Technologisches Gebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung von Serin-Protease, eines Serin-Protease-Präkursors und
ein Verfahren zur Herstellung dieser als auch ein
Serin-Protease-Präkursor-Gen. Serin-Protease steht mit der Entzündung in
Zusammenhang und kann die Funktionen von Lymphocyten,
Monocyten, NK-Zellen und Granulocyten ändern und steht auch mit
der Gencodierung von Serin-Protease in Zusammenhang.
Technologischer Hintergrund
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Yosuke Aoki und andere haben in Erythroblasten und Granulocyten
neben myeloiden Zellen eine neue Serin-Protease gefunden und
haben sie als Protease Medullasin bezeichnet. Sie haben
festgestellt, daß die Funktion von Medullasin darin besteht, die NK-
Zellen zu aktivieren und eine Entzündung hervorzurufen
(J. Biol. Chem. 253, 2026-2032 (1978); J. Clin. Invest. 69,
1223-1230 (1982)).
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Yosuke Aoki und andere haben außerdem festgestellt und
berichtet, daß Medullasin auch die nachfolgend beschriebenen
biologischen Wirkungen hat.
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(1) Medullasin nahm an der Steuerung der Hämsynthese in
Erythroblasten und an der Manifestation der
Pyridoxin-reaktiven Anämie teil.
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(2) Medullasin nahm an der Manifestation von Anämie teil, die
mit einer chronischen Entzündung verbunden ist.
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(3) Die Aktivität von Medullasin in Granulocyten nahm zu, wenn
die chronische Entzündungserkrankung schlimm wurde.
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(4) Wenn Medullasin mit einer physiologischen Konzentration in
die Haut eines Tieres injiziert wurde, wurde eine
Entzündung
hervorgerufen, die durch Monocyteninfiltration
gekennzeichnet ist, und die Endothelzellen der dünnen Vene wurden
charakteristisch denaturiert.
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(5) Wenn Human-Lymphocyten mit Medullasin behandelt wurden,
nahm deren Fähigkeit zur DNA- und RNA-Synthese zu, und
deren Reaktivität für verschiedene Mitogene stieg deutlich.
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(6) Wenn Monocyten mit Medullasin behandelt wurden, wurde ihr
Migrationsvermögen gestört, wohingegen ihre
Superoxid-Produktivität zunahm.
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(7) Wenn Granulocyten mit Medullasin behandelt wurden, stieg
ihr Migrationsvermögen.
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(8) Wenn Human-Lymphocyten mit Medullasin behandelt wurden,
nahm ihre NK-Aktivität deutlich zu, dies erfolgte jedoch
nicht durch die Erzeugung von Interferon.
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Die gesamte Amlnosäuresequenz von Medullasin wurde nicht
bestimmt, und der einzige Lieferant von Medullasin waren
Knochenmarkszellen des Menschen oder Human-Granulocyten. Somit war die
verfügbare Menge von Medullasin begrenzt.
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Der erste Zweck der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein
Gen, das Medullasin entspricht, mit einem genetischen
Rekombinationsverfahren zu klonen, um die Sequenz zu klären. Dadurch
ist es möglich, das Medullasin codierende Gen oder dessen
Vorstufe festzustellen und gleichzeitig die Aminosäuresequenz von
Medullasin zu klären. Der zweite Zweck der vorliegenden
Erfindung besteht darin, die Synthese von Medullasin durch chemische
Synthese oder genetische Rekombination zu ermöglichen und
Medullasin mit hoher Reinheit in hohen Mengen zu erhalten.
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Medullasin ist in myeloiden Zellen des Menschen oder in
peripheren Blutzellen in großen Mengen enthalten. Es wurden z.B.
etwa 10 ug Medullasin in 1 ml peripherem Blut vom Menschen
gefunden. Medullasin findet man in anderen Geweben und Zellen
kaum, jedoch ausdrücklich in Human-Blutzellen&sub1; insbesondere nur
in Leukocyten und Erythroblasten.
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Es wird deshalb erwartet, daß die Klärung des
Expressionsmechanismus des Medullasin-Gens darin besteht, die Gen-Expression zu
erklären, die für Human-Leukocyten oder -Erythroblasten
spezifisch ist, die bisher nicht aufgedeckt wurde.
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Die zellspezifische Gen-Expression wird nicht nur durch
Faktoren (Trans-Faktoren), z.B. Proteine, die für diese Zellen
spezifisch sind, usw., sondern auch durch die um und in diesen
Chromosomen-Genen vorhandenen Gen-Sequenzen gesteuert. Es wird
deshalb angenommen, daß eine DNA-Sequenz eines die
Transkription kontrollierenden Bereichs, die für die Gen-Expression
erforderlich ist, die für Leukocyten und Erythroblasten unter den
Human-Blutzellen spezifisch ist, um oder im Chromosomen-Gen der
oben beschriebenen Serin-Protease Medullasin existiert, die von
myeloiden Zellen des Menschen stammt.
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Die dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb
darin, die DNA-Sequenz der die Transkription kontrollierenden
Region vorzuschlagen, die für die zellspezifische
Gen-Expression erforderlich ist.
Beschreibung der Erfindung
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung von Serin-Protease nach Anspruch 1.
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Die vorliegende Erfindung besteht außerdem in einem
Serin-Protease-Präkursor, bei dem ein abspaltbares Peptid oder ein
Signalpeptid mit dem N-Terminus der reifen Serin-Protease
verbunden ist, die die in Figur 1 gezeigte Aminosäuresequenz hat, und
in einem Gen, das diesen Serin-Protease-Präkursor codiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1, 3 und 5 zeigen die teilweisen oder vollständigen
Aminosäuresequenzen der erfindungsgemäßen Serin-Protease;
und
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Fig. 2 und 4 zeigen die DNA-Sequenzen, die das erfindungsgemäße
Serin-Protease-Gen enthalten;
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Fig. 6 ist ein Beispiel der Aminosäuresequenz des
erfindungsgemäßen Serin-Protease-Präkursors; und
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Fig. 7 zeigt ein Beispiel der DNA-Sequenz, die den
erfindungsgemäßen Serin-Protease-Präkursor enthält;
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Fig. 8 bis 14 zeigen Verfahren zur Herstellung von Vektoren,
die die erfindungsgemäße Serin-Protease ausprägen;
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Fig. 15 ist ein Beispiel der DNA-Sequenz, die die die
Transkription kontrollierende Region codiert, die in einem
Chromosomen-Gen von Serin-Protease enthalten ist, das
von menschlichen myeloiden Zellen oder Granolocyten
stammt; und
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Fig. 16 zeigt die Chromosomen-Gen-Sequenz, die das
Serin-Protease-Strukturgen enthält, und deren die Expression
kontrollierende Region nach der vorliegenden Erfindung.
Beste Ausführungsformen für die Durchführung der Erfindung
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Die erfindungsgemäße Serin-Protease ist ein Polypeptid, das die
Aminosäuresequenz von 238 Resten zeigt, die in Figur 1 gezeigt
ist, und soweit die gleiche biologische Aktivität wie diese im
wesentlichen erhalten wird, gehören auch jene Polypeptide zur
erfindungsgemäßen Serin-Protease, die durch Teilsubstitution,
Deletion und Insertion in die oben beschriebene
Aminosäuresequenz gebildet werden.
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Protease verliert im allgemeinen einen Teil des N-Terminus und
außerdem in einigen Fällen einen Teil des C-Terminus, dies ist
durch die Tatsache bekannt, daß ein Präkursor-Protein, das
durch eine Messenger-RNA aus deren Gen synthetisiert wurde,
eine Behandlung erfährt und dadurch zur reifen Protease wird.
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Die vorliegende Erfindung prägt die Serin-Protease dieser
Ausführungsformen aus, so daß z.B. eine Aminosäuresequenz von C-
terminalen 19 Resten in einem Polypeptid, das aus der in Figur
1 gezeigten Aminosäuresequenz besteht, durch ein
Aufnahmeverfahren deletiert wird.
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Das erfindungsgemäße Serin-Protease-Gen ist ein Gen, das die
oben beschriebene erfindungsgemäße Serin-Protease codiert, und
die DNA-Sequenz stellt eines der repräsentativen Beispiele dar,
wobei eine die in Figur 2 gezeigte Sequenz enthält.
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Der erfindungsgemäße Serin-Protease-Präkursor ist einer, bei
dem ein abspaltbares Peptid oder Signalpeptid mit dem
N-Terminus der oben beschriebenen Serin-Protease verbunden ist, und
eines der Beispiele ist in Figur 6 gezeigt. Der in Figur 6
gezeigte Serin-Protease-Präkursor besteht aus der
Aminosäuresequenz von 267 Resten und ist der, bei dem die Sequenz von 29
Aminosäuren, die das Signalpeptid enthält, stromaufwärts mit
der Serin-Protease verbunden ist, die in Figur 1 gezeigt ist.
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Das erfindungsgemäße Serin-Protease-Präkursor-Gen ist das Gen,
das den Serin-Protease-Präkursor codiert, und das Gen, das die
in Figur 7 gezeigte DNA-Sequenz enthält, ist ein
repräsentatives Beispiel.
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Da die gesamte Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen 5er in-
Protease und deren Präkursors durch die Erfindung aufgedeckt
wurde, kann sie durch eine bekannte chemische Synthese
hergestellt werden, sie kann jedoch auch durch ein
Gen-Rekombinationsverfahren leicht und in großen Mengen hergestellt werden.
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Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Serin-Protease durch Gen-
Rekombination ist es zuerst erforderlich, daß die cDNA erhalten
wird, die das Serin-Protease-Gen enthält. Die cDNA kann
vorzugsweise durch folgende Verfahren erhalten werden.
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(1) Poly(A)&spplus;RNA wird aus einer Zelle extrahiert, die
Serin-Protease produziert.
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(2) cDNA wird mit der extrahierten Poly(A)&spplus;RNA als Templat und
Umkehrtranskriptase hergestellt, und dadurch wird eine
cDNA-Bank erhalten, die verschiedene cDNA enthält.
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(3) Eine DNA-Sonde, die die gewünschte cDNA hybridisiert, wird
chemisch synthetisiert, und die zu erzielende cDNA wird mit
dieser DNA-Sonde aus der cDNA-Bank auf genommen.
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Als Zelle, die die im Verfahren (1) verwendete Serin-Protease
produziert, wird vorzugsweise ML3 (siehe "Leukämie",
herausgegeben von E. Henderson und F. Gunz, S. 119-139 (Grune &
Strakton, New York, 1982)) verwendet, die die Human-APL-Zelle (akute
Promyelocyt-Leukämie) ist, da sie Serin-Protease kontinuierlich
produziert.
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Die DNA-Säure, die beim Verfahren (3) verwendet wird, wird
durch chemische Synthese und Markieren eines DNA-Oligomers
erhalten, das ein Genfragment ist, das der Aminosäuresequenz des
N-Terminus der Serin-Protease entspricht, die nach dem
Degradationsverfahren von Edman bestimmt wurde.
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Ein Vektor, der das Serin-Protease-Gen enthält, wird in den
geeigneten Expressionsvektor integriert, wodurch rekombinante DNA
erhalten wird. Die gewünschte Serin-Protease kann durch
Einführung dieser rekombinanten DNA in einen Wirt, z.B. Escherichia
coli, Bacillus subtilis, Hefe oder eine gezüchtete Tierzelle,
und durch Züchten der dadurch erhaltenen transformierten Zellen
produziert werden. Wenn bei diesem Verfahren eine
Eukaroytzelle, z.B. eine Tierzelle, als Wirt verwendet wird, kann
Serin-Protease mit einer Zuckerkette erhalten werden.
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Die oben beschriebene Genmanipulation kann durch ein bekanntes
Verfahren vorgenommen werden (T. Maniatis et al. "Molecular
Cloning, A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Lab. 1982)).
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Wenn Escherichia coli als Wirt verwendet wird, kann außerdem
die Expressionsleistung verbessert werden, wenn ein
Expressionsvektor verwendet wird, der ein Gen enthält, das eine
Protein-Chimäre codiert, die gebildet wird, indem ein Protein, z.
B. ein Peptid, das vom Phagen T7 stammt, ein Anthranillinsäure
synthetisierendes Enzym (nachfolgend als Trpe abgekürzt) oder
β-Galactosidase als entfernbare Form stromaufwärts mit der
erfindungsgemäßen Serin-Protease verbunden werden.
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Die Serin-Protease kann leicht durch Digerieren der oben
hergestellten Protein-Chimäre mit einem Enzym usw. abgetrennt
werden.
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Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine
DNA-Sequenz, die die die Transkription kontrollierende Region
codiert, der in einem Chromosomen-Gen von Serin-Protease enhalten
ist, die von einer myeloiden Human-Zelle stammt.
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Die die Transkription kontrollierende Region dieser Erfindung
enthält eine Promotorregion und einen Verstärker, und als diese
codierende DNA-Sequenz können z.B. die in Figur 15 gezeigte
Sequenz oder eine dazu äquivalente Sequenz zitiert werden, sie
ist jedoch nicht darauf begrenzt. Das Wort "Äquivalenz"
bedeutet hier jene, bei denen die DNA-Basen teilweise durch andere
DNA-Basen substituiert sind, teilweise eliminiert sind oder
andere DNA-Basen hinzugefügt wurden, und die gleichzeitig die
gleiche Funktionalität wie die ursprüngliche DNA-Sequenz haben.
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Die in Figur 15 gezeigte Sequenz entspricht der 1. bis 1250.
DNA-Sequenz in der in Figur 16 gezeigten DNA-Sequenz. Figur 16
zeigt die Sequenz des Chromosomen-Gens, das ein Strukturgen,
Medullasin und dessen die Expression kontrollierende Region
enthält, und dies ist die Basensequenz, die in einem
DNA-Fragment mit etwa 6 Kilobasen bestimmt wurde, das geklont wurde. In
der Sequenz von Figur 16 ist die Gesamtlänge des
Human-Medullasin-Gens
enthalten, und die TATA-Sequenz und die
CAAT-Sequenz, die charakteristische Promotorkomponenten sind, können
ebenfalls bestätigt werden. Durch Vergleich mit der
Basensequenz der cDNA von Medullasin wurde festgestellt, daß das
Medullasin-Gen aus 5 Exonen besteht, die durch 4 Intronen geteilt
werden.
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Als charakteristische Strukturen können 4
Wiederholungssequenzen, die 53 Basenpaare stromaufwärts der Promotorstruktur
umfassen, und 10 direkte Wiederholungsstrukturen, die 42
Basenpaare im dritten Intron umfassen, beobachtet werden. Eine an AT
reiche Struktur, die eine komplizierte Sekundärstruktur haben
kann, existiert ebenfalls im dritten Intron. Einige Sequenzen,
die der Consensus-Sequenz (GGCGGG, CCCGCC) ähnlich sind, die
durch das Protein SP1 gebunden ist, das einen die Transkription
kontrollierenden Faktor darstellt, existiert ebenfalls in der
Nähe des Promotorbereichs.
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Die Basensequenz in dem die Translation startenden Bereich des
Medullasin-Gens stimmt genau mit der Basensequenz überein, die
M. Kozack als notwendig vorschlägt, damit eine wirksame
Translation beginnt, und es wird eingeschätzt, daß dies einer der
Gründe dafür ist, daß das Protein Medullasin in relativ großen
Mengen existiert, z.B. etwa 10 ug pro 1 ml des peripheren Bluts
beim Menschen.
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Wie in den Beispielen gezeigt, haben die hier genannten
Erfinder außerdem festgestellt, daß durch Prüfung der Menge von
Poly(A)&spplus;RNA in den Zellen durch Northern-Blotting-Analyse
Poly(A)&spplus;RNA von Medullasin in ML3-Zellen (oben beschrieben),
die Zellen der akuten Promyelocyt-Leukämie beim Menschen
darstellen, in großen Mengen ausgeprägt wurden, jedoch in
diploiden Fibroblasten, die von fötalem Lungengewebe des Menschen
stammen, oder in Zellen des Zellstamms MIAPaCa-2 nur sehr wenig
ausgeprägt werden, die vom malignen, epithelialen
Pankreas-Tumor beim Menschen stammen.
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Aus diesen Ergebnissen kann man sehen, daß der die
Transkription kontrollierende Bereich eine Sequenz für eine bestimmte
Gen-Expression in Human-Hämocytenzellen, insbesondere
Erythroblasten und Granulocyten, ist.
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Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend durch folgende
Beispiele konkreter erläutert. In den Beispielen wurde der Begriff
reife Serin-Protease verwendet, damit die erfindungsgemäße
Serin-Protease nicht mit dem Serin-Protease-Präkursor verwechselt
wird.
Beispiel 1
Herstellung der cDNA von Serin-Protease und Bestimmung der
Basensequenz
(A) Synthese der DNA-Sonde
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225 ug gereinigtes Medullasin, das nach dem Verfahren von Aoki
et al. (J. Biol. Chem. 253, 2026-2032 (1978)) erhalten wurde,
wurde mit dem automatischen
Gasphasen-Peptid-Sequenzanalysegerät vom Typ 470A analysiert (von Applied Biosystems Co., Ltd.
hergestellt). Die Sequenz von 49 Aminosäureresten des
N-Terminus wurde wie in Figur 3 gezeigt durch Analyse der erhaltenen
Fraktion mit Hochleistungsflüssigchromatographie bestimmt. Bei
der Analyse der Aminosäurereste mit diesem Analyseverfahren
blieb eine gewisse Ungenauigkeit, diese wird in Klammern
angegeben.
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Von den oben beschriebenen 49 Aminosäureresten wurde der Teil
der Aminosäureseguenz ¹²Trp-Pro-Phe-Met-¹&sup6;Val, bei dem der
Degenerationsgrad der zu codierenden DNA gering war, ausgewählt,
und 8 Arten von DNA-Oligomeren mit einer Länge von 14 Basen,
ausschließlich der Base des 5'-Terminus (dies ist die dritte
Base, die Val codiert) mit komplementärer DNA-Basensequenz, die
den DNA-Basensequenzen komplementär ist, die diesen Teil der
Aminosäuresequenz codieren, wurden durch ein bekanntes
Verfahren chemisch synthetisiert. (Dies basiert auf der Tatsache, daß
es 4 Codone, die Prolin codieren, und 2 Codone gibt, die
Phenylalanin codieren.) Die Basensequenzen dieser 8 Arten von
DNA-Oligomeren wurden wie folgt beschrieben. Die
5'-Hydroxylgruppen
in der äquivalenten Mischung aus 8 Arten von
DNA-Oligomeren wurden durch Phosphorylierung mit T&sub4;-Polynucleotid-Kinase
und γ-³²UC-ATP markiert, wodurch die DNA-Sonde erhalten wurde.
(B) Herstellung von Poly(A)&spplus;RNA
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Die Zellinie ML3 wurde im Medium RPMI 1640, das 10% fötales
Kälberserum enthielt, bei 37ºC in 5% dichtem Kohlendioxid
gezüchtet. Als die Zellen etwa 1 x 10&sup6; Zellen/ml erreicht hatten,
wurde dem Medium Cycloheximid zugesetzt, so daß dessen
Konzentration 30 ug/ml betrug, und die Kultur wurde weitere 5 Stunden
fortgesetzt. 30 ml einer Lösung, die 6m Guanidinthiocyanat, 2%
Sarcosil, 50mM Tris(hydrochlorid) (pH = 7,6), 10mM EDTA und 1%
β-Mercaptoethanol umfaßt, wurden den oben erhaltenen Zellen
zugesetzt (etwa 1,4 x 10&sup9; Zellen), und die erhaltene viskose
Lösung wurde 5 mal durch eine Injektionsnadel mit 18G geleitet.
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Dieses Zellhomogenat wurde auf eine 5,7m Cäsiumchloridlösung
(die 100mm EDTA enthielt) gegeben, deren Volumen ein Drittel
des Homogenats betrug, und über Nacht bei 25ºC mit 35000 U/min
zentrifugiert. Die am Boden des Zentrifugenrohrs ausgefällte
RNA wurde in einer geringen Wassermenge gelöst und nach der
Phenolbehandlung mit Ethanol gefällt, wodurch 640 ug der
gesamten RNA erhalten wurden.
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Diese gesamte RNA wurde auf übliche Weise durch
Säulenchromatographie mit Oligo-(dt)-Cellulose fraktioniert, wodurch selektiv
86 ug Poly(A)&spplus;RNA erhalten wurden.
(C) Herstellung der cDNA
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Mit 5 ug der im vorangegangenen Absatz erhaltenen Poly(A)&spplus;RNA
wurden nach dem Verfahren von Gubler und Hoffman (Gene, 25,
263(1983)) mit einem Gerät zur cDNA-Synthese (von Amersham
hergestellt) nach dessen Vorschrift 640 ng doppelsträngige cDNA
synthetisiert. Dann wurden mit beiden Termini ECORI-Linker
verbunden, wobei das cDNA-Cloning-System (von Amersham
hergestellt) verwendet wurde, und die Reaktionsmischung wurde mit
ECORI digeriert. Danach wurden 434 ng der doppelsträngigen cDNA
mit den mit ECORI verbundenen Termini an beiden Enden durch
eine Gelfiltrationssäule erhalten. 86 ng dieser doppelsträngigen
cDNA wurden zu 1 ug λgtlo-Armen ligiert, wobei T4-Ligase
verwendet wurde, und die Reaktionsmischung wurde dem
λ-Phagen-Verpackungsextrakt zugesetzt, und es wurde eine Mischung von
rekombinanten Phagen erhalten (es wurden die Materialien des
cDNA-Cloning-Systems, das von Amersham Co., Ltd. hergestellt
wird, und deren Rezeptur verwendet). 9,6 x 10&sup4; pfu
(Plaquebildende Einheiten) von rekombinanten Phagen (cDNA-Bank)
wurden mit Escherichia coli NM514 als Wirt erhalten.
(D) Abtrennung des cDNA-Klons von Serin-Protease
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Etwa 25000 der oben erhaltenen rekombinanten Phagen wurden in
eine Petrischale mit einem Durchmesser von 145 mm, die das LB-
Medium enthielt, auf Escherichia coli NM514 als Wirt geimpft,
und dadurch wurde 4 Master-Platten hergestellt. Nach der
Übertragung des Phagen auf einen Nitrocellulosefilter wurde die
Phagen-DNA durch alkalische Denaturierung auf dem Filter
fixiert.
Es wurde das Verfahren von R. Davis et al. ("DNA
Cloning", herausgegeben von D.M. Glover, Bd. I, S. 49 78 (IRL
Press) (1985)) angewendet, das diesen Verfahren entspricht.
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Die Filter, auf denen die Phagen-DNA nach dem oben
beschriebenen Verfahren fixiert worden war, wurden durch Hybridisierung
ausgelesen, wobei die im Absatz (A) hergestellte DNA-Sonde
verwendet wurde. Die Hybridisierung erfolgte bei 35 ºC und das
Waschen erfolgte ebenfalls bei 35ºC. Es wurde das Verfahren von
T. Maniatis ("Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Cold
Spring Harbor Lab. (1982)) angewendet, das diesen Verfahren
entspricht. Durch die Hybridisierung wurden 7 Positive der
Klone erhalten, die durch Autoradiographie nachgewiesen wurden.
(E) Bestimmung der Basensequenz der cDNA von Serin-Protease
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Die Phagen-DNA von MED1-4a, der einer der im vorangegangenen
Absatz erhaltenen positiven Klone war, wurde extrahiert und mit
EcoRI getrennt, wodurch etwa 800 Basenpaare von DNA-Fragmenten
erhalten wurden. Zur Sequenzanalyse wurde dieses Fragment in
die EcoRI-Stelle des Klonierungsvektors pUC19 (von Takara Shuzo
Co., Ltd. hergestellt) und des Phagen M13mP19-RFDNA (von Takara
Shuzo Co., Ltd. hergestellt) eingesetzt. Die Sequenzanalyse
erfolgte mit dem Didesoxy-Verfahren mit
Deoxy-7-deazaguanintriphosphat. Zur Analyse der mittleren Teile wurden nacheinander
Primer synthetisiert, die den umgebenden Teilen entsprechen,
deren Sequenzen bereits bestimmt wurden, und die Sequenzanalyse
erfolgte nach dem Didesoxy-Verfahren. Somit wurde die in Figur
4 gezeigte DNA-Sequenz bestimmt. Bei der in Figur 4 gezeigten
DNA-Sequenz stammten der oberen Strom einschließlich der 7. C
und der untere Strom einschließlich der 807. G vom EcoRI-Linker
GGAATTCC, der zum Klonen am Vektor λgt10 verwendet wurde.
Deshalb war die DNA-Basensequenz von 8. bis 806. in der Figur
die cDNA, die von Poly(A)&spplus;RNA stammt. Das längste offene
Leseraster (Proteincodierender Bereich) wurde gesucht, und es wurde
festgestellt, daß das translatierte Codierungsraster der DNA-
Sequenz von 8. bis 718. in der Figur am längsten war, und ab
der 719. das Terminationscodon TGA folgte. Die translatierte
Aminosäuresequenz, die der DNA-Sequenz von der 8. bis zur 718.
entspricht, ist in Figur 5 gezeigt. Die Aminosäuresequenz von
der 1. bis zur 48. in dieser Figur ist zur Aminosäuresequenz
von der 2. bis zur 49. des gereinigten Medullasin vollständig
identisch, die in Figur 3 gezeigt ist. Aus diesem Ergebnis wird
die Schlußfolgerung gezogen, daß die DNA-Sequenz von der 8. bis
zur 718. in der in Figur 4 gezeigten DNA-Sequenz die cDNA
bildet, die den Teil der erfindungsgemäßen Serin-Protease
codiert, und dieser cDNA-Teil wurde in Figur 2 gezeigt. Der cDNA
fehlt der Teil, der Isoleucin (Ile) codiert, das die
N-terminale Aminosäure des gereinigten Medullasin ist, wie es in Figur
3 gezeigt ist; da es jedoch aus der oben beschriebenen Analyse
der Aminosäuresequenz von gereinigtem Medullasin klar ist, daß
Ile der N-Terminus von Medullasin ist, kann die Schlußfolgerung
gezogen werden, daß die gesamte cDNA-Sequenz, die die
erfindungsgemäße Serin-Protease codiert, die ist, bei der ATT,
ATC oder ATA, die Ile codieren, der 5'-Terminusseite der in
Figur 2 gezeigten Basensequenz hinzugefügt wurden. Die
Aminosäuresequenz, die dieser gesamten cDNA entspricht, und
zwar die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen
Serin-Protease, ist in Figur 1 gezeigt.
Beispiel 2
Herstellung einer vollen Länge der cDNA von Serin-Protease und
Bestimmung der Basensequenz
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Fünf positive Klone mit einer längeren cDNA von Serin-Protease
als 800 Basenpaare des in Beispiel 1 erhaltenen Klons MED1-4a
wurden unter Verwendung der in Beispiel 1 erhaltenen partiellen
cDNA als Sonde von etwa eins Millionen Plaques der λgt10 cDNA-
Bank abgetrennt, die gerade nach einem ähnlichen Verfahren wie
Beispiel 1, Absatz (C) synthetisiert wurde, wobei 5 ug
Poly(A)&spplus;RNA der ML3-Zelle verwendet wurden, das auf ähnliche
Weise wie in Beispiel 1, Absatz (B) hergestellt wurde. Die
Basensequenz der Region, die die N-Termini von Serin-Protease des
Klons MED10 und MED13 unter fünf positiven Klonen codiert,
wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1, Absatz (E)
bestimmt, und es wurde festgestellt, daß MED13 und MED10
weitere 89 und 128 Basenpaare stromaufwärts als MED1-4a enthält.
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Deshalb kann die Sequenz der cDNA des Serin-Protease-Präkursors
wie in Figur 7 gezeigt sein. Aus diesen DNA-Sequenzen wird
eingeschätzt, daß der Serin-Protease-Präkursor 267 Aminosäuren
umfaßte und weitere 29 Aminosäuren mit dem oberen Strom von
Isoleucin verbunden waren, das am N-Terminus der reifen Serin-
Protease angeordnet war (Figur 6). Neben dem Leader-Peptid, das
diese 29 Aminosäuren umfaßte, umfaßten 27 Aminosäuren der N-
Terminusseite 17 hydrophobe Aminosäuren (9 Leucine, 5 Alanine,
1 Phenylalanin, 1 Valin und 1 Prolin) und hatten die am besten
erkennbare Sequenz mit einer Signal-Peptidase, die an ihrer C-
Terminusseite Alanin-Leucin-Alanin umfaßt. Deshalb wurde
angenommen, daß es sich um ein Signalpeptid handelt. Außerdem wird
geschätzt, daß das Peptid, das 2 Aminosäuren,
Serin-Glutaminsäure, umfaßt, die auf dem unteren Strom dieses Leader-Peptids
angeordnet sind, ein Aktivierungspeptid ist.
Beispiel 3
Herstellung des Expressionsvektors pETMED, der Serin-Protease
in Escherichia coli ausprägt, und Expression der
Protein-Chimäre von T7-Serin-Protease
(A) Herstellung der cDNA des Vektors pUC19YMED von reifer
Serin-Protease:
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Zuerst wurde das EcoRI-Fragment der durch Beispiel 1 erhaltenen
cDNA, das in Figur 4 gezeigt ist, in die EcoRI-Stelle des
Klonierungsvektors pUC19 eingesetzt, und es wurde die Plasmid-DNA
pUC19MED1-4a ausgewählt, indem die Einschubrichtung bestätigt
wurde, in der der stromabwärtige Teil der in Figur 4 gezeigten
DNA in der Nähe der BamHI-Stelle von pUC19 war.
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Dieser Vektor pUC19MED1-4a wurde vollständig mit HindIII
digeriert und teilweise mit Naei digeriert. Dadurch wurde ein
Fragment mit 810 Basenpaaren der cDNA von Serin-Protease erhalten.
Der Vektor pUC19YMED mit der cDNA der reifen Serin-Protease
wurde hergestellt, indem dieses DNA-Fragment und ein
synthetisiertes Oligomer, das den N-Terminus der reifen Serin-Protease
codiert, zwischen die EcoRI-Stelle und die HindIII-Stelle von
pUC19 eingeschoben wurde, wobei T4-DNA-Ligase verwendet wurde
(Figur 8).
(B) Herstellung von pETMED:
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pET-36, das von Dr.F. William Studier (Biology Department,
Brookhaven National Laboratory, Upton, New York) vertrieben
wird, wurde vollständig mit BamHI digeriert, das auf dem
unteren Strom des Promotors T7 angeordnet war und danach durch
Behandlung mit Mung-Bean-Nuclease zu einem blunt end gemacht.
Danach wurde pUC19YMED aus dem Absatz (A) vollständig mit EcoRV
und HincII digeriert, und es wurden etwa 0,8 kb von
DNA-Fragmenten abgetrennt, die die cDNA der Reifung von Serin-Protease
umfaßten. Der Vektor pETMED, der Serin-Protease in Escherichia
coli ausprägt, wurde hergestellt, indem diese beiden
DNA-Fragmente mit T4-DNA-Ligase verbunden wurden (Figur 9). Aus diesem
Vektor wurde eine Protein-Chimäre mit 250 Aminosäuren
hergestellt, wobei das Peptid, das 11 Aminosäuren umfaßt (Met-Ala-
Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly), das vom Phagen T7 stammt,
und reife Serin-Protease, die 238 Aminosäuren umfaßt,
miteinander verbunden wurden, wobei Arginin dazwischen angeordnet
wurde. Die reife Serin-Protease kann abgetrennt werden, wenn
diese Protein-Chimäre teilweise mit Trypsin digeriert wird.
(C) Expression der Protein-Chimäre von T7-Serin-Protease
mit pETMED:
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Zuerst wurde der im Absatz (B) hergestellte pETMED in
Escherichia coli HMS174 eingeführt (J.L. Campbell et al., Proc. Natl.
Acad., Sci., U.S.A. 75, 2276-2280 (1978)). Diese Rekombinante
wurde über Nacht bei 37ºC auf 5 ml LB-Medium gezüchtet (T.
Maniatis et al., "Molecular Cloning", S. 440 (1982)), das 100
ug/ml Ampicillin und 0,4% (Gew./Vol.) Maltose enthielt, und
danach wurden 0,1 ml davon auf das NZCYM-Medium übertragen
(T. Maniatis et al., "Molecular Cloning", S. 440 (1982)), das
100 ug/ml Ampicillin und 0,4% (Gew./Vol.) Maltose enthielt.
Dies wurde bei 37ºC gezüchtet, bis die Absorption bei 600 nm
0,3 betrug, danach wurde mit dem Phagen CE6 infiziert
(F.W. Studier et al., J. Mol. Biol., 189, 113-130 (1986)),
dessen Menge das 5- bis 10-fache von Escherichia coli betrug,
und es wurde 3 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Durch Analyse des
gesamten Proteins des oben erhaltenen Bakteriums mit SDS-
Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese wurde ein Protein beobachtet,
dessen Molekulargewicht etwa 29000 betrug und das im Bakterium
nicht beobachtet wurde, wenn die Kontrolle pET-36 (oben
beschrieben) eingeführt wurde. Durch Western-Blotting mit dem
Antikörper für Medullasin wurde bestätigt, daß dieses Protein
die Protein-Chimäre von T7-Serin-Protease ist.
Beispiel 4
Herstellung des Vektors pATH2MED, der TrpE-Serin-Protease
ausprägt, und Expression einer Protein-Chimäre von TrpE-Serin-
Protease
(A) Herstellung des Vektors pATH2MED, der
TrpE-Serin-Protease ausprägt:
-
Ein DNA-Fragment mit etwa 800 Basenpaaren, das ein
Serin-Protease-Partialgen enthielt, wurde abgetrennt, indem pUC19MED1-4a
in Beispiel 1 vollständig mit HindIII digeriert und danach
teilweise mit NaeI digeriert wurde. Dieses Fragment und ein
synthetisiertes Oligomer, das die N-Terminusseite von Serin-
Protease codiert, wurden zwischen die Sa1I- und HindIII-Stellen
des Vektors pATH2 eingeschoben, damit die TrpE-Protein-Chimäre
ausgeprägt wird (C.L. Dieckman und A. Tzagoloff, J. Biol. Chem.
260, 1513-1520 (1985)), wobei T4-DNA-Ligase verwendet wurde,
und somit wurde der Vektor pATH2MED hergestellt, der eine
Protein-Chimäre von TrpE-Serin-Protease ausprägt (Figur 10).
-
Von diesem Vektor wurde eine Protein-Chimäre hergestellt, die
570 Aminosäuren umfaßt, bei der das Peptid, das 331 Aminosäuren
umfaßt, das von TrpE stammt, und Reifungs-Serin-Protease, die
238 Aminosäuren umfaßt, miteinander verbunden wurden, wobei
Lysin dazwischen angeordnet wurde. Die reife Serin-Protease kann
isoliert werden, wenn diese Protein-Chimäre teilweise mit der
Endoprotease lysC digeriert wird.
(B) Expression der Protein-Chimäre von TrpE-Serin-Protease
mit pATH2MED:
-
Escherichia coli HB101, das mit pATH2MED transformiert worden
war, wurde 7 Stunden bei 30ºC im LB-Medium gezüchtet, das 100
ug/ml Ampicillin enthielt (T. Maniatis et al., "Molecular
Cloning", S. 440 (1982)). 4 ml dieser Kultur wurden in 40 ml des
M9-Mediums übertragen (T. Maniatis et al., "Molecular Cloning",
S. 68 (1982)), das Magnesiumsulfat, Thiaminhydrochlorid,
Glucose und Ampicillin mit der Konzentration 1mM, 1 ug/ml, 1%
(Gew./Vol.) bzw. 100 ug/ml enthielt, es wurde über Nacht bei
25ºC gezüchtet und weitere 8 Stunden gezüchtet, nachdem 0,8 ml
Glucose, 0,16 ml eines 14%-igen (Gew./Vol.) Ammoniumhydroxids
und 40 ml Indolacrylsäure mit 10 mg/ml zugesetzt worden waren.
-
Durch Analyse des gesamten Proteins des Bakteriums mit
SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese wurde eine Protein-Chimäre von
TrpE-Serin-Protease bestätigt, deren Molekulargewicht etwa
61000 betrug, und die in HB101 nicht beobachtet wurde, in das
Kontroll-pATH2 eingeführt worden war. Durch Western-Blotting
mit einem Antikörper für Medullasin wurde bestätigt, daß dieses
Protein eine Protein-Chimäre von Serin-Protease war.
Beispiel 5
Herstellung des Vektors pATMED für Serin-Protease-Hefe und
Expression der Serin-Protease
(A) Herstellung des Vektors pUC19PMED mit der cDNA des
Serin-Protease-Präkursors:
-
Ein DNA-Fragment mit etwa 950 Basenpaaren wurde abgetrennt,
indem pUC19MED13 in Beispiel 3 vollständig mit HindIII und danach
teilweise mit Eco521 digeriert wurde. Der Vektor pUC19PMED mit
der Serin-Protease-Präkursor-cDNA wurde hergestellt, indem
dieses Fragment und synthetisierte Oligomere, die den N-Terminus
des Serin-Protease-Präkursors codieren, zwischen die EcoRI-
Stelle und die HindIII-Stelle von pUC19 eingeschoben wurden,
wobei T4-DNA-Ligase verwendet wurde (Figur 11).
(B) Herstellung von pATMED:
-
Zuerst wurde der Vektor pAT405 mit dem Promotor PH05 (saure
Phosphatase inhibierend) von Hefe, der von Dr. Tobe von der
Hiroshima University vertrieben wird, vollständig mit XhoI
digeriert und danach durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase zu
einem blunt end gemacht. Die Phosphorsäure am Terminus wurde
durch alkalische Phosphatase-Behandlung durch Escherichia coli
entfernt. Danach wurde pUC19PMED vom Absatz (A) vollständig mit
EcoRI digeriert und danach durch Behandlung mit
T4-DNA-Polymerase zu einem blunt end gemacht. Danach wurde das DNA-Fragment
mit etwa 950 Basenpaaren abgetrennt, das die Serin-Protease-
Präkursor-cDNA enthält. Der Vektor pATMED, der Serin-Protease
in Hefe ausprägt, wurde durch Verbinden dieser beiden
DNA-Fragmente hergestellt, wobei T4-DNA-Ligase verwendet wurde (Figur
12).
(C) Expression von Serin-Protease mit pATMED:
-
Hefe DCS mit eingeführtem pATMED (von Dr. Tobe der Hiroshima
University verbreitet) wurde über Nacht bei 30ºC in 5 ml des
Mediums "Yeast Nitrogen Base" (von Difco hergestellt)
gezüchtet, das Histidin und Glucose in einer Konzentration von 0,1
mg/ml bzw. 2% (Gew./Vol.) enthielt. 2,5 ml der Kultur wurden in
50 ml des gleichen Mediums übertragen und über Nacht bei 30ºC
weiter gezüchtet. Die Bakterien wurden aufgefangen, einmal mit
50 ml Wasser gewaschen, in 50 ml phosphorfreiem Medium
suspendiert (wobei KCL anstelle von KH&sub2;PO&sub4; des Mediums "Yeast Minimal
Medium" verwendet wurden (R.L. Rodriguez und R.C. Trait
"Recombinant DNA techniques" S. 151 (1983)) und es wurde 1,5
Tage bei 30ºC gezüchtet. 1 ml des gezüchteten Überstandes
wurden durch Lyophilisierung konzentriert und danach durch SDS-
Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese analysiert. Dadurch wurde ein
Protein nachgewiesen, dessen Molekulargewicht etwa 32000 betrug
und das im gezüchteten Überstand von DCS nicht beobachtet
wurde, in den ein Kontroll-pAT405 eingeführt worden war. Durch
Western-Blotting mit einem Antikörper für Serin-Protease wurde
bestätigt, daß dieses Protein Serin-Protease war.
Beispiel 6
Herstellung des Vektors pMFαMED, der Hefe von Serin-Protease
ausprägt, und Expression in Hefe
(A) Herstellen des Vektors pMFαMED, der Hefe von
Serin-Protease ausprägt
-
pUC19YMED von Beispiel 4, Absatz (A), wurde vollständig mit
EcoRI und HincII digeriert, und es wurde ein DNA-Fragment mit
etwa 800 Basenpaaren abgetrennt, das cDNA von reifer
Serin-Frotease umfaßt. Dann wurden ein Promotor des c'-Faktors, der ein
reifendes Pheromon von Hefe war, und der Vektor pMFα8
(A. Miyajima et al., Gene, 37, 155 (1985)) mit einer Leader-
Sequenz vollständig mit Stui digeriert und danach mit
alkalischer Phosphatasebehandlung von Escherichia coli
dephosphoryliert. Der Vektor pSRαMED für die Expression der
Serin-Protease in Hefe wurde hergestellt, indem diese beiden
DNA-Fragmente mit T4-DNA-Ligase verbunden wurden (Figur 13).
(B) Transformation von Hefe 20B12 mit pSRαMED:
-
10 ug von pSRαMED vom Absatz (A) wurden in etwa 1 x 10&sup7; Zellen
Hefe 20B12 eingeführt (von Dr. Tobe der Hiroshima University
verbreitet), dies erfolgte mit einer Alkalimetallbehandlung
(A. Kimura et al., J. Bacteriol., 153, 163(1983)). Die so
erhaltene transformierte Zelle wurde über Nacht bei 30ºC in 5
ml des Mediums "Yeast Nitrogen Base" gezüchtet (von Difco
hergestellt), das Glucose in einer Konzentration von 2%
(Gew./Vol.) enthielt. Danach wurde 1 ml der Kultur in 10 ml
desselben Mediums übertragen und weitere 24 Stunden gezüchtet.
1 ml des gezüchteten Überstandes wurden durch Lyophilisierung
konzentriert und danach durch Western-Blotting analysiert,
wobei ein Antikörper für Serin-Protease (Medullasin) verwendet
wurde. Dadurch wurde ein Protein nachgewiesen, dessen
Molekulargewicht etwa 32000 betrug und das im gezüchteten
Überstand von 20B12 nicht beobachtet wurde, in den Kontroll-pMF
α8 eingeführt worden war.
Beispiel 7
Herstellung des Vektors pSRαMED, der Serin-Protease in einer
Tierzelle ausprägt, und Expression in einer Tierzelle
(A) Herstellung des Vektors pSRαMED, der Serin-Protease in
einer Tierzelle ausprägt:
-
pUC19PMED von Beispiel 6, Absatz (A), wurde vollständig mit
EcoRI digeriert, und ein DNA-Fragment von etwa 950 Basenpaaren
wurde abgetrennt, das die Serin-Protease-Präkursor-cDNA
enthielt. Es wurde mit einem Vektor verbunden, der durch
vollständiges Digerieren von pcDLSRα296 (von Dr. Takebe, DNAX
erhalten) mit EcoRI und Dephosphorylieren mit alkalischer
Phosphatasebehandlung mit Escherichia coli mit T4-DNA-Ligase erhalten
wurde, und dadurch wurde der Vektor pSRαMED hergestellt, der
Serin-Protease in einer Tierzelle ausprägt (Figur 14).
(B) Transformation der COS-1 Zelle mit pSRαMED:
-
10 ug pSRαMED vom Absatz (A) wurden in etwa 2 x 10&sup6; Stücke von
COS-1 Zellen eingeführt, die von der Niere eines Affen stammen
(Y. Gluzman, Cell, 23, 175 (1981)), dies erfolgte nach dem
Kalziumphosphatverfahren (F.L. Graham et al., Virology, 54, 536).
Die Zellen wurden nach 5 Tagen aufgefangen, und die Proteine
der gesamten Zellen wurden durch Western-Blotting mit dem
Antikörper für Serin-Protease (Medullasin) analysiert. Es wurde ein
Protein nachgewiesen, dessen Molekulargewicht etwa 30000 betrug
und das in COS-1 Zellen nicht beobachtet wurde, in die der
Vektor nicht eingeführt worden war. Die Aktivität des Enzyms wurde
mit einem beschriebenen Verfahren gemessen (L. Visser et al.,
Biochem. Biophys. Acta, 268, 257 (1972)), wobei p-Nitrophenyl-
N-tert.-butyloxycarbonyl-L-alaninat als Substrat verwendet
wurde, das ein allgemeines Substrat von Elastase ist. Die
lösliche Fraktion, die durch Aufbrechen der Zellen durch
Gefrieren-Auftauen und durch 30-minütiges Zentrifugieren mit 12000 g
erhalten wurde, zeigte eine Aktivität, die die Absorption bei
347,5 nm im Vergleich mit der Kontrolle um 0,1 pro etwa 1 x 10&sup6;
Zellen verstärkt.
Beispiel 8
Southern-Hybridisierung von Chromosomen-DNA:
-
Vor dem Klonen des Human-Medullasin-Gens erfolgte zuerst die
Southern-Hybridisierung. Jeweils 10 ug von Chromosomen-DNA, die
aus der Mandel des Menschen stammen (das Herstellungsverfahren
basierte auf dem Verfahren, das in P. Chambon et al., Eur. J.
Biochem., 36, 5.32-38 (1973) beschrieben ist), wurden mit dem
Restriktionsenzym EcoRI, BamHI ir PstI getrennt, wobei mit
Agarose-Gel fraktioniert wurde. Die Southern-Hybridisierung
erfolgte nach dem Southern-Blotting mit Medullasin-cDNA als
Sonde. Durch dieses Ergebnis wurde deutlich, daß nur etwa 6 kb
des Fragmentes von EcoRI durch Digerieren mit der
Human-Medullasin-cDNA-Sonde hybridisierten, und daß nur eine Art des
Human-Medullasin-Gens im Chromosom existierte, und es war im
6 kb Fragment von EcoRI enthalten.
-
Die verwendete Medullasin-cDNA-Sonde wurde hergestellt, indem
die cDNA (das Fragment mit eingesetztem EcoRI, etwa 800 bp),
das in K. Okano et al., J. Biochem. 102, S.13-16 (1987)
beschrieben ist, durch Nick-Translation mit ³²P markiert wurde.
Beispiel 9
Klonen des Human-Medullasin-Gens:
-
Etwa 100 ug Human-Chromosomen-DNA wurden mit EcoRI geschnitten,
und die DNA mit einer Länge von etwa 6 kb wurden von der
Elektrophorese mit Agarose-Gel gewonnen. Die gewonnene DNA
wurde mit dem mit EcoRI digerierten Arm von DNA des Vektors
λgtWES λβ, der von einem λ-Phagen stammt (von BRL erhalten) als
Vektor ligiert (Ligase-Reaktion), und eine Genbank wurde durch
in vitro Verpackung hergestellt (das Gerät für die in vitro
Verpackung wurde von Takara Shuzo Co., Ltd. erhalten). Die
Genbank
mit 5 x 10&sup4; pfu konnte von 0,5 ug der gewonnenen DNA und
0,1 ug der Vektor-DNA erhalten werden. Diese Genbank wurde
durch übliche Plaque-Hybridisierung ausgewählt (T. Maniatis et
al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (hier nachfolgend
als Buch A abgekürzt)", S. 312-318 (Cold Spring Harbor
Laboratory (1982)), wobei als Sonde eine der Nick-Translation
unterzogene Medullasin-cDNA verwendet wurde (das Gerät für die Nick-
Translation wurde von Takara Shuzo Co., Ltd. erhalten). Als
Ergebnis wurden 3 Stücke von positiven Klonen erhalten. Eins
davon wurde λMED-2 genannt.
Beispiel 10
Bestimmung der Basensequenz von λMED-2:
-
Das EcoRI-Einschubfragment von λMED-2 wurde im
Sequenzierungsvektor pUC18 DNA oder pUC19 DNA (von Takara Shuzo Co., Ltd.
erhalten) subkloniert, und geeignete Deletionsvarianten wurden
mit dem Kilo-Deletions-Gerät erhalten (von Takara Shuzo Co.,
Ltd. erhältlich). Jede Basensequenz wurde durch das Didesoxy-
Sequenzanalyseverfahren mit dem Sequenzgerät 7-DEAZA bestimmt
(von Takara Shuzo Co., Ltd. erhalten). Das Ergebnis ist in
Figur 1 gezeigt. Von den eingesetzten Fragmenten des geklonten
λMED-2 wurden 5292 Basensequenzen bestimmt, diese sind in Figur
1 gezeigt. Die CAAT-Box, die TATA-Box und das Poly A-Signal
wurden mit kleinen Boxen umgeben, und die Regionen, die die
Proteine in mRNA von Medullasin codieren, wurden ebenfalls mit
Quadraten umgeben. Sich wiederholende Sequenzen, die im oberen
Strom des Promotors und im dritten Intron existieren, wurden
mit mit einem Pfeil markierten Unterstreichungen
gekennzeichnet. Es ist jedoch möglich, daß die Position des 5'-Terminus
von mRNA um einige Basen von der tatsächlichen Position
verschieden sein kann.
Beispiel 11
-
ML3 Zellen, normale diploide Fibroblasten, die von der fötalen
Lunge des Menschen stammen, und MIAPaCa-2-Zellen wurden in 5%
Kohlendioxidgas bei 32ºC im RPMI1640-Medium, das fötales
Kälberserum
(ML3) enthielt, Eagles MEM-Medium, das fötales
Kälberserum enthielt (normale diploide Fibroblasten, die von der
fötalen Lunge des Menschen stammen), oder Dalbeccos MEM-Medium
gezüchtet, das 10% fötales Kälberserum bzw. 2,5% Pferdeserum
(MIAPaCa-2-Zellen) enthielt. 16 ml einer Lösung, die 6m
Guanidinthiocyanat, 2% Sarcosil, 50mM (U.C.) Trischlorid (pH = 7,6),
10mM EDTA, 10% β-Mercaptoethanol enthielt, wurden in 2 bis 5 x
10&sup6; Zellen gegeben, und die erhaltene viskose Lösung wurde 5mal
durch eine Injektionsnadel mit 19G gedrückt. Dieses
Zellhomogenat wurde auf 18 ml einer 5,7m Lösung von Seciumchlorid
(secium chloride) gegeben, die 100mM EDTA enthielt, und über
Nacht bei 25ºC bei 35000 U/min zentrifugiert. Die RNA, die am
Boden des Zentrifugenrohrs gefällt wurde, wurde in einer
Pufferlösung gelöst und mit Phenol behandelt. Danach wurde die
gesamte RNA durch Fällung mit Ethanol erhalten. Dieses Verfahren
erfolgte nach dem Verfahren, das auf Seite 196 des Buchs A
beschrieben ist. Die Menge der gesamten so erhaltenen RNA betrug
200-600 ug. Die gesamte RNA wurde in einer Oligo-(dT)-Säule
nach dem Verfahren behandelt, das auf Seiten 192-198 des Buchs
A beschrieben ist, wodurch Poly(A)&spplus;RNA erhalten wurde. Jeweils
10 ug dieser Poly(A)&spplus;RNA wurden mit Formaldehyd-Agarose-Gel-
Elektrophorese fraktioniert und dann auf einen
Nitrocellulosefilter gegeben. Diese Verfahren erfolgten nach dem Verfahren,
das auf Seiten 202-203 des Buches A beschrieben ist.
-
Der so erhaltene Nitrocellulosefilter wurde durch
Northern-Hybridisierung analysiert, diese erfolgte entsprechend der
Southern-Hybridisierung, die auf Seiten 387-389 dieses Buchs
beschrieben ist. Als Sonde wurde cDNA von Serin-Protease
(Medullasin) verwendet, die in der Literatur K. Okano et al.,
J. Biochem. 102, S.13-16 (1987) beschrieben ist, die durch
Translation mit [α³²P] dCTP markiert ist (auf Seite 109-112
des Buchs A beschrieben) und deren spezifische Aktivität etwa 1
x 10&sup8; cpm/ug betrug. Die Konzentration der Sonde betrug 2 x 10&sup6;
cpm/ml, und die Hybridisierung erfolgte bei Bedingungen von 50%
Formamid bei 42ºC. Durch Belichtung mit dem Film XAR-5 von
Kodak über Nacht bei -70ºC in Gegenwart eines
Verstärkungsfilters wurde eine klare Bande auf der Position der Basenlänge von
etwa 1000 auf der Bahn der RNA aus den ML3-Zellen beobachtet.
-
Es wurde jedoch keine nachweisbare Bande auf den Bahnen
beobachtet, bei denen RNA, die von anderen Zellen erhalten wurde,
einer Elektrophorese unterzogen worden war.
Industrielle Anwendungsmöglichkeit
-
Die erfindungsgemäße Serin-Protease ist Mitbegründer einer
Entzündung, und es ist deshalb wichtig, ein entzündungshemmendes
Medikament zu entwickeln. Außerdem zeigt sie die Aktivität, daß
die Funktionen von Lymphocyten, Monocyten, der NK-Zelle und
Granulocyten geändert werden, und deshalb ist sie auf dem
Gebiet der medizinischen Behandlung sehr vorteilhaft.
-
Die erfindungsgemäße Serin-Protease kann außerdem bei der
medizinischen Versorgung vorteilhaft sein. Da die erfindungsgemäße
Serin-Protease eine die Thromben auf lösende Wirkung hat, kann
sie außerdem als Thromben lösendes Mittel für DIC (verbreitete
intravaskuläre Koagulation) verwendet werden. Papain, das eine
von der Pflanze stammende Protease ist, konnte früher in
einigen Fällen für die medizinische Behandlung von DIC verwendet
werden, seine möglicherweise auftretenden gefährlichen
Nebenwirkungen sind jedoch bedenklich, da die Wirkung zu stark ist
und durch die antigene Potenz eine allergische Reaktion
hervorgerufen wird. In diesem Zusammenhang ist es ein Vorteil, daß
die erfindungsgemäße Serin-Protease sicher verwendet werden
kann, da sie ein Enzym ist, das vom Menschen stammt. Als
weiteres Anwendungsbeispiel für die medizinische Versorgung ist es
außerdem bei der medizinischen Behandlung äußerer Verletzungen
möglich, Serin-Protease als ein Medikament für die äußere
Anwendung zu verwenden, damit granulomaartige erhöhte Gewebe oder
alte Hautgewebe entfernt und modifiziert werden. In diesem Fall
kann die erfindungsgemäße Serin-Protease sicher verwendet
werden, da sie vom Menschen stammt.
-
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz der die Transkription
kontrollierenden Region, die für die zellspezifische Gen-Expression
notwendig ist, ist außerdem vorteilhaft, damit insbesondere die
Expression eines Fremdgens auf einer Leukocyten- oder einer
Erythroblasten-Zelle erfolgt - vor allem davon stammende
gezüchtete Zellstämme.