DE69232544T2

DE69232544T2 - Vitamin-k-abhängige carboxylase

Info

Publication number: DE69232544T2
Application number: DE69232544T
Authority: DE
Inventors: E. Stafford; Sheue-Mei Wu
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; University of North Carolina System
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; University of North Carolina System
Priority date: 1991-05-08
Filing date: 1992-05-08
Publication date: 2002-11-21
Anticipated expiration: 2012-05-09
Also published as: AU665199B2; US5268275A; ES2174835T3; WO1992019636A1; AU2006292A; ATE215988T1; CA2102702A1; DE69232544D1; EP0587742A1; EP0587742B1; CA2102702C; EP0587742A4; DK0587742T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich auf DNA Sequenzen, die Enzyme codieren, bekannt als die Vitamin K abhängigen Carboxylasen, die die γ-Carboxylierung von Glutaminsäureresten in Vitamin K abhängigen Proteinen, wie Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C, Protein S und Prothrombin durchführen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Eine Zahl von Blutkoagulationsproteinen verlangen eine Post-Translations-, Vitamin K-abhängige Modifizierung für biologische Aktivität. In 1974 berichteten Stenflo et al., Nelsestuen et al. und Magnνsson et al., daß der Prototyp dieser Vitamin K-abhängigen Proteine, Prothrombin, die modifizierte Aminosäure γ-Carboxyglutaminsäure (Gla) enthielt. Siehe J. Stenflo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 2730-2733 (1974); G. Nelsestuen et al., J. Blot. Chem. 249: 6347 6350 (1974); S. Magnusson et al., FEBS Lett. 44: 189- 193 (1974). Prothrombin von Tieren, behandelt mit dem Vitamin K Antagonisten Warfarin fehlte diese Gla Modifikation. Es wurde aus diesen Beobachtungen gefolgert, daß die Blut-Gerinnungsaktivität der Vitamin K-abhängigen Vitamine γ-Carboxylierung von spezifischen Glutaminsäureresten erforderte. Kurz danach zeigten Esmon et al. eine Enzymaktivität, Vitamin K-abhängige Carboxylase (hier im nachfolgenden Carboxylase genannt), fähig zum Herstellen dieser Gla Modifikation. Siehe C. Esmon et al., J. Biol. Chem. 250: 4744-4748 (1975).
Nachdem cDNA Sequenzen für verschiedene der Vitamin K-abhängigen Proteine erhalten waren, verglichen Pan und Price die verringerten Aminosäuresequenzen und schlugen vor, daß die Propeptid Consensussequenz, die dem Amino-Terminus des Vitamin K-abhängigen Proteins vorangeht, eine Erkennungsstelle für die Carboxylase war. Siehe L-Pan und P. Price, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6109- 6113 (1985). Dieser Vorschlag wurde von Knobloch und Suttie bestätigt, die die Bedeutsamkeit des Propeptids bei Carboxylierung demonstrierten durch zeigen, daß die synthetische Propeptidsequenz von Humanfaktor die Aktivität der Carboxylase für ein kleines Substrat (Boc-Glu-Glu-Leu-OMe) in vitro stimulierte. J. Knobloch und J. Suttie, J. Biol. Chem. 262: 16157-16163 (1987). Jorgensen dehnte diese Beobachtung aus durch Zeigen, daß Faktor IX mit seinem gelöschten Propeptid nicht carboxyliert war. M. Jorgensen et al., Cell 48: 185-191 (1987).
Trotz ihrer Bedeutsamkeit ist die Carboxylase zuvor nicht gereinigt worden. Reinigung von 400 fach ist berichtet worden. Siehe J.-M Girardot, J. Biol. Chem. 257: 15008-15011 (1982). Vergleich von Girardots Ergebnissen zu späteren Reinigungen ist kompliziert, weil in unseren Händen Ammoniumsulfat und das Propeptid die Einfügung von CO&sub2; in das synthtetistische Peptidsubstrat FLEEL um 13-fach stimulieren. Wenn man den Mangel an Ammoniumsulfat und Propeptid in Girardots Assaymischung korrigiert, dann erzielte er eine spezifische Aktivität von 1,1 · 10&sup7; cpm/mg/h. Soute et al. zeigten, daß ein immobilisierter Faktor X Antikörper die Carboxylase binden würde, wahrscheinlich durch einen Faktor X Vorläufer-Carboxylase Komplex, und daß die gebundene Carboxylase ihre Aktivität für das synthetische Peptidsubstrat FLEEL behielt. Siehe B. Soute et al., Biochem. Biophys. Acta 676: 101-107 (1981). Harbeck et al. dehnte dieses Verfahren durch Eluieren der Carboxylase von einer Prothrombinantikörpersäule mit einem synthetischen Propeptid aus, eine 500-fache Reinigung und eine letztendliche spezifische Aktivität von 6,6 · 10&sup6; cpm/mg/h erzielend. Siehe M. Harbeck et al., Thromb. Res. 56: 317-323 (1989). Hubbard et al. berichteten die Reinigung der Carboxylase zu Homogenität unter Verwenden einer synthetischen Propeptidsequenz als ein Affinitätsligand. Siehe B. Hubbard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6893- 6897 (1989). Jedoch war die berichtete letztendliche spezifische Aktivität 1,3 · 10&sup7; cpm/mg/h noch nicht beträchtlich verschieden als diejenige, berichtet von Girardot. Zahlreiche Untersuchungen mit der Rohcarboxylase haben wichtige Information über ihre Eigenschaften und Betriebsweise ergeben. Siehe J. Suttie, Ann. Rev. Biochem. 54: 459-77 (1985). Es ist jedoch klar, daß für detaillierte mechanistische Untersuchungen und physikalische Charakterisierung des Enzyms Reinigung notwendig ist.
Wir haben kürzlich über die Herstellung in E. coli von vier verschiedenen 59-Rest Peptiden berichtet, die das Propeptid und Gla Domäne von Humanfaktor IX enthielten. Siehe S.-M. Wu et al., J. Biol. Chem. 265: 13124-13129 (1990). Wir berichten hier, daß eines dieser Peptide FIXQ/S (SEQ ID NR: 1) ein ausgezeichneter Affinitätsligand für Reinigung der Carboxylase ist. Eine 7000-fache Reinigung der Carboxylase auf annähernd 80%-90% offenkundige Reinheit und letzendliche spezifische Aktivität von etwa 2,4 · 10&sup9; cpm/mg/h wurde erhalten. Das offenkundige Molekulargewicht betrug 94000 durch Reduzieren von SDS-PAGE Analyse, wie in Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Band 88, Seite 2236- 2240 berichtet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein erster Aspekt der gegenwärtigen Erfindung ist eine isolierte DNA, die eine Vitamin K abhängige Carboxylase codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) isolierter DNA, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus DNA, die Rinder 94000 Dalton Vitamin K abängige Carboxylase codiert und die Sequenz von SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 11 oder SEQ ID NR: 13 umfaßt, und DNA mit der Sequenz, hier als SEQ ID NR: 15 gegeben, und die Human Vitamin K abhängige Carboxylase codiert; und (b) isolierte DNA, die an den komplementären Strang von isolierter DNA von (a), zuvor angegeben, unter stringenten Bedingungen hybridisiert, dargestellt durch eine Waschstringenz von 0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat und 0,1% SDS bei 70ºC, und die eine Vitamin K abhängige Carboxylase, mindestens 75% homolog zu isolierter DNA von (a), zuvor angegeben, codiert.
Ein zweiter Aspekt der gegenwärtigen Erfindung ist eine rekombinante DNA Sequenz, umfassend Vektor DNA, und eine DNA codierende Vitamin K abhängige Carboxylase, wie zuvor angegeben.
Ein dritter Aspekt der gegenwärtigen Erfindung ist eine Wirtszelle, enthaltend eine rekombinante DNA Sequenz, wie zuvor angegeben, und fähig zum Exprimieren der codierten Vitamin K abhängigen Carboxylaae.
Ein vierter Aspekt der gegenwärtigen Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen eines Vitamin K abhängigen Proteins. Das Verfahren umfaßt Kultivieren einer Wirtszelle, die ein Vitamin K abhängiges Protein in der Anwesenheit von Vitamin K exprimiert und dann Ernten des Vitamin K abhängigen Proteins aus der Kultur, ferner umfassend Verwenden als die Wirtszelle eine eukaryontische Wirtszeile, die ein rekombinantes DNA Molekül enthält, umfassend Klonierungsvektor DNA, operabel in der Wirtszelle, und eine DNA, eine Vitamin K abhängige Carboxylase codierend, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) isolierter DNA, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus DNA, die Rinder 94000 Dalton Vitamin K abhängige Carboxylase codiert und die Sequenz von SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 11 oder SEQ ID NR: 13 umfaßt, und DNA mit der Sequenz, hier als SEQ ID NR: 15 gegeben, und die Human Vitamin K abhängige Carboxylase codiert, (b) isolierter DNA, die hybridisiert an den komplementären Strang von isolierter DNA von (a), zuvor angegeben, unter stringenten Bedingungen, dargestellt durch eine Waschstringenz von 0,3 M NaCl, 0,03 M Natiumcitrat und 0,1% SDS bei 70ºC, und die eine Vitamin K abhängige Carboxylase, mindestens 75% homolog zu isolierter DNA von (a), zuvor angegeben, codiert.
Die vorhergehenden und andere Aspekte der gegenwärtigen Erfindung sind im Detail in den Zeichnungen, Beispielen und Detaillierter Beschreibung, im nachfolgenden dargestellt, erklärt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1. Silber-gefärbte, 10% reduzierende SDS-PAGE Analyse von Affi-FIXQ/S gereinigten Carboxylase Präparationen unter Zeigen der Wirkung von Beschallung. Die Counts spiegeln die Carboxylaseaktivität in jeder Bahn wieder. Bahn 1 ist das beschallte Beladungsmaterial (380 cpm/30 Min); Bahn 2 ist der beschallte Durchfluß (265 cpm/30 min); Bahn 3 ist uribeschallte Elution I Carboxylase Präparation (23500 cpm/30 Min); Bahn 4 ist beschaute Elution I Carboxylase Präparation (5000 cpm/30 Min).
Fig. 2. Autoradiogramm von vernetzen zwischen ¹²&sup5;I-FIXQ/S und Protein aus teilweise gereinigter Carboxylase Präparation, gezeigt in Fig. 1, Bahn 3. Proteine wurden durch 10$ nichtreduzierende SDS-PAGE getrennt. Bahn 1 ist proFIX19 Kompetition von Vernetzen; Bahn 2 ist Vernetzen in Abwesenheit von proFIX19.
Fig. 3. Aktivitätsprofil und reduzierende SDS-PAGE Analyse (10%, silbergefärbt) von Fraktionen von CM-Sepharosechromatographie. Die Fraktionszahlen sind auf der X-Achse. 7,5 ul von jeder Fraktion wurde durch SDS-PAGE analysiert. Die Counts, gezeigt auf der Y-Achse, stellen die Carboxylaseaktivität in jeder Bahn dar. Die Carboxylaseaktivität wurde bestimmt durch die ¹&sup4;CO&sub2;, Einfügungen FLEEL in den Standardassay. L ist Beladungsmaterial; Fraktionen 1-7 sind Durchfluß; Fraktionen 8-27 sind Waschung; Fraktionen 28-37 sind Elution.
Fig. 4. Silber-gefärbte, 10% reduzierende SDS-PAGE Analyse einer CM-gereinigten Carboxylase, erneut chromatographiert auf Affi-FIXQ/S unter Zeigen der Korrelation zwischen dem 94000 Mf Protein und Aktivität. Bahn 1 ist die erste Affi-FIXQ/5 Carboxylase Präparation (9750 cpm/30 Min); Bahn 2 ist gereinigtes CM Eluat (6729 cpm/30 Min, verwendet für die zweite Affi-FIXQ/S); Bahn 3 ist Durchfluß der zweiten Affi-FIXQ/S (394 cpm/30 Min); Bahn 4 ist eine Probe eines zweiten Affi-FIXQ/S Eluats (18853 cpm/30 Min, Eluat 1 Verfahren). Der Unterschied an Aktivität zwischen der Carboxylase, gezeigt in Bahnen 2 und 4 ist das Ergebnis von etwas Inaktivierung der Carboxylase von Bahn 2.
Fig. 5. Aktivitätsprofil und reduzierende SDS-PAGE Analyse (10%, silbergefärbt) von Fraktionen von Affl-FIXQ/5 Chromatographieelution II. 5,0 ul jeder Fraktion wurde für SDS-PAGE Analyse verwendet, ausgenommen, daß das Beladungsmaterial und Fraktion 8 vor Analyse 100fach verdünnt wurden. Die Fraktionszahl ist auf der X-Achse gezeigt. Die Y-Achse stellt die Carboxylaseaktivität in jeder Bahn dar. Die Carboxylaseaktivität wurde durch die ¹&sup4;CO&sub2; Einführung in FLEEL in den Standardassay bestimmt. L ist Beladungsmaterial; Fraktionen 1-20 sind Durchfluß (weil jede Fraktion äquivalent ist, ist nur eine gezeigt); Fraktionen 21-30 sind Waschungen; Fraktionen 31-49 sind Triton X-100 Gradient; Fraktionen 56-63 sind CHAPS Gradient; Fraktionen 64-75 sind CHAPS und proFIX19 Doppelgradient; Fraktionen 76-90 sind 1% CHAPS/2 uM proFIX19 Elution.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Aminosäuresequenzen, hier offenbart, sind in der Amino zu Carboxy Richtung dargestellt, von liniks bis rechts. Die Amino- und Carboxygruppen sind nicht in der Sequenz dargestellt. Nucleotidsequenzen sind hier nur durch Einzelstrang dargestellt, in der 5' bis 3' Richtung, von links nach rechts. Nucleotide und Aminosäuren sind hier in der Weise dargestellt, empfohlen von der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission, oder (für Aminosäuren) durch drei Buchstaben Code, in Übereinstimmung mit 37 CFR § 1.822 und festgelegtem Gebrauch. Siehe beispielsweise PatentIn User Manual, 99-102 (Nov. 1990) (U.S. Patent and Trademark Office, Office of the Assistant Commissioner for Patents, Washington, D. C. 20231); U.S. Patent Nr. 4 871 670 von Hudson et al. Spalte 3, Zeilen 20-43.

A. GENTECHNOLOGIETECHNIKEN

Die Herstellung von klonierten Genen, rekombinanten DNA, Vektoren, transformierten Wirtszellen, Proteinen und Proteinfragmenten durch Gentechnologie ist gut bekannt. Siehe beispielsweise, U.S. Patent Nr. 4 761 371 von Bell et al. bei Spalte 6, Zeile 3 bis Spalte 9, Zeile 65; U.S. Patent Nr. 4 877 729 von Clark et al. bei Spalte 4, Zeile 38 bis Spalte 7, Zeile 6; U.S. Patent Nr. 4 912 038 von Schilling bei Spate 3, Zeile 26 bis Spalte 14, Zeile 12; und U.S. Patent Nr. 4 879 224 Wallner bei Spalte 6, Zeile 8 bis Spalte 8, Zeile 59.
Ein Vektor ist eine replizierbare DNA Konstruktion. Vektoren werden hier verwendet, entweder DNA zu amplifizieren, die Vitamin K Abhängige Carboxylase codiert und/oder DNA zu exprimieren, die Vitamin K Ahängige Carboxylase codiert. Ein Expressionsvektor ist eine replizierbare DNA Konstruktion, dem eine DNA Sequenz, die Vitamin K Abhängige Carboxylase codiert, operabel an geeignete Kontrollsequenzen gekoppelt ist, fähig, die Expression von Vitamin K abhängiger Carboxylase in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Die Notwendigkeit für derartige Kontrollsequenzen variiert in Abhängigkeit von dem gewählten Wirt und dem gewählten Transformationsverfahren. Allgemein, Kontrollsequenzen schließen ein einen Transkriptionspromotor, eine wahlfreie Operatorsequenz zum Kontrollieren von Transcription, eine Sequenz, die geeignete mRNA ribosomale Bindungsstellen codiert, und Sequenzen, die die Termination von Transcription und Translation kontrollieren.
Amplifikationsvektoren benötigen nicht Expressionskontrolldomänen. Alles, was benötigt wird, ist die Fähigkeit, in einem Wirt zu replizieren, üblicherweise verliehen durch einen Replikationsursprung, und ein Selektionsgen zum Erleichtern von Erkennung von Transformanten.
Vektoren umfassen Plasmide, Viren (beispielsweise Adenovirus, Cytomegalovirus), Phage und integrierbare DNA Fragmente (d. h. Fragmente, integrierbar in das Wirtsgenom durch Rekombination). Der Vektor repliziert und funktioniert unabhängig von dem Wirtsgenom oder kann in einigen Fällen in das Genom selbst integrieren. Expressionsvektoren sollten einen Promotor und RNA Bindungsstellen enthalten, die operabel an das zu exprimierende Gen gekoppelt sind und operabel in dem Wirtsorganismus sind.
DNA Regionen sind operabel gekoppelt oder operabel assoziiert, wenn sie funktionell miteinander gekoppelt sind. Beispielsweise ist ein Promotor operabel an eine Codierungssequenz gekoppelt, wenn er die Transcription der Sequenz kontrolliert; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine Codierungssequenz gekoppelt, wenn sie so angeordnet ist, Translation zu erlauben.
Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit Vitamin K Abhängigen Carboxylase Vektoren, konstruiert unter Verwenden von rekombianten DNA Techniken, transformiert oder transfektioniert worden sind. Transformierte Wirtszellen exprimieren üblicherweise Vitamin K Abhängige Carboxylase, aber Wirtszellen, transformiert zu Zwecken von Klonieren oder Amplifizieren von Vitamin K Abhängiger Carboxylase DNA, müssen nicht Vitamin K Abhängige Carboxylase exprimieren.
Geeignete Wirtszellen schließen ein Prokaryont, Hefe oder höhere eukaryontische Zellen, wie Säugerzellen und Insektenzellen. Zellen, abstammend von multizellulären Organismen, sind ein besonders geeigneter Wirt für rekombinante Vitamin K Abhängige Carboxylase Synthese, und Säugerzellen sind besonders bevorzugt. Fortpflanzung derartiger Zellen in Zellkultur ist ein Routineverfahren geworden (Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Herausgeber (1973)). Beispiele von geeigneten Wirtszelllinien sind VERO und HeLa Zellen, Chinesische Hamsterovarium (CHO)-Zelllinien und W1138, BHK, COS-7, CV und MDCK Zelllinien. Expressionsvektor für derartige Zellen schließen üblicherweise ein (wenn notwendig) einen Replikationsursprung, einen Promotor, angeordnet stromaufwärts von der DNA, die zu exprimierende Vitamin K abhängige Carboxylase codiert, und wirksam damit verbunden, neben einer Ribosomenbindungsstelle, einer RNA Spleißstelle (wenn Intron-enthaltende genomische DNA verwendet wird), einer Polyadenylierungsstelle und einer Transcriptionsterminierungssequenz.
Die Transcriptions- und Translationskontrollsequenzen in Expressionsvektoren, zu Verwenden beim Transformieren von Wirbeltierzellen, werden oft durch Virusquellen geliefert. Beispielsweise stammen gebräuchlicherweise verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2 und Simian Virus 40 (SV40) ab. Siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 4 599 308.
Ein Replikationsursprung kann geliefert werden, entweder durch Konstruktion des Vektors, einen exogenen Ursprung einzuschließen, wie von SV 40 oder anderer Virus- (beispielsweise Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) Quelle abgeleitet werden kann, oder kann durch den chromosomalen Wirtszellreplikationsmechanismus zur Verfügung gestellt werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellchromosom integriert wird, ist das zuletzt Genannte oft ausreichend.
Eher als durch Verwenden von Vektoren, die Virusursprünge von Replikation enthalten, kann man Säugerzellen durch das Verfahren von Cotransformation mit einem selektierbaren Marker und der Vitamin K Abhängig Carboxylase DNA transformieren. Beispiele von geeigneten selektierbaren Markern sind Dihydrofolat Reduktase (DHFR) oder Thymidinkinase. Dieses verfahren ist ferner in U.S. Pat. Nr. 4 399 216 beschrieben.
Andere Verfahren, geeignet für Anpassung an die Synthese von Vitamin K Abhängiger Carboxylase in rekombinanter Wirbeltierzellkultur schließen diejenigen ein, beschrieben in M-J. Gething et al., Nature 293, 620 (1981); N. Mantei et al., Nature 281, 40; A. Levinson et al., EPO Anmeldung Nr. 117 060A und 117 058A.
Wirtszellen, wie Insektenzellen (beispielsweise kultivierte Spodoptera frugiperda Zellen) und Expressionsvektoren, wie der Baculovirus Expressionsvektor (beispielsweise Vektoren, abstammend von Autographa californica MNPV, Trichoplusia ni MNPV, Rachiplusia ou MNPV oder Galleria ou MNPV) können verwendet werden, die gegenwärtige Erfindung durchzuführen, wie in U.S. Patenten Nr. 4 745 051 und 4 879 236 von Smith et al. beschrieben. Im allgemeinen umfaßt ein Baculovirus Expressionsvektor ein Baculovirus Genom, enthaltend das zu exprimierende Gen, eingefügt in das Polyhedringen an einer Position, die von dem Polyhedrintranskriptionsstartsignal zu der ATG Startstelle reicht und unter der Transkriptionskontrolle eines Baculovirus Polyhedrin Promotors.
Prokaryonten Wirtzellen schließen gramnegative oder grampositive Oganismen ein, beispielsweise Escherichia coli (E. coli) oder Bacilli. Höhere eukaryontische Zellen schließen festgelegte Zelllinien von Säugerursprung, wie im nachfolgenden beschrieben, ein. Beispielhafte Wirtzellen sind E. coli W3110 (ATCC 27.325), E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), E. coli 294 (ATCC 31.446). Eine breite Mannigfaltigkeit von geeigneten prokaryontischen und mikrobiellen Vektoren ist verfügbar. E. coli wird typischerweise unter Verwenden von pBR322 transformiert. Promotoren, am gebräuchlichsten in rekombinanten mikrobiellen Expressionsvektoren verwendet, schließen ein die beta-Lactamase (Penicillinase) und Lactose Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1979); und Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979), ein Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980) und EPO Anm. Veröffent. Nr. 36 776) und den tac Promotor (H. De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21 (1983)). Der Promotor und Shine-Dalgarno Sequenz (für prokaryontische Wirtsexpression) sind operabel an die DNA gekoppelt, die Vitamin K Abhängige Carboxylase codiert, d. h. sie sind so angeordnet, Transcription von Vitamin K Abhängiger Carboxylase Messenger RNA von der DNA zu fördern.
Eukaryontische Mikroben, wie Hefekultur, können auch mit Vitamin K Abhängigen Carboxylasecodierenden Vektoren transformiert werden. Siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 4 745 057. Saccharomyces cerevisiae ist der am gebräuchlichsten verwendete unter niedrigeren eukaryontischen Wirtsmikroorganismen, obwohl eine Zahl von anderen Stämmen üblicherweise verfügbar ist. Hefevekoren können enthalten einen Replikationsursprung von dem 2 Mikron Hefeplasmid oder einer autonom replizierenden Sequenz (ARS), einen Promotor, DNA codierende Vitamin K Abhängige Carboxylase, Sequenzen für Poyadenylierung und Transcriptionstermination und ein Selektionsgen. Ein beispielhaftes Plasmid ist YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Geeignete fördernde Sequenzen in Hefevektoren schließen die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeuran et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hers et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); und Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978)) ein. Geeignete Vektoren und Promotoren für Verwendung in Hefeexpression sind ferner in R. Hitzeman et al., EPO Veröffentlichung Nr. 73 657 beschrieben.

B. VITAMIN K-ABHÄNGIGE CARBOXYLASE

Carboxylaseenzyme der gegenwärtigen Erfindung schließen Proteine, homolog zu und mit im wesentlichen den gleichen biologischen Eigenschaften wie die Rinder Vitamin K abhängige Carboxylase und die Human Vitamin K abhängige Carboxylase, hier offenbart, ein. Diese Definition soll natürliche allele Variationen in den Carboxylaseenzymen umfassen. Klonierte Gene der gegenwärtigen Erfindung können Carboxylaseenzym irgendeiner Ursprungsart codieren, einschließlich Maus, Ratte, Kaninchen, Katze, Schwein und Mensch, aber codieren vorzugsweise Carboxylaseenzym vom Säugerursprung. Somit sind DNA Sequenzen, die an DNA hybridisieren, die Rinder- oder Humanvitamin K abhängige Carboxylase codiert, und die für Expression für eine Vitamin K abhängige Carboxylase codieren, auch ein Aspekt dieser Erfindung. Bedingungen, die andere DNA Sequenzen erlauben, die für Expression für eine Vitamin K abhängige Carboxylase codieren unter Hybidisieren an die DNA Sequenz von Rinder oder Humanvitamin K abhängiger Carboxylase, können in einer Routineweise bestimmt werden. Beispielsweise kann Hybridisienrung derartiger Sequenzen unter Bedingungen reduzierter Stringenz oder sogar stringenten Bedingungen durchgeführt werden (beispielsweise Bedingungen, dargestellt durch eine Waschstringenz von 0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat, 0,1% SDS bei 60ºC oder sogar 70ºC) gegenüber DNA, die die Rinder oder Humanvitamin K abhängige Carboxylase codiert, hier in einem Standard in situ Hybridisierungsassay offenbart. Siehe J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2.te Auflage 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). Im allgemeinen sind Sequenzen, die für Vitamin K abhängige Carboxylase codieren und an die DNA hybridisieren, die Rinder oder Humanvitamin K abhängige Carboxylase codiert, hier offenbart, mindestens 75% homolog, 85% homolog oder sogar 95% homolog oder mehr mit der Sequenz der Rinder oder Humanvitamin K abhängigen Caboxylase, hier offenbart. Ferner sind DNA Sequenzen, die für Rinder oder Humanvitamin abhängige Carboxylase codieren, oder Sequenzen, die für eine Carboxylase codieren, codiert durch eine Sequenz, die an die DNA Sequenz hybridisiert, die Rinder oder Humanvitamin K abhängige Carboxylase codiert, aber die sich an Codonsequenz von diesen aufgrund der Degenerierbarkeit des genetischen Codes unterscheiden, auch ein Aspekt dieser Erfindung. Die Degenerierbarkeit des genetischen Codes, die es verschiedenen Nucleinsäuresequenzen erlaubt, das gleiche Protein oder Peptid zu codieren, ist in der Literatur gut bekannt. Siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 4 757 006 von Toole et al. Spalte 2, Tabelle 1.
Durch zur Verfügung stellen des Reinigungsverfahrens, im nachfolgenden dargestellt, und verfügbar machen von klonierten Genen, die Vitamin K abhängige Carboxylase codieren, macht die gegenwärtige Erfindung Vitamin K abhängige Carboxylase mit Reinheiten von mindestens 80% (Gewichtsprozent von Gesamtgewicht), mindestens 90% und mehr verfügbar. Gereinigte Carboxylase der gegenwärtigen Erfindung ist geeignet zum Carboxylieren von Vitamin K abhängigen Enzymen unter Erhöhen der Aktivität davon. Das Carboxylaseenzym kann gereinigt werden aus lysierten Zellfraktionen oder Mikrosomen, enthaltend das Enzym, in Übereinstimmung mit den hier beschriebenen verfahren, wahlfrei gefolgt von anderen Techniken, wie Ionenaustauschchromatographie. Siehe allgemein Enzyme Purification and Related Techniques, Methods in Enzymology 22, 233-577 (1977).

C. VITAMIN K-ABHÄNGIGE PROTEINE

Zahlreiche Vitamin K-abhängigen Proteine können mit der Carboxylase, hier offenbart, carboxyliert werden. Eine bevorzugte Gruppe von Vitamin K-abhängigen Proteinen zum Praktizieren der gegenwärtigen Erfindung sind die Blutkoagulationsproteine, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C, Protein S und Prothromin.
Wie zuvor angegeben, liefert die gegenwärtige Erfindung ein Verfahren zum Carboxylieren von Vitamin K abhängigen Proteinen durch Coexprimieren des Vitamin K abängigen Proteins und der Vitamin K abhängigen Carboxylase, hier offenbart, in einer einzenen Wirtszelle. Allgemein, das Verfahren umfaßt Kultivieren einer Wirtszelle, die ein Vitamin K abhängiges Protein exprimiert, in der Anwesenheit von Vitamin K, und dann Ernten des Vitamin K abhägigen Proteins aus der Kultur. Die Wirtszelle enthält ferner eine rekombinante DNA Sequenz, umfassend Vektor DNA, operabel in der Wirtszelle, und eine DNA, die eine Vitamin K abhängige Carboxylase codiert, wie hier beschrieben. Während einige Wirtszellen das Vitamin K abhängige Protein bei Basalspiegeln carboxylieren können, ist die Vektor DNA, die Vitamin K abhängige Carboxylase codiert, eingeschlossen, Carboxylierung zu erhöhen. Die Kultur kann in irgendeinem geeigneten Fermentationskessel durchgeführt werden, mit einem Wachstumsmedium und unter Bedingungen, angemessen für die Expression der Vitamin K abhängigen Carboxylase und Vitamin K abhängigen Proteins durch die bestimmte gewählte Wirtszelle. Das Vitamin K abhängige Protein, geerntet aus der Kultur, wird befunden, carboxyliert zu sein aufgrund der Expression der Vitamin K abhängigen Carboxylase in der Wirtszelle. Das Vitamin K abhängige Protein kann in der Wirtszelle exprimiert werden durch irgendeines der zuvor beschriebenen. Mittel zum Exprimieren der Vitamin K abhängigen Carboxylase in der Wirtszelle (beispielsweise durch Transformieren der Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, wie ein Plasmid, umfassend DNA, die das Vitamin K abhängige Protein codiert). Das Vitamin K abhängige Protein kann direkt aus den Kulturmedien gesammelt werden oder die Wirtszellen lysiert und das Vitamin K abhängige Protein daraus gesammelt werden. Das Vitamin K abhängige Protein kann dann weiter in Übereinstimmung mit bekannten Techniken gereinigt werden.
Faktor VII DNA Sequenzen neben Vektoren und Wirtszellen für Expression davon sind in U.S. Patent Nr. 4 784 950 von F. Hagen et al. offenbart.
Faktor IX DNA Codierungssequenzen neben Vektoren und Wirtszellen für die Expression davon sind in Europäischer Patentanmeldung 373012, Europäischer Patentanmeldung 251874, PCT Patentanmeldung 8505376, PCT Patentanmeldung 8505125, Europäischer Patentanmeldung 162782 und PCT Patentanmeldung 8400560 offenbart.
Faktor X Reinigung ist in U.S. Patent Nr. 4 411 794 von H. Schwinn et al. offenbart.
Protein C DNA Codierungssequenzen neben Vektoren und Wirtszellen für die Expression davon sind in U.S. Patent Nr. 4 992 373 von N. Bang et al., U.S. Patent Nr. 4 968 626 von D. Foster und E. Davie und U.S. Patent Nr. 4 959 318 von D. Foster et al. offenbart.
Protein S DNA Codierungssequenzen neben Vektoren und Wirtszellen für die Expression davon sind in Europäischer Patentanmeldung 255771 und Europäischer Patentanmeldung 247843 offenbart.
Prothrombinreinigung ist in Japanischer Offenlegung (Kokai) 2019400 offenbart.

D. EXPRESSION VON VITAMIN-K ABHÄNGIGER CARBOXYLASE IN SÄUGERMILCH

Die isolierte DNA der gegenwärtigen Erfindung kann beispielsweise verwendet werden bei der Herstellung von transgenen Säugern (beispielsweise Kühe, Ziegen, Schweine), enthaltend ein Expressionssystem, umfassend einen geeigneten Promotor, wie einen Caseinpromotor, operabel an eine DNA Sequenz gekoppelt, die Vitamin K abhängige Carboxylase codiert, wie hier offenbart, durch eine DNA Sequenz, die ein Signaleptid codiert, wirksam beim Ausscheiden der Carboxylase in Mammary- Gewebe. Derartige Tiere liefern ein Verfahren zum Herstellen des Carboxylaseenzyms, bei dem Milch von den Tieren gesammelt werden kann und das Carboxylaseenzym aus der Milch isoliert werden kann. Die Carboxylase, isoliert aus der Milch, kann dann verwendet werden unter anderen Dingen zum Carboxylieren von Vitamin K abhängigen Proteinen in vitro. In der Alternative können Vitamin K-abhängige Proteine mit der Vitamin K abhängigen Carboxylase in derartigen transgenen Tieren in ähnlicher Weise coexprimiert werden durch ein ähnliches Expressionssystem und die carboxylierten Proteine aus der Milch gesammelt werden. Derartige Tiere können hergestellt werden, und derartige Verfahren können in Übereinstimmung mit bekannten verfahren durchgeführt werden. Siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 4 873 316 von H.
Meade und N. Lonberg, betitelt "Isolation of Exogenous Recombinant Proteins from the Milk of Transgenic Mammals"; U.S. Patent Nr. 4 873 191 von T. Wagner und P. Hoppe, betitelt "Genetic Transformation of zygotes."

E. ZUSÄTZLICHE ANMELDUNGEN

Weil der beste Marker für Humanleberkarzinom erhöhte Spiegel von untercarboxyliertem Prothrombin ist, sind Hybidisierungssonden für mRNA Spiegel von Carboxylase geeignet für Diagnose von Leberkrebs, wie detailliert im nachfolgenden diskutiert. Wie auch im nachfolgenden diskutiert, können Antikörper für die Carboxylase hergestellt werden, mit einer geeigneten nachweisbaren Gruppe markiert werden und verwendet werden, geänderte Muster von Expression des Carboxylaseenzyms in einer Person (beispielsweise ein Patient, potentiell durch Leberkarzinom beeinträchtigt) zu diagnostizieren. Antikörper können auch verwendet werden, die Carboxylase für in-vitro Carboxylierung von untercarboxylierten Proteinen zu immobilisieren. Ferner kann man eine lösliche Form der Carboxylase exprimieren unter Ermöglichen der in vitro Modifizierung von untercarboxylierten Proteinen.
Hybridisierungssonden können cDNA Fragmente oder Oligonucleotide sein und können mit einer nachweisbaren Gruppe markiert sein, wie hier im nachfolgenden diskutiert. Die Sonden binden selektiv an mRNA, die Vitamin K-abhängige Carboxylase codiert. Paare von Sonden, die als PCR Primer für Carboxylase mRNA oder einen Teil davon dienen, können in Übereinstimmung mit dem Verfahren, beschrieben in U.S. Patenten Nr. 4 683 202 und 4 683 195, oder Modifikationen davon, die den Fachleuten offenkundig sein werden, verwendet werden.
Lösliches Carboxylaseenzym kann hergestellt werden durch Löschen der Transmembranregion der Carboxylase cDNA, dann Exprimieren des geänderten Enzyms und dann Sammeln des geänderten Enzyms für Solubilisierung in einer wäßrigen Lösung. Die Wahl von wäßriger Lösung ist nicht kritisch, wobei die gewählte Lösung einfach eine ist, die angemessen zum Durchführen der Carboxylierung von Vitamin K abhängigen Proteinen in vitro ist. Mit "Löschung," der Transmembranregion der cDNA meinen wir Entfernung oder Änderung eines ausreichenden Teils der hydrophoben Transmembrandomäne, das Enzym, für das codiert wird, löslich in einer wäßrigen Lösung zu machen.
Eine Mannigfaltigkeit von nachweisbaren Gruppen kann verwendet werden, Antikörper und Sonden zu markieren, und der Ausdruck "markiert" wird hier verwendet, sich auf das Konjugieren oder kovalente Binden irgendeiner geeigneten nachweisbaren Gruppe zu beziehen (beispielsweise Meerrettichperoxidase, β-Glucuronidase, alkalische Phosphatase und β-D-Galactosidase), fluoreszierende Markierungen (beispielsweise Fluorescein, Luciferase) und Radiomarkierungen (beispielsweise ¹&sup4;C, ¹³¹I, ³H, ³²p und ³&sup5;S) für die zu markierende Verbindung. Techniken zum Markieren verschiedener Verbindungen, einschließlich Proteine, Peptide und Antikörper sind gut bekannt. Siehe beispielsweise Morrison, Methods in Enzymology 32b, 103 (1974); Syvanen et al., J. Biol. Chem. 284, 3762 (1973); Bolton und Hunter, Biochem. J. 133, 529 (1973).
Antikörper, die spezifisch an das Carboxylaseenzym binden (d. h. Antikörper, die an eine einzelne antigene Stelle oder Epitop auf dem Carboxylaseenzym binden) können polyklonal oder monoklonal an Ursprung sein, aber sind vorzugsweise von monoklonalem Ursprung. Die Antikörper sind vorzugsweise IgG Antikörper von irgendeiner geeigneten Art, wie Ratte, Kaninchen oder Pferd, aber sind im allgemeinen von Säugerursprung. Fragmente von IqG Antikörpern, die die Fähigkeit zurückbehalten, spezifisch den ax1 Rezeptor zu binden, wie F(ab')&sub2;, F(ab') und Fab Fragmente, sollen von dem Ausdruck, Antikörper" hier umschlossen sein. Die Antikörper können chimär sein, wie von M. Walker et al., Molecular Immunol. 26, 403 (1989) beschrieben. Antikörper können auf einem festen Träger des Typs, verwendet als eine Packung in einer Affinitätschromatographiesäule, wie Sepharose, Silika oder Glaskugeln, in Übereinstimmung mit bekannten Techniken immobilisiert werden.
Monoklonale Antikörper, die an Carboxylaseenzym binden, werden hergestellt durch Kultivieren einer Zelle oder Zelllinie, fähig zum Herstellen eines Antikörpers unter Bedingungen, geeignet für die Herstellung des Antikörpers (beispielsweise durch Beibehalten der Zelllinie in HAT Medien), und dann Sammeln des Antikörpers aus der Kultur (beispielsweise durch Fällung, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, oder dergleichen). Die Antikörper können in einer Hybridomzelllinie in dem umfassend verwendeten verfahren, beschrieben, von G. Kohler und C. Milstein, Nature 256, 495 (1975), erzeugt werden, oder sie können mit einem rekombinanten Vektor in einer geeigneten Wirtszelle erzeugt werden, beispielsweise Escherichia coli, in der Weise, beschrieben von W. Huse et al., Generation of α Large Combinatorial Library of the Immunglobulin Repertoire in Phage Lambda, Science 246, 1275 (1989).
Die gegenwärtige Erfindung wird in größerem Detail in den folgenden nicht-beschränkenden Beispielen erklärt. In den Beispielen bedeutet mMol Millimole; ml bedeutet Milliliter; mCi bedeutet MilliCurie; ug bedeutet Mikrogramm; uM bedeutet Micromolar; gm bedeutet Gramm; h bedeutet Stunden; cpm bedeutet Counts pro Minute; MOPS bedeutet 4-Morpholinpropansulfonsäure; und CHAPS bedeutet 3- [(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1propansulfonat. Temperaturen sind in Grad Celsius gegeben.

BEISPIEL 1

REINIGUNG AUF BEINAHE HOMOGENITÄT DER VITAMIN K-ABHÄNGIGEN CARBOXYLASE

Alle hier verwendeten Chemikalien sind Reagenzgrad. 3,3' Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionat) (DSSP) wurde von Pierce Chemical Co. gekauft. Aprotinin und Pepstatin A wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals gekauft. Leupeptin, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und (3-((3- Cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propansulfonat (CHAPS) wurden von Sigma erhalten. Das Peptid FLEEL und die Proteaseinhibitoren FFRCK und FPRCK waren von Bachem. Peptid proFIX19, AVFLDHENANKILNRPKRY wurde von Frank Church von UNC-CH synthetisiert. NaH¹&sup4;CO&sub3;, spezifische Aktivität 50,0 mCi/mMol, war von NEN und Aqua Mephyton von Merck Sharp und Dohme. Proteaseinhibitor Cocktail (PIC) wurde frisch hergestellt als eine 10 X PIC Stammlösung mit 20 mM Dithiothreitol, 20 mm EDTA, 1,25 ug/ml FFRCK, 1,25 ug/ml FPRCK, 5 ug/ml Leupeptin, 7 ug/ml Pepstatin A, 340 ug/ml PMSF und 20 ug/ml Aprotinin.

HERSTELLUNG VON AFFINITÄTSSÄULE

Peptid FIXQ/S (SEQ ID NR: 1) (Reste -18 bis 41 von Faktor IX mit Mutationen Arg zu Glu bei Rest -4 und Arg zu Ser bei Rest -1) wurde als der Affinitätsligand gewählt, weil seine Affinität für die Carboxylase nicht geändert ist, und weil er weniger Trypsinspaltungsstellen als unsere anderen Peptide hat und es deshalb weniger wahrscheinlich ist, daß er durch Proteasen in den Rohextrakten, verwendet für Reinigung, abgebaut wird. Peptid FIXQ/S wurde hergestellt gemäß S.-M. Wu et al. supra. Einhundert mg FIXQ/S wurden an 25 ml Affi-Gel 10 (Bio-Rad Inc.) gemäß dem Hersteller gekoppelt. Die Reaktion wurde bei pH 4,8 durchgeführt, welches eine Einheit unterhalb des theoretischen pI von FIXQ/S ist. Die Endkonzentration des kovalent gebundenen FIXQ/S auf Affi-Gel 10 wurde als 442 uM gemessen, und der gekoppelte Ligand wird als Affi-FIXQ/S bezeichnet.
AFFINITÄTSREINIGUNG VON CARBOXYLASE
Herstellung von Mikrosomen aus Rinderleber, Solubilisierung von Mikrosomen und Ammonium- Sulfat Fraktionierung waren wie von Girardot (supra) beschrieben. Proteinkonzentration wurde mit dem Bio-Rad Proteinassay Kit gemessen. Siehe M. Bradford, Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976). Alternativ, Proteinkonzentration und relative Reinheit wurden bestimmt durch Scannen von SDS-PAGE Gelen, gefärbt mit Silber oder Coomassie blue. Siehe U. Laemmli, Nature 227: 680-685 (1970); H. Blum, et al., Electrophoresis 8: 93-99 (1987). In allen Fällen wurden Referenzkurven mit IgG als einem Standard hergestellt. Ammoniumsulfat fraktioniertes mikrosomales Protein (7-8 gm) wurde in Puffer A (25 mM MOPS, pH 7,0, 500 mM N&Cl, 20% Glycerol, 0,1% Phosophatidylcholin und 1 X PIC) mit 0,1% CHAPS zu einem Gesamtvolumen von 150 ml resuspendiert. In allen Reinigungsexperimenten, ausgenommen dasjenige in Bahn 3 von Fig. 1 dargestellte, wurde die Suspension mit einer Standard Ultraschallsonde (Sonicator Modell W-220F, Heat Systems Inc.) bei Maßstab 9 für 100 2-Sekundenpulse in einem Eisbad beschallt. Das beschallte Material wurde auf eine 25-ml Affi-FIXQ/S Säule, äquilibriert mit 150 ml 0,1% CHAPS in Puffer A bei 4ºC mit einer Flußgeschwindigkeit von 10 ml/h, geladen. Die beladene Säule wurde mit 100-200 ml 0,1% CHAPS in Puffer A gewaschen. Die Carboxylase wurde von der Affi-FIXQ/S Säule durch eines der folgenden verfahren eluiert.

ELUTION I

150 uM Propeptid in Puffer A mit 0,1% CHAPS wurde verwendet, die Carboxylase zu eluieren. Die Säule wurde mit Elutionsmittel gefüllt und über Nacht vor Sammeln des Eluats inkubiert. Das Propeptideluat wurde mit Centricon-30 (Amicon Inc.) konzentriert; das Filtrat konnte für Elution wiederverwendet werden. Beträchtliche Mengen von Carboxylaseaktivität wurden kontinierlich eine Woche lang eluiert.

ELUTION II

Eine Flußgschwindigkeit von 10 ml/h wurde für alle Chromatographiestufen verwendet. Eine umfassende Waschung wurde durch zwei aufeinaderfolgende Stufen durchgeführt: 100 ml 0,05% bis 0,85% Triton X-100 Gradient in Puffer B (25 mM MOPS, pH 7,0, 50 mM NaCl, 20% Glycerol, 0,1%, und 1 X PIC), enthaltend 0,2% Phosphatidylcholin, gefolgt von 100 ml 0,1% bis 1% CHAPS Gradient in Puffer B, enthaltend 0,1% Phosphatidylcholin. Elution wurde durchgeführt durch Verwenden von 100 ml eines Doppelgradienten von 0,1% bis 1% CHAPS und 0 bis 2 uM proFIX19 in Puffer A und fortgesetzt mit weiteren 100 ml 1% CHAPS und 2 um proFIX19 in Puffer A.

CM-SEPHAROSE CHROMATOGRAPHIE

Entsalzene, konzentrierte Carboxylase (Gesamtaktivität von 2,2 · 10&sup7; cpm/30 Min), eluiert durch Verfahren I, wurde in Puffer C hergestellt (25 mM MOPS, pH 7,0, 100 mM NaCl, 20% Glycerol, 1 X PIC) mit 1% Triton X-100, 0,7% Phosphatidylcholin und auf ein Gesamtvolumen von 3,85 ml. Diese Carboxylasepräparation wurde dann in einem Badbeschaller für 24 5-Sekunden Pulse beschallt und zu 5,8 ml CM Sepharose Chargen adsorbiert. Die CM Sepharose wurde in eine Säule gepackt, gewaschen und mit 10 ml von NaCl, Gradient von 100 mM bis 450 mM in Puffer C mit 0,05 Triton X-100, 0,2% Phosphatidylcholin eluiert.

VERNETZUNGREAKTION

Das vernetzen wurde mit (DTSSP) durchgeführt, wie von S. Jung und M. Moroi, Biochim. Biophys. Acta 761: 152-162 (1983) beschrieben. Für Wettbewerbsexperimente war ein 100-facher Überschuß von proFIX19 eingeschlossen.

CARBOXYLASE ASSAY

Der Assay wurde 30 Min lang durchgeführt, wie in S.-M. Wu et al., supra, beschrieben, in 25 mM MOPS, pH 7,0, 500 mm NaCl, mit 0,16% CHAPS/Phosphatidylcholin. FLEEL bei 3,6 mM und 5 uCi NaH¹&sup4;CO&sub3; waren die Substrate; 0,8 M, Ammoniumsulfat und 16 uM proFIX19 waren als Aktivatoren eingeschlossen.

IDENTIFIZIERUNG DER CARBOXYLASE

Fig. 1 zeigt eine reduzierende SDS-PAGE Analyse unserer anfänglichen Affi-FIXQ/S Reinigung von Carboxylase. Es gibt wenig Unterschied zwischen dem Proteinmuster des Ausgangsmaterials und dem Durchfluß (Bahn 1 und Bahn 2). Die Probe in Bahn 3 stellt Protein dar, eluiert mit 150 uM proFIX19. Es gibt einige Verstärkung einer Proteinbande bei 94000 Mf, aber die erzielte Reinigung ist nur 60-fach. Wir dachten, daß die geringe Reinigung das Ergebnis von großen Mizellen sein könnte, die mindestens ein Cacrboxylasemolekül enthielten wie auch andere integrale Membranproteine. Das Carboxylasemolekül würde Binden an die Affinitätsmatrix erlauben, aber die anderen Proteine würden mit der Carboxylase coeluiert werden. Wir versuchten, die Standardlösung auf dieses Problem anzuwenden, was bedeutet, die Detergenzkonzentration zu erhöhen, bis ein Protein pro Mizelle erzielt wird. Jedoch würde die Carboxylase nicht an Affi-FDCQ/S in der Anwesenheit einer hohen Konzentration einer Zahl von Detergenzien binden. Deshalb versuchten wir, die Mizellengröße zu reduzieren durch Beschallen des Ausgangsmaterials. Wie in Fig. 1, Bahn 4 gezeigt, ist die relative Intensität der 94000-Mf Bande in dem proFIX19 Eluat viel hervorragender nach Beschallung. Ferner erhöhte die Menge von Carboxylase, gebunden an Affi-FIXQ/S sich von 15% bis 30%, und die Reinigung erhöhte sich auf 500-fach.
Um die Bindungsspezifität von FIXQ/S zu bewerten und eine unabhängige Schätzung des Molekulargewichts der Carboxylase zu erzielen, vernetzten wir ¹²&sup5;I-FIXQ/S an 60-fach affinitätsgereinigtes Material (Fig. 1, Bahn 3). Das Autoradiogramm in Fig. 2, Bahn 2 zeigt eine Hauptbande, leicht größer als 97000 Mf, welches den Komplex des vernetzten Proteins und des synthetischen Peptids ¹²&sup5;I-FIXQ/S darstellt. Diese Hauptbande wurde eliminiert, als das gleiche Experiment in der Anwesenheit von Überschuß von nicht-radioaktivem proFIX19 (Fig. 2, Bahn 1) laufengelassen wurde. Die kleineren Banden in Bahn 2 wurden nicht durch den Wettbewerb (Bahn 1) beeinträchigt. Durch Abziehen des Molekulargewichts von FIXQ/S (7000 Mf) von der geschätzten Größe des vernetzten Komplexes schätzen wir, daß die Größe des Proteins, an das das FIXQ/S Pepid bindet, annähernd 94000 Mf ist. Dieses stimmt mit der Größe der Bande, angereichert in jeder der frühen Reinigungen (Fig. 1) überein, anzeigend, daß das 94000 Mf Protein (Bahnen 3 und 4) die Ezymcarboxylase ist, und daß die Wechselwirkung zwischen dem Peptid FIXQ/S und Carboxylase sehr spezifisch ist.
Ergebnisse, gezeigt in Fig. 3, zeigen, daß weitere Reinigung erzielt werden kann durch Chromatographie des 500fach affinitätsgereinigten Materials auf CM Sepharose. Resolubilisierung, Beschallung und Chargenadsorption auf CM Sepharose, gefolgt von Elution mit einem Salzgradienten, erzeugte eine dramatische Verbesserung an Reinigung. Die Chargenadsorptionsstufe ist sehr wichtig, wenn enzymatische Aktivität verloren geht, und beträchtlich weniger Reinigung wird erzielt, wenn das Material auf dem oberen Teil der Säule adsorbiert wird. Jedoch ist die wichtigste Information in dieser Figur, daß die Carboxylaseaktivität in jeder Fraktion proportional zu der Menge von 94000 Mf Protein bei der entsprechenden SDS-PAGE Analyse ist. Mengenmäßige Bestimmung des Silber-gefärbten Gels durch Scannen zeigt, daß das Protein 80-90% rein ist. Die spezifische Aktivität ist 2 · 10&sup9; epm/mg/h.
Weiterer Beweis, daß die 94000-Mf Bande die Carboxylase darstellt, ist in Fig. 4 dargestellt. Eine Carboxylase Präparation, gereinigt durch Affi-FIXQ/S und Carboxymethylsepharose (Bahn 2), wurde wiederum auf die Affi-FIXQ/S Säule angewendet. Bahn 3 zeigt, daß die Aktivität von Carboxylase entfernt wurde, als das 94000 MfProtein an Affi-FIXQ/S band. Bahn 4 zeigt, daß die Aktivität wiederum mit dem 94000 Mf Protein coeluierte. Diese Carboxylase ist von einer unserer früheren Präparationen und enthielt eine beträchtliche Menge von inaktiver Carboxylase. Dieses erklärt die Beobachtung, daß die mengen von Protein in den 94 000 Mf Banden in Bahnen 2 und 4 annähernd gleich sind, während die Aktivität in der Probe, erneut gereinigt durch Affi-FIXQ/S. größer ist; nur aktive Carboxylase bindet an die Affinitätssäule.

REINIGUNG DER CARBOXYLASE

Eines der Probleme bei Verwenden der Affinitätssäule ist, daß die Elution unter Verwenden des Propeptids sehr langam ist und mehrere Tage benötigt zum Erzielen einer angemessenen Ausbeute. Wir erkundeten deshalb alternative Verfahren zum Eluieren des Enzyms von der Affinitätssäule. Wie in Fig. 5 gezeigt, waren wir fähig, im wesentlichen alle kontaminierenden Proteine ohne Verlust von Carboxylaseaktivität zu entfernen durch Waschen der beladenen Affinitätssäule umfassend mit Triton X- 100, gefolgt von einem Waschen mit CHAPS. Die Carboxylase konnte dann mit einem Gradienten von CHAPS in einer hohen Konzentration von NaCl, eluiert werden (Daten nicht gezeigt) oder einem Gradienten von CHAPS und Propeptid, enthaltend eine Konzentration von NaCl (Fig. 5). Die Carboxylaseaktivität stimmt mit dem 94000 Mf Proteinprofil überein. Und in Abhängigkeit von der gewählten Fraktion ist die Carboxylase 80 bis 95% rein. Wenn das Propeptid von dem Elutionsgradienten weggelassen wird, verliert die Carboxylase in höheren Konzentrationen von CHAPS schnell Aktivität. Tabelle 1 ist die Reinigungstabelle für unser Endreinigungsschema. Beachte, daß 30% der Aktivität in dem Ausgangsmaterial gebunden ist (erhalten durch Abziehen der Aktivität in dem Durchfluß von der Beladung), und daß 34% von Gesamtaktivität durch Elution gewonnen wird. Somit erscheint es, daß sehr wenig des beobachteten Anstiegs an spezifischer Akivität auf der Entfernung eines Inhibitors beruht. TABELLE L. REINIGUNG VON CARBOXYLASE
Wir haben die Carboxylase auf 80-90% Reinheit mit einer Ausbeute von 34% affinitätsgereinigt. Das Verfahren ist schnell und effizient. Die gesamte Reinigung kann in vier Tagen durchgeführt werden. Es ist schwierig, verschiedene Reinigungsschemen zu vergleichen, aber durch Vergleichen spezifischer Endaktivitäten scheint es, daß unsere Reinigung zu einer Carboxylasepräparation führt, die 185-fach höher an spezifischer Aktivität als das beste zuvor veröffentlichte Verfahren ist. Von ¹&sup4;CO&sub2; Einfügung in das Pentapeptid FLEEL schätzen wir die spezifische Aktivität unserer Carboxylase, hergestellt durch Affi- FIXQ/S Chromatographie, eluiert durch Verfahren II (Fig. 5), als 2,4 · 10&sup9; cpm/mg Protein/h. Dieses stellt eine 7000-fache Reinigung dar. Hubbard et al. berichteten eine spezifische Aktivität von 1,3 · 10&sup7; cpm/mg Protein/h mit einer 107-fachen Reinigung aus ihrer Affinitätsreinigungsstufe. Die Ergebnisse sollten vergleichbar sein, weil das CO&sub2;, verwendet in den zwei Experimenten, die gleichen spezifischen Aktivitäten hatte.
Das Hauptprotein, das mit der Carboxylaseaktivität in unserer Präparation zusammentrifft, hat ein 94 000 Mf bei reduzierender SDS-PAGE Analyse. Dieses ist sehr verschieden von dem 77000 Mf Protein, berichtet von Hubbard et al. (supra). Flynn et al. zeigten, daß viele verschiedene kleine Peptide verwendet werden konnten für die Einzel-Stufen Afflnitätsreinigung von BiP (oder Glucose-reguliertes Protein oder hsp 78) von solubilisierten Mikrosomen. Siehe G. Flynn, Science 245: 385-390 (1989). Hubbard et al. (supra) erhielten unter Verwenden eines ähnlichen Ausgangsmaterials und eines ähnlichen Reinigungsschemas ein Protein mit dem gleichen Molekulargewicht wie BiP mit einer relativ niedrigen spezifischen Aktivität für Carboxylase. Wir schlußfolgerten, daß das 77000 Mf Protein, berichtet von Hubbard et al., BiP war, eines der reichlichsten Proteine in dem endoplasmatischen Retikulum.
Das in diesem Beispiel für Reinigung der Carboxylase verwendete Verfahren kann allgemeine Bedeutsamkeit für die Reinigung von Membranproteinen haben. Eine Grundstrategie zum Reinigen von integralen Membranproteinen ist es, Mizellen, enhaltend nur ein Protein, herzustellen. Jedoch führen höhere Konzentrationen von Detergenz oft zu der Inaktivierung des Proteins von Interesse. Durch angemessene Beschallung kann man kleinere gemischte Mizellen erzeugen, ohne auf die katalytische oder Bindungsfähikeit des Proteine zu wirken. Weil das immobilisierte Protein oft stabiler ist, können die Probleme, verbunden mit gemischten Mizellen, durch sorfältiges Wählen der Bedingungen zum Waschen der gebundenen festen Phase gelöst werden. Dieses Verfahren zum Waschen des gebundenen Proteins mit einer hohen Konzentration von Detergenz sollte auch auf integrale Membranproteine, gebunden an Standardionenaustauschmatrizen, anwendbar sein.
Carboxylase ist ein integrales Membranprotein, vorhanden in niedrigen Konzentrationen, das zuvor Reinigung widerstanden hat. Zum Überwinden der inhärenten Schwierigkeiten wählen wir Afinitätsbinden als die erste Reinigungsstufe. Durch Manipulieren der biophysikalischen Eigenschafen von Mizellen waren wir fähig, eine Einzelstufen-Reinigung von Carboxylase mit 80-90% Reinheit zu erzielen. Ausgehend von 8 Gramm von mikrosomalem Protein können wir leicht 300-400 ug Carboxylase von einer 25-ml Affl-FIXQ/S Säule mit einer Endausbeute von 34% der Ausgangsaktivität erzeugen. Glycerol, das oft verwendet wird, das Membranprotein während Reinigung zu stabilisieren, erwies sich, ein wichtiger Stabilisator für Carboxylase zu sein. Es erhöht die Wärmestabilität von Carboxylase und erhöht auch die Halbwertszeit von Carboylase bei 4ºC. Obwohl 20% Glycerol nicht Carboxylasebinden an Affi-FIXQ/S inhibiert, hält es nicht Carboxylase davon ab, durch proFIX19 eluiert zu werden und inhibiert auch die Enzymaktivität. Die gereinigte Carboxylase ist sehr stabil und kann bei -70ºC fur Monate ohne Aktivitätsverlust gelagert werden.

BEISPIEL 2

TEILSEQUENZIEREN VON CARBOXYLASEENZYM

Carboxylaseenzym, hergestellt durch das ZweiStufenreinigungsverfahren, dargestellt in Beispiel 1, zuvor angegeben, wurde weiterhin gereinigt durch Entfernen von Lipid durch Hexan/Isopropanol Extraktion. Das Enzym wurde dann erneut konzentriert und auf einem präparativen reduzierenden SDS- PAGE getrennt. Nach Elektrophorese wurden Gesamtproteine auf eine Nitrocellulosemembran mittels Standard Western Blot Methodologie überragen. Die übertragenen Proteine wurden mit Ponceau S unter Orten der Carboxylasebande gefärbt, die dann für Aminosäuresequenzieren herausgeschnitten wurde. Das Aminosäuresequenzieren wurde von Dr. William S. Lane, Harvard Microchem, Harvard Universität durchgeführt. Aminosäuresequenz wurde von verschiedenen tryptischen Peptiden der Carboxylase erhalten. Die Sequenz des längsten Peptids, NT77, ist durch SEQ ID NR: 2 gegeben. NT77 war 37 Aminosäuren lang. Die Sequenz eines zweiten Peptids, NT56, ist durch SEQ ID: 3 gegeben. Die Sequenz eines dritten Peptids, NT 49, ist in SEQ ID NR: 4 gegeben. NT56 und NT49 waren 12 und 16 Aminosäuren lang.

BEISPIEL 3

HERSTELLUNG VON TEIL cDNA SEQUENZ

Die Codons für die Aminsäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID NR: 2, zuvor angegeben, wurden verwendet, verschiedene redundante Oligonucleotide für Verwendung in der Polymerasekettenreaktion (PCR) zu entwerfen. Eine Mischung von 1024 Oligonucleotiden (SEQ ID NR: 5) wurde synthetisiert, die Redundanz in den Codons an dem Carboxyterminus des 38 Aminosäuren tryptischen Peptids NT77, gegeben als SEQ ID NR: 2, in Anschlag zu bringen; diese Mischung wurde verwendet, die Erststrang cDNA mit Reverser Transcriptase zu synthetisieren.
Zwei degenerierte Oligonucleotide wurden als PCR Primer synthetisiert und für die Polymerasekettenreaktion verwendet. Oligonucleotide enthielten regelmäßige Basen oder enthalten 5- Fluoruridin, um Redundanz zu reduzieren, und wurden von Oligos Etc., Inc., Suite 266, 800 Village Walk, Guilford, CT 06457 USA synthetisiert. Eines der Oligonucleotidprimer hatte die Sequenz: AAN NTN GCN TTN GGN MG (SEQ ID NR: 6), wobei das N bei Rest 3 5-Fluordeoxyuridin (F) darstellt; das N bei Rest 4 stellt F dar; das N bei Rest 6 stellt F oder G dar; das N bei Rest 9 stellt F oder G dar; das N bei Rest 12 stellt F dar; und das N bei Rest 15 stellt A, T, G oder C dar. Der andere Oligonucleotidprimer hatte die Sequenz: TC NCC NGC NGG YTC RAA (SEQ ID NR: 7), wobei das N bei Rest 3 F oder G darstellt; das N bei Rest 6 stellt F oder G dar; und das N bei Rest 9 stellt F oder G dar.
Die Polymerasekettenreaktion wurde mittels Standardverfahren durchgeführt (94ºC, 1 Min; 58ºC, 3 Min; 72ºC, 2 Min; 25 Zyklen) unter verwenden von Taq Polymerase, gekauft. von Perkin Ehner Cetus (Teil Nr. N801-0046) und eines Cetus Wärmekreislaufführers, erhalten von Cetus.
Ein Produkt von 87 Nucleotiden wurde aus der Polymerasekettenreaktion, zuvor beschrieben, erhalten und sequenziert. Eine 55 Nucleotidsonde, komplementär zu der Codierungssequenz des PCR Produkts, wurde dann synthetisiert; diese Sonde ist als SEQ ID NR: 8 gegeben.

BEISPIEL 4

HERSTELLUNG VON RINDER cDNA SEQUENZ

Die 55-Nucleotidsonde, dargestellt durch SEQ ID NR: 8, wurde von Oligos Etc., Inc. synthetisiert. Diese Sonde wird mit ³²P an dem 5' Ende in Übereinstimmung mit bekannten Techniken markiert und wird verendet, eine Rinder cDNA Bibliothek, gekauft von Stratagene, Inc. duchzumustern. Ein positiver Klon wird erhalten und als XZAP-CARB 1.6 identifiziert. Der positive Klon wird teilweise sequenziert, und Teile der Klonsequenz sind als SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 11 und SEQ ID NR: 13 gegeben. Die Peptide, codiert durch diese Sequenzen, sind separat als SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12 und SEQ ID NR: 14 gegeben. Beachte, daß in SEQ ID NR: 10 Aminosäurereste 58 bis 68 Aminosäureresten 1-11 des tryptischen Peptids NT77, gegeben als SEQ ID NR: 2, entsprechen; in SEQ ID NR: 10 entsprechen Aminosäurereste 1-12 Aminosäureresten 1-12 des tryptischen Peptids NT56, gegeben als SEQ ID NR: 3; in SEQ ID NR: 12 entsprechen Aminosäurereste 1-10 Aminosäureresten 28-37 von tryptischem Peptid NT77, gegeben in SEQ ID NR: 2; und in SEQ ID NR: 14 entsprechen Aminosäurereste 1-14 Aminosäureresten 1-14 von tryptischem Peptid NT49, gegeben als SEQ ID NR: 4.
Der Bakteriophage λZAP-CARB1.6 wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA in Übereinstimmung mit den Vorschriften des Budapester Vertrages am 23. April, 1991 hinterlegt und ihm ist die ATCC Hinterlegungsnummer 75002 zugeteilt worden.

BEISPIEL 5

HERSTELLUNG UND EXPRESSION VON HUMAN cDNA SEQUENZ

Die 1,6 Kb Insertion von λZAP-CARB1.6 wird verwendet, eine Human cDNA Bibliothek durchzumustern unter Nachweisen von Human cDNA Sequenz, die eine Vitamin K abhängige Carboxylase codiert. Durchmustern wird durch einen Standard in situ Hybridisierungsassay durchgeführt, siehe J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2te Auflage 1989), unter Bedingungen, dargestellt durch eine Waschstringenz von 0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat und 0,1% SDS bei einer Temperatur von 60ºC oder 70ºC. Eine Anzahl von positiven Klonen wird nachgewiesen.
Keiner der vorhergehenden Klone, codiert lili die gesamte Sequenz der Gammaglutamylcarboxylase. Sie waren jedoch wichtig, weil sie uns erlaubten, Lebercarboxylase mit der Carboxylase von einem anderen Gewebe zu vergleichen. Wir durchmusterten eine zweite cDNA Bibliothek, hergestellt mit mRNA von einer Humanzelllinie (HEL Humanerythroleukämie). Aus der HEL Bibliothek erhielten wir einen Klon, SEQ ID NR: 15, der die gesamte Codierungssequenz der Humancarboxylase einschloß und einige Stromaufwärts- und Stromabwärtssequenzen. Die cDNA codiert ein Protein von 758 Aminosäuren (SEQ ID NR: 16), dessen Molekulargewicht 87542 (ausschließlich Carbohydrate) ist. Dieser Klon ist die authentische Carboxylase und besitzt die gesamte Codierungssequenz.
Entscheidender Beweis, daß der Klon von SEQ ID NR: 15 die authentische Humancarboxylase enthält, ist aus vorübergehender Expression in Human 293 Nierenzellen. Mikrosomen aus Zellen, transfektioniert mit pCMV.hGC&sbplus;, welches der Expressionsvektor pCMVS (Cytomegaloviruspromotor) ist, der die cDNA von SEQ ID NR: 15 enthielt, zeigte einen 16-20fachen Anstieg an Carboxylaseaktivität, verglichen mit Mikrosomen aus Schein infizierten Zellen. Der Expressionsvektor pCMV5, siehe S. Andersson, J. Biol. Chem. 264, 8222-8229 (1989) war ein Geschenk von Dr. David Russel. Escherichia coli Zellen, enthaltend pCMV.hGC+, bezeichnet als E. coli, pCMV.hGC+, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockeville, Maryland 20852 USA in Übereinstimmung mit den Vorschriften des Budapester Vertrages am 15. August, 1991 hinterlegt und wurde die ATCC Hinterlegungsnummer 68666 zugeteilt.
Es ist wahrscheinlich, daß der Spiegel von Carboxylase größtenteils in stabilen Zelllinien erhöht werden kann. Dieses kann mittels Standardamplifikationstechniken durchgeführt werden und auch durch Machen der Translationsinitiierungsregion übereinstimmend mit dem Ideal (D. Cavener und S. Ray, Nucleic Acids Res. 19, 3185 (1991).
Es sollte bemerkt werden, daß die Humancarboxylase und Rindercarboxylase über die Region, wo beide Sequenzen bekannt. sind (664 Amnosäuren), 91% identisch sind. Die Aminosäuresequenz der Leber und HEL Carboxylase sind auch über die Region identisch, wo beide Sequenzen verfügbar sind (354 Aminosäuren). Es gibt zwei unterschiede an Nucleotidsequenz in den zwei Humanklonen, aber sie führen zu der gleichen Aminosäuresequenz. Es ist wahrscheinlich, daß etwas Polymorphismus existiert.
Die vorhergehenden Beispiele veranschaulichen die gegenwärtige Erfindung, aber sind nicht als beschränkend davon zu nehmen.

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT: Wu, Sheue-Mei Stafford, Darrel W.
(ii) TITLE OF INVENTION: Vitamin K-Dependent Garboxylase
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 16
(iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:
(A) ADDRESSEE: Kenneth D. Sibley; Bell, Seitzer, Park and Gibson
(B) STREET: Post Office Drawer 34009
(C) CITY: Charlotte
(D) STATE: North Carolina
(E) COUNTRY: U.S.A.
(F) ZIP: 28234
(v) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) CURRENT APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER:
(B) FILING DATE:
(C) CLASSIFICATION:
(vii) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: US 07/697,427
(B) FILING DATE: 08-MAY-1991
(viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:
(A) NAME: Sibley, Kenneth D.
(B) REGISTRATION NUMBER: 31,665
(C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 5470-34
(ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:
(A) TELEPHONE: 919-881-3140
(B) TELEFAX: 919-881-3175
(C) TELEX: 575102

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 59 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 37 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 12 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 16 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 17 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 17 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTN: 17 base pairs
(8) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 55 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTN: 204 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..204 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 68 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 36 base pairs
(B) TYPf: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..36 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11:

(2) INFORMATION FOR SEQ 10 NO: 12:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 12 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TDPOLDGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTIDN: SEQ ID NO: 12:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 42 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLDGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..42 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 14 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 14:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 2452 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 87..2360 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 15:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 758 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0 : 16:

Claims

1. Isolierte DNA, die eine Vitamin K abhängige Carboxylase codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) isolierter DNA, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus DNA, die Rinder 94000 Dalton Vitamin K abhängige Carboxylase codiert und die Sequenz von SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 11 oder SEQ ID NR: 13 umfaßt, und DNA mit der hier als SEQ ID NR: 15 gegebenen Sequenz, und die Human Vitamin K abhängige Carboxylase codiert, und

(b) isolierter DNA, die an den komplementären Strang von isolierter DNA von (a), zuvor angegeben, unter stringenten Bedingungen, dargestellt durch eine Waschstringenz von 0,3M NaCl, 0,03M Natriumcitrat und 0,1% SDS, bei 70ºC hybridisiert, und die eine Vitamin K abhängige Carboxylase mindestens 75% homolog zu isolierter DNA von (a), zuvor angegeben; codiert.

2. Isolierte DNA nach Anspruch 1, die eine Carboxylase codiert, die ein Vitamin K abhängiges Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C, Protein S und Prothrombin, aktiviert.

3. Isolierte DNA nach Anspruch 1, die Human Vitamin K abhängige Carboxylase codiert.

4. Rekombinantes DNA Molekül, umfassend Klonierungsvektor DNA und eine DNA nach Anspruch 1.

5. Rekombinantes DNA Molekül nach Anspruch 4, wobei die Vektor DNA einen Vektor, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Plasmiden, Adenoviren und Cytomegaloviren, umfaßt.

6. Rekombinantes DNA Molekül nach Anspruch 4, wobei die Vektor DNA einen Baculovirusvektor umfaßt.

7. Wirtszelle, enthaltend ein rekombinantes DNA Molekül nach Anspruch 4, das die codierte Carboxylase exprimiert.

8. Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle ist.

9. Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Babyhamsternierenzellen, Mauszellen und Eierstockzellen vom Chinesischen Hamster.

10. Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine Insektenzelle ist.

11. Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle ein Vitamin K abhängiges Protein exprimiert.

12. Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle ein Vitamin K abhängiges Protein, umfassend ein Blutkoagulationsprotein, exprimiert.

13. Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle ein Vitamin K abhängiges Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C, Protein S und Prothrombin, exprimiert.

14. Verfahren zum Herstellen eines Vitamin K abhängigen Proteins, das Kultivieren einer Wirtszelle, die ein Vitamin K abhängiges Protein in der Anwesenheit von Vitamin K exprimiert, und dann Ernten des Vitamin K abhängigen Proteins aus der Kultur umfaßt, und ferner umfassend:

Verwenden als die Wirtszelle eine eukaryontische Wirtszelle, enthaltend ein rekombinantes DNA Molekül, umfassend Klonierungsvektor DNA, operabel in der Wirtszelle, und eine DNA, die eine Vitamin K abhängige Carboxylase codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) isolierter DNA, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus DNA, die Rinder 94000 Dalton Vitamin K abhängige Carboxylase codiert und die Sequenz von SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 11 oder SEQ ID NR: 13 umfaßt, und DNA mit der hier als SEQ ID NR: 15 gegebenen Sequenz, und die Human Vitamin K abhängige Carboxylase codiert; und

(b) isolierter DNA, die an den komplementären Strang von isolierter DNA von (a), zuvor angegeben, unter stringenten Bedingungen, dargestellt durch eine Waschstringenz von 0,3M NaCl, 0,03M Nairiumcitrat und 0,1% SDS, bei 70ºC hybridisiert, und die eine Vitamin K abhängige Carboxylase mindestens 75% homolog zu isolierter DNA von (a), zuvor angegeben, codiert.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Vitamin K abhängige Protein ein Blutkoagulationsprotein umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Vitamin K abhängige Protein aus der Gruppe, bestehend aus Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C, Protein S und Prothrombin, ausgewählt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Vektor DNA einen Vektor, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Plasmiden, Adenoviren und Cytomegaloviren, umfaßt.

18. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Vektor DNA einen Baculovirusvektor umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle ist.

20. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Wirtszelle eine Insektenzelle ist.

21. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Vitamin K abhängige Carboxylase Rinder Vitamin K abhängige Carboxylase ist.