TW213951B - - Google Patents

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A (i H () 經濟部屮央標平局0工消作杜印11 明説明（,） 本發明為有闢一種新顥霣讎，詳言之為一可於大觴桿 _及豔嫌齠複製之往返載讎.含有由豔球豳類之侧囊胞 SI P B A 1 之 〇 Γ i A 匾 D N A 片段 β β鐮齠Μ囊胞结具類似离等植物特如红藻之光合作用 檐製.可由水，二《化磺及微量無機*生物合成有機物， 故為自營繁殖β且.《1«!跑SS為單细瞄，於洋菜基上形 成〇丨豳落，且其R2菌株易将DNA帶入细_内，故可依撖 生物及遣傳方法加以轉形· 故近來由使用侧囊胞齠R2齠株（如PUH24及PUS25)内生 質體發展許多S殖載鼸（參見C.A.H.J.J. von der Hondel 等人，P i* o c . N a t 1 . A c a d . S c i . U S A 7 7 ( 3 ) ; 1 5 7 0 - 1 5 7 4 ( 1 9 8 0 ) ;C.J.Kuhle^eier等人，Mol.Gen.Genet.184:249-254( 1981);L, ASheran及 P.van do Putte.J.Bacteriol.180 (1):410-413(1982);S.Gendel等人，J.Bacteriol 156 (1):148-154(1983 ) ;S.S.GoldenftL.A.Sherian.J. Bacteriol.155(3):966-972(1983);C.J.Kuhle^eier等人 ,Plasmid 10:156-163(1983);C.J.Kuhleieier等人， G e n e 3 1 : 1 0 9 - 11 6 ( 1 9 8 4 } ; D . E . L a u d e n b .等人，Μ o 1 · G e n , Genet, 199:00-302(1985) ;K.Y.Cruber1f Λ , Curr. Hicrobiol. 1 5 :265-268 ( 1 987 ),等〕，且用於如引入外 來基因及基因遘殖》 使用R2B株表現異生蛋白霣之例有，人讎磺酸脱水_ 及大腸桿篇lac IQ抑制蛋白〔G.D.Price及K.R.Badger, (ί*/1先閲 Α'·ι<竹而之；/).ifJfj^-'ii巧本灯) 裝. 本紙張尺度边用中as家炫準(CNS)1? 4規怙（210X297公«) 81. 2. 20,000 ‘U.:、發’説叫（>) Plant Physiol 91:505-513(1989)〕，解澱粉芽抱桿 《 A 50之 α -激粉酶[I.V.Elansk&ya及 I.B.Morzunoba.Mol •Genet Microbiol Virasol.0(9}:7-l(1989)〕，球形芽 孢桿醣1 5 9 3 H之殺ft蛋白質[D.J.Scanlan等人· Gene. 9 0 : 4 3 - 4 9 ( 1 9 9 0 ) . M.R.Seh&eter* S.S.Golden,J. Bacteriol 171Π>:3973-398Η1989Π ,大腸榫 β 之 Hn -遇氣技化 _ [M.Y.Gruber等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 8 7:2 6 0 8 - 2 6 1 2 ,入噬皤钃之（clts之抑制蛋白霣[ D.Friedbergft J.Seiifers,Mol.6en.Genet.203:505-510 ( 1 9 8 6 )] , cya ηobacteriu Synechosystis PCC.6 80 3 株之 disaturase[H.Wada等人.Nature 347:200-203( 1 9 9 0 )]等 0 此外，例囊胞«6301株被使用以网生質體（PBA1)載鼸 (與大腸桿阐之兩棲_鑛> 如PBAS 18〔 12fcb,IL.Shinozaki e t al. , Gene. 1 9 : 2 2 1 - 2 2 5 ( 1 982 )]及 pBAS 5 C 1 4kb . kazuo Shinozaki,"Shofcubutsu Idenshi Sosa GijutBH"(植物 基因搡作技術），由Hikoyuki Ya"guchi指導，98至llfl 頁，CMC發行〕上發展。但，毎一載《於基因操作上皆有 困雞，如可被嵌入任一載鼸之基因大小皆受限制，因其 本身即已有lOlib以上長度且任一 _體僅有少數可供SRI 之限制内切核酸期I作用部位《且· 6301齠株和R2_株相 比有不易將基因D Η Α»入纗胞内之缺點·故其轉形頻率 低於R2篇株·為增加6 3 0 1 68株轉形頻率，B.Daniell，

本紙張尺度边用中明囤家4i^(CNS)»F4規格（210X297AW 81. 2. 20,000 經濟部屮央桴準而卩工消frN-作杜印5Ϊ 1、發明説明u ) et al.〔PNAS(USA), 83 : 254β-255Μΐ986)〕，提出将 6301«株之细胞以EDTA-溶»素處理形成通透雎靨（ Perieaplasts),而使其易於帶人DNAe事實上此法的確 成功地增進了 63ϋ1®株的轉形頻率，但有如操作簧畤複 雜且更會因EDTA-溶β衆處理而損傷细胞之缺點· 故，為提离側囊胞齠6301皤株轉形頻率，構築一易於 基因操作處理之質β,本發明首先専研纽I小質麟•«由 將6301®株内生質讎pBAl複製起始S外之部份盡置縮小 做為-基部.U旧丨時將1比1體與含大梢閉C 〇 1 . E 1霣黼複»起始B (OriES )且其中由rop® (也稱γο·Ε但本發明中稱為1*0口 區定義之基因己除去之卯Α丨；段結合.、!!两使1m. I) (: 1 «所用之多申選范运·S' 而成功地製得4顯笤增強6 3 0 1 Μ株轉衫_苹之f j體，！ ！因ίίπ完,木特叫 故本發明明提供一能於大腸桿醣及籃嫌篇中複製生畏 之往返載體霣鼸，具有 U)由供囊胞睹所衍生之pBAl質鼸的OriAS · (b) 多重選殖匾，及 (c) 含OriEB且其由rop區定義之基因己去除之大鼸桿® 素E1質饑匾域β 以下詳述本發明之《黼· ”由侧囊胞齠所衍生之ΡΒΑ1»讎的OriAE "<籣稱"OriA" )於本發明之質讎中為含由豔*藻中cloococcus屬鲕囊 胞豳 6 3 0 1 ( S y n e c h 〇 c 〇 c c u s P P C β 3 0 1 , A T C C 2 7 1 4 4 , ϋ T EI 625¾株）之兩内生霣讎中分子量<5.04 土 0.2β>Χ 10» ( (-先閱-作而之沁^贺川^^巧木·^) 本紙張尺度边用中Sffl家標毕（CHS)T^ii岱（210x297公及） 81. 2. 20,000 A (； η ()_______ 發叫説明（斗） 霣子顯微分析所得）或5.2Χ 1〇β (洋菜醪《泳分析所得 )〔K.Shinozaki et ai.,Gene. ,1 9:2 2 1 - 2 2 4 ( 1 9 8 2 )〕之 PBAI質體所衍生之複製起始S之基因H段，大小遍常為 2.8至8.0111),以2.8至4.41[13之範園為佳。特以由^1»〇1及 Ββ·ΗΙ兩限製醐切拥pBAl所得4.4kb之含OriA區DNA片段， 或是以PvuII及Ββ·ΗΙ切割PBAI所得之3.3kb含OriAB之 DNA片段等。 "多重 選殖B"(簡稱"HCB")為具種種限制内切核_ _辨織部位的序列（又稱多達结子（Polylinker ί ) *包括 作為大颺捍«應殖載讎之〇〇181質_?旧，如具EcoRI,

SacI,Kpnl,Seal,X«aI,BaBHI,XbaI.SalI,AccI,Hindi,

PstI,SphI及Hindlll限制内切核酸W辨織部位之55bP DNA片段，及，由pus12, PUC13. PUC19等衍生之MCB及 大腸桿齄噬《讎載讎H13之HCB亦可❶更甚者•亦可用 化學合成之HCB β

於本發明中用於與OriA及HC结合”含OriE堪且其中由 γορΒ定義之基因己除去之由Col E1霣讎衍生之B域"（ 簡稱"OriE")意指大腸桿0中所用之co1 E1質讎禊製起 始B且其複製數（Copy number)為毎細胞20至30。此OriA

之代表性例為可用限制内切核酸_PvuII; AvaI，Ba*HI ,Eco47III,EcoRV, PstI 等由 PBR 3 2 2 切出，大小為 1.5 至 4.1kb,以1.5至2.5kb為佳且可使用質讎PUC18衍生之含 OriE DNAH 段。 81. 2. 20,000 (^先«!../;开而之./1':-卞川卟诏.?;;木.0;) 線- 本紙张尺度遑用中國困家《^(CNS)IM規怙（2丨0X297公放) Π (ί /;、發明説明（Γ ) 且，此含OriE之DNAH段可含抗蕖基因如安比西林抗 藥基因U p f ),作為避殖指樣。 只要是本發明所提供之質讎則分具前述三種必要基因 E , EP 0 r i A , M C E及0 r i E之D N A Η段，可含*箝其他蠢 傅訊息之DNAH段，如安比西林抗蕖基因做為抗抗生索 指禳且/或氰徽素基因做抗抗生素指標。此質體之典型 例為由本發明者命名之"質體ΡΒΑΧ18”，及”質讎ΡΒΑΧ20” 其含OriA,MC及OriE匾3基因區域之DNA片段，分子置分 別為 4.48MDa(约 6.9kb)及 3.76MDa(約 5.8kb)· 本發明中，霣釅分子量由洋菜謬《泳法澜得β 以下詳述質體ΡΒΑΧ18及ΡΒΑΧ20。 画1為質體ΡΒΑΧ18限制内切核酸Μ興·。 函2為質《|ρΒΑΧ20限制内切核酸_興_， 圖3為質髓ΡΒΑΧ18及ΡΒΑΧ20之構築β 質讎ΡΒΑΧ18及ΡΒΑΧ20對各種限制期辨織部位數目及限制 内切核酸酶切割Η段畏度（kb}示於表1。且，ρΒΑΧ 18及 ΡΒΑΧ20之限_内切核酸_興_示於圏1至2。 7 本紙張尺度边用中國Η家標準（CNS)T4規格（2丨Οχ297公兑） 81. 2. 20,000 -η iVJ Λη_ 而 木 (i Λ (ί ΙΠ;

S a m ΗI xr,al :/1彳 5 Τ Bg:II Hpal Ξ〇ο. Η V Seal FvuII Hindi: Kpnl PstI

pgMa· S -π 先 間 Ά 竹 3.8, 1.M5 0.OO5, 0.55 P25 2·8 , 1 ;V5 5 , C. 3 7 8.f- σ · 5.9 IT.9 Γ 0 s s H®珈» (kb)

stKPBAX IS Λ. 'fi I1} 木 α 裝 .線 0 0 經濟部屮央楛準劝八：作杜*f5i

本紙張尺度边用中a ffl家榀毕（CNS) Ή册Μ 2 ] 0 X :!D7公及) 81. 2. 20,000 A (i Η (i 經濟部屮央標平沿Ht-/νί你合作杜卬¾ 五、#叫説叫（7) 本發明中具上述特性之質讎PBAX18及pBAX2〇,可由如 下方法製得· 首先，由含《囊鼸鐘所衍生之霣βρΒΑΙ OriA DNAH 段可依習知方法（T.Haniatis et al.. Molecular Cloning-a Laboratory Manuo^l-,published by Cold S p r i n g B a b o r L a b o r a t o r y).於大腰桿鏞中 fi 播侧 β «及大《桿齠之往返«讎PBAS18(參考K.Shinozaki et al.，Gene 19:22 1- 22 4 (1982)〕，再依習知方法（1·· Kaniatis et al.,Holecular Cloning),由所選殖之質 臞PBAS18以一组BaiHI及Xhol限制内切核酸M或BaiHI及 p v 限制内切核St to之糾合加..丨.U1]别·由丨丨L. . Ilf分别丨π到约L Mi 約3 . 3ltb之含Ori A之DN A片段。必要時，可用T 4 DNA聚 合酶將5’-突出嫌加以變鈍。 另一方面，«黼PUC MCB可由如以限制内切核酸_ EcoRI及Hindlll切拥霣髅PUC18製得。 且，可簡便地利用質鼸PBR322,(其為一典型Col E1 質臞 >,做為含Col El霣鼸OriEB且其由roplg決定之基 因己去除之DNA片斷· 故所得MCB輿以限制内切核酸_EcoRI和HindIII®_ 之霣體PBR 3 2 2結合•以T 4 DNA结合酶處理得到上述HC 匾殖入霣 P B R 3 2 2之質讎P B K 3 2 2 Μ ·將由限制内切核_ _ Eco47III 及 PvuII切拥之霣籲 PBR322M.與含 OriB 及 NC B之2 · 5 k b D Η A片斷及上述含〇 r i A D Η A片斷结合•以Ϊ 4 DNA接合_作用可得所欲之霣讎PBAX18及PBAX20· -9 - 81. 2. 20,000 ___ϋϋ_ 五、發明説明u ) 钃3為質fl|pBAX18及PBAX20構築，其特殊製法於例 中教述 而本發明中所製備之質讎為具可於大腰捍朗中自行複 製之OriEB及可於侧囊胞«中自行複製之OriAH之往返 載鼸質體。故，本發明質讎可使用大腸挥齠快邃大量生 産，所得之大量霣醒可使藍錄_如僳囊胞菌有效轉形。 且，由於本發明中MCE己殖入霣體，故除霣*pBAS18 唯一所用之EcoRI辨識位置外可利用如S*aI,Ba*HI,XbaI ，ScaI及EcoRV做為嵌入（外來 > 基因辨雄位置。 且，本發明«髏可縮小質讎pBAX18(12kb)約一半大小 (6.9kb至5.8kb)，因質體pBAl中除OriAE之外的DHA部 份已於本發明質鱺中去除。故，可於本發明質鼸中殖入 一較可殖入PBAS18質體外來基因大之外來基因β 將具上述特性之本發明質體以基因操作法引入寄主細 胞之方法可依已知，如 D.A.Liahtfoot et al.,J.Geieral Microbial 134:1509 - l 514(1988)所敘述之方法 β 經濟部屮央標準杓ML消作杜印5Ϊ 此轉形的對侧囊胞睡6301,其轉形頻率可提离約1000 倍（對以質體PBAS18_形相同®株而言}·故，使用本發 明質B,甚至於有外來基因嵌入時，可易於邐取嵌入 目的基因質臞之细胞。 可嵌入本發明質黼之结構基因可由供囊胞»,其他藍 嫌菌細胞，其他細豳及高等動植物所衍生之结構基因等 ，故不受其來源限制.且亦可使用化學合成之结構基因 -1 0 - 本紙張尺度边用中國國家標準（匸吣）〒4規格（21〇父^/公龙） 81. 2. 20,000 經濟部屮央標準劝：消t合作杜印¾ _IUi_、發明説明（9 ) 匾用為本發明質體之殖入結構基因〇此基因之例子為如 化學合成之人類《氣枝化SS [h-SOD，h-SDD-Alae (參考 日本待公開専利申讅第158884/ 1990»等]β 本發明質·以下例詳述之„ 例 1 ( 1 )將多重《殖Ε (衍自P U C 1 8 )引入 A)pBR322之EcoKI-Hindlll切拥及鹹性磷酸期處理 於20>u l(10>u g)之pBR322 DNA溶掖中加入40# 1之5倍 HindI I I ί* 街液(50·Μ rris-HCl(pH7.5),35iM MgC1 2 , 3〇〇·Μ Nacl) ,80單位（i〇/U i>HindIII (由簀酒造公司出品 ),及130>u 1無齠水後將混掖於37T：中培餐2小時。反 慝後，於産物溶掖中加入40,“1 5倍EcoRI緩衝掖（500·Μ Tris-HCl (pH7 . 5) , 35·Μ Η gC t 2 , 2 5 0 ·Μ Nacl, 35·Μ l~Vt 氫乙酵，0·05%小牛血清白蛋白），120單位（10#1) EcoRI (由寶酒造公司製造）及50>ul無®水.再於37*C中 反應2小時。反慝後，以酚-氨仿處理及酒精沈澱，收

-Π 間 Λ；V 之 Λ A 集所得 D N A ,溶於 1 0 0 >u 1 , 0 . 1 Μ T r i s - H C 1 ( p Η 8 . 0 )後， Ρί加入10 U1鹼性磷持胸. Ί5: Ϊ!'1! ；v (1 單位 /10 1)1 鹼竹礤酷 _· 10 rnM 丨丨(:丨（ρΗ7.γη. Γ’0 γπΜ Nacl,l ·Μ ZnS04 ),再於37°C中反瞳1小時.反蠹後， 再追加10//I鹹性磷酸_溶液，再於65-C反應30分鐘β 所得産物溶掖以酚-氱仿《理再經酒精沈毈，收得DNA» Β)從 PUC18 分離多重菝殖 E (EcoRI-Hindlll) 於_小管30//l(2〇Ag)pUC18 DNA溶液中，各加入20# 1 〇 倍 K 播衡掖（2 0 0 Η T r i 8 - H C 1 ( p Η 8 . 5 ) , 1 0 0 _ Η M g C 1 2 , 11 本紙尺度边用中國國家標準（CNS) 1M规格（2】(1X2(JV公楚） 81. 2. 20,000 Λ (； IU; 丘、發明説明（λ 〇) 10·Μ DTT , 100·Μ Κ C 1 ) , 8 0 單位(1 0 # 1 ) H i η d I I I 及 1 4 0 >u 1 0 反DN P 得 37收 於澱 各沈 ，精 水酒 £ 並 無理 tA 於 溶 而 後 應 反 無 處得 仿所 氰於 斷KO 艟 入 各 中 液 溶 後

中 •C 倍應 5 -, 反 及 掖 酒 以 0 時 小 ( A 位DN 單澱 90沈 丨精 \y IX Λί 之 牧 回 再於1.5%洋菜膠霣泳分離目的DNA片斷（約50bp),由膠 鼸中溶離DNA,以酚-氰仿處理，酒精沈澱純化。 C)pBR322(以EcoRI-Hindlll切拥）與多重選殖B黏合 於 0.2// g{ \ μ 1 ) PBR 3 2 2 ( EcoRI -H indl I I , AP* 理）DNA 及 0 . 2 >u g ( 1 /z 1 )多重選殖 B D N A 加入 1 m 1 T E (1 0 Μ T r i s-HCl(pH8.0),l_M EDTA)及 24//1 Takara 黏合組套 A 溶液 ，混勻混掖後加入3>ui Takara酚-氰仿合合組B溶掖， 於1 6汜反鼷4小時。 D )質《3 P B R 3 2 2 Μ之趲殖 於3>u l(40ng>所得》S合溶液加入以50·Μ CaCl2處理 之2 0 0 # 1大腸桿《 Η B 1 0 1 , ffi和ffl合之。於冰水中培餐 半小時後於42Ό培餐2分鐘使细胞圾取DNA。於懸浮掖内 加入1.8·1 2ΥΤ液體培餐基（16g/l胰化蛋白鼸，10g/l 酵母萃取液，5g/l NaClh混掖並於37-C搖晃培餐1小 之 '/(Af 項办墒1'>;7^.=0 經濟部屮央標準XJn L消作合作杜.rp5i 於 \ 鋪5g 平· 後C1 時Na 基 餐 培 菜 洋 嫌 白 蛋 化 胰 \ g ο 5 含 /V 掖 取 萃 母 酵 «32 質ΒΓ 到(P 得 β 落質 @ 的 成目 形含 所得 由 0 ) 林 西 比 安 灌 篩 興 N 酸 核 切 内 刺 限 析 分 以 蓍 培00 的 拜0 嫌 所 0 落 篇 之 本紙張尺度边用中困國家楳準（CNS)T4規仂（210x297公犮） 81. 2. 20,000 A (i Π (i 五、發明説明（㈠） 於2 0 0 1 2 Υ T液讎培餐基（含1 0 0 >u g / 1安比西林）並依 SDS-alkali法大量製備霣AIDNA。 <2)軍離 PVUI1-EC047III片段（2550bp> 同（1)中裂法之g/ 1〇私UPBR322M質《IDRA中加入 2〇u 1 0 倍 M S 衢液（100 臟 Μ ΤΓί8-Β(：1(ρΗ7·5),100·Μ

HgC 1 2 , 10臟M DTT , 500·Μ Ν aC 1 ) , 12〇Stt (ΐ〇^ l)Pvu ΙΙΙ(寶酒堆公司出品）及無®水使混掖總龌建200/ζ 1β 於37*0反應3小時後以酚-氱仿處理，以酒精沈澱牧集DNA .分溶於174·1無醎水中•溶液内分別加入20/il 1〇倍 Η緩衡掖及24單位Eco47III(由寶酒造公司出品），並分 別於37*C反應3小時。反*後以酒精沈》得DH A後以1.5 %洋菜顧霣泳分離目的DNAH段<2550bp>e &Geneclean 純化分離之 D Ν A 片段形成 5 0// 1 0 1 H T r i 8 - H C 1 ( ρ Η 8 . , 溶掖·於溶液中加入5>ul鐮性《酸_溶掖後於37*〇反窿 1小時。反應後再加入5#1_性供酸_溶液再於β5<Ό反 醮30分鐘，以酚-氰仿處理後.酒精沈».收集所得DNa ，溶於 20 1 ΤΕβ (3)分離ft囊豳β之PBAS18複裂起始黏 將往返質讎？8冉318(1(.8111(1〇281^61:(^1.,66118 19: 經濟部+央標準劝A'L-vifr合作杜印1i 22卜224(1982)]〔可於大颺捍_及供囊胞鹧中複製生 長，其中將供囊16鏞6 30 169株之一内生質體（pBAl,以 Ββ·ΗΙ切割）殖人PBR322之BaMI位〕引入大腸桿_ 〇1〇1 株》所得齠株於含5fl>ug/il安比西林之LB液體培餐基 -1 3- 81. 2. 20,〇〇〇 本紙》尺度边用中Η國家標準（CNS)>fM規W(210X297公垃） W (i__ 五、發明説明（p) 中培餐，以SDS -齡性法大《製備__質鼸。於14#g(2〇 A 1)製得PBAS18 DNA中加入20>u 1 10倍k纽衡液，100 軍位（10# l)BaiBI(由寶酒迪公3出& )及麵0水使毎一 小管總«稹為200//1.該小管於30*0反鼴3小畤後以酒 精沈»枚集DNA·以1%洋菜膠霣泳分離目的DNAH段（ PBA1,約 8.0kbp)並以 Geneclean 純化。於 2#g(5#l)分 離鲔化之PBA1 (以Ba«HI切剌）之DNA中加入10倍K緩衝液 ,24擊位（2>u l)XhoI (由簀酒进公司出品）及38# 1無® 水，將混液於37*C反應：3小時後，以氛仿處理及酒 精沈醸收集DNA。所得以BaiHI-XhoI切割之pBAl DNA兩 衊以Takara補齊组套加以變鈍（blunted)。 (4) 構築縮小之大腸桿«及《囊睢齠往返載讎PBAX18( 6 . 9 k b ρ ) 於 40ng(2iu 1>變鈍之 DNA及 200ng(4iu 1)PuvIIEco47III DNA片段加人48//1 Takarafc合组套A溶液，充分混合 後再加入6# 1 B溶液後於16*C下反應4小畤·以此溶 掖將大颺桿篇BB101篇株_形後平鍤於LB洋菜培餐基（含 5 0// g/*l安比西林及1.5%洋菜）可得«落•由明落中 »備霣驩，並以分析限制内切核酸鼸興籂S含目的霣 釀PBAX18之《落。《選所得之B株以毎瓶45·1之2 YT掖 讎培餐基（含100# g/ ·1安比西林）培餐以SDS-_性法製 備霣fll DNA· (5) 製備 PBAX20(約 5.8kb) -14* 81. 2. 20,000 (••-'•先閒^介而之.'1-"#^,々^"^“) 本紙張尺度逍用中SH家楳準（CNS)T4垛IM210X29V公祛） Λ (i l\ (； 五、發明说明（G) 於 1// g(4# 1)(3}所製得之 Ba_BI-XhoI(鈍）BNAH 斷加 入2>ul 10倍Η缓衡掖，ι#ι(ΐ2摩位）Pvull及13/ul麹 Μ水後於37°C反應3小時。於2// I(l〇〇ng)本反鼴掖中 加入 100ng(2；u 1)由（2丨中所製捋之 PvuII-Eco47 DHAH 段及1β#1 TakaralS合组套a溶掖.充分混合後加入B 溶掖再於16*C反應2小時後，以本溶液將大颺榫《Η丨101 齠株轉形並平鋪於LB洋菜培養基上（含50# g/nl安比西 林及1.596洋菜）得到《落·由所得《落中鐮邇載有目的 質觴（PBAX20)之豳瑶並培餐於2〇〇·1 2YT掖鼸培餐基（含 100# g/il安比西林}並以SDS-鍊性法製備霣讎DNA· 例 2 倒囊胞豳6301之株轉形 將細胞於100»1BG-11掖齷培餐基中培餐1至5天後以 8000rp·速度5分鐮離心牧集細酶，懸浮於10111新鮮液 «培餐基（108至108細胞/ ·1)*將毎一毫升細胞戀浮 掖倒入聚乙二烯管（Falcon 2059}中·将由例1 ®得之 質體DNA加毎一管中（以1# g*度加入（PBAS18為10# g) 。分別以鋁》紙包裹管子，於30*0»夜培餐.除去«β 紙後於30*C以光照（10 0 0- 2000勒克斯）培餐之· 5倍裼 釋該懸浮掖（加入P B A S 1 8者不稀釋} •以1 〇 〇〜5 0 0// 1之 量平鋪於BG-11洋菜培餐基中（含1// g/«l安比西林及1·Η 硫代硫醆納及1.5%洋菜）·培餐平板於2000-3000勒克 斯光照下4至10日。 使用本發明質_畤所得_«_形鳞率為1〇~3至ΙΟ—4 -1 5- 本紙張尺度边用中SS家楳>Μ〇ί5)Ή^^(210χ:!97公及） 装- Τ» ---^ 線- M濟部屮央標準L消作合作杜卬¾ 81. 2. 20,000 -.^ ' s 4 Α6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ ) f 補充 細 胞 / U g質髖DHA ， 約為使用 PBAS質體 時（1 0' 7細胞 / U g質體DNA)之1 000倍。 例 3 PBAS10 (約 10 .1 k b )之做成 例 1 - (3) 所 分離 精 製之pBA 1 ( Ba mH I 切割 ) DNA兩終 端 > 以 Ta k a r a B 1 a n t i n g kit 平 滑 終 端 化° 於 所得之平 滑 终 端 化 DNA 4 0 n g ( 2 u \)與 P v u I I- Ec 〇47 I I I Η段之 DNA 200η g (4 u 1 ) 中 ，加入4 8 w 1之T a k a r a L ί g a t i ο η k i t A 液 t 並 充分 攪 拌後，加 入 6 u 1 B液， 於 161C下培 餐 4 小 時 O 使 用此 溶 液，轉形 大 腸 桿 菌 HB101 ，並塗覆 於LB洋菜培養基（ 含 5 0 w g / m 1安 比 西 林 ，1 . 5 %洋菜） ， 取 得 選 殖 株 0由 所 得之遘51 株 > 製 備 質體 > 並由分析 其 限 制 酶 輿 圖 ，筛 選 保持有目 的 質 體 PBAS10之選殖株。 將 篩 m 之 m 殖 株， 於 45ml 之 2YT 液 體 培 養基 ( 含 100 M g/ m 1安 比 西 林 ) 中培 養 ，並以SDS- 鹸 性 法 調製 質 體 DNA ° 例 4 A . η id υ 1 a η S R2株的轉形 於 100 m 1之 BG - I I 液體培養基 中 培 養 1-5 天 之細胞， 以 80 00 Γ P nt離心5分鐘收集， 並懸浮於1 0 m 1之新鮮液髖 培 養 基 中 ( 10 β -1 09 細胞/ 毫升） C >將此細胞懸浮液 各 1 m 1分 注 於 聚丙 烯 管（Fa 1 con 2059) 中 並於管中 加 入 例 1 製 得 之質髏DNA 0 . 5 u g ( PBAS18為 1 . 0 /Li g )濃 度 〇 分 別 以 鋁 鉑紙 包 裹管子* 於 30它 下 培餐 1 晚後•除 去 鋁 鉑 紙 於 光照 射 下 （1 0 0 0〜 2 00 0勒克斯 ) ，於 30t： 下 再 培 餐 6 小 時〇 5 倍稀釋該細 胞 懸 浮 液（ 加 入 PBAS1 8 -1 6 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲4(2丨(以297公釐）80.5.20,00〇張（出 •裝. 訂· _線· A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -/，，，’〜 ηΛ五、發明説明（） 修庀 衣年月日補充 者不稀釋）> 各1 0〜5 0 /1塗覆於B G - I I洋菜培養基 上（含1 wg/ml安比西林，1 mM硫代硫酸納，1.5 %洋 菜）。此些平板於光照射下（2000〜3000勒克斯）培餐 4 * 1 0 天。 如此所得之選殖株的轉形率，於使用本發明質髏時為 104〜10s細胞/ wg質體DNA ，成功地逹成於使用質 體PBAS18時（102細胞/Wg質體DHA)之約1000倍的效 率° 例 5 Anabaena variabilis IAM M205株之轉形 於Anabaena variabilis IAM M205細胞中之質體導入 ，為使用基因導入裝置GTE-10 (島津製作所社裝）進行 電穿孔作用。將於100ml BG-1培養基中培養至對數增殖 期之細胞，以10000rpm離心10分鐘收集，以1 mM Hepes-NaOH(pH7.2)清洗 2 次後，於 1 mM Hepes-HaOH(pH7.2) 中以10s細胞/ ml (O.D.730 = 3)懸浮。於腔室（chamber) 中加人50〜100W 1之細胞懸浮液及質體DNA溶液（25〜 30^/8),於濃縮器容量1“尸及3^卩中，各以2.3〜2.71115 與8.1〜8.3ms時定數之電氣條件，分別設定6〜8KV/cin之 電場強度，進行脈衝（pulse)。將印加有脈衝之細胞， 立即移至新培養基中，並於1〜2日光照射下培養。將 此細胞懸浮液塗覆於0.5〜1 /ig/ml安比西林BG-11洋菜 培餐基中。此些平板於光照射下培養4~10天。_ -17- 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) ................................................i...........................^...........................¥(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ο Α6 Β 6 五、發明説明（） 結果，於具有本發明質體PBAX18時，可轉形10細胞/ w s質體DNA。 工業上之利用性 本發明質髏可以大腸桿菌大置製備，且可於大腸桿菌 及藍緣菌中複製，並可作為於Μ綠菌中表現許多各種結 播基因之往返載體。 ................................................i...........................玎...........................緣 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印敗 18 Ψ 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H)

Claims (1)

1. A7 B7 C7 D7 鳗濟部中央標準局8工消費合作钍印发 lTfl01714號「新穎質醱之製法」專利案 (82年8月31日修正） A申請專利範圍： 1. 一種製備可於大腸桿菌、Anacystis nidulans或 Anabena variabilis中後製之往返載S3質鼸之方法 ，其待激為将侧囊胞菌6301衍生之内生質體pBAI 複製起始區（OriA區）外之部分儘量縮小做為一基 部，其中OriA區為含OriA區之DHA Η段，且當其由 質體pBAI切出時大小為2.8至8.0kb，且同時與含大 腸捍菌Col.Ei質醱複製起始區（OriE區）且其中 由γορ匾定義之基因已去除之DHAH段結合，並再結 合多重遘殖區，其次將所得之質醱轉形至大腸桿菌 ，Anacystis nidulans或 Anabena variabilis宿主 細胞中，將所得之轉形株培養於選擇培養基中並由 所得之菌落中筛選出帶有所欲質體之菌落。 之如申請專利範圍第1項之製法，其中OriE區（c)為 含OriE區且其中由rop區定義之基因已去除之DHAJH 段，且當其由質體PBR322切出時大小為1.5-4.lkb。 3.如申誚專利範圍第1項至第2項任一項之製法，其 中該含OriE之DNA Η段再含一安比西林抗藥基因 (A m pr ) 〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -丨裝· 訂 竦- 本紙张尺度適用中®國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 修正 82· 7. 2 I 本年月曰 I補充__ 第81101714號專利案本案載體於外源基因之表現實例 中文本 I表現調節區之製備（1-1) PANE 18之選殖 40ng(lw ΠρΑΝΕ 18(K.Shinozaki et.al.,Proc.Nath. Acad.Sw.USA 80:4050-4054(1983))〔其中於 pBR 322之 EcoRI址，已插人5,600bp段，其中含有Anacystis nidulans 6301之核薛糖-1,5 -二礎酸錢基酶/氧化酶之 起動子區者〕加入100//1之501!^經〇6丨15處理的大腸桿 菌HB101種条之細胞懸浮液，將混合物溫和混合。混合 物於冰水中培育30分鐘，又於42亡培育3分鐘，而將DNA 攝取入細胞内。於此懸浮液内加入lml LB培養基（10g/l 巴克多胰蛋白臃，5g/l酵回抽取物，10g/l NaCl), 於37t進行振搖培育1小時。取100/i 1及200w 1此細胞 懸浮液，接種至LB瓊脂培餐基（含50w g/ml安比西林及 1.5%瓊脂）上。此平板於37它培育24小時，然後，分離 所生成之菌落。 分離得之菌落以白金環接種入2ml 2YT液態培餐基（含 16g/l巴克多胰蛋白臃，10g/l酵母抽取物，5g/l NaCl ，及50wg/ml安比西林）内，及於37T：培育隔夜。取lml 培餐物，加至200ral 2YT液態培餐基（含100Ug/ml安比 西林）内，及於371C培餐隔夜。培餐細胞經由於8,000rpra 離心10分鐘收集，依SD-鹼方法（B.Perbal,A.分子選殖 之實用指南，273至276頁，約翰威利父子公司出販）， 由培餐細胞大量製備質醱DNA。 (1-2) Sac I-Sph I段之分離 (參照第1圖） 於依本朵夫管（容積1.5ml)内，將無菌水加至大量製 備的 10wl(10wg)pANE 18DHA, 10«1 之 10XL〇w 缓衝液 (100nM Tris-HC1(PH 7.5)，100nM MgCU , 10ΠΜ 二硫 赤絲醇（DTT))及50單位SacI(寶酒造公司生産）内，令總 體積為100//1,混合物於37C反應3小時。反應後，加 入 15w 1 之 10XHigh缓衝液（500πιΜ Tris-HCl(pH 7.5), 100mM MgC12 , 10mM DTT, 1 08mM NaC 1) , 50單位 SphI (寶酒造公司生産）及30W 1無菌水；又於37υ反應3小. 時。反應後，加入1/10容積之3Μ乙酸鈉（pH 4.8)及2.5 容積乙醇，混合物就此於-2 01：放置2小時或2小時以 上。於15,000rPni及4¾藉離心10分鐘收集所生成的沈 澱，以70%乙醇洗滌，及減壓乾燥。殘渣溶于50W1 TE (10mM Tris-HC1(PH 8.0)， lmM EDTA)内，加入 1/10倍 體積之電泳標記（0.25%溴酚藍，0.2 5%二甲苯氰醇， 30%甘油），混合物置1 , 5%瓊脂糖上，於50V使用TAE 缓衝液（40niM Tris -乙酸鹽，2mM EDTA)霄泳1.5小時。 電泳後，凝謬浸於0 . 5 u g / m 1 e t h i d ί u in溴溶液（於T A E ) 15分鑪，俾進行DNA之染色。染色後的凝膠置於轉發光 醴上，照射紫外光，切下含期望的DHA之帶。期望的DNA 段（約 l,200bp)使用 DNA純化套件 Geneclean(BIO 101 公 司製造）純化。 (1-3)於 pUC 18選殖 SacI-SphI 段 (1) SacI-SphI 切開 pUC 18 於依本朵夫管（容積1.5ml)内，無菌水加至1(10 A/g)pUC 18 DHA, 5W1 10XLow 緩衝液及 50 單位 SacI, 將總體積調至50m 1;混合物於37C反應3小時。反應 後，加入7.5//110父11丨8}1缓衝液，50單位5?^及37.5 w 1無菌水，反應又於37亡持纊3小時。酚：氣仿：異 戊醇（25: 24:1 )以等體積加至反應溶液，混合物經強力 攪拌，及於1 5 , 0 0 0 r p m及4 t離心4小時，取出水層。於 此水層内加入1/ 10倍體積之3M乙酸鈉（pH4.8)及2.5倍 體積乙醇，俾藉乙醇沈澱DNA。於15,000rpni及及4T離 心10分鐘，收集沈澱，以70%乙醇洗滌，及減壓乾燥。 殘渣溶於20/zl TE,用於如下實驗。 (2) 插人 Sacl-S^phl 段（1.200bp)至 pUC 18(SacI-SphI) 25wl Takara DNA接合套件A液（寶酒造公司生産）加 至 0.1« g(2/i l)SacI-SphI 段 DNA 及 0.5μ g(lu 1)pUC 18 (SacI-SphI),谢以充分攪拌。此溶液内加入3wl Takara DNA接合套件B液，混合物經充分攢拌，及於16C培育1 小時。反應後，此溶液用以轉形大腸桿_ J Μ 1 0 9。 (3) 大置製備pARup 18 -3- 於5 w I U 0 0 w s )接合i容液内，加入1 0 0 W 1經以C a C 1 2 處理的大腸捍菌J M 1 0 9之細胞懸浮液，繼以溫和混合。 混合物於冰水中培育3 0分鐘，然後於4 2 TC培育2分鐘， 而使細胞將DNA攝入其中。lml 2YT液態培養基加至此懸 浮液内，於37¾振搖培育1小時。取100以1及200w 1此 細胞懸浮液，接種於2YT瓊脂培養基（含50wg/inl安比 西林，40wg/l 5 -溴-4 -氛-3 -吲哚基- /3-D -硫基半乳 糖苷（X-gal), 23.83rag/ 1異丙基-/3 -D -硫基乳糖顋喃 糖蒈（IPTG)及1.5%琪脂）上。此平板於371C培育24小時 ，所得白色薗落打點於新製2YT瓊脂培養基（含50wg/ ml安比西林，X-gal, IPTG及1.5%瓊脂）上，於371C培 育隔夜，分離白色菌落。 分離得之白色菌落使用白金璟接種入2ral 2ΥΤ液態培 養基（含50Wg/ral安比西林），於3710培育隔夜。取lml 培養液.移人1.5ml依本朵夫管内，於15,000rpni離心30 秒，俾收集細胞。收集得之細朐懸浮於150/i 1SET缓衝 液（20% 蔗糖，50mM TiMs-HC1(pH 7.6), 50mM EDTA)内 ，加人5w 1 RNase溶液（10mg/ral核糖核酸酶A, 0.1M乙 酸納（P Η 4 . 8 ) , 0 . 3 m Μ E D T A ),混合物藉渦旋混合機充 分搜拌。於其中加入350// 1之溶解液（USDS, 0.2N NaOH ),藉將営倒置，溫和攪拌混合物，使其完金溶解。所 得溶解液於冰水中培育10分鐘，加入250w 1 3M乙酸納 (pH 4.8),混合物經充分混合，然後躭此置於冰水中歴 30分鐘。此混合液於15,000rpra及離心10分鐘，俾沈 澱SD和染色體DNA。上清液移至另一根依本朵夫管，加 入等量異丙醇，混合物經充分混合，繼以於15,000rpra ,4 t離心7分鐘，呈沈澱收集質體D N A。沈澱溶於無菌 水，部分溶液使用限剪内核酸酶EcoRI及Hind III(二者 皆由寶酒造公司生産）進行切開。切開産物接受1 . 5%瓊 脂糖膠電泳，俾證實l,200bP SacI-SphI段插入pUC 18。 已證實S a c I - S p h I段已插人p U C 1 8之薗落，移至4 0 0 m 1 2YT液態培養基（含100以g/πι丨安比西林），培育隔夜。 培育後細胞於8,000rpm及41C離心10分鐘回收，經由SDS-_方法大量製備質體DNA。 (1-4) EcoRI-Pst I段之分離（參考第1圖） (1) E c 〇 RI - H i n d I 11 段之分離 於依本朵夫管（容積1.5ml)内，將無菌水加至10« 1(10 wg)大量製備之pARup 18 DNA溶液，20W1 10Xk缓衝 液（200mM Tris-HCl(pH 8.5), 100mM MgCl2 , 100ibM DTT, l,000mM KC1)及 40 單位 Hindlll,將總體積調至 200 1。總計準備20根内含前述内容物之依本朵夫管，於 37TC持鑲反應3小時。反應後，以酚-氣仿處理混合物 ，藉乙醇沈澱收集D N A , i容于1 5 5 w 1無菌水。於此溶液 内，加入 40u I 5X EcoRI缓衝液（500mM Tris-HCl(pH7.5) ,35mM MgCl2 , 250mM NaCl, 35mM 2-氫硫基乙醇， 0.05%牛血淸白蛋白（BSA))及40單位EcoRI,而將總體 積調至2 0 0 W 1。於3 7 t：,於所得2 0根依本朵夫管（容積 1 . 5 m 1 )内分別反應3小時。反應後，反應混合物同樣接 受酚-氯仿處理及乙醇沈澱而回收DHA。期望的DNA段（約 l,200bp)藉1.5%瓊脂糖膠電泳分離，及使用DNA純化套 化套件Geneclean純化。 (2) EcoRI-Pst I段（約 350 bp)之分離 於依本朵夫管（容積1.5ml)内之40w g(86(w 1)純DNA 段内加入10w 1之10x High缓衝液及48單位Pstl(寶酒造 公司生産）而將總體積調至100w 1,於37C反應3小時。 反應後，進行1.5%瓊脂糖膠電泳，分離所需DNA段（約 350bp)。DNA自凝膠上電溶離，使用核酸純化卡匣Hensorb 20(杜邦公司生産）純化。 (1-5)Pst I-H ind I I I段之合成 (1)寡核苷酸之合成與純化 欲合成含Shine Dalgarn〇(S/D)序列之表現調節區， 使用DNA合成儀380A (日本應用生物糸統公司生産）藉磷 酸亞二酸法合成十寡核苷酸（參照第2圖）。合成完成後 ，以每15分鐘添加0.5ral之方式，總計加入2ml銨水（27% 或27%以上）至矽膠柱，由氣化矽載體上切下各寡核苷 酸，收集入小瓶。又將1 οι 1氛水加入此小瓶，小瓶利用 Μ及P a r a f ί 1 in等密封，於5 5 加熱8小時或8小時以上 ,俾於基部去除保護基（醯基）。小瓶由恆溫浴中取出， 調整回室溫，移開蓋後，内容物減ffi濃縮至乾。乾燥後 ，殘渣于200wl 0.01M三乙胺-乙酸溶液（TEAA, pH 7.5) 然後，使用A Μ - 3 1 3 - 0 D S (山村化學研究室公司生産）進行 HPLC,以乙贈及0.1M TEAA濃度梯度溶離，由溶離分中 分段取出主峰。所得峰經減壓濃縮至乾，加入100 w 1 8 0 %乙酸（乙W溶液），將混合物混合，然後，就此於室 溫放置30分鐘俾去除5’端之二甲基三苯甲基（DMTr),及 將其轉成OH基。30分鐘後，將混合物快速濃縮至乾，殘 渣溶解於200/i 1之0.01M TEAAUH7.5)，加入等體積二 乙醚，藉抽取去除D Μ T r基。所得溶液經減壓濃縮至乾， 殘渣溶於110w 1之0.01M TEAA(pH7.5),再度藉製備性 HPLC純化。含寡核苜酸之溶離分經減壓濃縮，殘渣溶於 T E ,用於下述實驗。 (2) 以動素酶將合成的寡核驻酸磷酸化 各4wg純寡核苷酸分別與120W 1整分之動素酶缓衝液 (50mM Tr i s-HC 1 (pH7 . 6) , 10mM MgCU , 0.1mM EDTA, 5mM DTT, 0·1πιΜ 精眯，1.7«M ATP)混合，加入 9 單位 T+聚核苷酸動素酶（寶酒造公司産製），及於37t培育 15分鐘。然後，加入ATP至終濃度為lmM,再度加入9單 位聚核苷酸動素酶，及於371C培育25分鐘。反應後 ，混合物接受90t：之熱處理5分鐘，使SS失活。磷酸化 寡核苷酸使用核酸純化卡匣N e n s 〇「b 2 0純化。 (3) Pst Ι-Η ί nd I I 段之製備 經由使用T4 DNA接合W(參照第3 _),直接接合寡 st I -H Ud I I 1段 0 H C 1 ( p H 7 . 6 ) , ( 0 m M 苷酸（屬於組成各 較佳tie「股之5’端 I調為80jU 1。所生 時時間逐漸冷卻至 M A T P ,加入2 . 5單 於4 C培育1 5小時。 乙醇沈澱回收DNA而 考第4圖） Pstl-Hindlll段之 I-Pst I段，及各 0 . 5 I I段，分別與5 /i I 套件B液加至所得各 反應後，溶液經以 醇沈澱俾回收DNA。 應混合物 w 1之無閨水中。4 -H C 1 ( p Η 7 . 5 ) , 3 5 m Μ w I ) Η ί n d I I I 加至 核苷酸而製備具不同m鹼基數之4 p 20W 1 5X 接合缓衝液（250ΙΠΜ Tris-MgCla )及無菌水，加至1.5jug寡核 Pstl-Hind III段之寡核轻酸中位在 )及各lM g其充寡核苷酸，而將總體I 成之溶液於9 0 加熱5分鐘，以2小 4^C ；加入各 10w 1 100idM DTT 及 10Π1 位接合酶（寶酒造公司産製），及 反應溶液以等體積酚-氛仿處理，藉 用於後述實驗。 (1-6) EcoRI-Hind III 段之製備（參 (1) EcoRI-PstI段（起動子區）與各 直接接合 各份1.0W g如上（1-4)分離之EcoR w g具不同氮鹼基數的四Pstl-Hindl 之0.3M Nall混合。1簀酒造接合 溶液，於2 6 υ培育1或1以上小時。 酚-氯仿處理，及以習知方式進行乙 (2 )以Η ί n d I I I — E c 〇 R I切開接合反 回收的D N A殘渣個別溶於每分1 4 . 5 w 1 5xHindIII 缓衝液（50mM Tris MgCl2 , 300raM NaCl)及 12單位（1.5 各溶液内，反應於37C進行1.5小時。反醮後，又加入 4 μ 1 5 x E c o R I 缓衝液，1 2 單位（1 . 0 w 1 ) E c o R I 和 5 以 1 無 菌水，又於37t反應1.5小時。以等量酚-氛仿處理反應 溶液，然後，藉乙醇沈澱回收D N A。 (1-7)四具不同氦鹼基數之表現調節區EcoRI-Hindlll 段之選殖 (1)以 EcoRI-Hind III 切開 pUC 18 於依本朵夫管（容積1.5ml)内，將無菌水加至25/ug P U C 1 8 , 1 0 w 1 1 0 X k 缓衝液（2 0 0 m Μ T r i s - H C 1 ( p Η 8 . 5 ), 100inM MgC 1 a , 10mM DTT , 100mM KC1)和 64 單位 18/z 1 )Hind III,而將總體積調為100w 1,反應於37七進行 3小時。此反應溶液以等體積酚-氯仿處理，藉乙醇沈 澱回收DNA。DNA殘渣溶解於75m 1無菌水，加入20W 1 5XEcoRI缓衝液和60單位（5/u l)Ec〇RI,反應於37T進 行3小時。反應後，反應混合物同樣接受酚-氣仿處理 與乙醇沈澱。回收的DNA溶於TE至0.25/ig/w丨，用於 下述實驗。 (2)四表現調節區EcoRI-Hind III之插入pUC 18 (EcoRI-Hind III) 各 60以（1/^ 1)四 EcoRI-Hind III 段及各份 500ns(2w 1) P U C 1 8 ( E c o R I - H i n d I I I)分別置於依本朵夫管内，加入 每份24m 1寶酒造接合套件A液，紐以充分混合。又將每 份3« 1寶酒造接合套件B液加至混合後之溶液内；混合 後，於16C反應2小時或以上。此等溶液用於下述實驗。

   (3)大量製備口41^9 1,2,3及4 於各3 w 1 ( 5 6 n g )接合溶液内加人各份1 0 0 w 1之經以 C a C丨2處理之大腸捍薗 J Μ 1 0 9細胞懸浮液，繼以溫和 攪拌。混合後之溶液於冰水中培育30分鐘，又於421C培 育2分鐘，而使細胞將DNA攝入其中。於此懸浮液内加 入每份lml之2ΥΤ液態培養基，於37¾振搖培養 1小時後 ，混合物接種於整分2YT瓊脂培養基（含有50/ig/ml安 比西林，40rag/l X-gal, 23.83g/l IPTG 和 1.5% 瓊脂 )上。經由自所得白色菌落製備質體，及分析限剪内核酸 酶圖譜，分別篩檢擄帶有所需質體pARup 1,2,3及4之菌 落。 攜有質體pARup 1,2,3及4之個別菌落，於毎份200ml 之2YT液態培養基（含100 W g/ ml安比西林）内培育·，藉 SDS-驗方法大量製得個別質體DNA。 (I - 8 ) E c 〇 R I - H i n d I I I 段之分離 各20“8(20"〖）大量製備之質體〇“卜&1?1^1,2,3及 4)分別置依本朵夫管内，將每份20/i 1之10X k缓衝液， 每份120單位（15w UHindlll及無菌水加入其中，而將 總醱積調為200/z 1。對各質體準備6根此依本朵夫管。 於37¾培育3小時。反應後，反應混合物經酚-氮仿處理 ,葙乙醇沈澱收集DNA,及溶於每份150m 1無豳水。此 等DNA溶液内加入每份40wl之SxEcoRI级衝液，及每 份120單位（10« l)EcoRI,於37C培育3小時。反應後 -10- .5 %瓊脂 用核酸純 菌 JM 109 55 (K . 80:4050-約 1 500 bp 醛糖-1 , 5-]攢拌。混 卜鐘，而使 LB液態培 !於LB瓊脂 脂）上，分 w s/四環 至 2 0 w g ( X H i gh缓 ,_乙醇沈澱回收DNA。期望的各段DNA段藉1 糖醪電泳分離。分別由凝膠上電溶離D H A ,使 化卡@^115〇1^20純化（4!?1^1,2,3和4)。 II轉錄終結（终結子）區之製備（參照第5圖） (11-1)?冉以115 5之選殖 於100w 1之經以50mM CaCU處理的大腸桿 之細胞懸浮液内加入5 0 0 w g ( 0 . 5 w 1 ) p A N P 1 1 Shinozaki et.al. ,Proc.Hath.Acad.Sci.USA 4054(1983)),其中於 pBR 322之 Pst I址插入 之一段，内含 Anacystis nidulans 6301 之核 二磷酸羧基酶/氣化酶之終結子區，繼以溫和 合液於冰水中培育30分鐘，又於421C培育2女 細胞將DNA攝入其中。於此懸浮液内加入linl 養基，於37υ振搖培養1小時後，混合物接巷 培養基（内含：12.5wg/ml四環素及1.5%瓊 離所得菌落。 分離所得菌落於2.81 2YT液態培養基（含25 素）内培餐，藉SDS-鹸方法大置製備質體DNA。 (I 1-2) Eco52 I-Pst I段之製備 (1) Pst I段之分離 於依本朵夫管（容積1.5π1)内，將無閨水加 2 0 w 1 )大量製備之 P A Ν Ρ 1 1 5 5 D N A , 2 0 w 1 1 0 衝液，及120單位U0wl>Pst I而將绝髖積調為200μ1 總計準備6根含前述内容物之依本朵夫管（容積1.5nl ),於各管内於3 71培育3小時。反應後，藉乙醇沈澱 回收DNA,然後，藉1.5%瓊脂糖膠電泳分離期望的DNA 段（約l,500bp)。分離得之DNA藉Geneclean純化，用於 下述實驗。 (2)以 Eco52I 切開 Pst I 段 於 6 4 , 5 w 1 (約 1 0 u g ) P s t I 段 D N A 溶液内，加入 7 . 5 w 1 1 0 X E c 〇 5 2 I 缓衝液（1 0 0 m Μ T r i s - H C 1 ( p Η 9 . 0 ) , 3 0 πι Μ M g C 1 2 ,1,000πιΜ HaCl, 0.1%BSA),及 18單位（3wl)Eco52I (Toyob 〇公司産製），於37 C培育3小時。培育後，混合 物接受酚-氱仿處理，及乙醇沈澱，及回收沈澱的DNA。 回收得之DNA溶于8w 1無菌水。 (I 1-3) pARut 13之生成 (1) Eco52I-Pst I 段之鈍化 lwl DHA鈍化套件（賫酒造公司産製）X10缓衝液加 至II-2製備之8W1 Ec〇52I-PstI段DNA溶液内，於70t 培育5分鐘後，混合物移至37C恆溫浴。於DNA鈍化套 件内，於此溶液内加入1 w 1 T + D Ν Α聚合SS ,混合物皆 滴液溫和混合，及於3 7 TC反應混合物5分鐘。反應後， 於DNA鈍化套件内，於此溶液内加入40jul DNA稀缓衝液 ，混合物皆渦旋強力«拌而使酶失活。 (2 )以S in a I切W p U C 1 3及去8S酸化作用 於 20m g(20/i 1 ) pUC 13 DHA 内力 Π 入 40/i 1 5 x S m a I ifg -12- 衝液（50mM Tris-HC1(PH8.0), 35mM MgCU , 100mM KCl ,35mM 2 -氫硫基乙醇，0.05%BSA), 80 單位（lewDSmal (寶酒造公司産製），及130α 1無菌水，繼以於30TC反應 4小時。反應後，反應混合物以酚-氣仿處理及接受乙 醇沈澱，回收DNA。回收得之DNA溶于100/il 0.1roM Tris -H C 1 ( p Η 8 . 0 ),加入1 0 W 1鹼性磷酸酶溶液（1 . 0單位鹼性 磷酸酶（AP,賫酒造公司産製），10niM Tris-HCl(pH 7.5) ，50mM NaCl, ΙπιΜ ZnS〇4 ),於 371C 反應 2 小時。反應 後又加入10 Μ 1_性磷酸酶溶液，繼以於65ΊΟ培育30分 鐘。反應溶液經以酚-氱仿處理，DHA經以乙醇沈澱， 收集，及溶解於ΤΕ至0.5Wg//il。 、 (3 )鈍端段之插入p U C 1 3 ( S m a I , A P ) 32w 1賫酒造接合套件A液加至2w 1 (約100 ng)鈍端 段DHA溶液及2α l(1.0/ig)經鹼性磷酸酿處理的pUC 13 DNA溶液，繼以充分搜拌。於此溶液内加入1寶酒造 接合套件B液，經充分攢拌後，於1 6 1C培育1小時或以 上。反應後。此溶液用以轉形大賜桿菌JM 109。 (I I - 4 ) B a m Η I - E c 〇 R I 段之製備 (1)大蛋製備pARnt 13 於ly 1 (約40ng)接合溶液内加入100w丨經以50πιΜ CaCl2 處理之大賜桿KIJM109細胞懸浮液，谢以溫和混合。混合 後之溶液於冰水中培育30分鐘，曲以於42C培育2分鏞 ，而使細胞將DNA攝入其中。lml 2YT液態培餐基加至此 -13- 懸浮液内，於3 7 1C振搖培育1小時，懸浮液接種至2 Y T 瓊脂培餐基（含5 0 u s / m 1安比西林，4 0 ra g / 1 X - g a 1 , 23.83ng/l IPTG及1.5%瓊脂）上。由所得白色菌落製 得質體，分析其限剪内核酸酶圖譜，藉此篩檢擄有期望 的質體pARut 13之薗落。篩檢得之菌落於400ral 2YT液 態培養基（含100W g/m丨安比西林）内培養，藉SDS -鹼方 法製得大量質體DNA。 (2 ) B a m Η I - E c 〇 RI 段之分離 準備8依本朵夫管（容積1.5ml),於其中，於15Wg( 15w 1)大量製備之質體DHA(pARut 13)内加人20μ I 10X k缓衝液，120單位（10W l)BaraHI (寶酒造公司産製 )及無菌水而調成總體積200w 1。各管於301C培育3小 時。反應後，反應混合物以酚氛仿處理，藉乙醇沈澱收 集DNA,溶於各份110/z 1無菌水中。於此等DNA溶液内， 加入每份30/i 1 5x EcoRI缓衝液，及毎份120單位（10// 1) EcoRI,龃於371培育3小時。反應後，藉乙醇沈澱回 收DMA,藉1.5%瓊脂糖膠電泳分離期望的DHA段（約300 bp)。由凝膠上分別溶離出DNA。使用核酸純化卡匣 Nensorb 20純化。 I I Ih 操縱子之生成 (III-1)轉錄終結區與h基因之接合 (1)以 BaraHI-EcoRI 切開 pUC 13-h-SOD 於依本朵夫管内，於 10iUg(20wl), pUC 13-h-S0D( -14- 參照日本第210129/1989號特許申請案說明書例1)〔其 中於PUC 13之Hindlll-Bam HI址已插入编碼著人超氣化 物變異SS之股全長（475bP)DNA段〕，加人40wl 5X EcoRI缓衝液，120單位（10iil)EcoRI,及無菌水而調成 _ 2 9 _ 總體積200^1，於37t：培育3小時。反應後，反應混合 物以酚-氯仿處理，藉乙醇沈澱收集DHA鄉力及溶於215 Μ 1無菌水。此溶液内加入25u 1 10Xk缓衝液及100單 位（1 0 μ 1 ) B a ra Η I ,於3 0 υ反應3小時。反應後，使用 Geneclean純化 DNA〇 (2 )將轉錄終結區（B a m Η I - E c 〇 R I)插人 p U C 1 3 - h - S 0 D (BaniH I-EcoR I) 至 加 液 A 件 套 合 接 造 酒 寶 3 11 Η N D 及 1.後 將拌 0 攪 合分 混充 分經 充 ， 以 内 0 液 , 溶 區此 結至 終加 錄液 轉 B 0 之件鐘 備套分 製合‘ PO II接育 1)造培 W酒 υ 4 寶16 (01 於 sw 反應後，此溶液用以轉形大腸桿菌 J Μ 1 0 9。 (I I I - 2 ) H i n d I I I - E c 〇 R I ( h S 0 D -終結子）段之製備-U 1 ; (1)大悬製備 P U C 1 3 - h S 0 D t 於2 /i 1 (約7 0 n g )接合溶液内，加入1 0 0 w 1經以5 0 m Μ CaCU處理的大賜桿菌JM 109細胞懸浮液，缈以溫和混 合。混合溶液於冰水中培育3 0分鐘，然後於4 2亡培育2 分鑪，而使細胞攝入DNA。添加1 ml 2YT液態培餐基後 ,所得混合物於3 7 t：振搖培養1小時，然後接種至2 Υ Τ 瓊脂培養基（含有50Wg/ml安比西林，40mg/l X-sal ,23.83mg/l IPTG及1.5%瓊脂）上。由所得白色菌落 製備質體，攜有所需的DNA段之菌落，經由分析其限剪 内核酸SS圖譜進行篩檢。篩檢得之菌落於60ral 2YT液態 培養基（含100ϋ g/ml安比西林）内培養，藉SDS -鹼方法 製得質體D N A。 (2) Hindlll-EcoRI 段之分離 準備二依本朵夫管（容積1.5ml),其中於50W l(25Wg) 製妥的pUC 13-hSOD DNA溶液内加入20/il 10xk缓衝 液，120單位（15wl)HUd III及無菌水而調成總體積 200m 1。於各管内，於37¾培育3小時。反應後，反應 混合物以酚-氛仿處理，藉乙醇沈澱，收集DNA,及溶於 150^1整分之無菌水中。於此等DNA溶液内，加入每份 40w l 5xEcoRI緩衝液及毎份 120單位（10W l)EcoRI, 於37P培育3小時。反應後，葙乙醇沈澱回收DNA,藉 1.5%瓊脂糖膠電泳分離所需DNA段（約790bp)。使用 Geneclean純化 DNA。 (III-3) Hind III-EcoRI(hSOD-終結子）段與表現調 節區ARup 1,2,3及4之接合（參照第6圖） 準備依本朵夫管，其中，於各1.12/ig(2.1iul表現調 節區（冉1?1^1,2,3及4)及2.11«8(2.2//1)整分之}1丨以111 -EcoRI段内，分別加人每份4α 1之5X接合缓衝液（250raM -16- Tris-HCl(pH 7.6), 50mM MgCl2 ),每份 2w 1 100mM DTT ，每份2w 1 ATP,每份2.5單位（lw 1)T4 DNA接合酶（ 簀酒造公司産製）及無菌水，而調成總體積20u 1。於此 等管内於15勺培育隔夜。藉60T：熱處理10分鐘中止反應 。於此等溶液内加入每份10w 1之5xEcoRI缓衝液，及 分別加入每份12單位（lw 1)之EcoRI及無菌水而將總體 積調成50w 1。此等溶液於37¾培育3小時。反應後， 藉2%瓊脂糖膠電泳分離所需各段DNA(參照第7圖，各 約1200bp)及使用Geneclean純化。 (III-4)四 sHOD基因表現性DNA段之選殖 (1) EcoRI切開pUC 18及隨後之鹼性磷酸酶處理 於依本朵夫管内，於20wg(30wl)質體pUC 18 DNA内 加人40u 1之5X EcoRI缓衝液，添加120單位（10/z l)EcoRI 及無菌水而將總體積調為200w 1,及於37¾培育3小時。 反應後，反應混合物以酚氣仿處理，藉乙醇沈澱收集DHA ，溶於 108/z 1 之 0.1M Tris-HCIUH 8.0)内。10u 1 驗性 磷酸酶溶液加入此溶液内，及於3 7七培育1小時。反應 後，又加入1 0 w 1鹼性礎酸酶溶液，於6 5 1C培育3 0分鐘 。反應溶液以酚-氯仿處理，藉乙醇沈澱收集DNA,及溶 於 ΤΕ至 0.16w g/ ml0 (2) hSOD操縱子段插人pUC 18(經EcoRI及Ap處理） 每份24wl之寶酒造接合套件A液分別加至各100ng(l w l)hS0D操縱子（起動子-SOD-終結子1,2,3及4)〇^及320 -17- ng(2u 1)整分之經EcoRI及1¾性磷酸SS處理之pUC 18DNA ,繼以充分攪拌。每份1之簀酒造接合套件B液加至 此等溶液内，經充分攪拌後，於1 t：培育隔夜。 (3) 大量製備？1)(：18-1?1^1-1^00 1,2,3及4 於各4 w 1 (約5 0 n g )接合溶液内加入毎份2 0 0 w 1之經以 50mMCaCl2處理之大腸桿菌 JM 109種糸細胞懸浮液， 繼以溫和攪拌。此等混合液於冰水中培育30分鐘，又於 42 =培育2分鐘，使細胞將DNA攝入其中。每份1Π1之2YT 液態培養基加至此等懸浮液，經於37C振搖培養1小時 後，混合物接種於部分於部分2YT瓊脂培養基（含50y g/ ml 安比西林，40ng/ral X-gal, 23.83ml/l IPTG 及 1.5 瓊脂）上。由所得白色菌落製備質體，藉分析其限剪内 核酸酶圖譜而分別篩檢攜帶有期望的個別質體（PUC 18-Rupt-hSOD 1,2,3及4)之0落。篩檢得之各菌落於每份 200ral之2YT液態培養基（含100W g/ml安比西林）内培養 ，藉S D S -鹼方法大量製備各質體D N A。 (4) EcoR I段（約 1 200bp)之分離 對毎種質體準備三根依本朵夫管，於各管内將毎份40 w 1之5X EcoRI缓衝液，每份120單位（10w l)EcoRI及毎 份130w 1無菌水，加至各約20/zg(20/i 1)大董製備之質 體（？1](：18-1?1^1:^500 1,2,3及4)〇於此等管内，於37 = 培育3小時。反應後，箱乙酵沈澱收集DNA,及對各K 體溶於每份100w 1 TE。藉1.5%瓚脂糖膠爾泳分離期望 的値別D N A段（約1 , 2 0 0 b P )及使用G e n e c 1 e a n純化。 (IV)hSOD基因表現媒介之選殖 ' (1 )以E c o R I切開p B A X 1 8及隨後之鹼性磷酸SS ( A P )處理 準備兩根依本朵夫管，其中於10wg(20w 1>pBAX18 DHA 内加入40w 1之5XEcoRI缓衝液，120單位（10W l)EcoRI 及130/i 1無菌水而調成總體積200w 1。各管内於37^0培 育小時，藉Geneclean純化DNA及溶于100wl之0.1M T r i s - H C 1 ( p Η 8 . 0 )。將1 0 w 1鹼性磷酸酶溶液加至此溶液 ,於3 7 t培育1小時，又加入10 w 1鹼性磷酸酶溶液後， 於65¾培育30分鐘。反應後，反應混合物以酚-氣仿處 理，及藉乙醇沈澱回收DNA。 (2) hSOD操縱子與PBAX18 (EcoRI, AP處理）之接合，大 置製備 每份0.5« g(0.1w 1)之經以EcoRI及AP處理之PBAX18 分別加至各0.25/i g(lw 1)之如上U -4)所製之四hSOD操 縱子（約1.2kbp),使用寶酒造接合套件進行接合。大腸 桿菌Η B 1 0 1種糸分別使用此等接合溶液轉形，個別含轉形 體之液體接種於LB瓊脂培餐基（含50/i g/ml安比西林） 上而得菌落。由所得菌落製備質體，藉分析其限剪内核 酸酶圖譜，篩檢攜有期望的個別質體（PBAXS0D6, PBAXS0D7 PBAXS0D8, PBAXS0D9, PBAXS0D6-4, PBAXS0D7-4.及 PBAXS0D8-4)2®^。篩檢得之個別菌落於每份50ml之 LB液態培養基（含100W 8/ra丨安比西林）内培餐，藉SDS- 鹺方法製備質體DNA。 V 使用藍綠溪 Anacystis nidulans 6301 及 R2 表現 hSOD 基因 (V-l) A.nidulans 6301(Synechcoccus PCC 6301)及 R2 (Synechococcus PCC 7942)之轉形 已於每份100ml之BG-11液態培養基内培養1至5目的 値別細胞，經由以8 , 0 0 0 r p m離心5分鐘收集，及愍浮於 毎份10ml之新製液態培養基（10a -103細胞/ ml)内。 各lral細胞懸浮液倒入聚乙烯管（Falcon 2059)内，製得 之質體DNA分別以0.1至10Wg濃度置於管内。製妥之管 分別覆以鋁箔，於30t：培育隔夜後，移開鋁箔，然後， 於30¾於光照下又培育6小時（光源：冷白營光燈； 1,000-2,000勒克司）。取各100至500/i 1之細胞懸浮液 ,接種於BG-11瓊脂培養基（含有liaM硫代硫酸納，1至 5/ug/ml安比西林，及1.5%瓊脂）。平板於光照下培養 4至10日（光源：冷白螢光燈；2,000-3 ,000勒克司）。 (V-2)培養 所得菌落移至每份2ml之BG-11液態培養基（含10// g/ m 1安比西林）及於光照下培餐1 0日（光源：冷白營光燈； 2,000台3,000勒克司）。然後，培餐醪移至每份100ml之 BG-11液態培餐基（含10m s/ml安比西林），於光照下培 養20日（2,000-3,000勒克司）。取各10ml培餐醪，分別 移至毎份100m丨之BG-11液態培餐基（含50α s/ral安比西 -20 - 林），及於光照下培育20日。經由於8,000rpn及離心 10分鐘而收集各細胞，再度懸浮於ImM Hepes缓衝液（pH 7 . 0 )内，藉離心洗滌。洗滌後，個別細胞儲存於-2 0 1C 至用於實驗為止。 (V - 3 ) h S 0 D之檢測 (1 ) h S 0 D活度染漬 使用經由以核糖黃素進行光聚合法，所製得之丙烯醯 胺膠進行電泳（蛋白質，核酸與酵素11:744(1966))。電 泳後，凝膠以50mM璘酸鉀（pH 7.8)-0.5mM EDTA洗二至 三次（5分鐘），然後浸於硝藍四唑錄（NBT)溶液（2.5mM NBT, 50mM磷酸鉀，0.5mM EDTA,pH7.8)内 7 分鐘。随後 ，凝膠浸於核糖黃素溶液（100X/M核糖黃素，30mM四甲 基乙饍二胺，50mM磷酸鉀，0.5raM EDTA, pH 7.8),於 白光中染漬至膠中出現對比為止。結果示於第9圖。此 圖中，具SOD活性之部分未經染漬，而其它部分染成紫 色。由此可知，除Anacystis nidulans本身具有的Fe-S 0 D活度外，於轉形體檢得h S 0 D活度。 (2 )以抗-人-S 0 D抗體進行檢測 (2 - 1 )西方吸漬 於還原態及Laemmli等人（自然237,680(1970))之條 件下，使用20% SDS-聚丙烯醛胺膠進行®泳。電泳後， 凝膠内之蛋白質_電鞞移至硝基纖維素膜（Amashai«公司 産製.Hybond(C))上。膜浸沒於含0.3%H2 02之50% 甲醇内20分鐘，使内生性過氧化酶失活，然後，於371 浸於 TBS〔（20niM T「is-HCl, 0.9%NaCl, PH7.4)含 5% 脱 脂乳及0 . 1 % T w e e η 2 0 (封阻）〕内2小時。膜接受封阻 處理，以洗滌液（含0.05%Tween 20之TBS)洗5分鐘， 繼以於371C於含1/ 1000抗-人-SOD抗體（caprine IgG, Binding Site公司産製）及0.1% Tween 20之TBS内培育 2小時。膜以洗滌液洗20分鐘（5分鐘X5);然後，以含 10mg 二胺聯苯胺（DAB)及 15W 1 32%H2 02 0.1M Tris -H C 1 ( ρ Η 7 . 4 ) 4 0 in 1 染漬。 結果，於線上檢知染成褐色的一帶，此處係由轉形體 所得抽取物被電泳之處，也是標準樣品hSOD(Sigi»a公司 生産的同一位置（第10圖）。 (2-2) Ouchterlony方法（免疫學實驗指南，74-77頁， Gakkai Shuppan 中心出販） 1 . 2 %瓊脂糖膠溶液（含有1 0 m Μ磷酸鹽缓衝液（ρ Η 7 . 2 ),0.15Μ NaCl,及 0.1%HaN3 )於培養皿（Falcon 1029 )内固化至厚2至3 mm,於適當位置打孔。10 w 1抗-人-S 0 D抗體置於中心孔，而轉形體油取物（各1 0 w 1 ), A . nidulans R2 (非轉形體）抽取物（40/nl)作對照，及標 準樣品hSOD分別置周圍各孔内，於4¾培育隔夜。培育 後，由培養皿中取出瓊脂平板，浸於PBS(10mM磷酸鹽缓 衝液，pH 7.2, 0.15M NaCl),箱此充分去除蛋白質（PBS 置換數次，2至3日）。此板浸於0.5%醯胺黑溶液（90ml -22 - Γ*· 甲醇，1 0 m丨冰醋酸）内染潰。結構顯示抗-人-$00抗體與 標準樣品hSOD間，及抗-人-SOD抗體與轉形體抽取物（6-4 ,8 - 4 )間生成沈澱線。又復，出現沈澱線組合成單一線 (3形），因而證實於轉形體内生成與標準樣品hSOD相同 的抗原（人-SOD)(第11圖）。 (3) h-SOD活度之檢測 雖然 Anacystis nidulans有生産 SOD(Fe-SOD),但可 利用其被lmM KCN抑制之差異，測量hS0D(Cu Zn-SOD)與 内生性SOD(Fe-SOD)之活度區別。光學試管（lnil)内放置 52raM磷酸鉀（pH7.8), 0.1mM EDTA, 0.1mM黃嘌昤，10WM 細胞色素C(馬心III型，SUraa公司産製）及樣品（SOD), 將總體積調為980/z 1。將20// 1之黃嘌昤氧化SS (Boehringer -Mannheim公司出品）加至其中，起始反應，隨著於550 mm之吸全蒺_始速率（30至60秒）之加快，測定細胞色素 C之還原，此值以u表示。未添加SOD樣品時，細胞色 素C之還原速率表示為v 。於此等條件下，SOD抑制50% 細胞色素C之還原定為1/3單位，由（ν/υ-1)測定樣 品内的總單位數（植物酵素-蛋白研究方法，3 7 3頁， Koji Asada, Kyoritsu出版公司）。愎次，.將 100mM KC1 (1 0 w丨）加至已測定y之反應溶液，測定細胞色素C通 原速率 ι/'及單位數（v/v'-l)〇 測定 Anacystis nidulans 細胞内生成的h S 0 D ( ( v· 1 ) - v / υ - 1 ))之活度。 結果，得自轉形體之粗製油取物之比活度（毎1 A280 -23- 213^)«^·· 單位之活度）顯示數值高0.7至12單位/ A280(表1)。 表 1 r — — — 丁 — — — — 丁 — — — — — — — — — I原始媒丨表現媒介丨hSOD表現量（比活度，| I介質體丨 丨單位/ A280) | ·_ι ιι I j·» — I .-bpv apJ 1 PBAX0D6 1 7.18 PBAX18 1 PBAX0D7 I 9.98 1 PBAX0D8 1 11.79 1 PBAX0D9 1 6.78 L__ 一丄一 一一一丄一________ J -24-