JPH0767393B2 - ポリペプチドの発現方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はポリペプチドの発現方法に関し、
さらに詳しくは、ラン藻細胞を宿主として用い、有用生
理活性を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子を
含有する担体ＤＮＡで形質転換することにより、効率よ
く該ポリペプチドを発現させる方法に関する。

【０００２】ラン藻(cyanobacteria シアノバクテリア
ともいう）は、大腸菌などと同様に、核膜をもたない原
核生物である。しかし、ラン藻は高等植物、特に紅藻の
光合成機構と類似しており、太陽からの光をエネルギー
源として、水及び二酸化炭素とわずかな無機塩類とから
有機物質を生合成し、独立栄養的に大量に増殖すること
が可能である。

【０００３】また、ラン藻は古くから食用とされてきた
種も数多くあり［スピルリナ(Spirulina)、スイゼンジ
ノリ(Aphanothece)、ネンジユモ(Nostoc)など]、動物に
対しての病原性及び寄生性も報告されていない。従つ
て、ラン藻は遺伝子組換えのための宿主として適してお
り、安全性にも優れている。

【０００４】上記のような特徴を持つラン藻に有用な生
理活性ペプチドをコードする遺伝子を導入し、大量に発
現できれば、農作物のように季節や天候に左右されずに
食料、機能性食品、飼料等をつくることが可能であり、
さらに、低コスト、省エネルギー、省資源的な医薬品、
医薬部外品、化粧品原料等の生産が可能となることが期
待できる。

【０００５】近年、ラン藻を宿主とする宿主−ベクター
系の開発が急速に進展し、Anacystis nidulansＲ２(Syn
echococcus PCC 7942）、 Agmenellum quadruplicatum(S
ynechococcus PCC 7002)、 Synechocystis PCC 6803, An
abaena PCC 7120などの種を用いて、多くの異種タンパ
ク質遺伝子の発現が報告されている［ヒトのカーボニツ
ク・アンヒドラーゼおよび大腸菌lac IQ リプレツサー
タンパク質の発現についてはG．D．Price and M. R. Ba
dger, Plant Physiol、９１：５０５−５１３（１９８
９）；高等藻類(Cyanophoraparadoxa)のアロフイコシア
ニンの発現についてはR. de Lorimier et al., J. Bact
erol. １６９：１８３０−１８３５（１９８７）；Baci
llus amyloliquefaciens Ａ５０のα−アミラーゼの発
現についてはI. V. Elanskaya and I. B. Morzunova, M
ol. Genet. Mikrobiol. Virusol. ０（９）：７−１１
（１９８９）；B. shaericus １５９３Ｍの殺虫タンパ
ク質の発現についてはN. Tandeau de Marsac etal., Mo
l. Gen. Genet. ２０９：３９６−３９８（１９８
７）；B. thuringiensis var. israelensis の１３０ｋ
Ｄａ δ−エンドトキシンの発現についてはC. Angsuth
anasombat and S. Panyim, Appl. Environ. Microbid.
５５：２４２８−２４３０（１９８９）；B．subtilis
のレバンシユクラーゼの発現についてはY. Cai and C．
P．Wolk，J. Bacteriol, １７２：３１３８−３１４５
（１９９０）；Vibrio harveiおよびV. fischeriのルシ
フエラーゼの発現についてはG. Schmetterer et al.,
J. Bacteriol，１６７：４１１−４１４（１９８６）；
大腸菌のβ−ガラクトシダーゼの発現についてはD. J.
Scanlan etal., Gene ９０：４３−４９（１９９０）、
M. R. Schaefer and S. S. Golden, J. Bacteriol, １
７１：３９７３−３９８１（１９８９）及びJ. S. Buzb
y etal., Science ２３０：８０５−８０７（１９８
５）；大腸菌のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの発現に
ついてはD. A. Lightfoot et al., Plant Mol. Biol.１
１：３３５−３４４（１９８８）；大腸菌のrecＡタン
パク質の発現についてはR. C. Murphy et al., J. Bact
eriol, １７２：９６７−９７６（１９９０）；大腸菌
のＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼの発現について
はM. Y. Gruberet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA８
７：２６０８−２６１２（１９９０）；光合成細菌Rhod
ospirillum rubrumのＲｕＢｉｓＣＯの発現については
J. Pierce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８
６：５７５３−５７５７（１９８９）；バクテリオフア
ージーλのｃＩリプレツサータンパク質の発現について
はD.Friedberg and J. Seijffers, Mol.Gen. Genet, ２
０３：５０５−５１０（１９８６）参照］。

【０００６】しかし、上記報告の多くは、異種タンパク
質をコードする遺伝子の発現のために、その施主の遺伝
子自身の転写開始領域をそのまま用いており、目的のタ
ンパク質の発現量はごく微量である。また、大腸菌のｔ
ａｃプロモーターやＯ_LＰ_Lプロモーターを用いて異種タ
ンパク質（ヒト−カーボニツク・アンヒドラーゼ、フア
ージ−λｃＩリプレツサー）を発現させた報告では、目
的タンパク質の発現量を増加させるために、それらのプ
ロモーターの制御タンパク質をコードする遺伝子も同一
ベクター上に導入するなどの工夫がなされているが、該
報告中に発現量が記載されているヒト−カーボニツク・
アンヒドラーゼでも、その発現量は可溶性タンパク質の
約０.３％という少量であり、期待されるほどの発現量
は得られていない。

【０００７】一方、異種タンパク質（大腸菌のβ−ガラ
クトシダーゼ）の発現のための転写開始領域として宿主
ラン藻の転写開始領域を用いるという報告もなされてい
る［前出のGene ９０：４３−４９（１９９０）及びJ.B
acteriol. １７１：３９７３−３９８１（１９８
９）］。しかし、いずれの場合にも、ラン藻の構造遺伝
子中にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が導入されているた
め、融合タンパク質として発現されており、目的の異種
タンパク質の産生という点で問題がある。

【０００８】そこで、本発明者らは、ラン藻細胞を宿主
として、生理活性を有するポリペプチドの効率的発現を
図るべく、まず、アナキステイス・ニデユランス(Anacy
stisnidulans)のＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子の転写開始領域
及び転写終止領域を発現させようとする構造遺伝子と連
結させ、ラン藻細胞中で機能するオペロンの作成につい
て鋭意研究を行った結果、ＲｕＢｉｓＣＯ転写開始領域
及び転写終止領域を用いることにより、構造遺伝子が効
率よく発現すること、また、作成したオペロンを導入す
るベクターの種類によつても、その発現量が影響するこ
とを見出した。そしてさらに、大腸菌などで報告のある
ＳＤ配列からＡＴＧ（翻訳開始点）間の塩基数が構造遺
伝子の発現に影響を与えることを見い出し、塩基数の最
適化によつて発現量を著るしく高めることに成功し、本
発明を完成するに至った。

【０００９】かくして、本発明によれば、生理活性を有
するポリペプチドをコードする構造遺伝子を含有する担
体ＤＮＡでラン藻細胞を形質転換することにより、ラン
藻細胞で該ポリペプチドを発現させる方法において、該
担体ＤＮＡとして、生理活性を有するポリペプチドをコ
ードする構造遺伝子と、該構造遺伝子の上流側に位置す
るアナキステイス・ニジユランスのＲｕＢｉｓＣＯ遺伝
子の転写開始領域と、該構造遺伝子の下流側に位置する
該ＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子の転写終止領域を含有する担体
ＤＮＡを使用することを特徴とするラン藻細胞での生理
活性を有するポリペプチドの発現方法が提供される。

【００１０】以下、本発明の発現方法についてさらに細
胞に説明する。

【００１１】［１］ 担体ＤＮＡの造成 生理活性を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子
（以下、便宜上「有用構造遺伝子」ということがある）
と、アナキステイス・ニデユランスのリブロース−１,
５−ジリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Ｒｕ
ＢｉｓＣＯ）の転写開始領域、ＳＤ様配列及び転写終止
領域［K. Shinozaki and M. Sugiura,Mol. Gen. Gene
t. ２００：２７−３２（１９８５）、熊野正信・杉浦
昌弘、遺伝３８（１２）：２６−３１（１９８４）等参
照］とが連結した担体ＤＮＡを調整するための具体的な
方法は後記実施例に示すとおりであり、以下、その基本
的操作について概説する。

【００１２】（１） ＲｕＢｉｓＣＯの転写開始（プロ
モーター）領域の調整 ＲｕＢｉｓＣＯのプロモーターを含むＤＮＡ断片は、例
えばK. Shinozagiらの文献[Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, ８０：４０５０−４０５４（１９８３）］に記載の
プラスミドｐＡＮＥ１８（ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩサ
イトにＲｕＢｉｓＣＯプロモーター領域を含む約５.６
ＭＤａのＥｃｏＲＩ断片が挿入されているもの）を常法
(T. Maniatis et al., Molecular cloning-A Laborator
y Manual-Cold Spring Horbor Laboratory刊)に従つ
て、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ及びＰｓｔＩを用い
て切り出すことにより調製することができる。

【００１３】（２） ＲｕＢｉｓＣＯの転写終止（ター
ミネーター）領域の調製 ＲｕＢｉｓＣＯのターミネーター領域は、例えばK. Shi
nozakiらの文献[Proc.Natl. Acad. Sci. USA ８０：４
０５０−４０５４（１９８３）］に記載のプラスミドｐ
ＡＮＰ１１５５（ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩサイトにＲｕ
ＢｉｓＣＯターミネーター領域を含む約１.５ＭＤａの
ＰｓｔＩ断片が挿入されているもの）を制限酵素Ｐｓｔ
Ｉ及びＥｃｏ５２Ｉを用いて切り出すことにより調製す
ることができる。

【００１４】（３） ＳＤ様配列の調製 本発明において用いる組換えＤＮＡには、リボソーム認
識配列として、有用構造遺伝子の上流側で且つプロモー
ター領域の下流側にＳＤ様配列が導入される。ＳＤ様配
列としては、宿主のラン藻のリボソーマルＲＮＡと相補
的なものを使用するのが好ましく、ラン藻としてアナキ
ステイス・ニジユランス６３０１株を用いる場合のＳＤ
様配列としてはＧＧＡＧなる塩基配列のものが使用でき
るが、これに限られるものではなく、ＳＤ様配列として
知られている他の塩基配列のものも同様に使用すること
ができる。そのようなＳＤ様配列は塩基数が少ないの
で、通常、合成によつてつくることが多い。

【００１５】また、ＳＤ様配列は通常ＡＴＧ（翻訳開始
点）の前に位置し、ＳＤ様配列からＡＴＧまでの長さ
（塩基数）は有用構造遺伝子の発現に影響を与える可能
性があるので、宿主の種類、構造遺伝子の塩基配列等に
応じて発現量が最適となるように調節することが望まし
い。その長さは宿主ラン藻の種類、構造遺伝子の塩基配
列等により異なるが、一般には３〜１０ベース程度であ
り、最適の長さは宿主構造遺伝子の塩基配列等に応じて
実験的に決めることができる。

【００１６】ＳＤ様配列を含むＤＮＡ断片の調製は通常
ＡＴＧ（翻訳開始点）の前まで又はＡＴＧも含めて行な
うことができ、そのＤＮＡ断片の合成はそれ自体既知の
遺伝子操作技術［日本生化学会編「続生化学実験講座１
遺伝子研究法II」東京化学同人刊（１９８７年）］によ
つて容易に行なうことができる。

【００１７】（４） 有用構造遺伝子の調製 本発明の方法により発現しうる生理活性を有するポリペ
プチド（以下、便宜上「有用ペプチド」ということがあ
る）は、特定のものに限定されるものではなく、本発明
の方法によれば、各種の有用ペプチドを効率よく発現さ
せることができる。

【００１８】しかして、本発明の方法により発現させう
る有用ペプチドとしては、例えばヒト−ＳＯＤ、インタ
ーロイキン（ヒト、マウスなど）、ヒトインターフエロ
ン−α，−β又は−γ、ヒト−インスリン、ヒト−腫瘍
壊死因子（ＴＮＦ）、ヒト・コロニー刺激因子（ＣＳ
Ｆ）、ヒト−組織プラスミノーゲンアクテイベーター
（ｔＰＡ）、ヒト−プロウロキナーセ、ウロキナーゼ、
ヒト−血液凝固因子（Ｉ〜Ｖ、ＶII〜ＸIII）、ヒト−
エリスロポエチン、ヒト−神経成長因子、ヒト−心房性
ナトリウム利尿ペプチド（α−ｈＡＮＰ）、ヒト−膵分
泌性トリプシンインヒビター、成長ホルモン（ヒト、ウ
シ、ブタ、ニワトリ、魚類など）、成長ホルモン放出因
子、抗体（免疫グロブリン）、殺虫タンパク質（ＢＴ蛋
白質など）、種子貯蔵タンパク質（フアゼオリン、ゼイ
ン、グルテニン、グリシニン、ホルデインなど）など並
びにこれら有用ペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドが挙げられる。

【００１９】ここで有用ペプチドと実質的に同一のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドとは、有用ペプチドそれ
自体並びにその有用ペプチドが本来もつ活性を実質的に
失なうことがない範囲内で該有用ペプチドのアミノ酸配
列の一部が他のアミノ酸と置き換つた有用ペプチドに類
縁するポリペプチドをも包含する意味で使用するもので
ある。

【００２０】従つて、後記実施例で使用されているヒト
−ＳＯＤを例にとつて言えば、「ヒト−ＳＯＤと実質的
に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」には、Ja
buschら[Biochemistry, １９：２３１０−２３１６（１
９８０）］及びBarraら［FEBS Letters１２０；５３−
５５（１９８０）］が報告したアミノ酸配列を有するｈ
ＳＯＤポリペプチドの他に、ｈＳＯＤとしての酵素活性
を実質的に失なうことがない範囲内でアミノ酸配列の一
部（一般には５個以下、好ましくは２個以下）が他のア
ミノ酸と置き換つたｈＳＯＤに類縁するポリペプチドを
も包含され、具体的には、 （ａ） ｈＳＯＤ （ｂ） ｈＳＯＤの６番目のシステイン残基（Ｃｙｓ）
がアラニン残基（Ａｌａ）に置き換つたもの（特願昭６
３−３１１０１３号明細書参照）、 （ｃ） ｈＳＯＤの１１１番目のシステイン残基（Ｃｙ
ｓ）がセリン残基（Ｓｅｒ）に置き換つたもの（特公昭
６２−１３０６８４号明細書参照）、 （ｄ） ｈＳＯＤの６番目のシステイン残基（Ｃｙｓ）
がアラニン残基（Ａｌａ）に、そして１１１番目のシス
テイン残基（Ｃｙｓ）がセリン残基にそれぞれ置き換つ
たもの（特公昭６３−２７３４７３明細書参照）等が挙
げられる。

【００２１】上記の如き有用ペプチドをコードする有用
構造遺伝子の調製は、それ自体既知の遺伝子操作技術
［例えば、日本生化学会編 「続生化学講座１遺伝子研
究法II」 東京化学同人刊（１９８７年）；村松正実編
「医学における遺伝子工学」東京化学同人刊（１９８
７年）等の実験書参照］によつて、有用ペプチドを産生
する能力をもつ動物、植物、微生物等の供給源細胞から
抽出クローニングしたり或いは化学的に合成することに
より行なうことができる。

【００２２】（５） 有用構造遺伝子を含有する発現可
能なオペロンの造成 上記のようにして調製されるＲｕＢｉｓＣＯプロモータ
ー領域、ＳＤ様配列を含むＤＮＡ断片及びＲｕＢｉｓＣ
Ｏターミネーター領域は、生理活性を有するポリペプチ
ドをコードする有用構造遺伝子と共に、（プロモーター
領域）−（ＳＤ様配列を含むＤＮＡ断片）−（翻訳開始
コドン、ＡＴＧ）−（有用構造遺伝子）−（翻訳終止コ
ドン）−ターミネーター領域）の順で、それ自体既知の
方法により連結され、ラン藻細胞中で発現可能なオペロ
ンが造成される。

【００２３】プロモーター及びＳＤ様配列はそれぞれ単
一である必要はなく、２つ又はそれ以上のプロモーター
を縦列させて用いたり及び／又は２つ又はそれ以上のＳ
Ｄ様配列を縦列させて用いることも可能である。

【００２４】上記の有用構造遺伝子を含有するオペロン
は、宿主及び／又はオペロンの種類等によつては実質的
にそのままの状態で宿主を形質転換することも可能であ
るが、通常は宿主に適したベクター（プラスミド）に導
入して形質転換に用いられる。

【００２５】（６） ベクター 前記の発現可能なオペロンを導入しうるベクターとして
は、ラン藻細胞中で用いられる広範囲の種類のベクター
を使用することができ、例えば、ｐＵＣ１０４、ｐＵＣ
１０５［C．J．Kuhlemeier et al., Mol. Gen. Genet.
１８４：２４９−２５４（１９８１）］；ｐＬＳ１０３
［L. A. Sherman and P. van de Putte,J. Bacteriol,
１５０：４１０−４１３（１９８２）］；ｐＤＰＬ１３
［S. Gendel et al., J. Bacteriol, １５６：１４８−
１５４（１９８３）］；ｐＵＣ３０３［C. J. Kuhlemei
er et al., Plasmid １０：１５６−１６３（１９８
３）］；ｐＳＧ１１１［S. S. Golden and L. A. Sherm
an, J. Bacteriol, １５５：９６６−９７２（１９８
３）］；ｐＰＵＣ２９［C. J. Kuhlemeier et al., Gen
e ３１：１０９−１１６（１９８４）］；ｐＰＬＡＮ
Ｂａ１［D. E. Landenbach et al., Mol. Gen Genet,
１９９：３００−３０５（１９８５）］；ｐＢＡＳ１８
［K. Shinozaki et al., Gene１９：２２１−２２４
（１９８２）］などが挙げられる。

【００２６】また、そのようなベクターは、プラスミド
及びウイルスから必要に応じて誘導することができ、例
えばアナキステイス・ニデユランス由来のプラスミドｐ
ＢＡ１のＯｒｉＡ領域と、プラスミドｐＵＣのマルチク
ローニング領域と、大腸菌ＣｏｌＥ１系プラスミドのＯ
ｒｉＥ領域とから本発明者らによつて造成された大腸菌
及びラン藻細胞内で複製可能なシヤトルベクターｐＢＡ
Ｘ１８、ｐＢＡＸ１９、ｐＢＡＸ２０なども有利に使用
することができる（後記実施例及び（平成３年３月８日
付で出願された同一出願人による発明の名称が「新規プ
ラスミド」の特許出願参照）。

【００２７】（７） 担体ＤＮＡの構築 上記（５）で述べた有用構造遺伝子を含有する発現可能
なオペロンは、それ自体既知の遺伝子操作技術によつ
て、上記（６）で述べた如きベクター（プラスミド）に
導入することができる。

【００２８】例えばｈＳＯＤをコードする有用構造遺伝
子を用いて前記（５）に述べた如くして調製されるｈＳ
ＯＤオペロンは、例えばアナキステイス・ニデユランス
細胞中で複製可能なｐＢＡＳ１８又はｐＢＡＸ１８の例
えばＥｃｏＲＩ認識部位を制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて
開裂させ、おのおののＤＮＡ断片を一緒にし、Ｔ₄ＤＮ
Ａリガーゼを作用させることにより挿入され、ｈＳＯＤ
発現用ベクターが得られる。ベクター中に挿入されるオ
ペロンは１つである必要はなく、同一方向であれば、
２、３、４個又はそれ以上縦列させることも可能であ
る。

【００２９】このようにして得られるｈＳＯＤ発現用ベ
クターは大腸菌で常法(T. Maniatiset al., Molecular
Cloning-A Laboratory Manual-Cold Spring Horbor Lab
oratory 刊）従つてクローリングすることができる。

【００３０】［２］ 形質転換 前述の如くして造成される担体ＤＮＡを用いて形質転換
することのできるラン藻細胞としては、例えば、次にも
のを例示することができる。

【００３１】アナキステイス・ニデユランス６３０１株
(Synechococcus PCC ６３０１)、 アナキステイス・ニデユランスＲ２株（Synechococcus
PCC ７９４２)、 Synechococcus PCC ７００２、 Synechococcus PCC ７４１８(Aphanothece halophiti
ca)、 Synechocystis PCC ６８０３、 Synechocystis PCC ６７１４、 Spirulina platensis、 Anabaena PCC 7120(Nostoc PCC 7120)、 Nostoc PCC ７１１９(Anabaena PCC ７１１９）、 Calothrix PCC ７６０１など。

【００３２】前記の担体ＤＮＡによるこれら宿主ラン藻
細胞の形質転換はそれ場対既知の方法、例えば、R. D.
Porter［CRC Critical Reviews in Microbiology １３
（２）：１１１−１３２］、D. A.lightfootら［J. Gen
eral, Microbiology １３４：１５０９−１５１４（１
９８８）］、S. S. Goldenら[J. Bacteriol, １５８：
３６−４２（１９８４）］、H. Daniellら[Proc. Natl.
Acad. Sci. USA ８３：２５４６−２５５０（１９８
６）］、T. Matsunagaら［Appl. Biochem. Biotechnol.
２４／２５：１５１−１６０（１９９０）］などに従
つて行なうことができる。

【００３３】例えば、ｈＳＯＤ発現ベクターをアナキス
テイス・ニデユランスへD．A．Lightfootらの方法で導
入し形質転換することができる。得られる形質転換体は
アンピシリン耐性などにより選抜した後、イムノブロツ
テイング法、オクテロニー法、ポリアクリルアミドゲル中
でのＳＯＤ活性染色、ＳＯＤ活性の測定などにより、所
期の形質転換体が得られていることを確認することがで
きる。

【００３４】このようにして得られる形質転換体は、光
の照射下で宿主細胞の増殖に応じたそれ自体既知の培地
で培養することにより生理活性を有するポリペプチドの
発現を行わせることができる。培地は形質転換体が選択
的に増殖するための適当量の薬剤、例えばアンピシリン
などを含むことが好ましい。

【００３５】形質転換体宿主がアナキステイス・ニデユ
ランスの場合、培地としてはＢＧ−１１培地、ＭＤＭ培
地などが適しており、また、培養条件として、培養温度
は一般に１０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃が適し
ている。さらに培地のｐＨは通常７〜８の範囲内及び照
度は５００〜５０００ルクスの範囲内が適している。こ
のような条件下に培養は５〜２０日程度行なうことがで
きる。また、培養は静置又は撹拌下で行なうことができ
る。

【００３６】以上に述べた本発明の方法によれば、有用
ペプチドの発現効率が極めて高く、ラン藻細胞中に産生
される有用ペプチドの分離回収は、培養物からそれ自体
既知の方法で行なうことができる。例えば、培養液から
遠心分離で細胞を集め、破砕したのち、通常知られてい
る方法、例えば塩析、透析、イオン交換クロマトグラフ
イー、ゲルろ過クロマトグラフイー、クロマトフオーカ
ツシング、ハイドロフオービツクインターラクシヨンク
ロマトグラフイー、アフイニテイークロマトグラフイ
ー、電気泳動などの操作を適宜組合せることにより分離
・回収することができる。

【００３７】このようにして製造される生理活性を有す
るポリペプチドは、医薬品、医薬部外品、化粧料等に利
用することができる。

【００３８】また、光照射下で培養された形質転換ラン
藻は、培養後、遠心分離などで集められ、そのまま食料
・飼料・機能性食品として利用することもできる。

【００３９】なお、本発明における組換えＤＮＡに用い
られるＲｕＢｉｓＣＯプロモーターは、その下流に位置
する有用構造遺伝子の発現を光の制御下で大量に誘導す
ることができ、大腸菌のlac, tac, trp プロモーターな
どを用いて発現を誘導させる場合に通常用いられる高価
な薬剤を使用しなくてもよいなどの利点がある。

【００４０】以下、実施例により本発明をさらに具体的
に説明する。

【００４１】

【実施例１】Ｉ．発現調節領域の調製 （Ｉ−１） ｐＡＮＥ１８のクローニング ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩサイトにAnacystis nidulans
６３０１株のリブロース−１,５−ジリン酸カルボキシ
ラーゼ／オキシゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域を含
む５６００bpの断片が挿入されたｐＡＮＥ１８(K. Shin
ozakiら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８０：４０５０
−４０５４（１９８３））４０ng(1μl)を５０ｍＭ Ｃ
ａＣｌ₂処理したEscherichia coli ＨＢ１０１株の細胞
懸濁液１００μｌに加え、おだえかに混合した。混合液
を氷水中で３０分間インキユベートした後、さらに４２
℃で３分間インキユベートしてＤＮＡを細胞中にとりこ
ませた。この懸濁液に１mlのＬＢ medium（１０ｇ／ｌ
バクトトリプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出エキス、１０ｇ／
ｌ ＮａＣｌ）を加え、振盪しながら３７℃で１時間イ
ンキユベートした。この細胞懸濁液を１００μｌおよび
２００μｌとりＬＢ寒天培地（５０μｇ／mlアンピシリ
ン、１.５％寒天を含む）上にプレートした。このプレ
ートを３７℃で２４時間インキユベートし、コロニーを
単離した。単離したコロニーを２mlの２ＹＴ液体培地
（１６ｇ／ｌバクトトリプトン、１０ｇ／ｌ酵母抽出エ
キス、５ｇ／ｌ ＮａＣｌおよび５０μｇ／mlアンピシ
リンを含む）に白金耳で植え付け３７℃で一晩培養し
た。培養液を１mlとり２００mlの２ＹＴ液体培地（１０
０μｇ／mlアンピシリンを含む）に加え、３７℃で一晩
培養した。培養した細胞を８０００rpm、１０分間遠心
して集め、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法(B.
Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, ｐ
２７３〜２７６、John Wileyand Sons Inc. 刊）により
大量に調製した。

【００４２】（Ｉ−２） ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片の単
離（図１参照） 大量調製したｐＡＮＥ１８ＤＮＡ１０μｌ（１０μｇ）
と１０×Low buffer（１００ｍＭ Tris-HCl(ｐＨ７.
５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオスレイ
トール（ＤＴＴ））１０μｌ及びＳａｃＩ（宝酒造
（株）製）５０unitsに滅菌水を加えて１００μｌとし
たエツペンドルフチユーブ（１.５ml容）を３７℃で３
時間反応させた。反応後、１０×High buffer（５００
ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７.５）、１００ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）１５
μｌ、ＳｐｈＩ（宝酒造（株）製）５０units及び滅菌
水３０μｌを加えてさらに３７℃で３時間反応させた。
反応後、1/10容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.８）及
び２.５容のエタノールを加え、−２０℃で２時間以上
放置した。生じた沈殿を１５０００rpm、４℃で１０分
間遠心し、７０％エタノールで洗浄後、減圧乾固させ
た。残渣を５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、1/10
容の電気泳動用マーカー（０.２５％ブロモフエノール
ブルー、０.２５％キシレンシアノール、３０％グリセ
ロール）を加え、１.５％アガロースゲルにのせＴＡＥb
uffer（４０ｍＭ Tris-acetate、２ｍＭ ＥＤＴＡ）
で５０Ｖ、１.５時間電気泳動を行った。泳動後、ゲル
を０.５μｇ／mlのエチジウムブロマイド溶液（ＴＡＥ
中）に１５分間浸漬し、ＤＮＡの染色を行った。染色し
たゲルをトランスイルミネーター上にのせ、紫外線をあ
て目的とするＤＮＡを含むバンドを切り出した。目的の
ＤＮＡ断片（約１２００bp）を、ＤＮＡ精製用キツトGe
neciean（ＢＩＯ１０１社製）を用いて精製した。

【００４３】(Ｉ−３) ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片のｐＵ
Ｃ１８でのクローニング(図１参照) （１） ｐＵＣ１８のＳａｃＩ−ＳｐｈＩ消化 ｐＵＣ１８ＤＮＡ１０μｌ（１０μｇ）と１０×Low bu
ffer ５μｌ及びＳａｃＩ ５０unitsに滅菌水を加えて
５０μｌとしたエツペンドルフチユーブ（１.５ml容）
を３７℃で３時間反応させた。反応後、１０×High buf
fer７.５μｌ、ＳｐｈＩ ５０units及び滅菌水３７.５
μｌを加えてさらに３７℃で３時間反応させた。この反
応液に等容のフエノール：クロロホルム：イソアミルア
ルコール（２５：２４：１）を加え激しく撹拌したのち
１５０００rpm、４℃、で４時間遠心して水層を分取し
た。この水層に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４.８）および２.５容のエタノールを加え、ＤＮＡをエ
タノール沈殿させた。沈殿を１５０００rpm、４℃、１
０分間遠心して集め、７０％エタノールで洗浄し、減圧
乾固させた。残渣を２０μｌのＴＥに溶解し、次の実験
に使用した。

【００４４】（２） ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片（１２０
０ｂｐ）のｐＵＣ１８（ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ）への挿入
ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片ＤＮＡ０.１μｇ（２μｌ）お
よびｐＵＣ１８（ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ）０.５μｇ（１
μｌ）に２４μｌのTakara ＤＮＡ ligation Kit Ａ液
（宝酒造（株）社製）を加え、よく撹拌した。この溶液
に３μｌのTakara ＤＮＡ ligation Kit Ｂ液を加え
よく撹拌した後、１６℃で１時間インキユベートした。
反応後、この溶液をE. coli ＪＭ１０９株の形質転換に
使用した。

【００４５】（３） ｐＡＲｕｐ１８の大量調製 ligation溶液５μｌ（１００μｇ）に５０ｍＭ ＣａＣ
ｌ₂で処理したE. coliＪＭ１０９株の細胞懸濁液１００
μｌを加え、おだやかに混合した。混合液を氷水中で３
０分間インキユベートした後、さらに４２℃で２分間イ
ンキユベートしてＤＮＡを細胞中にとりこませた。この
懸濁液に１mlの２ＹＴ液体培地を加え、振盪しながら３
７℃で１時間インキユベートした。この細胞懸濁液を１
００および２００μｌとり２ＹＴ寒天培地（５０μｇ／
mlアンピシリン、４０mg／ｌ５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−チオガラクトシド（Ｘ−ga
l)、２３.８３ｍｇ／ｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノサイド(ＩＰＴＧ)および１.５％寒天を含
む）上にプレートした。このプレートを３７℃で２４時
間インキユベートし、得られた白いコロニーを新しい２
ＹＴ寒天培地（５０μｇ／mlアンピシリン、Ｘ−gal、
ＩＰＴＧ、１.５％寒天を含む）にスポツトして３７℃
で一晩培養することにより白いコロニーを単離した。

【００４６】単離した白いコロニーを２mlの２ＹＴ液体
培地（５０μｇ／mlアンピシリンを含む）に白金耳で植
え付け３７℃で一晩培養した。培養液を１mlとり１.５m
l容エツペンドルフチユーブに移し、１５０００rpm、３
０秒間遠心して細胞を集めた。集めた細胞を１５０μｌ
のＳＥＴ buffer（２０％シヨ糖、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁
し、５μｌのRNase溶液（１０mg／mlリボヌクレアーゼ
Ａ、０.１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.８）、０.３ｍＭ
ＥＤＴＡ）を加えポルテツクスミキサーで十分混合し
た。これに３５０μｌの溶菌液（１％ＳＤＳ、０.２Ｎ
ＮａＯＨ）を加え、チユーブを逆さにすることにより
おだやかに撹拌し、完全に溶菌させた。この溶菌液を氷
水中で１０分間インキユベートした後、２５０μｌの３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.８）を加え、十分混合し、
さらに氷水中に３０分間放置した。この混合液を１５０
００rpm、４℃で１０分間遠心してＳＤＳおよび染色体
ＤＮＡを沈殿させた。上清を別のエツペンドルフチユー
ブに移し、等量のイソプロピルアルコールを加えよく混
合し、１５０００rpm、４℃で７分間遠心してプラスミ
ドＤＮＡを沈殿として集めた。沈殿を滅菌水に溶解し、
一部を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII（ともに宝酒
造（株）社製）消化し、１.５％アガロースゲル電気泳
動を行い１２００ｂｐのＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片がｐＵ
Ｃ１８に挿入されていることを確認した。

【００４７】ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片がｐＵＣ１８に挿
入されていると確認されたコロニーを４００mlの２ＹＴ
液体培地（１００μｇ／mlアンピシリンを含む）に移
し、一晩培養した。培養した細胞を８０００rpm、４℃
で１０分間遠心して集め、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−
アルカリ法により大量に調製した。

【００４８】（Ｉ−４） ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片の
単離（図１参照） （１） ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄII断片の単離 大量調製したｐＡＲｕｐ１８ＤＮＡ溶液１０μｌ（１０
μｇ）と１０×Ｋ buffer（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８.５）、１００ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ
ＤＴＴ、１０００ｍＭ ＫＣｌ）２０μｌ及びＨｉｎｄ
III４０unitsに滅菌水を加えて２００μlとしたエツペ
ンドルフチユーブ（１.５ml容）を２０本用意し、３７
℃で３時間反応させた。反応後、フエノール−クロロホ
ルム処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿して集め１５５μ
lの滅菌水に溶解した。この溶解に５×ＥｃｏＲＩbuffe
r（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、３５
ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、３５ｍＭ
２−メルカプトエタノール、０.０５％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ))４０μｌとＥｃｏＲＩ ４０unitsを加え
２００μｌとしたエツペンドルフチユーブ（１.５ml
容）２０本を３７℃で３時間反応させた。反応後、同様
にフエノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿を行
いＤＮＡを回収した。目的のＤＮＡ断片（約１２００ｂ
ｐ）を１.５％アガロースゲル電気泳動により分離し、
ＤＮＡ−精製用キツトGenecleanを用いて精製した。 （２） ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片（約３５０ｂｐ）の
単離 精製したＤＮＡ断片４０μｇ（８６μｌ）に１０×Ｈｉ
ｇｈ buffer １０μｌとＰｓｔＩ（宝酒造（株）社
製）４８unitsを加え、１００μｌとしたエツペンドル
フチユーブ（１.５ml容）を３７℃で３時間反応させ
た。反応後、１.５％アガロースゲル電気泳動を行い目
的のＤＮＡ断片（約３５０ｂｐ）を分離した。ＤＮＡを
ゲルから電気的に溶出し、核酸精製用カートリツジNens
orb２０（Dupond社製)を用いて精製した。(Ｉ−５） ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIII断片の合成 （１） オリゴヌクレオチドの合成および精製 Shine Dalgarno（Ｓ／Ｄ）配列を含む発現調節領域の合
成のために１０個のオリゴヌクレオチド（図２参照）を
ＤＮＡシンセサイザー３８０Ａ（アプライド・バイオシ
ステムズ・ジヤパン社製）を用いてホスホアミダイト法
により合成を行った。合成が終了したシリカゲルカラム
に２mlのアンモニア水（２７％以上）を０.５mlずつ１
５分おきに加え、オリゴヌクレオチドをシリカ支持体よ
り切り出しバイアルに捕集した。このバイアルにさらに
１mlのアンモニア水を加え、キヤツプおよびパラフイル
ム等によりシールして５５℃で８時間以上加温し、塩基
部分の保護基（アシル基）をはずした。恒温槽よりバイ
アルを取り出し室温に戻した後、キヤツプをはずして減
圧下で濃縮乾固した。乾固後、残渣を２００μｌの０.
０１Ｍトリエチルアミン−酢酸溶液（ＴＥＡＡ、ｐＨ
７.５）に溶解し、ＡＭ−３１３−０ＤＳ（山村化学研
究所製）カラムを用いてＨＰＬＣでアセトニトリル、
０.１M ＴＥＡＡの濃度勾配による溶出を行いメインピ
ークを分取した。分取したピークを減圧下で濃縮乾固し
た後、８０％酢酸（アセトニトリル溶液）１００μｌを
加え、混合して室温に３０分間放置することにより、
５’未満のジメチルトリチル（ＤＭＴｒ）基をはずし、
ＯＨ基に変換した。３０分経過後、迅速に乾固し、残渣
を０.０１M ＴＥＡＡ（ｐＨ７.５）２００μｌに溶解
し、等容のジエチルエーテルを加え、ＤＭＴｒ基を抽出
除去した。この溶液を減圧下で濃縮乾固した後、１１０
μｌの０.０１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７.５）に溶解し、再
びＨＰＬＣを用いて、分取、精製を行った。分取したオ
リゴヌクレオチドを含む溶液を減圧下で乾固した後、Ｔ
Ｅに溶解し、次の実験に使用した。

【００４９】（２） 合成オリゴヌクレオチドのキナー
ゼによるリン酸化 精製したオリゴヌクレオチド４μｇをKinase buffer
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭＤＴＴ、
０.１ｍＭスペルミジン、１.７μＭ ＡＴＰ）１２０μ
ｌに混合し、Ｔ₄ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造
（株）社製）９unitsを添加し、３７℃で１５分間イン
キユベートした。次にＡＴＰを終濃度１ｍＭになるよう
に加え、再度Ｔ₄ポリヌクレオチドキナーゼ９unitsを添
加し、３７℃で２５分間インキユベートした。反応後、
９０℃、５分間熱処理した酵素を失活させた。リン酸化
したオリゴヌクレオチドを核酸精製用カートリツジNens
orb２０を用いて精製した。

【００５０】（３） ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIII断片の作
製 ４つの塩基数をかえたＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIII断片をＴ₄
ＤＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチドの直結によつ
て行った（図３参照)。ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIII断片を構
成するオリゴヌクレオチドのうち下段のストランドの
５’未満に位置するオリゴヌクレオチド１.５μｇ、そ
の他のオリゴヌクレオチド１μｇに５×ligation buffe
r（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ₂）２０μｌと滅菌水を加えて８０μｌ
とした。この溶液を９０℃、５分間加熱した後、２時間
かけて４℃まで徐冷し、１００ｍＭ ＤＴＴと１０ｍＭ
ＡＴＰを１０μｌずつ加え、さらにＴ₄ ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造（株）社製）２.５unitsを添加して４℃で
１５時間インキユベートした。反応液を等容のフエノー
ル−クロロホルムで処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿し
て回収し次の実験に用いた。

【００５１】（Ｉ−６） ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断
片の作成（図４参照） （１） ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片（プロモーター領
域）とＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIII断片の直結 前記（Ｉ−４）で単離したＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片
１.０μｇに塩基数の異なる４つのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄI
II断片それぞれ０.５μｇを５μｌの０.３M ＮａＣｌ
に混合し、さらにTakara ligation kit Ｂ液 ５μｌを
加えよく混合した。この溶液を２６℃で１時間以上イン
キユベートした。反応後、溶液をフエノール−クロロホ
ルム処理し、常法どうりエタノール沈殿してＤＮＡを回
収した。

【００５２】（２） ligation反応物のＨｉｎｄIII−
ＥｃｏＲＩ消化 回収したＤＮＡ残渣を１４.５μｌの滅菌水に溶解し、
５×ＨｉｎｄIII buffer（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７.５）、３５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、３００ｍＭ
ＮａＣｌ）４μｌおよびＨｉｎｄIII １２units（１.
５μｌ）を加え、３７℃で１.５時間反応させた。反応
後、さらに５×ＥｃｏＲＩ buffer ４μｌ、ＥｃｏＲ
Ｉ １２units（１.０μｌ）および滅菌水５μｌを加え
３７℃で１.５時間反応させた。反応液を等量のフエノ
ール−クロロホルムで処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿
して回収した。

【００５３】（Ｉ−７） 塩基数の異なる４つの発現調
節領域ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片のｐＵＣ１８によ
るクローニング（図４参照） （１） ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII消化 ｐＵＣ１８ ２５μｇと１０×Ｋ buffer（２００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）、１００ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＫＣｌ）１０
μｌ及びＨｉｎｄIII ６４units（８μｌ）に滅菌水を
加えて１００μｌとしたエツペンドルフチユーブ（１.
５ml容)を３７℃で３時間反応させた。この反応液を等
容のフエノール−クロロホルムで処理し、エタノール沈
殿によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡ残渣を７５μｌの滅
菌水に溶解し、５×ＥｃｏＲＩ buffer ２０μｌ及び
ＥｃｏＲＩ ６０units（５μｌ）を加え、３７℃で３
時間反応させた。反応後、同様にフエノール−クロロホ
ルム処理、エタノール沈殿を行った。回収したＤＮＡは
ＴＥに０.２５μｇ／μｌになるように溶解し、次の実
験に用いた。

【００５４】（２） ４つの発現調節領域ＥｃｏＲＩ−
ＨｉｎｄIII断片のｐＵＣ１８（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄI
II）への挿入 ４つのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片をそれぞれ６０ｎ
ｇ（１μｌ）とｐＵＣ１８（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄII
I）５００ｎｇ（２μｌ）ずつをそれぞれエツペンドル
フチユーブに入れ、Takara ligation kit Ａ液２４μｌ
を加えよく混合した。これらの混合液に、さらにTakara
ligation kit Ｂ液３μｌを加え、混合した後、１６
℃で２時間以上反応させた。この溶液を次の実験に用い
た。

【００５５】（３） ｐＡＲｕｐ１、２、３および４の
大量調製 ligation溶液３μｌ（５６ｎｇ）に５０ｍＭ ＣａＣｌ
₂で処理したE. coliＪＭ１０９株の細胞懸濁液１００μ
ｌを加え、おだやかに混合した。混合液を氷水中で３０
分間インキユベートした後、さらに４２℃で２分間イン
キユベートしてＤＮＡを細胞中に取りこませた。この懸
濁液に１mlの２ＹＴ液体培地を加え、３７℃、１時間の
振盪培養後、２ＹＴ寒天培地（５０μｇ／mlアンピシリ
ン、４０mg/l Ｘ−gal、２３.８３mg／l ＩＰＴＧおよ
び１.５％寒天を含む）にプレーテした。得られた白い
コロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地図を解析
することによつて目的のプラスミドｐＡＲｕｐ１、２、
３および４）を保持しているコロニーをスクリーニング
した。

【００５６】プラスミドｐＡＲｕｐ１、２、３および４
を保持しているそれぞれのコロニーを２００mlの２ＹＴ
液体培地（１００μｇ／mlアンピシリンを含む）で培養
し、それぞれのプラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法
により大量に調製した。

【００５７】（Ｉ−８） ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断
片の単離 大量調製したプラスミドＤＮＡ（ｐＡＲｕｐ１、２、３
および４）を２０μｇ（２０μｌ）とり、１０×Ｋ bu
ffer ２０μｌ、 ＨｉｎｄIII １２０units（１５μ
ｌ）および滅菌水を加えて２００μｌとしたエツペンド
ルフチユーブを各々のプラスミドで６チユーブずつ用意
した。これらのチユーブを３７℃で３時間インキユベー
トした。反応後、フエノール−クロロホルム処理し、Ｄ
ＮＡをエタノール沈殿して集め、それぞれ１５０μｌの
滅菌水に溶解した。これらのＤＮＡ溶液にそれぞれ５×
ＥｃｏＲＩ buffer ４０μｌ及びＥｃｏＲＩ １２０
units（１０μｌ）を加え３７℃で３時間インキユベー
トした。反応後、ＤＮＡをエタノール沈殿して回収し
た。目的のそれぞれのＤＮＡ断片を１.５％アガロース
ゲル電気泳動により分離した。ＤＮＡをゲルから電気的
に溶出し、核酸精製用カートリツジNensorb２０を用い
て精製した（ＡＲｕｐ１、２、３および４）。

【００５８】II．転写終止（ターミネーター）領域の調
製（図５参照） （II−１） ｐＡＮＰ１１５５のクローニング ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩサイトにAnacystis nidulans
６３０１株のリブロース−１,５−ジリン酸カルボキシ
ラーゼ／オキシゲナーゼ遺伝子のターミネーター領域を
含む約１５００ｂｐの断片が挿入されたｐＡＮＰ１１５
５（K. Shinozakiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８
０：４０５０−４０５４（１９８３））５００ｎｇ
（０.５μｌ）を５０ｍＭ ＣａＣｌ₂処理したE. coli
ＪＭ１０９株の細胞懸濁液１００μｌに加え、おだやか
に混合した。混合液を氷水中で３０分間インキユベート
した後、さらに４２℃で２分間インキユベートしてＤＮ
Ａを細胞中に取りこませた。この懸濁液に１mlのＬＢ液
体培地を加え、３７℃、１時間の振盪培養後、ＬＢ寒天
培地（１２.５μｇ／mlテトラサイクリンおよび１.５％
寒天を含む）にプレートし、コロニーを単離した。

【００５９】単離したコロニーを２.８リットルの２Ｙ
Ｔ液体培地（２５μｇ／mlテトラサイクリンを含む）で
培養し、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法により
大量に調製した。

【００６０】（II−２） Ｅｃｏ５２Ｉ−ＰｓｔＩ断片
の調製 （１） ＰｓｔＩ断片の単離 大量調製したｐＡＮＰ１１５５ＤＮＡ２０μｇ（２０μ
ｌ）と１０×Highbuffer ２０μｌ、ＰｓｔＩ １２０
units（１０μｌ）に滅菌水を加えて２００μｌとした
エツペンドルフチユーブ（１.５ml容）６本用意し、３
７℃で３時間インキユベートした。反応後、ＤＮＡをエ
タノール沈殿して回収し、目的のＤＮＡ断片（約１５０
０ｂｐ）を１.５％アガロースゲル電気泳動により分離
した。分離したＤＮＡをGenecleanにより精製し、次の
実験に用いた。

【００６１】（２） ＰｓｔＩ断片のＥｃｏ５２Ｉ消化 ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液６４.５μｌ（約１０μｇ）
に１０×Ｅｃｏ５２Ｉbuffer（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ９.０、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０.１％ ＢＳＡ）７.５μｌ及びＥｃｏ
５２Ｉ（東洋紡績（株）社製）１８units（３μｌ）を
加え３７℃で３時間インキユベートした。インキユベー
ト後、フエノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿
してＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを８μｌの滅菌
水に溶解した。

【００６２】（II−３） ｐＡＲｕｔ１３の作製 （１） Ｅｃｏ５２Ｉ−ＰｓｔＩ断片の平滑末端化 II−２で調製したＥｃｏ５２Ｉ−ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ
溶液８μｌにＤＮＡBlunting Kit（宝酒造（株）社製）
の×１０ buffer １μｌを加え、７０℃で５分間イン
キユベートした後、３７℃の恒温槽に移した。この溶液
にＤＮＡ Blunting KitのＴ₄ＤＮＡ polymerase １
μｌを加え、ピペツテイングによりやだやかに混和し、
３７℃で５分間反応させた。反応後、この溶液にＤＮＡ
Blunting Kit のＤＮＡ dilution buffer ４０μｌを
加え、ボルテツクスで激しく撹拌することにより酵素を
失活させた。

【００６３】（２） ｐＵＣ１３のＳｍａＩ消化および
脱リン酸化 ｐＵＣ１３ ＤＮＡ ２０μｇ（２０μｌ）に５×Ｓｍ
ａＩ buffer（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.
０）、３５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＫＣｌ、３
５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０.０５％ ＢＳ
Ａ）４０μｌ、ＳｍａＩ（宝酒造（株）社製）８０unit
s（１０μｌ）および滅菌水１３０μｌを加え、３０℃
で４時間反応させた。反応後、フエノール−クロロホル
ム処理、エタノール沈殿をしてＤＮＡを回収した。回収
したＤＮＡを１００μｌの０.１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８.０）に溶解し、１０μｌのアルカリフオスフ
アターゼ溶液（１.０unitsアルカリフオスフアターゼ
（ＡＰ、宝酒造（株）社製）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７.５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｚ
ｎＳＯ₄）を加え、３７℃で２時間反応させた。反応
後、さらに１０μｌのアルカリフオスフアターゼ溶液を
加え６５℃で３０分間インキユベートした。反応液をフ
エノール−クロロホルム処理し、ＤＮＡをエタノール沈
殿して集め０.５μｇ／μｌになるようにＴＥに溶解し
た。

【００６４】（３）平滑化断片のｐＵＣ１３（Ｓｍａ
Ｉ、ＡＰ）への挿入 平滑末端化断片のＤＮＡ溶液２μｌ（約１００ｎｇ）と
ＳｍａＩ、アルカリフオスフアターゼ処理したｐＵＣ１
３のＤＮＡ溶液２μｌ（１.０μｇ）にTakaraligation
kit Ａ液３２μｌを加え、よく撹拌した。この溶液にT
akara ligation kit Ｂ液４μｌを加えよく撹拌した
後、１６℃で１時間以上インキユベートした。反応後、
この溶液をE. coli ＪＭ１０９株の形質転換に使用し
た。

【００６５】（ＩＩ−４） ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断
片の調製 （１） ｐＡＲｕｔ１３の大量調製 ligation溶液１μｌ（約４０ｎｇ）に５０ｍＭ ＣａＣ
ｌ₂で処理したE. coliＪＭ１０９株の細胞懸濁液１００
μｌを加え、おだやかに混合した。混合液を氷水中で３
０分間インキユベートした後、さらに４２℃で２分間イ
ンキユベートしてＤＮＡを細胞中に取りこませた。この
懸濁液に１mlの２ＹＴ液体培地を加え、３７℃、１時間
の振盪培養後、２ＹＴ寒天培地（５０μｇ／mlアンピシ
リン、４０mg／l Ｘ−gal、２３.８３mg／l ＩＰＴＧ
および１.５％寒天を含む）にプレートした。得られた
白いコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地図を
解析することによつて目的のプラスミドｐＡＲｕｔ１３
を保持しているコロニーをスクリーニングした。スクリ
ーニングしたコロニーを４００mlの２ＹＴ液体培地（１
００μｇ／mlアンピシリンを含む）で培養し、プラスミ
ドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法により大量に調整した。

【００６６】（２） ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片の単
離 大量調製したプラスミドＤＮＡ（ｐＡＲｕｔ１３）１５
μｇ（１５μｌ）に１０×Ｋ buffer ２０μｌ、Ｂａ
ｍＨＩ（宝酒造（株）社製）１２０units（１０μｌ）
及び滅菌水を加えて２００μｌとしたエツペンドルフチ
ユーブ（１.５ml容）を８本用意した。これらのチユー
ブを３０℃で３時間インキユベートした。反応後、フエ
ノール−クロロホルム処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿
して集め、それぞれ１１０μｌの滅菌水に溶解した。こ
れらのＤＮＡ溶液に５×ＥｃｏＲＩ buffer ３０μｌ
及びＥｃｏＲＩ １２０units（１０μｌ）を加え、３
７℃で３時間インキユベートした。反応後、ＤＮＡをエ
タノール沈殿して回収し、目的のＤＮＡ断片（約３００
ｂｐ）を１.５％アガロースゲル電気泳動により分離し
た。ゲルからＤＮＡを電気的に溶出し、核酸精製用カー
トリツジNensorb２０を用いて精製した。

【００６７】III．ｈオペロンの造成 （III−１）ｈ遺伝子への転写終止領域の連結（図５参
照） （１） ｐＵＣ１３−ｈ−ＳＯＤのＢａｍＨＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ消化 ｐＵＣ１３のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩサイトにヒト−
スーパーオキシド・ジスムターゼをコードする完全鎖長
ＤＮＡ断片（４７５ｂｐ）が挿入されたｐＵＣ１３−ｈ
−ＳＯＤ（特願平１−２１０１２９号特許出願明細書の
実施例１参照）１０μｇ（２０μｌ）に５×ＥｃｏＲＩ
buffer ４０μｌ、ＥｃｏＲＩ １２０units（１０
μｌ）及び滅菌水を加えて２００μｌとしたエツペンド
ルフチユーブを３７℃で３時間インキユベートした。反
応後、フエノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿
してＤＮＡを集め、２１５μｌの滅菌水に溶解した。こ
の溶液に１０×Ｋ buffer ２５μｌ及びＢａｍＨＩ
１００units（１０μｌ）を加え、３０℃で３時間反応
させた。反応後、ＤＮＡをGenecleanを用いて精製した。 （２） 転写終止領域(ＢａｍＨＩ-ＥｃｏＲＩ)のｐＵ
Ｃ１３−ｈ−ＳＯＤ（ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ）への挿
入 ｐＵＣ１３−ｈ−ＳＯＤ（ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ）Ｄ
ＮＡ５００ng（１μｌ）とIIで調製した転写終止領域６
０ng(０.４μｌ）にTakara ligation kit Ａ液１１.２
μｌを加え、よく混合した。この溶液にTakara ligati
on kitＢ液１.４μｌを加えよく撹拌した後、１６℃で
３０分間インキユベートした。反応後、この溶液をE. c
oli ＪＭ１０９株の形質転換に使用した。

【００６８】（III−２） ＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ
（ｈＳＯＤ−terminater)断片の調製 （１） ｐＵＣ１３−ｈＳＯＤｔの大量調製 ligation溶液２μｌ（約７０ng）に５０ｍＭ ＣａＣｌ
₂で処理したE. coliＪＭ１０９株の細胞懸濁液１００μ
ｌを加え、おだやかに混合した。この混合液を氷水中で
３０分間インキユベートした後、さらに４２℃で２分間
インキユベートしてＤＮＡを細胞中に取りこませた。こ
の懸濁液に１mlの２ＹＴ液体培地を加え、３７℃、１時
間の振盪培養後、２ＹＴ寒天培地（５０μｇ／mlアンピ
シリン、４０mg／l Ｘ−gal、２３.８３mg／l ＩＰＴ
Ｇおよび１.５％寒天を含む）にプレートした。得られ
た白いコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地図
を解析することにより目的のＤＮＡ断片を保持している
コロニーをスクリーニングした。スクリーニングしたコ
ロニーを６０mlの２ＹＴ液体培地（１００μｇ／mlアン
ピシリンを含む）で培養し、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ
−アルカリ法により調製した。

【００６９】（２） ＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ断片の
単離 調製したｐＵＣ１３−ｈＳＯＤｔ ＤＮＡ溶液５０μｌ
（２５μｇ）に１０×Ｋ buffer ２０μｌ、Ｈｉｎｄ
III １２０units（１５μｌ）及び滅菌水を加え、２０
０μｌとしたエツペンドルフチユーブ（１.５ml容）を
２本用意した。これらのチユーブを３７℃で３時間イン
キユベートした。反応後、フエノール−クロロホルム処
理し、ＤＮＡをエタノール沈殿して集め、それぞれ１５
０μｌの滅菌水に溶解した。これらのＤＮＡ溶液に５×
ＥｃｏＲＩ buffer ４０μｌ及びＥｃｏＲＩ １２０
units（１０μｌ）を加え、３７℃で３時間インキユベ
ートした。反応後、ＤＮＡをエタノール沈殿して回収
し、目的のＤＮＡ断片（約７９０ｂｐ）を１.５％アガ
ロースゲル電気泳動により分離した。ＤＮＡをGeneclea
nによつて精製した。（III−３） ＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ（ｈＳＯＤ−te
rminater)断片と発現調 節 領域ＡＲｕｐ１、２、３および４）の連結（図６参照） 発現調節領域（ＡＲｕｐ１、２、３および４）１.１２
μｇ（２.１μｌ）とＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ断片２.
１１μｇ（２.２μｌ）に５×ligation buffer（２５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂）４μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ２μｌ、１０
ｍＭ ＡＴＰ２μｌ、Ｔ₄ＤＮＡ ligase（宝酒造
（株）社製）２.５units（１μｌ）及び滅菌水を加えて
２０μｌとしたエツペンドルフチユーブをそれぞれ用意
した。これらのチユーブを１５℃で一晩インキユベート
した後、６０℃で１０分間熱処理して反応を止めた。こ
れらの溶液にそれぞれ５×ＥｃｏＲＩ buffer １０μ
ｌ、ＥｃｏＲＩ １２units（１μｌ）及び滅菌水を加
え５０μｌとした。これらの溶液を３７℃で３時間イン
キユベートした。反応後、目的のそれぞれのＤＮＡ断片
（図７参照それぞれ約１２００ｂｐ）を２％アガロース
ゲル電気泳動によつて分離し、Genecleanを用いて精製
した。

【００７０】（III−４） ４つのｈＳＯＤ遺伝子発現
用ＤＮＡ断片のクローニング （１） ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ消化、アルカリフオス
フアターゼ処理 プラスミドｐＵＣ１８ＤＮＡ２０μｇ（３０μｌ）に５
×ＥｃｏＲＩ buffer４０μｌ、ＥｃｏＲＩ １２０un
its（１０μｌ）に滅菌水を加えて２００μｌとしたエ
ツペンドルフチユーブを３７℃で３時間インキユベート
した。反応後、フエノール−クロロホルム処理、エタノ
ール沈殿してＤＮＡを集め、１００μｌの０.１M Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に溶解した。この溶液に１
０μｌのアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、３７℃
で１時間インキユベートした。反応後、さらに１０μｌ
のアルカリフオスフアターゼ溶液を加え６５℃で３０分
間インキユベートした。反応液をフエノール−クロロホ
ルム処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿して集め０.１６
μｇ／μｌになるようにＴＥに溶解した。

【００７１】（２） ｈＳＯＤオペロン断片のｐＵＣ１
８（ＥｃｏＲＩ、ＡＰ処理）への挿入ｈＳＯＤオペロン
（Promoter-ＳＯＤ−terminater１、２、３および４）
ＤＮＡ１００ng(１μｌ）とＥｃｏＲＩ、アルカリフオ
スフアターゼ処理したｐＵＣ１８ＤＮＡ３２０ng（２μ
ｌ）にTakara ligation kit Ａ液２４μｌをそれぞれ
加え、よく撹拌した。これらの溶液にTakara ligation
kit Ｂ液３μｌずつ加え、よく撹拌した後、１℃で一
晩インキユベートした。

【００７２】（３） ｐＵＣ１８−Ｒｕｐｔ−ｈＳＯＤ
１、２、３及び４の大量調製 各々のligation溶液４μｌ（約５０ng）に５０ｍＭ Ｃ
ａＣｌ₂で処理したE.coli ＪＭ１０９株の細胞懸濁液
２００μｌずつ加え、おだやかに混合した。これらの混
合液を氷水中で３０分間インキユベートした後、さらに
４２℃で２分間インキユベートしてＤＮＡを細胞中に取
りこませた。これら懸濁液に１mlの２ＹＴ液体培地を各
々加え、３７℃、１時間の振盪培養後、２ＹＴ寒天培地
（５０μｇ／mlアンピシリン、４０mg／ml Ｘ−ｇａ
ｌ、２３.８３mg／ｌ ＩＰＴＧおよび１.５％寒天を含
む）にプレートした。得られた白いコロニーからプラス
ミドを調製し、制限酵素地図を解析することにより目的
の各々のプラスミド（ｐＵＣ１８−Ｒｕｐｔ−ｈＳＯＤ
１、２、３及び４を保持しているコロニーをスクリーニ
ングした。スクリーニングした各々のコロニーを２００
mlの２ＹＴ液体培地（１００μｇ／mlアンピシリンを含
む）で培養し、各々のプラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アル
カリ法により大量に調製した。

【００７３】（４） ＥｃｏＲＩ断片（約１２００ｂ
ｐ）の単離 大量調製したプラスミド（ｐＵＣ１８−Ｒｕｐｔ−ｈＳ
ＯＤ１、２、３及び４）ＤＮＡ約２０μｇ（２０μｌ）
に５×ＥｃｏＲＩ buffer ４０μｌ、ＥｃｏＲＩ １
２０units（１０μｌ）及び滅菌水１３０μｌを加え２
００μｌとしたエツペンドルフチユーブを各々のプラス
ミドで３本ずつ用意した。これらのチユーブを３７℃で
３時間インキユベートした。反応後、ＤＮＡをエタノー
ル沈殿して集め、各々のプラスミドごとに１００μｌの
ＴＥに溶解した。目的の各々のＤＮＡ断片（約１２００
ｂｐ）を１.５％アガロースゲル電気泳動によつて分離
し、Genecleanを用いて精製した。

【００７４】ＩＶ．ラン藻用ｈＳＯＤ遺伝子発現ベクタ
ーの造成（図８参照）（IV−１） ｐＢＲ３２２へのマルチクローニングサイ
ト（ｐＵＣ１８由来）の導入 （１） ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII消
化、アルカリフオスフアターゼ処理 ｐＢＲ３２２ＤＮＡ溶液２０μｌ（１０μｇ）に５×Ｈ
ｉｎｄIII buffer（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７.５）、３５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、３００ｍＭＮａＣ
ｌ）４０μｌ、ＨｉｎｄIII ８０units（１０μｌ）及
び滅菌水１３０μｌを加え、３７℃で２時間インキユベ
ートした。反応後、この溶液に５×ＥｃｏＲＩ buffer
４０μｌ、ＥｃｏＲＩ １２０units（１０μｌ）及
び滅菌水５０μｌを加え、さらに３７℃で２時間反応さ
せた。反応後、フエノール−クロロホルム処理、エタノ
ール沈殿してＤＮＡを集め、１００μｌの０.１M Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に溶解した。この溶液に１
０μｌのアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、３７℃
で１時間インキユベートした。反応後、１０μｌのアル
カリフオスフアターゼ溶液を加え、さらに６５℃で３０
分間インキユベートした。この溶液をフエノール−クロ
ロホルム処理し、エタノール沈殿してＤＮＡを回収し
た。

【００７５】（２） ｐＵＣ１８からマルチクローニン
グサイト（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII）の単離 ｐＵＣ１８ＤＮＡ溶液３０μｌ（２０μｇ）に１０×Ｋ
buffer ２０μｌ、ＨｉｎｄIII ８０units（１０μ
ｌ）及び滅菌水１４０μｌを加えたエツペンドルフチユ
ーブ２本用意し、３７℃で３時間インキユベートした。
反応後、フエノール−クロロホルム処理し、エタノール
沈殿してＤＮＡ集め、１１２.５μｌの滅菌水に溶解し
た。これらの溶液に５×ＥｃｏＲＩ buffer ３０μ
ｌ、ＥｃｏＲＩ ９０units（７.５μｌ）を加え、３７
℃で３時間インキユベートした。ＤＮＡをエタノール沈
殿して回収し、１.５％アガロースゲル電気泳動を行い
目的のＤＮＡ断片（約５０ｂｐ）を分離した。ＤＮＡを
ゲルから電気的に溶出し、フエノール−クロロホルム処
理、エタノール沈殿して精製した。

【００７６】（３） ｐＢＲ３２２（ＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄIII消化）とマルチクローニングサイトの連結 ｐＢＲ３２２（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII、ＡＰ処理）
ＤＮＡ０.２μｇ（１μｌ）とマルチクローニングサイ
トＤＮＡ０.２μｇ（１μｌ）にＴＥ１μｌ、Takara l
igation kit Ａ液２４μｌを加え、よく撹拌した。こ
の溶液にTakaraligationkit Ｂ液３μｌを加え１６℃
で４時間インキユベートした。

【００７７】（４） プラスミド ｐＢＲ３２２Ｍのク
ローニング ligation溶液３μｌ（４０ng）に５０ｍＭ ＣａＣｌ₂
処理したE．coli ＨＢ１０１の細胞懸濁液２００μｌ
を加え、おだやかに混合した。この混合液を氷水中で３
０分間インキユベートした後、さらに４２℃で２分間イ
ンキユベートしてＤＮＡを細胞中にとりこませた。この
懸濁液に１.８mlの２ＹＴ液体培地を加え、３７℃で１
時間の振盪培養後、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／mlアンピ
シリンを含む）にプレートした。得られたコロニーから
プラスミドを調製し、制限酵素地図を解析することによ
り目的のプラスミド（ｐＢＲ３２２Ｍ）を保持している
コロニーをスクリーニングした。スクリーニングしたコ
ロニーを２００mlの２ＹＴ液体培地（１００μｇ／mlア
ンピシリンを含む）で培養し、プラスミドＤＮＡをＳＤ
Ｓ−アルカリ法により大量に調製した。

【００７８】（ＩＶ−２） ＰｖｕII−Ｅｃｏ４７III
断片（２５５０ｂｐ）の単離 前記（ＩＶ−１）を調製したＢＲ３２２ＭプラスミドＤ
ＮＡ１０μｇ（１０μｌ）に１０×Ｍ buffer（１００
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１００ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、５００ｍＭ ＮａＣ
ｌ）２０μｌ、ＰｖｕII（宝酒造（株）社製）１２０un
its（１０μｌ）および滅菌水を加え２００μｌとした
エツペンドルフチユーブ３本用意した。これらのチユー
ブを３７℃で３時間インキユベートした。反応後、フエ
ノール−クロロホルム処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿
して集め、１７４μｌの滅菌水にそれぞれ溶解した。こ
れらの溶液に１０×Ｈ buffer ２０μｌおよびＥｃｏ
４７III（宝酒造（株）社製）２４unitsずつ加え、３７
℃で３時間インキユベートした。ＤＮＡをエタノール沈
殿し回収し、目的のＤＮＡ断片（２５５０ｂｐ）を１.
５％アガロースゲル電気泳動により分離した。分離した
ＤＮＡ断片はGenecleanを用いて精製し、５０μｌの０.
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）溶液とした。こ
の溶液に５μｌのアルカリフオスフアターゼ溶液を加
え、３７℃で１時間インキユベートした。反応後、５μ
ｌのアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、６５℃で３
０分間さらにインキユベートした。反応後、フエノール
−クロロホルム処理し、エタノール沈殿してＤＮＡを集
め、２０μｌのＴＥに溶解した。

【００７９】（ＩＶ−３） ｐＢＡＳ１８のA．nidulan
sにおける複製開始点の分離 ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩサイトにA．nidulans６３０
１株の内在性プラスミド（ｐＢＡ１、ＢａｍＨＩ消化）
を挿入した大腸菌とA．nidulansとの間のシヤトルベク
ターｐＢＡＳ１８(k. Shinozakiら、 Gene, １９：２２
１−２２４（１９８２））をE．coli ＨＢ１０１に導
入し、ＬＢ液体培地（５０μｇ／mlアンピシリンを含
む）で培養し、ＳＤＳ−アルカリ法を用いて大量に調製
した。

【００８０】調製したｐＢＡＳ１８ＤＮＡ１４μｇ（２
０μｌ）に１０×Ｋ buffer ２０μｌ、ＢａｍＨＩ
１００units（１０μｌ）および滅菌水を加えて２００
μｌとしたエツペンドルフチユーブ３本用意し、３０℃
で３時間インキユベートした。反応後、ＤＮＡをエタノ
ール沈殿して回収し、目的のＤＮＡ断片（ｐＢＡ１、約
８.０ｋｂｐ）を１％アガロースゲル電気泳動を行い分
離し、Genecleanにより精製した。

【００８１】分離・精製したｐＢＡ１（ＢａｍＨＩ消
化）ＤＮＡ２μｇ（５μｌ）に１０×Ｋ buffer ５μ
ｌ、ＸｈｏＩ ２４units（２μｌ）および滅菌水３８
μｌを加え、３７℃で３時間インキユベートした。反応
後、フエノール−クロロホルム処理し、エタノール沈殿
してＤＮＡを集めた。得られたｐＢＡ１のＢａｍＨＩ−
ＸｈｏＩ消化ＤＮＡの両末端をTakaraligation kitを
用いて平滑末端化した。

【００８２】（ＩＶ−４） 小型化E．coli−A．nidula
nsシヤトルベクターｐＢＡＸ１８（６.９ｋｂｐ）の造
成 （１） ｐＢＡＸ１８（約６.９ｋｂ）の作成 平滑末端化ＤＮＡ４０ng（２μｌ）とＰｖｕII−Ｅｃｏ
４７III断片のＤＮＡ２００ng（４μｌ）にTakara lig
ation kit Ａ液４８μｌを加え、よく撹拌した後、Ｂ
液６μｌを加え、１６℃で４時間インキユベートした。
この溶液を用いE．coliＨＢ１０１株を形質転換し、Ｌ
Ｂ寒天培地（５０μｇ／mlアンピシリン、１.５％寒天
を含む）にプレートしてコロニーを得た。得られたコロ
ニーからプラスミドを調製し、制限酵素地図を解析する
ことにより目的のプラスミドｐＢＡＸ１８を保持するコ
ロニーをスクリーニングした。スクリーニングしたコロ
ニーを４５mlの２ＹＴ液体培地（１００μｇ／mlのアン
ピシリンを含む）で培養し、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ
−アルカリ法により調製した。

【００８３】（２） ｐＢＡＸ１９（約６.４ｋｂ）の
作成 上記（１）で調製したｐＢＡＸ１８ＤＮＡ溶液５μｌ
（２.５μｇ）に１０×Ｍ buffer ５μｌ、ＰｖｕII
（宝酒造（株）社製）２.５μｌ（３０units）及び滅菌
水３７.５μｌを加え、３７℃で３時間インキユベート
した。この反応液２μｌ（１００ng ＤＮＡ）にＴＥ２
μｌ及びTakara ligation Ａ液１６μｌを加えよく撹
拌した後、Takara ligation kit Ｂ液４μｌを加
え、１６℃で１０分間インキユベートしたるこの溶液を
用いE．coli ＨＢ１０１株を形質転換し、ＬＢ寒天培
地（５０μｇ／mlアンピシリン、１.５％寒天を含む）
にプレートしてコロニーを得た。得られたコロニーから
プラスミド（ｐＢＡＸ１９）を保持しているコロニーを
スクリーニングした。スクリーニングしたコロニーを２
００mlの２ＹＴ液体培地（１００μｇ／mlアンピシリン
を含む）で培養し、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカ
リ法により大量に調製した。

【００８４】（３） ｐＢＡＸ２０（約５.８ｋｂ）の
作成 前記（ＩＶ−３）で調製したＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ（平
滑末端化）ＤＮＡ断片１μｇ（４μｌ）に１０×Ｍ bu
ffer ２μｌ、ＰｖｕII １μｌ（１２units）及び滅
菌水１３μｌ）を加え、３７℃で３時間インキユベート
した。この反応液２μｌ（１００ng）に（２）で調製し
たＰｖｕII−Ｅｃｏ４７ＤＮＡ断片１００ng（２μｌ）
及びTakara ligation kit Ａ液１６μｌを加え、よ
く撹拌した後、さらに、Ｂ液４μｌを加え、１６℃で２
時間インキユベートした。反応後、この溶液を用いて
E．coli ＨＢ１０１株を形質転し、ＬＢ寒天培地（５
０μｇ／mlアンピシリン、１.５％寒天を含む）にプレ
ートしてコロニーを得た。得られたコロニーから目的の
プラスミド（ｐＢＡＸ２０）を保持しているコロニーを
スクリーニングし、２００mlの２ＹＴ液体培地（１００
μｇ／mlアンピシリンを含む）で培養し、プラスミドＤ
ＮＡをＳＤＳ−アルカリ法により調製した。

【００８５】（ＩＶ−５） ｈＳＯＤ遺伝子発現用ベク
ターのクローニング （１） ｐＢＡＸ１８のＥｃｏＲＩ消化、アルカリフオ
スフアターゼ（ＡＰ）処理 ｐＢＡＸ１８ＤＮＡ１０μｇ（２０μｌ）に５×Ｅｃｏ
ＲＩ buffer４０μｌ、ＥｃｏＲＩ １２０units（１
０μｌ）および滅菌１３０μｌを加え２００μｌとした
エンペンドルフチユーブ２本を用意した。これらのチユ
ーブを３７℃で３時間インキユベートした後、ＤＮＡを
Genecleanにより精製し、１００μｌの０.１M Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に溶解した。この溶液に１０
μｌのアルカリフオスフアターゼ溶液を加え３７℃、１
時間インキユベートした後、さらに１０μｌのアルカリ
フオスフアターゼ溶液を加え６５℃で３０分間インキユ
ベートした。反応後、フエノール−クロロホルム処理、
エタノール沈殿してＤＮＡを回収した。

【００８６】（２） ｈＳＯＤオペロンとｐＢＡＸ１８
（ＥｃｏＲＩ、ＡＰ処理）の連結、大量調製 前記（III−４）で調製した４つのｈＳＯＤオペロン
（約１.２ｋｂｐ）０.２５μｇ（１μｌ）にＥｃｏＲ
Ｉ、ＡＰ処理したｐＢＡＸ１８ ０.５μｇ（１μｌ）
をそれぞれに加え、Takara ligationkit を用いてligat
ionさせた。これらligation溶液を用いE. coli ＨＢ１
０１株をそれぞれ形質転換し、それぞれＬＢ寒天培地
（５０μｇ／mlアンピシリンを含む）にプレートしてコ
ロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドを調製
し、制限酵素地図を解析することにより目的の各々のプ
ラスミド（ｐＢＡＸＳＯＤ６、ｐＢＡＸＳＯＤ７、ｐＢ
ＡＸＳＯＤ８、ｐＢＡＸＳＯＤ９、ｐＢＡＸＳＯＤ６−
４、ｐＢＡＸＳＯＤ７−４及びｐＢＡＸＳＯＤ８−４）
を保持するコロニーをスクリーニングした。スクリーニ
ングした各々のコロニーを５０mlのＬＢ液体培地（１０
０μｇ／mlアンピシリンを含む）で培養し、プラスミド
ＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法により調製した。

【００８７】（３） ｐＢＡＳ１８のＥｃｏＲＩ消化、
アルカリフオスフアターゼ（ＡＰ）処理 ｐＢＡＳ１８ＤＮＡ１８μｇ（３０μｌ）に５×Ｅｃｏ
ＲＩ buffer４０μｌ、ＥｃｏＲＩ １２units（１０
μｌ）および滅菌水１２０μｌを加え２００μｌとした
エツペンドルフチユーブを３７℃で３時間インキユベー
トした。反応後、フエノール−クロロホルム処理、クロ
ロホルム処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿して回収し
た。回収したＤＮＡを１００μｌの０.１M Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に溶解し、１０μｌのアルカリフ
オスフアターゼ溶液（１units／１０μｌ）を加え、３
７℃で１時間インキユベートした。１時間後、１０μｌ
のアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、６５℃で３０
分間インキユベートした。反応後、フエノール−クロロ
ホルム、クロロホルム処理、エタノール沈殿してＤＮＡ
を精製・回収した。

【００８８】（４） ｈＳＯＤオペロンとｐＢＡＳ１８
（ＥｃｏＲＩ、ＡＰ処理）の連結、大量調製 前記（III−４）で調製した４つのｈＳＯＤオペロン
（約１.２ｋｂ）それぞれ０.２５μｇ（１μｇ）にＥｃ
ｏＲＩ、ＡＰ処理したｐＢＡＳ１８ １.５μｇ（２μ
ｌ）をそれぞれ加え、Takara ligation kitを用いてlig
ationさせた。これらの反応液を用いE．coli ＨＢ１０１
株をそれぞれ形質転換し、それぞれＬＢ寒天培地（５０
μｇ／mlアンピシリン−１.５％寒天を含む）にプレー
トしてコロニーを得た。得られたコロニーからプラスミ
ドを調製し、制限酵素地図を解析することにより目的の
プラスミド（ｐＢＡＳＯＤ６、ｐＢＡＳＯＤ７、ｐＢＡ
ＳＳＯＤ８、ｐＢＡＳＯＤ９）を保持するコロニーをス
クリーニングした。スクリーニングした各々のコロニー
を２００mlの２ＹＴ液体培地（１００μｇ／mlアンピシ
リンを含む）で培養し、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−ア
ルカリ法を用いて調製した。

【００８９】Ｖ．ｈＳＯＤ遺伝子のラン藻Anacystis ni
dulans６３０１、Ｒ２による発現 （Ｖ−１） A. nidulans６３０１(Synechococcus PCC
６３０１）およびＲ２株（Synechococcus PCC７９４
２）の形質転換 １００mlのＢＧ−１１液体培地で１〜５日間培養した細
胞を８０００rpmで５分間遠心して集め、１０mlの新鮮
な液体培地に懸濁した（１０⁸〜１０⁹cells／ml）。こ
の細胞懸濁液を１mlずつポリブロピレンチユーブ(Falco
n２０５９）に分注し、それぞれのチユーブに調製した
プラスミドＤＮＡを０.１〜１０μｇの濃度で加えた。
これらのチユーブをそれぞれアルミホイルでおおい、３
０℃で一晩培養した後、おおつていたアルミホイルをは
ずし、光照射下（光源：白色光蛍光灯；１０００〜２０
００ルクス）、３０℃でさらに６時間培養した。これら
の細胞懸濁液から１００〜５００μｌ取り、ＢＧ−１１
寒天培地（１ｍＭチオ硫酸ナトリウム、１〜５μｇ／ml
アンピシリン、１.５％寒天を含む）にプレートした。
これらのプレートを光照射下（光源；白色光蛍光灯；２
０００〜３０００ルクス）で４〜１０日間培養した。

【００９０】（Ｖ−２）培養 このようにして得られたコロニーを２mlのＢＧ−１１
（１０μｇ／mlアンピシリンを含む）液体培地に移し、
光照射下（光源：白色光蛍光灯；２０００〜３０００ル
クス）で１０日間培養した。次に、これらの培養液を１
００mlのＢＧ−１１（１０μｇ／mlアンピシリンを含
む）液体培地に移し、光照射下（２０００〜３０００ル
クス）で２０日間培養した。さらに、これらの培養液を
それぞれ１０mlずつとり、１００mlのＢＧ−１１（５０
μｇ／mlアンピシリンを含む）液体培地にそれぞれ移
し、光照射下で２０日間培養した。細胞を８０００rp
m、４℃で１０分間遠心して集め、１ｍＭ Hepes buffe
r（ｐＨ７.０）に再懸濁し、遠心することによつて洗浄
した。洗浄後、細胞は実験使用時まで−２０℃で保存し
た。

【００９１】（Ｖ−２）ｈＳＯＤの検出 （１） ｈ−ＳＯＤ活性染色 リボフラビンを加えた光重合法［蛋白質核酸酵素１１：
７４４（１９６６）］で作成したアクリルアミドゲルを
用い、電気泳動を行った。泳動後、ゲルを５０ｍＭリン
酸カリウム（ｐＨ７.８）−０.５ｍＭ ＥＤＴＡで２〜
３回（５分）洗浄し、ニトロブルーテトラゾリウム（Ｎ
ＢＴ）溶液（２.５ｍＭ ＮＢＴ、５０ｍＭリン酸カリ
ウム、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.８）に７分間浸し
た。次にリボフラビン溶液（１００μＭリボフラビン、
３０ｍＭテトラメチルエチレンジアミン、５０ｍＭリン
酸カリウム、０.５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７.８）に浸し、
ゲル中のコントラストができるまで白色光中で発色させ
た。その結果を９図に示す。この図においてＳＯＤ活性
のある部分は発色せず、他の部分は紫となるが、これか
らわかるように、アナキステイス・ニデユランス自身が
持つＦｅ−ＳＯＤ以外に、形質転換体ではｈＳＯＤの活
性が検出された。

【００９２】（２） 抗ヒト−ＳＯＤ抗体による検出 （２−１） ウエスタンブロツテイング ２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて、Laem
mliら（Nature、２３７、６８０（１９７０））の条件
下、還元状態で電気泳動を行った。泳動後、ゲル中のタ
ンバク質をニトロセルロース膜（アマシヤム社製、Hybo
nd（Ｃ）に電気的に移した。この膜を０.３％ Ｈ₂Ｏ₂
を含む５０％メタノールに２０分間浸し、内性のペルオ
キシダーゼを失活させた後、５％スキムミルク、０.１
％ Tween２０を含むＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、０.９％ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４）に３７℃で２時
間浸した（ブロツキング）。ブロツキング処理した膜を
洗浄液（０.０５％ Tween２０を含むＴＢＳ）で５分間
洗い、１／１０００抗体ヒト−ＳＯＤ（ヤギＩｇＧ、Bi
nding Site社製）、０.１％ Tween２０を含むＴＢＳに
３７℃で２時間インキユベートした。膜を洗浄液で２０
分間（５分×４）洗浄した後、１０mgジアミノベンチジ
ン（ＤＡＢ）及び１５μｌの３２％ Ｈ₂Ｏ₂を含む４０
mlの０.１M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）で染色さ
せた。

【００９３】その結果、形質転換体から抽出した抽出液
を泳動したレーン上に、標準試料のｈＳＯＤ（シグマ社
製）と同じ位置に、褐色に染色されたバンドが検出され
た（図１０）。

【００９４】（２−２） オクテローニー法（免疫学実
験入門ｐ７４〜７７、学会出版センター刊）１.２％ a
garose溶液（１０ｍＭリン酸buffer（ｐＨ７.２）、０.
１５MＮａＣｌ及び０.１％ ＮａＮ₃を含む）をシヤー
レ（Falcon１０２９）に厚さ２〜３mmになるように固
め、適当な位置に穴を開ける。中央の穴に抗ヒト−ＳＯ
Ｄ抗体を１０μｌ、その回りの穴には形質転換体の抽出
液（１０μｌ）、コントロールとしてA. nidulans Ｒ２
（非形質転換体）の抽出液（４０μｌ）及び標準試料の
ｈＳＯＤを入れ、４℃で一晩インキユベートした。イン
キユベート後、寒天プレートをシヤーレより取り出し、
ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸buffer、ｐＨ７.２、０.１５M
ＮａＣｌ）に浸し、十分に除タンパクした（ＰＢＳを
数回交換、２〜３日間）。このプレートを０.５％アミ
ドプラツク溶液（９０mlメタノール、１０ml氷酢酸）に
浸し、染色した。その結果、抗ヒト−ＳＯＤ抗体と標準
試料のｈＳＯＤ、形質転換体の抽出液（６−４、８−
４）との間に沈降線が形成されるのがわかつた。さら
に、その沈降線は一本の線（コの字）として現われ、形
質転換体中に標準試料のｈＳＯＤと同じ抗原（ヒト−Ｓ
ＯＤ）がつくられていることが確認された（図１１）。

【００９５】（３） ｈ−ＳＯＤ活性の検出 ラン藻アナキステイス・ニデユランスは内性のＳＯＤ
（Ｆｅ−ＳＯＤ）をもつているが、ｈＳＯＤ（Ｃｕ・Ｚ
ｎ−ＳＯＤ）とは１ｍＭ ＫＣＮによつて阻害されるか
どうかによつて活性を区別して測定することが可能であ
る。光学セル（１ml用）に５０ｍＭリン酸カリウム（ｐ
Ｈ７.８）、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１ｍＭキサンチ
ン、１０μＭチトクロムＣ（ウマ心臓Type III シグマ
社製）及びサンプル（ＳＯＤ）を入れ、全容を９８０μ
ｌとする。これにキサンチン酸化酵素（ベーリンガーマ
ンハイム社製）を２０μｌ加え、反応を開始し、チトク
ロームＣ還元を５５０nmの吸光度増加の初速（３０〜６
０秒）を求め、この値をνとする。ＳＯＤサンプルを加
えないときのチトクロームＣ還元速度をｖとした。この
条件下でのチトクロームＣ還元を５０％阻害するＳＯＤ
を1/3unitとし、（ｖ／ν−１）からサンプル中の総uni
t数を求めた（植物酵素・蛋白質研究法ｐ３７３浅田浩
二、共立出版）。またνを測定した反応液に１００ｍＭ
ＫＣｌ（１０μｌ）を加え、チトクロームＣ還元速度
ν’を求め、unit数を求めた（ｖ／ν’−１）。アナキ
ステイス・ニデユランスの細胞中に生成されたｈＳＯＤ
の活性｛（ｖ／ν−１）−（ｖ／ν’−１）｝を求め
た。

【００９６】その結果、形質転換体から得られた粗抽出
液の比活性（１Ａ₂₈₀unitあたりの活性）は０.７〜１２
units／Ａ₂₈₀という高い値を示した（表１）。

【００９７】

【表１】 また、これらの比活性は基となるベクターの種類及び
ＳＤ様配列とＡＴＧと間の塩基数によつて強く影響を受
け、量も比活性が高かったのはｐＢＡＸＳＯＤ８（ｐＢ
ＡＸ１８を基にし、ＳＤ〜ＡＴＧ間の塩基数が８塩基）
であつた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はアナキステイス・ニデユランスＲｕＢｉ
ｓＣＯ発現調節領域（ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片）の調
製のための工程図である。

【図２】図２はＳＤ様配列を含む領域（ＰｓｔＩ−Ｈｉ
ｎｄIII断片）を合成するために化学合成した１０個の
オリゴヌクレオチドの塩基配列である。

【図３】ＳＤ様配列を含む領域（ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄII
I断片）の調製のための工程図である。

【図４】ＲｕＢｉｓＣＯ発現調節領域（ＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄIII断片）の調製のための工程図である。

【図５】ＲｕＢｉｓＣＯ転写終止領の調製およびｐｕＣ
−ｈ ＳＯＤｔプラスミドの構築図である。

【図６】ｈＳＯＤオペロンの造成図である。

【図７】ｈＳＯＤオペロン（ＳＯＤ７）の塩基配列であ
る。

【図８】ベクタープラスミド ｐＢＡＸ１８、１９およ
び２０の構築図である。

【図９】ＳＯＤの活性染色の結果を示す図である。

【図１０】ウエスタンブロツテングの結果を示す図であ
る。

【図１１】オクテロニーの結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:89） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生理活性を有するポリペプチドをコード
   する構造遺伝子を含有する担体ＤＮＡでラン藻細胞を形
   質転換することにより、ラン藻細胞で該ポリペプチドを
   発現させる方法において、該担体ＤＮＡとして、生理活
   性を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子と、該
   構造遺伝子の上流側に位置するアナキステイス・ニジユ
   ランスのＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子の転写開始領域と、該構
   造遺伝子の下流側に位置する該ＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子の
   転写終止領域を含有する担体ＤＮＡを使用することを特
   徴とするラン藻細胞での生理活性を有するポリペプチド
   の発現方法。
2. 【請求項２】 該担体ＤＮＡが、生理活性を有するポリ
   ペプチドをコードする構造遺伝子と、該構造遺伝子の上
   流側に位置するアナキステイス・ニジユランスのＲｕＢ
   ｉｓＣＯ遺伝子の転写開始領域と、該構造遺伝子の下流
   側に位置する該ＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子転写終止領域から
   なるオペロンが導入されたベクタープラスミドである請
   求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 ベクタープラスミドがプラスミドｐＢＡ
   Ｓ１８、ｐＢＡＸ１８、ｐＢＡＸ１９又はｐＢＡＸ２０
   である請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 生理活性を有するポリペプチドがヒト−
   ＳＯＤと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプ
   チドである請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 ヒト−ＳＯＤと実質的に同一のアミノ酸
   配列を有するポリペプチドをコードするヒト−ＳＯＤ構
   造遺伝子と、その上流側に位置するアナキステイス・ニ
   ジユランスのＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子の転写開始領域と、
   該ヒト−ＳＯＤ構造遺伝子の下流側に位置する該ＲｕＢ
   ｉｓＣＯ遺伝子の転写終止領域からなるヒト−ＳＯＤオ
   ペロン。
6. 【請求項６】 請求項５記載のヒト−ＳＯＤオペロンが
   導入されたベクタープラスミドｐＢＡＳ１８又はｐＢＡ
   Ｘ１８よりなるヒト−ＳＯＤ発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載のヒト−ＳＯＤ発現ベクタ
   ーで形質転換されたラン藻細胞。
8. 【請求項８】 請求項７記載のラン藻細胞を培地で培養
   し、その培養物からヒト−ＳＯＤを採取することを特徴
   とするヒト−ＳＯＤの製造方法。