KR100497204B1 - 유산균으로부터 분리된 신규한 분비신호 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유산균으로부터 분리된 신규한 분비신호(secretion signal)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 분비신호를 포함하지 않는 알파-아밀라아제 유전자를 포함하는 분비신호 탐색용 셔틀벡터를 이용하여 유산균 염색체로부터 스크리닝한 신규한 분비신호에 관한 것이다.
본 발명의 분비신호는 재조합 단백질의 제조시 고효율로 목적 단백질을 세포 밖으로 분비시키는데 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 분비신호는 안정성이 확보된 균으로부터 분리된 것으로서 식품용 발현벡터에 사용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 유산균으로부터 분리된 신규한 분비신호(secretion signal)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 분비신호를 포함하지 않는 알파-아밀라아제 유전자를 포함하는 분비신호 탐색용 셔틀벡터를 이용하여 유산균 염색체로부터 스크리닝한 신규한 분비신호에 관한 것이다.
오늘날 미생물을 이용한 유용 단백질의 생산기술이 발달함에 따라 자연상태에서 미량으로 수득될 수밖에 없었던 유용한 의료용 단백질이나 산업용 효소 등의 대량 생산이 가능하게 되었다. 미생물을 이용한 유용 단백질의 생산은 숙주 미생물, 대상 유전자, 벡터, 선택 마커, 프로모터 및 분비신호 등과 같은 인자가 필수적으로 요구된다. 이 중에서, 분비신호는 미생물의 세포 내에서 생산된 단백질을 세포 밖으로 분비시키는 역할을 한다. 미생물을 이용한 재조합 단백질의 생산에 있어서, 합성된 유용 단백질을 주변 세포질(periplasmic space)이나 배양액으로 분비시키는 것은 여러 가지 장점이 있다. 과다 발현된 단백질이 세포질 내에서 불용성 응집체로 되기 전에 세포질 밖으로 분비시킴으로써 수용성의 활성 단백질로 만들어 낼 수 있으며, 세포질 내에 존재하는 단백질에 비해 세포질 밖으로 분비된 단백질을 분리 및 정제하는 과정이 더욱 용이하게 된다.
이로 인해, 최근에는 미생물에서 단백질 분비와 관련된 연구가 활발하게 수행되고 있다. 세균에서 단백질의 분비는 일반적으로 Sec-의존적인 수송에 의하여 이루어진다고 알려져 있다. 이러한 트랜스로케이션(translocation) 시스템은 단백질을 분비하기 위해서 페리페럴 멤브레인 단백질 SecA(peripheral membrane protein SecA), 인터그럴 멤브레인 단백질 SecE, SecY(integral membrane protein SecE, SecY) 유전자를 필요로 한다. 특히, 대장균에서 단백질을 분비하기 위해서는 SecY 유전자가 필수적으로 요구된다고 알려져 있다(W. M. De Vos et al., Genetics and Biotechnology of lactic acid bacteria, 52-103, 1994).
한편, 분비신호의 아미노산 서열은 보존 지역이 아주 낮은 것으로 알려져 있으나, 일반적으로 5∼8개의 양이온 측쇄를 가진 아미노산, 8∼15개의 극성 아미노산, 5∼8개의 시그널 펩티다아제에 의해 인식되고 절단되는 비극성 아미노산의 3가지 구별되는 도메인을 가지고 있다고 알려져 있다(G. von Heijine., J. Membr. Biol., 115, 195-201, 1990).
분비신호와 관련한 선행기술로는 대장균 및 효모에서의 분비신호가 많이 연구되어 있다. 미국특허 제5,919,654호에는 효모에서 분리된 분비신호 유전자가 개시된 바 있으며, 대한민국특허 등록번호 제283677호에는 대장균에서 분비되는 분비신호들의 공통적인 특징을 기초로 하여 새롭게 합성한 분비신호가 개시된 바 있다. 또한, 대한민국특허 공개번호 제2003-62854호에는 2종의 효모로부터 유래된 분비신호로 이루어진 복합분비신호를 포함하는 과립구-군체 자극인자를 고효율로 분비하는 분비형 벡터가 개시되어 있으며, 미국특허 제5,010,003호 및 미국특허 제5,013,652호에는 각각 효모용 분비신호로서 인버타제 분비신호 및 산 포스파타제 분비신호가 개시되어 있다.
한편, 미생물에서 분비되는 단백질은 각각 특정 분비신호를 가지고 있으나, 현재까지 알려진 분비신호들은 극히 일부분에 지나지 않다. 따라서, 미생물을 이용하여 외래 단백질을 보다 고효율로 생산하기 위해서는 단백질을 고효율로 분비하도록 하는 다양한 종류의 분비신호를 규명해야 할 필요가 절실하다.
한편, 지금까지 미생물을 이용한 유용 단백질의 생산은 주로 대장균을 이용한 의약품 생산에 치우쳐 왔다. 미생물을 이용하여 식품용 재조합 단백질을 생산하는 경우에는 의약품과는 달리 생산의 효율성보다 안전성을 최우선적으로 고려해야 한다. 따라서, 식품용 단백질을 생산하기 위해서는 유전자 조작을 위한 모든 요소가 안전성이 입증된 식품 미생물에서 유래된 "식품용"이어야 한다는 조건을 만족시켜야 한다.
유산균은 광범위한 식품에 이용되어 오면서 안전성이 입증된 GARS(Generally Recognized As Safe) 미생물로서 식품용으로 사용하기에 가장 적합한 균주라 할 수 있다. 유산균은 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존 등을 지니고 있어 유전자 도입을 위한 자체 벡터개발이 가능하고 당업계에 광범위하게 사용되는 전기충격 형질전환 방법에 의한 형질전환이 가능하며, 식품용 선택마커 유전자들도 확보되어 있기 때문이다. 또한, 유산균에서 외래 유용 단백질을 대량으로 발현시키기 위한 항시 고발현 프로모터(Jos M. B. M. van der Vossen et al., Appl. Environ. Microbial., 53, 2452-2457, 1987; Teija et al., App. Environ. Microbial., 57, 333-340, 1991) 및 조절가능한 프로모터(Pascalle et al., App. Environ. Microbial., 62, 3662-3667, 1996)가 연구되어 있다.
그러나, 유산균을 이용하여 유용 단백질을 생산하는데 있어서, 분비신호에 관련된 연구들은 미흡한 실정이다. 최근 들어, 미국 및 유럽에서 유산균을 이용한 라이브 백신 개발, 유용한 호르몬제의 장내 운반체에 대한 연구 및 이를 위한 효율적인 유전자원의 확보와 유산균용 삽입 벡터의 개발에 대한 연구가 시작되고 있다.
현재, 유산균에서 분리된 분비신호로는 락토코커스 락티스 Wg2, SK11, NCDO763 유래의 세린 프로테아제의 PrtP(Kok et al., Appl. Environ. Microbial., 55, 231-238, 1989; Vos et al., J. Biol. Chem., 264, 13579-23585, 1989; Kiwaki et al., Molec. Microbiol., 3, 359-369, 1989)와 NisP(van der Meer et al., J. Bacteriol., 175, 2578-2588, 1993), 락토코커스 락티스 MG1363의 Usp45(van Asseldonk et al., Mol. Gen. Genet., 240, 428-434, 1993), PrtM 및 NisZ(Pugsley, Microbiol. Rev., 57, 50-108, 1993)와 같은 5개의 단백질이 알려져 있을 뿐이다.
이에 본 발명자들은 유산균으로부터 신규한 분비신호를 분리하고자 연구하던 중 분비신호가 제거된 알파-아밀라아제를 포함하는 분비신호 탐색용 셔틀벡터를 이용하여 락토코커스 락티스의 염색체로부터 여러 종류의 신규한 분비신호를 분리함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 유산균으로부터 분리된 신규한 분비신호를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 분비신호를 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 분비신호를 포함하는 플라스미드 및 상기 플라스미드로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 방법으로 분리된 분비신호를 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 유산균으로부터 분리된 신규한 분비신호를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 분비신호를 코딩하는 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 분비신호를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 분비신호를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 분비신호를 코딩하는 핵산서열, 상기 분비신호에 의해 분비되는 외래 단백질을 코딩하는 핵산서열 및 상기 외래 단백질의 발현을 조절하는 프로모터를 벡터에 삽입시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환 시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 제조된 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 배양물로부터 외래 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 "분비신호(secretion signal)"란 세포 내에서 합성된 단백질을 세포 밖으로 수송한 후 시그날 펩티다제(signal peptidase)에 의해 잘려지게 되는 N-말단 서열(N-terminal sequence)을 말한다. 상기 분비신호는 리더서열(leader sequence), 신호서열(signal-sequence)이라고도 불리운다. 상기에서 단백질을 세포 밖으로 수송한다는 것은 주변 세포질(periplasmic space) 또는 배양액으로 분비시킨다는 의미이다.
본 발명자들은 새로운 분비신호를 탐색하기 위하여, 분비신호가 포함되지 않는 알파-아밀라아제 유전자를 포함하는 분비신호 탐색용 셔틀벡터를 사용하였다. 상기 셔틀벡터는 도 1에 나타낸 바와 같은 개열지도를 가지며, 그람음성균 및 그람양성균의 복제원점인 pWV01 복제원점, 에리스로마이신 저항성 유전자(Emr), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)로부터 클로닝된 분비신호가 포함되지 않은 알파-아밀라아제 유전자(서열번호 1) 및 대장균 및 유산균용 항시발현 P32 프로모터를 포함한다. 상기 셔틀벡터로 형질전환된 대장균 MC1061/pGS40은 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 2003년 9월 4일자로 기탁번호 KCTC 10517BP로서 기탁되어 있다.
상기 셔틀벡터 pGS40은 알파-아밀라아제 유전자 앞부분에 분비신호 활성을 가지는 단편이 삽입되게 되면 세포 내에서 합성된 아밀라아제를 세포 밖으로 분비하는 특성을 가지고 있다. 따라서, 상기 세포 밖으로 분비된 아밀라아제는 요오드 염색법을 이용하여 표현형으로 용이하게 식별할 수 있다. 즉, 아밀라아제는 전분을 글루코오스로 가수분해하는 효소이므로 본 발명의 분비신호 탐색용 셔틀벡터로 형질전환된 세포를 전분을 포함한 고체배지에서 배양한 후 요오드 염색하여 자주색으로 염색되지 않은 경우 아밀라아제 효소가 세포 밖으로 분비되어 전분을 글루코오스로 가수분해했음을 확인할 수 있으며, 자주색으로 염색된 경우에는 아밀라아제 효소가 세포 밖으로 분비되지 않은 것으로 판정할 수 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 원리를 기초로 하여 분비신호를 탐색하고자 하는 염색체를 제한효소 PstI으로 랜덤하게 절단하여 분비신호 후보 단편을 수득한 다음 상기 분비신호 후보 단편을 본 발명의 셔틀벡터의 동일한 제한효소 사이트에 삽입하고 이를 이용하여 숙주세포를 형질전환시켰다. 상기 형질전환체를 전분 및 항생제가 포함된 고체배지에서 배양한 다음 요오드 염색하여 분비신호 후보 단편의 아밀라아제 분비능을 측정하였다. 상기 아밀라아제 분비능은 요오드 염색한 결과 자주색으로 염색되면 아밀라아제가 세포 밖으로 분비되지 않은 것으로 판정하였고, 자주색으로 염색되지 않고 환을 형성하는 경우 아밀라아제가 세포 밖으로 분비된 것으로 판정하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 방법에 따라 유산균인 락토코커스 락티스 LM0230의 염색체로부터 6종류의 분비신호를 스크리닝하였다. 즉, 상기 락토코커스 락티스 LM0230의 염색체를 PstI으로 랜덤하게 절단하여 분비신호 후보 단편을 수득한 다음 이를 본 발명에 따른 셔틀벡터의 동일한 제한효소 사이트에 삽입하고, 이를 대장균에 형질전환하였다. 상기 대장균 형질전환체를 가용성 전분과 에리스로마이신을 포함하는 고체배지에서 배양한 다음 요오드 용액을 첨가하여 환을 형성하는 6개의 형질전환체를 선별하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 형질전환체로부터 분비신호를 포함하는 플라스미드를 분리하여 pGS401, pGS402, pGS404, pGS405, pGS406 및 pGS407으로 명명하였다. 상기 플라스미드를 각각 제한효소 PstI으로 처리하여 분비신호 활성을 지닌 단편 S401, S402, S404, S405, S406 및 S407을 수득하였다(실시예 1 참조).
나아가, 본 발명자들은 상기에서 선별한 분비신호를 포함하는 플라스미드로 대장균을 형질전환 한 다음 상기 형질전환체를 배양하여 각 분비신호의 아밀라아제 분비능을 측정하였다. 즉, 상기 형질전환체의 총 분획 및 주변 세포질 분획을 각각 제조한 다음 공지의 방법으로 총 아밀라아제 효소 역가 및 주변 세포질 아밀라아제 효소 역가를 측정하고 상기 총 아밀라아제 효소 역가에 대한 주변 세포질 아밀라아제 효소 역가의 비율로부터 본 발명의 분비신호의 분비 효율을 계산하였다. 실험 결과, 분비신호 S405의 경우 아밀라아제 분비효율이 84%로 가장 높게 나타났다(실시예 2 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 분비신호를 포함한 플라스미드로 유산균을 형질전환 한 다음 각 분비신호의 유산균에서의 분비능을 조사하였다. 전분을 포함한 고체배지에서 유산균 형질전환체를 배양하고 요오드 염색한 결과, 상기 형질전환체 모두 환을 형성함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 분비신호는 유산균에서도 그 활성을 나타내어 아밀라아제 효소를 세포 밖으로 분비시키는 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 본 발명의 분비신호 중 S407의 경우 유산균에서 세포 밖으로 분비한 알파-아밀라아제 효소 활성이 73.7U/mg의 역가를 나타냈다(실시예 3 참조).
따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 유산균 염색체로부터 분리된 것으로서 세포 내에서 합성된 단백질을 세포 밖으로 분비하는 활성을 가지는 펩타이드를 제공한다.
구체적으로 본 발명에 따른 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나의 서열을 갖는다.
또한, 본 발명에 따른 펩타이드의 범위에는 상기 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 기능적 동등물이 포함된다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 상기 분비신호들과 적어도 70% 이상의, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 본 발명에 따른 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 세포 내에서 합성된 단백질을 세포 밖으로 수송하는 활성을 말한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 갖는 핵산을 제공한다. 상기에서 핵산은 DNA 또는 RNA를 모두 포함하며, 바람직하게는 DNA를 말한다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산은 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12 중 어느 하나의 염기서열을 갖는다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 갖는 핵산을 포함하는 플라스미드를 제공한다. 상기 플라스미드는 본 발명의 분비신호를 코딩하는 핵산서열, 상기 분비신호에 의해 분비되는 외래 단백질을 코딩하는 핵산서열 및 상기 외래 단백질의 발현을 조절하는 조절서열을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 상기에서 "조절서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 플라스미드로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 플라스미드로 형질전환될 수 있는 형질전환체로는 모든 종류의 그람양성균 및 그람음성균이 포함된다. 바람직하게는, 인체에서 안전성이 입증된 식품용 미생물 예를 들어 유산균 등을 포함된다.
또한, 본 발명은 유전공학적 방법에 의해 재조합 단백질을 제조하는 경우 본 발명의 분비신호를 이용하여 세포 내에서 합성된 단백질의 세포 밖으로의 분비효율을 증가시킴으로써 불용성 응집체의 생성을 억제하고 재조합 단백질의 정제 효율을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 분비신호는 안전성이 입증된 유산균으로부터 분리된 것으로서 안전성이 요구되는 식품용 발현벡터에 사용될 수 있는 장점이 있다.
따라서, 본 발명은 (a) 상기 분비신호를 코딩하는 핵산서열, 상기 분비신호에 의해 분비되는 외래 단백질을 코딩하는 핵산서열 및 상기 외래 단백질의 발현을 조절하는 조절서열을 벡터에 삽입시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환 시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 제조된 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 배양물로부터 외래 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
상기에서 배양물로부터 외래 단백질의 회수는 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 즉, 배양물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용함으로써 용이하게 수행할 수 있다. 예를 들면, 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등의 컬럼 크로마토그래피를 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
분비신호 탐색용 셔틀벡터 pGS40을 이용한 유산균 염색체에서의 분비신호 탐색
대장균 MC1061/pGS40(기탁번호 KCTC 10517BP)로부터 알칼리 용해법에 의해 플라스미드를 분리함으로써 그람음성균 및 그람양성군에서 복제를 하는 복제원점 pWV01, 에리스로마이신 저항 유전자(Emr), 분비신호가 제거된 아밀라아제 유전자(α-amy) 및 대장균 및 유산균용 항시발현 프로모터 P32를 포함하는 5.3kb의 분비신호 탐색용 셔틀벡터 pGS40을 수득하였다(도 1)
상기 분비신호 탐색용 셔틀벡터 pGS40을 이용하여 유산균 염색체로부터 분비신호 활성을 가진 단편을 선별하였다.
먼저, 생체에 안전한 유산균인 락토코커스 락티스 LM0230(Lactococcus lactis LM0230)(J. D. Efstathion et al., J. Bacteriol, 130, 257-265, 1977)의 염색체 DNA를 공지의 방법을 변형하여 분리하였다(E. Johansen et. al., J. Dairy. Sci., 75, 1186-1191, 1992). 0.5% 글루코오스가 함유된 M17 배지에서 배양된 유산균 1.5 ml을 7,500rpm으로 5분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 -20℃에서 1시간 이상 얼렸다가 녹인 후 50mM 트리스(pH 8.0), 1mM EDTA, 6.7% 수크로오스(sucrose)로 구성된 TES 완충용액으로 세척한 후, 25% 수크로오스, 5% 트립톤(Triton) X-100, 50 mM EDTA, 50mM 트리스(pH 8.0) 및 30mg/ml농도의 라이소짐이 함유된 374 ㎕의 STET 완충용액으로 현탁하여 15분간 37℃에서 배양하였다. 배양한 현탁액에 40㎕의 20% SDS를 첨가하여 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응시키고 65℃에서 30분간 반응시켰다. 상기 반응액에 100㎕의 TE(pH 8.0) 완충용액을 첨가한 후 페놀처리로 단백질을 제거하고, 2배의 에탄올을 첨가하여 원심분리기로 DNA를 침전시킴으로써 염색체 DNA를 분리하였다. 분리한 염색체 DNA를 제한효소 PstI으로 처리하여 상기 제한효소에 의해 무작위로 생성된 1000여개의 단편을 수득하였다.
상기 제한효소 PstI에 의해 잘라진 각 단편을 분비신호 탐색용 벡터 pGS40의 아밀라아제 유전자 앞부분에 존재하는 동일한 제한효소 사이트로 삽입한 다음 이를 각각 대장균 MC1061에 형질전환시켰다. 상기 형질전환체를 1% 가용성 전분 및 200μg/ml 농도의 에리스로마이신을 포함하는 LB 고체배지에서 37℃로 10시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 요오드 용액(0.3% I2 + 0.6% KI)을 고체배지에 첨가하여 알파-아밀라아제를 발현하여 분비함으로써 자주색으로 염색되지 않고 환을 형성하는 형질전환체를 선별하였다. 상기와 같은 본 발명에 따른 분비신호 활성을 가지는 단편의 탐색방법은 도 2에 개략적으로 나타내었다.
실험 결과, 환을 형성하는 6개의 형질전환체가 선별되었다(도 3). 상기 선별된 형질전환체로부터 플라스미드를 분리한 다음 이를 각각 pGS401, pGS402, pGS404, pGS405, pGS406 및 pGS407으로 명명하였다. 상기 각각의 플라스미드를 제한효소 PstI으로 처리한 후 분비신호 활성을 지닌 단편 6개를 수득하고 이들을 각각 S401, S402, S404, S405, S406 및 S407로 명명하였다. 이들 분비신호 활성 단편의 특성을 대략적으로 확인하기 위하여 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 방법에 따라 선별된 단편들은 1kb에서 5kb의 다양한 크기를 가지고 있음을 확인할 수 있었다(도 4).
<실시예 2>
유산균 염색체로부터 선별된 분비신호의 대장균에서의 분비능 측정
상기 실시예 2에서 락토코커스 락티스 LM0230으로부터 선별된 6개의 분비신호의 대장균에서의 분비능을 조사하였다. 이를 위해, 상기 실시예 2의 분비신호를 포함하는 플라스미드 pGS401, pGS402, pGS404, pGS405, pGS406 및 pGS407로 대장균MC1061(ATCC 53338)을 형질전환 한 다음 상기 형질전환체의 총 분획 및 주변 세포질 분획을 제조하여 각각의 알파-아밀라아제 활성을 측정하였다.
상기 형질전환체의 총분획을 제조하기 위해 상기 형질전환체를 대장균 배지인 LB 액체 배지 5ml에 접종하여 37℃에서 10시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 상기 배양액 1ml를 회수하여 얼음에서 초음파 파쇄기를 이용하여 세포벽을 파쇄시켰다. 그 다음 상기 파쇄물을 4℃, 6,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상기 상층액을 이용하여 세포 전체의 아밀라아제 총 활성을 측정하기 위한 시료로 사용하였다.
또한, 상기 형질전환체의 주변 세포질 분획을 제조하기 위해, 상기 형질전환체의 배양액 1ml을 회수한 다음 7,500rpm에서 5분간 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 수득한 펠렛을 5mg/ml의 라이소짐, 10mM EDTA 및 0.3M의 수크로스를 포함하는 pH7.5의 0.1M 염화인산 완충용액에 녹인 후 37℃에서 30분간 처리하였다. 이를 4℃, 6,000rpm에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 수득하여 주변 세포질로 분비된 아밀라아제의 활성을 측정하기 위한 시료로 사용하였다.
알파-아밀라아제의 활성은 공지된 방법(Miller et al.. Anal. Chem. 31. 46-428, 1959)인 DNS 측정법으로 측정하였다. 즉, 1% 가용성 전분을 0.1M 염화인산 완충용액에 녹여서 기질을 제조한 다음 상기 기질 500㎕를 반응 튜브에 첨가한 다음 55℃에서 전처리하였다. 여기에 상기에서 제조한 시료를 1ml가 되도록 첨가 한 후 30분간 반응시킨 다음 3ml의 DNS액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이를 90∼95℃에서 5분간 가열 한 다음 575nm에서 흡광도를 측정하여 효소 역가를 측정하였다. 알파-아밀라아제의 분비효율은 전체 아밀라아제 효소 역가에 대한 주변 세포질로 분비된 아밀라아제 효소 역가의 비율에 의해서 계산하였다.
실험 결과, 본 발명에 따른 형질전환체의 아밀라아제 효소의 분비효율은 12에서 84%까지 다양하게 나타났다. 이 중 분비신호 S405의 경우 아밀라아제 분비효율이 84%로 가장 높게 나타났다(표 1).
| 분비신호 | 알파-아밀라아제 역가(U/ml) | 분비효율(%) | |
| 총 역가 | 주변 세포질 역가 | ||
| S401 | 2.9 | 2.0 | 69 |
| S402 | 2.8 | 1.8 | 64 |
| S404 | 23.6 | 4.2 | 18 |
| S405 | 2.5 | 2.1 | 84 |
| S406 | 23.7 | 5.0 | 21 |
| S407 | 22.6 | 2.8 | 12 |
또한, 분비된 효소가 알파-아밀라아제임을 증명하기 위하여 상기에서 분비효율이 가장 우수한 pGS405로 형질전환된 대장균의 총 분획 및 주변 세포질 분획을 SDS-PAGE로 전개하였다. 그 다음 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하고, X-레이 필름에 감광시켰다. 이때, 대조군으로는 형질전환하지 않은 대장균의 총 분획 및 주변 세포질 분획을 사용하였다. SDS-PAGE 결과 나타난 밴드를 확인하고, 나타난 밴드가 알파-아밀라아제임을 증명하기 위해 활성 염색을 실시하였다. 활성염색은 공지의 방법에 따라 수행하였다(Lin L. L. et al., J. Appl. Microbiol., 82, 325-334, 1997). 상기에서 SDS-PAGE로 전개한 후, 전개한 젤을 즉시 1% 가용성 전분을 함유한 50mM Tris-HCl (pH 8.5) 완충용액에 침수시킨 후 60℃에서 2시간동안 배양하여 젤에 가용성 전분이 함유되도록 하였다. 상기 배양한 젤을 0.1N KI 용액에 침지시켜 자주색으로 염색되는지의 여부를 확인하였다. 이때, 젤에 알파-아밀라아제가 존재하는 경우 알파-아밀라아제에 의해 가용성 전분이 분해되어 자주색으로 염색되지 않게 되고 젤에 알파-아밀라아제가 존재하지 않는 경우에는 가용성 전분이 분해되지 않아 자주색으로 염색되게 된다.
실험 결과, pGS405로 형질전환된 대장균의 총 분획 및 주변 세포질 분획의 경우, 알파-아밀라아제의 분자량인 55kDa 근처에서 밴드가 나타남을 확인하였다. 또한, 상기 밴드를 활성 염색한 결과, 55kDa에서 염색이 되지 않는 밴드를 확인함으로써 알파-아밀라아제 효소임을 확인하였다(도 5).
<실시예 3>
유산균 염색체로부터 선별된 분비신호의 유산균에서의 분비능 측정
3-1) 분비신호를 포함하는 플라스미드를 이용한 유산균의 형질전환
상기 실시예 2에서 락토코커스 락티스 LM0230으로부터 선별된 분비신호의 유산균에서의 분비능을 조사하였다. 이를 위해, 상기 실시예 2의 분비신호를 포함하는 플라스미드 pGS401, pGS402, pGS404, pGS405, pGS406 및 pGS407을 락토코커스 락티스 MG1363(Lactococcus lactis MG1363)(Gassion M. J. et al., J. Bacteriol., 154, 1-9, 1983)(National Institute for Research in Dairying, England, Gasson M. J.로부터 제공받음)에 전기천공법(electroporation)으로 형질전환시켰다. 형질전환시 컴피턴트 유산균의 제조는 공지의 방법을 변형하여 수행하였다(Holo. H et al., App. Environ. Microbiol., 56:1890-1896, 1989). 상기 락토코커스 락티스 MG1363을 0.5% 글루코오스를 함유한 5ml의 M17 액체 배지에 접종하여 30℃에서 18시간 동안 배양한 후, 이를 0.5% 수크로오스, 0.5% 글라이신, 0.5% 글루코오스를 포함한 50ml의 M17 액체배지에 1% 접종하여 600nm에서의 흡광도가 0.5에 도달할 때까지 배양하였다. 배양된 세포를 4℃에서 5,000rpm으로 15분간 원심분리하여 회수하고, 회수된 균체를 다시 1/10 부피의 0.5M 수크로오스 및 10% 글라이신을 포함한 세척완충용액으로 두 번 세척하였다. 세척한 균체를 상기와 동일한 방법으로 원심분리 하여 균체를 회수하고, 1/100 부피의 세척완충용액으로 현탁하여 -70℃에 보관하였다가 형질전환에 사용하였다.
상기와 같이 제조된 컴피턴트 세포 46㎕와 본 발명의 플라스미드 DNA 100 내지 200ng를 0.2cm 큐벳에 혼합 한 후, 진 펄셔 시스템(Gene Pulser system, Bio-Rad)을 사용하여 2.5kV, 25μF로 전기적 충격을 가하여 유산균을 형질전환하였다.
3-2) 형질전환된 유산균에서 본 발명에 따른 분비신호의 분비능 측정
상기 실시예 3-1)의 형질전환체를 1% 가용성 전분을 함유한 M17 고체배지에 접종하여 30℃에서 18시간 동안 배양한 후 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 요오드 용액을 첨가하여 환 형성 여부를 확인하였다.
또한, 각 분비신호의 분비능을 확인하기 위하여 상기 형질전환체를 0.5% 글루코오스를 포함한 M17 액체배지에서 30℃에서 18시간 동안 배양한 후 7,500rpm에서 5분간 원심분리 후 펠렛은 버리고 상층액만 회수하여 암모늄 설페이트 침전법에 의하여 단백질을 농축 후, 세포 밖으로 분비된 알파-아밀라아제의 활성을 상기 실시예 3의 DNS 측정법으로 측정하였다.
실험 결과, 본 발명의 분비신호를 포함한 형질전환체는 알파-아밀라아제가 분비되어 투명한 환이 형성됨을 확인할 수 있었다(도 6). 또한, 분비신호 S407을 포함하는 형질전환체의 알파-아밀라아제 활성이 73.7U/mg의 역가를 나타냈다.
<실시예 4>
본 발명의 분비신호의 아미노산 서열 및 염기서열의 결정
상기 실시예 1에서 선별된 분비신호 S401, S402, S404, S405, S406 및 S407의 아미노산 서열 및 염기서열을 결정하였다. 상기 분비신호의 염기서열은 생거 등의 방법(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467(1977)에 따라 5'-TTGCAAGCGCGCTTCCAATG-3'(서열번호 14)의 염기서열을 가지는 DNA 시퀀싱 프라이머를 이용하여 분석하였다. 상기에서 분석된 염기서열로부터 DNAstar (DNASTAR Inc.) 프로그램을 이용하여 아미노산 서열을 분석하였다. 또한, 대장균에서 높은 분비효율을 나타냈던 분비신호 S405와 유산균에서 높은 분비효율을 가진 S407의 구조를 히든 마코브 모델 프로그램(hidden Markov model program)(Krogh et al., ISMB., 6:122-130, 1998)을 이용하여 분석하였다.
실험 결과, 본 발명에 따른 분비신호 S401, S402, S404, S405 S406 및 S407의 염기서열은 각각 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13에 나타낸 바와 같다. 상기 염기서열들은 리포터 유전자인 알파-아밀라아제 앞 부분에 ORF(open reading frame)을 가지고 있으며, 이를 발현시키는 것으로 추정되는 프로모터를 포함하고 있음을 알 수 있었다. 또한, 개시코돈 앞부분에 리보솜 바인딩 사이트인 SD 염기서열이 존재함을 확인할 수 있었다(도 7a 및 도 7b).
또한, 상기 염기서열로부터 유추된 아미노산 서열은 각각 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 및 서열번호 7에 나타낸 바와 같다. 이 중에서 분비신호 S405 및 S407의 구조를 히든 마코브 모델 프로그램으로 분석한 결과, 공통적으로 3종류의 구별되는 도메인을 가지고 있음을 알 수 있었다. 즉, S405의 경우 8개의 아미노산을 포함한 양이온 측쇄를 가진 아미노산, 13개의 극성 아미노산, 절단지역을 가진 친수성 아미노산으로 구성되어 있었으며, S407의 경우에는 5개의 아미노산을 포함한 양이온 측쇄를 가진 아미노산, 14개의 극성 아미노산, 절단지역을 가진 친수성 아미노산으로 구성되어 있음을 알 수 있었다.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명의 분비신호는 재조합 단백질의 제조시 고효율로 목적 단백질을 세포 밖으로 분비시키는데 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 분비신호는 안정성이 확보된 균으로부터 분리된 것으로서 식품용 발현벡터에 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 분비신호 탐색용 셔틀벡터 pGS40의 개략적인 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 분비신호 탐색용 셔틀벡터를 이용하여 락토코커스 락티스의 염색체로부터 분비신호를 선별하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 3은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 염색체로부터 수득한 분비신호 후보 단편을 포함하는 본 발명의 분비신호 탐색용 셔틀벡터로 대장균을 형질전환하고, 대장균 형질전환체를 가용성 전분 및 항생제를 포함한 고체배지에서 배양한 후 요오드 용액을 첨가한 결과 환을 형성한 형질전환체를 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 락토코커스 락티스 염색체로부터 선별한 분비신호를 SDS-PAGE 전개한 결과를 나타낸 것이다(레인 1: λ/HindIII 사이즈 마커 위에서부터 크기는 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564bp, 레인 2: S401, 레인 3: S402, 레인 4: S404, 레인 5: S405, 레인 6: S406, 레인 7: S407).
도 5는 대장균에서 분비효율이 가장 우수한 분비신호 S405를 SDS-PAGE로 전개한 결과 및 활성 염색을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
레인 1: 단백질 마커
레인 2: 형질전환하지 않은 대장균의 총 분획
레인 3: 형질전환하지 않은 대장균의 주변 세포질 분획
레인 4: pGS405로 형질전환 대장균의 총 분획
레인 5: pGS405로 형질전환한 대장균의 주변 세포질 분획
레인 6: 형질전환하지 않은 대장균의 총 분획을 활성염색한 결과
레인 7: 형질전환하지 않은 대장균의 주변 세포질 분획을 활성염색한 결과
레인 8: pGS405로 형질전환한 대장균의 총 분획을 활성염색한 결과
레인 9: pGS405로 형질전환한 대장균의 주변 세포질 분획을 활성염색한 결과
도 6은 락토코커스 락티스의 염색체로부터 수득한 분비신호 후보 단편을 포함하는 본 발명의 분비신호 탐색용 셔틀벡터로 유산균을 형질전환하고, 유산균 형질전환체를 가용성 전분 및 항생제를 포함한 고체배지에서 배양한 후 요오드 용액을 첨가한 결과 환을 형성한 형질전환체를 나타낸 사진이다.
도 7a는 본 발명의 분비신호 S405의 염기서열을 분석한 결과이다.
도 7b는 본 발명의 분비신호 S407의 염기서열을 분석한 결과이다.
<110> LEE, Hyong Joo
KIM, Jeong Hwan
CHOI, Youn Chul
JEONG, Do Won
<120> Novel secretion signal isolated from the lactic acid bacteria
<160> 14
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1461
<212> DNA
<213> Bcillus licheniformis
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1461)
<223> alpha-amylase
<400> 1
gcagcggcgg caaatcttaa tgggacgctg atgcagtatt ttgaatggta catgcccaat 60
gacggccaac attggaagcg tttgcaaaac gactcggcat atttggctga acacggtatt 120
actgccgtct ggattccccc ggcatataag ggaacgagcc aagcggatgt gggctacggt 180
gcttacgacc tttatgattt aggggagttt catcaaaaag ggacggttcg gacaaagtac 240
ggcacaaaag gagagctgca atctgcgatc aaaagtcttc attcccgcga cattaacgtt 300
tacggggatg tggtcatcaa ccacaaaggc ggcgctgatg cgaccgaaga tgtaaccgcg 360
gttgaagtcg atcccgctga ccgcaaccgc gtaatttcag gagaacacct aattaaagcc 420
tggacacatt ttcattttcc ggggcgcggc agcacataca gcgattttaa atggcattgg 480
taccattttg acggaaccga ttgggacgag tcccgaaagc tgaaccgcat ctataagttt 540
caaggaaagg cttgggattg ggaagtttcc aatgaaaacg gcaactatga ttatttgatg 600
tatgccgaca tcgattatga ccatcctgat gtcgcagcag aaattaagag atggggcact 660
tggtatgcca atgaactgca attggacggt ttccgtcttg atgctgtcaa acacattaaa 720
ttttcttttt tgcgggattg ggttaatcat gtcagggaaa aaacggggaa ggaaatgttt 780
acggtagctg aatattggca gaatgacttg ggcgcgctgg aaaactattt gaacaaaaca 840
aattttaatc attcagtgtt tgacgtgccg cttcattatc agttccatgc tgcatcgaca 900
cagggaggcg gctatgatat gaggaaattg ctgaacggta cggtcgtttc caagcatccg 960
ttgaaatcgg ttacatttgt cgataaccat gatacacagc cggggcaatc gcttgagtcg 1020
actgtccaaa catggtttaa gccgcttgct tacgctttta ttctcacaag ggaatctgga 1080
taccctcagg ttttctacgg ggatatgtac gggacgaaag gagactccca gcgcgaaatt 1140
cctgccttga aacacaaaat tgaaccgatc ttaaaagcga gaaaacagta tgcgtacgga 1200
gcacagcatg attatttcga ccaccatgac attgtcggct ggacaaggga aggcgacagc 1260
tcggttgcaa attcaggttt ggcggcatta ataacagacg gacccggtgg ggcaaagcga 1320
atgtatgtcg gccggcaaaa cgccggtgag acatggcatg acattaccgg aaaccgttcg 1380
gagccggttg tcatcaattc ggaaggctgg ggagagtttc acgtaaacgg cgggtcggtt 1440
tcaatttatg ttcaaagata g 1461
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> Lactococcus lactis LM0230
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(14)
<223> secretion signal S401
<400> 2
Met Asn Lys Ser Lys Ile Ile Ala Phe Ser Ala Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> Lactococcus lactis LM0230
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(30)
<223> secretion signal S402
<400> 3
Met Glu Met Leu Gln His Leu Leu Thr Leu Asn Ser Glu Thr Asp Phe
1 5 10 15
Val Lys Lys Asn Asp Gln Phe Val Ala Leu Val Lys Glu Thr
20 25 30
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> Lactococcus lactis LM0230
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(22)
<223> secretion signal S404
<400> 4
Met Leu Val Met Lys Ile Leu Leu Met Glu His Val Asn Asn Gly Asp
1 5 10 15
Asn Gln Asn Thr Thr Thr
20
<210> 5
<211> 23
<212> PRT
<213> Lactococcus latis LM0230
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(23)
<223> secretion signal S405
<400> 5
Met Asn Arg Thr Phe Ile Lys Gly Phe Leu Ala Gly Asn Ala Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Gly Ile Thr Ala Ala
20
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> Lactococcus lactis LM0230
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(20)
<223> secretion siganl S406
<400> 6
Met Tyr Leu Ile Thr Glu Thr Phe Tyr Asp Gln Glu Gly Lys Gln Ser
1 5 10 15
Asn Ala Glu Thr
20
<210> 7
<211> 29
<212> PRT
<213> Lactococcus lactis LM0230
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(29)
<223> secretion signal S407
<400> 7
Met Glu Tyr Gly Val Leu Ser Val Ile Leu Val Ile Leu Val Leu Phe
1 5 10 15
Leu Ala Gly Leu Glu Gly Leu Asp Pro Trp Gln Phe His
20 25
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis LM0230
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(44)
<223> secretion signal S401
<400> 8
atgaataaat caaaaattat tgctttctct gcagcagcgg cggc 44
<210> 9
<211> 83
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis LM0230
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(83)
<223> secretion signal S402
<400> 9
atgttgcagc acttgttgac gttgaattca gaaacagact ttgttaaaaa aaatgaccaa 60
tttgttgctt tggttaaaga aac 83
<210> 10
<211> 66
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis LM0230
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(66)
<223> secretion signal S404
<400> 10
atgctggtaa tgaaaatctt gctaatggaa catgtaaaca atggtgataa ccaaaataca 60
acgact 66
<210> 11
<211> 81
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis LM0230
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(81)
<223> secretion signal S405
<400> 11
atgaatcgta catttattaa aggctttttg gcggggaatg cacttttgtt agcaggaatt 60
actgctgcag cagcggcggc a 81
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis LM0230
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(60)
<223> secretion signal S406
<400> 12
atgtacctta tcacagaaac tttttatgac caagagggga agcaatcgaa tgcagaaact 60
<210> 13
<211> 90
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis LM0230
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(90)
<223> secretion signal S407
<400> 13
atggaatacg gtgttttatc tgtaatcttg gtcattctcg ttgccttcct tgctggtctt 60
gaaggtatct ttgacccctg gcaattccac 90
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
ttgcaagcgc gcttccaatg 20
Claims (15)
- 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 세포 내에서 합성된 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 펩타이드.
- 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 세포 내에서 합성된 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 펩타이드.
- 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 세포 내에서 합성된 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 펩타이드.
- 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 세포 내에서 합성된 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 펩타이드.
- 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 세포 내에서 합성된 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 펩타이드.
- 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 세포 내에서 합성된 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 펩타이드.
- 제1항의 펩타이드를 코딩하는 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 갖는 핵산.
- 제2항의 펩타이드를 코딩하는 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 갖는 핵산.
- 제3항의 펩타이드를 코딩하는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 갖는 핵산.
- 제4항의 펩타이드를 코딩하는 서열번호 11로 표시되는 염기서열을 갖는 핵산.
- 제5항의 펩타이드를 코딩하는 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 갖는 핵산.
- 제6항의 펩타이드를 코딩하는 서열번호 13으로 표시되는 염기서열을 갖는 핵산.
- 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 플라스미드.
- 제13항의 플라스미드로 형질전환된 형질전환체.
- (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펩타이드를 코딩하는 핵산서열, 상기 펩타이드에 의해 분비되는 외래 단백질을 코딩하는 핵산서열 및 상기 외래 단백질의 발현을 조절하는 조절서열을 벡터에 삽입시키는 단계;(b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환 시키는 단계;(c) 상기 (b) 단계에서 제조된 형질전환체를 배양하는 단계; 및(d) 상기 (c) 단계의 배양물로부터 외래 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법.
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