DE69735192T2

DE69735192T2 - Mikrobische herstellung von substanzen aus dem aromatischen metabolismus / i

Info

Publication number: DE69735192T2
Application number: DE69735192T
Authority: DE
Inventors: Georg Sprenger; Ruth Siewe; Hermann Sahm; Martin Karutz; Theodorus Sonke
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH; Holland Sweetener Co VOF
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH; Holland Sweetener Co VOF
Priority date: 1996-10-26
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2017-10-18
Also published as: AU4727797A; EP0934418A1; CA2269800A1; JP2001506486A; KR20000052825A; US6316232B1; WO1998018936A1; ZA979568B; ES2258787T3; KR100528527B1; EP0934418B1; DE69735192D1; DE19644566A1; CN1256440C; CN1241214A; ATE317015T1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die mikrobielle Herstellung von Substanzen, insbesondere aromatische Aminosäuren, nach den Ansprüchen 1–23, 36 und 37, Genstrukturen nach den Ansprüchen 24–29 und transformierte Zellen nach den Ansprüchen 30–35.
Mikrobiell hergestellte Substanzen, wie Feinchemikalien, insbesondere aromatische Aminosäuren, sind von großem wirtschaftlichen Interesse, wobei der Bedarf von, zum Beispiel Aminosäuren, ständig ansteigt. So wird L-Phenylalanin zum Beispiel für die Herstellung von Medikamenten verwendet und insbesondere auch in der Herstellung des Süßstoffs Aspartam (α-L-Aspartyl-L-Phenylalaninmethylester). L-Tryptophan wird als ein Medikament und als ein Zusatzstoff für Tierfutter benötigt; ähnlich besteht ein Bedarf an L-Tyrosin als ein Medikament und auch als ein Rohmaterial in der pharmazeutischen Industrie. Zusätzlich zu der Isolierung aus natürlichen Materialien ist die biotechnologische Herstellung ein sehr wichtiges Verfahren zum Erhalten von Aminosäuren in der gewünschten optisch aktiven Form unter ökonomisch zu rechtfertigenden Bedingungen. Die biotechnologische Herstellung wird entweder unter Verwendung von Enzymen oder unter Verwendung von Mikroorganismen durchgeführt. Die zuletzt genannte mikrobielle Herstellung erfreut sich des Vorteils, dass einfache und billige Rohmaterialien verwendet werden können. Weil die Biosynthese von Aminosäuren in der Zelle jedoch in einer großen Vielzahl von Wegen kontrolliert wird, wurde bereits eine große Anzahl von Versuchen unternommen, um die Erzeugnisbildung zu steigern. So wurden zum Beispiel Aminosäureanaloga verwendet, um die Regulation der Biosynthese abzuschalten. Es wurden zum Beispiel Mutanten von Escherichia coli, die eine gesteigerte Herstellung von L-Phenylalanin erlauben, durch Selektieren auf Resistenz gegenüber Phenylalaninanaloga (GB-2,053,906) erhalten. Eine ähnliche Strategie führte auch zu überexprimierenden Stämmen von Corynebacterium (JP-19037/1976 und JP-39517/1978) und Bacillus (EP-0,138,526). Darüber hinaus sind Mikroorganismen bekannt, die unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken konstruiert wurden, in denen die Regulation der Biosynthese ebenso aufgehoben wurde, wobei die Gene, die Schlüsselenzyme kodieren, die nicht länger der Feedback Inhibierung unterworfen sind, kloniert und exprimiert wurden. Als ein Prototyp beschreibt die EP-0,077,196 ein Verfahren zur Herstellung von aromatischen Aminosäuren, in dem eine 3-Desoxy-D-arabinoseheptulosonat-7-phosphatsynthase (DAHP Synthase), die nicht länger der Feedback Inhibierung unterworfen ist, in E. coli überexprimiert wird. Die EP-0,145,156 beschreibt einen E. coli Stamm, in dem Chorismatmutase/Prephenatdehydratase zusätzlich zum Zweck der Herstellung von L-Phenylalanin überexprimiert werden.
Ein gemeinsames Merkmal der oben genannten Strategien ist, dass das Eingreifen zur Verbesserung der Herstellung auf den Biosyntheseweg beschränkt ist, der spezifisch für aromatische Aminosäuren ist. Um jedoch die Herstellung noch weiter zu steigern, müssen Anstrengungen unternommen werden, um das Bereitstellen der primären Metaboliten, Phosphoenolpyruvat (PEP) und Erythrose 4-Phosphat (Ery4P) zu verbessern, die für die Herstellung von aromatischen Aminosäuren benötigt werden.
PEP ist ein aktivierter Vorläufer des Glykolyseerzeugnisses Pyruvat; Ery4P ist ein Zwischenprodukt im Pentosephosphatweg.
Es wurden verschiedene Versuche unternommen, um eine spezifische Verbesserung in der Bereitstellung des primären Metaboliten Ery4P zu erreichen. Es wurde ein gesteigerter Fluss von Kohlenstoff durch den Pentosephosphatweg in E. coli durch Ausschalten des Enzyms Phosphoglucoseisomerase erreicht; dies führte dazu, dass Tryptophan gebildet wurde (Mascarenhas D. et al., Appl. Environ. Microbiol. 57 (1991) 2995–99). Die US-A-5,168,056 offenbart, dass die Überexpression einer Transketolase, die durch rekombinante DNA Techniken erreicht wurde, es möglich macht, eine gesteigerte Bereitstellung von Ery4P und, als eine Folge, eine Verbesserung in der Bildung von L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin als Erzeugnisse zu erhalten. Sowohl Draths K.M. et al. (J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 3956–62) als auch Flores N. et al. (Nat. Biotechnol. 14 (1996) 6203) zeigten dieselbe Wirkung. Wie jedoch Feldmann gezeigt hat, führt das einfache Steigern der Aktivität von Transketolase in Zymomonas mobilis Stämmen, denen Transaldolase Aktivität fehlt, zu der Anreicherung von Metaboliten des Pentosephosphatwegs in den Zellen und, als eine Folge, zu negativen Wirkungen auf das Zellwachstum (Feldmann S.D. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 (1992) 354–61 ). Diese physiologische Wirkung kann möglicherweise einer übermäßigen intrazellulären Konzentration an Sedoheptulose-7-Phosphat zugeschrieben werden. Die Erfinder haben auch eine entsprechende Inhibierung von Biomassenwachstum als eine Folge von Transketolase Überexpression im Fall von E. coli tal⁺ Stämmen gefunden.
Die Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Substanzen, insbesondere aromatischen Aminosäuren bereitzustellen, wobei das Verfahren sich durch ein gesteigertes Bereitstellen in intrazellulären metabolischen Zwischenprodukten für die Synthese dieser Substanzen unterscheidet, ohne an den oben beschriebenen Nachteilen der Verfahren zu leiden, wobei die Nachteile die Folge nur der Steigerung der Aktivität der Transketolase sind.
Überraschenderweise wird dieses Ziel erfindungsgemäß durch das Bereitstellen eines Verfahrens für die mikrobielle Herstellung von Substanzen erreicht, wobei in dem Verfahren die Aktivität einer Transaldolase in einem die Substanzen erzeugenden Mikroorganismus erhöht ist, wobei die Aktivität eines Phosphoenolpyruvat (PEP)-abhängigen Zucker-Aufnahme-Systems in diesem Mikroorganismus anwesend, reduziert oder abwesend ist.
Dieses Ergebnis ist insbesondere dahingehend überraschend, dass es in keiner Weise selbstverständlich ist, dass Transaldolasen eine wichtige Rolle im Wachstum von Mikroorganismen und in der Herstellung von Substanzen spielen. Dies trifft insbesondere auf den Fall des Wachstums auf Hexosen zu. So sind zum Beispiel Hefestämme bekannt, die immer noch in der Lage sind, auf Glucose zu wachsen, obwohl sie eine Mutation in dem Transaldolasegen aufweisen (Schaaff L. et al., Eur. J. Biochem. 188 (1990) 597–603). Demzufolge sollte eine Transaldolase keinen wesentlichen Einfluss auf Zellwachstum ausüben. Dies wird unterstützt durch die Tatsache, dass auch bakterielle Spezies bekannt sind, die in der Lage sind, in der Abwesenheit einer Transaldolase zu wachsen (Feldmann S.D. et al., Appl. Mikrobiol. Biotechnol. 38 (1992) 354–62).
Darüber hinaus können Hexosen, wie Glucose, im Gegensatz zu Xylose und anderen Pentosen, auch durch Degradationswege, die von dem Pentosephosphatweg verschieden sind, metabolisiert werden. Es ist deshalb keinesfalls selbstverständlich, dass eine Transaldolase eine essentielle Funktion in der Glucosedegradation aufweist.
Es kann auch bemerkt werden, dass ein gesteigerter Fluss der Enzyme des Pentosephosphatwegs in vitro in Extrakten von Saccharomyces cerevisiae Zellen, in denen die Aktivität einer Transaldolase gesteigert war, gemessen wurde (Senac T. et al., Appl. Environ. Microbiol. 57 (1991) 1701–6). Jedoch erlauben die experimentellen Bedingungen, die in dieser Studie gewählt wurden, keine Übertragung der Ergebnisse auf die natürlichen Phänomene von metabolischer Physiologie, die in lebenden Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, auftreten. Zusätzlich kann bemerkt werden, dass Liao J.C. et al. (Biotechn. Bioeng. 52 (1996) 129–140 gezeigt haben, dass, wenn die Aktivitäten einer Transaldolase und AroG gleichzeitig gesteigert werden, die DAHP Bildung ansteigt. Diese Wirkung wird hauptsächlich der gesteigerten AroG Aktivität zugeschrieben. Eine Steigerung in der Herstellung von Substanzen als ein Ergebnis eines Anstiegs der Transaldolase Aktivität als solche wird nicht offenbart oder angegeben. Es konnte deshalb in keinem Fall erwartet werden, dass es eine kausale Beziehung zwischen einem Anstieg in der Transaldolase Aktivität in Mikroorganismen und dem Bereitstellen von Ery4P für die verbesserte Herstellung von Substanzen gibt.
Die Steigerung der Aktivität (Überexpression) einer Transaldolase in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung stellt ein alternatives Verfahren zum Implementieren eines gesteigerten Flusses von Kohlenstoff durch den Pentosephosphatweg bereit und bewirkt folglich eine verbesserte Bereitstellung des primären Metaboliten Ery4P. Folglich steht eine gesteigerte Menge an Ery4P für die mikrobielle Synthese von Substanzen bereit, in dessen Synthese mindestens ein Zwischenprodukt des Pentosephosphatwegs, und insbesondere Ery4P, involviert ist. Die Erfinder haben gezeigt, dass die verbesserte Verfügbarkeit von Ery4P sowohl in Mikroorganismen auftritt, in denen die Aktivität eines PEP-abhängigen Zucker-Aufnahme-Systems anwesend oder reduziert ist, als auch in Mikroorganismen, in denen eine solche Aktivität abwesend ist. So können erfindungsgemäß nicht nur Organismen, die noch aktive Phosphotransferasesysteme (PTS) oder Phosphotransferasesysteme mit reduzierter Aktivität (pts⁺ Stämme) aufweisen, verwendet werden, sondern auch Organismen, in denen das PTS ausgeschaltet wurde (pts^- Stämme).
Innerhalb der Bedeutung der Erfindung werden unter Substanzen zum Beispiel Feinchemikalien, wie aromatische Aminosäuren, Indigo, Indolessigsäure, Adipinsäure, Melanin, Chinone und Benzoesäure und auch ihre möglichen Derivate und sekundären Erzeugnisse – oder in einer allgemeinen Weise, sekundäre Erzeugnisse von Zwischenprodukten des Pentosephosphatwegs verstanden. Jedoch sollte dies auch all die Verbindungen, zum Beispiel Pyridoxin und seine Derivate, einschließen, deren biochemische Synthese durch das Bereitstellen von Erythrose-4-Phosphat gefördert werden. Innerhalb des Zusammenhangs dieser Erfindung werden all diese Substanzen auch als Substanzen aus dem aromatischen Metabolismus bzw. Aromaten-Metabolismus erachtet. Es kann in diesem Zusammenhang bemerkt werden, dass weitere genetische Veränderungen an den Substanz erzeugenden Mikroorganismen zusätzlich zu den neuen Eingriffen zur Herstellung von Indigo, Adipinsäure und anderen unnatürlichen sekundären Produkten benötigt werden. Dieses erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere für die Herstellung von Substanzen in Mikroorganismen geeignet, die vor der Erhöhung der Transaldolase Aktivität nicht als Stämme mit einem ausgeschalteten Phosphotransferasesystem (pts^- Stämme) aus Stämmen, die zuvor ein Phosphotransferasesystem (pts⁺ Stämme) beinhaltet haben, selektiert wurden. In diesem Zusammenhang kann angemerkt werden, dass die nicht vorveröffentlichte Patentbeschreibung WO-96/34961 eine solche Selektion von zuvor pts⁺ Stämmen beschreibt, aber in dieser Studie geht diese Selektion der Erhöhung der Transketolase oder Transaldolase Aktivität voran.
Bezüglich der Erhöhung der Aktivität einer Transaldolase wird der Erhöhung der Aktivität einer Escherichia coli Transaldolase der Vorzug gegeben, und insbesondere der Aktivität von Escherichia coli Transaldolase B (TalB). Wenn das entsprechende talB Gen verwendet wird, stammt dieses Gen vorzugsweise von Escherichia coli K12 oder von einem Stamm, der davon abgeleitet ist. Neben diesem ist jedoch irgendein Gen ebenfalls geeignet, dessen Genprodukt eine Reaktion katalysiert, die jener von Transaldolase entspricht, dies ist die Umwandlung von Sedoheptulose 7-Phosphat plus Glycerinaldehyd-3-Phosphat in Ery4P und Fructose-6-Phosphat.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die Aktivität einer Transketolase zusätzlich zu der erhöhten Aktivität der Transaldolase erhöht. Bei Anwesenheit von Pentosen führt die Expression eines eigenen Transketolasegens zu der Bildung von Metaboliten im Pentosephosphatweg (Feldmann S.D., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 (1992) 354-61). Dies besitzt eine schädliche Wirkung auf die Zelle und die Ergebnisse, inter alia, dahingehend, dass die transformierten Zellen mit verminderter Geschwindigkeit wachsen. Die Erfinder beobachteten auch eine identische Wirkung im Fall eines Escherichia coli Stammes, der auf Glucose wuchs und der erhöhte Transketolase Aktivität zeigte. Jedoch wurde gefunden, dass die gleichzeitige Erhöhung der Aktivität einer Transketolase zusammen mit einer Transaldolase sehr vorteilhaft für das Bereitstellen von Ery4P ist und nicht die negativen Nebenwirkungen einer alleinigen Überexpression einer Transketolase zeigt. Die Anreicherung von Metaboliten des Pentophosphatwegs, die auftritt, wenn die Aktivität einer Transketolase erhöht ist, zeigt sich folglich als ein Ergebnis der Erhöhung der Aktivität einer Transaldolase nicht, als dessen Ergebnis die Beeinträchtigung im Wachstum der Zellen nicht nur gestoppt sondern sogar in eine Wachstumserhöhung umgewandelt wird. Es zeigt sich deshalb, dass die Erhöhung der Aktivität einer Transketolase insbesondere in Stämmen mit einer erhöhten Aktivität einer Transaldolase erfindungsgemäß eine sinnvolle Maßnahme ist.
Bezüglich der Erhöhung der Aktivität einer Transketolase ist es bevorzugt, die Aktivität einer Escherichia coli Transketolase und insbesondere die Aktivität von Escherichia coli Transketolase A (TktA) zu erhöhen. Wenn das entsprechende tktA Gen verwendet wird, stammt dieses Gen vorzugsweise von Escherichia coli K12 oder von einem Stamm, der davon abgeleitet ist. Zusätzlich dazu ist jedoch jedes Gen ebenso geeignet, dessen Genprodukt eine Reaktion katalysiert, die jener einer Transketolase entspricht, dies bedeutet die Umwandlung von Ribose-5-Phosphat plus Xylulose-5-Phosphat in Sedoheptulose-7-Phosphat plus Glycerinaldehyd-3-Phosphat oder die Umwandlung von Xylulose-5-Phosphat plus Ery4P in Fructose-6-Phosphat plus Glycerinaldehyd-3-Phosphat.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist/sind die Aktivität eines Transportproteins für PEP-unabhängige Aufnahme eines Zuckers und/oder die Aktivität einer Kinase, welche den entsprechenden Zucker phosphoryliert, zusätzlich zu der Erhöhung der Aktivität einer Transaldolase oder der Erhöhung der Aktivität einer Transaldolase und einer Transketolase erhöht. Im Fall des Transportproteins wird die Aktivität dieses Proteins als die Protein vermittelte Aufnahmerate verstanden. Die zusätzliche Erhöhung der Aktivität eines dieser zuletzt genannten Proteine, d.h. des Transportproteins und der Kinase, oder von beiden Protein, macht es möglich, eine noch höhere Bildung von Substanzen zu erreichen, insbesondere aromatische Aminosäuren, aufgrund der Tatsache, dass PEP in erhöhter Menge für die Kondensation mit Ery4P bereitgestellt wird, um die primären Metaboliten des allgemeinen Wegs für die Biosynthese von aromatischen Verbindungen, d.h. Desoxy-D-Arabinoseheptulosonat-7-Phosphat (DAHP) zu bilden.
Es ist ratsam, einen Förderer als das Transportprotein für die PEP-unabhängige Aufnahme eines Zuckers zu verwenden, das heisst ein Transportprotein, das in Übereinstimmung mit dem Prinzip der Protein vermittelten erleichterten Diffusion wirkt. Insbesondere ist es geeignet, das Glucosefördererprotein (Glf) von Zymomonas mobilis zu verwenden. Wenn das zuletzt genannte verwendet wird, wird das Protein kodierende Gen, glf, zum Beispiel aus Z. mobilis ATCC 10988, ATCC 29191 oder ATCC 31821 erhalten. Jedoch sind auch andere bakterielle Zucker-Transport-Gene, deren Genprodukte zum Beispiel Glucose, Fructose oder Sucrose transportieren, und wenn sie dies tun, kein PEP verwenden, zum Beispiel das GalP System aus Escherichia coli, für das neue Verfahren geeignet. Gene für Zucker-Transport-Systeme, wie HXT1 bis HXT7 aus eukaryonten Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis oder Kluyveromyces lactis oder Zucker-Transport-Gene allgemein von anderen Organismen können auch verwendet werden, vorausgesetzt dass sie in einer funktionellen Weise in den Mikroorganismen exprimiert werden können und dass die Genprodukte in diesem Zusammenhang ohne die Verwendung von PEP für den Transport der Zucker wirken. Es ist für sie insbesondere ratsam, dass es ihnen möglich ist, die Zucker-Transport-Gene in Aminosäure bildenden Mikroorganismen (Aminosäurebilder) zu exprimieren.
Es ist deshalb besonders geeignet, das Förderergen glf, isoliert aus Z. mobilis ATCC 31821, zur Aufnahme von Zuckern, wie Glucose, Fructose oder Mannose zu verwenden, wenn aromatische Aminosäuren in Übereinstimmung mit dem neuen Verfahren hergestellt werden (Parker C. et al., Mol. Microbiol. 15 (1995) 795–802; Weisser P. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 3351–4). Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere für die Herstellung von aromatischen Aminosäuren in Mikroorganismen geeignet, in denen das PTS System eine verringerte Aktivität aufweist oder vollständig abwesend ist. In solchen Fällen kann das PTS System verringert oder ausgeschaltet sein, bevor, aber auch nachdem die Transaldolase Aktivität erhöht wurde.
Insbesondere das glf Gen sollte insbesondere in einer geringen Genkopienzahl eingebaut werden, um schädliche Wirkungen auf die Zelle aufgrund von übermäßiger Expression von Membranproteinen zu vermeiden. Deshalb ist eine Genkopienzahl von 2 bis 5 zum Beispiel für das glf Gen bevorzugt. Es ist insbesondere vorteilhaft, das glf Gen in eines der Gene des ptsHI-crr Operons einzubauen, zum Beispiel in das ptsI Gen.
Wenn eine Zucker phosphorylierende Kinase verwendet wird, ist es ratsam eine Hexose phosphorylierende Kinase, vorzugsweise eine Kinase, insbesondere Glucokinase (Glk) aus Zymomonas mobilis zu verwenden. Wenn die zuletzt genannte verwendet wird, stammt das Protein kodierende Gen, glk, zum Beispiel aus Z. mobilis ATCC 10988, ATCC 29191 oder ATCC 31821. Andere Gene für Hexose phosphorylierende Kinasen aus Bakterien, deren Genprodukte Hexosen phosphorylieren während sie ATP verbrauchen, wie eine Fructokinase oder eine Mannokinase sind ebenso für das neue Verfahren geeignet. Darüber hinaus sind Gene für zum Beispiel Kinasen aus eukaryonten Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae oder in einer allgemeinen Weise, Gene für Zucker phosphorylierende Kinasen aus anderen Organismen, ebenso geeignet, vorausgesetzt sie können in einer funktionellen Weise in den Mikroorganismen, insbesondere Aminosäurebildnern exprimiert werden und können ohne PEP zu verwenden wirken, um Zucker zu phosphorylieren. Das Glucokinasegen, glk, zur Phosphorylierung von Glucose, wobei dieses Gen aus Z. mobilis ATCC 29191 isoliert wird, ist besonders für die Herstellung von aromatischen Aminosäuren in Übereinstimmung mit den neuen Verfahren geeignet.
Die Verfügbarkeit von PEP zur Herstellung des ersten Zwischenprodukts des aromatischen Aminosäure Metabolismus kann in Mikroorganismen beschränkt sein, in denen der Materialfluss in Richtung Ery4P erhöht ist. In diesen Fällen kann es vorteilhaft sein, andere PEP verbrauchende Reaktionen im Metabolismus zu verringern oder vollständig auszuschalten, wie die Reaktion des PEP:Zucker-Phosphotransferase-Systems (PTS), das eine PEP abhängige Zuckeraufnahme katalysiert, wenn dieses System anwesend ist. Erfindungsgemäß können beide Organismen, die noch aktive PTS Gene besitzen (pts⁺ Stämme) und, für die weitere Verbesserung des Verfahrens, pts Mutanten, in denen die Aktivität des pts verringert ist (im vorliegenden Fall auch als pts⁺ erachtet) oder in denen das pts ausgeschaltet wurde (pts^- Stämme), verwendet werden. Eine Verringerung dieser Natur kann entweder auf der enzymatischen Ebene oder durch Verwendung genetischer Verfahren, zum Beispiel durch Einbauen eines glf und/oder eines glk Gens in das Chromosom und insbesondere in den Locus des ptsI Gens, einem Verfahren das gleichzeitig die rekombinante DNA im Chromosom stabilisiert (Segregationsstabilität) und folglich bedeutet, dass die Verwendung eines Vektors entbehrlich ist, bewirkt werden. Die Erfahrungen der Erfinder haben gezeigt, dass die Verringerung oder das Ausschalten der Aktivität des PTS vorzugsweise nicht stattfinden sollte bevor die Aktivität der Transaldolase erhöht ist.
Innerhalb der Bedeutung der Erfindung werden Maßnahmen zur Erhöhung der Aktivität verstanden als alle Maßnahmen, die zur Erhöhung der Aktivität der Transaldolase, der Transketolase, des Transportproteins und der Kinase geeignet sind. Die folgenden Maßnahmen sind insbesondere für diesen Zweck geeignet:

– Einführen von Genen, zum Beispiel unter Verwendung von Vektoren oder temperenten Phagen;
– Erhöhen der Genkopienzahl, zum Beispiel unter Verwendung von Plasmiden mit dem Ziel des Einführens der erfindungsgemäßen Gene in die Mikroorganismen mit einer erhöhten Kopienzahl, dies bedeutet einer Kopienzahl, die geringfügig (z.B. von 2 bis 5 fach) erhöht bis stark (z.B. von 15 bis 50 fach) erhöht ist;
– Erhöhen der Genexpression, zum Beispiel durch Erhöhen der Transkriptionsgeschwindigkeit, zum Beispiel unter Verwendung von Promotorelementen, wie Ptac, Ptet oder anderen regulatorischen Nukleotidsequenzen und/oder durch Erhöhen der Translationsgeschwindigkeit, zum Beispiel unter Verwendung einer Konsensus Ribosomenbindestelle;
– Erhöhen der endogenen Aktivität von Enzymen, die anwesend sind, zum Beispiel durch Mutationen, die einer zufälligen Weise durch herkömmliche Verfahren gebildet werden, zum Beispiel unter Verwendung von UV Strahlung oder mutationsauslösenden Chemikalien, oder durch Mutationen, wie Deletion(en), Insertionen) und/oder Nukleotidaustausch(e), die in einer spezifischen Weise unter Verwendung von Genetic Engineering Verfahren gebildet werden;
– Erhöhen der Aktivität von Enzymen durch Verändern der Struktur von Enzymen, zum Beispiel durch Mutagenese unter Verwendung von physikalischen, chemischen oder molekularbiologischen oder anderen mikrobiologischen Verfahren;
– Verwenden deregulierter Enzyme, zum Beispiele Enzyme, die nicht länger einer Feedback Inhibierung unterworfen sind;
– Einführen von korrespondierenden Genen, welche die deregulierten Enzyme kodieren.

Kombinationen der oben genannten Verfahren und andere analoge Verfahren können ebenfalls für die Erhöhung der Aktivität eingesetzt werden. Die endogene oder eingeführte Aktivität von Transportproteinen kann zum Beispiel durch Klonieren des Gens unter Verwendung zum Beispiel der oben genannten Verfahren oder durch Selektieren von Mutanten, die einen erhöhten Transport von Substraten zeigen, erhöht werden.
Vorzugsweise wird die Aktivität durch Integrieren des Gens oder der Gene in eine Genstruktur oder in mehrere Genstrukturen erhöht, wobei jedes Gen oder die Gene in die Genstruktur als (eine) einzelne Kopie(n) oder in einer erhöhten Kopienzahl eingebaut werden.
Innerhalb der Bedeutung der Erfindung wird unter einer Genstruktur ein Gen oder irgendeine andere Nukleotidsequenz verstanden, die erfindungsgemäße Gene trägt. Geeignete Nukleotidsequenzen können zum Beispiel Plasmide, Vektoren, Chromosomen, Phagen oder andere Nukleotidsequenzen sein, die nicht geschlossen zirkulär sind.
Ein Chromosom innerhalb der Bedeutung der Erfindung ist ein Chromosom, in das mindestens ein erfindungsgemäßes Gen eingeführt wurde, wobei die resultierende Nukleinsäuresequenz mindestens ein Gen oder eine Genkopie mehr enthält als natürlich in diesem Chromosom enthalten ist. Andererseits führt zum Beispiel homologe Rekombination innerhalb eines Genlocus zu einem Chromosom, das sich nicht notwendigerweise von der natürlichen Form unterscheiden muss. Die Chromosomen, die durch homologe Rekombination hergestellt werden, werden deshalb nicht als in Übereinstimmung mit der Erfindung erachtet, wenn die natürliche Zahl von homologen Genen nicht überschritten wird.
Innerhalb der Bedeutung der Erfindung wird unter einer Genstruktur auch eine Kombination der oben genannten Genträger, wie Vektoren, Chromosomen und temperente Phagen verstanden, auf welche die erfindungsgemäßen Gene verteilt sind. Zum Beispiel können zwei tal Gene in die Zelle auf einem Vektor eingeführt werden, oder zwei tal Gene können in ein Chromosom eingebaut werden. Zusätzlich kann ein weiteres Gen zum Beispiel in die Zelle unter Verwendung eines Phagen eingeführt werden. Dasselbe gilt für die anderen erfindungsgemäßen Gene. Diese Beispiele sollen andere Kombinationen von Genverteilungen von der Erfindung nicht ausschließen. In jedem Fall ist es wesentlich, dass die Zahl der Gene, die in dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus enthalten sind, die natürliche Zahl der entsprechenden Gene überschreitet. Vorzugsweise wird die Zahl der glf Gene zum Beispiel durch einen Faktor von 2 bis 5 erhöht sein, um die erfindungsgemäße Aktivitätserhöhung zu erreichen. Bei diesen Konzentrationen wird keine zelltoxische Wirkung auftreten. Jedoch ist es auch vorgesehen, die erfindungsgemäßen Gene in die Mikroorganismen in einer höheren Kopienzahl von bis 50 Genkopien in einer Form mit demselben Effekt einzuführen.
In dem neuen Verfahren zur Herstellung von Substanzen, wird der Verwendung von Mikroorganismen der Vorzug eingeräumt, in denen eines oder mehrere Enzyme, die zusätzlich in die Synthese von Substanzen involviert sind, dereguliert ist/sind und/oder eine erhöhte Aktivität aufweist/aufweisen.
Diese Enzyme sind insbesondere die Enzyme des aromatischen Aminosäure Metabolismus und insbesondere DAHP Synthase, Shikimatkinase und Chorismatmutase/Prephenatdehydratase, und auch alle anderen Enzyme, die in die Synthese von Zwischenprodukten des aromatischen Metabolismus und ihrer sekundären Produkte involviert sind.
Neben den erfindungsgemäßen Enzymen ist die Deregulierung und Überexpression von DAHP Synthase insbesondere wichtig für die Herstellung von Substanzen, wie Adipinsäure, Gallensäure und Chinonverbindungen und ihrer Derivate. Zusätzlich sollte Shikimatkinase dereguliert und ihre Aktivität erhöht sein, um eine noch weiter gesteigerte Synthese von zum Beispiel Tryptophan, Tyrosin, Indigo und Derivaten von Hydroxybenzoesäure und Aminobenzoesäure und Naphthochinonen und Anthrachinonen und auch ihrer sekundären Produkte zu erreichen. Deregulierte und überexprimierte Chorismatmutase/Prephenatdehydratase ist zusätzlich von besonderer Wichtigkeit für die wirksame Herstellung von Phenylalanin und Phenylbrenztraubensäure und ihren Derivaten. Jedoch ist es beabsichtigt, dass sie alle anderen Enzyme umfassen, deren Aktivitäten zu der biochemischen Synthese von Substanzen beitragen, dies bedeutet Verbindungen, deren Herstellung durch die Bereitstellung von Erythrose-4-Phosphat gefördert wird, zum Beispiel Pyridoxin und seine Derivate. Es kann angemerkt werden, dass weitere genetische Veränderungen an den Substanz bildenden Organismen, zusätzlich zu dem neuen Eingreifen, benötigt werden zum Zweck der Herstellung von Indigo, Adipinsäure und anderen unnatürlichen sekundären Produkten.
Das neue Verfahren ist insbesondere für die Herstellung von aromatischen Aminosäuren, insbesondere Phenylalanin geeignet. In dem zuletzt genannten Fall ist die Genexpression und/oder die Enzymaktivität einer deregulierten DHAP Synthase (z.B. in E. coli AroF oder AroH) und/oder einer genauso deregulierten Chorismatmutase/Prephenatdehydratase (PheA) vorzugsweise erhöht.
Escherichia Spezies und auch Mikroorganismen der Genera Serratia, Bacillus, Corynebacterium oder Brevibacterium und andere Stämme, die von herkömmlichen Aminosäure Verfahren bekannt sind, sind zur Verwendung als Herstellungsorganismen geeignet. Escherichia coli ist besonders geeignet.
Es ist eine andere Aufgabe der Erfindung, geeignete Genstrukturen und transformierte Zellen, die diese Genstrukturen tragen, bereitzustellen, die es erlauben, das Verfahren in einer besonders erfolgreichen Weise auszuführen. Innerhalb des Zusammenhangs der Erfindung werden jetzt neue Genstrukturen bereitgestellt, wobei die Genstrukturen in rekombinanter Form a) ein Gen kodierend eine Transaldolase oder ein Gen kodierend eine Transaldolase und ein Gen kodierend eine Transketolase, und b) mindestens ein Gen kodierend ein Transportprotein für die PEP-unabhängige Aufnahme eines Zuckers oder kodierend eine Kinase, die einen Zucker phosphoryliert, enthalten. In diesen Genstrukturen ist es bevorzugt, dass das Gen für das Transportprotein einen Förderer kodiert und dass das Gen für die Kinase eine Hexose phosphorylierende Kinase kodiert. Insbesondere stammen die Gene für die Transaldolase und die Transketolase von Escherichia coli, und die Gene für das Transportprotein und die Kinase stammen von Zymomonas mobilis.
Genstrukturen sind besonders vorteilhaft, in denen das Gen für die Transaldolase Escherichia coli talB und das Gen für Transketolase Escherichia coli tktA ist, während das Gen für das Transportprotein Zymomonas mobilis glf und das Gen für die Kinase Zymomonas mobilis glk ist.
Die geeigneten Gene werden isoliert, und die Zellen werden transformiert, in Übereinstimmung mit gegenwärtigen Verfahren: die vollständigen Nukleotidsequenzen der taB und tktA Gene von Escherichia coli K12 sind bekannt (Yura T. et al., Nucl. Acid Res. 20 (1992) 3305-8; Sprenger G.A., Biochim. Biophys. Acta 1216 (1993) 307–10; Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 5930–9) und in Datenbanken, wie jener des EMBL in Heidelberg hinterlegt. Wenn das Escherichia coli talB Gen kloniert wird, ist das Verfahren der Polymerase Kettenreaktion (PCR) zum Beispiel geeignet, um das Gen spezifisch unter Verwendung von chromosomaler DNA aus Escherichia coli K12 Stämmen zu amplifizieren (Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 5930–9). Die homologe Komplementierung einer Transketolase defizienten Mutante ist zum Beispiel geeignet, wenn das Escherichia coli tktA Gen kloniert wird (Sprenger G.A. in: Bisswanger N. et al., Biochemistry and physiology of thiamine diphosphate enzymes, VCH (1991) 322–6).
Wenn zum Beispiel das Zymomonas mobilis Transportgen glf oder das Zymomonas mobilis Glucokinase Gen glk kloniert wird, ist zum Beispiel die PCR für das spezifische Amplifizieren des Gens unter Verwendung von chromosomaler DNA aus Zymomonas mobilis Stämmen ATCC 29191 oder ATCC 31821 geeignet, ebenso wie die heterologe Komplementierung von Escherichia coli Mutanten, die in PTS Funktionen defizient sind und die deshalb nicht in der Lage sind, zum Beispiel Glucose zu transportieren (Snoep J.L. et al., J. Bacteriol. 174 (1994) 1707–8; Parker C. et al., Mol. Microbiol. 15 (1995) 795-82; Weisser P. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 3351–4). Nach dem Isolieren der Gene und ihrer in vitro Rekombination mit Vektoren mit niedriger Kopienzahl, wie pACYC184, pACYC177, pSC101 oder pZY507 (Weisser P. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 3351–4) wird die Wirtszelle unter Verwendung chemischer Verfahren, Elektroporation, Konjugation oder Transduktion transformiert.
Das isolierte Transaldolase Gen kann zusammen mit einem oder mehreren der Gene, die innerhalb des Zusammenhangs der Erfindung beschrieben wurden, in irgendeiner Kombination in eine Genstruktur oder in mehrere Genstrukturen integriert werden. Ohne die exakte Allokation der Genstrukturen zu betrachten, führt dies zu Kombinationen wie taB, taB + tktA, taB + glf, taB + glk, taB + glf + glk, talB + tktA + glf, taB + tktA + glk oder talB + tktA + glf + glk.
Genstrukturen sind vorteilhaft, die mindestens eine regulatorische Gensequenz enthalten, die einem der Gene zugewiesen ist. Somit kann die Wiederherstellung von regulatorischen Elementen vorzugsweise auf der Ebene der Transkription durch insbesondere Wiederherstellen der Transkriptionssignale bewirkt werden. Dies kann zum Beispiel durch Erhöhen der Aktivität des Promotors oder der Promotoren durch Verändern der Promotorsequenzen, die oberhalb der Strukturgene angeordnet sind oder durch vollständiges Austauschen der Promotoren gegen wirksamere Promotoren bewirkt werden. Die Transkription kann auch wiederhergestellt werden durch das Ausüben eines entsprechenden Einflusses auf ein regulatorisches Gen, das den Genen zugewiesen ist; zusätzlich dazu ist es jedoch auch möglich, die Translation durch zum Beispiel das Verbessern der Stabilität der Messenger RNA (mRNA) wiederherzustellen.
Die geeignetesten Genstrukturen sind jene, in denen mindestens eines der beschriebenen Gene derart eingebaut ist, dass es unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht. Wenn die Gene in einer erfindungsgemäßen Genstruktur angeordnet sind, kann ein Promotor oberhalb eines Gens angeordnet sein, oder er kann als ein gemeinsamer Promotor oberhalb von mehreren Genen angeordnet sein, oder zwei entgegengesetzte Promotoren können verwendet werden, zwischen denen die Gene derart angeordnet sind, dass sie in entgegengesetzten Richtungen gelesen werden. In diesem Zusammenhang kann zum Beispiel das glf Gen oberhalb eines relativ schwachen Promotors (z.B. Ptet) angeordnet sein, und andere Gene können unter der Kontrolle des tac Promotors stehen. Eine oder mehrere DNA Sequenzen können oberhalb und/oder unterhalb der Gene, die in einer Genstruktur enthalten sind, mit oder ohne einem oberhalb gelegenen Promotor oder mit oder ohne einem zugeordneten regulatorischen Gen, angeordnet sein. Durch die Verwendung von induzierbaren Promotorelementen, z.B. lacI^q/Ptac, ist es möglich, neue Funktionen (Induktion von Enzymsynthese) zum Beispiel durch das Hinzufügen von chemischen Auslösern, wie Isopropylthiogalactosid (IPTG) anzuschalten.
Das Ziel der Erfindung wird auch durch das Bereitstellen transformierter Zellen erreicht, die eine erfindungsgemäße Genstruktur in replizierbarer Form enthalten.
Innerhalb der Bedeutung der Erfindung wird unter einer transformierten Zelle ein Mikroorganismus verstanden, der eine erfindungsgemäße Genstruktur trägt, wobei die Genstruktur der Zelle die erhöhte Bildung von Substanzen verleiht. Die Wirtszellen können durch chemische Verfahren transformiert werden (Hanahan D., J. Mol. Biol. 166 (1983) 557–580) und auch durch Elektroporation, Konjugation oder Transduktion.
Für die Transformation ist es vorteilhaft, Wirtszellen zu verwenden, in denen eine oder mehrere Enzyme, die zusätzlich in die Synthese der Substanzen involviert ist/sind, dereguliert ist/sind und/oder eine erhöhte Aktivität besitzt/besitzen. Ein Mikroorganismusstamm, insbesondere Escherichia coli, der eine aromatische Aminosäure und eine andere erfindungsgemäße Substanz bildet, wird mit der Genstruktur transformiert, welche die relevanten Gene enthält. Für die Transformation mit den Genstrukturen ist es vorteilhaft, Wirtszellen zu verwenden, in denen die Aktivität des PEP-abhängigen Zucker-Aufnahme-Systems, wenn es anwesend ist, verringert oder ausgeschaltet ist.
Insbesondere werden transformierte Zellen bereitgestellt, die in der Lage sind, eine aromatische Aminosäure bereitzustellen, wobei die aromatische Aminosäure vorzugsweise L-Phenylalanin ist.
Unter Verwendung des neuen Verfahrens und des Mikroorganismus, der in Übereinstimmung mit der Lehre der Erfindung transformiert wurde, kann ein breites Spektrum von Substraten für die Herstellung von Substanzen eingesetzt werden. Innerhalb des Zusammenhangs der Erfindung wird folglich auch ein Verfahren für die mikrobielle Herstellung von Substanzen bereitgestellt, in dem Zellen, die in Übereinstimmung mit der Erfindung transformiert wurden und in denen eine Genstruktur anwesend ist, die mindestens eine regulatorische Gensequenz enthält, die einem der Gene zugewiesen ist, kultiviert werden, wobei die Enzymsynthese in dem Mikroorganismus nach mindestens zwei Zellteilungen induziert wird (am Beginn der exponentiellen Wachstumsphase). Folglich kann die Herstellung der Mikroorganismen unabhängig von ihrem Wachstum erhöht werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des neuen Verfahrens werden transformierte Zellen verwendet, die zusätzlich zu den Zwischenprodukten des Pentosephosphatwegs auch eine erhöhte Verfügbarkeit von anderen Metaboliten des zentralen Metabolismus enthalten. Diese Metabolite schließen zum Beispiel Pyruvat aus der Glykolyse oder Gluconeogenese oder Oxalacetat aus dem Zitronensäurezyklus ein. Darüber hinaus kann die relevante Verbindung oder ihre Vorläufer, dies sind die Vorläufer von Pyruvat oder von Metaboliten des Zitronensäurezyklus, wie Fumarat oder Malat den wachsenden Zellen durch Füttern zur Verfügung gestellt werden.
Die Erfindung wird unten detaillierter mit der Hilfe von wenigen Einführungsbeispielen beschrieben. Die folgenden Stämme wurden bei DSM unter den Bedingungen des Budapester Abkommens hinterlegt:
DSM 11210 Escherichia coli AT2471/pZYTT7tal
DSM 11209 Escherichia coli AT2471/pZY557tkttal
DSM 11206 Escherichia coli AT2471 GP704glfint PTS⁺
DSM 11205 Escherichia coli AT2471 glfint PTS^-
Der verwendete Wirtsorganismus, d.h. AT2471 wurde von Taylor und Trotter (Bacteriol. Rev. 13 (1967) 332–353) in der CGSC unter der Nummer 4510 hinterlegt und ist frei zugänglich.
Die Merkmale und die Herkunft aller im Zusammenhang mit dieser Patentanmeldung verwendeter Organismen sind detailliert in Tabelle 1 beschrieben.
Der folgende Text beabsichtigt, die verwendeten Materialien und Verfahren anzugeben und die Erfindung mit experimentellen Beispielen und Vergleichsbeispielen zu unterstützen:
Allgemeine Verfahren
In den genetischen Studien wurden Stämme von E. coli, außer es ist anders angegeben, auf LB Medium bestehend aus Difco Bactotrypton (10 g·l^-1), Difco Hexeextrakt (5 g·l^-1) und NaCl (10 g·l^-1) kultiviert. In Abhängigkeit von Resistenzeigenschaften der verwendeten Stämme wurde/wurden Carbenicillin (20–100 mg·l^-1) und/oder Chloramphenicol (17 – 34 mg·l^-1) zu dem Medium, falls notwendig, hinzufügt. Hierfür wurde Carbenicillin zunächst in Wasser gelöst, und Chloramphenicol in Ethanol, und die Lösungen wurden, nachdem sie durch Filtration sterilisiert wurden, zu dem zuvor autoklavierten Medium hinzugefügt. Difco Bactoagar (1,5%) wurde zu dem LB Medium zur Herstellung von Agarplatten hinzugefügt. Plasmid DNA wurde aus E. coli mittels alkalischer Lyse unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Systems (Qiagen, Hilden) isoliert. Chromosomale DNA wurde aus E. coli und Z. mobilis, wie von Chen und Kuo beschrieben, isoliert (Nucl. Acid Res. 21 (1993) 2260).
Restriktionsenzyme, DNA Polymerase I, alkalische Phosphatase, RNase und T4 DNA Ligase wurden gemäß den Angaben der Hersteller (Boehringer, Mannheim, Deutschland oder Promega, Heidelberg, Deutschland) verwendet. Für die Restriktionsanalyse wurden die DNA Fragmente in Agarosegelen (0,8%) aufgetrennt und aus der Agarose durch Extraktion unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Systems isoliert (Jetsorb Genomed, Bad Oeynhausen, Deutschland).
Für die Southern Analysen wurde chromosomale DNA (10 μg) mit Restriktionsenzymen gespalten, nach der Größe durch Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Nylonmembran (Nytran 13, Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) mittels Vakuum vermittelter Diffusion transferiert (VacuGene System, Pharmacia, Freiburg, Deutschland). Geeignete DNA Fragmente wurden isoliert, mit Digoxigenin-dUTP markiert und als Sonden verwendet. Die Markierung, Hybridisierung, Waschverfahren und der Nachweis wurden mit Hilfe eines kommerziell verfügbaren Markierungs- und Nachweissystems durchgeführt (Boehringer, Mannheim, Deutschland).
Für die Transformation wurden die Zellen bei 37°C und 200 rpm für 2,5–3 h in LB Medium (5 ml Röhrchen) inkubiert. Bei einer optischen Dichte (620 nm) von ungefähr 0,4 wurden die Zellen abzentrifugiert und in einem Zehntel des Volumens in TSS (LB Medium enthaltend 10% (w/v) PEG 8000, 5% (v/v) DMSO und 50 mM MgCl₂) aufgenommen. Nach einer 30 Minuten Inkubation bei 4°C mit von 0,1 bis 100 ng DNA und anschließender Inkubation bei 37°C für 1 h wurden die Zellen auf LB Medium enthaltend ein geeignetes Antibiotikum ausplattiert.
Beispiel 1
Herstellung von pZY557tal, pBM20tal und pZY557tkttal als Prototypen von erfindungsgemäßen Plasmid basierten Genstrukturen, und von pZY557tkt
Das Plasmid pZY507 (Weisser et al. 1995 J. Bacteriol. 177:3351–3345) wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI und HindIII geöffnet, und das größere Fragment (10,1 kB der DNA) wurde isoliert. Ein Teil der multiplen Klonierungsstelle wurde aus dem Vektor pUCBM20 (Boehringer, Mannheim, Deutschland) unter Verwendung von BamHI und HindIII ausgeschnitten und in das größere pZY5078amHI/HindIII Fragment ligiert, was zu dem Vektor pZY557 führte, der dem Vektor pZY507 gleicht, mit Ausnahme der anderen Restriktionsschnittstellen. Das talB Gen wurde aus dem Vektor pGSJ451 (Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 5930–36) mit Hilfe von PCR amplifiziert. Hierfür wurde das Oligonukleotid I: 5' CCGATGCTGTTTAAAGAGAAATA 3' (die hier unterstrichenen Basenpaare entsprechen den Basenpaaren 84 bis 101 der talB Sequenz aus Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 5930–6), das mit einer Schnittstelle für das Restriktionsenzym SphI versehen war, und der kommerziell erhältliche M13/pUC Sequenzierprimer (Nr. 1010093, Boehringer Mannheim, Deutschland) als Oligonukleotid II verwendet. Das resultierende amplifizierte DNA Fragment enthält eine Schnittstelle für SphI an jedem Ende und wurde mit dem Restriktionsenzym SphI gespalten. Dieses Fragment wurde anschließend jeweils in die Vektoren pZY557 und pUCBM20 ligiert, wobei die Vektoren auch mit SphI linearisiert wurden. Jeweils die rekombinanten Plasmide pZY557tal und pBM20tal wurden nach dem Transformieren von E. coli mit den zwei Ligationslösungen und dem Klonieren der Transformanten erhalten. Das tktA Gen wurde durch PCR aus dem Vektor pGSJ427 (Sprenger G.A. et al., Eur. J. Biochem. 230 (1995) 525–32) amplifiziert, wobei eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym NotI an dem 5' Ende und eine Schnittstelle für das Enzym SphI an dem 3' Ende eingeführt wurde. In diesem Fall wurde das Oligonukleotid III verwendet: 5' TTAGCGGCCGCCCTTCATCATCCGATCT 3' (die hier unterstrichenen Basenpaare entsprechen den Basenpaaren 126 bis 146 der tktA Sequenz aus Sprenger G.A., Biochim. Biophys. Acta. 1216 (1993) 307–10), das mit einer Schnittstelle für das Restriktionsenzym NotI versehen war, und IV: 5' ATAGCATGCTAATTACAGCAGTTC 3' (die hier unterstrichenen Basenpaare entsprechen den Basenpaaren 2018–2036 der tktA Sequenz aus Sprenger G.A., Biochim. Biophys. Acta. 1216 (1993) 307–10), das mit einer Schnittstelle für SphI versehen wurde. Das resultierende PCR Fragment wurde mit NotI und SphI gespalten und in den Vektor pZY557tkt ligiert, der in derselben Weise behandelt wurde, was zu dem Vektor pZY557tkt führte. pZY557tkt wurde anschließend mit SphI geöffnet und mit dem SphI gespaltenen PCR Fragment enthaltend taB ligiert. Nach dem Transformieren von E. coli und dem Klonieren der Transformanten (siehe oben) wurden Plasmide erhalten, die das tktA Gen und das talB Gen in derselben Richtung orientiert unterhalb des tac Promotors enthielten und die anschließend als Genstruktur pZY557tkttal verwendet wurden.
Die resultierenden Transformanten wurden bei -80°C auf LB Medium in der Form von Glycerolkulturen (30%) gelagert. Wenn sie benötigt wurden, wurden die Glycerolkulturen direkt vor der Verwendung aufgetaut.
Beispiel 2
Wirkung der erhöhten Aktivität einer Transaldolase auf das Wachstum von Stämmen, in denen Transketolase Aktivität auch erhöht ist
Das Wachstum der E. coli Stämme AT2471, AT2471/pZY557tkt, AT2471/pZT557tal und AT2471/pZY557tkttal auf Glucose wurde in Mineralmedium untersucht. Dieses bestand aus Na Citrat·3H₂O(1,0 g·l^-1), MgSO₄·7H₂O(0,3 g·l^-1), KH₂PO₄(3,0 g·l^-1), K₂HPO₄(12,0 g·1^-1), NaCl(0,1 g·1^-1), (NH₄)₂SO₄(5,0 g·l^-1), CaCl₂·2H₂O(15,0 mg·l^-1), FeSO₄·7H₂O(0,75 g·l^-1) und L-Tyrosin (0,04 g·l^-1). Zusätzliche Mineralien wurden in der Form von Spurenelementlösung (1 ml·l^-1) hinzugefügt, die aus Al₂(SO₄)₃·18H₂O(2,0 g·l^-1), CoSO₄·6H₂O(0,7 g·l^-1), CuSO₄·5H₂O(2,5 g·l^-1), H₃BO₃(0,5 g·l^-1), MnCl₂· 4H₂O(20,0 g·l^-1), Na₂MoO₄·2H₂O(3,0 g·l^-1), NiSO₄·3H₂O(2,0 g·l^-1) und ZnSO₄·7H₂O(15,0 g·l^-1) zusammengesetzt war. Vitamin B1(5,0 mg·l^-1) wurde in Wasser gelöst und, nachdem es durch Filtration sterilisiert wurde, zu dem Medium hinzugefügt, nachdem das zuletzt genannte autoklaviert wurde, ebenso wie Carbenicillin und/oder Carbenicillin und Chloramphenicol, wenn die Notwendigkeit bestand. Glucose (30 g·l^-1) wurde getrennt autoklaviert und in gleicher Weise zu dem Medium hinzugefügt, nachdem das zuletzt genannte autoklaviert worden war.
Für die Experimente wurden Schüttelflaschen (1000 ml enthaltend 100 ml Minimalmedium) mit 2 ml Glycerolkultur inokuliert und bei 37°C und 150 rpm für 72 h auf einem Überkopfschüttler inkubiert. Nachdem eine optische Dichte (620 nm) von ≈ 1 erreicht war, wurden die Zellen durch Hinzufügen von 15–100 μM IPTG induziert. Die optische Dichte der Kultur wurde in regelmäßigen Intervallen bis zu diesem Punkt gemessen. Unter den oben beschriebenen Bedingungen erreichte der Wirtsorganismus E. coli AT2471 eine optische Dichte von 1,2 nach 7,25 h. Die Erhöhung in der Aktivität der Transketolase in mutantem AT2471/pZY557tkt führte zu einer merklichen Reduktion der Wachstumsgeschwindigkeit; während er eine identische optische Dichte zu Beginn des Experiments aufwies, erreichte dieser Stamm nur eine optische Dichte von 0,49 nach 7,25 h. Die wachstumsinhibierende Wirkung ist wahrscheinlich der Synthese von inhibitorischen Konzentrationen von metabolischen Zwischenprodukten des Pentosephatwegs zuzuweisen.
Die Erhöhung in der Aktivität der Transaldolase in der Mutante AT2471/pZY557tal führte auch zu einer spürbaren Reduktion (fast genauso spürbar wie im Fall der Transketolase) in der Wachstumsgeschwindigkeit; eine optische Dichte von 0,52 wurde nach 7,25 h erreicht. Es war möglich, eine optische Dichte von 1,1 nach 7,25 h durch Erhöhen der Aktivität der Transaldolase zusätzlich zu jener der Transketolase zu erreichen, wie in E. coli AT2471/pZY557tkttal bewirkt wurde. Dieses Ergebnis macht deutlich, dass das zusätzliche Erhöhen der Aktivität einer Transaldolase in einem Stamm mit einer erhöhten Aktivität an Transketolase die negative Wirkung der alleinigen Erhöhung der Aktivität der Transketolase zunichte macht und nahezu ungehindertes Wachstum erlaubt.
Beispiel 3
Bestimmung der Enzymaktivitäten der Transaldolase
Um die Aktivität der Transaldolase zu bestimmen, wurden Zellen von E. coli AT2471, AT2471/pZY507, AT2471/pZY557tal und AT2471/pZY557tkttal wie oben beschrieben kultiviert, wobei jedoch 3-(Morpholin)propan-sulfonsäure (MOPS, 16,7 g·l^-1) zu dem Medium hinzugefügt und die Phosphat Konzentration auf ein Zehntel der Konzentration erniedrigt wurde, die in den Wachstumsexperimenten verwendet wurde. Um die Induktion der Zellen zu überprüfen, wurden parallele experimentelle Mischungen aufgestellt, von denen eine Mischung durch Hinzufügen von IPTG (20 μM) nach 7 Zellteilungen (OD ≈ 1) induziert wurde. 20 ml der Kulturbrühe wurde von all den Mischungen direkt vor dem Hinzufügen des Induktors zu den relevanten Flaschen entfernt, und 3 Stunden nach der Induktionszeit wurden die Zellen bei 6000 g für 10 min. bei 4°C sedimentiert.
Die geernteten Zellen wurden in 50 mM Glycylglycin Puffer, pH 8,5 enthaltend 1 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl₂ und 0,5 mM Thiamindisphosphat gewaschen. Die Zellen in dem Sediment wurden durch Ultraschallbehandlung (Branson 250 Sonifier, ausgestattet mit einer Mikrospitze) in einem Schallzyklus von 25% und bei einer Intensität von 40 Watt für 4 min. pro ml Zellsuspension zerstört. Nach dem Zentrifugieren bei 18.000 g für 30 min. bei 4°C wurde der Überstand (Rohextrakt) zum Messen der Aktivität der Transaldolase verwendet.
Die Transaldolase Aktivität in dem Rohextrakt wurde unter Verwendung eines enzymatischen Tests bestimmt, der optisch mit der Bildung von NAD gekoppelt war. Hierfür wurde der Rohextrakt in einem Gesamtvolumen von 1 ml enthaltend 0,8 mM Fructose-6-Phosphat, 6 mM Erythrose-4-Phosphat und 0,4 mM NADH im Puffer (50 mM Glycylglycerin, pH 8,5, 1 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl₂ und 0,5 mM Thiamindisphosphat) inkubiert. Das resultierende Glycerinaldehyd-3-Phosphat wurde mit den Enzymen Triosephosphat Isomerase (9 U) und Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase (3 U), wobei die Enzyme auch hinzugefügt wurden, unter der Bildung von NAD umgesetzt. Die Oxidation von NADH wurde spektrophotometrisch bei 350 nm (ε = 6,3·10³l·mol^-1·cm^-1) überwacht, wobei die Umwandlung von 1 μmol NADH äquivalent ist zu dem Verbrauch von 1 μmol Fructose-6-Phosphat. Der Umsatz von 1 μmol NADH pro Minute wurde als 1 U definiert.
Die Protein Konzentration in Rohextrakten wurde wie bei Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976) 248–254) beschrieben unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Farbreagenzes bestimmt. Rinderserumalbumin wurde als der Standard verwendet.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Enzymmessungen, wenn der Wirtsstamm E. coli AT2471 und seine Mutanten, die eines der Plasmide pZY557, pZY557tal oder pZY557tkttal tragen, verwendet werden. Am Zeitpunkt der Induktion wurde gefunden, dass der Wirtsstamm und der Stamm, der den Vektor pZY557 trägt, eine Transketolase Aktivität von ungefähr 0,65 U·(mg Protein)^-1 aufweist. Wie für E. coli AT2471/pZY557 gezeigt wurde, stieg der Wert in drei Stunden als das Ergebnis von physiologischem Wachstum auf 0,8 U·(mg Protein)^-1. Aufgrund der Abwesenheit des tal Gens in dem verwendeten Vektor wurde nicht erwartet, dass die Induktion, die in diesem Experiment durchgeführt wurde, irgendeine Wirkung besitzen würde.
In parallelen experimentellen Mischungen wurde gefunden, dass E. coli AT2471/pZY557tal Transketolase Aktivitäten von jeweils 0,53 und 0,61 U·(mg Protein)^-1 zum Zeitpunkt der Induktion aufwies. Während der Wert für die Transaldolase Aktivität in 3 h auf nur 0,6 U·(mg Protein)^-1 anstieg, wenn die Kultur nicht induziert wurde, erreichte die Transaldolase Aktivität einen Wert von 1,06 U·(mg Protein)^-1 als ein Ergebnis der Induktion. In anderen experimentellen Mischungen wurde E. coli AT2471/pZY557tkttal verwendet, was ansonsten identische Experimente waren; in diesem Fall war die Transaldolase Aktivität in den ersten 3 h nach dem Induzieren der Zellen von 0,8 auf 1,16 U·(mg Protein)^-1 gestiegen, was einer Verdopplung der Aktivität im Vergleich zu den entsprechenden Experimenten unter Verwendung des Wirtsstamms entsprach.
Beispiel 4
Herstellung von Substanzen unter Verwendung von Stämmen die eine erhöhte Transketolase Aktivität zusätzlich zu der erhöhten Transaldolase Aktivität zeigen
Das Medium, das für die Wachstumsexperimente eingesetzt wurde, wurde verwendet, um die synthetische Leistung zu bestimmen. Die Kulturen von E. coli AT2471 und AT2471/pZY557tkttal wurden bei einer optischen Dichte von 1 induziert, und der Zeitraum der Kultur wurde auf 72 h ausgedehnt. Nach 24 und 48 h wurde der pH-Wert der Kulturen gemessen und falls notwendig auf den Ausgangswert von 7,2 durch Hinzufügen von KOH (45%) zurückgebracht. Zusätzlich wurden Proben (2 ml) nach 24, 48 und 72 h zum Bestimmen der optischen Dichte ebenso wie der Konzentrationen von Glucose und L-Phenylalanin entnommen.
Die Phenylalanin Konzentration wurde mittels Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC, Hewlett Packard, München, Deutschland) in Kombination mit Fluoreszenznachweis (Extinktion 335 nm, Emission 570 nm) bestimmt. Eine Nukleosil-120-8-C18 Säule (250·4,6 mm) wurde als die feste Phase verwendet; die Säule wurde unter Verwendung eines Gradienten eluiert (Elutionsmittel A: 90 50 mM Phosphorsäure, 10% Methanol, pH 2,5; Elutionsmittel B: 20% 50 mM Phosphorsäure, 80% Methanol, pH 2,5; Gradient: 0–8 min. 100% A, 8–13 min. 0% A, 13–19 min. 100% A). Die Elutionsgeschwindigkeit wurde auf 1,0 ml·min^-1 eingestellt; die Säulentemperatur wurde auf 40°C eingestellt. Es wurde eine Postsäulenderivatisierung unter Verwendung von o-Phthaldialdehyd in einer Reaktionskapillare (14 m·0,35 mm) bei Raumtemperatur durchgeführt. Es wurde gefunden, dass L-Phenylalanin eine Retentionszeit von 6,7 min. unter den beschriebenen Bedingungen aufweist.
Die Messung der Glucose Konzentration mit Enzymteststreifen (Diabur, Boehringer Mannheim, Deutschland) und, abhängig von den Ergebnissen, das anschließende Hinzufügen von 2 ml einer konzentrierten Glucose Lösung (500 g· l^-1) stellte sicher, dass keine Glucose Verknappung in den experimentellen Mischungen auftrat. Nach einer Inkubationszeit von 48 h wurde ein (Phenylalanin) Indexwert von 119 nach dem Induzieren des Wirtsstamms E. coli AT2471 erreicht; dies wird mit einem Phenylalaninwert von 100 für den nicht induzierten Wirtsstamm verglichen. Das einfache Induzieren des Plasmids pZY557tkttal in den Wirtsstamm wies das Ergebnis auf, dass sich dieser Indexwert, der die Phenylalanin Konzentration beschreibt, auf 167 selbst ohne das Induzieren der Zellen erhöhte. Wie die Experimente zeigen, führte das Induzieren des Stamms E. coli AT2471/pZY557tkttal zu einer weiteren Erhöhung auf einen Wert von 204.
Dies entsprach einer Erhöhung von 71% im Vergleich zu dem induzierten Wirtsstamm.
Dieses Ergebnis zeigt die positive erfindungsgemäße Wirkung, wobei die Wirkung die Synthese von aromatischen Verbindungen erhöht, die zusätzliche Erhöhung der Aktivität einer Transketolase in Stämmen, die bereits eine erhöhte Transaldolase Aktivität aufweisen oder die zusätzliche Aktivität der Transaldolase in Stämmen, die bereits eine erhöhte Transketolase Aktivität aufweisen.
Beispiel 5
Herstellung von Substanzen unter Verwendung von Stämmen mit einer erhöhten Transaldolase Aktivität
Die Mutante E. coli AT2471/pZY557tal wurde in einem Experiment kultiviert, das ansonsten identisch war zu jenem, das in Beispiel 4 beschrieben ist. Nach 48 h führte die Induktion des Stamms zu einem (Phenylalanin) Indexwert von 131, der mit einem Phenylalaninwert von 100 für den nicht induzierten Stamm verglichen wird.
Dieses Ergebnis zeigt klar die positive Wirkung, welche die erhöhte Aktivität einer Transaldolase auf die Synthese von aromatischen Substanzen ausübt, insbesondere nach dem erfindungsgemäßen Induzieren.
Beispiel 6
Herstellung von Substanzen unter Verwendung von PTS^- Mutanten in denen ein PEP-unabhängiges Zucker-Aufnahme-System exprimiert wird zusätzlich zu einer vorhandenen erhöhten Transaldolase Aktivität, wobei die Transaldolase Aktivität nach der Induktion des PEP-unabhängigen Zucker-Aufnahme-Systems erhöht ist
Das glf Gen wurde erhalten, wie von Weisser P. et al. (J. Bacteriol. 177 (1995) 3351–54) unter Verwendung von PCR (Multis K.B. et al., Meth. Enzymol. 155 (1987) 335-50) beschrieben wurde. Die vollständige Nukleotidsequenz dieses Gens ist verfügbar (Barnell W.O. et al., J. Bacteriol. 172 (1990) 7227–40). Das glf Gen wurde unter Verwendung von Plasmid pZY600 als die Matrize (Weisser P. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 3351–4) amplifiziert.
Zum Zweck der Integration des glf Gens in Gene, die Bestandteile des E. coli PTS Systems kodieren, wurde Plasmid pPTS1 (siehe Tabelle 1) mit BglIII gespalten und mit Klenow Fragment behandelt. Die einzige Schnittstelle ist in dem ptsI Gen angeordnet. Das glf Gen wurde als ein BamHI-KpnI Fragment aus Plasmid pBM20glfglk isoliert und genauso mit Klenow Fragment behandelt. Es wurden Klone erhalten, die das glf in derselben Orientierung wie die ptsHI Gene durch Ligation der stumpfen Enden erhalten. Ein 4,6 kB PstI Fragment, das die 3' Region des ptsH Gens und ptsI enthaltend integriertes glf und crr trägt, wurde aus dem resultierenden Plasmid pPTSglf erhalten. Dieses Fragment wurde in die EcoRV Schnittstelle des Vektors pGP704 ligiert. Weil dieser Vektor nur in der Lage, in λpir Stämmen zu replizieren, wurde der Vektor in Transformanten in das Chromosom integriert, die diesen Phagen nicht enthalten, wenn diese Transformanten in der Lage sind, auf Carbenicillin zu wachsen. Die Integration wurde durch Southern Blot Analyse (Miller V.L. et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2575–83) überprüft. Die resultierenden Transformanten enthielten die vollständigen PTS Gene zusätzlich zu dem glf Gen.
Der Vektorrest kann in einem zweiten homologen Crossover heraus rekombiniert werden, was zu dem Verlust der Carbenicillin Resistenz führt. Weil in diesem Fall die pts Gene durch die Insertion des glf Gens zerstört werden, wird das PTS nicht in einer funktionellen Weise in diesen Mutanten exprimiert. Die gewünschten PTS^- Mutanten wurden wie folgt selektiert: nach dem Subkultivieren der Transformanten, die immer noch PTS⁺ waren, einige Mal auf LB Medium ohnel Antibiotika, Aliquots der Zellsuspension wurden auf LB Platten enthaltend 100 μg· l^-1 Phosphomycin ausplattiert. PTS^- Mutanten waren in der Lage, auf diesen Platten zu wachsen. Gewachsene Klone wurden auf LB Platten enthaltend entweder Phosphomycin oder 20 μg·l^-1 Carbenicillin ausgestrichen. Chromosomale DNA wurde aus Klonen isoliert, die immer noch Wachstum auf den Phosphomycin Platten zeigten, aber die nicht in der Lage waren, auf den Carbenicillin Platten zu wachsen. Die Integration des glf Gens in die Gene, die das PTS System kodieren, wurde durch Southern Analyse bestätigt. Die korrespondierenden Mutanten wurden als phänotypisch PTS defizient identifiziert. Ein Klon wurde als der Wirtsorganismus E. coli AT2471glfintPTS^- selektiert und für die Transformationen (siehe oben) mit Plasmid pZY557tal verwendet. Nach den experimentellen Bedingungen, die für die Beispiele 4 und 5 beschrieben wurden, wurden die PTS negative Mutante E. coli AT2471glfintPTS^-/pZY557tal und der korrespondierende Wirtsstamm AT2471glfinPTS^- in jedem Fall in zwei parallelen Mischungen kultiviert, und die Zellen einer Mischung in jedem Fall wurden nach ungefähr 7 Teilungen induziert.
Die Induktion verringerte die synthetische Leistung des Wirtsstamms, der anfänglich einen Indexwert von 100 ohne Induktion aufwies, auf einen Wert von 56. Im Vergleich erhöhte die Induktion den Phenylalanin Indexwert von 73 auf 103 und folglich über den anfänglichen Wert für den Wirtsstamm in Kulturen des transformierten Stammes AT2471 glfintPTS^-/pZY557tal.
Dieses Ergebnis zeigt, dass das einfache Erhöhen der Transaldolase Aktivität eine positive Wirkung auf die Synthese von Phenylalanin selbst in solchen Mikroorganismen aufweist, in denen die Aktivität des PTS Systems verringert ist oder dieses System vollständig ausgeschaltet ist und in das, zu derselben Zeit, ein PEP-unabhängiges Zucker-Aufnahme-System integriert wurde.
Beispiel 7
Herstellung von Substanzen unter Verwendung von PTS^- Mutanten, in denen zusätzlich zu einer erhöhten Transaldolase Aktivität ein PEP-unabhängiges Aufnahmesystem exprimiert wurde, wobei die Transaldolase Aktivität vor dem Einführen des PEP-unabhängigen Zucker-Aufnahme-Systems erhöht wurde
E. coli AT2471/pZY557tal wurde wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten. Anschließend wurde in diesen Stamm ein glf Gen in die Gene integriert, welche die Bestandteile des PTS Systems von E. coli kodieren. Diese Integration wurde durchgeführt wie in Beispiel 6 beschrieben. Unter Verwendung der experimentellen Bedingungen, die in den Beispielen 4 und 5 beschrieben sind, wurden diese PTS negativen E. coli AT2471glfintPTS^-/pZY557tal Mutanten kultiviert. Es wurde gefunden, dass die biosynthetische Leistung der abgeleiteten Mutanten jener der Stämme, die Beispiel 6 beschrieben sind, entsprach.
Beispiel 8
Herstellung von Substanzen in einem Fermentationsgefäß unter Verwendung von Stämmen mit einer erhöhten Transaldolase Aktivität und Stämmen mit einer erhöhten Transketolase Aktivität zusätzlich zu ihrer erhöhten Transaldolase Aktivität
Die Mutanten E. coli AT2471, E. coli AT2471/pZY557tal und E. coli AT2471/pZY557tkttal wurden in einem Fermentationsgefäß (Reaktorvolumen 15 l) kultiviert. Hierzu wurden zwei Schüttelflaschen (2000 ml) mit dem Minimalmedium, wie in Beispiel 2 (250 ml) beschrieben, für das Präkultivieren verwendet. In diesem Verfahren wurde die Glucose Konzentration auf 5,0 g·l^-1 verringert. Die Flaschen wurden mit 2 ml Glycerol Kultur inokuliert und auf einem Überkopfschüttler bei 37°C und 150 rpm inkubiert, bis eine optische Dichte (600 nm) von 3 erreicht war.
Die Präkulturen wurden für das Inokulieren von 4,5 l Herstellungsmedium verwendet. Dieses enthielt MgSO₄·7H₂O(0,3 g·l^-1), KH₂PO₄(3,0 g·l^-1), NaCl 0,1 (g·l^-1), (NH₄)₂SO₄(5,0 g·l^-1), CaCl₂·2H₂O(15,0 mg·l^-1), FeSO₄·7H₂O(0,75 g· l^-1) und L-Tyrosin (0,24 g·l^-1). Zusätzliche Mineralien wurden in der Form einer Spurenelement Lösung (1,5 ml·l^-1) hinzugefügt, die aus Al₂(SO₄)₃·18H₂O (2,0 g· l^-1), CoSO₄·6H₂O(0,7 g·l^-1), CuSO₄·5H₂O(2,5 g·l^-1), H₃BO₃(0,5 g·l^-1), MnCl₂ 4H₂O(20,0 g·l^-1), Na₂MoO₄·2H₂O(3,0 g·l^-1), NiSO₄·3H₂O(2,0 g·l^-1) und ZnSO₄·7H₂O(15,0 g·l^-1) zusammengesetzt war. Vitamin B1 (75,0 mg·l^-1) wurde in Wasser gelöst und, nachdem es durch Filtration sterilisiert worden war, zu dem Medium hinzugefügt, nachdem das zuletzt genannte autoklaviert worden war. Glucose (15 g·l^-1) wurde getrennt autoklaviert und genauso zu dem Medium hinzugefügt, nachdem das zuletzt genannte autoklaviert worden war. Durch Hinzufügen von NH₄OH (25%) wurde der pH Wert in dem Medium bei 7 kontrolliert, der Sauerstoffpartialdruck wurde bei einem Wert von 20% über die Rührgeschwindigkeit, das zugeführte Luftvolumen und den Druck innerhalb des Fermentationsgefäßes kontrolliert. Durch Hinzufügen einer Glucose Lösung (700 g· l^-1) wurde die Glucose Konzentration in dem Kulturmedium bei Werten um ungefähr 5 g·l^-1 gehalten. In Abhängigkeit von der Fermentationszeit wurde L-Tyrosin zu der Glucose Lösung in verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt, um eine L-Tyrosin Verknappung zu vermeiden.
In Experimenten, in denen eine Zellinduktion bewirkt wurde, wurde dies in Übereinstimmung mit der Erfindung nach 6 Stunden durch Hinzufügen von 50 μM IPTG durchgeführt. Nach einer Inkubationszeit von 36 Stunden wurde ein (Phenylalanin) Indexwert von 120 durch einfaches Induzieren des pZY557tal Plasmids erreicht; dies wurde mit einem (Phenylalanin) Indexwert von 100 für den nicht induzierten Wirtsstamm E. coli AT2471 verglichen. Durch die erfindungsgemäße Induktion könnte dieser Wert weiter auf 153 gesteigert werden. Durch Induzieren des pZY557tkttal Plasmids alleine und somit Steigern der Transketolase Aktivität zusätzlich zu der Transaldolase Aktivität könnte ein (Phenylalanin) Indexwert von 130 im Vergleich zu dem Wirtsstamm erreicht werden. Die Experimente zeigen weiterhin, dass die Induktion des Stammes E. coli AT2471/pZY557tkttal eine weitere Erhöhung im (Phenylalanin) Indexwert auf 250 erlaubt. Dies entspricht einer Erhöhung von 92% im Vergleich zu dem nicht induzierten Stamm.
Dieses Ergebnis zeigt, dass selbst in Experimenten, die in Fermentationsgefäßen durchgeführt wurden, eine Erhöhung in der Synthese von aromatischen Verbindungen erfindungsgemäß durch Erhöhen der Transaldolase Aktivität ebenso wie durch Erhöhen der Transketolase Aktivität in Stämmen, die bereits eine erhöhte Transaldolase Aktivität aufweisen, erreicht werden kann.
Tabelle 1
Tabelle 2

Claims

Verfahren für die mikrobielle Herstellung von Substanzen aus einem aromatischen Metabolismus in einem Mikroorganismus, wobei die Substanzen sekundäre Erzeugnisse von Zwischenprodukten des Pentosephosphatwegs sind, umfassend die Schritte (i) des Erhöhens der Aktivität einer Transaldolase in einem die Substanzen erzeugenden Mikroorganismus und (ii) des Erzeugens einer der Substanzen in dem Mikroorganismus, mit der Maßgabe, daß der Mikroorganismus nicht einer ist, der vor dem Erhöhen der Aktivität einer Transaldolase als ein Stamm mit einem ausgeschalteten Phosphotransferasesystem (pts^--Stamm) aus Stämmen, die zuvor ein Phosphotransferasesystem (pts⁺-Stämme) beinhaltet haben, selektiert wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Substanzen eines aromatischen Metabolismus hergestellt werden, in deren Synthese mindestens ein Zwischenprodukt des Pentosephosphatwegs involviert ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Zwischenprodukt Erythrose-4-Phosphat (Ery4P) ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Transaldolase eine Escherichia coli-Transaldolase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Transaldolase eine Transaldolase B (TalB) von Escherichia coli ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (1) zusätzlich die Aktivität einer Transketolase in dem die Substanzen erzeugenden Mikroorganismus erhöht ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Transketolase eine Escherichia coli-Transketolase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Transketolase eine Transketolase A (TktA) von Escherichia coli ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (i) die Aktivität eines PEP-abhängigen Zucker-Aufnahme-Systems, falls vorhanden, vermindert oder abgeschaltet wird, und ferner dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Aktivität eines Transportproteins für die PEP-unabhängige Aufnahme eines Zuckers in dem die Substanzen erzeugenden Mikroorganismus erhöht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (i) die Aktivität eines PEP-abhängigen Zucker-Aufnahme-Systems, falls vorhanden, vermindert oder abgeschaltet wird, und ferner dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Aktivität einer Kinase, die einen Zucker phosphoryliert, der in einer nicht-phosphorylierten Form in den Mikroorganismus aufgenommen wird, in dem die Substanzen erzeugenden Mikroorganismus erhöht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennnzeichnet, daß in Schritt (i) die Aktivität eines PEP-abhängigen Zucker-Aufnahme-Systems, falls vorhanden, vermindert oder abgeschaltet wird, und ferner dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Aktivität eines Transportproteins für die PEP-unabhängige Aufnahme eines Zuckers und die Aktivität einer Kinase, die diesen Zucker phosphoryliert, in dem die Substanzen erzeugenden Mikroorganismus erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Transportprotein ein Förderer ist.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Förderer ein Zymomonas mobilis-Glukose-Förderer-Protein (Glf) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Kinase eine Hexose-phosphorylierende Kinase ist.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Kinase von Zymomonas mobilis stammt.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Kinase eine Zymomonas mobilis-Glukokinase (Glk) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (i) die Aktivität von mindestens einer der folgenden Komponenten, d.h. Transaldolase, Transketolase, Transportprotein und Kinase, in dem die Substanzen erzeugenden Mikroorganismus a) durch das Einführen der Gene b) und/oder durch das Erhöhen der Anzahl der Genkopien c) und/oder durch das Erhöhen der Genexpression d) und/oder durch das Erhöhen der endogenen Aktivität der Enzyme e) und/oder durch das Verändern der Struktur der Enzyme f) und/oder durch das Verwenden von deregulierten Enzymen g) und/oder durch das Einführen von Genen, die deregulierte Enzyme kodieren, erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Erhöhung der Aktivität durch das Integrieren des Gens oder der Gene in eine Genstruktur oder in verschiedene Genstrukturen erhalten wird, wobei das Gen oder die Gene in die Genstruktur als (eine) einzelne Kopie(n) oder in ansteigender Kopienzahl eingeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus verwendet wird, in dem eines oder mehrere Enzyme, die zusätzlich in die Synthese der Substanzen involviert sind, dereguliert sind und/oder eine erhöhte Aktivität aufzeigen.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz, die hergestellt wird, eine aromatische Aminosäure ist.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die aromatische Aminosäure L-Phenylalanin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mikroorganismus zu dem Genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Corynebacterium oder Brevibacterium gehört.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Escherichia coli ist.
Genstruktur, enthaltend in rekombinanter Form, a) ein Gen, das eine Transaldolase kodiert, oder ein Gen, welches eine Transaldolase kodiert, und ein Gen, das eine Transketolase kodiert, und b) mindestens ein Gen, welches ein Transportprotein für eine PEP-unabhängige Aufnahme eines Zuckers kodiert, oder eine Hexose-phosphorylisierende Kinase kodiert.
Genstruktur nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für das Transportprotein einen Förderer kodiert, und das Gen für die Kinase eine Hexose-phosphorylierende Kinase kodiert.
Genstruktur nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene für die Transaldolase und die Transketolase von Escherichia coli stammen und die Gene für das Transportprotein und die Kinase von Zymomonas mobilis stammen.
Genstruktur nach den Ansprüchen 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für die Escherichia coli-Transaldolase talB ist und das Gen für die Escherichia coli-Transketolase tktA ist und das Gen für das Zymomonas mobilis-Transportprotein glf ist und das Gen für die Zymomonas mobilis-Kinase glk ist.
Genstruktur nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Genstruktur mindestens eine regulatorische Gensequenz, die einem der Gene zugeordnet ist, enthält.
Genstruktur nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Gen in die Genstruktur so eingegliedert ist, daß es unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors ist.
Transformierte Zelle, die eine Genstruktur nach den Ansprüchen 24 bis 29 in replizierbarer Form beinhaltet.
Transformierte Zelle nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß in der Zelle ein oder mehrere Enzyme, die zusätzlich in der Synthese der Substanzen aus dem aromatischen Metabolismus, welche sekundäre Produkte der Zwischenprodukte des Pentosephosphatwegs sind, involviert sind, dereguliert sind und/oder eine erhöhte Aktivität aufweisen.
Transformierte Zelle nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine Escherichia coli-Zelle ist.
Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität des PEP-abhängigen Zucker-Aufnahme-Systems, falls dieses System vorhanden ist, vermindert oder ausgeschaltet ist.
Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß sie befähigt ist, eine aromatische Aminosäure zu erzeugen.
Transformierte Zelle nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die aromatische Aminosäure L-Phenylalanin ist.
Verfahren für die mikrobielle Herstellung von Substanzen aus einem aromatischen Metabolismus, wobei die Substanzen sekundäre Produkte von Zwischenprodukten des Pentosephosphatwegs gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 sind, dadurch gekennzeichnet, daß transformierte Zellen nach einem der Ansprüche 30 bis 35, in denen eine Genstruktur nach Anspruch 29 vorliegt, kultiviert werden, wobei während der Kultivierung frühestens nach zwei Zellteilungen eine Induktion veranlaßt wird, so daß transformierte Zellen, welche Zwischenprodukte des Pentosephosphatwegs in einer erhöhten Verfügbarkeit enthalten, erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die transformierte Zelle zusätzlich dazu, daß sie Zwischenprodukte des Pentosephosphatwegs in erhöhter Verfügbarkeit enthält auch andere Metabolite des zentralen Metabolismus in erhöhter Verfügbarkeit, enthält.