefunden, dass L-Phenylalanin eine Retentionszeit von 6,7
min. unter den beschriebenen Bedingungen aufweist.
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Die
Messung der Glucose Konzentration mit Enzymteststreifen (Diabur,
Boehringer Mannheim, Deutschland) und, abhängig von den Ergebnissen, das
anschließende
Hinzufügen
von 2 ml einer konzentrierten Glucose Lösung (500 g· l-1)
stellte sicher, dass keine Glucose Verknappung in den experimentellen
Mischungen auftrat. Nach einer Inkubationszeit von 48 h wurde ein
(Phenylalanin) Indexwert von 119 nach dem Induzieren des Wirtsstamms
E. coli AT2471 erreicht; dies wird mit einem Phenylalaninwert von
100 für
den nicht induzierten Wirtsstamm verglichen. Das einfache Induzieren
des Plasmids pZY557tkttal in den Wirtsstamm wies das Ergebnis auf,
dass sich dieser Indexwert, der die Phenylalanin Konzentration beschreibt,
auf 167 selbst ohne das Induzieren der Zellen erhöhte. Wie
die Experimente zeigen, führte
das Induzieren des Stamms E. coli AT2471/pZY557tkttal zu einer weiteren
Erhöhung
auf einen Wert von 204.
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Dies
entsprach einer Erhöhung
von 71% im Vergleich zu dem induzierten Wirtsstamm.
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Dieses
Ergebnis zeigt die positive erfindungsgemäße Wirkung, wobei die Wirkung
die Synthese von aromatischen Verbindungen erhöht, die zusätzliche Erhöhung der Aktivität einer
Transketolase in Stämmen, die
bereits eine erhöhte
Transaldolase Aktivität
aufweisen oder die zusätzliche
Aktivität
der Transaldolase in Stämmen,
die bereits eine erhöhte
Transketolase Aktivität
aufweisen.
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Beispiel 5
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Herstellung
von Substanzen unter Verwendung von Stämmen mit einer erhöhten Transaldolase
Aktivität
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Die
Mutante E. coli AT2471/pZY557tal wurde in einem Experiment kultiviert,
das ansonsten identisch war zu jenem, das in Beispiel 4 beschrieben
ist. Nach 48 h führte
die Induktion des Stamms zu einem (Phenylalanin) Indexwert von 131,
der mit einem Phenylalaninwert von 100 für den nicht induzierten Stamm
verglichen wird.
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Dieses
Ergebnis zeigt klar die positive Wirkung, welche die erhöhte Aktivität einer
Transaldolase auf die Synthese von aromatischen Substanzen ausübt, insbesondere
nach dem erfindungsgemäßen Induzieren.
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Beispiel 6
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Herstellung von Substanzen
unter Verwendung von PTS- Mutanten in denen
ein PEP-unabhängiges
Zucker-Aufnahme-System exprimiert wird zusätzlich zu einer vorhandenen
erhöhten
Transaldolase Aktivität,
wobei die Transaldolase Aktivität
nach der Induktion des PEP-unabhängigen
Zucker-Aufnahme-Systems erhöht ist
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Das
glf Gen wurde erhalten, wie von Weisser P. et al. (J. Bacteriol.
177 (1995) 3351–54)
unter Verwendung von PCR (Multis K.B. et al., Meth. Enzymol. 155
(1987) 335-50) beschrieben wurde. Die vollständige Nukleotidsequenz dieses
Gens ist verfügbar
(Barnell W.O. et al., J. Bacteriol. 172 (1990) 7227–40). Das
glf Gen wurde unter Verwendung von Plasmid pZY600 als die Matrize
(Weisser P. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 3351–4) amplifiziert.
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Zum
Zweck der Integration des glf Gens in Gene, die Bestandteile des
E. coli PTS Systems kodieren, wurde Plasmid pPTS1 (siehe Tabelle
1) mit BglIII gespalten und mit Klenow Fragment behandelt. Die einzige Schnittstelle
ist in dem ptsI Gen angeordnet. Das glf Gen wurde als ein BamHI-KpnI
Fragment aus Plasmid pBM20glfglk isoliert und genauso mit Klenow
Fragment behandelt. Es wurden Klone erhalten, die das glf in derselben
Orientierung wie die ptsHI Gene durch Ligation der stumpfen Enden
erhalten. Ein 4,6 kB PstI Fragment, das die 3' Region des ptsH Gens und ptsI enthaltend
integriertes glf und crr trägt,
wurde aus dem resultierenden Plasmid pPTSglf erhalten. Dieses Fragment
wurde in die EcoRV Schnittstelle des Vektors pGP704 ligiert. Weil
dieser Vektor nur in der Lage, in λpir Stämmen zu replizieren, wurde
der Vektor in Transformanten in das Chromosom integriert, die diesen
Phagen nicht enthalten, wenn diese Transformanten in der Lage sind, auf
Carbenicillin zu wachsen. Die Integration wurde durch Southern Blot
Analyse (Miller V.L. et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2575–83) überprüft. Die
resultierenden Transformanten enthielten die vollständigen PTS
Gene zusätzlich
zu dem glf Gen.
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Der
Vektorrest kann in einem zweiten homologen Crossover heraus rekombiniert
werden, was zu dem Verlust der Carbenicillin Resistenz führt. Weil
in diesem Fall die pts Gene durch die Insertion des glf Gens zerstört werden,
wird das PTS nicht in einer funktionellen Weise in diesen Mutanten
exprimiert. Die gewünschten PTS- Mutanten wurden wie folgt selektiert: nach
dem Subkultivieren der Transformanten, die immer noch PTS+ waren, einige Mal auf LB Medium ohnel Antibiotika,
Aliquots der Zellsuspension wurden auf LB Platten enthaltend 100 μg· l-1 Phosphomycin ausplattiert. PTS- Mutanten waren in der Lage, auf diesen Platten
zu wachsen. Gewachsene Klone wurden auf LB Platten enthaltend entweder
Phosphomycin oder 20 μg·l-1 Carbenicillin ausgestrichen. Chromosomale
DNA wurde aus Klonen isoliert, die immer noch Wachstum auf den Phosphomycin Platten
zeigten, aber die nicht in der Lage waren, auf den Carbenicillin
Platten zu wachsen. Die Integration des glf Gens in die Gene, die
das PTS System kodieren, wurde durch Southern Analyse bestätigt. Die
korrespondierenden Mutanten wurden als phänotypisch PTS defizient identifiziert.
Ein Klon wurde als der Wirtsorganismus E. coli AT2471glfintPTS- selektiert und für die Transformationen (siehe
oben) mit Plasmid pZY557tal verwendet. Nach den experimentellen
Bedingungen, die für
die Beispiele 4 und 5 beschrieben wurden, wurden die PTS negative
Mutante E. coli AT2471glfintPTS-/pZY557tal
und der korrespondierende Wirtsstamm AT2471glfinPTS- in
jedem Fall in zwei parallelen Mischungen kultiviert, und die Zellen
einer Mischung in jedem Fall wurden nach ungefähr 7 Teilungen induziert.
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Die
Induktion verringerte die synthetische Leistung des Wirtsstamms,
der anfänglich
einen Indexwert von 100 ohne Induktion aufwies, auf einen Wert von
56. Im Vergleich erhöhte
die Induktion den Phenylalanin Indexwert von 73 auf 103 und folglich über den
anfänglichen
Wert für
den Wirtsstamm in Kulturen des transformierten Stammes AT2471 glfintPTS-/pZY557tal.
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Dieses
Ergebnis zeigt, dass das einfache Erhöhen der Transaldolase Aktivität eine positive
Wirkung auf die Synthese von Phenylalanin selbst in solchen Mikroorganismen
aufweist, in denen die Aktivität
des PTS Systems verringert ist oder dieses System vollständig ausgeschaltet
ist und in das, zu derselben Zeit, ein PEP-unabhängiges Zucker-Aufnahme-System
integriert wurde.
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Beispiel 7
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Herstellung von Substanzen
unter Verwendung von PTS- Mutanten, in denen
zusätzlich
zu einer erhöhten Transaldolase
Aktivität
ein PEP-unabhängiges
Aufnahmesystem exprimiert wurde, wobei die Transaldolase Aktivität vor dem
Einführen
des PEP-unabhängigen
Zucker-Aufnahme-Systems erhöht
wurde
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E.
coli AT2471/pZY557tal wurde wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten.
Anschließend
wurde in diesen Stamm ein glf Gen in die Gene integriert, welche
die Bestandteile des PTS Systems von E. coli kodieren. Diese Integration
wurde durchgeführt
wie in Beispiel 6 beschrieben. Unter Verwendung der experimentellen
Bedingungen, die in den Beispielen 4 und 5 beschrieben sind, wurden
diese PTS negativen E. coli AT2471glfintPTS-/pZY557tal
Mutanten kultiviert. Es wurde gefunden, dass die biosynthetische
Leistung der abgeleiteten Mutanten jener der Stämme, die Beispiel 6 beschrieben
sind, entsprach.
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Beispiel 8
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Herstellung von Substanzen
in einem Fermentationsgefäß unter
Verwendung von Stämmen
mit einer erhöhten Transaldolase
Aktivität
und Stämmen
mit einer erhöhten
Transketolase Aktivität
zusätzlich
zu ihrer erhöhten Transaldolase
Aktivität
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Die
Mutanten E. coli AT2471, E. coli AT2471/pZY557tal und E. coli AT2471/pZY557tkttal
wurden in einem Fermentationsgefäß (Reaktorvolumen
15 l) kultiviert. Hierzu wurden zwei Schüttelflaschen (2000 ml) mit dem
Minimalmedium, wie in Beispiel 2 (250 ml) beschrieben, für das Präkultivieren
verwendet. In diesem Verfahren wurde die Glucose Konzentration auf
5,0 g·l-1 verringert. Die Flaschen wurden mit 2
ml Glycerol Kultur inokuliert und auf einem Überkopfschüttler bei 37°C und 150
rpm inkubiert, bis eine optische Dichte (600 nm) von 3 erreicht
war.
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Die
Präkulturen
wurden für
das Inokulieren von 4,5 l Herstellungsmedium verwendet. Dieses enthielt MgSO4·7H2O(0,3 g·l-1),
KH2PO4(3,0 g·l-1), NaCl 0,1 (g·l-1),
(NH4)2SO4(5,0 g·l-1), CaCl2·2H2O(15,0 mg·l-1), FeSO4·7H2O(0,75 g· l-1)
und L-Tyrosin (0,24 g·l-1). Zusätzliche
Mineralien wurden in der Form einer Spurenelement Lösung (1,5
ml·l-1) hinzugefügt, die aus Al2(SO4)3·18H2O (2,0 g· l-1),
CoSO4·6H2O(0,7 g·l-1), CuSO4·5H2O(2,5 g·l-1),
H3BO3(0,5 g·l-1), MnCl2 4H2O(20,0 g·l-1),
Na2MoO4·2H2O(3,0 g·l-1),
NiSO4·3H2O(2,0 g·l-1) und
ZnSO4·7H2O(15,0 g·l-1)
zusammengesetzt war. Vitamin B1 (75,0 mg·l-1)
wurde in Wasser gelöst
und, nachdem es durch Filtration sterilisiert worden war, zu dem
Medium hinzugefügt,
nachdem das zuletzt genannte autoklaviert worden war. Glucose (15
g·l-1) wurde getrennt autoklaviert und genauso
zu dem Medium hinzugefügt,
nachdem das zuletzt genannte autoklaviert worden war. Durch Hinzufügen von
NH4OH (25%) wurde der pH Wert in dem Medium
bei 7 kontrolliert, der Sauerstoffpartialdruck wurde bei einem Wert
von 20% über
die Rührgeschwindigkeit,
das zugeführte
Luftvolumen und den Druck innerhalb des Fermentationsgefäßes kontrolliert.
Durch Hinzufügen
einer Glucose Lösung
(700 g· l-1) wurde die Glucose Konzentration in dem
Kulturmedium bei Werten um ungefähr
5 g·l-1 gehalten. In Abhängigkeit von der Fermentationszeit
wurde L-Tyrosin zu
der Glucose Lösung
in verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt, um eine L-Tyrosin Verknappung
zu vermeiden.
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In
Experimenten, in denen eine Zellinduktion bewirkt wurde, wurde dies
in Übereinstimmung
mit der Erfindung nach 6 Stunden durch Hinzufügen von 50 μM IPTG durchgeführt. Nach
einer Inkubationszeit von 36 Stunden wurde ein (Phenylalanin) Indexwert
von 120 durch einfaches Induzieren des pZY557tal Plasmids erreicht;
dies wurde mit einem (Phenylalanin) Indexwert von 100 für den nicht
induzierten Wirtsstamm E. coli AT2471 verglichen. Durch die erfindungsgemäße Induktion
könnte
dieser Wert weiter auf 153 gesteigert werden. Durch Induzieren des
pZY557tkttal Plasmids alleine und somit Steigern der Transketolase
Aktivität
zusätzlich
zu der Transaldolase Aktivität
könnte
ein (Phenylalanin) Indexwert von 130 im Vergleich zu dem Wirtsstamm
erreicht werden. Die Experimente zeigen weiterhin, dass die Induktion
des Stammes E. coli AT2471/pZY557tkttal eine weitere Erhöhung im
(Phenylalanin) Indexwert auf 250 erlaubt. Dies entspricht einer Erhöhung von
92% im Vergleich zu dem nicht induzierten Stamm.
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Dieses
Ergebnis zeigt, dass selbst in Experimenten, die in Fermentationsgefäßen durchgeführt wurden,
eine Erhöhung
in der Synthese von aromatischen Verbindungen erfindungsgemäß durch
Erhöhen
der Transaldolase Aktivität
ebenso wie durch Erhöhen
der Transketolase Aktivität
in Stämmen,
die bereits eine erhöhte
Transaldolase Aktivität
aufweisen, erreicht werden kann.
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