KR0163062B1

KR0163062B1 - 폴리펩타이드의 형질발현 방법

Info

Publication number: KR0163062B1
Application number: KR1019920702851A
Authority: KR
Inventors: 히데아끼 하기와라; 야스노부 다께시마
Original assignee: 하기와라 요시히데
Priority date: 1991-03-13
Filing date: 1992-03-11
Publication date: 1998-11-16
Also published as: EP0533942B1; AU1565992A; EP0533942A4; PT100236A; IL101182A0; EP0533942A1; TW321686B; ATE141951T1; CA2082802C; JPH0767393B2; WO1992016641A1; IL101182A; JPH04330294A; CA2082802A1; OA09713A; FI925143A; PT100236B; DE69213145D1; FI925143A0; DE69213145T2

Abstract

생리학적 활성 폴리펩타이드를 코딩하는 구조 유전자, 구조 유전자의 상류에 위치한 아나시스티스 니둘란스 RuBisCO 유전자의 전사 개시 영역, 및 구조 유전자의 하류에 위치한 RuBisCO 유전자의 전사 종료 영역을 함유하는 재조합 DNA를 재조합 DNA로 사용함을 특징으로 하는, 폴리펩타이드 코딩 구조 유전자를 함유하는 재조합 DNA로 남조류 세포를 형질 전환 시킴으로써 남조류 세포내에서 생리학적 활성 폴리펩타이드를 형질 발현시키는 방법. 본 방법에 따르면, 남조류를 사용하여 생리학적 활성 폴리펩타이드가 효율적으로 형질 발현될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

폴리펩타이드의 형질발현 방법

[기술분야]

본 발명은 폴리펩타이드의 형질 발현 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 남조류 세포를 숙주세포로 사용하고 폴리펩타이드-코딩 구조 유전자를 함유하는 캐리어 DNA로 상기 숙주세포를 형질전환 시킴으로써, 생리학적 활성 폴리펩타이드를 효율적으로 형질 발현시키는 방법에 관한 것이다.

[배경기술]

에스케리키아 콜리 등과 같은 남조류(남세균(청록색 세균)이라고도 한다)는 핵막을 갖지 않은 원핵생물이다. 그러나 남조류는 고등 식물, 특히 홍조류와 유사한 광합성계를 갖고 있으며, 태양 빛을 에너지 원으로 사용하여 물과 이산화탄소와 소량의 무기염으로 부터 유기 물질을 생합성하여 독립 영향적으로 다량 증식할 수 있다.

또한, 많은 종의 남조류[스피룰리나(Spirulina), 아파노테세(Aphanothece), 노스톡(Nostoc) 등]는 오래전부터 식용되어 왔으며, 동물에 대한 병원성 및 기생성에 대하여는 보고된 바 없다. 따라서, 남조류는 유전자 재조합용 숙주로서 적절하고 또한 안전성도 뛰어나다.

만일 유용한 생리학적 활성 펩타이드를 코딩하는 유전자를 상기 특징을 갖는 남조류내에 도입하여 상기 펩타이드를 다량으로 형질 발현시키는 것이 가능해진다면, 작물의 경우 계절과 기후에 영향을 받지 않은 채로 식품, 기능식, 사료 등을 제조할 수 있으며, 의약품, 의약품에 포함되지 않지만 의료에 사용되는 화학 약품, 화장품 원료 등을 적은 비용으로 적은 에너지를 사용하여 원료측면에서 경제적으로 제조하는 것이 가능해질 것으로 기대된다.

최근들어, 남조류를 사용한 숙주-벡터 체계의 개발이 급속히 전행되어 왔으며, 아나시스티스 니둘란스(Anacystis nidulans) R2(시네코코커스(Synechococcus) PCC 7942), 아그메넬룸 쿠아드루플리카툼(시네코코커스 PCC 7002), 시네코시스티스(Synechocystis) PCC 6803 및 아나배나(Anabaena) PCC 7120과 같은 종을 이용한 다수의 이종 단백질 유전자의 형질 발현이 보고되고 있다[참고 : G. D. Price and M. R. Badger, Plant Physiol, 91 : 505∼513(1989) 인체 탄산 탈수효소 및 에스케리카아 콜리의 lac I_Q억제인자 단백질의 형질 발현 ; R. de Lorimier et al., J. Bacteriol, 169 : 1830∼1835(1987) 고등조류 시아노포라 파라독사(Cyanophora paradoxa)의 알로피코시 아닌의 형질발현; I. V. Elanskaya and I. B. Morzunova, Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol_i0(9) : 7∼11(1989) 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 A50의 α-아말라아제의 형질발현 ; N. Tandeau de Marsac et al., Mol. Gen. Genet. 209 : 396∼398(1987) B. 샤에리쿠스 1593M의 살충 단백질의 형질발현 ; C. Angsuthanasombat and S. Panyim, Appl. Environ. Microbid. 55:2428∼2430(1989) B. 투린기엔시스 var. 이스라엘렌시스의 130 KDa δ-엔도톡신의 형질 발현 ; Y. Cai and C. P. Wolk, J. Bacteriol, 172 : 3138∼3145(1990) B. 서브틸리스의 레반수크라제의 형질발현 ; G. Schmetterer et al., J. Bacteriol, 167 : 411∼414(1986) 비브리오 하르베이 및 비브리오 피쉐리의 루시페라제의 형질발현; D. J. Scanlan et al., Gene 90 : 43∼49(1990), M. R. Schaefer and S. S. Golden, J. Bacteriol, 171 : 3973∼3981(1989) and J. S. Buzby et al., Science 230 : 805∼807(1985) 에스케리키아 콜리의 β-갈락토시다제의 형질발현 ; D. A. Lightfoot et al., Plant Mol. Biol, 11 : 335∼344(1988) 에스케리카아 콜리의 글루타메이트 데히드로게나제의 형질발현 ; R. C. Murphy et al., J. Bacteriol, 172 : 967∼976(1990) 에스케리카아 콜리의 rec A 단백질의 형질발현 ; M. Y. Gruber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2608∼2612(1990) 에스케리키아 콜리의 Mn-수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 형질발현 ; J. Pierec et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 5753∼5757(1989) 광합성 세균 로도스피릴룸 투브룸의 RuBsisCO의 형질발현 ; D. Friedberg and J. Seijffers, Mol. Gen. Genet. 203:505∼510(1986) 박테리오파아지 λ의 cI 억제인자 단백질의 형질발현].

그러나, 상기 다수의 보고문헌에 있어서는, 이종 단백질-코딩 유전자의 형질발현을 위하여 숙주 유전자의 전사개시 영역 자체가 그대로 사용되며, 형질발현된 목적 단백질의 양도 매우 소량이다. 또한, tac 프로코터 또는 O_LP_L프로모터를 사용하여 이종 단백질(인체 탄산 탈수효소, 파아지 λcI억제인자)을 형질발현시키는 보고문헌에 있어서는, 형질 발현되는 목적 단백질의 양을 증가시키기 위하여, 예를 들면 프로모터의 조절 단백질 코딩 유전자를 동일한 벡터내로 도입시키는 방법이 역시 사용되었다. 그러나, 심지어 인체 탄산 탈수효소의 경우(이것의 형질 발현 양은 보고 문헌에 개시되어 있음)에서는, 형질 발현량이 작고, 단지 약 0.3%의 수용성 단백질이며 기대되었던 형질 발현량은 수득될 수 없다.

한편, 숙주 남조류의 전사 개시 영역을 이종 단백질(에스케리키아 콜리의 β-갈락토시다아제)의 형질 발현을 위한 전사 개시 영역으로 사용하는 것도 보고되어 있다.[Supra Gene 90 : 43∼49(1990) 및 J. Bacteriol. 171 : 3973∼3981(1989)]. 그러나, 각 경우에서, β-갈락토시다아제 유전자가 남조류의 구조 유전자에 도입되기 때문에, β-갈락토시다아제 유전자는 융합 단백질로 형질 발현되고, 따라서 목적하는 이종 단백질의 생산 측면에서 쿤제점이 있다.

따라서, 남조류를 숙주세포로 사용하여 생리학적 활성 단백질을 효율적으로 형질 발현시키기 위하여, 본 발명자들은 먼저 아나시스티스 니둘란스의 RuBisCO 유전자의 전사 개시 영역과 전사 종료 영역을 형질 발현시키고자 하는 구조 유전자에 결찰시키고, 얻어진 결찰물을 사용하여 남조류내에서 작용하는 오페론 조제에 대해 집중적으로 연구하였다. 그 결과, RuBisCO의 전사 개시 영역과 전사 종료 영역을 사용함으로써 구조 유전자가 효율적으로 형질 발현되고, 형질 발현양은 조제 오페론이 도입되는 벡터의 종류에 따라 영향 받음을 알게 되었다.

또한, 본 발명자들은, SD 서열(에스케리키아 콜리 등에서 일부 보고되어 있음)로 부터 ATG(번역 개시 부위)까지의 염기수가 구조 유전자의 형질 발현에 영향을 미침을 알아내었으며, 염기수를 적정화함으로써 형질 발현 양을 현저히 증가시키는 것에 성공하여, 본 발명을 완성하였다.

[발명의 개시]

본 발명에 따르면, 폴리펩타이드를 코딩하는 구조 유전자-함유 캐리어 DNA로 남조류 세포를 형질 전환시킴으로써 남조류 세포내에서 생리학적 활성 폴리펩타이드를 형질 발현하는 방법이 제공되며, 이 방법은 생리학적 활성 폴리펩타이드-코딩 구조 유전자, 구조 유전자의 상류에 위치하는 아나시스티스 니둘란스의 RuBisCO 유전자의 전사 개시 영역, 및 구조 유전자의 하류에 위치하는 RuBisCO 유전자의 전사 종료 영역을 함유하는 캐리어 DNA를 캐리어 DNA로서 사용함을 특징으로 한다.

본 발명의 형질 발현 방법을 이하에서 더욱 상세히 설명한다.

[1] 캐리어 DNA의 형성

생리학적 활성 폴리펩타이드를 코딩하는 구조 유전자(이하에서는 때로 편의를 위해 유용한 구조 유전자라고 언급함)가 리불로오스-1,5-디포스포르산 카르복실라아제/옥시케나아제(RuBisCO)의 전사 개시 영역, SD-형 서열 및 전사 종료 영역에 결찰되어 있는 캐리어 DNA 를 조제하기 위한 특정 방법은 이하 설명된 실시예에 나타낸 바와 같다.[참고 : K. 시노자끼 및 M. 스기우라, Mol. Gen Genet. 200 : 27∼32(1985), 마사노부 구마노 및 마사히로 스기우라, 유전학 38(12) : 26∼31(1984), 등].

(1) RuBisCO의 전사 개시(프로모터) 영역의 조제

RuBisCO의 프로모터를 함유하는 DNA 단편은, 예를 들어 K. 시노자끼 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4050∼4054(1983)]에 개시되어 있는 플라스미드 pANE18(RuBisCO 프로모터 영역을 함유하는 약 5.6 MDa의 EcoRI 단편이 pBR322의 EcoRI부위에 삽입되어 있음)로 부터 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI, SacI 및 PstI을 사용하여 통상의 방법(T. 마니아티스 등, Molecular Cloning-A Laboratory Manual-Cold Spring Horbor Laboratory 발행)에 따라 절단해 냄으로써 준비될 수 있다.

(2) RuBisCO의 전사 종류(터미네이터) 영역의 조제

RuBisCO의 터미네이터 영역은 K. 시노자끼 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 4050∼4054(1983)]에 개시되어 있는 플라스미드 pANP 1155(pBR 322의 PstI 부위에 RuBisCO의 터미네이터 영역을 함유하는 약 1.5 MDa의 PstI 단편이 삽입되어 있음)로 부터 제한 엔도뉴클레아제 PstI 및 Eco 52 I을 사용하여 절단해 냄으로써 조제될 수 있다.

(3) SD-형 서열의 준비

리보소옴 인식 서열로서의 SD-형 서열을 본 발명에서 사용되는 제조합 DNA내에 유용한 구조 유전자의 상류쪽, 프로모터 영역의 하류쪽으로 도입시킨다.

숙주 남조류의 리보소옴 RNA에 상보성인 것이 SD-형 서열로 바람직하게 사용되며, 남조류가 아나시스티스 니둘란스 6301 균주인 경우에는 염기서열 GGAG가 SD-형 서열로 사용될 수 있다. 그러나, SD-형 서열은 이것에 한정되지 않으며, SD-형 서열로서 공지된 기타 염기 서열도 유사하게 사용될 수 있다. 이러한 SD-형 서열은 작은 수의 염기 수를 갖고, 통상적으로 합성에 의해 조제된다.

또한, SD-형 서열은 ATG(번역 개시 부위)의 앞에 위치하고, SD-형 서열로 부터 ATG까지의 길이(염기수)는 유용한 구조 유전자의 형질 발현에 영향을 미칠 가능성이 있으므로, 따라서 숙주의 종류, 구조 유전자의 염기서열 등에 따라 길이를 조절하여 형질 발현 양을 적정 수준으로 만드는 것이 요망된다. 길이는 숙주 남조류의 종류, 구조 유전자의 염기 서열 등에 의존하여 바뀌지만, 일반적으로 3∼10 염기의 정도이며, 숙주의 구조 유전자의 염기 서열 등에 따라서 적정 길이를 실험적으로 결정할 수 있다.

SD-형 서열을 함유하는 DNA 단편의 조제는 통상적으로 ATG(번역개시 부위)앞의 서열 또는 ATG를 포함하는 서열을 사용하여 수행될 수 있고, DNA 단편의 합성은 공지된 유전자 조작 기술[예를 들어, 유전자 연구를 위한 생화학적 실험 1 방법의 강연집 Ⅱ(Lectures of Biochemical Experiments 1 Methods for Studying Genes Ⅱ) Japan Society for Biochemistry 편찬, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. 발행(1987) 참조]에 따라 용이하게 수행될 수 있다.

(4) 유용한 구조 유전자의 조제

본 발명의 방법에 의해 형질 발현될 수 있는 생리학적 활성 폴리펩타이드(이하, 때로는 편의를 위해 유용한 펩타이드라고 함)는 특정하게 한정되지 않으며, 각종 유용한 폴리펩타이드는 본 발명의 방법에 따라 효율적으로 형질 발현될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 형질 발현될 수 있는 유용한 펩타이드의 예는 SOD(인간, 쥐, 등등), 인터로이킨, 인간-인터페론-α,-β 또는 -γ, 인간-인슐린, 인간-종양 괴사 인자(TNF), 인간-콜로니 자극 인자(CSF), 인간-조직 플라스미노겐 액티베이터(TPA), 인간-프로우로키나아제, 유로키나아제, 인간-혈액 응고 인자(I-V, Ⅶ-ⅩⅢ), 인간-적혈구 조혈소, 인간-신경성장 인자, 인간-심방 나트륨이뇨성 펩타이드(α-hANP), 인간-췌장-분비 트립신 억제인자,(인간, 소, 돼지, 닭, 어류의) 성장 호르면, 성장 호르몬 방출인자, 항체(면역 클로블린), 살출성 단백질(BT 단백질 등), 종자-저장 단백질(파세올린, 제인, 글루테닌, 글리시닌, 호르데인, 등) 등, 및 유용한 펩타이드가 가지고 있는 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 들 수 있다.

유용한 펩타이드와 실직적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드란, 유용한 펩타이드 그 자체 뿐만 아니라, 유용한 펩타이드가 본래 가지고있는 활성이 실질적으로 소실되지 않는 범위내에서 유용한 펩타이드의 아미노산 서열 일부가 다른 아미노산으로 대체된 유용한 펩타이드에 유사한 폴리펩타이드도 포함하는 의미로 본 명세서에서 사용된다

따라서, 이후 실시예에서 사용되는 인간-SOD를 예로 들자면, 인간-SOD와 실질적으로 동일한 아미노산을 갖는 폴리펩타이드는, Jabusch등 [Biochemistry, 19 : 2310∼2316(1980)] 및 Barra 등 [FEBS Letters 120 : 53∼55(1980)]에 의해 보고된 아미노산 서열을 갖는 hSOD 펩타이드 뿐만아니라, hSOD의 효소 활성이 실질적으로 소질되지 않은 범위내에서 아미노산 서열의 일부(일반적으로 5개 이하, 바람직하게는 2개 이하)가 다른 아미노산으로 대체된 hSOD 유사 폴리 펩타이드 포함한다. 그의 특정예는 다음과 같다:

(a) hSOD

(b) hSOD의 여섯번째 시스테인 잔기(Cys)가 알라닌 잔기(Ala)로 치환된 폴리펩타이드(일본국 특허 공개 공보 제156884/1990호 참조)

(c) hSOD의 111번째 시스테인 잔기(Cys)가 세린 잔기(Ser)로 치환된 폴리펩타이드(일본국 특허 공고 제 130684/1987호 참조)

(d) hSOD의 여섯 번째 시스테인 잔기(Cys)가 알라닌 잔기(Ala)로 치환되고 111번째 시스테인 잔기(Cys)가 세린 잔기(Ser)로 치환된 플리펩타이드(일본국 특허 공고 제 273473/1988호 참조).

상기와 같이 유용한 펩타이드를 코딩하는 유용한 구조 유전자는, 유용한 펩타이드의 생성 능력을 가진 동물, 식물 및 미생물과 같은 공급원의 세포로 부터 유전자를 추출 및 클로닝함으로써, 또는 화학적 합성법에 의해 조제될 수 있다.

(5) 유용한 구조 유전자를 함유하고, 형질 발현 가능한 오페론의 구축

이렇게 조제된 RuBisCO 프로모터 영역, SD-형 서열 함유 DNA 단편 및 RuBisCO 터미네이터 영역을, 생리학적 활성 폴리펩타이드를 코딩하는 유용한 구조 유전자와 함께, 공기의 방법에 따라서 (프로모터 영역)-(SD-형서열 함유 DNA 단편)-(번역 개시 코돈, ATG)-(유용한 구조 유전자)-(번역 종료 코돈)-(터미네이터 영역)의 순서로 결찰시켜, 남조류 세포내에서 형질 발현될 수 있는 오페론을 만든다.

프로모터와 SD-형 서열의 수가 각각 1인 것은 불필요하며, 열내에 둘 이상의 프로모터를 사용하고/하거나 열 내에 둘 이상의 SD-형 서열을 사용할 수도 있다.

숙주 및/또는 오페론의 종류 등에 의존하여, 실질적으로 오페론 그 자체의 상태에서 상기 유용한 구조 유전자-함유 오페론으로 숙주를 형질전환시킬 수 있지만, 통상적으로는 일단 오페론을 숙주에 적절한 벡터(플라스미드)내에 도입시킨 다음 형질 전환을 위해 사용한다.

(6) 벡터

상기 형질발현 가능한 오페론을 도입할 수 있는 벡터로서는, 남조류 세포내에서 사용가능한 포괄적인 종류의 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 벡터의 예로는 pUC 104 및 pUC 105[C. J. Kuhlemeier 등., Mol. Gen. Genet. 184 : 249∼254(1981)]; pLS103[L. A. Sherman 및 P. van de Putte, J. Bacteriol, 150 : 410∼413(1982)]; pDPL13 [S. Gendel 등., J. Bacteriol, 156 : 148∼154(1983)]; pUC303[C. J. Kuhlemeier 등., Plasmid 10 : 156∼163(1983)]; pSG111 [S. S. Golden 및 L. A. Sherman, J. Bacteriol, 155 : 966∼972(1983)]; pPUC29 [C. J. Kuhlemeier 둥., Gene 31 : 109∼116(1984)]; pPLAN Bal [D, E. Landenbach 등. Mol. Gen. Genet, 199 : 300∼305(1985)]; pBAS18 [K. Shinozaki 등., Gene 19 : 221∼223(1982)] 등을 들 수 있다.

또한, 필요하다면, 이러한 벡터는 플라스미드 및 비루스에서 유래될 수 있으며, 예를 들면 에스케리키아 콜리 및 남조류의 세포내에서 복제 가능한 셔틀 벡터 pBAX 18, pBAX 20 등을 또한 유리하게 사용할 수도 있고, 이것들은 안시스티스 니둘란스 유래 플라스미드 pBA1의 Ori A 영역, 플라스미드 pUC의 멀티클로닝 영역 및 에스케리키아 콜리의 Col E1 플라스미드의 Ori E 영역을 사용하여 본 발명자에 의해 만들어졌다[이후 설명된 실시예 및, 본 출원인에 의해 1991년 5월 8일자로 발명의 명칭을 신규 플라스미드로 하여 출원된 특허출원(일본국 특허출원 제 67774/1992호) 참조].

(7) 캐리어 DNA의 구축

유용한 구조 유전자를 함유하고 형질 발현 가능한 상기 (5)에 언급된 오페론을 공지된 유전자 조작 기술에 따라서 상기 (6)에 언급된 벡터(플라스미드)내로 도입시킬 수 있다.

예를 들면, hSOD-코딩 유용한 구조 유전자를 사용하여 상기 (5)의 설명에 따라 조제된 hSOD 오페론 DNA 단편을, 아나시스티스 니둘란스 세포내에서 복제가능한 예컨대 pBAS18 또는 pBAX18의 EcoRI 인식 부위를 엔도뉴클레아제 EcoRI으로 절단시킴으로써 수득되는 DNA 단편과 합하고, T4 DNA 리가아제를 여기에 작용시켜서, 유용한 구조 유전자가 도입된 hSOD-형질 발현 벡터를 수득한다. 벡터내로 삽입되는 오페론의 수가 1인 것은 불필요하며, 또한 오페론의 2, 3, 4 또는 그 이상의 카피가 동일 방향인 한 이들이 열내에 도입될 수도 있다.

이렇게 수득된 hSOD-형질 발현 벡터를 통상적 방법에 따라서 에스케리키아 콜리 내에 클로닝할 수 있다(T. Maniatis 등, Molecular Cloning-A Laboratory Manual-Cold Spring Horbor Laboratory 발행).

[2] 형질 전환

이렇게 형성된 캐리어 DNA를 사용하여 형질전환시킬 수 있는 남조류 세포로는 예를 들어 다음을 언급할 수 있다.

아나시스티스 니둘란스 6301(시네코코커서 PCC 6301),

아나시스티스 니둘란스 R2(시네코코커스 PCC 7942),

시네코코커스 PCC 7002,

시네코코커스 PCC 7418(아파노테세 할로피티카),

시네코시스티스 PCC 6803,

시네코시스티스 PCC 6714,

스피룰리나 플라텐시스,

아나베나 PCC 7120(노스톡 PCC 7120),

노스톡 PCC 7119(아나베나 PCC 7119),

칼로트릭스 PCC 7601, 등.

이 숙주 남조류 세포를 상기 캐리어 DNA로 형질 전환시키는 것은 공지의 방법, 예를 들면 R. D. Porter[CRC Critical Reviews in Microbiology 13(2) : 111∼132], D. A. Lightfoot 등. [J. General, Microbiology 134 : 1509∼1514(1988)], S. S. Golden 등. [J. Bacteriol, 158 : 36∼42(1984)], H. Daniell 등. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 2546∼2550(1986)] T. Matsunaga 등. [Appl. Biochem. Biotechnol. 24/25 : 151∼160(1990)], 등의 방법에 의해 수행될 수 있다.

예를 들면, 아나시스티스 니둘란스는 D. A. Lightfoot 등의 방법에 따라서 hSOD 발현 벡터를 도입시킴으로써 형질 전환될 수 있다.

얻어진 형질 전환체를 암피실린-내성 등을 기준으로 하여 선별한 후에, 면역 블롯팅 방법, 오크테로니(Ouchterlony) 방법, 폴리아크릴아미드 겔상에서의 SOD활성 염색법, SOD 활성 측정법 등에 의해 목적 형질 전환체의 수득을 확인할 수 있다.

숙주 세포의 증식을 위해 적절하고 이미 공지되어 있는 배지중에서 빛조사하에 상기 수득된 형질 전환체를 배양함으로써 생리학적 활성 폴리펩타이드를 형질 발현시킬 수 있다. 바람직하게는, 형질 전환체를 선택적으로 증식시키기 위하여, 적절한 양의 암피실린과 같은 약품을 배지에 함유시킨다.

형질 전환체 숙주가 아나시스티스 니둘란스인 경우에, 적절한 배지는 BG-11 배지, MDM 배지 등이고, 배양 조건으로서 적절한 배양 온도는 일반적으로 10∼35℃, 바람직하게 25∼30℃이다. 또한, 배지의 적절한 pH는 통상 7∼8의 범위이고, 적절한 조도는 500∼5,000룩스의 범위이다. 이러한 조건하에서 약 5∼20일 동안 배양을 수행할 수 있다. 또한, 정치 또는 교반하에 배양을 수행할 수 있다.

상기 언급된 본 발명의 방법에 따르면 유용한 펩타이드를 매우 높은 형질 발현 효율로 수득할 수 있고, 남조류 세포내에 생성된 유용한 펩타이드를 공지의 방법에 따라서 분리 및 회수할 수 있다. 예를 들면, 원심분리에 의해 배양 브로쓰로 부터 세포를 수집하고, 세포 파괴후에, 파괴된 세포를 예를 들어 염석, 투성, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 전기 영동과 같은 통상의 공지된 조작을 적절히 조합하여 처리 시킴으로써 분리 및 회수를 수행할 수 있다.

이렇게 조제된 생리학적 활성 폴리펩타이드는 의약품, 의약품에 속하지 않지만 의료에 사용되는 화학 약품, 화장품 등으로서 또는 이들을 위해 사용될 수 있다.

또한, 빛 조사하에 배양된 형질 전환 남조류를 배양후 원심분리 등에 의해 수집하여, 식품, 사료, 기능식으로서 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 재조합 DNA에 사용된 RuBisCO 프로모터는 그의 하류에 위치하는 유용한 구조 유전자를 빛 조절하에서 다량으로 형질 발현 유도할 수 있으므로, 따라서 예를 들면 에스케리키아 콜리 등의 lac, tac 또는 trp 프로모터를 이용하여 형질 발현을 유도할 경우 통상 사용되는 값비싼 약품을 사용할 필요가 없다는 장점을 갖고 있다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 아나시스티스 니둘란스 RuBisCO 형질 발현 조절 영역(EcoRI-PstI 단편)의 조제를 위한 과정을 나타낸 것이다.

제2도는 SD-형 서열 함유 영역(PstI-Hind Ⅲ 단편)의 합성을 위해 화학적으로 합성된 CO 올리고 뉴클레이티드의 염기 서열이다.

제3도는 SD-형 서열 함유 영역(pstI-Hind Ⅲ 단편)의 조제를 위한 과정을 나타낸 것이다.

제4도는 RuBisCO 형질 발현 조절 영역(EcoRI-Hind Ⅲ 단편)의 조제를 위한 과정을 나타낸 것이다.

제5도는 RuBisCO 전사 종료 영역의 조제 및 pUC-hSODt 플라스미드의 구축을 나타낸 도면이다.

제6도는 hSOD 오페론의 형성을 나타낸 도면이다.

제7도는 hSOD 오페론(SOD7)의 염기 서열이다.

제8도는 벡터 플라스미드 pBAX18 및 20의 구축을 나타낸 도면이다.

제9도는 SOD의 활성 염색법의 결과를 나타낸 도면이다.

제10도는 웨스턴 블롯팅의 결과를 나타낸 도면이다.

제11도는 오크테로니(Ouchterlony)의 결과를 나타낸 도면이다.

[실시예]

본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명된다.

[실시예 1]

Ⅰ. 형질발현 조절 영역의 조제

(Ⅰ-1) pANE 18의 클로닝

40ng(1 ㎕)의 pANE 18(K. 시노자끼 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 4050∼4054(1983), 아나시스티스 니둘란스 6301의 리불로오스-1,5-디포스페이트 카르복실라아제/옥시게나아제 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5,600bp 단편이 pBR322의 EcoRI부위에 삽입된 것)을, 50mM 세포-처리된 에스케리키아 콜리 HB 101 균주의 세포 현탁액 100㎕에 첨가하고, 혼합물을 서서히 혼합한다. 혼합물을 빙수중에서 30분간 항온처리하고, 42℃에서 3분간 더욱 항온처리하여 세포내로 DNA를 도입시킨다. 이 현탁액에 1㎖의 LB 배지(10g/1 박토트립톤, 5g/1 효모 추출물, 10g/1NaCl)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 진탕하에 배양을 수행한다. 이 세포 현탁액 100㎕와 200㎕를 취하여 LB 한천 배지(50㎍/㎖ 암피실린 및 1.5% 한천 함유)상에 도말한다. 이 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 형성된 콜로니를 단리해낸다.

단리된 콜로니를 백금이로 2㎖의 2YT 액체 배지(16g/1 박토 트립톤, 10g/1 효모 추출물, 5g/1 NaCl 및 50㎍/㎖ 암피실린 함유)내에 접종시키고, 37℃에서 밤새 배양한다. 배양액 1㎖를 취하여 200㎖ 2YT 액체 배지(100㎍/㎖ 암피실린 함유)에 첨가하고, 37℃에서 밤새 배양한다.

배양된 세포를 8,000 rpm에서 10분간 원심분리에 의해 수집하고, 이로부터 SD-알카리법(B. Perbal, A. Practical Guide to Molecular Cloning, pages 273∼276, John Wiley and Sons Inc. 발행)에 따라서 플라스미드 DNA를 다량 조제해낸다.

(Ⅰ-2) SacI-SphI단편의 단리(제1도 참조)

에펜도르프 튜브(부피 1.5㎖)내에서, 10㎕(10㎍)의 상기 다량 조제된 pANE18 DNAm 10㎕의 10x 저 완충액(100mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM MgCl₂10mM 디티오트레이톨(DTT)) 및 50 유니트의 SacI(다까라 슈조가부시끼가이샤 제품)에 멸균수를 첨가하여 총 부피를 100㎕로 만들고, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 더욱 반응시킨다. 반응 후에, 15㎕의 10× 고 완충액(500mM Tris-HC1 (pH 7.5), 100mM, MgC1_2,10mM DTT, 100mM NaC1), 50 유니트의 SphI(다까라 슈조 가부시끼가이샤 제품) 및 30㎕의 멸균수를 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 더욱 반응시킨다. 반응 후에, 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨(pH 4.8) 및 2.5 부피의 에탄올을 첨가하고, 혼합물을 -20℃에서 2시간 이상 동안 그대로 방치한다. 형성된 침전물을 4℃에서 10분간 15,000rpm으로 원심분리하여 수집하고, 70% 에탄올로 세척하고 감압하에 건조시킨다. 잔류물을 50㎕의 TE(10mM 트리스-HCI(pH 8.0), 1mM EDTA)에 용해시키고, 1/10 부피의 전기 영동 마커(0.25% 브로모페놀 블루, 0.25% 크실렌 시아놀, 30% 클리세롤)를 첨가하고, 혼합물을 1.5% 아가로오스에 놓고, TAE 완충액(40mM 트리스-아세테이트, 2mM EDTA)을 사용하여 1.5시간 동안 50V에서 전기 영동을 수행한다.

전기 영동후에, 0.5㎍/㎖ 에티디움 브로마이드 용액(TAE중)내에 15분간 겔을 침지시켜 DNA 염색을 수행한다. 염색된 겔을 광성투과기 위에 놓고 자외선을 조사하여, 목적 DNA를 함유하는 밴드를 절단해낸다. DNA-정제용 kit Geneclean(BIO 101 Co. 제)을 사용하여 목적 DNA 단편(약 1,200bp)을 정제한다.

(Ⅰ-3) SacI-SphI단편의 pUC18내 클로닝

(1) pUC18의 SacI-SphI 소화

에펜도르프 튜브(용량 1.5㎖)내에서, 10㎕(10㎍)의 pUC18 DNA, 5㎕의 10x 저 완충액 및 50 유니트의 SacI에 멸균수를 첨가하여 총 부피를 50㎕로 만들고, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 반응후에, 7.5㎕의 10x 고 완충액, 50 유니트의 SphI 및 37.5㎕의 멸균수를 첨가하고, 반응을 37℃에서 3시간 동안 계속한다. 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알콜(25 : 24 : 1)을 동일부피로 반응용액에 첨가하고, 혼합물을 격렬히 교반하고, 4℃에서 4시간동안 15,000rpm으로 원심분리하여, 물층을 분리해낸다. 이 물층에 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨(pH 4.8) 및 2.5부피의 에탄올을 첨가하여, DNA를 에탄올 침전시킨다. 침전물을 4℃에서 10분간 15,000rpm으로 원심 분리하여 수집하고, 70% 에탄올로 세척한 다음, 감압하에 건조시킨다. 잔류물을 20㎕의 TE에 용해시키고, 하기 실험에 사용한다.

(2) pUC18(SacI-SphI)내로 SacI-SphI 단편(1,200bp)의 삽입

24㎕의 다까라(Takara) DNA 결찰 kit A 액체(다까라 슈조 가부시끼가이샤 제품)를 0.1㎍(2㎕)의 SacI-SphI 단편 DNA 및 0.5㎍(1㎕)의 pUC18(SacI-SphI)에 첨가한 다음, 충분히 교반한다. 이 용액에 3㎕의 다까라 DNA 결찰 kit B 액체를 첨가하고, 혼합물을 충분히 교반하고, 16℃에서 1시간 동안 배양을 수행한다. 반응 후에, 이 용액을 이. 콜리 JM109의 형질전환을 위해 사용한다.

(3) pARup18의 다량 조제.

CaCl₂로 처리된 이. 콜리 JM109의 세포 현탁액 100㎕를 5㎕(100㎍)의 결찰 용액에 첨가한 다음 서서히 혼합한다. 혼합물을 빙수에서 30분간 항온처리한 다음 42℃에서 2분간 항온 처리하여 세포내로 DNA를 도입시킨다. 1㎖의 2YT액체 배지를 상기 현탁액에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양한다. 이 세포 현탁액 100㎕ 와 200㎕를 취하여 2YT 한천 배지(50㎍/㎖ 암피실린, 40㎎/1 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-티오갈락토시드(X-gal), 23.83 ㎎/1 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG) 및 1.5% 한천 함유)상에 도말한다. 이 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 얻어진 백색 콜로니를 새로운 2YT 한천 배지(50㎍/㎖ 암피실린, X-gal, IPTG 및 1.5% 한천 함유) 상에 점으로 찍고, 37℃에서 밤새 배양하며, 백색 콜로니를 단리해낸다.

단리된 백색 콜로니를 백금이로 2㎖의 2YT 액체 배지(50㎍/㎖ 암피실린 함유)에 접종하고, 37℃에서 밤새 배양한다. 1㎖의 배양액을 취하여 1.5㎖에펜도르프 튜브로 옮기고, 15,000rpm으로 30초간 원심분리하여 세포를 수집한다. 수집된 세포를 150㎕의 SET 완충액(20% 슈크로오스, 50mM 트리스-HCI(pH 7.6), 50mM EDTA)에 현탁시키고, 5㎕의 RN아제 용액(10㎎/㎖ 리보뉴클레아제 A, 0.1M 아세트산 나트륨(pH 4.8), 0.3mM EDTA)을 첨가하고, 혼합물을 볼텍스 믹서로 충분히 교반한다. 이것에 350㎕의 세포 용해액체(1% SDSm 0.2N NaOH)를 첨가하고, 튜브 위쪽을 거꾸로 돌리면서 혼합물을 서서히 교반하여 완전히 세포용해시킨다. 얻어진 세포 용해된 액을 빙수에서 10분간 항온처리하고, 250㎕의 3M 아세세트산 나트륨(pH 4.8)을 첨가하고, 혼합물을 충분히 혼합한 다음, 빙수내에서 30분간 그대로 방치한다. 혼합 액체를 4℃에서 10분간 15,000rpm으로 원심분리하여, SD 및 염색체 DNA를 침전시킨다. 상층액을 다른 어펜도르프 튜브내로 옮기고, 동일양의 이소프로필 알콜을 첨가하고, 혼합물을 충분히 혼합한 다음, 4℃에서 7분간 15,000rpm으로 원심분리하여, 플라스미드 DNA를 침전물로 수집한다. 침전물을 멸균수에 용해시키고, 용액의 일부를 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 Hind Ⅲ(모두 다까라 슈조가부시끼가이샤 제품임)로 소화시킨다. 소화물을 1.5% 아가로오스겔 전기영동하여 1,200bp의 ScaI-SphI 단편이 pUC18에 삽입됨을 확인한다.

SacI-SphI 단편이 pUC18내에 삽입되었음이 확인된 콜로니를 400㎖의 2YT액체 배지(100㎍/㎖ 암피실린 함유)에 옮기고 밤새 배양한다. 배양된 세로를 4℃에서 10분간 8,000rpm으로 원심분리하여 수집하고, SDS-알칼리법에 의해 플라스미드 DNA를 다량 준비한다.

(Ⅰ-4) EcoRI-PstI 단편의 단리(제1도 참조)

(1) EcoRI-Hind Ⅲ 단편의 단리

에펜도르프 튜브(용량 1.5㎖) 내에서, 다량 준비된 pARup 18 DNA용액 10㎕(10㎍), 20㎕의 10×K 완충액(200mM 트리스 - HCI(pH 8.5), 100mM MgCl₂, 100mM DTT, 1,000mM KCl)) 및 40 유니트의 Hind Ⅲ에 멸균수를 첨가하여 총 부피를 200㎕로 만든다. 상기와 동일한 내용물을 함유하는 총 20개의 에펜도르프 튜브를 준비하고, 37℃에서 3시간 동안 반응을 수행핸다. 반응후에, 혼합물을 페놀-클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 수집하여, 155㎕의 멸균수에 용해시킨다. 이 용액에 40㎕의 멸균수를 용해시킨다. 이 용액에 40㎕의 5×EcoRI완충액(500mM 트리스-HCl(pH 7.5), 3.5mM MgCl₂, 250mM NaCl, 35mM 2-메르캅토에탄올, 0.05% 소혈청 알부민(BSA) 및 40 유니트의 EcoRI을 첨가하여 총 부피를 200㎕로 만든다. 얻어진 20개 에펜도르프 튜브(용량 1.5㎖)내에서 각각 37℃에서 3시간 동안 반응을 수행한다.

반응후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 처리하고 에탄올 침전시켜 DNA를 회수한다. 목적 DNA 단편(약 1200bp)을 1.5% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분리해내고 DNA-정제용 kit Geneclean을 사용하여 정제한다.

(2) EcoRI-PstI 단편(약 350bp)의 단리

에펜도르프 튜브(용량 1.5㎖)내에서 10㎕의 10×고 완충에 및 48유니트의 PstI(다까라 슈조 가부시까가이샤 제)을 40㎍(86㎕)의 정제 DNA 단편에 첨가하여 총 부피를 100㎕로 만들고, 37℃에서 3시간동안 반응을 수행한다. 반응후에, 1.5% 아가로오스 겔 전기영동을 수행하여 목적하는 DNA 단편(약 350bp)을 분리해낸다. 겔에서 DNA를 전기적으로 용출해내고, 핵산-정제용 카트리지 Nensorb 20(Dupond Co. 제품)을 사용하여 정제한다.

(Ⅰ-5) PstI-Hind Ⅲ 단편의 합성]

(1) 올리고뉴클레오티드의 합성 및 정제.

샤인 달가노(Shine Delgamo, S/D) 서열을 함유하는 형질 발현 조절 영역을 합성하기 위하여, DNA 합성기 380A(Applied Biosystems Japan Co. 제품)를 사용한 포스포아미디트 법에 의해 10 올리고뉴클레오티드(제2도 참조)를 합성한다. 합성 완결후에 0.5㎖분량을 매 15분마다 첨가하는 방식으로 암모니아수(27% 이상) 총 2㎖를 실리카겔 칼럼에 첨가하고, 각각의 올리고뉴클레오티드를 실리카 지지체에서 절단해 내어 바이알에 수집한다.

암모니아수 1㎖를 추가로 바이알에 첨가하고, 뚜껑과 파라필름 등으로 바이알을 밀봉하고, 55℃에서 8시간 이상 동안 가열하여, 기저부의 보호기(아실기)를 제거한다. 바이알을 항온 배스에서 꺼내어 실온으로 되돌리고, 뚜껑을 제거한 후 내용물을 감압하에 농축 건조 시킨다. 건조후에, 잔류물을 200㎕의 0.01M 트리에틸아문-아세트산 용액(TEAA, pH 7.5)에 용해시킨 다음, AM313-ODS(야마무라 가가꾸겡뀨쇼 가부시끼가이샤 제품)를 사용하여 HPLC시키고, 0.1M TEAA의 농도 구배로 아세토니트릴를 사용하여 용출하고, 용출분획으로 부터 주요 피크를 취한다. 얻어진 피크를 감압하에 농축 건조시키고, 100㎕의 80% 아세트산(아세토니트릴 용액)을 첨가하고, 혼합물을 혼합한 다음, 실온에서 30분간 그대로 정치시켜 5'-말단의 이메틸트리틸(DMTr)기를 제거하고 이것을 OH기로 전환시킨다. 30분 후에, 혼합물을 빨리 농축 건조시키고, 잔류물을 200㎕의 0.01M TEAA(pH 7.5)에 용해시키고, 동일 부피의 디에틸 에테를를 첨가하고, DMTr기를 추출에 의해 제거한다. 얻어진 용액을 감압하에 농축 건조시키고, 잔류물을 110㎕의 0.01M TEAA(pH 7.5)에 용해시키고, 정제 HPLC로 다시 정제한다. 올리고뉴클레오티드를 함유하는 용출 분획을 감압하에 농축건조시키고, 잔류물을 TE에 용해시켜 하기 실험에서 사용한다.

(2) 키나아제를 이용한 합성올리고뉴클레오티드의 포스포릴화

각각의 정제된 올리고뉴클레이티드 4㎍을 각각 120㎕분량의 키나아제 완충액(50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl₂, 0.1mM EDTA, 5mM DTT, 0.1mM 스페르미딘, 1.7μM ATP)과 혼합하고, 9 유니트의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(다까라 슈조 가부시끼가이샤 제품)를 첨가하고, 37℃에서 15분간 항온처리한다. 이어서, ATP를 1mM의 최종 농도까지 첨가하고, 9유니트의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 다시 첨가한 다음, 37℃에서 25분간 항온처리한다. 반응 후에, 혼합물을 90℃에서 5분간 가열 처리하여 효소를 불활성화시킨다. 핵산-정제용 카트리지 Nensorb 20을 사용하여 포스포릴화 올리고뉴클레오티드를 정제한다.

(3) PstI-Hind Ⅲ 단편의 조제

T4 DNA 리가아제를 사용한 올리고뉴클레오티드의 직접 결찰에 의하여, 서로 상이한 염기수를 갖는 4개의 PstI-Hind Ⅲ 단편을 조제한다(제3도 참조). 각각의 PstI-Hind Ⅲ 단편을 구성하는 올리고뉴클레오티드들 중에서 가장 하급열의 사슬의 5'-말단에 위치한 올리고뉴클레오티드 1.5㎍ 및 나머지 각각의 올리고뉴클레오티드 1㎍에, 20㎕의 5x결찰 완충액(250mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM, MgCl₂) 및 멸균수를 첨가하여, 총 부피를 80㎕로 만든다. 얻어진 용액을 90℃에서 5분간 가열하고, 2시간에 걸쳐 서서히 4℃로 냉각시킨 다음, 100mM DTT 및 10mM ATP를 각각 10㎕씩 첨가하고, 2.5 유니트의 T4 리가아제(다까라 슈조 가부시끼가이샤 제품)를 첨가하고, 4℃에서 15시간 동안 항온 처리한다. 반응 용액을 동일 부피의 페놀-클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하여 하기 실험에서 사용한다.

(Ⅰ-6) EcoRI-Hind Ⅲ 단편의 조제(제4도 참조)

(1) EcoRI-PstI 단편(프로모터 영역)과 각각의 PstI-Hind Ⅲ 단편의 직접 결찰

상기(Ⅰ-4)에서 처리된 EcoRI-PstI 단편의 1.0㎍ 분량과 서로 상이한 염기수를 갖는 4개의 PstI-Hind Ⅲ 단편 각각의 0.5㎍을 각각 5㎕분량의 0.3M NaCl과 혼합한다. 각각의 얻어진 용액에 5㎕의 다까라 결찰 kit B용액을 첨가하고, 26℃에서 1시간 이상 동안 항온 처리한다. 반응 후에, 용액을 페놀-클로로포름으로 처리하고, 통상의 방법으로 에탄올 침전시켜 DNA를 회수한다.

(2) Hind Ⅲ-EcoRI을 이용한 결찰 반응 혼합물의 소화

각각의 회수된 DNA 잔류물을 각각 14.5㎕분량의 멸균수에 용해시킨다. 4㎕의 5×Hind Ⅲ 완충액(50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 35mM MgCl₂, 300mM NaCl) 및 12 유니트(1.5㎕)의 Hind Ⅲ를 각각의 용액에 첨가하고, 37℃에서 1.5시간 동안 반응시킨다. 반응 후에, 4㎕의 5×EcoRI 완충액, 12 유니트(1.0㎕)의 EcoRI 및 5㎕의 멸균수를 더욱 첨가하고, 37℃에서 1.5시간동안 반응시킨다. 반응용액을 동량의 페놀-클로로포름으로 처리한 다음, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한다.

(Ⅰ-7) 서로 상이한 염기수를 갖는 4개의 형질 발현 조절 영역 EcoRI-Hind Ⅲ 단편의 클로닝(제4도 참조)

(1) pUC18의 EcoRI-Hind Ⅲ 소화

에펜도르 튜브(용량 1.5㎖)내에서, 25㎍의 pUC18, 10㎕의 10×K 완충액(200mM 트리스-HCl(pH 8.5), 100mM MgCl₂, 10mM DTT, 100mM KCl) 및 64유니트(8㎕)의 Hind Ⅲ에 멸균수를 첨가하여 총 부피를 100㎕로 만들고, 37℃에서 3시간 동안 반응을 수행한다. 이 반응 용액을 동일 부피의 페놀-클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한다. DNA 잔류물을 75㎕의 멸균수에 용해시키고, 20㎕의 5×EcoRI 완충액 및 60 유니트(5㎕)의 EcoRI을 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 반응을 수행한다. 반응후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 처리시키고 에탄올 침전시킨다. 회수된 DNA를 0.25㎍/㎕까지 TE중에 용해시켜 하기 실험에서 사용한다.

(2) 4개의 형질 발현 조절 영역 EcoRI-Hind Ⅲ 단편의 pUC 18(Ecori-Hing Ⅲ)내로 삽입

네 개의 EcoRI-Hind Ⅲ 단편의 각각 60ng(1㎕) 및 pUC 18(EcoRI-Hind Ⅲ) 500ng(2㎕) 분량을 각각 에펜도르프 튜브내에 넣고, 24㎕분량의 다까라 결찰 kit A액체를 첨가한 다음 충분히 혼합한다. 또한 3㎕분량의 다까라 결찰 kit B 액체를 상기 혼합 용액에 첨가하고 혼합한 후, 16℃에서 2시간 동안 반응을 수행한다. 이용액을 하기 실험에서 사용한다.

(3) pARup 1, 2, 3 및 4의 다량 조제

CaCl₂로 처리된 이. 콜리 JM 109 세포 현탁액 100㎕ 분량을 각각의 결찰용액 3㎕(56ng)에 첨가한 다음 서서히 교반한다. 혼합 용액을 빙수에서 30분간 항온 처리한 다음 42℃에서 2분간 항온처리하여 DNA를 세로내로 도입시킨다. 세포 현탁액에 1㎖분량의 2YT 액체 배지를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양한 후, 혼합물을 2YT 한천 배지(50㎍/㎖ 암피실린, 40㎎/1 X-gal, 23.83 ㎎/1 IPTG 및 1.5% 한천 함유) 일부에 도말한다. 얻어진 백색 콜로니에서 플라스미드를 조제하고 제한 엔도뉴클레아제 지도를 분석함으로써, 목적 플라스미드 pARup 1, 2, 3 및 4를 각각 보유하는 콜로니들을 선별해낸다.

플라스미드 pARup 1, 2, 3 및 4를 보유하는 각각의 콜로니를 200㎖분량의 2YT 액체 배지(100㎍/㎖ 암피실린 함유)에서 배양하고, SDS-알칼리법에 의해 각각의 플라스미드 DNA를 다량 조제한다.

(Ⅰ-8) EcoRI-Hind Ⅲ 단편의 단리

다량 조제된 각각의 플라스미드 DNA(pARup 1, 2, 3 및 4)를 20㎍(20㎕)씩 각각 에펜도르프 튜브에 넣고, 20㎕분량의 10×K 완충액, 120유니트(15㎕)분량의 Hind Ⅲ 및 멸균수를 여기에 첨가하여 총 부피를 200㎕로 만든다. 이러한 에펜도르프 튜브를 각각의 플라스미드당 6개씩 준비한다. 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 반응 후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 수집하고 150㎕분량의 멸균수에 용해시킨다. 이렇게 준비된 DNA용액에 40㎕분량의 5×EcoRI 완충액을 첨가하고, 120유니트(10㎕)분량의 EcoRI을 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 반응후에, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한다. 목적하는 각각의 DNA 단편을 1.5% 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리한다. DNA를 각각 겔로 부터 전기적 용출시키고, 핵산-정제용 카트리지 Nensorb 20을 사용하여 정제한다(ARup 1, 2, 3 및 4).

Ⅱ. 전사 종료(터미네이터) 영역의 조제(제5도 참조)

(Ⅱ-1) pANP 1155의 클로닝

50mM CaCl₂로 처리된 이. 콜리 JM 109의 세포 현탁택 100㎕에 500ng(0.5㎕)의 pANP 1155(K. 시노자끼 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 4050∼4054(1983), 아나시스티스 니둘란스 6301)의 리불로오스-1,5-디포스페이트 카르복실라아제/옥시게나아제 유전자의 터미네이터 영역을 함유하는 약 1500bp 단편이 pBR322의 PstI 부위에 삽입되어 있음)을 첨가하고, 서서히 교반한다. 혼합 액체를 빙수에서 30분간 항온처리한 다음, 42℃에서 2분간 더욱 항온 처리하여 세포내로 DNA를 도입시킨다.

이 현탁액에 1㎖의 LB 액체 배지를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양한 후, 혼합물을 LB 한천 배지(12.5㎍/㎖ 테트라사이클린 및 1.5%한천 함유)에 도말하고, 얻어진 콜로니를 단리해낸다.

단리된 콜로니를 2.8 1의 2YT 액체 배지(25㎍/㎖ 테트라사이클린 함유)에서 배양하고, SDS-알칼리법에 의해 플라스미드 DNA를 다량 조제한다.

(Ⅱ-2) Eco 52 I-PstI 단편의 조제

(1) PstI 단편의 단리

에펜도르프튜브(용량 1.5㎖)내에서, 상기 다량 조제된 pANP 1155 DNA 20㎍(20㎕), 20㎕의 10×고 완충액 및 120 유니트(10㎕)의 PstI에 멸균수를 첨가하여 총 부피를 200㎕로 만든다. 상기와 동일한 내용물을 함유하는 에펜 도르프 튜브(용량 1.5㎖)를 총 6개 준비하고, 각각의 튜브에서 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 반응 후에, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한 다음, 1.5% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 목적 DNA 단편(약 1500bp)을 분리해낸다. 분리된 DNA를 Geneclean에 의해 정제하여 하기 실험에 사용한다.

(2) PstI 단편의 Eco 52 I 소화

64.5㎕(약 10㎍)의 PstI 단편 DNA 용액에 7.5㎕의 10×Eco 52 I 완충액(100mM 트리스-HCl(pH 9.0), 30mM MgCl₂, 1,000mM NaCl, 0.1% BSA) 및 18 유니트(3㎕)의 Eco 52 I(도요보 가부시끼가이샤 제품)을 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 항온처리를 수행한다. 항온 처리후, 혼합물을 페놀-클로로포름 처리하고 에탄올 침전시켜 침전된 DNA를 회수한다. 회수된 DNA를 8㎕의 멸균수에 용해시킨다.

(Ⅱ-3) pARut 13의 형성

(1) Eco 52 I-PstI 단편의 블런트화

Ⅱ-2에서 조제된 Eco 52 I-PstI 단편의 DNA 용액 8㎕에 1㎕의 DNA 블런팅 kit(다까라 슈조 가부시끼가이샤 제품)×10 완충액을 첨가하고, 70℃에서 5분간 항온처리한 후, 혼합물을 37℃의 항온 배스로 옮긴다. 이 용액에 DNA 블런팅 kit내의 T4 DNA 플리머라아제 1㎕를 첨가하고, 혼합물을 피펫팅에 의해 서서히 혼합한 후, 37℃에서 5분간 반응 시킨다.

반응 후에, DNA 블런팅 kit내의 DNA 희석 완충액 40㎕를 상기 용액에 첨가하고, 혼합물을 볼텍스에 의해 격렬히 교반하여 효소를 불활성화시킨다.

(2)pUC13의 SmaI 소화 및 탈포스포릴화 반응

20㎍(20㎕)의 pUC 13 DNA에 40㎕의 5×SmaI 완충액(50mM 트리스-HCl(pH 8.0), 35mM MgCl₂, 100mM KCl, 35mM 2-메르캅토에탄올, 0.05% BSA), 80 유니트(10㎕)의 SmaI(다까라 슈조 가부시끼가이샤 제품) 및 130㎕의 멸균수를 첨가한 다음, 30℃에서 4시간 동안 반응시킨다. 반응 후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름으로 처리하고 에탄올 침전시키고, DNA를 회수한다. 회수된 DNA를 100㎕의 0.1M 트리스-HCl(pH 8.0), 10㎕의 알칼리성 포스파타아제 용액(1.0 유니트의 알칼리성 포스파타아제(AP. 다까라 슈조 가부시끼가이샤 제품), 10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 50mM NaCl, 1mM ZnSO₄)을 첨가하고, 반응을 37℃에서 2시간 동안 수행한다.

반응 후에, 또 다른 10㎕의 알칼리성 포스파타아제 용액을 첨가한 다음 65℃에서 30분간 항온처리한다. 반응 용액을 페놀-클로로포름으로 처리하고, DNA를 에탄올롤 침전시키고 수집하여, 0.5㎍/㎕까지 TE중에 용해시킨다.

(3) 블런트화 단편의 pUC13(SmaI, AP)내로의 삽입

32㎕의 다까라 결찰 kit A 액체를 2㎕(약 100ng)의 블런트화 단편 DNA용액 및 2㎕(1.0㎍)의 알칼리성 포스파타아제-처리 pUC 13 DNA용액에 첨가한 다음 충분히 교반한다. 이 용액에 4㎕의 다까라 결찰 kit B 액체를 첨가하고, 충분히 교반한 후, 16℃에서 1시간 동안 항온처리 한다. 반응 후에, 이 용액을 이. 콜리 JM109의 형질전환에 사용한다.

(Ⅱ-4) BamHI-EcoRI 단편의 조제

(1) pARut 13의 다량 조제

50mM CaCl₂로 처리된 이. 콜리 JM109의 세포 현탁액 100㎕를 1㎕(약 40ng)의 결찰 용액에 첨가한 후, 서서히 혼합한다. 혼합 용액을 빙수에서 30분간 항온처리한 다음, 42℃에서 2분간 항온 처리하여 세포내로 DNA를 도입시킨다. 1㎖의 2YT 액체 배지를 이 현탁액에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양한 후, 현탁액을 2YT 한천 배지(50㎍/㎖ 암피실린, 40㎎/1 X-gal, 23.83 ㎎/1 IPTG 및 1.5% 한천 함유) 상에 도말한다. 얻어진 백색 콜로니에서 플라스미드를 조제하고, 그의 제한 엔도뉴클레아제 지도를 분석하여 목적 플라스미드 pARut 13을 보유하는 콜로니를 선별해 낸다. 선별된 콜로니를 400㎖의 2YT 액체 배지(100㎍/㎖ 암피실린 함유)에서 배양하고, SDS-알칼리법에 의해 다량의 플라스미드 DNA를 조제한다.

(2) BamHI-EcoRI 단편의 단리

상기 다량 조제된 플라스미드 DNA(pARut 13) 15㎍(15㎕) 각각에 20㎕의 10×K 완충액, 120유니트(10㎕)의 BamHI(다까라 슈조 가부시끼가이샤 제품) 및 멸균수를 첨가하여 총 부피를 200㎕로 만든 8개의 에펜도르프 튜브(용량 1.5㎖)를 준비한다. 이 튜브들을 30℃에서 3시간동안 항온 처리한다. 반응 후에, 반응 혼합물을 각각 페놀-클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 수집하고 110㎕의 멸균수에 각각 용해시킨다. 이 DNA 용액에 30㎕분량의 5×EcoRI 완충액 및 120 유니트(10㎕) 분량의 EcoRI을 첨가한 다음, 37℃에서 3시간 동안 항온 처리한다. 반응후에, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하고, 1.5% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 목적하는 DNA 단편(약 300bp)을 분리한다. DNA를 각각 겔로 부터 전기적 용출시키고, 핵산-정제용 카트리지 Nensorb20을 사용하여 정제한다.

Ⅲ. h 오페론의 형성

(Ⅲ-1) 전사 종료 영역의 h유전자로의 결찰

(1) pUC13-h-SOD의 BamHI-EcoRI 소화

에펜도르프 튜브내에서, 인간 수퍼옥사이드 디스뮤타아제를 코딩하는 전체 사슬 길이(475bp)의 DNA 단편이 pUC13의 Hind Ⅲ-BamHI 부위에 삽입되어 있는 10㎍(20㎕)의 pUC 13-h-SOD(일본국 특허출원 제 210129/1989호 명세서의 실시예 1 참조)에 40㎕의 5×EcoRI 완충액, 120유니트(10㎕)의 EcoRI 및 멸균수를 첨가하여 총 부피를 200㎕로 만들고 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 반응 후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 수집하고 215㎕의 멸균수에 용해시킨다. 이 용액에 25㎕의 10×K 완충액과 100유니트(10㎕)의 BamHI을 첨가하고, 30℃에서 3시간 동안 반응을 수행한다. 반응 후에, Geneclean을 사용하여 DNA를 정제한다.

(2) 전사 종료 영역(BamHI-EcoRI)의 pUC 13-h-SOD(BamHI-EcoRI)내로의 삽입

11.2㎕의 다까라 결찰 kit A 액체를 500ng(1㎕)의 pUC 13-h-SOD(BamHI-EcoRI) DNA 및 상기 Ⅱ에서 조제된 60ng(0.4㎕)의 전사 종료 영역에 첨가한 다음 충분히 혼합한다. 1.4㎕의 다까라 결찰 kit B 액체를 상기 용액에 첨가하고 충분히 교반한 후 16℃에서 30분간 항온 처리한다. 반응 후에, 이 용액을 이. 콜리 JM 109의 형질전환에 사용한다.

(Ⅲ-2) Hind Ⅲ-EcoRI(hSOD-터미네이터) 단편의 조제

(1) pUC 13-hSODt의 다량 조제

50mM CaCl₂로 처리한 이. 콜리 JM109의 세포 현탁액 100㎕를 2㎕I(약 70ng)의 결찰 용액에 첨가한 다음 서서히 혼합한다. 이 혼합 용액을 빙수중에서 30분간 항온처리한 다음, 42℃에서 2분간 항온 처리하여 DNA를 세포내로 도입시킨다. 1㎖의 2YT 액체 배지를 첨가한 후, 얻어진 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양한 다음, 2YT 한천 배지(50㎍/㎖ 암피실린, 40㎎/1 X-gal, 23.83 ㎎/1 IPTG 및 1.5% 한천 함유)상에 도말한다. 얻어진 백색 콜로니로 부터 플라스미드를 조제하고, 제한 엔도뉴클레아제 지도를 분석하여 목적 DNA 단편을 보유하는 콜로니를 선별해낸다. 선별된 콜로니를 60㎖의 2YT 액체 배지(100㎍/㎖ 암피실린 함유)에서 배양하고, SDS-알칼리법에 의해 플라스미스 DNA를 조제한다.

(2) Hind Ⅲ-EcoRI 단편의 단리

각각, 상기 조제된 50㎕(25㎍)의 pUC 13-hSODt DNA 용액에 20㎕의 10×K 완충액, 120유니트(15㎕)의 Hind Ⅲ 및 멸균수를 첨가하여 총 부피를 200㎕로 만든 두 개의 에펜도르프 튜브(용량 1.5㎖)를 준비한다. 각각의 튜브를 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 반응 후, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 수집하고, 150㎕분량의 멸균수에 용해시킨다. 상기 DNA 용액에 40㎕분량의 5×EcoRI 완충액 및 120 유니트(10㎕)분량의 EcoRI을 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 항온처리 한다. 반응 후에, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하고, 1.5% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 목적 DNA 단편(약 790bp)을 분리해낸다. DNA를 Geneclean에 의해 정제한다.

(Ⅲ-3) 형질 발현 조절영역 ARup 1, 2, 3 및 4에 대한 Hind Ⅲ-EcoRI(hSOD-터미네이터) 단편의 결찰(제6도 참조)

형질 발현 조절 영역(ARup 1, 2, 3 및 4) 각각의 1.12㎍(2.1㎕) 및 Hind Ⅲ-EcoRI 단편 2.11㎍(2.2㎕) 분량에 4㎕ 분량의 5×결찰 완충액(250mM 트리스-HCl(pH 7.6), 50mM MgCl₂), 2㎕분량의 100mM DTT, 2㎕ 분량의 ATP, 2.5 유니트(1㎕)분량의 T4 DNA 리가아제(다가라 슈조 가부시끼가이샤 제품) 및 멸균수를 첨가하여 각각 총 부피를 20㎕로 만든 에펜도르프 튜브를 준비한다. 이 튜브들을 15℃에서 밤새 항온 처리하고, 60℃에서 10분간 열처리에 의해 반응을 정지시킨다. 이 용액에 10㎕분량의 5× EcoRI 완충액, 12유니트(1㎕) 분량의 EcoRI 및 멸균수를 첨가하여 총 부피를 50㎕로 만든다. 이 용액을 37℃에서 3시간 동안 항온 처리한다. 반응후에, 목적하는 각각의 DNA 단편(제7도 참조, 각각 약 1200bp)을 2% 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 분리해내고 Geneclean을 사용하여 정제한다.

(Ⅲ-4) 네 개의 hSOD유전자-형질 발현 DNA 단편의 클로닝

(1) pUC18의 EcoRI 소화 및 연속되는 알칼리 포스파이타아제 처리

에펜도르프 튜브내에서, 20㎍(30㎕)의 플라스미드 pUC 18 DNA에 40㎕의 5×EcoRI 완충액, 120유니트(10㎕)의 EcoRI 및 멸균수를 첨가하여 총 부피를 200㎕로 만들고, 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 반응 후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 수집하고 100㎕의 0.1M 트리스-HCℓ(pH 8.0)에 용해시킨다. 10㎕의 알칼리 포스파타아제 용액을 이 용액에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온 처리한다. 반응 후에, 다른 10㎕의 알칼리 포스파타아제 용액을 첨가하고, 65℃에서 30분 동안 항온 처리를 수행한다. 반응 용액을 페놀-클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 수집하고, 0.16㎍/㎕까지 TE 중에 용해시킨다.

(2) hSOD 오페론 단편의 pUC 18(EcoRI 및 AP-처리)내로의 삽입

24㎕ 분량의 다가라 결찰 kit A 액체를 hSOD 오페른(프로모터-SOD-터미네이터 1, 2, 3 및 4) DNA 각각의 100ng(1㎕) 및, 320ng(2㎕) 분량의 EcoRI과 알칼리 포스파타아제로 처리된 pUC 18 DNA에 각각 첨가한 다음, 충분히 교반한다. 3㎕분량의 다까라 결찰 kit B 액체를 이 용액에 첨가하고, 충분히 교반한 후 1℃에서 밤새 항온처리한다.

(3) pUC 18-Rupt-hSOD 1, 2, 3 및 4의 다량 조제

50mM CaCl₂로 처리된 이.콜리 JM 109 균주의 세포 현탁액 200㎕ 분량을 각각의 결찰 용액 4㎕(약 50ng)에 첨가한 다음 서서히 혼합한다. 이 혼합 용액을 빙수에서 30분간 항온처리한 다음 42℃에서 2분간 더욱 항온처리하여 세포내로 DNA를 도입시킨다. 1㎖ 분량의 2YT 액체 배지를 이 현탁액에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양한 후, 혼합물을 2YT 한천 배지(50㎍/㎖ 암피실린, 40㎎/㎖ X-gal, 23.83 ㎎/1 IPTG 및 1.5% 한천)일부에 도말한다. 수득된 백색 콜로니로 부터 플라스미드를 조제하고, 제한 엔도뉴클레아제 지도를 분석함으로써, 목적하는 각각의 플라스미드(pUC 18- Rupt-hSOD 1, 2, 3 및 4)를 보유하는 콜로니를 각각 선별한다. 각각의 선별된 콜로니를 200㎖분량의 2YT 액체 배지(100㎍/㎖ 암피실린 함유)에서 배양하고, SDS-알칼리법에 의해 각각의 플라스미드 DNA를 다량 조제한다.

(4) EcoRI단편(약 1200bp)의 단리

상기 다량 조제된 각각의 플라스미드(pUC 18-Rupt-hSOD 1, 2, 3 및 4)의 약 20㎍(20㎕)에 40㎕분량의 5×EcoRI 완충액, 120 유니트(10㎕) 분량의 EcoRI 및 130㎕ 분량의 멸균수를 첨가한 에펜도르프 튜브를 각각의 플라스미드당 3개씩 준비한다. 이 튜브들을 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 반응 후에, 에탄올 침전에 의해 DNA를 수집하고, 각각의 플라스미드를 100㎕분량의 TE에 용해시킨다. 목적하는 각각의 DNA 단면(약 1,200 bp)을 1.5% 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 분리하고, Geneclean을 정제한다.

Ⅳ. 남조류를 위한 hSOD 유전자 형질 발현 벡터의 형성(제8도 참조)

(Ⅳ-1) 멀티클로닝 부위(pUC 18에서 유래)의 pBR 322 내로의 도입

(1) pBR 322의 EcoRI-Hind Ⅲ 소화 및 연속적인 알칼리 포스파티아제 처리 20㎕(10㎍)의 pBR 322 DNA 용액에 40㎕의 5×Hind Ⅲ 완충액(50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 35mM MgCl₂, 300mM NaCl), 80 유니트(10㎕)의 Hind Ⅲ 및 130㎕의 멸균수를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 항온처리 한다. 반응후에, 이 용액에 40㎕의 5×EcoRI 완충액, 120유니트(10㎕)의 EcoRI 및 50㎕의 멸균수를 첨가하고, 37℃에서 2시간동안 반응을 추가로 수행한다. 반응 후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름으로 처리하고, DNA를 에탄올 침전에 의해 수집하고, 100㎕의 0.1M 트리스-HCl(pH 8.0)에 용해시킨다. 10㎕의 알칼리 포스파타아제 용액을 이 용액에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리를 수행한다.

반응 후에, 10㎕의 알칼리 포스파타아제 용액을 첨가하고, 65℃에서 30분간 항온처리한다. 이 용액을 페놀-클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한다.

(2) pUC 18로 부터 멀티클로닝 부위(EcoRI-Hind Ⅲ)의 단리

20㎕의 10×K 완충액, 80 유니트(10㎕)의 Hind Ⅲ 및 140㎕의 멸균수를 30㎕(20㎍의 pUC 18 DNA 용액에 첨가한 각각의 에펜도르프 튜브 2개를 준비하고, 37℃에서 3시간 동안 항온 처리한다. 반응 후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름으로 처리하고, 각각의 DNA를 에탄올 침전에 의해 수집하고, 112.5㎕의 멸균수에 용해시킨다. 이 용액에 30㎕분량의 5×EcoRI 완충액 및 90 유니트(7.5㎕) 분량의 EcoRI을 각각 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 항온 처리한다. 에탄올 침전에 의해 DNA를 수집하고, 1.5% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 목적 DNA 단면(약 50bp)을 분리해낸다. 겔로 부터 DNA를 전기적으로 용출시키고, 페놀-클로로포름 처리 및 에탄올 침전에 의해 DNA를 정제한다.

(3) pBR 322(EcoRI-Hind Ⅲ 소화)의 멀티클로닝 부위로 결찰

1㎕의 TE 및 24㎕의 다까라 결찰 kit A 액체를 0.2㎍(1㎕)의 pBR 322(EcoRI-Hind Ⅲ, AP처리) DNA 및 0.2㎍(1㎕)의 멀티클로닝 부위 DNA에 첨가한 다음 충분히 교반한다. 3㎕의 다까라 결찰 kit B 액체를 상기 용액에 첨가하고, 16℃에서 4시간 동안 항온 처리한다.

(4) 플라스미드 pBR 322 M의 클로닝

CaCl₂로 처리된 이. 콜리 HB 101의 세포 현탁액 200㎕를 3㎕(40ng)의 결찰 용액에 첨가한 다음 서서히 혼합한다. 이 혼합 액체를 빙수중에서 30분간 항온처리한 다음, 42℃에서 2분간 항온처리하여 세포내로 DNA를 도입시킨다. 1.8㎖의 2YT액체 배지를 상기 현탁액에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양한 후, 혼합물을 LB 한천 배지(50㎍/㎖ 암피실린 함유)상에 도말한다. 얻어진 콜로니로 부터 플라스미드를 준비하고 제한 엔도뉴클레아제 지도를 분석함으로써, 목적 플라스미드(pBR 322 M)를 보유하는 콜로니를 선별한다. 선별된 콜로니를 200㎖의 2YT 액체 배지(100㎍/㎖ 암피실린 함유)중에서 배양하고, SDS-알칼리법에 의해 플라스미드 DNA를 다량 조제한다.

(Ⅳ-2) PvuⅡ Eco 47 Ⅲ 단편(2550 bp)의 단리

상기(Ⅳ-1)에서 조제된 pBR 322 M 플라스미드 DNA의 10㎍(10㎕)에 10㎕의 10×M 완충액(100mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 500mM NaCl), 120 유니트(10㎕)의 PvuⅡ(다까라 슈조 가부시끼가이샤 제품) 및 멸균수를 첨가하여 총 부피를 200㎕로 만든 3개의 에펜도르프 튜브를 준비한다. 이 튜브들을 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 반응 후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 수짐하고 174㎕분량의 멸균수에 용해시킨다.

이 용액에 20㎕분량의 10×H 완충액 및 24 유니트 분량의 Eco 47Ⅲ(다까라 슈조 가부시끼가이샤 제품)을 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 항온 처리한다. DNA를 에탄올 침전시켜 회수하고, 목적 DNA 단편(2550bp)을 1.5% 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 분리한다. 분리된 DNA 단편을 Geneclean을 사용하여 정제하고, 50㎕의 0.1M 트리스-HCl(pH 8.0)에 용해시킨다. 5㎕의 알칼리 포스파타아제 용액을 이 용액에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 반응 후에, 5㎕의 알칼리 포스파타아제 용액을 첨가하고, 65℃에서 30분 동안 계속 항온 처리한다. 반응 후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 수집하고 20㎕의 TE에 용해시킨다.

(Ⅳ-3) A. 니둘란스에서 pBAS 18의 복제 개시점 분리

A. 니둘란스 6301의 내인성 플라스미드(pBAI 및 BamHI으로 소화)를 pBR 322의 BamHI 부위에 삽입한 이. 콜리와 A. 니둘란스 간의 셔틀 벡터 pBAS 18(K. 시노자끼 등, Gene, 19 : 221~224(1982))을 이. 콜리 HB 101에 도입시킨다. 얻어진 균주를 LB 액체 배지(50㎍/㎖ 암피실린 함유)에서 배양하고, SDS-알칼리법에 의해 벡터를 다량 조제한다.

상기 조제된 14㎍(20㎕)의 pBAS 18 DNA에 20㎕의 10×K 완충액, 100 유니트(10㎕)의 BamHI 및 멸균수를 첨가하여 총 부피를 200㎕로 만든 세 개의 에펜도르프 튜브를 각각 준비하고, 30℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 반응 후에, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하고, 1%아가로오스 겔 전기 영동에 의해 목적 DNA 단편(pBAI, 약 8.0 kbp)을 분리해내고 Geneclean에 의해 정제한다.

2㎍(5㎕)의 분리 및 정제된 pBAl(BamHI으로 소화됨) DNA에 5㎕의 10×K 완충액, 24 유니트(2㎕)의 XhoI 및 38㎕의 멸균수를 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 항온 처리한다. 반응 후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 수집한다. 수득된 BamHI-XhoI-소화 DNA의 양쪽 말단을 다까라 결찰 kit를 사용하여 블런트화 한다.

(Ⅳ-4) 소형화 이, 콜리-A, 니둘란스 셔틀 백테 pBAX 18(6.9 kbp)의 형성

(1) pBAX 18(약 6.9kb)의 조제

48㎕의 다까라 결찰 kit A 액체를 40ng(2㎕)의 블런트화 DNA 및 200ng(4㎕)의 PvuⅡ-Eco 47 Ⅲ 단편 DNA에 첨가하고, 충분히 교반한후, 6㎕의 B 액체를 첨가하고 16℃에서 4시간 동안 항온 처리한다. 이 용액을 사용하여 이. 콜리 HB101균주를 형질 전환시키고 LB 한천 배지(50㎍/㎖ 암피실린 및 1.5% 한천 함유)에 도말하여 콜로니를 수득한다. 수득된 콜로니로 부터 플라스미드를 조제하고, 제한 엔도뉴클레아제 지도를 분석함으로써 목적 플라스미드 pBAX 18을 보유하는 콜로니를 선별해낸다. 선별된 콜로니를 2YT 액체 배지(100㎍/㎖ 암피실린 함유)에서 배양하고 SDS-알칼리법에 의해 플라스미드 DNA를 조제한다.

(2) pBAX 20(약 5.8 kb)의 조제

상기(Ⅳ-3)에서 조제된 1㎍(4㎕)의 BamHI-XhoI(블런트화) DNA 단편에 2㎕의 10×M 완충액, 1㎕(12 유니트)의 PvuⅡ 및 13㎕의 멸균수를 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 항온 처리한다. 2㎕(100ng)의 상기 반응 용액에 (2)에서 조제된 100ng(2㎕)의 PvuⅡ-Eco 47 DNA 단편 및 16㎕의 다까라 결찰 kit A 액체를 첨가하고, 충분히 교반한 후, 4㎕의 B 액체를 첨가하고, 16℃에서 2시간 동안 항온처리한다. 반응 후에, 이 용액을 사용하여 이. 콜리 HB101을 형질 전환시키고, LB 한천 배지(50㎍/㎖ 암피실린 및 1.5%한천 함유)에 도말하여 콜로니를 수득한다. 수득된 콜로니에서 목적 플라스미드(pBAX 20)를 보유하는 콜로니를 선별해내고 200㎖의 2YT 액체 배지(100㎍/㎖ 암피실린 함유)에서 배양하고, SDS-알칼리법에 의해 플라스미드 DNA를 조제한다.

(Ⅳ-5) hSOD유전자-형질 전환 벡터의 클로닝

(1) pBAS 18의 EcoRI 소화 및 연속적인 알칼리 포스파타아제(AP) 처리

각각의 에펜도르프 튜브내에서, 10㎍(20㎕)의 pBAX 18 DNA에 40㎕의 5×EcoRI 완충액, 120 유니트 (10㎕)의 EcoRI 및 130㎕의 멸균수를 첨가하여 총 부피를 200㎕로 만든 2개의 에펜도르프 튜브를 준비한다. 각각의 튜브를 37℃에서 3시간 동안 항온처리하고, DNA를 Geneclean에 의해 정제하고 100㎕의 0.1M 트리스-HCl(pH 8.0)에 용해시킨다. 10㎕의 알칼리 포스파타아제 용액을 상기 용액에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하고, 또 다른 10㎕의 알칼리 포스파타아제 용액을 첨가한 후 65℃에서 30분 동안 항온처리를 수행한다. 반응 후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름으로 처리하고 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한다.

(2) hSOD 오페론의 pBAX 18(EcoRI, AP 처리)로의 결찰, 다량 조제

EcoRI 및 AP로 처리된 0.5㎍(1㎕) 분량의 pBAS 18을 상기(Ⅲ-4)에서 조제된 네 개의 hSOD 오페론(약 1.2kbp) 각각의 0.25㎍(1㎕)에 각각 첨가하고, 다까라 결찰 kit를 사용하여 결찰을 수행한다. 이 결찰 용액을 사용하여 이. 콜리 HB 101 균주를 별도로 형질 전환시키고, 각각의 형질 전환체-함유 액체를 LB 한천 배지(50㎍/㎖ 암피실린 함유)에 도말하여 콜로니를 수득한다. 수득된 콜로니에서 플라스미드를 조제하고, 제한 엔도뉴클레아제 지도를 분석함으로써, 목적하는 각각의 플라스미드(pBAX SOD 6, pBAX SOD 7, pBAX SOD 8, pBAS SOD 9, pBAX SOD 6-4, pBAX SOD 7-4 및 pBAX SOD 8-4)를 보유하는 콜로니를 선별해낸다. 선별된 각각의 콜로니를 50㎖분량의 LB 액체 배지(100㎍/㎖ 암피실린 함유)에서 배양하고, SDS-알칼리 법에 의해 플라스미드 DNA를 조제한다.

(3) pBAS 18의 EcoRI 소화 및 연속되는 알칼리 포스파타아제(AP) 처리

에펜도르프 튜브에서, 18㎍(30㎕)의 pBAS 18 DNA에 40㎕의 5×EcoRI 완충액, 12 유니트(10㎕)의 EcoRI 및 120㎕의 멸균수를 첨가하여 총 부피를 200㎕로 만들고, 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 반응 후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름으로 처리한 다음 클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한다. 회수된 DNA를 100㎕의 0.1M 트리스-HCl(pH 8.0)에 용해시키고, 10㎕의 알칼리 포스파타아제 용액(1 유니트/10㎕)을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온 처리한다. 이어서, 10㎕의 알칼리 포스파타아제 용액을 첨가하고, 65℃에서 30분 동안 항온 처리한다. 반응 후에, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름으로 처리한 다음 클로로포름으로 처리하고 DNA를 정제하고 에탄올 침전에 의해 회수한다.

(4) hSOD오페론의 pBAS 18 (EcoRI 및 AP로 처리)으로의 결찰 및 다량조제

1.5㎍(2㎕) 분량의 EcoRI 및 AP-처리된 pBAS 18을 상기(Ⅲ-4)에서 조제된 네 개의 hSOD 오페론(약 1.2kb) 각각의 0.25㎍(1㎕)에 첨가하고, 다까라 결찰 kit를 사용하여 결찰을 수행한다. 이 반응 용액을 사용하여 이. 콜리 HB101 균주를 각각 형질 전환시키고, LB 한천 배지 (50㎍/㎖ 암피실린-1.5% 한천 함유)상에 도말하여 콜로니를 수득한다. 수득된 콜로니로 부터 플라스미드를 조제하고, 제한 엔도뉴클레아제 지도를 분석함으로써, 목적 플라스미드(pBASOD 6, pBASOD 7, pBASOD 8 및 pBASOD 9)를 보유하는 콜로니를 선별해낸다. 선별된 각각의 콜로니를 200㎖ 분량의 2YT 액체 배지(100㎍/㎖ 암피실린 함유)에서 배양하고, SDS-알칼리 법에 의해 플라스미드 DNA를 조제한다.

Ⅴ. 남조류 아나시스티스 니둘란스 6301 및 R2를 이용한 hSOD 유전자의 형질발현

(V-1) A. 니둘란스 6301(세니코코커스 PCC 6301) 및 R2(시네코코커스 PCC 7942)의 형질 전환

100㎖ 분량의 BG-11액체 배지중에서 1~5일간 배양한 각각의 세포를 8,000rpm에서 5분간 원심분리에 의해 수집하고, 10㎖ 분량의 새로운 액체 배지 중에 현탁시킨다(10⁸~10⁹세포/㎖). 1㎖ 분량의 각각의 세포 현탁액을 폴리에틸렌 튜브(Falcon 2059)에 붓고, 조제된 플라스미드 DNA를 각각 0.1~1.0㎍의 농도로 튜브내에 넣는다. 얻어진 튜브를 각각 알루미늄 호일 시트로 덮고, 30℃에서 밤새 배양한 후, 알루미늄 호일시트를 제거한 다음, 빛 조사(광원 : 차가운 백색 형광 램프 ; 1,000~2,000룩스)하에서 30℃에서 6시간 동안 배양을 계속한다. 이 세포현탁액을 각각 100~500㎕씩 취하고, BG-11 한천 배지(1mM 소듐 티오술페이트, 1~5㎍/㎖) 암피실린 및 1.5% 한천 함유)에 도말한다. 이 플레이트를 빛 조사(광원 : 차가운 백색 형광 램프 ; 2,000~3,000룩스)하에 4~10일간 배양한다.

(Ⅴ-2) 배양

이렇게 수득된 콜로니를 2㎖ 분량의 BG-11 액체 배지(10㎍/㎖ 암피실린 함유)로 옮기고, 빛 조사(광원 : 차가운 백색 형광 램프 : 2,000~3,000룩스)하에 10일간 배양한다. 이어서, 이 배양액을 100㎖분량의 BG-11 액체 배지(10㎍/㎖ 암피실린 함유)에 각각 옮기고, 빛 조사(2,000~3,000룩스)하에 20일간 배양한다. 각각의 배양을 10㎖씩 취하여 100㎖분량의 BG-11액체 배지(50㎍/㎖ 암피실린 함유)에 각각 옮기고, 빛 조사하에 20일간 배양한다. 각각의 세포를 4℃에서 10분 동안 8,000rpm에서 원심 분리에 의해 수집하고, 1mM Hepes 완충액(pH 7.0)중에 재현탁시키고 원심분리에 의해 세척한다. 세척후에, 각각의 세포를 실험에서 사용할 때까지 -20℃에서 보관한다.

(Ⅴ-2) hSOD의 검출

(1) h-SOD활성 염색

리보플라빈을 사용한 광중합법에 의해 제조된 아크릴아미드 겔을 사용하여 전기영동을 수행한다[단백질, 핵산 및 효소, 11 : 744(1966)]. 전기 영동 후에, 겔을 50mM 인산 칼륨(pH 7.8)-0.5mM EDTA로 2~3회(5분간) 세척한 다음, 니트로블루테트라졸륨(NBT) 용액 (2.5mM NBT, 50mM 인산칼륨, 0.5mM EDTA, pH 7.8)중에 7분간 침지시킨다. 이어서, 겔을 리보플라빈 용액(100μM 리보플라빈, 30mM 테트라메틸에틸렌디아민, 50mM 인산칼륨, 0.5mM EDTA, pH 7.8)에 침지시키고, 겔에 현저한 대조가 나타날 때까지 백색광으로 염색한다. 결과를 제9도에 나타낸다. 도면에서, SOD 활성을 갖는 부분은 염색되지 않고 다른 부분은 보라색으로 염색된다.

이로부터 알 수 있는 바와 같이, 형질 전환체에서 아나시스티스 니둘란스 자체가 갖고 있는 Fe-SOD활성 외에도 hSOD활성이 검출된다.

(2) 항-인간 SOD 항체를 이용한 검출

(2-1) 웨스턴 블롯팅

20% SDS-플리아크릴아미드 겔을 사용하여 환원 상태에서 Leammli 등의 조건(Nature 237, 680(1970))하에서 전기영동을 수행한다. 전기영동 후에 겔중의 단백질을 니트로셀룰로오스 막(Amasham Co. 제품, Hybond(C)) 상으로 전기적으로 이동시킨다. 막을 0.3% H₂O₂를 함유하는 50% 메탄올중에 20분 동안 침지시켜 내인성 퍼옥시다아제를 불활성화시킨 다음, 5% 탈지유 및 0.1% Tween 20을 함유하는 TBS(20mM 트리스-HCl, 0.9% NaCl, pH 7.4)중에 37℃에서 2시간 동안 침지시킨다(블로킹). 블로킹 처리한 막을 세정액(0.05% Tween 20을 함유하는 TBS)으로 5분 동안 세척한 다음, 1/1000항-인간 SOD 항체(caprine IgG, Binding Site Co. 제품) 및 0.1% Tween 20을 함유하는 TBS중에서 37℃에서 2시간 동안 항온처리한다. 막을 20분 동안 세정액으로 세척한 다음(5분x5), 10㎎ 디아미노벤지딘(DAB) 및 15㎕의 32% H₂O₂를 함유하는 0.1M 트리스-HCl(pH 7.4) 40㎖로 염색한다.

그 결과, 형질전환체로 부터 추출된 추출물이 전기영동된 레인 상에서 갈색으로 염색된 밴드가 검출되며, 이는 표준 샘플 hSOD(Sigma Co. 제품)에서와 동일한 위치이다(제10도).

(2-2) 오크테로니(Ouchterlony) 법[A Guide to Immunological Experiments, pages 74~77, Gakkai Shuppan Center 발행]

1.2% 아가로오스 용액(10mM 인산염 완충액(pH 7.2), 0.15M NaCl 및 0.1% NaN₃함유)을 페트리 접시(Falcon 1029)에서 2~3mm의 두께로 고형화하고, 적절한 위치에 구멍을 낸다. 10㎕의 항-인간 SOD 항체를 중심 구멍에 놓고, 형질 전환체의 추출물(각각 10㎕), 대조군으로서 A. 니둘란스 R2(비형질 전환체)의 추출물(40㎕) 및 표준 샘플 hSOD를 각각 주변 구멍에 넣고, 4℃에서 밤새 항온처리한다. 항온처리후에, 페트리 접시로부처 한천 플레이트를 꺼내고, PBS(10mM 인산염 완충액, pH 7.2, 0.15 NaCl)중에 침지시키고, 단백질을 충분히 유리시킨다(PBS를 여러번 교체한다. 2~3일간). 이 플레이트를 0.5% 아미드 블랙 용액(90㎖ 메탄올, 10㎖ 빙초산) 중에 침지시켜 염색시킨다. 그 결과, 항-인체 SOD 항체와 표준 샘플 hSOD 사이에, 그리고 항-인체 SOD 항체와 형질 전환체의 추출물(6-4, 8-4)사이에 침전선이 형성됨이 드러난다. 또한, 침전선은 서로 결합하여 단일선(의 형태)로 보이며, 따라서, 표준 샘플 hSOD와 동일한 항원(인간-SOD)가 형질 전환체 내에 형성됨이 확인된다(제11도).

(3) h-SOD활성의 검출

아나시스티스 니둘란스는 내인성 SOD(Fe-SOD)를 갖고 있기 하지만, 내인성 SOD(Fe-SOD)의 활성과는 뚜렷히 구별되는 hSOD(Cu Zn-SOD)의 활성은 1mM KCN에 의한 이들의 억제율 차이를 이용함으로써 측정될 수 있다. 광학 셀(1㎖에 대해)내에 50mM 인산칼륨(pH 7.8), 0.1mM EDTAm 0.1mM 크산틴, 10μM 시토크롬 C(말 심장 유형 Ⅲ, Sigma Co. 제품) 및 샘플(SOD)를 넣고, 전체 부피를 980㎕로 만든다. 20㎕의 크산틴 옥시디아제(뵈링거-만하임사 제품)를 여기에 첨가하여 반응을 개시하고, 시토크롬 C 환원을 550nm에서 흡광도 증가의 초기 속도(30~60초)로 측정하고, 이 값을 ν로 표현한다. SOD 샘플이 첨가되지 않은 경우 시토크롬 C 환원 V로 표현한다. 이 조건하에서 시토크롬 C 환원을 50% 억제하는 SOD는 1/3 유니트로 추측되며, 샘플내의 총 유니트 수는(V/ν-1)로 부터 결정된다(Plant Enzyme Protein-Studying Methods, page 373, Koji Asada, Kyoritsu Publisher Co., Ltd. 발행). 또한, ν을 측정한 반응 용액에 100mM KCl(10㎕)을 첨가하고, 시토크롬 C 환원율 ν' 및 유니트 수를 결정한다.(V/ν'-1). 아나시스티스 니둘란스의 세포내에 형성된 hSOD의 활성{(V/ν-1)-(V/ν'-1)}을 결정한다.

그 결과, 형질 전환체로 부터 수득된 조 추출물의 비활성(1 A₂₈₀유니트당 활성)은 0.7~12유니트/A₂₈₀의 높은 값을 나타낸다.

또한, 비활성은 원래 벡터의 종류 및 SD-형 서열과 ATG간의 염기수에 의해 크게 영향을 받으며, pBAXSOD8(SD와 ATG간의 염기수는 pBAX18을 기준으로 8쌍이다)은 가장 높은 비활성을 갖는다.

[산업상 이용가능성]

상기 기술된 본 발명에 따르면, 남조류 세포를 숙주로 사용하여 유용한 펩타이드를 매우 높은 효율로 형질 발현시킬 수 있으며, 제조된 유용한 펩타이드는 의약품, 의약품에 속하지 않지만 의료용으로 사용되는 화학약품, 화장품 등으로서 사용될 수 있고, 배양된 형질 전환 남조류는 식품, 사료 및/또는 기능식으로 이용될 수 있다.

Claims

생리학적 활성 폴리펩타이드를 코딩하는 구조 유전자, 구조 유전자의 상류에 위치한 아나시스티스 니둘란스 RuBisCO 유전자의 전사개시 영역, 및 구조 유전자의 하류에 위치한 RuBisCO 유전자의 전사 종료 영역을 함유하는 캐리어 DNA를 캐리어 DNA로 사용함을 특징으로 하는, 폴리펩타이드 코딩 구조 유전자를 함유하는 캐리어 DNA로 남조류 세포를 형질 전환시킴으로써 남조류 세포내에서 생리학적 활성 폴리펩타이드를 형질 발현 시키는 방법.
제1항에 있어서, 캐리어 DNA가, 생리학적 활성 폴리펩타이드를 코딩하는 구조 유전자, 구조 유전자의 상류에 위치한 아나시스티스 니둘란스 RuBisCO 유전자의 전사 개시 영역, 및 구조 유전자의 하류에 위치한 RuBisCO 유전자의 전사 종료 영역으로 이루어진 오페론이 도입된 벡터 플라스미드임을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 벡터 플라스미드가 플라스미드 pBAS 18, pBAS 18 또는 pBAX 20임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 생리학적 활성 폴리펩타이드가 인간-SOD와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드임을 특징으로 하는 방법.
인간 SOD와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 인간-SOD 구조 유전자, 인간-SOD 구조 유전자의 상류에 위치한 아니시스티스 니둘란스 RuBisCO 유전자의 전사개시 영역, 및 인간-SOD 구조 유전자의 하류에 위치한 RuBisCO 유전자의 전사 종료 영역으로 이루어진 인간-SOD오페론.
제5항 기재의 인간-SOD 오페론이 도입된 멕터 플라스미드 pBAS 18 또는 pBAX 18로 이루어진 인간-SOD-형질 발현 벡터.
제6항 기재의 인간-SOD-형질발현 벡터로 형질 전환된 남조류 세포.
제7항 기재의 남조류 세포를 배지에서 배양하고, 배양액으로부터 인간-SOD를 회수함을 특징으로 하는 인간-SOD의 제조방법