HU207533B

HU207533B - Process for clowning superoxide dismutase, expressing them in microorganisma and improving enzyme-yeald of microorganismus cultures

Info

Publication number: HU207533B
Application number: HU844138A
Authority: HU
Inventors: Robert A Hallewell; Guy T Mullenbach
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1983-10-03
Filing date: 1984-09-28
Publication date: 1993-04-28
Also published as: JP2635500B2; EP0656418B1; DE3485284D1; IE59518B1; DE3486452D1; EP0138111B1; EP0138111A1; JPS60137286A; CA1296272C; JPH06165674A; ES8607388A1; HUT37458A; DE3486452T2; JPH07298884A; JPH05192140A; JP2664123B2; WO1985001503A1; JP2568794B2; DE3486493D1; IL73156A

Description

A találmány tárgya eljárás szuperoxid diszmutáz klónozására és mikroorganizmusokban történő kifejezésére és acetilezett polipeptid előállítására.

A szuperoxid diszmutáz („SÓD”) valójában különböző enzimek sokaságát jelenti, melyek a legtöbb élő szervezetben megtalálhatók. Az emlősökben egyik funkciója az, hogy elbontja a szuperoxidot. Ez az anyag természetes úton keletkezik a fagocitózis folyamán. A szuperoxid diszmutáz családok jellemzése azon alapszik, hogy milyen fém kapcsolódik az enzimhez. A fém lehet vas, mangán, réz és réz-cink. Például a marhamáj eredetű szuperoxid diszmutáz klinikai felhasználásra kerül, mivel emlősöknél - beleértve az embereket is - mint gyulladásgátló szer alkalmazható. Egyéb haszna a következőkben van: - eltávolítja a szuperoxid anionokat, amelyek akkor keletkeznek, amikor egy gazdaszervezet ki van téve különböző szuperoxid-indukáló hatásoknak, pl. sugárzásnak, paraquat (gyomirtószer) mérgezésnek, stb.; - bizonyos degeneratív betegségek, ilyen pl. az emfizéma (emphysema), kezelése és megelőzése; - élelmiszer-tartósítás; és hasonló területek.

Fentiek alapján fontos, hogy fiziológiai szempontból elfogadható szuperoxid diszmutázból állandó ellátást biztosítsunk, különösen in vivő felhasználás céljára, gyulladásgátlószerként, vagy más terápiás célokra. Humán alkalmazás a homológ enzim használata lenne a legkedvezőbb, a lehetséges immunválasz minimumra való csökkentése érdekében. A rekombináns DNS technológia alkalmazásával lehetőség van arra, hogy olyan hatékony terméket állítsunk elő, amely a szuperoxid diszmutáz kívánt biológiai aktivitásával, azaz immunológiai és enzimatikus aktivitásával rendelkezik.

A humán vörösvérsejt Cu-Zn szuperoxid diszmutáz aminosav szekvenciáját Jabusch és munkatársai [Biochemistry, 19., 2310--2316. (1980)], valamint Bárrá és munkatársai [FEBS Letters, 720, 53-55. (1980)] közölték, A marha Cu-Zn SÓD leírása Steinman és munkatársai [J. Bioi. Chem. 249, 7326-7338. (1974)] közleményében található. Egy SOD-1 cDNS klőnról Lieinan-Hlirwitz és munkatársai [Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 79, 2808-2811. (1982)] tudósítanak, melynek során humán szuperoxid-diszmutáz cDNS-t klónoznak, és alkalmaznak próbaként különböző humán és egér sejtek által kódolt mRNS-nél. A cikk a Down-szindróma molekuláris mechanizmusát tárgyalja, és nem tesz említést élesztőben történő SOD-temie lésről, ezenkívül az általuk alkalmazott baktériumok nem fejezték ki a klónozott DNS-t és a szuperoxid-diszmutáz polipeptidet sem termelték. Hogy az iniciációs kodon feletti (upstream) transzlatálatlan régió változtatása milyen hatással van a transzláció hatékonyságára, erről a következő közlemények tájékoztatnak: Gheysen és munkatársai, Gene, 77, 55-63. (1982); Thummel és munkatársai, J. Virol. 37, 683-697. (1981); Matteucci és Heyneker, Nucl. Acids Rés., //, 3113-3121. (1983). A J. Bacteriol. 1983, 155(3), 1078-87. cikke E. coli mangán szuperoxid diszmutáz klónozását és genetikai térképét ismerteti. Ez a gén a találmány szerinti réz/cink szuperoxid diszmutáztól lényegesen eltérő szerkezetű proteint kódol. A 131 843 számú európai nyilvánosságrahozatali irat szarvasmarha és humán növekedési hormont kifejező specifikus vektorokat ismertet. Megemlíti ugyan, hogy ezen vektorok számos protein, köztük szuperoxid diszmutáz kifejezésére is alkalmasak, azonban csak a bGH-t és hGH-t kódoló gén klónozását ismertetik, a szuperoxid diszmutáz klónozását és kifejezését nem.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.

Az 1. ábrán a DNS linker szekvenciákat mutatjuk be felhasználásuk folyamat-diagramjával; a 2. és 3. ábra folyamat-diagramjai a plot5/SOD előállítását ábrázolják; a 4. ábrán a humán SÓD cDNS kódoló szála (5’—>3’) és a képződött transzlációs terméknek a szekvenciája látható.

Az 5. ábrán az alább következő leírás szerint izolált humán SOD-gén szekvenciáját mutatjuk be.

A 6. ábrán az alábbi leírás szerint izolált humán SOD-gén restrikciós térképét ábrázoljuk.

A találmány olyan módszerekre és anyagokra vonatkozik, amelyek felhasználása lehetővé teszi humán CuZn szuperoxid diszmutáz („hSOD”) biológiai aktivitásával rendelkező polipeptidek hatékony expresszióját. Az eljárás folyamán egy olyan DNS szekvenciát („hSODgén”) alkalmazunk, amely a hSOD aminosav szekvenciájának lényeges részét kódolja és össze van kapcsolva egy transzlációt indító régióval. Ez a régió optimalizálja az expressziós gazdasejtben történő kifejeződést. A hSOD gént, gazdasejtben történő kifejeződése érdekében, megfelelő vektorba építjük be olyan alkalmas körülmények mellett, amelyek oly módon biztosítják a szekretálődást, hogy a SÓD terméket az extracelluláris közegből kinyerhessük.

A találmány ezenkívül olyan módszerekre és anyagokra is vonatkozik, amelyek segítségével a hSOD polipeptidek N-terminális acetilezése elvégezhető. Itt az acelilezés a polipeptidek és proteinek amino-terminálásához történő addíciót jelent, ellentétben azzal, amikor az aminosav oldalláncokat - például a lizint módosítjuk, ami a természetben is megfigyelhető. A polipeptidek és proteinek acetilezése számos különböző ok miatt hasznos. Amikor a polipeptid természetes körülmények között acetileződik - ez történik a citoplazma eredetű hSOD-dal - akkor azok az expressziós módszerek, amelyek magukba foglalják az acetileződést, fogják a kívánt természetes struktúrával és konformációval rendelkező terméket eredményezni. Ahol a termék gyógyszerként és/vagy in vitro vagy in vivő diagnosztikumként keiül alkalmazásra, az acetilezett anyagnak minimális lesz, vagy megszűnik immunogén hatása gazdaszervezetnek történő beadása és/vagy biológiai anyagokkal való kapcsolata esetén. Ezenkívül az acetilezett polipeptidek valószínűleg sokkal stabilabbak és rezisztensebbek a proteázok lebontó hatásával szemben, és ezért tovább megmaradnak a sejtben, vérben és a test- és szövetnedvekben.

A hSOD polipeptid strukturális génje -5’ végén egy acetilációs szignál szekvenciát tartalmaz, s ez a szignál szekvencia készteti az expressziós élesztő gazdasejtet az acetilezésre. Az acetilációs szignál szekven1

HU 207 533 Β cia a polipeptidben lévő első két N-terminális aminosavat is kódolja. Az első aminosav alanin vagy glicin lesz, míg a második aminosav poláris aminosav, rendszerint treonin, szerin vagy aszparaginsav.

Az aminosavak olyan N-terminális aminosavak lehetnek, amelyek a kifejezendő polipeptidben normál körülmények közt is megvannak. Ez a helyzet a hSOD esetében is, ahol az első két aminosav az alanin, illetve treonin. Egyéb olyan természetben előforduló acetilezett proteinek, amelyek élesztőben kifejeződhetnek és acileződhetnek, a következők:

Protein	Eredet	Szignál szekvencia
Citokróm C	Ember, Rhesus majom, kutya, ló stb.	GLY-ASP
Citokróm C	Castor (hód) Sesamum indicum (szezámfű), Phaseolus aureus (arany paszuly)	ALA-SER
Glutaminsav dehidrogenáz	Neurospóra	SER-ASN
Kalmodulin	Disznó.	SER-ALA
Miozin (A2 könnyű lánc)	-	SER-PHE
ADH	Drosophila	SER-PHE

A jelen találmány szerinti eljárást, a természetben nem acetilezett formában előforduló polipeptidek és proteinek acetilezésére is fel lehet használni. Az acetilezést el lehet érni úgy, hogy az acetilációs szignál szekvenciát a polipeptid strukturális génjének 5’ végéhez kapcsoljuk. Az acetilációs szignál szekvencia legalább két aminosavat határoz meg (lásd fent) és többet is kódolhat, tízet, vagy ennél többet, de előnyösen ötnél kevesebb aminosavat. Kevesebb aminosav hozzáadása rendszerint kedvezőbb, ha polipeptid kívánt aktivitásával való interferenciát vagy az aktivitás elvesztését korlátozni, illetve elkerülni akarjuk. A szignál szekvenciát alkalmas módon szintetizáljuk és hozzákapcsolhatjuk a struktruális génhez jól ismert módszerekkel.

Más módon is hozzáadhatjuk az acetilációs szignál szekvenciát a strukturális génhez, ugyanis a strukturális gén 5’-végét néha úgy is lehet módosítani, hogy a polipeptid első két aminosava közül az egyiket, vagy mindkettőt szubsztituáljuk. Az ilyen módosítást különböző konvencionális módszerekkel hajthatjuk végre. Például: a strukturális gént 5’ vége közelében elhasítjuk, hogy a meghatározott számú nukleotidot eltávolítsunk. Ezután egy szintetikus oligonukleotidot kapcsolhatunk a hasítás után visszamaradt kohéziós véghez. Az oligonukleotid helyreállítja és helyettesíti azokat a bázispárokat, amelyek szükségesek a kívánt acetilációs szignál szekvencia előállításához. Ezenkívül például az Ml 3 fágot használhatjuk arra - hely specifikus mutagenezist alkalmazva -, hogy a strukturális gén 5’-végét megfelelően módosítsuk.

A hSOD előállításához szükségünk van egy olyan DNS szekvenciára, amely hSOD-t határoz meg. Egy ilyen szekvenciához való jutás egyik módja az, ha hSOD termelő sejtek mRNS-éből származó cDNS-t klónozunk. Alkalmas módon, humánmájsejteket használhatunk erre a célra. Miután a cDNS-t klónoztuk, amikor is a DNS kódoló szekvencia egy része ismert, kiszűrhetjük a cDNS-t olyan próbaanyagok segítségével, amelyek az aminosav csoportok speciális sorát kódoló nukleotidok összes lehetséges változatát tartalmazzák. A szekvencia által kódolt csoportoknak a megválasztása bizonyos fokig önkényes, bár a kiválasztott csoportokat rendszerint úgy kell szelektálni, hogy ezzel minimalizáljuk a szintetizálandó különböző szekvenciák számát.

Ami a hSOD-t illeti, előnyösen legalább a 19-24 aminosav csoportot kódoló DNS szekvenciát használhatjuk, de különösen egy olyan próba-anyagot, mely legalább körülbelül 15 bázisból, de nem több mint 20 bázisból áll, legelőnyösebben mintegy 17 bázisból. Ezután restrikciós enzimmel a kiónokat emésztjük, amelyek a jelzett próba-anyagokkal hibridizálnak, majd a DNS fragmentumokat frakcionáljuk. A hibridizálást megismételjük, előnyösen egy második olyan próbaanyag sorozat használatával, amelyek a hSOD-ban lévő különböző aminosav sorokat kódoló DNS szekvenciával hibridizálnak. Ezek előnyösen a 109-114 aminosav csoportok. Egy vagy több olyan kiónt használhatunk, amelyek mindkét próbaanyaggal pozitívnek bizonyulnak, és ezeket használhatjuk fel a hSOD legalábbis egy lényeges részét kódoló cDNS forrásként.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a hSOD-ra közölt aminosav szekvenciák a csoportok szignifikáns számában különböztek a cDNS által meghatározott aminosav szekvenciától. Ahol a két közölt szekvencia [Jabusch és munkatársai, Biochemistry, 19, 2310-2316 (1980) és Bárrá és munkatársai, FEBS Letters, 120, 153-156 (1980)] különbözött, azokat pontos jelöléssel a következőképpen soroljuk fel: 11. csoport, aszparaginsav; 17. csoport, izoleucin; 26. csoport, aszparagin; 49. csoport, glutaminsav; 52. csoport, aszparaginsav; 53. csoport, aszparagin; 92. csoport, aszparaginsav; 98. csoport, szerin (lásd a 4. ábrát).

Minthogy a riboszóma kötő hely és a transzlációt iniciáló kodon - rendszerint AUG - közti távolságnak a transzlációra való hatása bizonytalan, jelen eljárás egy olyan módszert ismertet, amellyel változtatni lehet ezt a távolságot és azokat a nukleotidokat, amelyek a riboszóma kötő helyet az iniciációs kodontól elválasztják. A riboszóma kötő hely és az iniciációs kodon közti üres régióban (spacer) rendszerint 6-15, leggyakrabban 6-12 nukleotid van. Mivel az iniciáció helyétől lefelé (downstream) eső bázis szekvencia szintén befolyásolhatja a transzláció hatékonyságát, jelen találmány szerinti eljárás módszert ad arra is, hogyan variáljuk a nukleotid szekvenciát (de nem a hosszát) a polipeptid kezdeti néhány 5’-kodonján belül, amennyire ezt a genetikai kód degenerációs lehetőségei megengedik. Ez a variációs lehetőség az iniciáció helyétől lefelé (downstream) 4 kodonig terjedhet, de rendszerint 2 kodonig.

HU 207 533 Β

Számos linkért állítunk elő legalább 2 nukleotiddal, rendszerint legalább 3 nukleotiddal, de nem többel, mint 10 nukleotid, általában nem többel, mint 6 nukleotid. Ha a spaceren belül változtatunk, a 4 nukleotidosokat használjuk, hogy ha a polipeptid strukturális génjén belül, akkor a 2, 3 vagy 4 nukleotidos linkereket használjuk, amennyire ezt a genetikai kódredundancia megengedi. Ezenkívül olyan - különböző számú nukleotidot tartalmazó - linkereket is előállítunk, amelyek nemcsak szekvenciájukban, hanem hosszúságukban is különböznek. A hosszúságbeli különbözőséget úgy lehet eléírni, hogy a Iinker szintézise folyamán a hordozó egy részét eltávolítjuk, és ha szükséges, a szintézist a következő lépésnél folytatjuk úgy, hogy különböző hosszúságú linkereket kapjunk. A keverékben a linkerek hossza általában legalább egy nukleotidos, s rendszerint 4 nukleotidnál többet nem tartalmaznak.

Ez ott ábrázolható egyszerűbben, ahol a terminális bázisok hiányoznak. Minden lépés után a hordozó egy részét eltávolítjuk, és a szintézist azokkal a fonalakkal folytatjuk, amelyek, amelyek a hordozóhoz vannak kapcsolva, s minden lépésben mind a négy nukleotidról (dNTP = dezoxi-ribonukleozid-trifoszfát) gondoskodunk. Ezeket a szimpla szálakat ezután egy olyan szimpla szállal hibridizáljuk, amelynek egy része komplementer ott, ahol a variábilis régió a túllógó szál. Ilyen módon olyan fokozatos Iinker sorozatot kapunk, amelyekben a túllógó szálnak mind a nukleotid szekvenciája, mind hossza különbözik. Az ezt követő hibridizálásí eljárás egy megfelelő pontján, ligáz reakcióval, vagy klónozással betöltjük a túllógó régió(ka)t, miáltal olyan kétszálú anyagot kapunk, amelyet a további manipulációba bevonhatunk. Ezt rendszerint és előnyösen in vitro végezzük, például a DNS polimeráz I Klenow fragmentjének segítségével; más esetekben, bizonyos szerkezetek esetén, a túllógó régiót szimpla szálként klónozuk, és ennek betöltése in vivő, a transzformáit vagy transzficiált gazdasejtben megy végbe. Egy komplementer szálhoz való hibridizálás kivitelezése úgy történhet, hogy a variábilis nukleotid sortól felfelé (upstream) egy 5’ szekvenciával rendelkezünk, s ez azzal a terminális szekvenciában lévő szekvenciával komplementer, amelyhez a linkért kell kapcsolni. A hiányzó bázisok helyét ezután in vitro vagy in vivő be lehet tölteni.

A linkerek szekvenciája magába foglalhatja a riboszóma kötő hely és az iniciációs kodon közti régiónak legalább egy részét, előnyösen azokat a nukleotidokat, amelyek az iniciációs kodon közelében vannak; a linkéi’ ugyancsak tartalmazhatja az iniciációs kodont és a strukturális gén egy részét, a riboszóma kötő helyet és a riboszóma kötő helytől felfelé eső bázisokat, amelyek vagy tartalmazhatják a transzkripciót szabályozó szekvenciát, vagy nem.

A Iinker rendszerint legalább 50 bázisból áll, még inkább legalább körülbelül 20 bázisból, és általában nem haladja meg a körülbelül 200 bázist, rendszerint azonban a 100 bázist. Amikor a Iinker nagyobb, mint 35 bázisú, akkor olyan 10-35 bázisból álló egyszálú, szekvenciákkal szereljük őket össze, amelyek egy komplementer szálnak csak egy részével homológok, így túllógó szállal bíró komplementer, egymást fedő szekvenciákhoz jutunk, s ezáltal a különböző szimpla szálakat hibridizálhatjuk és összekapcsolhatjuk. A hiányos és/vagy különböző hosszúságú túllógó részeket betölthetjük olyan módon, ahogy fent leírtuk, s ezzel a kívánt ragadós (cohesive) és/vagy tompa végű (bluritended) linkért előállítottuk.

Amikor a strukturális génben megfelelő restrikciós hely van, rendszerint az iniciációs kodontól lefelé nem több mint 50 bázissal, lehasíthatunk egy olyan fragmentumot, amely a strukturális gént tartalmazza, s ezt összekapcsolhatjuk a Iinker egy komplementer kohéziós végével, vagy betölthetjük, hogy egy tompa véget kapjunk, és ezt a tompa véget ligáz reakcióval a Iinker tompa végével kapcsolhatjuk össze. A linkért úgy szerkeszthetjük meg, hogy biztosítsa a strukturális gén teljességét, és hogy az iniciációs kodonnal leolvasási sorrendben legyen.

Ahogy jeleztük, a Iinker előállításánál egy sor olyan Iinker keletkezik, amelyek a nukleotidok random-sorozatát tartalmazzák, azaz a kódoló szálban a négy lehetséges nukleotid mindegyikét (alávetve a genetikai kód megszorító kikötéseinek, ahogy ezt fent jeleztük), s amelyek különböző nagyságúak, hiányozván belőlük egy vagy több olyan nukleotid, amelyek az intermedier régiót határozzák meg, vagy áthidalják a riboszóma kötő helyet és az iniciációs kodont. Ezeket a szimpla szálból előállított linkereket hozzá lehet kapcsolni más szimpla vagy dupla DNS szálakhoz nagyobb terjedelmű linkerek előállítása céljából, amelyek már nemcsak a riboszóma kötő helyet, hanem a riboszóma kötő helytől felfelé lévő bázisokat is magukba foglalhatják. Azonban a linkerek viszonylag olyan kicsik is lehetnek, hogy a riboszóma kötő helyen belül, vagy ennek közelében kezdődnek, és az iniciációs kodontól egy lefelé eső helyig vagy a strukturális gén egy belső helyéig terjednek.

Bár a találmány szerinti szerkezetek előállítása érdekében a különbözhő fragmentumok összekapcsolásának a speciális sorrendje rendszerint nem meghatározó jellegű, mégis előnyös, ha először a strukturális gént kapcsoljuk a linkerhez. Ez a DNS szerkezei nemcsak a strukturális gént fogja tartalmazni, hanem a riboszóma kötő helyet is, és minden olyan további nukleotidot, amelyek a riboszóma kötő helytől felfelé helyezkednek el. Ezenkívül a nukleotidok és a nukleotidok száma igen változó lesz a riboszóma kötő hely és az iniciációs kodon között. A találmány tárgyát képező DNS szerkezetet beépítjük egy megfelelő expressziós vektorba, amely a szóban forgó DNS szerkezet beépítésének helyétől felfelé a szükséges transzkripciót indító szabályozó szekvenciával, valamint a beépítés helyétől lefelé a transzkripciót leállító szabályozó szekvenciával rendelkezik. így a Iinker a transzkripciót indító szabályozó szignál szekvenciával együtt az 5’-véget fogja határolni és a 3’-véget a kódoló régió legalább egy részével és a transzkripciót és transzlációt leállító szekvenciákkal együtt. (Az 5’- és 3’- a transzkripció irányára utal.)

HU 207 533 Β

Plázmidot vagy vírus DNS-t készítünk elő egy megfelelő gazdasejtbe történő bejuttatáshoz (ez rendszerint együtt történik a különböző túllógó régiók betöltését szolgáló manipulációkkal, annak egy megfelelő fázisában), majd a gazdasejtet transzformáljuk, illetve transzficiáljuk, klónozzuk, a kiónokat szélesztjük és egyedi kiónokat válogatunk a hatékony kifejeződés elérésére annak alapján, hogy megvizsgáljuk, vajon termeli-e a kívánt terméket, például a hSOD-t. A termék különböző előállítási szintjének meghatározása érdekében szűrendő kiónok száma attól függ, hogy a szintetikus linker hossza milyen mértékben változatos és hogy milyen változtatásokat építettünk a szekvenciájába. A szűrendő kiónok száma fenti tényezőkkel arányos. Ahogy a találmány ezen megvalósítási módja példázza, a 4 különböző hosszúságú linker mind a 6 nukleotidjában lévő négyszeres szekvencia változat következtében a lehetséges rekombináns szekvenciák száma 5440. Általában legalább néhány száz, előnyösen néhány ezer vagy ennél több kiónt szűrünk. A szűrővizsgálatot eredményesen a Western szűrőpapír módszerrel (a termék antitest termelésének vizsgálata) végezzük úgy, hogy a gazdasejt telepeket vagy vírusplakkokat nitrocellulóz szűrőkre, vagy más megfelelő anyagra visszük fel. Vagy elektroforézist végzünk, és a sávok többségénél - minden sáv egy individuális kiónnak felel meg - azonnali és közvetlen összehasonlítást tehetünk arra nézve, hogy melyik kiónnál a leghatékonyabb az expresszió, mivel a termék sávjának festődési intenzitásából, vagy autoradiográfiás vizsgálattal, vagy a Western-féle szűrőpapír módszerrel ez megállapítható. Ez a szűrővizsgálat rendszerint elegendő, bár több quantitatív immun-assayt vagy enzim-assayt is alkalmazhatunk, ahol ezek helyénvalók.

Ha kívánt, a szerkezetet átvihetjük egy másik olyan gazdasejtbe, amely az expressziós szerkezetet szabályozó szignáljait felismeri; vagy megváltoztatjuk az expressziós szerkezetet úgy, hogy megfelelő helyeire bevisszük a szükséges szabályozó szignálokat, s ezáltal egy másik gazdasejtben lehetővé tesszük a hatékony kifejeződését.

Ha kívánt, a hSOD gént hozzákapcsolhatjuk szekréciós vezér és processzor szignálokhoz, hogy biztosítsuk a hSOD szekretálódását és termelési folyamatát. Különböző szekréciós vezér és processzor szignálokat ír le a szakirodalom. Lásd például a 4336336, és a 4338 397 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat, valamint a tárggyal összefüggő 522909 (benyújtva 1983. augusztus 12-én) és 488857 (benyújtva 1983. április 26án) sorszámú szabadalmi bejelentéseket, amelyek jelentős része itt referenciaként szerepel.

Különösen előnyös gazdasejtek az egysejtű mikroorganizmus gazdák, úgy a prokarióta, valamint az eukarióta sejtek, ilyenek a baktériumok, algák, gombák stb. Különösen az E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Streptomyces és Neurospora szolgálhatnak gazdasejtek gyanánt.

Egysejtű mikroorganizmusokban történő alkalmazásra a vektorok széles változata áll rendelkezésre. A vektorok plazmidokból és vírusokból származtathatók. A vektorok lehetnek egymásolatú, vagy többmásolatú (kevés, vagy nagyszámú másolattal) vektorok. A vektorok klónozásra és/vagy kifejezésre használhatók. Mivel a vektorokra vonatkozó szakirodalom igen bőséges, sok vektor a kereskedelemből is beszerezhető, a kézikönyvek is foglalkoznak a vektorok leírásával, restrikciós térképeikkel és jellemzőikkel, kimerítő tárgyalásukat itt nem tartjuk szükségesnek. Jól ismert, hogy'a vektorok rendesen markereket tartalmaznak, amelyek a citotoxikus anyagokkal szembeni rezisztenciára, valamint prototrófiára, vagy immunológiai tulajdonságra utalnak, s ezek lehetővé teszik a szelekciójukat. Gyakran több marker van jelen, különböző jellemzőkkel.

A merkereken kívül a vektorok replikációs rendszerrel kell rendelkezzenek és expressziós vektorok esetén rendszerint a transzkripciót szabályozó és leállító szignálokat is tartalmazniuk kell, ilyenek a promoterek, amelyek egyszeres és többszörös tandem promoterek lehetnek. Tartalmazniuk kell továbbá egy mRNS capping szekcvenciát, egy TATA boxot, serkentőket, terminátort, poliadenilációs szekvenciát és a terminátorhoz társulva egy vagy több stop kodont. A transzlációhoz gyakran alkalmaznak riboszóma kötő helyet és egy vagy több stop kodont, bár a stop kodonok rendszerint a strukturális génhez kapcsolódnak. Más esetben, ezek a szabályozó szekvenciák jelen lehetnek a struktruális gént tartalmazó egy fragmentumban, amelyet a vektorba beépítünk.

A vektorban rendszerint egy vagy több restrikciós hely van, a strukturális génnek az expressziós vektorba való beépítése szempontjából alkalmas helyzetben. Mihelyt a beépítés megtörtént, a strukturális gént tartalmazó vektort megfelelő gazdasejtbe vezethetjük be, és a klónozott gazda a hSOD hatékony kifejeződését fogja lehetővé tenni.

Bizonyos esetekben a vektorok speciális tulajdonságokkal vannak felruházva, ilyen az expresszió hőérzékenysége, a transzkripciót szabályozó operátorok és aktivátorok és ehhez hasonlók. Különösen előnyös lehet, ha a transzkripció szabályozása külső behatásra történik, ilyen a hőmérséklet, induktorok, korepresszorok, stb., és amikor a transzkripciót gyorsítani vagy gátolni lehet oxigén - rendszerint szerves - vegyülettel.

Olyankor, amikor a hSOD intracellulárisan képződik, akkor ha a sejttenyészet nagy sűrűséget ér el, a sejtek alkalmas módon - centrifugálással különíthetők el. A sejteket ezután lizáljuk, és a hSOD-t különböző módszerekkel izolálhatjuk, például extrahálással, affinitás kromatográfiával, elektroforézissel, dialízissel, vagy ezek kombinációival. Az esetben, amikor a termék szekretálódik a táptalajba, hasonló módszereket alkalmazhatunk, de a kívánt termék a tápoldat össz-proteinjében lényegesen nagyobb arányban lesz jelen, mint a sejtlizátumban, A képződött hSOD-nak alapjában véve ugyanaz lesz az aminosav szekvenciája, mint a természetben előforduló szuperoxid-diszmutáznak, mégis általában 5-nél kevesebb aminosavban, de rendszerint 2-nél kevesebb aminosavban különöznek egymástól. A rekombináns hSOD („r-hSOD”)· alapvetően ugyanazokkal a biológiai tulajdonságokkal rendelkezik, mint a természetben előforduló hSOD. A biológiai tulajdonságok közé tartoznak az im5

HU 207 533 Β munológiai tulajdonságok; az autentikus hSOD-al szembeni antitestek keresztreakcióba lépnek az r-hSOD-al. Ezenkívül a hSOD meghatározására alkalmazott szokásos bioassayk-ben az rhSOD az autentikus hSOD enzim aktivitásával összehasonlításban, ezen aktivitás lényeges hányadának megfelelő' (legalább 10%-ának, előnyösen legalább 50%-ának, még előnyösebben legalább kb. 80%-ának) aktivitást fejt ki, a protein tömegét véve alapul. Markiund és Markiund [Eur. J. Biochem., 47, 469474. (1974)] egy ilyen meghatározási módszert írtak le. A találmány szerinti eljárás megvalósításának módját a következő példákkal szemléltetjük anélkül, hogy a találmány oltalmi körét a példákra korlátoznánk.

A példákban ismertetett klónozási technikák általánosan ismertek és alkalmazottak. A restrikciós enzimekkel végzett emésztéseket az enzimgyártó instrukciói és/vagy Maniatis és munkatársai; Molecular Cloning: Cold Spring Harbor 1982 (a továbbiakban: Maniatis) utasításai szerint végeztük. A fragmensek tisztítását preparatív agaróz vagy poliakril-amid gél-elektroforézissel végeztük (Maniatis, 173-178.). Az izolált fragmensek ligálása kereskedelmi ligázokkal (New England Biolabs), a gyártó instrukciói alapján történt. Ligálás előtt a fragmensek 5’végeit T4 polinukleotid-kinázzal foszforiláltuk (Maniatis, 123. old.), DNS polimeráz I Klenow-fragmensssel tompa végűvé alakítottuk (Maniatis, 114. old.), vagy al5 kalikus foszfatázzal kezeltük az 5’-foszfát lehasítására (Maniatis, 134. old.).

/. példa

A hSOD cDNS molekuláris klónozása

Felnőtt ember májából ossz RNS-t izolálunk guanidínium-tiocianát/lítium-klorid módszerrel [Cathala és munkatársai, DNA, 2,329-335 (1983)]. A poliA RNS-t használjuk fel a kétszálú cDNS szintetizálására (Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring

Harbor, 1982, p. 213-242), s ezt Sepharose CL4B oszlopon engedjük át, hogy az anyagot a 350 bp-nál (bp = bázispár) hosszabb láncú cDNS-ekben feldúsítsuk [Fiddes és Doodman, Nature, 281, 351-356 (1979)]. A cDNS-t a pBR322-ből származó plot4 plaz20 mid PstI helyére építjük be. A plot4-ben a Pstl-EcoRJ helyet a következő szekvencia helyettesíti:

Esti HinfI Alul

GGTGAATCCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC

ACGTCCACTTAGGCATTAGTACCAGTATCGACAAAGGACACACTTTAACAATAGGCGAG

Hphl HindlIAluI

ACAATTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTT

TGTTAAGGTGTGTAATATGCTCGGCTACTAATTAACAGTTGTCGAGTAAAGTCTTATAAA

EcoRI

GCCAGAACCGTTATGATGCGG

CGGTCTTGGCAATACTACGCCTTTAA

A plazmid kereskedelmi forgalomban hozzáférhető, azt saját gyűjteményünkben fenntartjuk.

A cDNS beépítésénél az oligo-dG:dC farkakkal operáló módszert használjuk (Maniatis). A keverékkel E. coli D1210 törzset transzformálunk, és a transzformált sejteket 10 pg/ml tetraciklin tartalmú L-agaron [S. R. Kushner, a Genetic Engineering (1978) 17. oldalán, szerkesztek: Η. B. Boyer és S. Nicosia (Elsevier/North Holland, Amsterdam)] választjuk el. A máj cDNS gyűjteményből való plazmid DNS-t közvetlenül állítjuk elő [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982) 86-94 oldal] úgy, hogy mintegy 62000 rckombináns telepet szélesztünk Petri-csészékre. A sűrűség kb. 3000 telep per 9 cm átmérőjű Petri-csésze.

2. példa r-hSOD klánok izolálása

A D1210 törzset retranszformáljuk máj cDNS gyűjteménnyel és körülbelül 40000 kiónt tenyésztünk 9 db 14 cm átmérőjű Petri-csészében. Miután a telepeket nitrocellulóz lemezekre vittük, és a plazmid DNS-t klőramfenikollal együtt szaporítottuk (Maniatis 313. old.), a sejteket lizáljuk, és a szűrőket hibridizáláshoz készítjük elő [Ish-Horowicz és Bürke, Nucleic Acids Research, 9, 2989-2998 (1981)]. Oligonukleotid próba-anyagokat használunk a hibridizációval történő szűréshez. A próbaanyagok enzim-izotóposán jelzett, kémiai úton szintetizált DNS molekulák, amelyek a protein 19-24 aminosav csoportjait kódoló mRNS-ével komplementerek (Jabusch és munkatársai, lásd fent, Bárrá és munkatársai, lásd fent); a keverék szekvenciája a következő:

3' TTA AAA CTT GTT TTT CT 5'

G G C C C amelyben a peptid szekvencia kódolásához minden említett lehetőség (32-szeres változat) megvan. A próbaanyagokat 1—3xl0⁸ cpm/pg specifikus aktivitású ³²P-vel jelöljük, és felhasználás előtt Millipore szűrőn (0,45 pm) megszűrjük. A szűrőmembránokai 6 órán át 30 °C-on előhibridizáljuk 4xSSC, 2xDenhardt-oldatban, mely még 40 mM nátrium-foszfátot (pH = 7,5) és 300 pg/ml ultrahanggal feltárt lazacsperma DNS-t tartalmaz.

A 20xSSC törzsoldat összetétele: 175,3 g NaCl és 88,2 g nátrium-citrát 800 ml vízben oldva, majd néhány csepp 10 n NaOH-oldattal pH = 7 értékre történő állítás után vízzel 1 1-re töltve.

Az 50xDenhardt-lörzsoldat összetétele: 5 g Ficoll, 5 g polivinilpirrolidon és 5 g BSA (Peutax 5. frakció), 500 ml vízzel elegyítve.

A törzsoldatokból vízzel hígítva nyerjük a fenti oldatokat.

A hibridizálást ugyanebben az oldatban 20 órán át 30 °C-on végezzük 2xl0⁶ cpm/ml aktivitású hSOD DNS próbaanyaggal (19-24 csoport). A szűrőlemezeket 4xSSC oldattal mossuk, először 15 percig szobahö1

HU 207 533 B mérsékleten, és kétszer 15 percig 30 °C-on, majd szárazra itatjuk, és ezután erősítő szűrővel 24 órán át 70 °C-on autoradiográfiát végzünk.

Az eredeti lemezeken levő területeket, amelyek megegyeznek a duplikátum pozitív szignálokkal, felszúrjuk és L-táplevesre visszük, majd a plazmid DNS-t miniscreen módszerrel [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, 178, 368-369 (1982) Cold Spring Harbor] izoláljuk. A kapott DNS-t Pstl-vel hasítjuk, majd a Southemféle szűrőpapír-analízisnek [Southern, J. Mól. Bioi. m 98, 503-517 (1975)] vetjük alá, hogy először az előzőleg jelzett próbaanyagokkal (19-24 aminosav csoport) hibridizáljuk, majd ezután még olyan radioizotóppal jelzett próbaanyagokkal, amelyek a 109-114 aminosav csoportból származnak, és amelyek a következő szekvenciákkal vannak jelen (72-szeres változat) keverék alakban:

3' CTA GTA ACA TAA TAA CC 5'

G G G G G

T T

Egy 520 bp cDNS inszertumot tartalmazó plazmid pool (pSOD 1) mindkét próbaanyaggal hibridizált. A telep megtisztítása után a klónból előállítottuk a plazmid DNS-t (Maniatis, 366-368), és ezt szekvencia analízissel - Maxam és Gilbert módszere szerint [Proc. Nat. Acod. Sci. USA, 74, 560-564 (1977)] - megvizsgáltuk. Az eredményt a 4. ábrán mutatjuk be. A pSODl jelű hSOD cDNS kiónt a hSOD 10-153 aminosavát meghatározó régió, egyetlen transzlációs stop kodon és egy 3’ transzlatálatlan

EcoRI régió alkotja. Ezért az expressziós vektor szerkezetben az 1-9 aminosavat kódoló régió alapszekvenciáját, melyet a hSOD-ra közölt (Jabusch és munkatársai, lásd fent; Bárrá és munkatársai, lásd fent) aminosav szekvenciából származtatunk, kémiai szintézissel állítjuk elő, mintegy a variábilis linker szegmentum (lásd lentebb) részeként.

3. példa

A plot5 plazmid szerkesztése (lásd a 2. és 3. ábrát) A plotl plazmidot, mely egy hibrid trp-lac („tac”) promotert tartalmaz [DeBoer és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80 21-25 (1983)] úgy szerkesztjük, hogy a ptrpLl plazmid [Edman és munkatársai, Natúré, 291,503-506 (1981)] 180 bp HgiA-Taql fragmentumát és a pKB268 plazmid [Bockman és Ptashne, Cell, 13, 65-71 (1978)] 58 bp Hpall-EcoRI fragmentumát gélben izoláljuk, és ezeket a fragmentumokat a Pstl-gyel és EcoRI-gyel emésztett pBR322 plazmidhoz kapcsoljuk. Az így keletkezett plazmidot alkalmazzuk a D1210 törzs transzformálására és a tetraciklin rezisztencia alapján választjuk ki a kiónokat. A plot3 plazmidot úgy szerkesztjük, hogy gélben izoláljuk a tac promotert tartalmazó plotl plazmid 155 bp Fnu4HI-EcoRI fragmentumát - ebben az Fnu4HI helyet DNS polimeráz I Klenow fragmentumával („pol I K” vagy „pol. Klen”) telt végűvé (flushended) változtatjuk - és az alábbi szekvenciájú %AN7-ből származó 18 bp EcoRl-Pstl polilinker fragmentumot:

HindlII

5' AATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGATCTCTAGA

3' GGGCCCCTAGGCAGCTGGACGTCTAGAGATCTTCGA

I I Sáli PstI

Ezeket a fragmentumokat a gélben tisztított EcoRIgyel emésztett pBR322-höz kapcsoljuk, mely végeit előzőleg telítettük pol I K kezeléssel, majd Pstl-gyel emésztettük. Ezt a ligációs elegyet használjuk D1210 törzs transzformálására 10 gg/ml tetraciklin tartalmú L-agar lemezeken szelektálva (Maniatis 250-251 old).

A plot5 plazmidot a következőképpen állítjuk elő: először megszerkesztjük a πΑΝ7 polilinkert - ez egy EcoRI-PvuII szubsztitúció a pBR322-ben - tartalmazó plazmidot. (New England Biolabs) a következőképpen: a πΑΝ7 plazmidot HindlII-mal emésztjük, végeit pol I K (New England Biolabs) segítségével betöltjük, majd önmagával komplementer, PvuII linker molekulát [d(5’-CCAGCTGG-3’)] kapcsolunk a fentiek szerint módosított πΑΝ7 plazmidhoz. ExoRI-gyel és PvuIIvel való emésztés után a kapott 44 bp polilinker fragmentumot (4 túllógó bázissal) gélben izoláljuk és (EcoRl-Pvuü-emésztett pBR322-be klónozzuk, mintegy EcoRI-PvuII szubsztituensként.

A plot3 plazmidot ExoRI-gyel emésztjük és fenolkloroformos extrahálás és etanolos kicsapás után a kiálló 5’ végeket telt-végűvé alakítjuk SÍ nukleázzal való kezelés révén [Palmiter, Biochemistry, 13, 3606-3615 (1974)]; Hallewell és Emtage, Gene, 9,27-47 (1980)]. A fenol-klorofbrmos kezelés és etanolos kicsapás után a DNS-t Clal-gyel emésztjük, pol I K-vel (New England Biolabs) telt végűvé alakítjuk és a tac promotert tartalmazó 237 bp fragmentumot preparatív poliakrilamid gél elektroforézissel izoláljuk. Ezt a telt végű tac promoter fragmentumot építjük be a fent előállított, polilinkert tartalmazó pBR322 plazmid PvuII helyére (lásd a 3. ábrát) és a kapott kiónokban a tac promoter irányítja a transzkripciót a pBR322 β-laktamáz génje irányában.

4. példa r-hSOD-t kifejező plotS származékok szerkesztése Az 1. ábrán bemutatott F(26), C(16), B(31), D(11),

E(13) és 4(24) szintetikus DNS-molekulákat foszforamidit módszerrel szintetizáljuk. A szimpla szálú 4(24)et mind a 4 bázis felhasználásával - azokon a helyeken, melyeket X-szel jelöltünk - készítjük. Ezen felül, a 24mer szintézisénél elvonjuk a kovaföldet (silica), így a 24mer-en kívül szimpla szálú 21mer-ek, 22mer-ek és 23mer-ek keletkeznek. A kovaföld hordozó elvonása után a négy keveréket megfelelő arányban úgy kombináljuk, hogy minden lehetséges egyszálú polimerből ekvimoláris mennyiségeket kapjunk. Ezt a keveréket egyetlen termékként tekintjük a következő lépésekben.

HU 207 533 Β

Az F(26), C(16), B(31) és D(ll) molekulák ekvimoláris mennyiségeiből keveréket készítünk és 10 pgját T4 polinukleotid kinázzal foszforiláljuk. Fenol-éteres extrahálás után nem foszforilált 4(24) és E(13) szintetikus DNS-molekulákat adunk a reakciókeverékhez úgy, hogy minden fragmentumból ekvimoláris mennyiségeket tartalmazzon. Az ekvimoláris keverék 13 pg DNS-t tartalmaz 133 pl 0,3xkináz pufferben. (50 mM trisz-HCl [pH 7,6],10 mM MgCl₂, 5 mM ditiotreitol, 0,1 mM spermidin, 0,1 mM EDTA.)

A szimpla szálakat úgy kötjük egymáshoz, hogy 60 percen át fokozatosan lehűtjük őket 70 °C-ról 20 °C-ra, s az összekapcsolás T4 ligázzal történik 200 pl ligáz-reakciókeverékben (50 mM trisz [pH 7,4], 10 mM MgCl₂, 10 mM ditiotreitol, 1 mM spermidin, 1 mM ATP, 0,1 mg/ml BSA) 14 °C-on 4 óra hoszszat. Ezután fenol-kloroformos extrahálás és etanolos kicsapás következik, majd a 4(24) és E(13) 5’-végeit T4 polinukleotid kinázzal (Maniatis és munkatársai, lásd a fenti közleményt) foszforiláljuk. A teljesen öszszekapcsolódott 53 bp nagyságú anyagot, melynek 5’és 3’-végein túllógó láncok vannak, preparatív poliakrilamid gél elektorforézissal izoláljuk.

A fentiek szerint tisztított fragmentum keveréket ezután a hSOD cDNS 460 bp Taql-PstI szegmentumához kapcsoljuk, ahogy az 1. ábrán bemutatjuk. Magát a szegmentumot úgy állítjuk elő, hogy géllel végzett tisztítással (Maniatis, 174-178. old.) izoláljuk a pSOD1454 bp Taql-Alul fragmentumát, pol I K-val telt végűvé alakítjuk és beépítjük a plot5 plazmidba az EcoRl és Sáli helyek között (lásd a 3. ábrát), ahol a végeket szintén betöltöttük. A rekombináns plazmid DNS-t kipreparáljuk (Maniatis, 366-368. old.), majd a 460 bp Taql-PstI hSOD fragmentumot preparatív poliakril-amid gél elektroforézissel izoláljuk. Extrahálás és precipitálás után a szintetikus fragmentumnak a 460 bp Taql-PstI hSOD fragmentumhoz való csatolása révén keletkezett 515 bp fragmentumot pol I K-val betöltjük (525-528 bp), majd Sall-gyel emésztjük, és a kapott 519-522 bp nagyságú hSOD fragmentumot poliakrilamid gél elektroforézissel izoláljuk. Ezt a fragmentumot ezután beépítjük a plot5-be, melyet előzőleg PvuII-vel és Sall-gyel emésztettünk, majd alkalikus foszfatázzal kezeltünk. A kapott plazmidokat használjuk a D1210 törzs transzformálására. A D1210 törzs transzformálása után kapott rekombináns telepeket 100 pg/ml ampicillin tartalmú L-agaron szelektáljuk, így egy változó SÓD expresszióval rendelkező klón készletet kapunk (jele plot5/SOD).

5. példa r-hSOD kifejeződés és p!ot5!SOD plazmid kiválasztás

Abból a célból, hogy az összes E. coli proteint megvizsgáljuk SDS-poliakril-amid gél elektroforézissel, egynapos tenyészeteket harmincszorosára hígítva I ml L-tápleveshez adunk és rázott tenyésztést végzünk 37 °C-on 90 percig körülbelül OD_6í0 = 0,2 értékig. A tenyészetekhez annyi izopropil-tio-galaktozidot (IPTG-t) adunk, hogy végső koncentrációja 2 mM legyen, és további 3 órán át inkubáljuk. Centrifugálás után a sejtüledéket 50 pl L'aemmli pufferben [Natúré, 227, 680-685 (1970)] reszuszpendáljuk, s a sejt szuszpenziót a következő lépések háromszori ismétlésével lizáljuk: 1 perces fagyasztás, 2 perces forralás, 10 másodperc sejt-homogenizálás.

Elektroforézis után (Laemmli, lásd fenti közleményt) a protein sávokat Coomassie kékkel festjük, és az egyes kiónok által témáéit SÓD mennyiségét megmérjük; Coomassie módszerrel (Bradford, Analyt Biochem (1976) 72 , 248 és Bio-Rad kit); ezeket az eredményeket ezután az autentikus humán SÓD elleni nyúl poliklonális antitestet tartalmazó Western szűrőpapírok használatával ellenőrizzük. Több mint 300 kiónt analizáltunk és a SÓD kifejeződés szintje nulla vagy csekély értéktől az ossz oldható sejt-protein 5-10%-ának megfelelő - becsült - mennyiségig változott. Fenti 300 klónból hat klón eredményeit az I. táblázatban mutatjuk be, a 4(24) DNS-molekula szekvenciájával együtt. A szekvencia analízist Maxam és Gilbert (lásd fenti közleményt) módszerével végeztük.

/. táblázat

E. coliban termelt SÓD szekvenciája és mennyisége

Klón	Szekvencia:	Az Ossz proicin körülbelüli tömegszázalékában
5’-XXXX	ATG	GCX	ACX
pSODxS	AACA		A	G	5%
pSODll	GTAT		T	G	10%
pSODxló	A CAT		A	A	5%
pSOD5	AATC		A	A	10%
pSODló	ATTT		T	T	10%
pSOD18	AACT		A	G	7,5%

6. példa r-hSOD meghatározási módszerek

Az enzimvizsgálalokhoz 100 ml-es tenyészeteket készítünk a fent leírtak szerint.

Szolubilis sejt kivonatokat készítünk oly módon, hogy a sejtüledékeket sejt-homogenizátorban kezeljük (vortexing) 10x20 másodpercig 4 °C-on azonos mennyiségű 0.45-0,5 mm átmérőjű üveggyöngyökkel (Braun AG) és azonos mennyiségű assay-pufferrel [50 mM trisz-kakodilát (pH = 8.2), 1 mM dietilén-triamin-pentaecetsav] 1,5 ml-es mikro-cenlrifuga csőben. A sejttörmeléket mikro-centrifugában (Beckman) ülepítjük úgy, hogy a csöveket 1 percig centrifugáljuk. A felülúszót 1-1 mM cink-szulfát és rész-szulfát tartalmú assay pufferrel szemben dializáljuk 4 órán át 4 °C-on.

A SÓD meghatározásokat pirogallol módszerrel (Markiund és Markiund, lásd az előbbiekben) végezzük. A reakciókeverékekben 0,2 mM pirogallol tartalmú assay puffért használunk, és a reakció lefolyását 5 perces időtartam alatt, Hewlett-Packard 8450 spektrofotométerrel, 420 nm hullámhosszon követjük. Négy különböző vizsgálati mintát készítettünk: szolubilis E. coli extraktu-. mok; autentikus hSOD; mindkét előbbi minta előinkubálva nyálban termelt autentikus hSOD ellenanyaggal.

HU 207 533 Β

Minden vizsgálati mintát küvettában inkubáltunk 1 percig 25 °C-on, mielőtt a pirogallolt hozzáadjuk. A vizsgálatot 25 °C-on végezzük. Az ellenanyag tartalmú mintákat assay pufferben 5 μΐ antitesttel 10 percig szobahőmérsékleten előinkubáljuk. Ezeket a feltételeket megfelelőnek találtuk 100 ng tiszta hSOD inaktívvá tételéhez. A plot5-öt kontrollként használtuk. Ez a plazmid nem tartalmaz SÓD szekvenciát.

A II. táblázatban az egyik vizsgált klónnál (pSODx8) kapott eredményeket mutatjuk be.

//. táblázat

E. coliban [D1210 törzs-(pSOD'xS)] termelt humán Cu-ZnSOD enzim aktivitása

Enzim készítmény	SÓD egység/mg protein
tiszta humán Cu-Zn SÓD	15,384
pSODx8 protein kivonat	3,017
anti-humán SÓD (nyúl) antitesttel preinkubált pSODx8 protein kivonat	685
plot5 protein kivonat	470
anti-humán SÓD (nyúl) antitesttel preinkubált plot5 protein kivonat	485

Ezek az eredmények azt igazolják, hogy a teljes szolubilis sejt-protein 15%-a hSOD (feltételezve, hogy a referenciaként használt tiszta humán Cu-Zn SÓD teljesen aktív volt).

A protein extraktumok antitesttel történő inkubálása antitest-antigén komplexet eredményez, mely inaktiválja az enzimet. így az antitesttel előinkubált enzimmintáknál az enzimaktivitás alacsony. A pSODx8-ból és plot5-ből nyert protein-extraktumok enzimaktivitáskülönbsége a plazmidok SOD-kifejezésének különbségéből adódik. A pSODx8 vektor riboszóma-kötődési helyét az SÓD kifejezés optimalizálására módosítottuk. Az elektroforézissel kapott adatokkal (lásd fent) összevetve, amikor is a szolubilis sejt protein 5-10%ra mint hSOD vándorol, úgy tűnik, hogy a képződött hSOD tekintélyes része, talán a nagyobb része aktív.

A protein-extraktum és antitest inkubálása antitestantigén komplex képződéséhez vezet, mely az enzimet inaktiválja. Ezért az antitesttel preinkubált enzimminták aktivitása alacsonyabb. A pSODx8 és plot5 protein kivonat közötti aktivitáskülönbség a két plazmid közötti SÓD kifejeződés különbségéből ered. A pSODx8 vektorban a riboszóma kötődési helyet a SÓD kefejezés optimalizálására módosítottuk.

A klónozott gén pontos szekvenciáját Maxam és Gilbert módszerével határozzuk meg (lásd fent). Ezenkívül az N-terminális első 12 aminosavát automatizált Edman degradációs vizsgálattal határozzuk meg. A kapott aminosav szekvencia a következő:

ALA-THR-LYS-ALA-VAL-(CYS)-VAL-LEULYS-GLY-ASP-GLYA kimutatott első ALA csoport körülbelül azonos moláris koncentrációban volt jelen, mint a bevitt pepiidben, s ezt azt jelenti, hogy az amino-terminális vég nincs blokkolva. A CYS csoportot nem mutatja ki az aminosav analízisre alkalmazott módszer, de jelenléte a nukleotid szekvenciából következik.

Fentiek alapján a bakteriális expressziós termék nem tartalmaz (N-formil-) metionint, az anyagnak helyes az aminosav szekvenciája, azaz a eitoplazma hSOD-ra közölt 1-10 csoporttal azonos, de az N-temíinális ALA nem acetilezett. Továbbá: az E. coliban termelt polipeptid 1%-os agaróz gélben (pH = 8,6) elektroforetizálva sokkal lassabban vándorol, mint a természetes protein, ami a töltésbeli különbségre utal (CominG Universal eleetrophoresis film, Clausen szerint festve, Immunochemical Techniques, 530-531 oldal), s ez szintén az acetilezettség hiányát mutatja. Ezenkívül úgy a bakteriális hSOD polipeptid, mint az autentikus (acetilezett) természetes protein tripszines kezelésekor kapott peptidek azonosak, kivéve a bakteriális N-terminális peptid, amely várhatóan másképp vándorol, azaz úgy, mint egy N-acetil csoportot nem tartalmazó peptid.

7. példa

Kifejeződés élesztőben

Annak érdekében, hogy az r-hSOD gént élesztő vektorba vigyük át, a plot5/SOD plazmid kiónokat a kódoló régió 5’-végén elhelyezkedő Ncol restrikciós hely szempontjából szűrjük. Ugyanis azokban a plazmidokban, ahol a variábilis nukleotidok helyén - az iniciációs kodon tói 5’ irányban - CC van, a CCATGG szekvencia egy Ncol helyet szolgáltat. A kiónok szűrése után egyet kiválasztunk és phSOD jellel látjuk el.

A phSOD plazmid Ncol-gyel és Sall-gyel történő emésztése után egy 550 bp-os fragmentumot kapunk, amely 5’ végén transzlatálatlan nukleotidot és a hSOD teljes régióját tartamlazza. pPGAP plazmidot (ez egy élesztő expressziós vektor, mely GAP promotert hordoz; szerkesztését lásd a 8. példában) emésztünk Ncolgyel és Sall-gyel, majd alkalikus foszfatázzal kezeljük. A phSOD 550 bp Sall-Ncol fragmentummal a pPGAP-ban a GAP promotertől lefelé lévő Ncol-Sall fragmentumot szubsztituáljuk, és így megkapjuk a pPGAPSOD-ot. Ezt BamHI-gyel emésztjük, és ekkor egy 2 kb (kilo bázis pár) nagyságú fragmentumhoz jutunk, melyet géllel tisztítunk (Maniatis, 178. old.) és ligálással beépítjük a pCl/1 és a pCl/1 GAL4/370 plazmid egyedüli Bam I helyére, miáltal a pCl/lGAPSOD, illetve a pCl/lGALGAPSOD plazmidokhoz jutunk.

A pCl/1 plazmid egy élesztő ingázó vektor, melyet úgy állítunk elő, hogy a pJDB219 plazmid pMB9 régiójának BamHI-Sall részét a pBR322 plazmid 4 kb BamHI-Sall fragmensével helyettesítjük. [Beggs, Natúré, 275, 104 (1978)]. Szekréciós és processzor szignállal ellátott expressziós vektor szerkesztése a 4 870 008 számú USA szabadalmi leírásban található: a GA11/GAL10 szabályozó régiót tartalmazó szabályozható élesztő expressziós vektor (a GAL4 gén expreszsziós terméke által szabályozva) szerkesztésének leírását lásd a 9i példában.

A pCl/lGAPSOD és a pCl/lGALGAPSOD plazmiddal a 2150-2-3 élesztő törzset [Lee Harwelltől

HU 207 533 Β (University of Washington) kaptuk] transzformáljuk [Hinnen és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 75, 1929-1933. (1987)], és az expresszió eredményeit a III. táblázatban ismertetjük.

III. táblázat

Humán SÓD kifejeződése a 2150 élesztő törzsben

Plazmid	Szénforrás	SÓD² pg/mg protein
pCI/1	g, L¹	0
pCl/lGAPSOD	g,L	148
pCl/lGALGAPSOD	g,L gal	0,4 68

Minden tenyésztéshez Mintis Leucine táptalajt (Promega Biolabs, Inc.) használtunk 2% tejsavval (L), 3% glicerinnel (g) és/vagy 2% galaktózzal (gal) vagy anélkül. A tenyésztést a kcsöi lóg vagy a korai stacioner fázisig folytattuk.

“ A meghatározás RIA-val (radio-iinmuno-assay) történt.

A hSOD értékeket standard radio-immun-assay-vel határozzuk meg, standardként jódozott autentikus hSOD-t használunk. A GAP promotertó'l eredő konstitutív szintézis igen magas szintű, a teljes sejt protein 10-30%-ának megfelelő ItSOD termelést eredményez. A galaktózzal való indukció csaknem ilyen jól működik: a sejt protein körülbelül 7%-a hSOD.

Ha a bSOD képződése ilyen magas szinten történik, a teljes enzimatikus, azaz katalitikus aktivitás kifejtéséhez rendszerint gondoskodnunk kell a protein tennék prosztetikus csoportját alkotó cink- és rézionok utánpótlásáról, amit például cink-szulfát és réz-szulfát 1 míllimólos oldatával szembeni dialízissel biztosíthatunk. Másképpen úgy járhatunk el, hogy a tenyészléhez cink- és/vagy rézionokat adunk; ez a módszer a hSOD-t magas szinten termelő törzsek szelekciójára is felhasználható és/vagy arra is, hogy elkerüljük a hSOD-t kifejező vektorok elvesztését az egyébként nem szelektív táptalajon.

8. példa

A pPGAP szerkesztése

A pBr322 plazmid HindlII helyére a GAP49 GAPDH-gént tartalmazó HindlII restrikciós fragmenst [Holland és Holland, J. Bioi. Chem. 254, 5466-5474. (1979)] építjük be, és így a pGAPl plazmidot állítjuk elő. A pGAPl-et Hinfl-gyel emésztjük, és a kapott 500 bp fragmentumot gélelektroforézissel izoláljuk. E fragmentumot Bal31-gyei (New England Biolabs) hasítjuk, hogy 50 vagy 90 bázispárt eltávolítsunk, ezután HindlII linkerekkel (New England Biolabs) kapcsoljuk össze, majd HindlII-mal emésztünk. A pBR322-t HindlII-mal emésztjük, ezután alkalikus foszfatázzal kezeljük, és a kapott mintegy 450 vagy 410 bp hosszú fragmentum beépítése révén kapjuk a pGAP128-at.

A pGAP128-at HindlII-mal emésztjük, a fragmentum végeit Klenow fragment és a dNTP-k segítségével betöltjük (blunt end), majd a kapott 450 bp fragmentumot gélelektroforézissel izoláljuk. Ezt a fragmentumot az előzőleg alkalikus foszfatázzal kezelt, majd Smalgyel emésztett plot5-be építjük be, miáltal a plot5pGAP128 plazmidhoz jutunk, amely a GAPDH promoter és kódoló régió -400-tól +27-ig terjedő bázispárjait tartalmazza.

A pPGAP élesztő expressziós vektort - amely egy polirestrikciós linkért tartalmaz a GAPDH terminátor és a rövid promoter között - a következőképpen szerkesztjük meg. A plot5pGAP128 plazmidot BamHIgyel és Taql-gyel emésztjük, így egy közelítőleg 390 bp BamHI-Taql fragmentumot kapunk, amely a GAPDH promoter -400-tól -26-ig terjedő fragmentumát tartalmazza. Ezt a fragmentumot a GAPDH gén -25-től -1 bp-ig terjedő promoterét és számos restrikciós helyet, beleértve az Ncol-et is tartalmazó, alábbi szekvenciájú:

CGA₂TA₃(CA)3TA₃CA₃CACCATG₃A₂TCGT₂AG₂T₂AT₃(GT)₃AT₃GT₃GTGGTAC₃T₂A₂GCA₂TC₂AGCT szintetikus fragmenshez ligáljuk.

Ezzel egy BamHI-Sall fragmentumot kapunk, amelyet BamHI-gyel és Sall-gyel emésztünk és arra használjuk, hogy az alkalikus foszfatázzal kezelt és BamHI-SalI-gyel emésztett pBR322 plazmid BamHISall fragmentumát helyettesítsük. Ligálás után a pGAPNRS plazmidhoz jutunk, amelyet BamHI-gyel és Sall-gyel emésztünk, s ekkor egy 400 bp hosszú BamHI-Sall fragmentumot kapunk, melyet izolálunk. Ezt a fragmentumot egy körülbelül 900 bp hosszú olyan GAPDH Sall-BamHI fragmentumhoz kapcsoljuk, amely a GAPDH terminátor régióját és a 3’ kódoló régió egy rövid szegmentumát tartlmazza. így egy 1,4 bp hosszú BamHI-BamHl fragmentum keletkezik. A Sall-BamHI GAPDH terminátor fragmentumot úgy kapjuk, hogy a pGAP2-t Sall-gyel és BamHI-gyel emésztjük. A pGAP2 egy plazmid, mely úgy készül, hogy a pBR322 plazmid BamHI helyére beépítünk egy GAP49 GAPDH gént (Holland és Holland, lásd fenti közleményt) tartalmazó mintegy 3,3 kb hosszú BamHI fragmentumot. A pGAP2 és PGAPl plazmidokal a következőkélppcn szerkesztjük: élesztő gén gyűjteményt állítunk elő. hogy a Charon 28 iambda fágba egy - a teljes élesztő DNS Sau3A restrikciós endonukleázzal történő parciális emésztése révén kapott - fragmentumot építünk be [Blattner és munkatársai, Science, 196. 161-169. (1977)]. A fág gyűjteményt élesztő GAPDH mRNS-sel komplementer DNS-sel szűrjük, és e kiónok egyikéből származó élesztő GAPDH gént beklónozzuk vagy mintegy körülbelül 3,3 kg BamHI fragmentumként a pBR322 plazmid BamHI helyére (pGAP-2) vagy mintegy körülbelül 2,1 HindlII fragmentumként a pBR322 plazmid HindlII helyére (pGAP-1).

A pBR322 plazmidot EcoRI-gyel és Sall-gyel emésztjük, a végeket betöltjük és hozzákapcsoljuk BamHI linkerekhez, ezután BamHI-gyel való emésztés következik, majd a 3,8 kb BamHI-BamHl fragmentumot gélből izoláljuk, recirkularizáljuk ön-ligáz reakcióval, klónozzuk és a pBRARl-Sal jellel látjuk el. A fentiek szerint izolált 1,4 kb BamHI-BamHl fragmentumot be1

HU 207 533 Β építjük a BamHI-gyel emésztett, alkalikus foszfatázzal kezelt pBRARl-Sal vektorba, miáltal az amp^r génnel ellenkező orientációjú fragmentumot tartalmazó 5,3 kb pPGAP plazmidhoz jutunk.

9. példa

GÁL szabályozással rendelkező plazmidok szerkesztése

A pLGSD5 plazmidot a Guarente és munkatársai által leírt [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79,'7410-7414. (1982)] módszerrel állítjuk elő. A plazmiddal a következő manipulációkat végezzük:

először Xhol enzimmel hasítjuk, a túllógó végeket a DNS polimeráz I Klenow fragmentjének („Klenow fragment”) segítségével betöltjük, összekapcsoljuk EcoRI linkerekkel (GGAATTCC), majd teljesen emésztjük ExoRI-gyel és Sau3A-val. Ekkor egy 370 bp fragmentumot is kapunk, melyet gélelektroforézissel izolálunk, s ez a fragmentum az élesztő GÁLI és GAL10 génjei közti szekvenciát tartalmazza, mely a

GÁLI és GÁL 10 gének GAL4 szabályozó szekvenciáját reprezentálja.

A kapott fragmentumot beépítjük a pBR322 plazmidba, melyet EcoRI-gyel és BamHI-gyel teljesen megemésztettünk, majd alkalikus foszfatázzal kezeltünk, hogy megakadályozzuk az oligomerizációt, s így a pBRGAL4 plazmidhoz jutunk.

A pBRGAL4 plazmidot teljesen megemésztjük Sau3A-val, a túllógó végeket Klenow-fragment segítségével betöltjük, a keletkező telt-végű (blunt-ended) fragmentumot Sáli linkerekhez (CGTCGACG) kapcsoljuk, majd Sall-gyel és Xhol-gyel emésztünk. A kapott 370 bp fragmentumot gélelektroforézissel izoláljuk. Ez a fragmentum az eredeti 370 bp nagyságú élesztő GAL4 szabályozó szekvencia'Xhol és Sáli végekkel.

E fragmentumot ezután a plot5 plazmidba klónozzuk (lásd 4. példa). A plot5 plazmid szerkesztése a következőképpen történik: az alábbi szekvenciájú 40 bp polilinker fragmentumot

EcoRI BamHI BglII Xbal HindlII

I I III

5' AATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGATCTCTAGAAGCTTCAG

3' GGGCCCCTAGGCAGCTGGACGTCTAGAGATCTTCGAAGTC a pBR322 plazmidba építjük be, EcoRI-PvuII szubsztituensként, majd a PvuII helyre a trp-lac promoter [Russell és Bennett, Gene, 20, 231-245 (1982)] beépítése következik a polilinker szekvencia felé orientált transzkripcióval. A plot5 plazmidot teljesen megemésztjük Sall-gyel, ezután alkalikus foszfatázzal kezeljük, majd az előbb kapott 370 bp fragmentumot beépítjük a plot5-be, s így kapjuk a plot5GAL4/370 plazmidot. Ezt a plazmidot teljesen megemésztjük BamHI-gyel és Sall-gyel, hogy újra megkapjuk a polilinker fragmentum 6 bázispárra terjedő individuális fragmentumát. Ezt a fragmentumot a pCl/1 plazmidhoz kapcsoljuk, miután azt teljesen megemésztettük BamHI-gyel és Sall-gyel, majd alkalikus foszfatázzal kezeltük, hogy megakadályozzuk a gyűrűbe záródást. A keletkező plazmidot a pCl/lGAL4/370 jelzéssel látjuk el. A BamHI-Sall fragmentum a pCl/1 vektor pBR322-ből álló részében helyezkedik el.

Az élesztőben termelt phSOD polipeptid azonos a természetes humán proteinnel. Az élesztőben előállított hSOD a proteinnel azonos módon vándorol úgy poliakrilamid gél elektroforézissel (SDS-sel és SDS nélkül is), mint agaróz gél elektroforézissel vizsgálva (lásd fent). Ezenkívül, ha az igen tiszta élesztő polipeptidet tizenkét Edman degradációs ciklusnak vetjük alá, ugyanazt a szekvenciát kapjuk, mint amit az E. coliban termelt humán proteinre leközöltek (1-10 csoport) és fent bemutattunk. Azonban a bevitt proteinhez viszonyítva - moláris alapon - a kimutatott érték a vártnak csak 5-10%-a. Ez az alacsony kimutathatósági szint azt mutatja, hogy az N-terminális aminosav blokkolva van, feltehetően acetiPvuII lezve. Ezt az eredményt az élesztőben termelt hSOD és az autentikus acetilezett humán anyag tripszines kezelése révén kapott peptidek összehasonlító v izsgálata is igazolja, azaz mindkét mintában azonosak voltak a tripszinnel kezelt proteinek, beleértve az N-terminálisokat is, ami az élesztőben kifejeződött termékben az acetilezett N-terminális ALA-csoport jelenlétére utal.

//. példa

A humán SOD-gén izolálása A humán SOD-gén izolálása céljából humán genomot reprezentáló lambda bakteriofág gyűjteményt [R.

Lawn és munkatársai, C_ell, 15, 1157-1174 (1978)] szűrünk radioizotóppal jelzett DNS próbaanyaggal, melyet humán SÓD cDNS-ből készítünk. Egy millió fág plakkot szűrtünk és 13 pozitívan hibridizáló plakkot tisztítottunk. A fág DNS restrikciós endonukleázzal való vizsgálata azt mutatta, hogy legalább 5 különböző gén van jelen, mely szerint feltételezhető, hogy másféle SOD-t meghatározó gének és géntermékek is léteznek. Egy ilyen gén-jelölt a legutóbb felfedezett extracelluláris Cu/Zn SÓD [S. Markiund, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 79, 7634-7638 (1982)]. Hogy az autentikus citoplazma Cu/Zn SOD-gént a rokon génektől megkülönböztethessük, az alábbi szintetikus DNS-anyagokat alkalmaztuk:

5’-AATGCTTCCCCACACC-3’ és 5’-CTCAGTTAAAATGTCTGTTTG-3’, melyek a 19-26 amino55 savnak, illetve a 3’ transzlatálatlan régióban lévő 3’ terminátor .kodonból való 193-213 nukleotidoknak felelnek meg. A tizenhárom genom DNS közül csak egy hibridizált ezekkel a· próba-anyagokkal, jelez11

HU 207 533 Β vén, hogy ez az autentikus humán citoplazma SODgén. Ezt az N-terminális régió DNS szekvencia analízise is bizonyítja. Az 5. ábrán bemutatjuk az analízis eredményét, azaz a protein szekvencia analízissel bizonyított aminosav szekvenciát. Ez azt is jelenti, 5 hogy a SOD-nak nincs preproteinje, minthogy az iniciátor metionin kodontól 5’ felé kilenc nukleotiddal egy in-frame terminátor kodon létezik. Az 5. ábrán látható, hogy a humán Cu/Zn SOD-gén közbeeső szekvenciákat tartalmaz. A SOD-gén térképe, 10 melyet a 6. ábra mutat, azt mutatja, hogy több közbeeső szekvencia is létezik.

Bár a találmány szerinti eljárást a jobb megértés érdekében példákkal és ábrákkal megvilágítva a fentiekben részletesen leírtuk, mégis magától értetődik, 15 hogy bizonyos változtatások és módosítások végrehajthatók a csatolt szabadalmi igénypontokban megfogalmazott körön belül.

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás acetilezett humán réz-cink szuperoxiddiszmutáz előállítására, melynek során

i) szuperoxid-diszmutázt kódoló DNS szekvenciát tartalmazó kifejező vektort készítünk, ii) az élesztő gazdasejtet transzformáljuk a vektornál, iii) a transzformált gazdasejtet tenyésztjük, és iv) a keletkezett acetilezett humán szuperoxid-diszmutázt kinyerjük, azzal jellemezve, hogy az alábbi humán szuperoxiddiszmutázt kódoló DNS-szekvenciát:

GCG ACG AAG GCC GTG TGC GTG CTG AAG GGC GAC GGC CCA GTG CAG GGC ATC ATC AAT TTC GAG CAG AAG GAA AGT AAT GGA CCA GTG AAG GTG TGG GGA AGC ATT AAA GGA CTG ACT GAA GGC CTG CAT GGA TTC CAT GTT CAT GAG TTT GGA GAT AAT ACA GCA GGC TGT ACC AGT GCA GGT CCT CAC TTT AAT CCT CTA TCC AGA AAA CAC GGT GGG CCA AAG GAT GAA GAG AGG CAT GTT GGA GAC TTG GGC AAT GTG ACT GCT GAC AAA GAT GGT GTG GCC GAT GTG TCT ATT GAA GAT TCT GTG ATC TCA CTC TCA GGA GAC CAT TGC ATC ATT GGC CGC ACA CTG GTG GTC CAT GAA AAA GCA GAT GAC TTG GGC AAA GGT GGA AAT GAA GAA AGT ACA AAG ACA GGA AAC GCT GGC AGT CGT TTG GCT TGT GGT GTA ATT GGG ATC GCC CAA TAA

vagy az ugyanezen polipeptidet kódoló variánsát, melyek 5’-végén olyan acetilező szignál helyezkedik el, amelynek első kodon-helyzetében glicin vagy alanin, és a második kodonhelyzetben poláris aminosav van, 30 tartalmazó kifejező vektort készítünk.

(Elsőbbsége: 1984.05. 11.)

2. Eljárás humán réz-cink szuperoxid-diszmutáz kifejezésére alkalmas vektor előállítására, melynek során

i) iniciációs kodonnal és stop kodonnal rendelkező, 35 humán réz-cink szuperoxid-diszmutázt kódoló struktúrgént készítünk, ii) a kapott struktúrgént transzkripciós és transzlációs fázisban a promoter és riboszóma kötőhely után beépítjük, és iii) az előállított kifejező egységet egy vektorral kombináljuk, azzaljellemezve, hogy struktúrgénkénl az alábbi humán szuperoxid-diszmutázt kódoló DNS-szekvenciát:

GCG ACG AAG GCC GTG TGC GTG CTG AAG GGC GAC GGC CCA GTG CAG GGC ATC ATC AAT TTC GAG CAG AAG GAA AGT AAT GGA CCA GTG AAG GTG TGG GGA AGC ATT AAA GGA CTG ACT GAA GGC CTG CAT GGA TTC CAT GTT CAT GAG TTT GGA GAT AAT ACA GCA GGC TGT ACC AGT GCA GGT CCT CAC TTT AAT CCT CTA TCC AGA AAA CAC GGT GGG CCA AAG GAT GAA GAG AGG CAT GTT GGA GAC TTG GGC AAT GTG ACT GCT GAC AAA GAT GGT GTG GCC GAT GTG TCT ATT GAA GAT TCT GTG ATC TCA CTC TCA GGA GAC CAT TGC ATC ATT GGC CGC ACA CTG GTG GTC CAT GAA AAA GCA GAT GAC TTG GGC AAA GGT GGA AAT GAA GAA AGT ACA AAG ACA GGA AAC GCT GGC AGT CGT TTG GCT TGT GGT GTA ATT GGG ATC GCC CAA TAA vagy az ugyanezen polipeptidet kódoló variánsát alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1983. J0. 03.)
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterkent egy élesztőpromotert vagy egy bakteriális promotert alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1983. 10. 03.)
4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy olyan struktúrgént készítünk, mely a DNS-szekvencia 5'-helyzetében acetilező szignált tartalmaz.

(Elsőbbsége: 1983. 10. 03.)
5. Eljárás baktériumtenyészetek humán réz-cink

50 szuperoxid-diszmutáz. termelőképességének fokozására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerinti eljárással előállított vektor riboszóma kötőhelye és az iniciációs kodon között 1-4 nukleotid-számú DNS-hidakat alakítunk ki, és a kapott vektorokkal gazda mik55 roorganizmust transzformálunk, és azt tenyésztjük, és a legnagyobb tennelőképességet biztosító telepeket szelektáljuk. (Elsőbbsége: 1983. 10.03.)

HU 207 533 Β Int. Cl.⁵: C 12 N 15/53