DE3486493T2

DE3486493T2 - Klonieren von Superoxiddismutase und Expression in Mikroorganismen

Info

Publication number: DE3486493T2
Application number: DE3486493T
Authority: DE
Inventors: Robert A Hallewell; Guy T Mullenbach
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1983-10-03
Filing date: 1984-09-25
Publication date: 2003-05-22
Anticipated expiration: 2004-09-26
Also published as: ES536441A0; PT79308A; ES8607388A1; JPH06165674A; DK243785D0; JP2568794B2; JP2664123B2; IE842506L; DE3485284D1; DK243785A; PT79308B; EP0656418A1; EP0656418B1; CA1296272C; ATE155527T1; HUT37458A; JPS60137286A; DE3486452D1; IE59518B1; JP2609446B2

Description

Gebiet der Erfindung

Superoxiddismutase ("SOD") ist in Wirklichkeit eine Anzahl verschiedener Enzyme, die in den meisten lebenden Organismen gefunden werden. Eine Funktion bei Säugetieren ist die Zerstörung von Superoxid, einem während der Phagocytose natürlich hergestellten Material. Die Superoxiddismutasen werden in Familien eingeteilt, je nachdem welches Metall mit dem Enzym assoziiert ist, wobei die Metalle zwischen Eisen, Mangan, Kupfer und Kupfer-Zink variieren. Superoxiddismutase, beispielsweise aus Rinderleber, hat klinische Anwendung gefunden, insbesondere als entzündungshemmendes Mittel bei Säugetieren, einschließlich Menschen. Andere Anwendungen schließen das Abfangen von Superoxidanionen, die infolge der Exposition eines Wirtes an verschiedene Superoxid erzeugende Agenzien, beispielsweise Strahlung, Paraquat usw. entstanden sind, ein; Prophylaxe oder Therapie für bestimmte degenerative Erkrankungen, beispielsweise Emphysem; Nahrungsmittelkonservierung; und dergleichen.
Es ist deswegen wichtig, dass stabile Vorräte physiologisch annehmbarer Superoxiddismutase zur Verfügung gestellt werden, insbesondere zur in vivo-Verwendung als ein entzündungshemmendes Mittel oder für andere therapeutische Zwecke. Für die Anwendung beim Menschen wäre es vorzuziehen, das homologe Enzym zu verwenden, um eine mögliche Immunreaktion zu verhindern oder zu minimieren. Durch den Einsatz der rekombinanten DNA-Technik besteht die Möglichkeit, effizient Produkte herzustellen, die die gewünschten biologischen Aktivitäten der Superoxiddismutase haben, wie immunologische und enzymatische Aktivitäten.

Beschreibung des Standes der Technik

Die Aminosäuresequenz der Cu-Zn-Superoxiddismutase menschlicher Erythrocyten wird in Jabusch et al., Biochemistry (1980) 19: 2310-2316 und Barra et al., FEBS Letters (1980) 120: 53-55 beschrieben. Cu-Zn-SOD aus Rinder-Erythrocyten wird von Steinman et al., J. Biol. Chem (1974) 249: 7326-7338 beschrieben. Ein SOD-1-cDNA- Klon wird von Lieman-Hurwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 2808-2811 beschrieben. Betreffend die Auswirkung der Variation der untranslatierten Region oberhalb des Startcodons auf die Translationseffizienz siehe Gheysen et al., Gene (1982) 17: 55-63; Thummel et al., J. Virol. (1981) 37: 683-697; und Matteucci und Heyneker, Nucl. Acids Res. (1983) 11: 3113-3121. Sherman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 5465-5469 offenbart die Nukleotidsequenz und die Expression der vom menschlichen Chromosom 21 codierten mRNA der Superoxiddismutase.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die effiziente Herstellung von Polypeptiden, welche die biologische Aktivität von menschlicher Cu-Zn-Superoxidddismutase zeigen, wird demonstriert durch die Herstellung von cDNA des größeren Teils des Strukturgens, Verknüpfen mit einer Mischung von Adaptern, die verschiedene Sequenzen bereitstellen, die sich von der ribosomalen Bindungsstelle bis zu degenerierten Nukleotiden im Codierungsbereich erstrecken, und Insertion des vollständigen Gens mit seinen Translationssignalen in einen Expressionsvektor. Die Transformation von E. coli resultiert in der effizienten Herstellung eines funktionsfähigen Polypeptides, das die biologische Aktivität menschlicher Cu-Zn-Superoxiddismutase aufweist. Das Gen kann weiter zur Kombination mit sekretorischen und Prozessierungs-Signalen zur Sekretion in einem geeigneten Wirt verwendet werden.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein DNA-Konstrukt bereit, umfassend einen funktionellen Vektor zur Expression in E. coli, wobei dieser Expressionsvektor in abwärtslaufender Reihenfolge der Transkription umfasst:
(1) einen Promotor;
(2) eine ribosomale Bindungsstelle;
(3) ein Startcodon, wobei eine DNA-Spacersequenz zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Startcodon angeordnet ist, wobei die DNA-Spacersequenz, das Startcodon und die ersten zwei Codons des Strukturgens der menschlichen cytoplasmatischen Cu/Zn-Superoxiddismutase durch die Sequenz:
XnXnXnXnATGGCXACX
bereitgestellt werden, wobei jedes n unabhängig voneinander 1 ist, und jedes X unabhängig voneinander A, C, T oder G ist, und wobei die Nucleotidzusammensetzung des DNA-Spacers derart verändert ist, dass ein Expressionsniveau von mindestens 5% w/w des gesamten zellulären Proteins erreicht wird;
(4) ein Strukturgen der menschlichen cytoplasmatischen Cu/Zn-Superoxiddismutase oder ein Allel davon im Leseraster mit dem Startcodon, das ein Stopcodon an dem 3'-Terminus des Gens aufweist; und
(5) einen Transkriptionsterminator,
wobei das DNA-Konstrukt bei Einführung in E. coli nichtacetylierte aktive menschliche cytoplasmatische Cu/Zn-Superoxiddismutase exprimiert.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides, umfassend nichtacetylierte enzymatisch aktive menschliche cytoplasmatische Cu/Zn- Superoxiddismutase bereit, die sich um nicht mehr als vier Aminosäuren von natürlich vorkommender menschlicher cytoplasmatischer Cu/Zn-Superoxiddismutase unterscheidet, wobei das Verfahren umfasst, E. coli enthaltend das obige DNA-Konstrukt in einem Nährmedium zu kultivieren und die resultierende nichtacetylierte enzymatisch aktive menschliche cytoplasmatische Dismutase zu isolieren, welche durch E. coli exprimiert wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die DNA-Linkersequenz und ein Ablaufdiagramm, das ihre Verwendung zeigt;
Fig. 2 und 3 sind Ablaufdiagramme, welche die Herstellung von plot5/SOD zeigen;
Fig. 4 zeigt die Sequenz sowohl des codierenden Strangs der cDNA (5' → 3') menschlicher SOD wie auch des resultierenden Translationsproduktes.
Fig. 5 zeigt die Sequenz des isolierten Gens für menschliche SOD, das hiernach im experimentellen Teil beschrieben wird.
Fig. 6 ist eine Restriktionskarte des isolierten Gens für menschliche SOD, das hiernach im experimentellen Teil beschrieben wird.

BESCHREIBUNG SPEZIELLER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Es werden Methoden und Zusammensetzungen für die effiziente Expression von Polypeptiden bereitgestellt, die die biologischen Aktivitäten menschlicher Cu-Zn-Superoxiddismutase ("hSOD") zeigen. Die Methoden verwenden eine DNA-Sequenz ("hSOD-Gen"), die einen wesentlichen Teil der Aminosäuresequenz von hSOD codiert, in Verbindung mit einem Translationsinitiationsbereich, der für die Expression in einem E. coli-Wirt optimiert ist. Das hSOD-Gen wird in einen zur Expression in dem Wirt geeigneten Vektor eingebaut, geeigneterweise unter Bedingungen, die Sekretion zulassen, um das SOD-Produkt aus dem extrazellulären Medium zu gewinnen.
Das Strukturgen für hSOD oder ein anderes Polypeptid schließt eine Signalsequenz zur Acetylierung an seinem 5'-Ende ein, wobei diese Signalsequenz einen Hefe- Expressionswirt veranlasst, eine Acetylierung auszuführen. Die Signalsequenz zur Acetylierung codiert mindestens die ersten beiden N-terminalen Aminosäuren in dem Polypeptid. Die erste Aminosäure wird entweder Alanin, Glycin oder Serin sein, während die zweite Aminosäure eine polare oder aromatische Aminosäure sein wird, welche gewöhnlich Threonin, Serin, Aspartat oder Phenylalanin ist.
Um hSOD herzustellen, ist es notwendig eine DNA-Sequenz zu haben, die hSOD codiert. Ein Verfahren eine solche Sequenz zu erhalten ist es, cDNA aus Boten-RNA aus Zellen, die hSOD herstellen, zu klonieren. Geeigneterweise können menschliche Leberzellen für diesen Zweck verwendet werden. Nachdem die cDNA kloniert ist, kann man dann, wenn die Codierungssequenz der DNA unbekannt ist, aber mindestens eine teilweise Aminosäuresequenz bekannt ist, die cDNA mit Mischungen von Sonden durchsuchen, die sämtliche möglichen Variationen von Nucleotiden aufweisen, welche die spezielle Abfolge von Aminosäureresten codieren. Die Auswahl der Reste, die die Sequenz codiert, ist etwas willkürlich, obwohl die gewählten Reste gewöhnlich so ausgewählt werden, dass die Anzahl der verschiedenen Sequenzen, die synthetisiert werden müssen, minimiert wird.
Für hSOD kann geeigneterweise eine DNA-Sequenz verwendet werden, die mindestens für die Aminosäurereste 19 bis 24 codiert, insbesondere eine Sonde mit mindestens etwa 15 und nicht mehr als etwa 20 Basen, noch geeigneter etwa 17 Basen. Man kann dann die Klone mit Restriktionsenzymen verdauen, die mit den markierten Sonden zu hybridisieren scheinen, die DNA-Fragmente fraktionieren und die Hybridisierung wiederholen, speziell indem eine zweite Reihe von Sonden verwendet wird, die zu DNA-Sequenzen hybridisieren, die eine andere Serie von Aminosäureresten der hSOD codieren. Geeigneterweise können dies die Aminosäurereste 109 bis 114 sein. Es können ein oder mehrere Klone gefunden werden, die positiv auf beide Sonden reagieren, und diese können als Quelle für cDNA, die mindestens einen wesentlichen Teil von hSOD codiert, verwendet werden.
Ganz überraschend wurde gefunden, dass die Aminosäuresequenzen, die für hSOD veröffentlicht wurden, sich in einer beachtlichen Anzahl von Resten von der Aminosäuresequenz unterschieden, welche von der cDNA codiert wird. Speziell wo die beiden veröffentlichten Sequenzen sich unterschieden (Jabusch et al., Biochemistry (1980) 19: 2310-2316 und Barra et al., FEBS Letters (1980) 120: 153-156) sind die richtigen Zuordnungen: Rest 11, Aspartat; Rest 17, Isoleucin; Rest 26, Asparagin; Rest 49, Glutamat; Rest 52, Aspartat; Rest 53, Asparagin; Rest 92, Aspartat; Rest 98, Serin (siehe Fig. 4).
Wegen der Unsicherheiten der Auswirkung des Abstandes zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Translationsstartcodon, normalerweise AUG, auf die Translation, stellt die gegenwärtige Methode eine Technik bereit, die Nukleotide in dem Spacer zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Startcodon zu verändern. Da die Basensequenz abwärts von der Initiationsstelle auch die Translationseffizienz beeinflussen kann, ermöglicht die gegenwärtige Methode auch eine Veränderung der Nukleotidsequenz (nicht aber der Länge) innerhalb der ersten 5'-Codons des Polypeptids, wie sie die Redundanz-Einschränkungen des genetischen Codes erlauben. Eine solche Degeneration kann sich auf bis zu 2 Codons abwärts von der Initiationsstelle beziehen.
Eine Vielzahl von Linkem werden hergestellt, worin mindestens 2 Nukleotide, gewöhnlich mindestens 3 Nukleotide, und nicht mehr als 6 Nukleotide verändert werden, um Mitglieder einzuschließen, die jedes der 4 Nukleotide haben, wenn sie innerhalb des Spacers sind, oder 2, 3 oder 4 Nukleotide, wie die Redundanz des genetischen Codes zulässt, wenn sie innerhalb des Strukturgens für das Polypeptid sind. Außerdem werden die Linker mit verschiedenen Anzahlen von Nukleotiden hergestellt, so dass eine Gruppe von Linkem bereitgestellt wird, die sich nicht nur in der Sequenz, sondern auch in der Länge unterscheiden. Der Längenunterschied kann durch Entfernen von Teilen des Trägers während der Linkersynthese und, falls geeignet, der Fortsetzung der Synthese bei einem nachfolgenden Stadium erreicht werden, so dass Linker mit einer abgestuften Anzahl von Sequenzlängen bereitgestellt werden. Gewöhnlich wird sich die Linkermischung in der Länge um mindestens ein Nukleotid und nicht mehr als über einen Bereich von sechs Nukleotiden, gewöhnlich nicht mehr als vier Nukleotide, unterscheiden.
Dies kann geeignet veranschaulicht werden, wenn die fehlenden Basen am Ende sind. Nach jedem Schritt wird ein Teil des Trägers entfernt und die Synthese mit den Strängen, die an den Träger gebunden sind, fortgesetzt, wobei alle vier Nukleotide (dNTP) bei jedem Schritt bereitgestellt werden. Diese einzelnen Stränge werden dann zu einem Einzelstrang hybridisiert, der teilweise komplementär ist, und worin die variable Region ein Überhang sein wird. Auf diese Weise wird man eine abgestufte Serie von Linkem mit Überhängen, die sich sowohl hinsichtlich der Nukleotidsequenz wie auch der Länge unterscheiden, erzielen. An einem geeigneten Punkt während der nachfolgenden Hybridisierungs-, Ligierungs- oder Klonierungsvorgänge wird/werden die Überhangregion/-en aufgefüllt, um doppelsträngiges Material zu ergeben, das für eine weitere Manipulation verwendbar ist. Dies wird gewöhnlich und vorzugsweise in vitro durchgeführt, z. B. unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I; alternativ konnte in bestimmten Konstrukten der Überhang als ein Einzelstrang kloniert werden, wobei das Auffüllen in vivo in dem transformierten oder transfizierten Wirt erfolgte. Die Hybridisierung zu einem komplemetären Strang kann erreicht werden, indem eine 5'-Sequenz aufwärts von der veränderbaren Nukleotidserie vorhanden ist, die zu einer Sequenz komplementär ist, die in der terminalen Sequenz, mit der der Linker verbunden werden soll, vorhandenen ist. Die fehlenden Basen können dann in vitro oder in vivo aufgefüllt werden.
Die Linker umschließen innerhalb ihrer Sequenz mindestens einen Teil der Region zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Startcodon, vorzugsweise die dem Startcodon nächstliegenden Nukleotide. Der Linker kann auch das Startcodon und Teile des Strukturgens, die ribosomale Bindungsstelle und Basen aufwärts von der ribosomalen Bindungsstelle einschließen, welche die transkriptionell regulatorischen Sequenzen einschließen können oder nicht.
Gewöhnlich wird der Linker mindestens etwa 5 Basen, noch gewöhnlicher mindestens etwa 20 Basen, und gewöhnlich nicht mehr als etwa 200 Basen, noch gewöhnlicher nicht mehr als etwa 100 Basen aufweisen. Sofern der Linker größer ist als etwa 35 Basen, wird er gewöhnlich unter Verwendung von Einzelstrangsequenzen von etwa 10 bis 35 Basen zusammengebaut werden, die nur mit einem Teil des komplemetären Strangs Homologie aufweisen, um auf diese Weise komplemetäre überlappende Sequenzen mit Überhängen bereitzustellen, so dass wie oben angezeigt die verschiedenen Einzelstränge hybridisiert und ligiert werden können und der degenerierte Über hang aufgefüllt werden kann, um den gewünschten Linker mit überhängenden und/oder glatten Enden herzustellen.
Wo das Strukturgen eine passende Restriktionsstelle hat, gewöhnlich nicht mehr als etwa 50 Basen abwärts vom Startcodon, kann ein Fragment, welches das Strukturgen enthält, geschnitten und mit einem komplementären überhängenden Ende des Linkers verbunden werden oder aufgefüllt werden, um ein Ende mit glattem Ende bereitzustellen, wobei das glatte Ende mit einem glatten Ende des Linkers ligiert werden kann. Der Linker ist dazu bestimmt, sicherzustellen dass das Strukturgen vollständig und im Leseraster mit dem Startcodon ist.
Wie angezeigt, sorgt man bei der Herstellung des Linkers dafür, dass es eine Serie von Linkem gibt, die eine Zufallsreihenfolge von Nucleotiden haben, das heißt, jedes der vier möglichen Nucleotide ist in dem codierenden Strang (unter dem Vorbehalt der oben angezeigten Einschränkungen des genetischen Codes).
Diese Linker, die aus Einzelsträngen hergestellt sind, können mit anderen einzelnen oder doppelten DNA-Strängen verbunden werden, um verlängerte Linker bereitzustellen, die nicht nur die ribosomale Bindungsstelle, sondern auch Basen aufwärts von der ribosomalen Bindungsstelle einchließen können. Alternativ können die Linker relativ klein sein, beginnend an einer Stelle innerhalb oder angrenzend an die ribosomale Bindungsstelle, und sich abwärts bis zu einer Stelle am Startcodon oder innerhalb des Strukturgens erstrecken.
Während die spezielle Reihenfolge der Verbindung der verschiedenen Fragmente, um die Konstrukte der vorliegenden Erfindung herzustellen, gewöhnlich nicht kritisch sein wird, kann das Strukturgen geeigneterweise zuerst mit dem Linker verbunden werden. Dieses DNA-Konstrukt wird nicht nur das Strukturgen, sondern auch die ribosomale Bindungsstelle und jegliche zusätzlichen Nukleotide aufwärts von der ribosomalen Bindungsstelle einschließen. Außerdem wird eine wesentliche Vielfalt in den Nukleotiden zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Startcodon vorhanden sein. Das gegenwärtige DNA-Konstrukt wird in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert, der die notwendigen regulatorischen Sequenzen für den Transkriptionsstart aufwärts, wie auch die regulatorischen Sequenzen für die Transkriptionstermination abwärts von der Insertionsstelle des gegenwärtigen DNA-Konstrukts aufweist. Auf diese Weise wird der Linker am 5'-Ende von regulatorischen Signalsequenzen für den Transkriptionsstart und am 3'-Ende mit mindestens einem Teil einer Codierungsregion und Terminationssequenzen für Transkription und Translation flankiert sein. (5'- und 3'- bezeichnen die Richtung der Transkription.)
Nach Herstellung der Plasmid- oder viralen DNA zur Einführung in einen geeigneten E. coli-Wirt (was gewöhnlich an einem geeigneten Stadium der Manipulationen die Auffüllung der variablen Überhangregion einschließt), wird der Wirt transformiert bzw. transfiziert, kloniert, die Klone werden ausgestrichen und individuelle Klone zur effizienten Expression ausgewählt, indem ein Assay auf die Herstellung des erwünschten Produktes, beispielsweise hSOD, durchgeführt wird. Die Anzahl der Klone, die durchsucht werden müssen, um die verschiedenen Grade der Herstellung des Produkts zu bestimmen, wird von dem Ausmaß der Sequenzdegeneration, die in den synthetischen Linker eingeführt wurde, abhängen und ihm proportional sein. Wie in der vorliegenden Ausführungsform beispielhaft aufgeführt, ist mit 4 Längenvarianten und 4-facher Sequenzdegeneration bei jedem von 6 Nukleotiden im Linker die Anzahl möglicher rekombinanter Sequenzen 5440. Gewöhnlich werden mindestens ein paar Hundert, vorzugsweise mehrere Tausend oder mehr Klone durchsucht werden. Die Durchsuchung kann mittels des Western-Blot-Verfahrens (Antikörperdetektion des Produkts), angewendet auf Wirtszellkolonien oder virale Plaques, die auf Filter aus Nitrocellulose oder anderem geeigneten Material überführt wurden, effizient durchgeführt werden. Alternativ dazu kann bei Verwendung der Elektrophorese und Bereitstellung einer Vielzahl von Bahnen, wobei jede Bahn ein individueller Klon ist, durch Visualisieren der Anfärbeintensität, Autoradiographie oder "Western blotting" der Produktbande ein unmittelbarer und direkter Vergleich angestellt werden, welche Klone am effizientesten in der Expression sind. Diese Durchsuchung wird gewöhnlich ausreichend sein, obwohl quantitativere Immunoassays oder Enzymassays verwendet werden können, wenn das angemessen ist.
Wenn gewünscht, kann das Konstrukt in einen anderen E. coli-Wirt übertragen werden, der die regulatorischen Signale des Expressionskonstruktes oder des durch Einführung der notwendigen regulatorischen Signale an geeigneten Stellen, um eine wirkungsvolle Expression in einem alternativen Wirt zu ermöglichen, abgewandelten Expressionskonstrukts erkennt.
Wenn gewünscht, kann das hSOD-Gen mit sekretorischen Leit- und Prozessierungssignalen verbunden werden, um Sekretion und Prozessierung der hSOD zu ermöglichen. Verschiedene Leit- und Prozessierungssignale sind in der Literatur beschrieben worden. Siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 4 336 336 und 4 338 397, ebenso wie die gleichzeitig anhängigen Anmeldungen Seriennummern 522 909, angemeldet am 12. August 1983, und 488 857, angemeldet am 26. April 1983, deren diesbezüglichen Teile hierin durch den Bezug darauf eingeschlossen werden.
Von besonderem Interesse als Wirte sind E. coli.
Eine große Vielfalt von Vektoren sind zur Verwendung in E. coli verfügbar, wobei die Vektoren von Plasmiden und Viren abgeleitet sind. Die Vektoren können solche mit einer Einzelkopie oder Vektoren mit niedriger oder hoher Kopienzahl sein. Vektoren können zur Klonierung und/oder zur Expression dienen. Im Hinblick auf die breite Literatur bezüglich Vektoren, die Verfügbarkeit vieler Vektoren im Handel, und sogar von Handbüchern, die Vektoren und deren Restriktionskarten und Kennzeichen beschreiben, ist hier keine ausführliche Diskussion notwendig. Wie gut bekannt ist, umfassen die Vektoren normalerweise Marker, die eine Selektion gestatten, wobei diese Marker Resistenz gegen Zellgifte, Prototrophie oder Immunität verleihen können. Häufig sind eine Vielzahl von Markern vorhanden, die für verschiedene Kennzeichen sorgen.
Zusätzlich zu den Markern haben Vektoren ein Replikationssystem, und im Fall von Expressionsvektoren werden sie gewöhnlich die transkriptionsregulatorischen Signale sowohl für Start und Termination, wie Promotoren, welche einzelne oder mehrfache Tandempromotoren sein können, eine TATA-Box, Verstärker, einen Terminator, und ein oder mehrere Stopcodons, die mit dem Terminator verbunden sind, einschließen.
Zur Translation wird häufig eine ribosomale Bindungsstelle ebenso wie eines oder mehrere Stopcodons vorhanden sein, obwohl Stopcodons gewöhnlich mit einem Strukturgen verbunden sind. Alternativ können diese regulatorischen Sequenzen auf einem das Strukturgen enthaltenden Fragment vorhanden sein, das in den Vektor eingefügt (insertiert) wird.
Gewöhnlich werden eine oder mehrere Restriktionsstellen passend lokalisiert sein, um das Strukturgen in den Expressionsvektor zu insertieren. Einmal insertiert, kann der das Strukturgen enthaltende Expressionsvektor in einen E. coli-Wirt eingeführt werden, und der Wirt kloniert werden, um für eine wirkungsvolle Expression von hSOD zu sorgen.
Unter manchen Umständen können spezielle Eigenschaften für den Vektor bereitgestellt werden, wie Temperaturempfindlichkeit der Expression, Operatoren oder Aktivatoren zur Regulation der Transkription, und dergleichen. Von besonderem Interesse ist die Fähigkeit, die Transkription mittels exogener Mittel wie Temperatur, Induktoren, Korepressoren usw. zu beeinflussen, wobei die Transkription mit einer exogenen, üblicherweise organischen Verbindung hervorgerufen oder unterdrückt werden kann.
Wenn die hSOD intrazellulär erzeugt wird, können die Zellen, wenn die Zellkultur eine hohe Dichte erreicht hat, isoliert werden, geeigneterweise durch Zentrifugation, lysiert und die hSOD mittels verschiedener Techniken wie Extraktion, Affinitätschromatographie, Elektrophorese, Dialyse oder Kombinationen davon isoliert werden. Wenn das Produkt ausgeschieden wird, können ähnliche Techniken mit dem Nährmedium angewendet werden, jedoch wird das gewünschte Produkt in dem Nährmedium einen wesentlich höherer Anteil am Gesamtprotein haben als in dem Zell-Lysat.
Die hSOD, die gebildet wird, hat im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die natürlich vorkommende menschliche Superoxiddismutase, welche gewöhnlich um weniger als 5 Aminosäuren, noch gewöhnlicher um weniger als 2 Aminosäuren abweicht. Die rekombinante hSOD ("r-hSOD") zeigt im Wesentlichen dieselben biologischen Eigenschaften wie natürlich vorkommende hSOD. Die biologischen Eigenschaften schließen immunologische Eigenschaften ein, wenn gegen authentische hSOD erzeugte Antikörper mit r-hSOD kreuzreagieren. Überdies weist das r-hSOD-Erzeugnis in für hSOD verwendeten üblichen Bioassays einen wesentlichen Teil der enzymatischen Aktivität der authentischen hSOD auf, gewöhnlich mindestens etwa 10%, vorzugsweise mindestens etwa 50%, noch bevorzugter mindestens etwa 80%, bezogen auf das Gewicht an Protein. Ein veranschaulichendes Assayverfahren wird von Marklund und Marklund, Eur. J. Biochem. (1974) 47: 469-474 beschrieben.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung angeboten.

EXPERIMENTELLES

Molekulare Klonierung der cDNA von hSOD

Die Gesamt-RNA wurde mit der Guanidiniumthiocyanat/Lithiumchlorid-Methode aus einer Leber eines erwachsenen Menschen präpariert (Cathala et al., DNA (1983) 2: 329-335). PolyA-RNA wurde verwendet, um doppelsträngige cDNA zu synthetisieren (Maniatis et al., Molecular Cloning, 213-242, Cold Spring Harbor, 1982), und diese wurde über eine Sepharose CL4B-Säule geleitet, um cDNAs mit mehr als 350 bp anzureichern (Fiddes und Goodman, Nature (1979) 281: 351-356). Die cDNA wurde an der PstI-Stelle von plot4 insertiert, einem pBR322-Derivat mit der folgenden Sequenz, welche die PstI-EcoRI-Stelle ersetzt.
Die cDNA-Insertion verwendete die oligo-dG:dC-Tailingmethode (Maniatis et al., siehe oben). Der E. coli-Stamm D1210 wurde mit dieser Mischung transformiert, und auf L- Agar, der 10 ug/ml Tetracyclin enthielt, wurden Transformanten selektioniert (Kushner, S. R. (1978) in: Genetic Engineering, Herausgeber Boyer, H. B. und Nicosia, S., (Elsevier/North Holland, Amsterdam) Seite 17). Plasmid-DNA, die eine Leber-cDNA- Bibliothek bildete, wurde direkt hergestellt (Maniatis et al., Molecular Cloning, Seiten 86-94, Cold Spring Harbor 1982) aus ungefähr 62.000 rekombinanten Kolonien, die mit einer Dichte von ungefähr 3.000 Kolonien pro Petrischale von 9 cm Durchmesser ausplattiert wurden.

Isolierung der r-hSOD-Klone

Stamm D1210 wurde mit der Leber-cDNA-Bibliothek retransformiert, und ungefähr 40.000 Klone wurden auf neun Petrischalen von 14 cm Durchmesser angezogen. Nach Übertragung der Kolonien auf Nitrocellulosepapier und Chloramphenicol-Amplifikation der Plasmid-DNA wurden die Zellen lysiert und die Filter zur Hybridisierung vorbereitet (Ish-Horowicz und Burke, Nucleic Acids Research (1981) 9: 2989-2998). Oligonucleotidsonden wurden zur Durchmusterung durch Hybridisierung verwendet, wobei die Sonden aus enzymatisch radiomarkierten, chemisch synthetisierten DNA- Molekülen bestanden, die komplemetär zu der die Aminosäurereste 19 bis 24 des Proteins codierenden mRNA sind (Jabusch et al., siehe oben; Barra et al., siehe oben); die Mischung hatte die folgenden Sequenzen:
wobei alle angezeigten Möglichkeiten, die Peptidsequenz zu codieren, hergestellt wurden (32-fach degeneriert).
Die Sonden wurden mit 32P bis zu einer spezifischen Aktivität von 1-3 · 10&sup8; cpm/ug markiert und vor Gebrauch durch einen Millipore-Filter (0,45 um) flltriert. Die Filter wurden 6 Stunden lang bei 30ºC in 4 · SSC, 2 · Denhardt'scher Lösung, 40 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 300 ug/ml sonifizierter Lachssperma-DNA vorhybridisiert. Die Hybridisierung erfolgte 20 Stunden lang bei 30ºC in der selben Lösung, welche 2 · 10&sup6; pm/ml hSOD-DNA-Sonde (Reste 19-24) enthielt. Die Filter wurden einmal 15 min bei Raumtemperatur und zweimal 15 min bei 30ºC in 4 · SSC gewaschen, trockengetupft und mit einem Verstärkungsschirm 24 Stunden lang bei -70ºC autoradiographiert.
Flächen auf den Masterplatten, die doppelten positiven Signalen entsprachen, wurden in L-Nährlösung aufgenommen, und mit dem Miniscreen-Verfahren wurde Plasmid- DNA hergestellt (Maniatis et, al., Molecular Cloning, 178, 368-369, Cold Spring Harbor 1982). Diese DNA wurde mit PstI geschnitten und der Southern-Blot-Analyse unterworfen (Southern, J. Mol. Biol. (1975) 98: 503-517), wobei anfangs mit den vorher markierten Sonden (Aminosäurereste 19-24) hybridisiert wurde und dann mit zusätzlichen radiomarkierten Sonden, die von den Aminosäureresten 109-114 abgeleitet wurden und die folgenden Sequenzen (alle möglichen Variationen, 72-fach degneriert) aufwiesen, die als eine Mischung vorlagen:
Ein Plasmidpool (pSOD1) enthielt ein cDNA-Insert von 520 bp, das mit beiden Sonden hybridisierte, und nach Reinigung der Kolonie wurde Plasmid-DNA aus diesem Klon hergestellt und nach der Methode von Maxam und Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 560-564) mit den in Fig. 4 gezeigten Ergebnissen sequenziert. Der cDNA Klon der hSOD pSOD1 bildet den codierenden Bereich für die Aminosäuren 10-153 von hSOD, ein einzelnes Translation-Stopcodon und einen untranslatierten 3'-Bereich. Deswegen wird in dem Expressionsvektorkonstrukt die Basensequenz des Bereichs, der die Aminosäuren 1-9 codiert, aus der veröffentlichten Aminosäuresequenz für hSOD (Jabusch et al., siehe oben; Barra et al., siehe oben) abgeleitet und als ein Teil des veränderbaren Linkersegments (siehe unten) chemisch synthetisiert.

Aufbau des Plasmids plot5 - (siehe Fig. 2 und 3)

Das Plasmid plotl, enthaltend einen hybriden trp-lac ("tac")-Promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80 : 21-25) wurde aufgebaut, indem das 180 bp HgiA-TagI-Fragment von ptrpL1 (Erdman et. al., Nature (1981) 291: 503-506) und das 58 bp HpaII-EcoRI-Fragment von pKB268 (Backman und Ptashne, Cell (1978) 13: 65-71) gelisoliert wurden, und diese Fragmente in durch PstI und EcoRI verdauten pBR322 ligiert wurden. Das entstandene Plasmid wurde verwendet, um den Stamm D1210 zu transformieren, und Klone wurden auf Tetracyclinresistenz hin selektioniert. Das Plasmid plot3 wurde aufgebaut durch Gelisolation des den tac-Promotor enthaltenden 155 bp Fnu4HI-EcoRI-Fragments von plotl, wobei die Fnu4HI-Stelle unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I ("pol I K" oder "pol. Klen.") glatt gemacht wurde, und des 18 bp EcoRI-PstI-Polylinker-Fragments von ΠAN7 der folgenden Sequenz:
Diese Fragmente wurden mit gelgereinigtem pBR322, das mit EcoRI verdaut wurde, unter Verwendung von pol I K mit glatten Enden versehen wurde, gefolgt von einem Verdau mit PstI und gelgereinigt, ligiert. Diese Ligationsmischung wurde verwendet, um den Stamm D1210 zu transformieren, wobei auf L-Agar-Platten, enthaltend 10 uq/ml Tetracyclin, selektioniert wurde.
Das Plasmid plot5 wurde hergestellt, indem zuerst ein den ΠAN7-Polylinker als Ersatz für EcoRI-PvuII in pBR322 enthaltendes Plasmid aufgebaut wurde. Um dies zu tun, wurde das Plasmid ΠAN7 mit HindIII verdaut und durch Auffüllen mit pol I K und einem synthetischen, selbstkomplementären PvuII-Linkermolekül (d(5'-CCAGCTGG-3')), ligiert mit dem oben modifizierten Plasmid ΠAN7 glattendig gemacht. Nach Verdauung mit EcoRI und PvuII wurde das entstandene 44 bp-Polylinkerfragment (mit 4- Basen-Überhängen) gelisoliert und in pBR322 als ein EcoRI-PvuII-Ersatz kloniert.
Das Plasmid plot3 wurde mit EcoRI verdaut und nach Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung wurden die herausragenden 5'-Enden durch Behandlung mit S1- Nuklease (Palmiter, Biochemistry (1974) 13: 3606-3615; Hallewell und Emtage, Gene (1980) 9: 27-47) glattendig gemacht. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung wurde die DNA mit ClaI verdaut, mittels pol I K glattendig gemacht, und das den tac-Promotor enthaltende 237 bp-Fragment durch präparative Polyacrylamid- Gelelektrophorese isoliert. Dieses glattendige tac-Promotor-Fragment wurde dann an der PvuII-Stelle des pBR322-Polylinker-Plasmids insertiert (siehe Fig. 3) und Klone erhalten, in denen der tac-Promotor die Transkription in Richtung des β-Lactamase- Gens von pBR322 steuerte.

Aufbau von plot5-Derivaten, die r-hSOD exprimieren

Die in Fig. 1 gezeigten synthetischen DNA-Moleküle F(26), C(16), B(31), D(11), E(13) und 4(24) wurden mittels der Phosphoramidit-Methode synthetisiert. Der Einzelstrang 4(24) wurde an jeder Stelle, wo X angezeigt ist, unter Verwendung aller 4 Basen hergestellt. Außerdem wurde aus der Synthese des 24-mers Siliciumdioxid entfernt, so dass einzelsträngige 21-mere, 22-mere und 23-mere zusätzlich zu den 24-meren erhalten wurden. Nach Entfernung von dem Siliciumdioxidträger wurden die vier Mischungen in geeigneten Anteilen vereinigt, um äquimolare Mengen jedes der möglichen Einzelstränge bereitzustellen. Diese Mischung wurde in den folgenden Schritten als ein Einzelprodukt behandelt.
Die Moleküle F(26), C(16), B(31) und D(11) wurden in äquimolaren Mengen zusammengemischt und 10 ug wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert. Nach Phenol-Ether-Extraktion wurden die zusätzlichen nichtphosphorylierten synthetischen DNA-Moleküle 4(24) und E(13) hinzugefügt, so dass alle Fragmente äquimolar waren. Die äquimolare Mischung enthielt 13 ug DNA in 133 ul 0,3x- Kinasepuffer.
Nach Annealen durch Abkühlen mit gleichmäßiger Geschwindigkeit von 70ºC auf 20ºC innerhalb 60 Minuten wurden die Einzelstränge mittels T4-Ligase in 200 ul Ligationsmischung bei 14ºC 4 Stunden lang zusammenligiert, mit Phenol-Chloroform extrahiert, ethanolgefällt und die 5'-Enden von 4(24) und E(13) unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (Maniatis et al., siehe oben) phosphoryliert. Eine präparative Polyacrylamidgelektrophorese wurde verwendet, um das vollständig ligierte 5'- und 3'-Überhänge aufweisende 53 bp-Material zu isolieren.
Die obige, gereinigte Fragmentmischung wurde dann wie in Fig. 1 gezeigt mit dem 460 bp-TaqI-PstI-Segment der cDNA von hSOD ligiert. Dieses Segment selbst wurde hergestellt durch Isolierung des 454 bp-TaqI-AluI-hSOD-Fragments, Versehen desselben mit glatten Enden unter Verwendung von pol I K und Inserierung in plot5 zwischen den auf gleiche Art glattendig gemachten EcoRI- und SalI-Stellen (siehe Fig. 3). Nach Herstellung von Plasmid-DNA aus dieser Rekombinanten wurde das 460 bp- TaqI-PstI-hSOD-Fragment mittels präparativer Polyacrylamidgelektrophorese isoliert. Nach Extraktion und Fällung wurde das 515 bp-Fragment, entstanden aus der Anbindung des synthetischen Fragments an das 460 bp-TaqI-Psti-hSOD-Fragment mit pol I K aufgefüllt (525-528 bp) und dann mit SaII verdaut, und das entstandene 519-522 bp-hSOD-Fragment mittels Polyacrylamidgelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde dann in plot5 insertiert, das mit PvuII und SalI verdaut und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Die entstandenen Plasmide wurden verwendet, um den Stamm D1210 zu transformieren. Nach Transformation von Stamm D1210 erhaltene Rekombinanten wurden auf 100 ug/ml Ampicillin enthaltendem C-Agar selektioniert, um einen Satz von Klonen (bezeichnet als plot5/SOD) mit unterschiedlicher SOD-Expression zu ergeben.

Expression von r-hSOD und Auswahl der plot5/SOD-Plasmide

Zur Analyse der gesamten E. coli-Proteine mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurden über-Nacht-Kulturen 30-fach in 1 ml L-Nährmedium verdünnt und unter Schütteln bei 37ºC 90 Min. lang zu einer optischen Dichte bei 650 nm (O.D.&sub6;&sub5;&sub0;) von etwa 0,2 angezogen. IPTG (Isopropylthiogalaktosid) wurde bis zu einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben und die Kulturen zusätzliche 3 Stunden inkubiert. Nach Zentrifugation wurde das Zellpellet in 50 ul Gelladepuffer resuspendiert (Laemmli, Nature (1970) 227: 680-685) und durch 3-maliges Wiederholen der folgenden Prozedur lysiert: 1 Min. einfrieren, 2 Min aufkochen, 10 sec. vortexen.
Nach elektrophoretischer Auftrennung (Laemmli, siehe oben) wurden die Proteinbanden mit Coomasie-Blau angefärbt und die von jedem Klon hergestellte Menge an SOD abgeschätzt; diese Ergebnisse wurden dann mittels Western-Blots mit Antikörpern gegen authentische menschliche SOD bestätigt. Über dreihundert Klone wurden analysiert, und sie zeigten Grade der SOD-Expression, die um von wenig oder nichts bis zu als auf 5-10% des gesamten löslichen Zellproteins geschätzte Mengen variierten. Ergebnisse für sechs der über dreihundert Klone werden in Tabelle 1 gezeigt, zusammen mit der speziellen Sequenz für DNA-Molekül 4(24), bestimmt nach der Methode von Maxam und Gilbert, siehe oben. Tabelle 1 Sequenz und Grad der SOD-Herstellung in E. coli

Assays auf r-hSOD

Für Enzymassays wurden 100 ml-Kulturen wie oben beschrieben induziert. Lösliche Zellextrakte wurden hergestellt durch 10 · 20 Sek. vortexen von Zellpellets mit einem gleichen Volumen an Glaskügelchen von 0,45-0,5 mm Durchmesser (Braun AG) und einem gleichen Volumen an Assaypuffer (50 mM Triscacodylat, pH 8,2, 1 mM Diethylentriaminpentaessigsäure) in einem 1,5 ml-Mikrofugenröhrchen bei 4ºC. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation des Röhrchens für 1 Min. in einer Mikrofuge (Beckman) pelletiert. Der Überstand wurde gegen den jeweils 1 mM Zinksulfat und Kupfersulfat enthaltenden Assaypuffer 4 Stunden lang bei 4ºC dialysiert.
SOD-Assays wurden unter Verwendung der Pyrogallolmethode (Marklund und Marklund, siehe oben) durchgeführt. Die Reaktionsmischungen verwendeten 0,2 mM Pyrogallol in Assaypuffer, und die Reaktionsgeschwindigkeiten wurden über eine Dauer von 5 Min. mittels eines Hewlett-Packard-8450-Spektralphotometers bei 420 nm bestimmt. Es wurden vier verschiedene Assayproben hergestellt: lösliche E. coli-Extrakte; authentische hSOD; und jede der vorigen Proben, vorinkubiert mit Kaninchen- Antikörper gegen authentische hSOD. Jede Probe wurde in einer Küvette 1 Min bei 25ºC inkubiert, bevor das Pyrogallol zugefügt und bei 25ºC der Assay durchgeführt wurde. Die Antikörper-Proben waren mit einer Vorinkubation von 10 Min. bei Raumtemperatur in Assaypuffer mit 5 ul Antikörper verbunden. Diese Bedingungen wurden als ausreichend gefunden, um 100 ng reine hSOD zu inaktivieren.
Die folgende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse für einen der untersuchten Klone (pSODx8): Tabelle 2 Enzymatische Aktivität menschlicher Cu-Zn-SOD, hergestellt in E. coli (Stamm D1210 (pSODX8))
Diese Werte zeigen an, dass etwa 15% des gesamten löslichen Zellproteins hSOD war (unter der Annahme, dass die als ein Bezug verwendetete reine menschliche Cu-Zn- SOD voll aktiv war). Zusammengenommen mit den elektrophoretischen Daten (siehe oben), die anzeigen, dass 5-10% des gesamten läslichen Zellproteins wie hSOD wanderten, erscheint es, dass ein wesentlicher Teil, wahrscheinlich die Mehrheit der hergestellten hSOD, aktiv ist.
Die richtige Sequenz des klonierten Gens wurde mit der Methode von Maxam und Gilbert, siehe oben, bestimmt. Zusätzlich wurden die ersten zwölf Aminosäuren an dem N-Terminus durch automatisierten Edman-Abbau bestimmt, Die ermittelte Aminosäuresequenz war folgendermaßen:
ALA-THR-LYS-ALA-VAL-(CYS)-VAL-LEU-LYS-GLY-ASP-GLY-
Der erste ermittelte ALA-Rest war in einer molaren Konzentration etwa gleich der des eingegebenen Peptids anwesend, was die Abwesenheit eines blockierten Aminoterminus anzeigt. Der CYS-Rest wurde von der verwendeten Methode der Aminosäureanalyse nicht ermittelt, jedoch wurde seine Gegenwart aus der Nukleotidsequenz geschlossen.
So wurde das (N-Formyl-)methionin aus dem bakteriellen Expressionsprodukt entfernt und das Material hatte die richtigen Aminosäuresequenzen, das heißt identisch mit den für die Reste 1-10 der cytoplasmatischen hSOD berichteten, jedoch war der N-terminale ALA-Rest nicht acetyliert. Außerdem wanderte das in E. coli hergestellte Polypeptid langsamer als das natürliche Protein bei der Elektrophorese in 1% -Agarosegel (pH 8,6), was Unterschiede bei der Ladung nachweist (Corning Universal Elektrophoresefilm, angefärbt gemäß Clausen, Immunochemical Technique, Seite 530-531), was ebenfalls auf fehlende Acetylierung hinweist. Außerdem ergab die Analyse der tryptischen Peptide sowohl des bakteriellen hSOD-Polypeptides als auch des gereinigten, authentischen (acetylierten) natürlichen Proteins, dass alle tryptischen Peptide identisch waren, außer dem bakteriellen N-terminalen Peptid, welches anders wanderte, das heißt, mit einer Ladung, die für ein Peptid erwartet wird, dem die N-Acetylgruppe fehlt.

Isolieren des Gens der menschlichen SOD

Um das Gen der menschlichen SOD zu isolieren, wurde eine für das menschliche Genom repräsentative Bakteriophage Lambda-Bibliothek (R. Lawn et al., (1978) Cell 15: 1157-1174) mit einer aus der cDNA der menschlichen SOD hergestellten radiomarkierten DNA-Sonde durchsucht. Es wurden eine Million Plaques der Phagen durchsucht, und 13 positiv hybridisierende Plaques wurden gereinigt. Eine Restriktionsendonucleaseanalyse der DNAs der Phagen zeigte an, dass mindestens 5 verschiedene Gene vorhanden sind, was nahelegt, dass andere mit SOD verwandte Gene und Genprodukte existieren. Ein Kandidat für ein solches Gen ist die neuerdings entdeckte extrazelluläre Cu/Zn-SOD (S. Marklund, (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7634-7638). Um das authentische cytoplasmatische Cu/Zn-SOD-Gen von den verwandten zu unterscheiden, verwendeten wir die synthetischen DNA-Sonden 5'-AATGCTTCCCCACACC-3' und 5'-CTCAGTTAAAATGTCTGTHG-3', die den Aminosäureresten 19-26 bzw. den Nucleotiden 193-213 3' von dem Terminationscodon in der untranslatierten 3'-Region entsprechen. Nur eine der 13 genomischen DNAs hybridisierte mit diesen Sonden, was anzeigt, dass es das authentische Gen der menschli chen cytoplasmatischen SOD ist. Dies wurde durch DNA-Sequenzierungsanalyse der N-terminalen Region bestätigt, wie in Fig. 5 gezeigt ist, wo die durch Proteinsequenzierung bestimmte Aminosäuresequenz bestätigt wird. Dies zeigt auch, dass kein Präprotein für SOD existiert, denn es existiert ein Terminationscodon im Leseraster neun Nukleotide in 5'-Richtung von dem Methionin-Startcodon. Wie in Fig. 5 gezeigt, enthält das menschliche Cu/Zn-SOD-Gen intervenierende Sequenzen. Die in Fig. 6 gezeigte Karte des SOD-Gens zeigt, dass mehr als eine intervenierende Sequenz vorhanden ist.
Obwohl die vorliegende Erfindung in einigen Einzelheiten durch Veranschaulichung und Beispiele zum Zweck der Klarheit des Verständnisses beschrieben wurde, ist es naheliegend, dass gewisse Änderungen und Abwandlungen innerhalb des Umfangs der beiliegenden Ansprüche ausgeübt werden können.
Der Stamm E. coli D1210 (pSODX8) wurde bei der ATCC am 27. September 1983 hinterlegt und er erhielt die Eingangsnummer 39453. Der Hefestamm 2150-2-3 (pCl/IGAPSOD) und die E. coli-Stämme D1210 (pSOD11) und D1210 (pS2OR) wurden bei der ATCC am 9. Mai 1984 hinterlegt, und sie erhielten jeweils die Eingangsnummern 20708, 39679 und 39680.

Claims

1. Ein DNA-Konstrukt, umfassend einen funktionellen Vektor zur Expression in E. coli, wobei dieser Expressionsvektor in abwärtslaufender Reihenfolge der Transkription umfasst:

(1) einen Promotor;

(2) eine ribosomale Bindungsstelle;

(3) ein Startcodon, wobei eine DNA-Spacersequenz zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Startcodon angeordnet ist, wobei die DNA-Spacersequenz, das Startcodon und die ersten zwei Codons des Strukturgens der menschlichen cytoplasmatischen Cu/Zn-Superoxiddismutase durch die Sequenz

XnXnXnXnATGGCXACX

bereitgestellt werden, wobei jedes n unabhängig voneinander 1 ist, und jedes X unabhängig voneinander A, C, T oder G ist, und wobei die Nucleotidzusammensetzung des DNA-Spacers derart verändert ist, dass ein Expressionsniveau von mindestens 5% w/w des gesamten zellulären Proteins erreicht wird;

(4) ein Strukturgen der menschlichen cytoplasmatischen Cu/Zn-Superoxiddismutase oder ein Allel davon im Leseraster mit dem Startcodon, das ein Stopcodon an dem 3'-Terminus des Gens aufweist; und

(5) einen Transkriptionsterminator;

wobei das DNA-Konstrukt bei Einführung in E. coli nichtacetylierte aktive menschliche cytoplasmatische Cu/Zn-Superoxiddismutase exprimiert.

2. Das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 1, wobei die Nucleotidzusammensetzung der DNA-Spacersequenz 5'-AACAATGGCAACG-3' ist.

3. Das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 1, wobei die Nucleotidzusammensetzung der DNA-Spacersequenz 5'-ACATATGGCAACA-3' ist.

4. Das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch T, wobei die Nucleotidzusammensetzung der DNA-Spacersequenz 5'-AACTATGGCAACG-3' ist.

5. Das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 1, wobei die Nucleotidzusammensetzung der DNA-Spacersequenz 5'-GTATATGGCTACG-3' ist.

6. Das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 1, wobei die Nucleotidzusammensetzung der DNA-Spacersequenz 5'-AATCATGGCAACA-3' ist.

7. Das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 1, wobei die Nucleotidzusammensetzung der DNA-Spacersequenz 5'-ATTTATGGCTACT-3' ist.

8. Das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 1, wobei das DNA-Konstrukt mit einem Replikationssystem zur extrachromosomalen Replikation und Erhaltung verbunden ist.

9. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides, umfassend nichtacetylierte enzymatisch aktive menschliche cytoplasmatische Cu/Zn-Superoxiddismutase, die sich um nicht mehr als vier Aminosäuren von natürlich vorkommender menschlicher cytoplasmatischer Cu/Zn-Superoxiddismutase unterscheidet, wobei das Verfahren umfasst:

Kultivieren von E. coli, enthaltend ein DNA-Konstrukt, das einen funktionellen Vektor zur Expression in E. coli umfasst, in einem Nährmedium, wobei dieses DNA- Konstrukt in abwärtslaufender Reihenfolge der Transkription umfasst:

(1) einen Promotor;

(2) eine ribosomale Bindungsstelle;

XnXnXnXnATGGCXACX

(5) einen Transkriptionsterminator;

wobei das DNA-Konstrukt bei der Expression nichtacetylierte aktive menschliche cytoplasmatische Cu/Zn-Superoxiddismutase exprimiert; und

Isolieren der resultierenden nichtacetylierten enzymatisch aktiven menschlichen cytoplasmatischen Superoxiddismutase, welche durch die E. coli exprimiert wird.