TW321686B - - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 321686 A7 B7 五、發明説明（丨） 技術領域 本發明傜關多肽之表現方法，詳言之，偽關有效表現 生理活性多肽之方法，該方法偽經由使用藍辱藻細胞作 寄主，及以含該多肚之编碼結構基因的載體DNA轉形該 寄主。 背景技術 藍綠藻（亦名绀菌），類似大腸桿菌等，為不具核膜 之原核生物。唯，藍綠藻具有類似高等植物之光合成条 统，特别紅藻；因此，可利用陽光作能源，由水及二氧 化磺生物，合成有機物質及徹量無機鹽，因而可自養性 地大量增生。 又復，長久以來，多種藍緣藻已供食用(Spirul ina, Aphanothece》Η o s t o c ,等），但未有對動物具致病與寄 生性質之報告。因此，藍緣藻適用作基因重組之奇主， 同時，安全度絕佳。 若可於具有前述持徴的藍綠藻内，引進有用的生理活 性肽之编碼基因，且以大量表現之，則可生産食物，機 难食物，飼料等，而不受季節及氣候之影礬（視作物而 定）；以及預期可以低成本，及低能置，及就來源方面 言，經劑地生産藥物，非屬藥物但可用於醫事處理的化 學品，化粒品原料等。 近來，使用藍綠藻發展寄主-載體糸統之發展快速進 展，曾報導使用下列各種屬表現多種異源蛋白質基因·· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） .^—1— n nn ^ϋ—— .^11^11 τ 1111 rA. 一 U3. .f ( ， ,(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印製 A7 ____B7_ 五、發明説明（ι) 例如 Anacystis nidu 1 ans R2 (Synechococcus PCC 7 9 4 2 ),Agoenel lun quadrupl icatun (Synechococcus PCC 7002),Synech〇cysits PCC 6803及 Anabaena PCC 7120 〔參考 G.D.Rrice and M.R.Badger,Plant Physiol,91 :505-513(1989(有關人碩酸酐之表現及大腸桿菌之lac I 阻渴子；R.de Lorimier et al.,J.Bacteriol,169: 1830-1835(1987)有關表現高等藻 Cyanophora paradoxa 之 a 1 1 o p h y c o c y a n i η ; I. V . E 1 a n s k a y a a n d I. B . Μ o r z u η o v a ,Mol.Genet.(iikrobiol.Virusol, 0(9) :7-11 (1989)有聞 Bacillus aBylollque-faciens Α5Θ 之 a-截粉拥之表現 sN.Tandeau de Marsac et al.> Ho 1. Gen . Genet.2Θ9 ： 396-398(1987)有關 B.shaericus 1 593M之殺蟲性蛋白質 之表現；C.Angsuthanasonbat and S.Panyin.App. 1.Environ.

Microbid.55:2428-2430(1989)有關 B.thuringiensis 變種 israelensis 之 130kDa δ-内毒素之表現；Y.Cai and C.P. Wo lk,J.Bacteriol,172:3138-3145(1990)有關枯草 桿菌之果聚醏蔗糖酶之表現；G.Schmetterer et al.， J.Bacteriol,167:411-414(1986)有關 Vibrio h a r v e i及 V.fischeri之蟲營光素酶之表現；D.J.ScanUn et al·, Gene 90J43 - 49 ( 1 990 ) , M . R . Schaefer and S.S.Golden, J . Bacterio 1 ,171：3973 -398 1 ( 1 989 )and J.S.Buzby et al.,Science 230:805-807(1985)有關大腸桿菌之 /3 -半 乳糖替8每之表現；D.A.Lightfoot et.al.,Plant Mol 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規潘·（ 210X297公釐） ------------«裝—-----訂------】J - -一 (請先閲讀背面之注^^項再填寫本頁) 321686 A7 B7 五、發明説明（3 )

Biol，11:335-344(1988)有闋大腸桿菌之链按酸去SSi每 之表現；R.C.Murphy et al.，J.Bacteriol，172:967-97M1990)有關大腸桿菌之ree A蛋白質之表稗；.M.Y. Gruber et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2608-2612(1990)有關大腸桿菌之Mn-超氣化物歧化W之表現 ;J,Pierce et al..Proc.Acad.Sci.USA 86:5753-5757 (1989)有關光合成菌 Rhodospirillua rubrum^. R u B i s C 0 之表現；D.Friedberg及 J.Seijffers,Mol.Gen.Genet. 203:505-510(1986),有關噬菌髏λ之cl阻遏子蛋白質 之表現〕。 然而，於前述多篇報告中，寄主之基因本身之轉錄起 始區，就此用以表現異源蛋白質之编碼基因，而表現出 的期望的蛋白質數量極微。又愎，於其中像使用t a c起 動子或W起動子表現異源蛋白質（人碩酸酐_，噬 ΚϋλοΙ阻遏子）之報告中，欲增加期望的蛋白質之表 現數S,巧作設計，舉例言之，也將此等起動子之控制 蛋Θ質之编碼基因引進一載匾内。然而，即使以人硪酸 SfiS (報告中掲示其表現數量）為例，表現量小，僅占可 i容SS質之約0.3%，而期望的表現數量不可得。 方面，也有報告，其中寄主藍緣藻之轉錄起始區 轉錄起始區，供表現異源蛋白質（大腸桿菌（/S-半每）〔參見上文，Gene 90:43-49(1990)和 J. Bacte「Ui.171:397_3981(1989)〕。唯，各例中 由於 -5 - 本紙》家镎丰（CNS )从胁（21〇><297公羡） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· A. 經濟部中央樣準局員工消费合作社印製 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印装 A7 ______B7__五、發明説明（4 ) /3-半乳糖苷酶基因係引入藍綠藻之结構基因内，故/5-半乳糖¥ IS基因僳表現成融合蛋白霣，因而就生産期望 的異源蛋白質而言，仍有問題。 如此•欲使用藍緣藻作宿主細胞，有效表現生理活性 .蛋白質，發明人首先將Anacystis n i d u 1 a n s之R u B i s CO 基因之轉錄起始區和轉錄終結匾，與期望表現的结構基 因接合，徹底研究使用所得接合産物，於藍綠葎發揮功 能的操縱子。結果，發現經由使用RuBisCO之轉錄起始 區和轉錄終結區，可有效表現結構基因，及發現表現量 也受所製得之操縱子被引進其中之載體種類所影響。 愎次，發明人發現由SD序列（大腸捍菌等之SD序列已 有報告）至ATG(轉譯起始址）之氮驗基數目，對結構基因 之表現有影饗，經由將氮驗基數目最適化•而成功地顯 ¾. I紙 本 0 明 發 本 成 完 而 因 量 現 表示 其掲 進之 促明 著發 性體 活載 理之 生因 現基 表構 中結 胞之 細肽 藻多 綠此 藍碼 於编 種有 - 含 以 肽 多 A Η 由之 藉藻 ，綠 法藍 方形 之轉 活之 I -理 生 碼-0 有 含 為 A cl N C〇| D 體 載A, 之DN 用髏 使載 所之 於因 在基 徽構 特結 其之 , 肽 胞多 細性 而 > 0 游游 上下 之之 因因 基基 奪 $ 構構 結結 。 於於下 位位如 區區節 始結細 起終述作 錄錄詳製 轉轉法之 之之現)NA 因因表} 基基之 ο ο 明 c C s S 發 • 1 *1 B B 本 者 帶 嫌 6 ------1--If 裝------訂-------- (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 準 標 家 國 I國 I中 用 適 " 9 A7 B7 321686 五、發明説明（夂） .(請先聞讀背面之注拳項再填寫本頁) 後述例中呈示一種製備載體DHA之特定方法，其中， 生理活性多肽（後文數方便計，禺爾稱為"有用的結構基 因”）係與核醛糖-1,5-二镔酸羧基_ /氣化酶（RuBisCO) 之轉錄起始區，仿SD序列和轉錄終結區接合〔參見K. Shinozaki and Μ .Sugiura,Μ ο 1 .Geη .Genet.200 - 27 - 32 ( 1985),Masanobu Kunano and Masahiro Sugiura.Iden (遣傳）38(12):26-31(1984),等〕。 (1) RuBisCO之轉錄起始（起動子）區之製備 含RuBisCO起動子之DHA段之製法，為使用限剪内核酸 函每EcoRI.SacI,及PsT I依習知方法（T.Maniatis等人。 分子選殖一簧驗室手冊-冷杲港實驗室出販）由質體 pANE18(其中，將約5.6MDa之含RuBisCO起動子匾約 EcoRI段插入PBR322之EcoRI址，例如掲示於K.Shinozaki 等人之參考文獻〔P r 〇 c . N a t h A c a d . S c i . , II. S . A，而： 4050-4054(1983)〕）切下該 DNA段。 (2) RuBisCO之轉錄終結（起動子）區之製備 經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝

RuBisCO之終結區之裂法僳，使用限剪内核酸_Pst I Eco52I,由質醱pANP1155(其中，含RuBisCO之終結區的 長約1.5MDa之PstI段，僳插人PBR322之PstI址，掲示於 上。Shinozahi等人之參考文獻〔Proc.Nath.Acad.Sci· USA 80:4050 -4054 ( 1 983)〕）切下該區。 (3) 仿SD序列之製備 仿SD序列，被引進本發明之重組體DHA内，位在有用 表紙ftXjl遘Λ中國國家梂丰（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（& ) 的結構基因上游，與起動子區下游，作核糖匾辨識序列 〇 較好，用作仿SD者，僳與寄主藍綠藻之核糖體RNA互 補者；而若使用Anacystis n i d u 1 a n s 6301種糸作藍緣 藻，則可使用氛鹼基序列GGAG作仿SD序列。唯，仿SD序 列並非僅限於此，同理，也可使用其它稱之為仿SD序列 之氡驗基序列。此種仿SD序列之氡鹼基數目小，通常傺 藉合成製備。 又復，仿SD序列通常位在ATG(轉譯起始址）前方，由 仿SD序列至ATG的長度（m鹼基數目）可能對有用的結構 基因之表現有影堪；因此，需要依寄主類別，結構基因 之氮鹼基數目，等調整長度，因而獲致最佳表現數量。 長度隨寄主藍綠葎種頚，結構基因之氮鹼基序列，等而 異，但通常僳於3至10氮驗基之譜，而最佳長度可依寄 主的結構基用之氮驗基序列等，經實驗決定。 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印裝 .(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 通常偽使用ATG(轉譯起始址）前方序列，或含ATG之序 列進行製備，含仿SD序列之DNA段；而DNA段之合成則方 便地依已知之基因操作技術進行〔例如，參照日本生物 化學會编輯，東京化學士人公司出販”生化實驗講話I基 因研究方法I I”]。 (4)有用的結構基因之製備 可藉本發明方法表現的生理活性多肽（後文為便利計 ，偶稱為”有用的肽”），非僅限於特定者，依本發明方 本紙張尺度逋用中國國家橾準（CNS >八4规格（210 X 297公釐） 321686 A7 __________ 五、發明説明（7 ) 法，可有效表現各種有用的肽。 可藉本發明方法表現的有用的肽之例有：SOD,(人， 鼠等）介白素，人-干镘素-α, -/3,或-7,人-胰島素 ，人-腫瘤壊死因子（TNF),人-菌落剌撖因子（CSF)。人-組織胞質素原活化劑（ΤΡΑ),人-原尿激酶，尿撖人-凝血因子（I-V, VII-XIII),人-红血球生成素，人-神 經生長因子，人-前房利銷尿肽（α-hANP),人-胰分泌 的胰蛋白酶抑制爾，（人，牛，豬，雞，魚）生長激素， 生長激素釋放因子，抗體（免疫球蛋白），殺蟲蛋白（BT 蛋白，等），貯於種籽的蛋白質（植物凝血素，玉米素， 麩質素，大豆精，大麥精，等）等，以及多肽，其大匾 具有如同此等有用的肽之胺基酸序列者。 大體具有如同有用肽之胺基酸序列的多肽，一術語用 於本文代表包含有用的肽本身，以及有用肽的類似多肽 ，其中有用肽之部分胺基酸序列，像由一定範圍内之其 它胺基酸所置換者，因而，有用肽特有的活度大體不會 喪失者。 經濟部中央標率局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 因此，以後文例中所用之人-SOD為例，"大體具有如 同人-SOD之胺基酸序列之多肽”包含：除Jabusch等人〔 生化學，19:210-2316(1980)〕和 Barr a等人〔卩EBS Letters 120:53-55(1980)〕所報告之具胺基酸序列的 hSOD多肽外，hSOD之類似多肽，其中部分（通常為5或 5以下，較好，2或2以下）胺基酸序列，僳由在hSODWi -9 -本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X2.97公釐） 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印裝 A7 _B7_ 五、發明説明（β ) 活度大體不致喪失的，該範圍内的其它胺基酸所置換。 其待例有： (a) hSOD : (b) 多肽，其中hSOD之第六半胱胺酸殘基（cys)偽由丙胺 酸殘基（Ala)所置換者（參照日本特許公開案第Ι56δδ4 / 1990號〉； (c) 多肽，其中hSOD之第111半胱胺酸殘基（Cys)偽由絲 胺酸殘基（Ser)所置換者（參照日本待許公告案第 130684 1 / 1 987號）； (<0多肽，其中第六半胱胺酸殘基（Cys>偽由丙胺酸殘基 (Ala)所置換，而第111半胱胺酸殘基（Cys)偽由絲胺 酸殘基（Ser)所置換者（參照日本待許公告案第273473 / 1988號）〇 編碼者前述有用肽之有用的結構基因，可經由從可生 産生有用肽之供應源，如動物，植物及撖生物之細胞抽 取與遘殖而製備，或經由化學合成製備。 (5)含有用的結構基因可表現的操縱子之營築 如此所製得之RuBisCO起動子區，含仿SD序列之DNA段 ，及RuBisCO终結子區，連同生理活性多肽之编碼有用 結構基因，依己知方法，以（起動子區）-(含仿SD序列之 DNA段）-轉譯起始字碼子，ATG)-(有用的結構基因）_(轉 譯終結字碼子）-(終結子區）之順序接合，而生成—可於 藍绿藻細胞内表現的操縱子。 -10- 本纸張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) AOL格（2丨0X297公漦） ------------^装----I--—訂 (請先聞讀背面之注$項再填寫本頁) 321686 A7 B7 五、發明説明（？） 起動子及仿SD序列數目無箱分別為一，於一棺中也可 使用二或二以起動子及/或二或二以上仿SD序列。 可使用前述含有用結構基因的操縱子·以大體就此狀 態（視寄主種類及/或操縱子，等而定），轉形寄主；但 ，通常，操縱子是一次引進該寄主之適當載體（質體）内 ，隨後，用以轉形。 (6)載體 藍緣藻細胞内有用的數種載體，可用作可將前述可被 表現的操縱子引進其中的載髏。載體之例有PUC104及 pUC105〇 [C. J. Kuhlemeier et al., Mol. Gen. Genet. 1:2^9-25 与（1981)]; pLSl〇3 -[L. A. Sherman 及+. P. van de Putte, J. Bacteriol, 150:410-1113(1982)]; pDPL13 [S. Gendel et al.， J. Bacteriol, 156:148-15^0983)]； pUC3〇3 CC. J. Kuhle-raeier et al.， Plasmid 10:156-163(1983)]; PSG111 [S. S. Golden 及.· L·. A. Sherman, J. Bacteriol, 155： 966-972 (1983)]; pPUC29 CC. J. Kuhlemeier et al., Gene 31:109-116(1984)]; pPLAN Bal [D. E. Landenbach et al. Mol. Gen. Genet, 199:300-305(1985)]; PBAS18 [K. Shinozaki et al.， Gene 19 :-221-223( 1982) ], ^ . 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注$項再填寫本页) 又復，若有所需，此種載體可衍生自質體及病毒，例 如，可有利地使用可用於大腸桿菌和藍綠藻細胞内複製 的穿梭載體PBAX18, PBAX20,等；此穿梭載體偽由本發 明人使用衍生自Ancystis nidu丨ans之質體pBA 1之OriA 區，質體pUC之多重選殖區，及大腸桿菌ColEl質體之 -11-本紙Λ尺度遍用中國家楳準（CNS ) A4規格（2!〇X297公釐） A7 ___B7___ 五、發明説明（〖。）

OriE區而生成者（參考後例，和1991年5月8日由本案 申請人提出申諳的專利申讅案，發明標題為"新顆質體" (日本專利申謓案第6777 4/ 1992號）。 (7)載體DHA之營築 如上（5)所述，可被表現且含有用的結構基因之，操 縱子可依己知之基因操作技術，引進如上（㈠所述之載 體（質匾）内。 舉例言之，（依如上（5)之說明，使用hSOD之編碼有用 的結構基因，製備之）hSOD操縱子DNA段，與DNA段合併； 該DNA段偽經由使用内核酸_EcoRI，割裂可於Anacystis nidulans细胞内後製的，例如pBAS 18或pBAX 18之，例 如EcoRI辨識址而得；含T4 DHA接合酶作用於該合併組 合上•而獲得有用的結構基因被引進其中的，hSOD表現 載體。插入載體内之操縱子數無需為一，也可於一檔内 引進2,3, 4或4以上之操縱子複本·但規定各複本皆同一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 之1C販 得.an出杉 所.M室fir各 o'上(T驗 列 向如殖實23下 取選港 f 得 值 者 菌泉 桿冷 腸 -大冊 於手 丨室 法驗 方實 知 I 習殖 依選 可子 體分 載 ， 現人 表等 帶 搛 的 成 生 所 此 如 用 使 可 作 如 例 提 胞 細 藻 綠 藍 的 形 轉 A N D 者 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（|丨）

Anacystls nidulane 6301 (Synechococcus pcc 63ου,

Anacysbi3 nidulans R2 (Synechococcus PCC 7942),

Synechococcus PCC 7002,

Synechococcus PCC 7418 (Aphanothece halophitica),.、

Synechocystis PCC 6803，

Synechocystis PCC 671^,

Spirulina platensis,

Anabaena'PCC 7120 (Nostoc PCC 7120)，

Nostoc PCC 7119 (Anabaena PCC 7119),

Calothrix PCC 7601,等. 以如上播帶者DHA轉形此等寄主藍緣葎細胞，可藉已知 方法進行，例如下列：R.D.p〇rter〔CRC徹生物學騣謹 綜覚 13(2) : 111-132〕 . D. A. Lightfoot et al. CJ. General, Microbiology 13^:1509-151^( 1988)3 , S. S. Golden et al. [J.. Bacteriol, 158:36-H2C981})], H. Daniell et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2546二2550O986) ], . T· Matsunaga et al. C Appl. Biochem. Biotechnol. 24/25:151-160(1990)]，等. 例如，Anacystis nidu Ians可經由依 D.A.Lightfoot ·._ — 等人之方法，將hSOD表現載體引進其中而轉形。 基於安比西林抗藥性等，選出所生成的轉形體後，可 藉免疫墨漬法* 〇uchterl〇ny法’聚丙嫌睡胺圈二匕500 活性染漬，SOD活度之瑜rq，等證實獲得期望的轉形體。 -13- 本紙張尺度適用中國國家採準（CNS ) A4规格（210 X297公釐） ------.---叫裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 A7 B7 五、發明説明（〖X) S由將如此所得之轉形醍，於已知適用於寄主細胞增 ----------!裝— (請先聞讀背面之注$項再填寫本頁) &的培餐基内，於照光下培育，可表現生理活性多肽 。較好，培養基含有適量藥物，如安比西林供選擇性増 生轉形體。 轉形鱧寄主為Anacystis n i d u 1 a n s時，適當培養基為 BG-11培養基，MDM培養基，等，而至於培育條件之適當 培育溫度通常為10至351C ,較好25至30t：。 又復，培餐基之適當pH通常係於7至8之範圍，適當照 度偽於5Θ0至5,00 0勒克司之範圍。於此條件下，可培養 5至20日之譜。復次，可於靜置或攪拌下進行培育。 依如此所述之本發明方法，可以棰高表現效率，獲得 有用的肽，及，依已知方法，分離與回收藍緣藻細胞内 所生産的有用的肽。舉例言之，分離與回收之進行方式: 方式，可藉離心，由培餐膠中收集細胞，及於碎裂細胞 後，令所得碎裂細胞進行如下一般已知作業的適當組合 ，例如，鹽析，摻析，離子交換層析，_濾層析，層析 聚焦，疏水作用層析，親和層析，及電泳。 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印裝 如此製得之生理活性多肽可用作或用於藥物，非靥藥 物但可用於路事治療之化學品，化粧品，等。 又復，於培育後，可藉離心等，收集於光照下培養的 經轉形的藍緣藻，就此用作食品，機能食品之進料。 復次•本發明之重組體DNA所用之RuBisCO起動子，於 光控制下，誘使位在其下游的有用的結構基因大量的表 -14-本纸張尺度適用中國國家揉準（CNS >从缄爲（210X297公釐） ^^1686 A7 B7 五、發明説明（/3 ) 現；如此，起動子的優點例如為，當使用大腸桿菌之lac ,tac或trp起動子等誘使表現時，無需使用昂貴藥物。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圔式之簡單說明 第 1 圖為 Anacystis n i d u I a n s RuBisCO表現調節區 (EcoRI-Pst I段）之製備過程圖。 第2圖為經化學合成的，供合成含仿SD序列區（Pst-I-Hin dill段）用之CO寡核苷酸之氮鹼基序列。 第3圖為含仿SD序列區（Pst I-Hind III段）之製備過 程圖。 % 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 第4圔為RuBisCO表現調節區（EcoRI-Hind III段）之 製備過程圖。 第5圖為顯示RuBisCO轉錄终結區之製備，及pUC-hSODt 質體之菅氣圖。 第6匾為hSOD操縱子之生成圖。 第7圖為hSOD操縱子之氮鹼基序列（SOD 7)。 第8圔為載體質體pBAX 18及20之營築圖。 第9圖為顯示SOD之活度染漬結果之圖。 第10圖為顯示西方墨漬結果之圖。 第11圖為顯示Ouchteriony結果之圖。 將舉一例更特定地說明本發明如下。 實施例 1 I表現調節區之製備（1-1) PANE 18之選殖 -15- 木紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（γ) 40ηε(1« 1)pANE 18(K.Shinozaki et.al.,Proc.Nath. A c a d . S w . U S A 8 0 : 4 0 5 0 - 4 0 5 4 ( 1 9 8 3 ))〔其中於 p B R 3 2 2 之 EcoR I址，已插人5,600bp段，其中含有Anacy&t i s nidulans 6301之核醛糖-1,5-二磷酸羧基酶/氧化醸之 起動子區者〕加入100/i 1之50πΜ經Cells處理的大腸桿 菌HB 101種条之細胞懸浮液，將混合物溫和混合。混合 物於冰水中培育30分鐘，又於42C培育3分鐘，而將DKA 攝取入細胞内。於此懸浮液内加入IbI LB培養基（10s/ 1 巴克多胰蛋白脎，5g/l酵回抽些物，10g/l HaCl), 於371C進行振搖培育1小時。取100/z 1及200 # 1此細胞 懸浮液，接種至LB瓊脂培養基（含50Wg/_l安比西材=及 1 . 5%瓊脂）上。此平板於37¾培育24小時，然後*分離 所生成之菌落。 分離得之菌落以白金環接種入2nil 2YT液態培養S 16g/l巴克多胰蛋白膀，10g/l酵母抽取物，5g/l MaCl ，及50Mg/ml安比西林）内，及於37t：培育隔夜0取1Bl 培餐物，加至200ml 2YT液態培養基（含100wg/BlSfcb 西林）内，及於371培養隔夜。培養細胞經由於8’000Γ·ρΠ 離心10分鐘收集，依SD-鹾方法（B.Perbal,A.分子選殖 之實用指南，273至276頁，約翰威利父子公司出11^’ 由培養細胞大量製備質髏DNA。 (1-2) Sac I-Sph I段之分離 (參照第1圖） -16* 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 A7 B7 五、發明説明（ίΓ ) 於依本朵夫管（容積1.5b 1)内，將無菌水加至大量製

備的 10wl(10wg)pANE 18DNA, 10wl 之 10xLow 缓衝液 (1 0 0 m Μ T r i s - H C 1 (p Η 7 . 5 ) , 1 0 0 b Μ M g C 1 2 , 10 b Μ 二硫 赤絲醇（DTT))及50單位SacI(寶酒造公司生産）内，令總 體積為100w 1,混合物於3710反應3小時。反匾後，加 入 15w 1之 10xHigh缓衝液（5Θ0·Μ Tris-HC1(PH 7.5), 108bM MgCU , 10·Μ DTT, 100·Μ NaCl), 5 0單位 SphI (寶酒造公司生産）及30ϋ 1無菌水；又於371C反應3小 時。反應後，加入1/10容積之3M乙酸納（pH 4.8)及2.5 容積乙醇，混合物就此於-20t!放置2小時或2小時以 上。於15,000rpB及4t!藉離心10分鐘收集所生成的沈 澱，以7 0%乙醇洗滌，及減壓乾燥。殘渣溶于50 wl TE (10bM T「is-HCl(pH 8.0), lmM EDTA)内，加入 1/10倍 體積之電泳標記（0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯氡醇， 30%甘油），混合物置1 . 5%瓊脂糖上，於50V使用TAE 缓衝液（40bM Tris-乙酸鹽，2bM EDTA)霄泳1.5小時。 電泳後，凝_浸於0.5tfg/inl ethidiu·溴溶液（於TAE) 15分鐘，侔進行DNA之染色。染色後的凝謬置於轉發光 體±，照射紫外光，切下含期望的DNA之帶。期望的DNA 段（約 l,200bp)使用 DNA 纯化套件 Geneclean(BIO 101公 司裂造 > 純化。 (1-3)於 pUC 18選殖 SacI-SphI段 (1) Sac I-Sph I切開 pUC 18 -17- 本紙張尺度適用中國國家梯率（CNS ) A4規格（210X297公釐） —·ϋ I n n I n I I I I I ^ - ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（外） 於依本朵夫管（容積1.5·1)内•無菌水加至10W1(10 «g)pUC 18 DNA, 5wl 10xLow缓衝液及 50單位 SacI, 將總體積調至50« 1;混合物於37t!反應3小時。反應 後，加入7.5«110><11丨芭11缓衝液，50單位5?111及37.5 «丨無菌水，反應又於37t：持鑲3小時。酚：氛仿：異 戊酵（25 : 24 : 1)以等體積加至反應溶液，混合物經強力 攪拌，及於15,000rPB及41C離心4小時，取出水層。於 此水層内加入1/10倍暖積之3M乙酸鈉（pH4.8)及2.5倍 體積乙醇，俥藉乙醇沈澱DHA。於15,000γρβ及及離 心10分鐘，收集沈澱，以70%乙醇洗滌，及減S乾燥。 殘渣溶於20 w 1 TE,用於如下實驗。 (2) 插人 SacI-SphI 段（l,200bp)至 pUC 18(SacI-SphI) 25// 1 Takara DHA接合套件A液（寶酒造公司生産）加 至 0.1w g(2/z l)SacI-SphI段 DNA 及 8.5// g(ltf 1)pUC 18 (SacI-SphI),繼以充分搜拌。此溶液内加入1 Takara DKA接合套件B液，混合物經充分攪拌，及於16t：培育1 小時。反應後，此溶液用以轉形大腸捍菌JM 109。 (3) 大量製備pARup 18 於5« l(100/ig)接合溶液内，加入100W 1經以CaCU 處理的大腸桿菌JM 10 9之細胞懸浮液，繼以溫和混合。 混合物於冰水中培育30分鐘，然後於42 t：培育2分鐘， 而使細胞將DHA攝入其中。lnl 2YT液態培養基加至此懸 浮液内.於371C振搖培育1小時。取100w 1及200« 1此 -18- 本紙張复適用中國國家標準（CNS ) A4規Λ· ( 2丨Ο X 297公釐） 1.111111.— Η 装 訂 (請先閲讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁) A7 B7 五、發明説明（，？） 細胞懸浮液，接種於2YT瓊脂培養基（含50wg/*l安比 西林，40Wg/l 5-溴-4-氛-3-吲¢8基-/3-D-硫基半乳 糖苷（X-gal)，23.83nig/·丨異丙基-点-D-硫基乳糖毗喃 糖苷（IPTG)及1.5%瓊脂）上。此平板於37t：培育24小時 ，所得白色菌落打點於新製2ΥΤ瓊脂培養基（含50wg/ al安比西林，X-gatl· IPTG及1.5%瓊脂）上•於371培 育隔夜，分離白色菌落。 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印装 ---------^—-^装-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 分離得之白色菌落使用白金環接種入2«1 2YT液態培 養基（含50ws/nl安比西林），於37C培育隔夜。取1·1 培養液，移入1.5β1依本朵夫管内，於i5,000rpB離心30 秒，俥收集細胞。收集得之細胞懸浮於150 w 1 SET缓衝 液（20% 蔗糖· 50mM Tris-HCl(pH 7.6), 50·Μ EDTA)内 ，加入5wl RNase溶液（10Bg/Bl核糖核酸酶Α, β.ΙΜ乙 酸鈉（pH 4.8), 0.3bM EDTA),混合物藉渦旋混合機充 分攪拌。於其中加人350«1之溶解液（1%SDS, 0.2H HaOH ),藉將管倒置，溫和攪拌混合物，使其完全溶解。所 得溶解液於冰水中培育10分鐘，加人250 w 1 3M乙酸納 (pH 4.8),混合物經充分混合，然後就此置於冰水中歴 30分鐘。此混合液於15,0001^«1及4<1〇離心10分鐘，俥沈 澱SD和染色髏DHA。上清掖移至另一根依本朵夫管，加 入等量異丙醇，混合物經充分混合，趙以於1 5,000rpm ,4它離心7分鐘•呈沈澱收集質體DNA。沈澱溶於無菌 水，部分溶液使用限剪内核酸_EcoRI及Hind III(二者 -19- 本紙法尺Λ遥用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（丨^ ) 皆由寶酒造公司生産 >進行切開。切開産物接受1.5%瓊 脂糖謬電泳，侔證實l，200bp SacI-SphI段插入plIC 1δ。 已證實SacI-SphI段己插人pUC 18之菌落，移至400·1 2ΥΤ液態培養基（含100/zg/nl安比西林），培育隔夜。 培育後細胞於8, 080rp*及4Ϊ：離心10分鐘回收，經由SDS-驗方法大量製備質體DNA。 (1-4) EcoHI-Pst I段之分離（參考第1圃） (1) EcoRI-Hind III段之分離 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 於依本朵夫管（容積1.5nl)内，將無菌水加至10</1(10 wg)大量製備之pARup 18 DHA溶液，20/il 10xk缓衝 液（200bM Tris-HCl(pH 8.5)， 100·Μ MgCl§ , 100bM DTT, 1,000πΜ KC1)及 40 單位 Hindlll,將總髅積調至 2Θ0 w I。總計準備2 0根内含前述内容物之依本朵夫管，於 37*0持缠反應3小時。反應後，以酚-氯彷處理混合物 ，藉乙醇沈澱收集DHA，溶于155w 1無菌水。於此溶液 内，加人 40« 丨 5xEcoRI緩衝液（500bM Tris-HCl(pH7.5) ,35mM MgCi2 ，250bM HaCl，35mM 2-氳硫基乙醇， 0.05%牛血清白蛋白（BSA))及40單位EcoRI，而將總體 積調至200μ1。於37C,於所得20根依本朵夫管（容積 1.5ml)内分別反應3小時。反應後，反應混合物同樣接 受酚-氛仿處理及乙醇沈澱而回收DNA。期望的DHA段（約 l,200bp)藉1.5%瑰脂糖膠電泳分離，及使用DNA純化套 化套件Geneclean純化。 -20-本纸張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局負工消費合作社印装 Α7 Β7 五、發明説明（α) (2) EcoRI-Pst I 段（約 350 bp>之分離 於依本朵夫管（容積1.5·1)内之40w g(86U 1)純DHA 段内加人10« 1之10xHigh缓衝液及4 8單位Pstl(簀酒造 公司生産）而將總髏積調至100w 1，於37<〇反匾3小時。 反慝後，進行1.5%瓊脂糖膠電泳，分離所需DHA段（約 350bp)。DMA自凝膠上電溶離，使用核酸純化卡匣Nensorb 20 (杜邦公司生産）純化。 (1-5) Pstl-Hind III段之合成 (1)寡核苷酸之合成與純化 欲合成含Shine DaUarno(S/D)序列之表現調節區， 使用DNA合成儀380A(日本應用生物条统公司生産）藉磷 酸亞脒酸法合成十寡核苷酸（參照第2圖）。合成完成後 ，以每15分鐘添加0.5b1之方式，總計加入2nl銨水（2 7% 或27%以上）至矽膠柱，由氣化矽載龌上切下各寡核苷 酸，收集入小瓶。又將1 b 1氨水加入此小販，小瓶利用 蓋及P&rafiU等密封，於55TC加熱8小時或8小時以上 ,俥於基部去除保護基（酵基）。小瓶由恒溫浴中取出， 調整回室溫，移開蓋後，内容物減壓濃缩至乾。乾燥後 ,殘渣于200//1 0.01M三乙胺-乙酸溶液（TEAA, pH 7.5) 然後，使用AM-313-0DS(山村化學研究室公司生産）進行 HPLC,以乙Η及0.1M TEAA濃度梯度溶離，由溶離分中 分段取出主峰。所得峰經減壓濃插至乾，加入100« 1 80%乙酸（乙臍溶液），將混合物混合，然後，就此於室 -21- 本紙張尺度逋用中國國家梂準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） --------7---If—裝-----—訂------Γ— -(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印裝 A7 ___B7 五、發明説明卜° ) 溫放置30分鐘侔去除5’端之二甲基三苯甲基（DMTr),及 將其轉成0H基。30分鐘後，將混合物快速濃縮至乾，殘 渣溶解於20θ« 1之0.01M TEAA(pH7.5),加入等體積二 乙醚，藉抽取去除DMTr基。所得溶液經減壓潑縮至乾， 殘渣溶於110« 1之0.01M TEAA(pH7.5),再度藉製備性 HPLC純化。含寡核苷酸之溶離分經減壓濃縮，殘渣溶於 TE,用於下述實驗。 (2)以動素_將合成的寡核苷酸磷酸化 各4W8!純寡核苷酸分別與120W 1整分之動素_缓衝液 (50丨M Tris-HC.l(pH7.6), 10丨M MgCl2 , 8.1 丨M EDTA, 51^〇11,0.111^精脒，1.7««冉了？）混合，加人9單位 Τ*聚核苷酸動素酶（寶酒造公司産裂 >,及於37t培育 15分鐘。然後，加入ATP至終濃度為IbM,再度加入9單 位T*聚核苷酸動素醃，及於371C培育25分鐘。反應後 ，混合物接受901C之熱處理5分鐘，使W失活。磷酸化 寡核苷酸使用核酸純化卡匣Hensorb 20純化。 (3 ) P s U - Η ί n d 11 段之裂備

經由使用T4 DNA接合_(參照第3圖），直接接合寡 核苷酸而製備具不同氡鹼基數之4 Pstl-Hindlll段。 20jul 5X 接合缓衝液（250nM Tr*is_HCl(pH7.6), (0mM

MgCU )及無菌水，加至1.5wg寡核苷酸（颶於組成各 Pstl-Hind III段之寡核苷酸中位在較佳tier股之5,端 )及各其充寡核苷酸，而將總髏積調為80W 1。所生 -22- 本纸張尺度適用中國國家«率< CNS ) A4*t格（2丨0X297公釐） --------^--If裝------訂------J-泉 . (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 321686 A7 _B7___ 五、發明说明（ >丨） 成之溶液於90¾加熱5分鐘，以2小時時間逐漸冷卻至 411〇;加人各10“11001«11〇>111及101^戌了？，加人2.5單 位T4接合酶（賫酒造公司産製），及於培育15小時。 反應溶液以等體積酚-氯仿處理，藉乙醇沈澱回收DNA而 用於後述實驗。 (1-6) EcoRI-Hind III段之製備（參考笫4圔） (1) EcoRI-PstI段（起動子區）與各Pstl-Hindlll段之 直接接合 各份1.0// g如上（1-4)分離之EcoRI-PstI段，及各0.5 yg具不同氡驗基數的四Pstl-Hindlll段，分別與5w 1 之0.3M Nall混合。5 wl寶酒造接合套件B液加至所得各 溶液，於26Ό培育1或1以上小時。反慝後，溶液經以 酚-氯仿處理，及以習知方式進行乙醇沈澱俾回收DNA。 (2) 以Hindlll— EcoRI切開接合反應混合物 回收的DH A殘渣個別溶於每分14.5w 1之無菌水中。4 以 1 5x Hindlll 缓衝液（50idM Tris-HCl(pH7.5), 35mM MgC 1 2 , 300bΜ HaC 1)及 1 2單位（1 . 5/i 1) H ind I 11加至 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 各溶液内，反應於37 t：進行1 . 5小時。反慝後，又加入 4 u 1 5xEcoRI 缓衝液，12 單位（1.0m1)EcoRI 和 5//1 無 菌水，又於3 7 C反應1 . 5小時。以等量酚-氯彷處理反應 溶液，然後，藉乙醇沈澱回收DNA。 (1-7)四具不同氮鹼基數之表現調節區EcoRI-Hindlll 段之選殖 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局貞工消费合作社印製 A7 ____B7__ 五、發明説明（^ ) (1)以 EcoRI-Hind III切開 pUC 18 於依本朵夫管（容積1.5nl)内·將無菌水加至25</g P (J C 1 8，1 0/i 1 1 0 X k 緩衝液（2 0 0 η Μ T r ί s - H C 1 ( p Η 8 . 5 )， 100βΜ MgCl3 , 10πΜ DTT， 100βΜ KC1)和 64 單位 18/i 1 )Hind III,而將總體積調為100ul,反匾於37¾進行 3小時。此反慝溶液以等體積酚-氛仿處理，藉乙醇沈 澱回收DNA。DNA殘渣溶解於75w丨無菌水，加人20w 1 5xEcoRI緩衝液和60單位（5w UEcoRI,反應於371C進 行3小時。反應後，反應混合物同樣接受酚-氣彷處理 與乙醇沈澱。回收的DHA溶於TE至0.25//g/wl,用於 下述實驗。 (2) 四表現調節區EcoRI-Hind III之插入pUC 18 (EcoRI-Hind III) 各 60ng(l# 1)四 EcoRI-Hind III 段及各份 500ng(2w 1) pUC 18(EcoRI-iHncl III)分別置於依本朵夫管内，加入 每份24w 1寶酒造接合套件A液，繼以充分混合。又將每 份3/u 1賓酒造接合套件B液加至混合後之溶液内；混合 後，於16C反應2小時或以上。此等溶液用於下述實驗 〇 (3) 大量製備pARup 1,2,3及4 於各3/i l(56ng)接合溶液内加入各份100u 1之經以 CaCl 2處理之大腸桿菌JM 10 9細胞懸浮液，繼以溫和攪 拌。混合後之溶液於冰水中培育30分鐘，又於42¾培 -2 4 - 本纸張又度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） I.n ϋ ϋ n n-n ^ .裝 II 訂— I — —^ V. (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印裝 A7 _____B7_ 五、發明説明（) W2分鐘，而使細胞將DN A攝入其中。於此懸浮液内加 入每份1·1之2YT液態培養基，於37它振搖培養1小時後 ，混合物接種於整分2ΥΤ瓊脂培養基（含有50«s/b1安 比西林· 40ag/l X-gal. 23.83g/l IPTG 和 1.5% 瓊脂 )上。經由自所得白色_落製備質體，及分析限剪内核酸 酶圖譜，分別篩檢擄帶有所需質體pARup 1,2,3及4之菌 落。 攔有質體？41{1^1,2,3及4之傾別菌落，於每份200««1 之2YT液態培餐基（含100wg/nl安比西林）内培育；藉 SDS-驗方法大量製得個別質醱DHA。 (1-8) EcoRI-iUnd III 段之分離 各20//8(20//1)大量製備之質體〇»^卜戍1?1^1,2,3及 4)分別置依本朵夫管内，將每份20 «1之10 xk緩衝液， 每份12 0單位（1 5 w 1) H i n d 111及無菌水加入其中，而將 總體積調為200w 1。對各質體準備6根此依本朵夫管。 於37¾培育3小時。反應後，反謳混合物經酚-氛仿處 理，藉乙醇沈澱收集DNA,及溶於毎份150wl無菌水。 此等DNA溶液内加人每份40wl之5xEcoRI缓衝液，及每 份120單位（10u l)EcoRI,於37t!培育3小時。反慝後 ，藉乙醇沈澱回收DNA。期望的各段DNA段藉1.5%瓊脂 糖膠電泳分離。分別由凝膠上電溶離DHA,使用核酸純 化卡里^115〇1^20純化（八1{1^1，2,3和4)。 II轉錄終結（终結子）區之製備（參照第5圔） -25- 本纸張>^適用中國國家榇準（CNS ) Λ4ΐΙ#· ( 210X2_97公釐） --------；—ΙΓ 裝------訂------^ •(請先閲讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7_ 五、發明説明（蛉） (II-l) pANP 1155之選殖 於100 « I之經以50bM CaC 12處理的大腸桿菌JM 109 之細胞懸浮液内加人500wg(0.5w 1)pANP 1155(K. Shinozaki et.al.，Proc.Nath.Acad.Sci.USA 80:4050-4054 ( 1 983)),其中於 PBR 322 之 Pst I 址插人約 1500bp ，之一段，内含 Anacystis nidulans 6301 之核薛糖-1,5-二磷酸羧基酶/氣化酶之終結子區，繼以溫和攪拌。混 合液於冰水中培育30分鐘，又於42¾培育2分鐘，而使 細胞將DNA攝入其中。於此懸浮液内加入lml LB液態培 養基，於37¾振搖培養1小時後，混合物接種於LB瓊脂 培養基（内含：12.5« g/画1四琢素及1.5%瓊脂）上，分 離所得菌落。 分離所得菌落於2.81 2YT液態培養基（含25« g/四環 素）内培養，藉SDS-鹸方法大量製備質醱DHA。 (II-2) Eco52I-Pst I段之製備 (1) Pst I段之分離 於依本朵夫管（容積1.5·1)内，將無菌水加至20ug( 20// 1)大置製備之 pANP 1155 DNA, 20w 1 10x High缓 衝液，及120單位（10«l)pst I而將總體積調為200wl 。總計準備6根含前述内容物之依本朵夫管（容積1.5ml ),於各管内於37¾培育3小時。反應後，藉乙醇沈澱 回收DNA,然後，藉1.5%瓊脂糖膠電泳分離期望的DNA 段（約l,500bp)。分離得之DNA藉Geneclean純化，用於 -26- 本纸張尺度適用中國國家輮率{ CNS > A4*t格（2丨0X297公釐） !—裝 1—^1 訂 I—y V· . .ί - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 321686 五、發明説明（>文） 下述實驗。 (2)以 Eco52 I切開 Pst I段 於 64.5wl(約 10«g) Pst I 段 DNA 溶液内，加入 7.5//1 10xEco52I缓衝液（ΙΘΘβΜ Tris-HCl(pH9.0), 30·Μ MgCU ,1，000βΜ HaCl, 0.1%BSA),及 18單位（3wl)Eco52I (Toyobo公司産製），於37=0培育3小時。培育後，混合 物接受酚-氛彷處理，及乙醇沈澱，及回收沈澱的DNA。 回收得之DNA溶于8w 1無菌水。 (11-3) pARut 13之生成 (1) Eco52I-Pst I 段之鈍化 lwl DNA鈍化套件（寶酒造公司産製）X10缓衝液加 至II-2製備之8wl Eco52I-PstI段DNA溶液内，於70C 培育5分鐘後，混合物移至37t：恆溫浴。於DNA鈍化套 件内，於此4液内加入Ιϋΐ T4 DHA聚合8每，混合物皆 滴液溫和混合，及於37¾反應混合物5分鐘。反匾後， 於DNA鈍化套件内，於此溶液内加入40//1 DNA稀缓衝液 ，混合物皆渦旋強力攪拌而使酶失活。 (2) 以Smal切開pUC 13及去磷酸化作用 於 20wg(20w 1)pUC 13 DNA内加人 40u 1 5xSmaI緩 衝液（5 0 b Μ T r i s - H C 1 ( p Η 8 . 0 )，3 5 id Μ M g C 1 2 , 1 0 0 b Μ K C 1 ，35βΜ 2-氫硫基乙醇，0.0 5%BSA), 80單位（10«l)SmaI (賫酒造公司産製），及130wl無菌水，趄以於30t反應 4小時。反應後，反應混合物以酚-氛仿處理及接受乙 -27- 本紙張Λ度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ! I I 「裝 I I __ I II 訂— ^ · V, (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央梂準局貝工消費合作社印裝 A7 B7___ 五、發明説明（以） 醇沈澱，回收DHA。回收得之DNA溶于100wl 0.1·Μ Tris -1Κ1(ρΙ18.0),加人10wl驗性磷酸_溶液（1.0單位齡性 磷酸酶（AP,寶酒造公司産製），10bM Tris-HCl(pH 7.5) ,50bM NaCl, IbM ZnS(U ),於 3710 反應 2 小時。反應 後又加入10w 1鹼性磷酸_溶液，繼以於65*C培育30分 鐘。反應溶液經以酚-氣仿處理，DNA經以乙醇沈澱· 收集，及溶解於TE至0.5wg/wl。 (3)鈍端段之插人pUC 13(Sna Ι,ΑΡ) 2u 1寶酒造接合套件Α液加至2w 1 (約100 ng)鈍端 段DHA溶液及2w l(1.0«g)經鹼性磷酸酶處理的pUC 13 D ΝΑ溶液，逛以充分攪拌。於此溶液内加入4« 1寶酒造 接合套件Β液，經充分攪拌後，於16*C培育1小時或以 上。反應後。此溶液用以轉形大腸桿菌JM 109。 (II-4) BanHI-EcoRI段之製備 (1)大量製備pARut 13 經濟部中央標準局貝工消费合作社印装 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於lw 1 (約40ng)接合溶液内加人100« 1經以50·Μ CaCl2 處理之大腸桿菌JM 10 9細胞懸浮液，繼以溫和混合。混合 後之溶液於冰水中培育30分鐘，逛以於42t培育2分鐘 ，而使細胞將DNA攝入其中。lnl 2YT液態培養基加至此 懸浮液内，於37Ό振搖培育1小時，懸浮液接種至2 YT 瓊脂培養基（含50wg/nl安比西林，40Bg/l X-gal, 2 3.83ng/l IPTG及1.5%瓊脂）上。由所得白色菌落製 得質體，分析其限剪内核酸梅圖譜，藉此篩檢攜有期望 2 8 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 ___B7__ 五、發明説明（、？） 的質匾pARut 13之菌落。篩檢得之菌落於400·1 2YT液 態培養基（含100«g/Bl安比西林）内培養，藉SDS-齡方 法製得大量質體DNA。 (2) BanHI-EcoRI 段之分離 準備8依本朵夫管（容積1.5ml),於其中，於15ug( 1 5/ζ 1)大量製備之質體D N A ( p A R u t 1 3)内加入2 0 « 1 10x k缓衝液，12 0單位（10«1)Β3·ΗΙ(寶酒造公司産裂 )及無菌水而諝成總體積200 // 1。各管於30*0培育3小 時。反應後，反應混合物以酚氛仿處理，藉乙醇沈澱收 集DHA,溶於各份110W1無菌水中。於此等DHA溶液内， 加入每份30«1 5xEcoRI缓衝液，及毎份120單位（10 W 1) EcoRI,繼於371C培耷3小時。反應後，藉乙酵沈澱回 收DNA,藉1.5%瓊脂糖膠電泳分離期望的DNA段（約300 bp)。由凝膠上分別溶離出DKA。使用核酸純化卡匣 Hensorb 20純化。

Illh操縱子之生成

(III-1)轉錄終結區與h基因之接合 (1)以 B a b Η I - E c 〇 R I 切開 p U C 1 3 - h - S 0 D 於依本朵夫管内，於10tfg(20«l), pUC 13-h-S0D( 參照日本第21012 9/ 1989號特許申請案說怪諸例1)〔其 中於PUC 13之Hindlll-Bam HI址已插入编碼著人超氧化 物變異酶之股全長（475bp)DHA段]，加入40//1 5X EcoRI缓衝液，120單位（10wl)EcoRI,及無菌水而調成 -29- 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — II — — — — —(I 裝— —訂 JT 泠 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 A7 _B7_ 五、發明説明（畤） 總匾積200« 1,於371C培育3小時。反醱後，反醮混合 物以酚-氣仿處理，藉乙酵沈澱收集DNA,及溶於215 μ 1無菌水。此溶液内加入25« 1 10Xk缓衝液及10 0單 位（10w DBamHI,於30它反慝3小時。反應後•使用 Geneclean純化 DNA。 (2)將轉録終結區（BamHI-EcoRI)插人 pUC 13-h-SOD (BanHI-EcoRI) 11.2w 1賽酒造接合套件A液加至500Bg(lu 1)pUC 13 -h-SOD(BaBHI-EcoRI)DHA,及 60ng(0.4tt 1)11 裂備之轉 錄終結區，繼以充分混合。將1.4w 1寶酒造接合套件B 液加至此溶液内，經充分攪拌後，於16¾培育30分鐘。 反應後，此溶液用以轉形大賭桿菌JM 109。 (III-2) Hind III-EcoRI(hSOD-終結子）段之製備 (1)大量製備 pUC 13-hSODt 於2wl (約70ng)接合溶液内，加入100wl經以50·Μ CaCU處理的大腸桿菌JM 109細胞懸浮液，繼以溫和混 合。混合溶液於冰水中培育30分鐘，然後於421C培育2 分鐘，而使細胞攝入DNA。添加1 ml 2YT液態培養基後 ,所得混合物於37C振搖培養1小時，然後接種至2ΥΪ 琪脂培養基（含有50wg/rol安比西林，40ng/l X-gal ,23.83mg/l IPTG及1.5%理脂）上。由所得白色菌落 製備質體，攜有所需的DHA段之_落，經由分析其限剪 内核酸酶圖譜進行篩檢。筛檢得之菌落於60 ml 2 YT液態 -3 0 _ 本紙張尺度適用中國國家鏢攀（CNS )Μ洗格（2丨0X297公釐） .— —-I 裝 —— II 訂 • (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 321686 A7 £7_ 五、發明説明（对） 培餐基（含100«g/Bl安比西林）内培餐•藉SDS-齡方法 製得質餵DNA。 (2) HindI II-EcoR I 段之;分離 準備二依本朵夫管（容積1.5b1),其中於50wl(25wg) 製妥的pUC 13-hSOD DKA溶液内加入20wl 10xk缓衝 液，120單位（15«l)Hind III及無菌水而調成總體積 200wl。於各管内，於37t：培育3小時。反匾後，反應 混合物以酚-氰仿處理•藉乙醇沈澱•收集DNA,及溶於 150wl整分之無菌水中。於此等DHA溶液内，加入每份 40w 1 5XEC0RI 缓衝液及每份 120 單位（10tfl)EcoRI, 於37t：培育3小時。反應後，藉$酵沈澱回收DNA,藉 1.5%瓊脂糖膠霣泳分離所需DH A段（約7 90 bp)。使用 Geneclean純化 DNA。 (III-3) Hind III-EcoRI(hSOD-終結子）段與表現調 節區ARup 1,2,3及4之接合（參照第6圓）

準備依本朵夫管，其中，於各1.12ws(2.1/il表現調 節區（冉81^1,2,3及4)及2.11//6(2.2//1)整分之11111<1111 -EcoRI段内·分別加人每份4w 1之5X接合缓衝液（250·Μ Tris-HCl(pH 7.6), 50mM MgCU ),每份 2w 1 100bM DTT ，每份2w 1 ATP,每份2.5單位（1/i 1)Τ4 DNA接合酶（ 賫酒造公司産製）及無菌水，而調成總體積20wl。於此 等管内於15Ί0培育隔夜。藉60C熱處理10分鐘中止反應 。於此等溶掖内加入每份10« 1之5xEcoRI缓衝液，及 -31- 本紙張尺度適用中國困家橾準（CNS > A4規格（210X297公釐） ； |「，裝 —訂 . f 汉 (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 經濟部中央梂準局貝工消费合作社印装 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 A7 B7__ 五、發明説明（知） 分別加入每份12單位（1/u丨）之EcoRI及無菌水而將總體 積調成50w 1。此等溶液於37t：培育3小時。反應後， 藉2%瓊脂糖膠電泳分離所需各段DNA(參照第7圖，各 約1200bp)及使用Geneclean純化。 (III-4)四SHOD基因表現性DNA段之選殖 (1) EcoRI切開pUC 18及随後之鹼性磷酸酶處理 於依本朵夫管内，於20/zg(30wl)質體pUC 18 DNA内 加入40« 1之5xEcoRI缓衝液，添加120單位（10w l)EcoRI 及無菌水而將總體積調為2 00 wl,及於37 t：培育3小時。 反應後，反應混合物以酚氯仿處理，藉乙酵沈澱收集DHA ，溶於 100m 1 之 0.1M Tris-HCl(pH 8.0)内。10« 1 驗性 磷酸閾溶液加入此溶液内，及於37C培育1小時。反應 後，又加入10wl鹼性磷酸酶溶液，於65C培育30分鐘 。反應溶液以酚-氣仿處理，藉乙醇沈澱收集DNA,及溶 於 TE至 0.16w g/ ml。 (2) hSOD操縱子段插入pUC 18(經EcoRI及Ap處理） 每份24m 1之寶酒造接合套件A液分別加至各100ng(l w l)hS0D操縱子（起動子- SOD-終結子1,2,3及4)〇1^及320 ng(2iU 1)整分之經EcoRI及鹼性磷酸酶處理之pUC 18DNA ，繼以充分攪拌。每份1之賫酒造接合套件B液加至 此等溶液内，經充分攪拌後，於1它培莆隔夜。 (3) 大量製備 pUC 18-Rupt-hSOD 1,2,3及 4 於各4W 1 (約50ng)接合溶液内加入毎份200« 1之經以 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公釐） ------^———II裝-------訂------Γ涑 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 五 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 、發明説明（J) 50nMCaCl2處理之大腸桿菌 109種条细胞懸浮液， 繼以溫和攪拌。此等混合液於冰水中培育3Θ分鐘，又於 42t：培育2分鐘，使細胞將DHA攝入其中。毎份lml之2YT 液態培養基加至此等懸浮液，經於37t：振搖培養1小時 後，混合物接種於部分於部分2YT瓊脂培養基（含50wg/ ml 安比西林，40ng/ml X-gal, 23.83ail/l IPTG 及 1.5 瓊脂）上。由所得白色菌落製備質體，藉分析其限剪内 核酸N圖譜而分別篩檢撝帶有期望的個別質體（〇11(：18-111^1;-^00 1,2,3及4)之菌落。篩檢得之各菌落於毎份 200ml之2YT液態培餐基（含100tt g/»l安比西林）内培養 ，藉SDS-鹼方法大量裂備各質醱DNA。 (4) EcoRI段（約 1200bp)之分離 對每種質體準備三根依本朵夫管，於各管内將每份40 1之5x EcoRI緩衝液，每份120單位（10W l)EcoRI及每 份130W1無菌水，加至各約20Wg(20tfl)大量製備之質 體（pUC18-Rupt-hS0D 1,2,3 及 4)〇 於此等管内，於 37t： 培育3小時。反應後，藉乙醇沈澱收集D Η A,及對各質 體溶於每份100w 1 TE。藉1.5%瓊脂糖膠電泳分離期望 的個別DNA段（約l,200bp)及使用Geneclean純化。 IV供藍緣藻用之hSOD基因表現載體之生成（參照第8圖 (Π-1)將多選殖址（衍生自PUC18)引進pBR 322 (1)以EcoRI-Hind III切開pBR 322及隨後之鹾性磷酸 酶處理 -33- _ ^ 『 裝 、tr^ V. (請先閲讀背面之注意事項再填k本頁) 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐} 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（A) 於 20w l(10w s)pBR322 DNA溶液内加入 40W 1 之 5x Hind III緩衝液（50·Μ Tris-HCl(pH7.5), 35·Μ MgCU ，300bM HaCl)· 80單位（10« l)HindIII及 /30u 1 無菌 水，於37¾培育2小時。反應後，於此溶液内加入40« 1 之5x EcoRI緩衝液，120單位（10m l)EcoRI及50« 1無菌 水，又於37t：反應2小時。反匾後，反應混合物以酚-氛仿處理，藉乙醇沈澱收集DHA,及溶于100W 1之0.1M Tris-HC1(PH8.0)内。10«1驗性磷酸酶溶液加至此溶液 ，於37 t：培育1小時。反應後，加入10 « 1驗性磷酸囊每 溶液，於65¾培育30分鏡。此溶液以酚-氯仿處理，藉 乙醇沈截回收DKA。 (2) 由pUC分離多選殖址（EcoRI-Hind III) 準備二根依本朵夫管，其中將2//1之10xk缓衝液， 80 單位（10/z l)Hind III 及 140tf 1 無菌水加至 30# 1(20 w g) PUC18 DHA溶液，及於37t：培育3小時。反應後， 反應混合物以酚仿處理，藉乙酵沈澱收集各DNA,及 於溶於112.5w 1無菌水。於此等溶液内分別加入毎份30 wl之 5xEcoRI缓衝液及 90單位（7.5wl EcoRI,於 37C 培育3小時。經由乙醇沈澱收集DNA ,然後接受1 . 5%瓊 脂糖膠電泳，侔分離期望的DNA段（約50bp)cDNA自凝膠 中電溶離出，藉酚-氛仿處理及乙醇沈澱而純化。 (3) pBR 322 (EcoRI-Hind III切開）與多選殖址之接合 1 TE及24u I寶酒造接合套件A液加至0.2/i l(lwL) -34- 本紙張尺度適用中國·家標舉（CNS > A4«t格（210X297公釐） — — — — — — ^~ 裝 I 訂 I I —^1穸 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印氧 A7 B7 五、發明説明（w ) pBR 322(EcoRI-Hind III, AP處理）DNA及 0.2« g(lw 1)

多選殖址DNA,进以充分攙拌。將3/z 1寶酒造接合套件B 掖加至此溶液，於16C培育4小時。 U)質體PBR 322M之選殖 於3w l(40ng)接合溶液内加入200w 1經以CaCU處理 的大腸桿S1HB 101细胞懸浮液，趙以溫和攢拌。混合液 於冰水中培育30分鐘，然後於42C培育2分鐘，使得細 胞將DNA攝入其中。1.8β1之2ΥΤ液態培餐基加至此懸浮 液，於37TC振搖培養1小時後，混合物接種至LB瓊脂培 養基（含50 wg/iil安比西林）上。藉著自所得菌落製備 質匾，及分析其限剪内核酸醐圖繕，筛檢搞有期望的質 體（pBR 322M)之菌落。篩檢得之菌落於300b1 2YT液態 培養基（含100w s/nil安比西林）内培育，藉SDS-弟方法 大量製備質體DNA。 (IV-2) PvuII Eco47III 段（2550bp)之分離 準備三根依本朵夫管，其中於如上（IV-1)製備之10wg (10u 1)pBR 322M 質體 DHA 内，加入 20W 1 之 10XM 缓衝 液（100bM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl2 , 10mM DTT ,500nM NaCl), 120單位（10// l)PvuII(寶酒造公司産 製），及無菌水，而調成總體積200W1。於此等管内， 於37¾培育3小時。反應後，反匾混合物以酚-氛仿處 理.經由乙醇沈澱收集DHA,及溶於174Π丨整分之無菌水 中。於此等溶液内加入每份20wl 10XH缓衝液及24單 -3 5 - 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS > A4規格（210X297公釐} ------；——「i— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印裝 S^1686 A7 B7 五、發明説明（并） 位Eco47III(寶酒造公司），於37*C培育3小時。DHA以 乙醇沈澱及回收，藉1.5%瓊脂糖膠電泳分離期望的DHA 段（2550bP)。分離得之DNA段使用Geneclean純化，及溶 于 50W 1 0.1M Tris-HCl(pH8.0)。5w 1 鹼性磷酸酶溶液 加至此溶液内，於37T培育1小時。反應後，加入5« 1 鹼性磷酸酶溶液，又於65¾持續培育30分鐘。反應後， 反應混合物以酚-氣仿處理，藉乙醇沈澱，收集DNA,及 溶於 20 /i 1 TE。 (IV-3)於A . n i du 1 ans分離PBAS 18之複製起點 於大腸桿菌HB 101内引進介於大腸桿菌與A.nidulans 間之穿梭載體 pBAS 18(K.Sh〖onozaki et. al.,基因 19: 22 1 -224 ( 1982)),其中内 A.nidulans 6301 之生質匾（以 pBAI及BanHI切開）己插人pBR 322之BanHI址。所得種条 於LB液態培養基（含50// g/ j〇1安比西林）内培餐，藉SDS-鹼方法大量製備載體。 準備三根依本朵夫管，其中，於14wg(20wl)所製得 之PBAS 18 DNA加入20ϋ1之10xk缓衝液，100單位（10//1 )BamHI及無菌水，調為總體積20« 1，於301C培育3小 時。反應後，藉乙醇沈澱回收DNA,藉1%瓊脂糖膠電泳 分離期望的〇^段（9841,約8.1^0)及藉〇6»1<;丨6311純化。 於g(5« 1)經分離與純化的pBAl(經以BainHI切開） DNA,加人 5wl 10xk 缓衝液，24 單位（2ul)XhoI 及 38 wl無菌水，於37它培育3小時。反匾後，反應混合物 _ 3 6 - 本紙張尺度逋用中國國家橾率（CNS > A4規格（210X297公釐） -------I .— .—「裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂_ 4 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 _________B7 五、發明説明（π) 仿處理，藉乙酵沈蹐收集dna。所得之經BaeHI ~Xh〇I切開之dha之兩端使用寶酒造接合套件弄鈍。 (IV-4)縮小的大腸捍菌-A.niduUns穿梭載體、p B A X 1 8 (6.9 kbp)之生成 (1) pBAX18(約 6.9kb)之製備 48// 1簧酒造接合套件a液加至40ng(2w 1)弄鈍的DHA 及2 00wg(4« l)PvuII-Eco47I段DNA,及經充分攪拌後 ，加入6wl B液，及於16Ό培育4小時。使用此溶液 轉移大腸捍菌HB 101種条，接重於LB瓊脂培養基（含 50« g/ ml安比西林及1.5%琪脂）上，獲得菌落。由所 得菌落製備質體，經由分析其限剪内核酸酶圖譜而篩檢 攜有所需質體ΡΒΛ X 18之菌落。筛檢得之菌落培養於2 YT 液態培養基（含100wg/ml安比西林），藉SDS-鹼方法製 備質體DNA。 (2) pBAx 20 (約 5.8kb)之製備 2wl 之 10XM缓衝液，lw 1(12 單位）PvuE，及 13// 1 無菌水加至1« g(4/z 1)如上（IV-3)製備之BamHI-Xh〇I( 已純化）DNA段，及於37¾培育3小時。於2w l(100ng) 此反應溶液内，加入100ng 12ul)之口）所製備之PvuI Eco47 DNA段•及16«1寶酒造接合套件A液，經充分搜 拌後，加入4/ti 1 B液，及於161C培育2小時。反應後， 大腸桿菌HB101以此溶液轉形，及接重於LB理脂培養® ( 含50ug/oil安比西林及1.5%瓊脂），俥得菌落。由所得 -37- 本紙張尺度適《肀·*家尊♦ (CNS> A4規格（210X297公釐） -----------「¥-------tr------- ^ •(請先閱讀背*之Ϊ事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 A7 __B7_ 五、發明説明（W ) 菌落篩檢鶼有所需質體（PBAX20)之菌落，於20·1 2YT液 態培餐基（含100Wg/ail安比西林）内培餐，藉SDS-篇方 法製備質體DHA。 (IV-5)~U2;hS0D基因表現載體之選51〜ϋΐ; (1) 以EcoRI切開ρΒΑΧ18及隨後之鹼性磷酸酶（ΑΡ)處理 準備兩根依本朵夫管，其中於10«8(20«1)?&4¥18〇以 内加入40w 1之5x EcoRI緩衝液，120單位（10w l)EcoRI 及130W 1無菌水而調成總體積20 0 w 1。各管内於371C培 育小時，藉Geneclean純化DNA及溶于100wl之0.1M TMs-HC1(pH8.0)。將10« 1齡性磷酸酶溶液加至此溶液 ，於3 7 C培育1小時，又加入10// 1酴性磷酸酶溶液後， 於65¾培育30分鐘。反慝後，反慝混合物以酚-氛仿處 理，及藉乙醇沈澱回收DNA。 (2) hSOD操縱子與PBAX18 (EcoRI, AP處理）之接合，大 量製備 每份0.5w g(0.1/z 1)之經以EcoRI及AP處理之PBAX18 分別加至各0.25« g(l/Lt 1)之如（H -4)所製之四hSOD操 縱子（約1.2kbP),使用賫酒造接合套件進行接合。大腸 桿菌ΗΒ1Θ1種条分別使用此等接合溶液轉形，個別含轉形 體之液體接種於LB9脂培養基（含50 w g/ 安比西林） 上而得菌落。由所得菌落製備質簏，藉分析其限剪内核 酸酶圖譜，篩檢撝有期望的個別質體（PBAXS0D6, PBAXS0D7 P B A X S 0 D 8 , ρ B A X S 0 D 9 , p B A X S 0 D 6 - 4 , ρ B A X S 0 D 7 - 4 ,及 _ 3 8 _ 本紙張尺度適用中家標窣{ CNS >八4«1格（210X297公釐） ------；--1「'裝-------訂------^，^ (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印装 A7 ___B7_ 五、發明説明（W ) PBAXS0D8-4)之菌落。篩檢得之値別菌落於每份50b1之 LB液態培養基（含l00Wg/Bl安比西林）内培養，藉SDS-鹼方法製備質體DNA。 (3) 以EcoRI切開PBAS18及隨後之驗性磷酸梅（AP)處理 於依本朵夫管内，於18//8(30«1)口8&$18〇“内加入 40w 1 之 5xEcoRI緩衝液，12單位（10w l)EcoRI及 120// 1 無菌水而調成總體積208以1,於37t：培育3小時。反應 後，反匾混合物以酚-氛仿處理，繼以氯仿處理，藉乙 酵沈澱回收DHA。回收得之DHA溶於100 1之0. 1M Tr is- HC1(PH8.0),加入10wl齡性磷酸酶溶液（1單位/10»1 ),於37*C培育1小時。隨後，加入10/zl驗性链酸鷗溶 液，於65¾培育30分鐘。反慝後，反應混合物以酚氛仿 處理，繼以氯仿處理，藉乙醇沈澱，純化與回收DH A。 (4) hSOD操縱子與pBAS18(經以EcoRI及AP處理）之接合 以及大置製備 每份1.5« g(2w 1)之經以EcoRI及AP處理之PBAS18, 加至各0.25w g(l// 1)之如上（ -4)所製之四hSOD操縱 子（約1.2kb),使用寶酒造接合套件進行接合。大腸捍 菌HB101種条使用此等反應溶液個別轉形，接種至LB瓊 脂培養基（含50 w g/ ml安比西林-1.5%瓊脂）上獲得菌 落。由所得菌落製備質體，藉分析其限剪内核酸酶圖譜 ,篩檢撝有期望的質體（PBAS0D6, PBAS0D7， PBAS0D8， 及PBAS0D9)之菌落。筛檢得之個別菌落於每份200nl之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2!0><297公釐） ------：--—裝------訂------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 A7 __B7 ___ 五、發明説明（3〇 2YT液態培養基（含100/ig/il安比西林）内培養，使用 SDS-驗方法製備質腥DNA。 V 使用藍緣藻 Anacystis nidulans 6301 及 R2 表現 hSOD 基因 (V-l) A.nidulans 6391 (Synechcoccus PCC 6301 )及 R2 (S jr n e c h o c o c c u s P C C 7 9 4 2)之轉形 已於每份100· 1之BG-11液態培養基内培養1至5目的 傾別細胞，經由以8,000rpB離心5分鐘收集，及懸浮於 每份10b1之新製液態培養基（108 -10s細胞/ ·1)内。 各lal細胞懸浮液倒入聚乙烯管（Falcon 2059)内•裂得 之質體DNA分別以0.1至10wg濃度置於管内。裂妥之管 分別覆以鋁箔，於30亡培育隔夜後，移開鋁箔，然後， 於3(31C於光照下又培育6小時（光源：冷白螢光燈； 1,000-2,000勒克司）。取各100至500 w丨之細胞懸浮液 ,接種於BG-11瓊脂培養基（含有1»M硫代硫酸納，1至 5//8/1»1安比西林，及1.5%瓊脂）。平板於光照下培養 4至10日（光源：冷白螢光燈；2,000-3,000勒克司）。 (V-2)培養 所得菌落移至毎份2b1之BG-11液態培養基（含10« g/ ml安比西林）及於光照下培養10日（光源：冷白螢光燈； 2,000台3,000勒克司）。然後，培養醪移至每份100nl之 BG-11液態培養基（含10w g/Bl安比西林），於光照下培 養20日（2,000-3,000勒克司）。取各10ml培養醪，分別 -4 0 - 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ------：丨—丨「丨裝-------訂------^旅 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本真) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（^) 移至每份100·1之BG-11液態培養基（含50w g/*l安比西 林），及於光照下培育20日。經由於8,000rp«i及4t：離心 10分鐘而收集各細胞，再度懸浮於1·Μ Hepes缓、.衝液（pH 7.0)内，藉離心洗滌。洗滌後，個別細胞儲存於- 20t： 至用於實驗為止。 (V-3) hSOD之檢測 (1) hSOD活度染潰 使用經由以核糖黃素進行光聚合法，所製得之丙烯醛 胺膠進行電泳（蛋白質，核酸與酵素11:744(1966))。電 泳後，凝膠以50bM8?酸鉀（pH 7.8)-0.5raM EDTA洗二至 三次（5分鐘），然後浸於硝藍四唑錄（NBT)溶液（2.5aM ΝΒΤ, 50πΜ 磷酸鉀，0.5mM EDTA,pH7.8)内 7 分鐘。随後 ，凝膠浸於核糖黃素溶液（100« Μ核糖黃素，30mM四甲 基乙撐二胺，5 0 π Μ磷酸鉀，0 . 5 m Μ E D T A , p Η 7 . 8 ),於 白光中染漬至膠中出現對比為止。結果示於第9圖。此 圖中，具SOD活性之部分未經染漬，而其它部分染成紫 色。由此可知，除Anacystis n i d u 1 a n s本身具有的F e -SOD活度外，於轉形體檢得hSOD活度。 (2) 以抗-人-SOD抗體進行檢測 (2 - 1)西方吸漬 於還原態及Laemmli等人（自然237,680(1970))之條 件下，使用20%SDS -聚丙烯醯胺膠進行電泳。電泳後， 凝膠内之蛋白質藉電轉移至硝基繼維素膜（Aniasham公司 —4 1 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4说格（210X297公釐） ------------裝-------訂------J旅 • (請先％讀貧面之注意事項再填寫本瓦) 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印裝 A7 ___ B7__ 五、發明説明（4。） 産製，Hybond(C))上。膜浸沒於含0.3%H3 〇2之50% 甲醇内20分鐘，使内生性過氣化酶失活，然後•於37C 浸於 TBS〔（20bM Tris-HCl, 0.9%NaCl, PH7.4)含 5% 脱 脂乳及0 . 1% Tween 20 (封阻）〕内2小時。膜接受封阻 處理，以洗滌液（含0.05%T»een 2 0之TBS)洗5分鐘， 繼以於37 t：於含1/ 1000抗-人-SOD抗醱（caprine IgG, Binding Site公司産製）及0.1%T»een 20之TBS内培育 2小時。膜以洗滌液洗20分鐘（5分鐘X 5);然後，以含 10eg 二胺聯苯胺（DAB)及 15/z 1 3 2%H2 〇2 之 0.1M Tris -HC1(ΡΗ7.4)40·1 染漬。 結果，於線上檢知染成褐色的一帶，此處偽由轉形體 所得抽些物被電泳之處，也是標準樣品hS0D(SigBa公司 生産的同一位置（第10圖）。 (2-2) Ouchterlony方法（免疫學賨驗指南，74-77頁， Gakkai Shuppan 中心出版）

1.2%瓊脂糖膠溶液（含有10·Μ磷酸鹽缓衝液（pH 7.2 )，0.15M HaCl,及 0.1%IUH3 )於培養皿（Falcon 1029 )内固化至厚2至3 b m ,於適當位置打孔。1 0 w 1抗-人-SOD抗匾置於中心孔，而轉形體抽些物（各10« 1), A. nidulansR2 (非轉形體）抽些物（40wl)作對照，及標 準樣品hSOD分別置周圍各孔内，於4¾培育隔夜。培育 後，由培養皿中取出瓊脂平板，浸於pBS(10inM磷酸鹽緩 衝液，pH 7.2, 0.15M NaCl),藉此充分去除蛋白質（PBS -42- 本紙張尺度適用t膚*家樣率（CNSM4規格（21〇Χ297公釐） (锖先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) ‘裝· 訂 321686 A7 B7 五、發明説明（ 置換數次，2至3日）。此板浸於0.5%酵胺黑溶液（90·1 甲醇，10ml冰酷酸）内染漬。结構顯不抗-人-SOD抗體與 標準樣品hSOD間，及抗-人-SOD抗體與轉形體抽些物（6-4 ,8-4)間生成沈澱線。又復，出現沈澱線组合成單一線 (3形），因而證實於轉形體内生成與標準樣品hSOD相同 的抗原（人-SOD)(第11圖）。 (3) h-SOD活度之檢測 雖然 Anacystis nidulans有生産 SOD(Fe-SOD),但可 利用其被IbM KCN抑制之差異，測量hS0D(Cu Zn-SOD)與 内生性SOD(Fe-SOD)之活度區別。光學試管（lei)内放置 50bM 磷酸鉀（pH7.8), 0.1bM EDTA, 0.1·Μ 黃嗦昤，10tfM 細胞色素C(馬心III型，Sigma公司産製）及樣品（SOD), 將總體積調為980w 1。將20« 1之黃嘌昤氧化_ (Boehringer -Mannheini公司出品）加至其中，起始反應，隨著於550 mm之吸光率起始速率（30至60秒）之加快•测定細胞色素 C之還原，此值以v表示。未添加SOD樣品時，細胞色 素C之還原速率表示為v 。於此等條件下· SOD抑制50% 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁} 細胞色素C之還原定為1/ 3單位，由（v/ V -1)测定樣 品内的總單位數（植物酵素'蛋白研究方法，373頁，

Koji Asada, Kyoritsu出販公司）。復次，將 100mM KC1 (1 0 w 1)加至已測定v之反匾溶液，測定細胞色素C還 原速率 V ’及單位數（v/v ’-1)。測定 Anacystis nidulans 細胞内生成的hS0D{(v/i/-l)-v/ v ’-1)}之活度。 -4 3 - 本纸张尺度適用中國國家標準（cNS)M規格（210x297公瘦）

赘明説明（4y

结果， 得 自轉形體 之粗製抽些物之比活度 (毎 位之活度）顯示數值离0.7至12單位/ A280 (表 表 1 一 一— T Τ η 原始載 1 表現載醱 1 hSOD表現景（比活度， 1 體質體 1 | 單位 / Α28Θ) 1 -一 ~. + +--------- Η 1 PBAS0D6 | 6.57 1 PBAS18 1 PBAS0D7 | 8.85 1 1 PBAS0D8 | 7.61 ! 1 P6AS0D9 1 5.98 1 -\ i PBAXS0D6 I 7. 18 i PBAX18 1 PBAXS0D7 1 9.98 1 1 PBAXS0D8 1 11.79 1 ί PBAXS0D9 I 6.78 I 丄 JL 11 — — III·*_{ 裝！ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝

L 此外*此等比活度受原始載體種類，及仿SD序列舆ATG 間之氯鹺基數所強力影W. PBAXS0D8(基於PBAX18, SD 與ATG間之氦鹼基數為8)之比活度最高。 實施例2 於Anacyst is n i d u 1 a n s 6301株中刺炫魚成長荷爾蒙之 表現 44 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央揉準局員工消费合作社印製 A7 ______ _B7 _五、發明説明（4》） 编碼剌黢魚成長荷爾蒙186傾胺基酸殘基之基因，分 成21侮寡核苷酸，以化學合成之。21锢寡核苷酸於5,終 端礙酸化後，以DN A連接酶連接成完全長鏈之剌鬣魚 成長荷爾蒙基因（Hindlll.BaeHI片段）。此基因與實 施例1調製之RuBisCO啓動子區域（EcoRI· HindlllH 段）及終結區（BaBHI*EcoRI片段）連結，做成剌Μ魚 成長荷爾蒙基因表現用卡匣（cassette, EcoRI· EcoRI Μ段）。此刺酸魚成長荷爾蒙基因表現用卡匣，導入實 施例1做成之穿梭選殖載體ρΒΑ5(18之EcoRI側，做成刺氍 魚成長荷爾蒹基因表現嫌帶者。 將此鶼帶者導入Anacystis nidulans 6301细胞中。 100nl BG-11培養基培餐至對數增殖期之細胞，以8000rpm 離心5分鐘收集，以103細胞/ nI (0.D._ =3 )懸浮 於新鮮的掖體培養基中。此細胞懸浮掖分注入聚丙烯管 (Falcon 2059)中，並於各管中加人0.5-1.0/zg濃度 之調製的質醴DNA 。造些管分別以鋁箔包覆，於30Ό培 餐1晩後，移開鋁箔，於光照卞（1000〜2000勒克司） ，301下再培養6小時，取50~500« 1之細胞懸浮液，塗 覆至BG-11瓊脂培養基（含有1 bM硫代硫酸納，1 w g/Bl 安比西林及1.5%琪脂）平板於光照下培餐4~ 10日。藉由 剌Μ魚成長荷爾蒙基因表現載薛可轉形102〜103細胞 /以g質體DHA 〇 將由此所得之選殖體移至2 b1之BG-11 (含10tf g/nl -4 5 - — — — — II 裝 訂 —線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公着> 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 A7 ____B7 五、發明説明（44 ) 安比西林）液®培養基中，於光照下（2000~3000勒克司 )30t；培餐10天。其次，將此培餐液移至100·1之BG-1 1(含50wg/ml安比西林）液匾培餐基中，並同寧培養 。培餐之细胞以8000rpn，4C離心10分_·收集*並愍浮 於Hepes缓街液（ΡΗ7.Θ)中洗淨。洗淨後*細胞保存於 -20t!至用於實驗為止。 使用10~20 %SDS-聚丙烯醛胺膠，於Laeanli等人〔 Mature 237:680 (197 0)之條件下*進.行還原狀態下之 電泳。電泳後，膠以考馬斯亮藍（Cooeassie Brillian t Blue)染色。结果，由轉形暖萃取出之萃取液於泳動 道（lye)上，可檢測出野生株所不存在的約21仟道耳 呑之蛋白質帶。以光密度計測定结果，其蛋白質之表現 量逹金部可溶性蛋白質之約1%。 實施例3

Anabaena v a r i a b f 1 i s IAM Μ2Θ5株之轉形 於 Anabaena var iabi 1 is IAM M205细胞之質體導入， 為使用基因導入裝置GTE-10(島津製作所社製）*並以 電穿孔法進行。於100B1之BG-11培餐基中培養至對數增 殖期之细胞以10000ΓΡΒ雔心10分鐘收集，以1 nM HePes -NaOH (_ρΗ7.2)洗淨 2 次後，以 103 细胞 / ml ( O.D.7,0=3)魅浮於 1 bM Hepes-HaOH (pH7.2)中。於 腔室中置入细胞懸浮液50-100U 1及質匾DNA溶液（25~ 30以8)，霣氣條件設定為於港细器容SlwF及3«F中 本紙倀尺度遢州中**家樣舉（CNS ) MAIL格（210X 297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消资合作社印災 ^1686_^_ 五、發明説明（45 ) ，各以2.3〜2.7»s與8.1〜8.3bs時定數，電場強度6~8 KV/cb,並加入脈衝（pulse)。将印加有脈衝之细胞， 立邸移至新培餐基中，並於卜2日光照射下培奄·*>將此 细胞怒浮液塗布於0.5~lw g/Bl安比西林之BG-11琪脂培 養基中。此些平板於光照射T挎餐4-10天。 具有質匾PBAX18時可轉形10细胞/以S質浪DJA。 實施例4 S d ί r η 1 i n a platensis HIE S39株之轉形 於Soirulina platensis HIE S39细胞之質匿導入，為 使用基因導人裝置Gene Pu lser (日本B io.rad社製），並 依河田等之方法（日本農薛化學學會1992年度大會演講 要旨集2Zp22)以電穿孔法進行。將於100 ml之MM培養基 培餐至葑數增殖期（〇.D.66en«=1.0)之葎體，於培養基 中以超音波處理细分。细分化之细胞以4000xg離心10分 鏡收集，並再愍浮於MM培養基中*於弱光下培養1晚。 細分化葎塍以1 nM Hepes-HaOH (PH7.2)洗淨5次後， 以 O.D. βββ =0.5懸浮於 1 nM Hepes-HaOH ( ρΗ7·2).中 。於腔室中置入细胞懸浮液50-100 /zl及質匾DHA溶液（ 10〜20«ε)，電氣條件設定為於濃縮器容S1«F及 3 W F中，各以2.3〜2.7ms與8,1-8.3bs時定數，電場強 度6〜8KV/cb，並加入脈衝。將印加脈衝之落饅，立即移 至含有0.5%瓊脂之MM培養基中，並塗布於含有1.5%環 琪脂及5 Mg/ ml安比西林之MM培餐基中，於约1週光照 下培養。 具有質®pBAX18時可轉形10细胞/ms質體DMA 。 工茱逋用 依SL如此説明之本發明，可使用裔绿葎细胞作寄主， 以棰高效率表現有用肽，所裂得之肽可用作藥物•非® 藥物但可用於S藥治療之化學品，化粧品等•培餐轉形 的短绿辑可用作食品飼料及./或機能食品。 -47 - 本紙浪尺度通用中國國家搞芈（CNS ) A4说格（2丨0X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、tT -f

Claims (1)

1. S21686 公告尽

   、申請專利範圍 第81101836號「於藍綠藻細胞中表現人-S0D多肢之方法J 専利案申覆書 (8 5年12月-31日修正） 杰申誚專利範圍： 1.一種於藍錄藻細胞中表現人-SOD多肽之方法，该 細胞你靥於Anacystis nidulans·而該方法像以含有编 碼此多肽之结構基因之載髏DNA使藍綠藻細胞轉形，其待 擞在於當載體DHA為έ自質體PBAS18或PBAX18之載醱質體 ,及導入包含编碼人- SOD多肽之结構基因之操縱子時， Anacystis nidulans之RuBisCO基因之轉錄.起始區位於结 構基因上游，而RuBisCO基因之轉錄終结區位於结構基因 下游。 --------< -裝------訂-----一線 (請先閲讀背面之注項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）