NO301487B1 - Isolert nukleinsyremolekyl kodende for en termisk stabil cytosin deaminase, rekombinant ekspresjonsvektor, vertscelle og fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant termisk stabil cytosin deaminase - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører isolert nukleinsyremolekyl kodende for en termisk stabil eytosin deaminase, rekombinant ekspresjonsvektor, vertscelle og fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant termisk stabil cytosin deaminase.

Cytosin deaminase (CDase, EC 3.5.4.1) katalyserer hydrolyse av cytosin til uracil ved følgende reaksjon.

Enzymet som spiller en viktig rolle i mikrobiell pyrimidin metabolisme (0'Donovan og Nauhard, 1970), er blitt isolert fra flere forskjellige mikroorganismer, men ser ikke ut til å være tilstede i pattedyrceller (Nishiyama et al., 1985).

De fysiske egenskapene til CDase fra forskjellige organismer er blitt vist å være betraktelig forskjellige med hensyn på molekylvekt, stabilitet og subenhetsammensetning. CDase fra Salmonella typhimurium er for eksempel blitt renset til homogenitet (ved SDS-PAGE) og består av fire subenheter av 54 kilodalton (kDa) hver (West et al., 1982) mens enzymet fra Escherichia coli har en molekylvekt på 200 kDa og består av 35 og 46 kDa subenheter (Karsuragi et al., 1986). Begge disse enzymene er meget termostabile og opprettholder høy aktivitet ved 55°C.

Bakegjær ( Saccharomyce cerevisiae) er også blitt anvendt som en kilde for CDase. CDase tilveiebragt derifra har en molekylvekt på 34 kDa ifølge bestemmelsen ved gelfiltrering (Ipata et al., 1971, 1978) og 32-33 kDa bestemt ved SDS-PAGE og aminosyreanalyse (Yergatian et al., 1977). CDase enzymet som tidligere er blitt isolert fra bakergjær ser derfor ut til å være et monomerisk protein.

Oppløsninger av tidligere isolert bakergjær CDase opprett

holder aktivitet i minst 48 t ved lagring ved 4°C mellom pE 5-9 (Ipata et al., 1971, 1978). Ved 37°C er det blitt vist at et råpreparat av bakergjær CDase mister halvparten av dets aktivitet ilt (Kream og Chargaff, 1952), og en renset form av enzymet har en halveringstid på 30 min. (Katsuragi, 1988). Halveringstiden ved 37° C kan bli øket til 28 dager ved immobilisering av enzymet på epoksy-akryliske perler (Katsuragi et al., 1987). Den termiske instabiliteten av CDase fra bakergjær, sammen med den lave molekylvekten, gjør den forskjellig ifra bakterielle enzymer beskrevet tidligere.

CDase er blitt anvendt terapeutisk for omdanning av promedi-kamentet 5-fluorcytosin (5-FC) til anticancermedikamentet 5-fluoruracil (5-FU) (Karsuragi et al., 1987; Nishiyama et al., 1985; Sakai et al., 1985; Senter et al., 1987). Bakterielle kilder for CDase er upraktiske for slik anvendelse, som krever dyrkning i stor skala for å oppnå tilstrekkelig aktivitet (Sakai et al., 1985). I tillegg kan mikrobielle ekstrakter forårsake uønskede bivirkninger i mottakerene.

Gjær kan bli anvendt som en kilde for CDase for å unngå disse problemene. Termisk ustabilitet til tidligere gjær-avledet produkt krever at enzymet blir immobilisert før det blir anvendt (Katsuragi et al., 1987). Isolering og rensing av en termisk stabil gjær CDase tilveiebringer forbedret enzym for anvendelse i anticancerterapi. Kloning av genet for termisk stabil CDase fra gjær muliggjør introduksjon av definerte endringer eller tilsetninger til selve genet, sekvenser som kontrollerer expressjonen, og genfusjoner dannet mellom genet og andre molekyler. Slike nye konstruksjoner øker effektiviteten eller brukbarheten til enzymet i anticancerterapi.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den uventede oppdagel-sen av en termisk stabil CDase fra bakergjær. Aminosyre-sekvensanalyse for dette enzymet viser ingen signifikant homologi med kjente sekvenser til andre proteiner.

Foreliggende oppfinnelse vedrører isolert nukleinsyremolekyl

kodende for en termisk stabil cytosin deaminase, kjennetegnet ved at nukleinsyremolekyler koder for cytosin deaminase med aminosyresekvens som angitt i figur 10, eller koder for et protein funksjonelt ekvivalent dertil med samme biologiske aktivitet som forblir minst 50$ aktiv i fri, ikke-immobilisert tilstand i mer enn 12 timer ved 37° C, som bestemt ved registrering av omdanningen av 5-fluorcytosin til 5-fluoruracil.

Oppfinnelsen omfatter også rekombinant ekspresjonsvektor kjennetegnet ved at den omfatter og effektivt kan uttrykke nukleinsyremolekylet som angitt ovenfor.

Det er også beskrevet vertsceller kjennetegnet ved at de er transformert med rekombinant ekspresjonsvektor som angitt ovenfor.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant termisk stabil cytosin deaminase omfattende en aminosyresekvens som angitt i figurene 6 eller 10, eller et protein funksjonelt ekvivalent dertil med samme biologiske aktivitet som forblir minst 50$ aktiv i fri, ikke-immobilisert tilstand i mer enn 12 timer ved 37°C, bestemt ved registrering av omdanningen av 5-fluorcytosin til 5-fluoruracil, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) tilveiebringing av en vertscelle som angitt ovenfor, (b) dyrking av nevnte vertscelle under betingelser som

tilveiebringer ekspresjon av cytosin deaminasen; og (c) isolering og rensing av nevnte cytosin deaminase.

Ytterligere aspekter, fordeler og anvendelser av foreliggende oppfinnelse fremkommer for fagfolk innenfor fagområdet i lys av beskrivelsen heri.

Tegningene utgjør en del av denne beskrivelsen.

Figur 1 viser SDS-PAGE analyse av CDase (14$ polyakrylamid under ikke-reduserende betingelser). Forbindelsene angitt i hver kolonne er som følger. Kolonnene 1 og 9, markørpro-teiner; kolonne 2, autolyse supernatant fra trinn 1 ifølge eksempel 1; kolonne 3, produkt etter (NH^j^SC^precipitering

(7056) ifølge trinn 2 i eksempel 1; kolonne 4, produkt etter (NH4)2S04precipitering (50-73$) ifølge trinn 2 i eksempel 1; kolonne 5, produkt avledet fra Q-Sepharose kromatografi ifølge trinn 3 i eksempel 1; kolonne 6, produkt etter G-75 kolonne ifølge trinn 4 i eksempel 1; kolonne 7, produkt etter octyl-Sepharose rensning ifølge trinn 5 i eksempel 1; kolonne 8, sluttprodukt tilveiebragt etter andre G-75 kolonne ifølge trinn 6 i eksempel 1. Figur 2 angir elueringsprofilen til CDase fra en G-50 Sephadex kolonne (1.5 x 100 cm). (A) 27 U av renset CDase ble blandet med ribonuclease A (2 mg), ovalbumin (2 mg) og chymotrypsinogen A (1 mg) og eluert med PBS. Fraksjoner ble registrert ved 280 nm for å bestemme totalt proteininnhold, og ved 290 nm ved anvendelse av 5FC som substrat for å bestemme CDase aktiviteten. (B) Eluering av CDase fra G-50 Sephadex kolonnen ovenfor uten kalibreringsstandardene. Figur 3 illustrerer stabiliteten til CDase ved 37°C. CDase (72 U/mg) i PBS som inneholdt protease-fritt BSA (1 mg/ml) ble inkubert ved 37" C i et polypropylenrør. Ved forskjellige intervaller ble CDase aktiviteten bestemt ved anvendelse av 10 pl av enzymoppløsningen. Figur 4 viser profilen av HPLC-begrenset CDase. De horison-tale pilene angir fraksjonene som ble slått sammen for aminosyre sekvensanalyse. Figur 5 illustrerer SDS-PAGE analyse av CDase etter HPLC rensning (15$ polyakrylamid under reduserende betingelser). Kolonne 1, pool A; kolonne 2, pool B. Figur 6 viser partiell aminosyresekvens til CDase. Peptider oppnådd fra spaltning med CNBr (M-serier), endoproteinase Glu-C (E-serier), endoproteinase Lys-C (K-serier) og endoproteinase Asp-N (D-serier) er angitt. Figur 7 viser nucleotidsekvensene til primerene CDA4R1 og CDA5AS, korresponderende aminosyresekvenser og relative posisjoner til disse primerene i CDase aminosyresekvensen. CDA4R1 er orientert 5' til 3' på plusstråden mens CDA5AS er orienter 5' til 3' på minustråden. Figur 8 angir nucleotidsekvensen til DNA avledet fra genomiske kloner som koder for CDase. Figur 9 angir åpne leserammer (ORFs) som finnes i den genomiske sekvensen til CDase. Figur 10 viser nucleotidsekvensen og korresponderende aminosyresekvens til ORF 2. Ytterligere aminosyrer, bestemt fra nucleotidsekvensen men ikke påvist ved peptidsekvenser-ing, er fremhevet med uthevet type, og start og stopp kodonene er omgitt av en boks. Figur 11 illustrerer plasmidekpressjonsvektor "fusionator" inneholdende CDase genet.

Figur 12 viser kartet av pH3M vektoren.

Ved utførelse av foreliggende oppfinnelse vil det bli anvendt, dersom ikke er angitt, konvensjonelle teknikker for proteinkjemi, molekylærbiologi, mikrobiologi og rekombinant DNA teknologi, som hører inn under dette fagområdet. Slike teknikker er forklart i litteraturen. Se for eksempel Scopes, R.K., Protein Purification Principles and Practice. 2. utgave (Springer-Verlag 1987); Methods in Enzymology (S. Colowick og N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. utg. (1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984 ).

A. Def inis. ioner

Ved beskriving av foreliggende oppfinnelse vil følgende betegnelser bli anvendt, og som anvendt heri antas å være definert som angitt nedenfor.

"Termisk stabil cytosin deaminase" referer til en CDase som forblir minst 50$ aktiv i fri, uimmobilisert tilstand, i mere enn 12 timer ved 37" C, fortrinnsvis i mere enn 1 dag ved 37" C, og fortrinnsvis i mere enn 3 dager ved 37° C, bestemt ved registrering av omdanningen av 5FC til 5FU i nærvær av det isolerte enzymet ved hjelp av analysen som er forklart nedenfor.

En aminosyresekvens eller et protein er "vesentlig homolog" til en annen aminosyresekvens eller protein når minst omtrent 50$, fortrinnsvis minst omtrent 85$, og mest foretrukket er minst omtrent 90-95$, av aminosyre match over en definert lengde av molekylet. I tillegg kan aminosyrevariasjonene omfatte substitusjoner, delesjoner eller addisjoner.

Betegnelsen "funksjonelt ekvivalent" angir at aminosyresekvensen eller proteinet definerer en kjede som vil produsere et termisk stabilt enzym, som beskrevet ovenfor, som kan omdanne 5-FC til 5-FU som beskrevet i eksemplene. Et protein som er funksjonelt ekvivalent til termisk stabil CDase trenger ikke å ha det nøyaktige eller hele aminosyre sekvensen angitt i figurene heri. Proteinet kan istedet for bestå av et biologisk aktivt fragment derav hvor aktiviteten er definert som ovenfor. Proteinet kan i tillegg omfatte addisjoner, delesjoner eller substitusjoner til de angitte sekvensene, dersom proteinet forblir biologisk aktivt.

Et "renset protein" er et som er vesentlig fritt for andre materialer, for eksempel er protein A vesentlig fri for B når B er en blanding av andre cellulære komponenter og proteiner, og når minst omtrent 50 vekt-# av totalt A + B tilstede, mere foretrukket er minst 75 vekt-# og mest foretrukket er 90-95 vekt-$ eller til og med 99 vekt-#, tilstede er A. "Renset" betegner derimot ikke fremgangsmåte som proteinet er avledet ved. Et renset protein kan derfor være et som er produsert ved rekombinante teknikker, produsert syntetisk eller isolert direkte fra en organisme hvori proteinet finnes i naturen.

Betegnelsene "polypeptid" og "protein" blir anvendt i videste forstand, det vil si en hvilken som helst polymer av aminosyrene (dipeptid eller større) koblet gjennom peptid-bindinger. Betegnelsene omfatter derfor oligopeptider, proteinfragmenter, analoger, muteiner, fusjonsproteiner og lignende. Betegnelsene inkluderer native og rekombinante proteiner.

"Rekombinant" proteiner eller polypeptider betegner proteiner uttrykt fra en rekombinant nucleotidsekvens; det vil si produsert fra celler transformert ved en eksogen DNA konstruksjon kodende for det ønskede polypeptidet.

Betegnelsen "rekombinant" anvendt heri for å karakterisere nucleotidsekvensen kodende for CDase beskriver nucleinsyre av genomisk, cDNA, semisyntetisk eller syntetisk opprinnelse, som i kraft av opprinnelsen eller manipuleringen er enten en nuclotidsekvens som ikke oppstår i naturen eller en nucleotidsekvens koblet til nucleoinsyrene forskjellig fra de som de er koblet til i naturen.

Et "replikon" er et hvilket som helst genetisk element (for eksempel et plasmid, et kromoson, et virus) som oppfører seg som en autonom enhet ved polynucleotidreplikasjon i en celle; det vil si som kan replikere under egen kontroll.

En "vektor" er et replikon hvori et annet polynucleotid-segment er koblet, for å tilveiebringe replikasjon og/eller ekspresjon av det koblede segmentet. En "ekspresjonsvektor" betegner en vektor som har evne til autonom replikasjon eller integrasjon og som inneholder kontrollsekvenser som leder transkripsjonen og translasjonen av ønsket nucleotidsekvens i en hensiktsmessig vert.

En "kodende sekvens" er en polynucleotidsekvens som blir transkribert og/eller translatert til et polypeptid.

En "promoter sekvens" er en DNA regulator i sk region som kan binde RNA polymerase og initiere transkribsjon av en nedstrøms (det vil si i 3' retningen) kodende sekvens.

En kodende sekvens er "under kontroll" av promotersekvensen i en celle når transkripsjon av den kodende sekvensen er et resultat av binding av RNA polymerase til promotersekvensen; translasjon av det resulterende mRNA fører deretter til polypeptidet som blir kodet innenfor den kodende sekvensen.

"Operabelt bundet" betegner en sammenstilling hvori kompo-nentene er formet slik at de utfører deres vanlige funksjon. Kontrollsekvenser som er operabelt bundet til en kodende sekvens kan utføre ekspresjonen av kodende sekvens.

"Kontrollsekvenser" betegner de sekvensene som kontrollerer transkripsjonen og/eller translasjonen av kodende sekvens (er); de kan omfatte, men er ikke begrenset til, promotersekvenser, transkripsjonen initiering og termi-neringssekvenser, og transplasjonell initiering og termi-

neringssekvenser. I tillegg referer "kontrollsekvenser" ti sekvenser som kontrollerer prosesering av polypeptidet som blir kodet innenfor den kodende sekvensen; disse kan omfatte, men er ikke begrenset til, sekvenser som kontrollerer utskilling, proteasespaltning og glycoselering av polypeptidet.

En "signalsekvens" kan bli innbefattet før den kodende sekvensen. Denne sekvensen koder for et signalpeptid, N-terminalt for polypeptidet, som kommuniserer med vertscellen om å lede polypeptidet til celleoverflaten eller utskille polypeptidet inn i mediet. Dette signalpeptidet blir spaltet av vertscellen før proteinet forlater cellen. Signal-sekvenser kan bli funnet assosiert med forskjellige proteiner som er native for procaryoter og eaucaryoter. a-faktor er for eksempel et nativt gjærprotein, blir utskilt fra gjær, og signalsekvensen til denne kan bli koblet til heterologe proteiner som skal bli utskilt til mediet (se US-PS 4 546 082). a-faktor og analogene derav er blitt vist å utskille heterologe proteiner fra forskjellige gjærtyper, så som Saccharomyces og Kluyveromyces (se for eksempel EPO-publ.

0 301 669, publikasjonsdato 1. februar 1989).

"Transformasjon" er innskudd av et eksogent polynucleotid inn 1 en vertscelle. Det eksogene nucleotidet kan bli opprettholdt som et plasmid, eller alternativt, bli integrert inn i genomet til verten.

"Rekombinante vertceller", "vertsceller", "celler" og andre slike betegnelser som angir mikroorganismer blir anvendt om hverandre, og referer til celler som kan bli, eller som er blitt, anvendt som mottagere for rekombinante vektorer eller annet overført DNA, og omfatter avkommet til den opprinnelige cellen som ble transfektert. Avkommet til en enkelt parantal celle behøver selvfølgelig ikke være fullstendig identisk i genomisk eller total DNA komplement som de opprinnelige foreldrene, på grunn av tilfeldig eller bestemt mutasjon.

Betegnelsene angir derfor avkom av parentale celler som er tilstrekkelig like til foreldren som skal blikarakterisertved relevant egenskap, for eksempel, substitusjon av et nativt gen som koder for et essensielt enzym med et klonet gen koblet til et strukturelt gen kodende for et ønsket genprodukt.

En "terapeutisk effektiv mengde" av CDase er en mengde som, når administrert med et substrat som CDase virker overfor, er tilstrekkelig for å omdanne substratet til et aktivt cytotoksisk middel som igjen kan inhibere veksten av tumorceller.

B. Generelle fremgangsmåter

Foreliggende oppfinnelse vedrører en CDase isolert fra gjær som har termisk stabilitet. Denne CDasen har egenskaper som gjør den forskjellig fra tidligere isolerte CDase enzymer fra gjær. Molekylvekten til nettopp isolert gjær CDase er på omtrent 32 kDa, bestemt ved gelfiltreringskromatografi. SDS-PAGE viser et hovedbånd ved 17 kDa, som indikerer at tilstedeværende CDase består av en dimer, hvor hver subenhet har en molekylvekt på omtrent 17 kDa. I tillegg, mens tidligere isolerte gjær CDase enzymer er blitt vist å være meget termolabile ved 37"C, er det rensede enzymet i foreliggende oppfinnelse stabil ved denne temperaturen. Aminosyresekvensen til denne nye CDasen viser videre ingen signifikant sekvenshomologi med andre kjente sekvenserte proteiner. Kloning og ekspresjon av genet som koder for denne unike CDasen gir en kodende sekvens på omtrent 474 basepar i lengde, spesifiserende en protein på 158 aminosyrer med en antatt molekylvekt på omtrent 17,506 dalton. Termisk stabil CDase kan bli isolert fra gjær, inkludert medlemmer av ascosporogenos, basidiosporogenos og imperfekte gjær-medlemmer. CDase blir fortrinnsvis isolert fra medlemmer av Saccharomycetoidea familien, idet Saccharomyces sp_. er foretrukket og Saccharomyces cerevisiae (bakergjær) er spesielt foretrukket. Fleishmanns komprimerte gjær har blitt vist å være en meget god kilde for termisk stabil CDase og kan lett bli oppnådd kommersielt fra bakerier og matvarefor-retninger.

Foreliggende fremgangsmåte for rensning av CDase er forskjellig rapporterte fremgangsmåter (se for eksempel Katsuragi et al., 1987; Katsuragi! et al., 1986; Ipata et al., 1978; Ipata et al., 1971) samt er forskjellig i forhold til Katsuragi, 1988. Fremgangsmåten anvender spesifikt forskjellige rensningstrinn, inkludert en ytterligere gelgjennomtrengningskolonne rensning mellom anion-utbytte og hydrofobiske kromatografitrinn (beskrevet nedenfor), samt forskjellige betingelser for rensning inkludert forskjellige buffere, pH og bufferkonstituenter, så som EDTA og DDT. Tidligere fremgangsmåter tilveiebringer ikke et termisk stabilt enzym.

Første trinnet i rensning av termisk stabil CDase fra gjær omfatter ødeleggelse av gjærceller for å tilveiebringe et autolysat inneholdende CDase. Autolyse kan oppnås ved anvendelse av flere forskjellige fremgangsmåter kjent innenfor dette fagområdet. For eksempel kan gjærceller bli plasmolysert med et toluen ifølge metoden til Kunitz (1947). Spesielt nyttig er usetting av gjær for et organisk opp-løsningsmiddel så som etylacetat etterfulgt av tilsetning av en buffer for å opprettholde oppløsningen ved omtrent pH 7. Egnede buffere omfatter kaliumfosfatbuffer, fosfatbufret saltvann, tris buffer, samt flere andre som er velkjente innenfor fagområdet. Bufferen inneholder fortrinnsvis ammoniumsulfat i konsentrasjoner varierende fra 1 til 25$, fortrinnsvis 15$, samt EDTA og ditiotreitol (DTT) for å stabilisere CDase. Alternativt kan EDTA og DTT bli eliminert fra denne og påfølgende bufferoppløsninger. Konsentrasjonen av EDTA, når tilstede, varierer fra 0.1 mM til 10 mM, idet 5 mM er er foretrukket, mens DTT kan være tilstede i konsentrasjoner fra .01 mM til 10 mM, fortrinnsvis 0.1 mM. Denne blandingen blir omrørt i flere dager, og pH opprettholdt ved omtrent 7. Celledebris kan bli fjernet ved sentrifugering. Etter autolyse blir totalt protein presipitert fra autoly-satet ved anvendelse av ammoniumsulfat. Ammoniumsulfat blir tilsatt ved konsentrasjoner som er tilstrekkelig for å tilveiebringe et høyere CDase til proteinforhold. For eksempel kan ammoniumsulfat først bli tilsatt for å oppnå mellom 60-80$ metning, fortrinnsvis 70$ metning. EDTA blir fortrinnsvis tilsatt i reaksjonsblandingen i en konsentrasjon på mellom 1-3 g/l, fortrinnsvis 1.5-2.0 g/l, idet reaksjonen blir gående i flere timer, og precipitatet samlet etter sentrifugering. Pelleten blir løst opp i en egnet buffer, så som PBS, ved omtrent pH 7.0, idet bufferen fortrinnsvis inneholder EDTA og DTT, som ovenfor, og oppløsningen dialysert mot samme buffer. Dialysatet kan bli behandlet nok en gang med ammoniumsulf at for å oppnå en konsentrasjon på omtrent 50$, idet EDTA er tilstede som ovenfor. Precipitatet blir igjen samlet ved sentrifugering og ammoniumsulfat tilsatt til supernatanten for å oppnå omtrent 73$ metning. Precipitatet blir samlet og løst opp i en egnet buffer ved omtrent pH 6.5-8.5, fortrinnsvis en trisbuffer ved pE 8.0 inneholdende DTT ved en konsentrasjon som beskrevet ovenfor. Prekonstituert precipitat blir deretter dialysert mot denne bufferen i flere timer. CDase fra dialysatet kan bli ytterligere renset ved anion-bytte kromatografi ved anvendelse av for eksempel en kryss-bundet agarose eller cellu-losepakkingsmateriale. Spesielt nyttig er anionbyttere så som Q-Sepharose og DEAE-Sepharose, tilgjengelig fra Pharmacia. Egnede ekvilibreringsbuffere omfatter, for eksempel, tris eller fosfatbuffere, idet elueringen blir oppnådd ved anvendelse av en lineær gradient. Spesielt nyttig er anvendelse av 20 mM tris inneholdende 0.1 mM DTT ved pH 8.0, med en lineær gradient på 0-0,3 M KC1 i denne bufferen.

Etter anionbyttekromatografi blir fraksjonene inneholdende CDase aktivitet (vurdert som beskrevet nedenfor) slått sammen og konsentrert ved ultrafiltrering ved anvendelse av for eksempel et filter som kutter ved molekylvekt på omtrent 30.000 dalton (DA) eller mindre.

Deretter blir CDase-innholdende oppløsningen kjørt på en gelgjennomtrengningskolonne. Spesielt nyttig er kryss-bundet dextran, agarose, eller dextran/bisakrylamidgeler med Sephadex G-75, G-100 eller Sephacryl S-300 er foretrukket. Elueringsmidlet kan være en hvilken som helst konvensjonell buffer som er velkjent innenfor fagområdet, ved omtrent pE 7, idet PBS inneholdende DTT som tidligere beskrevet er foretrukket. Fraksjoner inneholdende CDase aktivitet blir slått sammen og dialysert mot en buffer så som kaliumfosfat. Bufferen inneholder fortrinnsvis 1-2 M ammoniumsulfat, og EDTA og DTT som beskrevet ovenfor med hensyn på autolysat-bufferen. En ytterligere gelgjennomtrengningskolonne kan bli kjørt om nødvendig og de aktive fraksjonene konsentrert ved ultrafiltrering ved anvendelse av et filter med en molekylvektkutt på for eksempel 5000 Da.

Deretter kan CDase-inneholdende materiale bli applisert på en kolonne som separerer forbindelser basert på hydrofobisitet og eluert ved anvendelse av for eksempel en revers gradient av ammoniumsulfat i kaliumfosfatbuffer. Fraksjoner med CDase aktivitet blir kombinert og konsentrert ved ultrafiltrering, ved anvendelse av et filter med en molekylvektkutt på 5000 Da. Konsentratet kan bli lagret frossent for videre bruk. Dersom en ytterligere gelgjennomtrengningskolonne ikke ble utført og/eller dersom spesifikk aktivitet til CDase er lav, kan en ytterligere gelgjennomtrengningskolonne, som beskrevet ovenfor, bli kjørt. CDase renset på denne måten er termisk stabil og kan derfor bli lagret frosset eller lyofilisert i fri form.

Aktiviteten til CDase kan bli registrert i løpet av rensningen ved forskjellige kjente fremgangsmåter. For eksempel kan omdanning av cytosin til uracil, eller derivater derav, i nærvær av CDase, bli registrert ved en direkte spektrofoto metrisk analyse ut i fra fallet av absorbance ved 286 nm etter omdanningen. (Se for eksempel Ipata og Cercignani, 1978). Alternativt kan aktiviteten bli bestemt ved registrering ved omdanningen av 5FC til 5 FU spektrofotometrisk som beskrevet av Nishiyama et al., 1985, og inkorporert heri som referanse.

Termisk stabil CDase renset på denne måten er blitt sek-vensert som beskrevet i den eksperimentelle delen og en delvis aminosyresekvens er angitt i figur 6. Sekvensen viser ingen vesentlig homologi med andre kjente sekvenserte proteiner. Basert på denne informasjonen kan termisk stabil CDase bli produsert på en rekombinant måte. For eksempel kan DNA sekvenser kodende for CDase bli reparert syntetisk, basert på den tilveiebragte aminosyresekvensen, ved anvendelse av hensiktsmessige kodoner. Vanligvis blir foretrukne kodoner valgt for den verten som skal bli anvendt for ekspresjon av CDase. Den fullstendige sekvensen blir oppstilt fra overlappende oligonukleotider fremstilt ved standard metoder. Se for eksempel Edge (1981) Nature 297:756; Nambair et al., (1984) Science 223:1299; Jay et al.,

(1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Alternativt kan rekombinant, termisk stabil CDase bli preparert som følger. Oligonukleotid prober inneholdende kodoner for en del av den bestemte aminosyresekvensen kan bli preparert og anvendt for å screene genomisk eller cDNA bibliotek for genet som koder for CDase. Hovedstrategier for preparering av oligonukleotidprober og DNA bibliotek, samt deres screening ved nukleinsyrehybridisering, er velkjent for fagfolk innenfor dette fagområdet. Se for eksempel Oligonucleotide Svnthesis. ovenfor; T. Maniatis et al., ovenfor. Når en klon fra det screende biblioteket er blitt identifisert ved positiv hybridisering kan restriksjonsenzymanalyse og DNA sekvensering bli utført for å bekrefte at det bestemt bibliotekinnskuddet inneholder genet som koder for CDase. I tillegg kan polymerasekjedereaksjonen (PCR) bli anvendt for å amplifisere og deretter påvise nucleotidsekvensen kodende for CDase. Denne metoden er beskrevet i Saiki et al., (1986) og i US-PS 4 683 195 og 4 683 202, idet beskrivelsene er inkorporert heri som referanse. Analyse av nucleotidsekvensen til PCR-amplifiserte produkter kan oppnås ved direkte sekvensanalyse som beskrevet av Saiki et al. (1988). Alternativt kan amplifisert målsekvens(er) bli klonet før sekvensanalysen. En metode for direkte kloning og sekvensanalyse av enzymatisk ampliserte genomiske segmenter er blitt beskrevet av Scharf et al. (1986). I fremgangsmåten blir primerene anvendt i PCR teknikken modifisert nær ved deres 5'-ender for å danne hensiktsmessige restriksjonsseter for direkte kloning deri, for eksempel, en M13 sekvenserings-vektor. Etter amplifikasjon blir PCR produktene spaltet med hensiktsmessige restriksjonsenzymer. Restriksjonsfragmentene ble legert inn i M13 vektor, og transformert inn i, for eksempel, en JM 103 vert, sådd ut, og resulterende plaque blir screenet ved hybridisering med en merket oligonukleotid probe. Andre metoder for kloning og sekvenseringsanalyse er kjent innenfor fagområdet.

I en spesielt foretrukket fremgangsmåte for anvendelse i foreliggende oppfinnelse blir to oligonukleotid primere syntetisert ved anvendelse av den delvis aminosyresekvensen og mønstrene for kodonanvendelse fra S. cerevisiae (Guthrie og Abelson, 1982) som en rettledning for konstruering av "guessmer" sekvenser av DNA sekvensen. Disse primerene ble anvendt for PCR hvori klonet gjærgenomisk bibliotek DNA var tilstede som templat. Oligonukleotidene ble syntetisert fra regioner av CDase hvori aminosyrene viser markert kodonanvendelse ensidighet og/eller liten degenerasjon. Den første primeren, CDA4R1, var en 42-mer inneholdende 33 nukleotider tilsvarende en aminoterminal aminosyresekvens, mens den andre, CDA5AS, inneholdende nukleotider komplementære til sekvensen beliggende nær den karboksy-terminale enden til proteinet. Sekvensen til disse oligonukleotidene er vist i figur 7. To genomiske bibliotek ble anvendt som templat DNA i PCR reaksjoner og begge ble funnet å tilveiebringe et enkelt spesifikt fragment omtrent 350 basepar i lengde, idet størrelsen ble bestemt fra tilsvarende tilgjengelig aminosyresekvens. PCR primerene ble konstruert med EcoRI restriksjonsseter ved deres 5' ender for å mette kloning av fragmentene dannet ved PCR. PCR avledede fragmenter med 350 basepar ble renset ved gelelektroforese og ble subklonet inn i en hensiktsmessig vektor for DNA sekvensering.

Det PCR-avledede fragmentet ble også anvendt som en CDase spesifikk probe for screening av gjærbibliotek ved koloni-filter hybridiseringsteknikker. Opprinnelige forsøk på å anvende "guessmer" oligonukleotlder som prober var ikke vellykket på grunn av et lavt signal:bakgrunns kontamina-sjonsforhold etter hybridisering. Alle potensielle kloner ble plukket og på ny screenet to ganger for å verifisere det positive hybridiseringssignalet. Plasmider ble renset fra individuelle kloner og restriksjonskartlagt ved spaltning med en serie restriksjonsenzymer både alene og i forskjellige multiple spaltningsreaksjoner.

Både de klonede PCR fragmentene og genomiske kloner som koder for CDase ble utsatt for DNA sekvensanalyse. Variasjoner i reaksjonsbetingelsene tillot analyse av sekvenser direkte ved siden av primeren opptil flere hundre basepar lenger borte. Den oppnådde DNA sekvensen er vist i figur 8. Dette viser at sekvensene har homologi på 93$ med 23 feilparringer og 330 parringer. ORF funnet i denne sekvensen er vist i figur 9. Figur 10 viser nukleotidsekvensen og den avledede aminosyresekvens til ORF 2, som bekrefter den tidligere bestemte aminosyresekvensen og viser tilføying av bare noen få aminosyrer til begge endene av den delvise sekvensen oppnådd ved analyse av det rensede proteinet.

DNA sekvensdata ble deretter anvendt for å konstruere nye PCR primere for dannelse av amplifiserte DNA kassetter kodende for CDase. Slike kassetter kan bli anvendt i genetiske konstruksjoner konstruert for å danne høye nivåer av genekspressjon i enten procaryote eller eucaryote celler, og å danne genfusjoner mellom CDase og andre molekyler som er av "biologisk interesse, inkludert men ikke begrenset til immunoglobulinmolekyler oppfanget mot cancerantigener.

CDasekodende sekvensen kan bli klonet inn i en hvilken som helst egnet vektor eller replikon, som er velkjent innenfor fagområdet. Eksempler på rekombinante DNA vektorer for kloning og vertsceller som de kan transformere, vist i parenteser, omfatter bakteriofag X (E. coil), pBR322 (E. coli). pACYClW (E. coli). pKT230 (gram-negative bakterier), pGV1106 (gram-negative bakterier), pLAFRl (gram-negative bakterier), pME290 (ikke-E. coli gram-negative bakterier), pHV14 (E. coil og Bacillus subtilis). pBD9 ( Bacillus1. pIJ61 ( Streptomyces). pUC6 ( Streptomyces). YIp5 ( Saccharomyces). YCpl9 ( Saccharomyces) og bovint papillomavirus (pattedyrceller ).

Den kodende sekvensen for CDase proteinet kan bli plassert under kontroll av en promoter, ribosombindingssete (for bakteriell ekspressjon) og, eventuelt, en operator (samlet betegnet heri som "kontroll" elementer), slik at DNA sekvensen som koder for proteinet blir transkribert inn i RNA i vertscellen transformert med en vektor inneholdende denne ekspresjonskonstruksjonen. Den kodende sekvensen kan eller behøver ikke å inneholde et signalpeptid eller ledersekvens. Ledersekvenser kan bli fjernet av den bakterielle verten ved post-translasjons prosessering. Se, for eksempel, TJS-PS 4 431 739; 4 425 437; 4 338 397.

I tillegg til kontrollsekvenser kan det være hensiktsmessig å tilsette regulatoriske sekvenser som muliggjør regulering av sekvensene for ekspressjon av CDase relativt til veksten av vertscellen. Regulatoriske sekvenser er kjent for fagfolk, og eksemplet omfatter de som forårsaker ekspressjon av et gen som blir aktivert eller inaktivert i respons til et kjemisk eller fysisk stimuli, inkludert tilstedeværelse av en regulatorisk forbindelse. Andre typer regulatoriske elementer kan også være tilstede i vektoren, for eksempel, forsterkningssekvenser (enhancer) sekvenser.

En ekspress-onsvektor blir konstruert slik at CDase kodende sekvensen er beliggende i vektoren med hensiktsmessige regulatoriske sekvenser, idet beliggenheten og orienteringen av den kodende sekvensen med hensyn på kontrollsekvensene er slik at den kodende sekvensen blir transkribert under "kontroll" av kontrollsekvensene (det vil si, RNA polymerase som ble bundet til DNA molekylet ved kontrollsekvensene transkriberer den kodende sekvensen). Modifikasjon av sekvensene som koder for CDase kan være ønskelig å oppnå. I noen tilfeller kan det for eksempel være nødvendig å modifisere sekvensen slik at den kan bli koblet til kontrollsekvensene med riktig orientering; det vil si, for å opprettholde leserammen. Kontrollsekvensene og andre regulatoriske sekvenser kan bli legert til den kodende sekvensen før innskudd inn i en vektor, som kloningsvektorene beskrevet ovenfor. Alternativt kan den kodende sekvensen bli klonet direkte inn i en ekspressjonsvektor som allerede inneholder kontrollsekvensene og et hensiktsmessig restrik-sjonssete.

Et antall prokariotiske ekspressjonsvektorer er kjent innenfor fagområdet. Se for eksempel US-PS 4 440 859; 4 436 815; 4 431 740; 4 431 739; 4 428 941; 4 425 437; 4 418 149; 4 411 994; 4 366 246; 4 342 832, se også UK patentsøknadene GB 2 121 054; 2 008 123; 2 007 675 og europeisk patentsøknad 103 395. Ekspressjonsvektorer fra gjær er også kjent innenfor fagområdet. Se for eksempel US-PS 4 446 235; 4 443 539; 4 430 428; se også europeisk patentsøknadene 103 409; 100 561; 96 491. Pattedyr ekspressjonsvektorer er også kjente.

Avhengig av ekspresjonssystem og verten som blir valgt, blir CDase produsert ved dyrkning av vertsceller transformert med en ekspressjonsvektor beskrevet ovenfor under tilstander hvorved CDase blir uttrykt. Proteinet blir deretter isolert fra vertscellene og renset. Dersom ekspressjonssystemet utskiller proteinet i vekstmediet kan proteinet bli renset direkte fra mediet. Dersom proteinet ikke blir utskilt blir det isolert fra cellelysater. Valg av hensiktsmessige vekstbetingelser og metoder for isolering er kjent innenfor fagområdet.

Et eksempel på en konstruksjon for kontrollert induksjon av CDase sekvenser i gjær omfatter innskudd av CDase kassetten inn i en gjærvektor betegnet "fusionator". Denne vektoren er tilgjengelig fra Department of Genetics, University of Washington, Seattle, Washington, og fra NIH. En slik konstruksjon er angitt i figur 11. I denne konstruksjonen blir CDase innskutt inn i en polylinker som plasserer ekspressjonen derav under kontroll av den meget uttrykte og stringent regulerte GÅL10 promoteren fra gjær (Johnston, M. 1987). GAL10 promoteren reagerer overfor galaktose, som induserer ekspressjon i høyt nivå av genet under dens kontroll. Denne vektoren kan også bli anvendt for å danne en CDase-lacZ genfusjon ved hensiktsmessige forandringer i DNA sekvensen. Det dannede fusjonsproteinet kan lette kvantiter-ing av induksjon, rensning og biokjemisk analyse. Disse konstruksjonene kan bli transformert inn i en egnet gjærstamme, så som den som er beskrevet av Hovland, et al.,

(1989). Denne gjærstamme har et antall mutasjoner som gjør den egnet for anvendelse med en konstruksjon så som beskrevet ovenfor. Spesifikt er en gall mutasjon tilstede som resulterer i mangel av enzymet som katalyserer det første trinnet av galaktoseanvendelsen, som derved forhindrer fjerning av inducer (galaktose) i mediet. En regl-501 mutasjon er også tilstede, som eliminerer glukoserepressjonen av galaktosegen ekspressjonen og muliggjør opprettelse av kulturer under betingelser som er optimale for vekst og levedyktighet. Induksjon kan med letthet bli oppnådd ved tilsetning av galaktose til rikt glukose-basert medium. Videre er flere proteasemanglende mutasjoner tilstede i stammen, alt dette øker stabiliteten til eventuelle heterologe proteiner eller fragmenter derav, produsert i løpet av veksten. En slik ekspressjonskonstruksjon bør lette isolering og grensning av CDase fra gjær i mengder som tidligere var umulig ved anvendelse av ekspressjonsnivåene som blir oppnådd med det endogene genet.

Andre konstruksjoner kan bli dannet for anvendelse i pattedyr celle kultursystemer. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blir kassetten kodende for CDase tilkoblet ved anvendelse av PCR teknologi til det sekretoriske signalpeptidet for oncostatin M (Malik, et al., 1989), og kan deretter bli skutt inn i pattedyr ekspressjonsvektor pE3MPy (Stamenkovic, et al., 1990)som inneholder hensiktsmessige for-sterkere, promotere, terminering og prosesseringssignalet for pattedyrekspresjon. Konstruksjonen kan bli transfektert inn i COS celler, (Aruffo og Seed, 1987) serum-fritt kulturmedium samlet og analysert for CDaseaktivitetssystem som mangler en enzymaktivitet. Likeledes kan cDNA konstruksjoner for genfusjoner mellom CDase og andre molekyler av interesse bli konstruert ved standardteknikker, transfusert inn i COS celler og celleekstrakter eller supernatanter analysert for proteiner og deres aktivitet.

Andre genfusjoner kan også anvendes ved rekombinant produksjon av CDase. For eksempel kan en nucleotidsekvens kodende for CDase eller en funksjonell mutant eller et fragment derav bli koblet til cDNA-kodende immunoglobullinmolekyler oppfanget mot cancer antigener, for å danne et antistoff-fusjonsprotein. Monoklonale antistoffer som gjenkjenner determinanter fortrinnsvis uttrykt på tumorceller (Hellstrom, et al., 1984) er blitt tilveiebragt. Fusjonsproteiner som spesifikt oppfanger valgte tumorceller. Se for eksempel US patent nr. 4 906 562 og Hellstrom og Hellstrom, 1985. Enzymet kan deretter virker direkte på tumorcellestedet for å omdanne promedikament 5FC til anticancermiddel 5FU. Genomiske fusjoner mellom gener som koder for enzymet av interesse og antistoffet mot cancerceller eliminerer muligheten av kjemisk konjugasjon av de to proteinene. cDNA konstruksjoner mellom to molekyler av interesse vil likeledes øke fleksibiliteten til slike konstruksjoner i heterologe ekspressjonssystemer.

I et system blir cDNA for den tunge kjeden til et cancer antistoff tilveiebragt fra cellelinjer som produserer dette antistoffet. PCR fragmenter som koder for alle deler av dette cDNA kan deretter bli dannet ved hjelp av metoder som er kjente for fagfolk innenfor dette fagområdet. I-ramme fusjon av de to kassettene kan oppnås ved standard teknikker ved flere beliggenheter, og resulterende fusjoner kan bli undersøkt for produksjon av proteiner med ønsket biologisk aktivitet. Co-transfeksjon med et annet plasmid inneholdende cDNA kodende for den lette kjededelen av antistoffmolekylet muliggjør isolering av et biologisk aktivt antistoff fragment kondensert til et aktivt CDase enzym. Overføring av enzymet til ønsket beliggenhet vil derved bli oppnådd.

Det er også ønskelig å produsere mutanter eller analogen av termisk stabil CDase som er funksjonelt ekvivalent dertil. Mutanter eller analoger kan bli preparert ved delesjon av en del av sekvensen som koder for CDase, ved et innskudd av en sekvens og/eller ved substitusjon av en eller flere nukleotider innenfor sekvensen. Teknikker for modifisering av nukleotidsekvenser, så som sete-rettet mutagenese eller PCR oligonukleotid mutagenese, er velkjent for fagfolk innenfor dette området. Se for eksempel T. Maniatis et al.

CDase blir også produsert ved kjemisk syntese så som fast fase peptidsyntese, ved anvendelse av kjente aminosyresekvenser eller aminosyresekvenser avledet fra DNA sekvensen til genet av interesse. Slike metoder er velkjente for fagfolk.

Termisk stabil CDase kan bli anvendt som et kjemoterapeutisk middel. Dette enzymet kan spesifikt bli anvendt in vivo for å anvende promedikament 5FC til anticancermidlet 5FU. CDase kan dermed bli koadministrert med 5FC som ved kirurgisk plassering av CDase ved eller nære ved tumorstedet og administrering av 5FC oralt, som beskrevet av Katsuragi et al., 1987, idet beskrivelsen er inkorporert heri som referanse. Alternativt kan enzymet bli ført til tumorsetet ved målført levering av et CDase/antistoffkompleks til tumorer ved anvendelse av antistoffer som er spesifikke for disse tumorene. Dette komplekset kan bli dannet ved kjemiske metoder, eller genetisk ved konstruering av genfusjoner mellom det hensiktsmessige immunoglobulingenet og CDase genet, som beskrevet ovenfor.

Eksempel 1

Enzymrensning. aktivitesbestemning og karakterisering av CDase.

CDase ble renset fra Fleishmanns komprimerte bakergjær ved anvendelse av følgende metode. Alle trinnene i rensningen ble utført ved 4°C. Enzymaktiviteten ble bestemt med 5' fluorcytosin (5FC) ved 3 mM i fosfatbufret saltvann (PBS) ved 37°C (Nishiyama et al., 1985) og beskrivelsen er inkorporert som referanse i sin helhet. Oppløsningene av enzymet ble tilsatt og forløpet av reaksjonen ble registrert spektrofotometrisk i aliquoter som ble stoppet med 0.1 N HC1. Absorbance forhold på 250/290 ble anvendt for å måle mengden av dannet 5-fluoruracil (5FU). En enhet enzymaktivitet er definert som 1 pmol 5FU dannet pr. minutt ved 37° C. Proteinkonsentrasjon ble målt ved anvendelse av BCA analyse tilgjengelig fra Pierce (Rockford, IL). SDS-PAGE ble anvendt for å registrere proteinsammensetningen etter hvert rensningstrinn.

Trinn 1. Preparering av gjær autolvsat

Bakergjær (2,25 kg) ble blandet med etylazetat (225 ml) og omrørt i 30 min. Til dette ble 2.25 1 50 mM kaliumfosfatbuffer tilsatt ved pE 7.2 inneholdende 15$ ammoniumsulfat, 5 mm EDTA ig 0.1 mm ditiotreitol (DDT). Denne blandingen ble omrørt i 3 dager og pE ble justert daglig til pE 7.2 med et fast trihydroksymetylaminometan (tris). Celledebris ble fjernet ved sentrifugering ved 10.000 rpm i 15 min.

Trinn 2. Ammoniumsulfat separering

Totalt protein ble precipitert fra supernatanten i trinn 1 ved tilsetning av EDTA (1.8 g/l) og ammoniumsulfat (371 g/l) dertil slik at den finale konsentrasjonen av ammoniumsulfat var 70$ metning. Oppløsningen ble holdt ved 4°C i omtrent 16 timer, hvorpå precipitatet ble samlet ved sentrifugering. Pelleten ble løst opp i 1.5 1 50 mm kaliumfosfatbuffer ved pH 7.2 inneholdene 5 mm EDTA og 0,1 mm DTT og dialyse mot denne bufferen ble fortsatt i omtrent 12 til 16 timer.

EDTA (1,8 g/l) ble tilsatt til dialysatet, og ammoniumsulfat ble tilsatt for å oppnå 50$ metning (314 g ammoniumsulfat/l dialysat). Etter 1 t ble precipitatet sentrifugert og ytterligere ammoniumsulfat ble tilsatt til supernatanten slik at den finale ammonosulfatkonsentrasjonen var 73$ metning. Precipitatet ble samlet, løst opp i 1 1 20 mm trisbuffer ved pE 8.0 inneholdende 0.1 mm DTT, og dialysert kraftig mot denne bufferen i omtrent 12 til 16 timer.

Trinn 3. Anion- byttekromatografi

Dialysatet fra trinn 2 ble applisert på en 4.8 x 25 cm Q-separose (Pharmacia) kolonne som var ekvilibrert i 20 mm tris inneholdende 0.1 mm DTT ved pE 8.0. Kolonnen ble vasket, og enzymet ble eluert med en lineær gradient bestående av 0-0.3 M KC1 i ovennevnte buffer. Fraksjoner inneholdende CDase aktivitet ble slått sammen og konsentrert til omtrent 15 ml ved ultrafiltrering (Amicon, PM 30 filter).

Trinn 4. Gelg. 1ennomtrengn. ings kromatografi

CDase inneholdende oppløsning fra trinn 3 ble applisert på en G-75 Sephadex kolonne (2,5 x 100 cm) og eluert med PBS inneholdende 0.1 mm DTT. Fraksjoner inneholdende CDase aktivitet ble slått sammen og deretter realisert mot 4 1 av 100 mm kaliumfosfatbuffer inneholdende 1.8 M ammoniumsulfat, 5 mm EDTA og 0,1 mm DTT ved 7.0.

Trinn 5. Hydrofob interaks. ionskromatografi

Materialet fra trinn 4 ble applisert på en 2.5 x 15 cm oktyl-sefarose (Pharmacia) kolonne som ble ekvilibrert med 100 mm kaliumfosfat inneholdende 1.8 m ammoniumsulfat, 5 mm EDTA og 0. 1 mm DTT ved pH 7.0. Kolonnen ble vasket med denne bufferen, og enzymet ble eluert med en lineær gradient på 1.8-0 m ammoniumsulfat i ovennevnte fosfatbuffer. Fraksjonene inneholdende CDase aktivitet ble kombinert og konsentrert ved ultrafiltrering (Amicon, YM5 filter).

Trinn 6. Gelg. iennomtrengningskromatografi

En endelig gelfiltrering av materialet fra trinn 5 på G-75 sefadex ved anvendelse av PBS som elueringsmiddel ble utført som beskrevet i trinn 4. Det rensede enzymet ble konsentrert ved ultrafiltrering og lagret ved -70°C.

Resultatene trinn etter trinn av rensningen kan sees i Tabell 1. SDS-PAGE profiler, anvendt for å registrere proteinsammensetningen etter hvert rensningstrinn kan sees i figur

1. Det siste enzympreparatet besto av et hovedbånd ved omtrent 17 kDA og et mindre bånd ved omtrent 19 kDa.

Molekylvekten til CDase ble bestemt ved applisering av det rensede enzymet på en G-50 Sephadex kolonne sammen med ribonuclease A (13.7 kDa), chymotrypsinogen A (25 kDa) og ovalbumin (43 kDa). Fraksjoner ble registrert ved 280 nm for å måle totalt protein, og for CDase aktivitet ved anvendelse av 5FC som et substrat. CDase enzymaktivitet var sentrert ved omtrent 32 kDa (Figur 2a). Enzymet eluerte nøyaktig i samme volum når det ble applisert på kolonnen uten kalibrer-ingsstandarder (Figur 2B).

Stabiliteten til resnet CDase ved 37° C i fosfatbufret saltvann ved pH 7.2 ble bestemt ved anvendelse av 5FC som et substrat. En sakte reduksjon i enzymaktivitet ble observert etter forlenget inkubasjon (Figur 3). Under disse betingel-sene mistet enzymet halvparten av dets aktivitet etter 5.2 dager. Det var ikke noe tilsynelatende tap av enzymatisk aktivitet i de første 4 t av inkubasjonen (Figur 3 innskudd).

Eksempel 2

Aminos<y>resekvensen til CDase

Reagensene anvendt for sekvensering av CDase ble oppnådd fra Applied Biosystems, Inc. Oppløsningsmidlene anvendt for revers fase HPLC var fra Burdick og Jackson. 4-vinylpyridin var fra Aldrich Chemical Co., CNBr var fra Kodak og alle andre kjemikalier hadde reagenskvalitet. Endoproteinase Glu-C fra Sta<p>h<y>lococcus aureus ble oppnådd fra Miles Laborator-ies. Encoproteinase Asp-N fra Pseudomonas fragi og endoproteinase Lys-C tilveiebragt fra Boehringer Mannheim.

Automatisert sekvensanalyse ble utført på en modell 475A aminosyre sekvenator (ABI) ved anvendelse av RUN470-L eller PR0470-L programmene. Totalt 1.5 mg BioBrene (ABI) ble applisert og utsatt for to eller tre forcykluser av Edman degradering før applisering av prøven. Omdanning av tiazolinon derivater til fenyltiohydantoin aminosyrer ble utført med 25$ TFA ved 61°C. Fenyltiohydantoin aminosyre-derivater ble separert ved revers fase HPLC på en PTH C18 kolonne (2.1 x 220 mm, ABI) med en natriumacetat buffer inneholdende 5$ (v/v) tetrahydrofuran som utgangsbuffer og acetonitril inneholdende 500 nM dimetylfenyltiourea (ABI) som begrensende buffer på en modell 120A PTH analysator (ABI).

CDase og peptidfragmenter ble renset ved anvendelse av revers fase HPLC på en modell 130A separasjonssystem (Applied Biosystems, Inc.). Separasjonen ble utført ved 40°C på en RP-300 kolonne (2.1 x 30 mm; ABI). En lineær gradient på 0-60$ acetonitril i en 0.1$ vandig trifluoreddiksyre (TFA) over 2 t ved 0.1 ml/min ble anvendt for å eluere proteinene og peptidfragmentene. CNBr peptider, endoproteinase Lys-C peptider, endoproteinase Glu-C og endoproteinase Asp-N peptider ble anvendt for sekvensanalyse uten ytterligere rensning.

Omsetning av CDase med 4- vinylpyrldin

CDase fra eksempel 1, trinn 6, ble registrert ved tilsetning av 4-vinylpyridin på følgende måte. CDase ble redusert ved 20 mm ditiotreitol i 0,1 ml 0.4 M tris-HCl buffer, pH 8,5, inneholdende 6M guanidin-ECl, 0.1$ Na2EDTA ved 50°C i 2 t og deretter omsatt med 100 mm 4-vinylpyridin over natt ved romtemperatur. Eeaksjonsblandingen ble surgjort til pE 2.0 med 20$ TFA, avsaltet og renset ved revers fase HPLC som beskrevet ovenfor.

HPLC analyse av det resulterende produktet indikerte tilstedeværelse av to bestemte topper (Figur 4) som ble separert og på ny analysert ved SDS-PAGE (Figur 5). Den mindre toppen (sammenblanding A) korresponderte med 19 kDa båndet i Figur 1 og den større toppen korresponderte med 17 kDa båndet.

Amino-terminal aminosyresekvensen for proteinet i sammenblanding A (Figur 4) ble tilveiebragt ved identifikasjon av aminosyre fenyltiohydantoinderivatene opp til residiet 27. Sekvensen ble vist å være identisk med den N-terminale sekvensen til bakergjær superoksid dismutase (EC 1.15.1.1, Stelnman, 1980). Dette bestemte identiteten til det mindre båndet som sees i geler av renset CDase (Figur 1.5).

Ingen aminosyresekvens ble oppnådd fra Edman degradering av den store toppen i figur 4 (sammenblanding B), som tyder på at den aminoterminale enden til CDase var blokkert. Den delvise aminosyresekvensen til CDase ble derfor oppnådd ved sekvensering av valgte fragmenter fra enzymatisk og cyanogen bromid degradering, som beskrevet nedenfor.

Enzymatisk og k. lemisk spaltning av CDase

Spaltning av CDase som var modifisert med 4-vinylpyridin med endoproteinase Lys-C og endoproteinase Glu-C ble utført i 40 jjI 0.1 M tris-eddiksyrebuffer (pH 8.0) ved 37° C i omtrent 12- 16 timer. Enzym/substrat forholdet var 1:10 (v/v), respektivt. Endoproteinase Asp-N spaltningen ble utført på en lignende måte med et enzym/substratforhold på 1:100 ved 37° C i omtrent 12-16 timer. De enzymatiske spaltningene ble surgjort med 20$ TFA til pH 2.0 og separert ved revers fase

HPLC.

Cyanogen bromid (CNBr) ble anvendt for å spalte CDase ved metionyl residiene. CDase (2.25 nmol) som var modifisert med 4-vinylpyridin, ble rekonstituert i 40 pl 70$ maursyre og et 200-ganger molart overskudd av CNBr i 70$ maursyre ble tilsatt. Reaksjonen ble latt forløpe ved 35° C i 2 t, og deretter i omtrent 12-16 timer ved romtemperatur. Spaltningen var fortynnet med vann og vakuum-tørket for å fjerne overskudd CNBr. En oppløsning av revers fase HPLC analyse ble preparert i 1$ TFA.

Figur 6 viser delvis aminosyresekvens av CDase basert på fragmentene oppnådd fra cyanogen bromidspaltning, og proteolytisk spaltning ved anvendelse av enzymene, endoproteinase Glu-C, endoproteinase Lys-C og endoproteinase Asp-N. Et strekk på 154 aminosyrer ble identifisert omfattende hoveddelen av proteinet. Nummerering av aminosyreresidiene omfatter ikke aminosyrene nære ved den aminoterminale enden som enda ikke er blitt identifisert. Sammenligning av delvis CDase sekvens med hvilke som helst andre kjente sekvenser, inkluderet muse adenosin deaminase (Yeung et al., 1985) og bakergjær dCMP deaminase (Mclntosh og Haynes, 1986), viste ingen vesentlig homologi.

Eksempel 3

Kloning og ekspres. lon av CDasegenet

Genet som koder for CDase ble isolert fra laboratoriestammene av S. cerevisiae (bakergjær) og uttrykt i en pattedyr-cellelinje ved anvendelse av følgende metode: Trinn 1; Dannelse av CDase spesifikk probe ved anvendelse av

PCR

To oligonukleotid primere ble syntetisert på en automatisert DNA syntesemaskin ved anvendelse av den ikke fullstendige aminosyresekvensen og mønstrene for kodonanvendelse fra S. cerevisiae (Guthrie og Abelson, 1982) som en rettledning for konstruering av "guessmer" segmenter av DNA sekvensen. Disse oligonukleotidene ble deretter anvendt som primere i PCR med klonet gjærgenomisk bibliotek DNA tilstede som templat.

Primerene, betegnet CDA4R1 og CDA5AS, var begge 42-merer inneholdende 33 nucleotider av sekvens tilsvarende CDase pluss og minustråder, respektivt. Det gjenværende av hvert oligonucleotid kodet for restriksjons enzymsete til EcoRI. Sekvensen til de to primerene er vist i Figur 7.

Begge primerene var tilstede ved enten 50 eller 100 pmol pr. reaksjon. To genomiske bibliotek anvendt templat DNA i PCR reaksjoner ble konstruert fra gjærgenomisk DNA ved Sau3A delvis restriksjonsspaltning etterfulgt av ligering inn i BamHI seter på enten CV13 eller YCp50 skyttelvektor. Disse to vektorene og genomiske bibliotek er generelt tilgjengelige for folk innenfor dette fagområde, og ble oppnådd fra Department of Genetics ved University of Washington. Begge bibliotekene ble oppnådd allerede transformert inn i bakterielle verter. Bibliotek DNA ble isolert ved alkalisk lysis av plasmidpreparater som deretter ble renset ved sentrifugering gjennom cesium klorid-etidium bromid tett-hetsgradienter. PCR reaksjoner ble satt opp ved anvendelse av 1 pg CsCl renset CV13 eller YCp50 genomisk bibliotek DNA fra gjær, 50 eller 100 pmol av hver primer, 1/10 volum 10x PCR reaksjonsbuffer (Stratagene), 16/100 volum 1.25 mm dNTP (A, G, T, C), destillert vann med PCR kvalitet og 0.5 pl Taq DNA polymerase (5U/pl, Stratagene), til et finalt volum på pl. Reaksjonene ble utført i sterile mikrosentrifugerør under et 75 pl lag av renset mineralolje for å forhindre avdampning. PCR reaksjonene ble kjørt i en Perkin-Elmer Cetus Thermal Cycler i et 30-cyklus program med følgende temperaturskift: en trinns cyklus ved 94<0>C i 30 sekunder for å denaturere, 55°C i 45 sekunder for å sammensmelte og 72°C i 1.5 minutter (90 sekunder) for å utvide.

Aliquoter fra PCR reaksjoner ble analysert på agarosegeler for å bevise det antatte fragmentet med 350 basepar som koder for det meste av CDase. 350 basepar fragmenter ble deretter renset ved preparativ agarose gel elektroforese etterfulgt av eluering ved anvendelse av protokollen og reagensene tilført med GeneClean kit (BI0101) for å fjerne primerene og heterologe fragmenter fra preparatet.

Trinn 2: Subkloning av PCR fragmenter for sekvensering

PCR primerene fra trinn 1 ble omkonstruert med EcoRI restriksjonsseter ved deres 5' ender for å lette kloning av dannede fragmenter. En aliquot av renset 350 bp PCR-avledet fragment ble spaltet med restriksjonsenzymet EcoRI og ligert til EcoRI kuttet fagmidvektor pBSII-SK<+>(Stratagene). Restriksjonsenzymer ble tilveiebragt fra Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB). Spaltninger ble inkubert ved 37°C i 2 timer, etterfulgt av ekstraksjon med et likt volum fenol:kloroform:isoamyl alkohol, og etanolprecipitert. Fragmentet ble resuspendert i TE (10 mm tris-HCl pH 8,0, 1 mm EDTA pH 8,0) og legert sammen ved anvendelse av T4 DNA ligase (BMB). Kompetente JM109 bakterier ble transformert med 1/5 og ligeringsreaksjonen og hensiktsmessige fortynninger ble sådd ut på LB+ampicillin (100 pg/ml) skåler supplementert med XGal (50 pl av en 2% stamoppløsning i dimetylformamid) og IPTG (10 pl av en 100 mm stamoppløsning). Hvite kolonier ble plukket og plasmidpreparater i liten skala ble utført ifølge protokollene angitt i Sambrook et al. (1989). Plasmider ble screenet for 350 bp innskuddet ved spaltning ved EcoRI. Flere forskjellige isolater ble plukket, plasmid DNA ble isolert og renset og utsatt for DNA sekvensanalyse.

Trinn 3: Ved anvendelse av PCR fragmentet som en CDase spesifikk probe for screening av nærgenomiske biblioteker

PCR fragmentet oppnådd i trinn 1 ble også anvendt som en probe for påvisning av CDase kodende sekvensen ved screening av genomiske bibliotek for kloning inneholdene genet. Det rensede fragmentet ble merket ved anvendelse av a-^2P-dCTP og et tilfeldig primer DNA merkingskit fra Boehringer Mannheim Biochemicals. Gjærbibliotek ble dyrket over natt i LB+amp og fortynningene ble sådd ut på LB+amp skåler for å tilveiebringe kolonitettheter på 250-2000 kolonier pr. skål. Koloniuttak ble utført ved anvendelse av 0.45 pm nitro-cellulosesirkler eller firkanter fra Schliecher og Schuell. Filtrene ble bearbeidet ved plassering av disse med koloni-siden opp på Whatman 3MM papir mettet med 10$ SDS i 5 minutter for å fiksere, 0.5 NaOH, 1.5 NaCl i 5 minutter for å denaturere, 1.5 NaCl, 0 .5M TrisHcl pH 7.4 i 5 minutter for å nøytralisere og 2 X SSC i 5 minutter før UV-kryssbinding med en Statalinker (Stratagene), ifølge forhandlerens instruksjoner. Filtrene ble deretter nedsenket i 2 X SSC i 5 minutter og forvasket i 5 X SSC, 0,5$ SDS, 1 mm EDTA ved 50°C.

Prehybridisering ble utført i plastposer som kan forsegles med varme inneholdende 20 ml oppløsning pr. pose med 12 filtere. Prehybridiseringsoppløsningen inneholdt 50$ formamid, 6 X SSC, 0,01 M NaP pH 6.8, 1 mm EDTA (pE 8.0), 0,5$ SDS, 100 pg/ml denaturert laksesperm DNA og 5 X Denhardfs oppløsning. Plastposene ble nedsenket i et 42°C vannbad og inkubert i omtrent 12-16 timer. Merket probe ble renset fra uinnkorporerte nukleotider ved eluering fra Push-kolonner (Stratagene). Probe ble tilsatt ved omtrentlig IO<6>cpm/ml fluid og inkubert i omtrent 12 til 16 timer ved 42°C for hybridisering.

Filtrene ble vasket flere ganger i 2 X SSC, 0.1$ SDS ved romtemperatur, etterfulgt av en vask i 1 X SSC, 0,1$ SDS ved 55" C i 1 time. Filtrene ble lufttørket, dekket med saran-innpakning og utsatt over natt for røntgenfilm ved -70° C sammen med intensiverende skjermer. Autoradiografer ble oppstilt med filtrene og hovedskålene for selektering av kloner med et positivt hybridiseringssignal. Positive kloner ble på ny screenet ved metoden beskrevet ovenfor to ganger til før isolering av plasmidet. Plasmid DNA ble isolert ved dyrkning av kloramfenikol amplifiserte 500 ml LB+ampicillin kulturer og påfølgende rensning ved anvendelse av alkalisk lyseringsteknikken som beskrevet i Sambrook et al., 1989. Noen av plasmidene ble renset ved cesiumklorid ethidium bromid likevektssentrifugering, mens andre ble eluert fra PZ253 kolonner (5' -> 3') etterfulgt av precipitering med et polyetylenglykol, fenoltkloroformekstrahering og etanolprecipitering.

Trinn 4: Sekvensering av PCR- avledede og genomiske CDase-kodende kloner

Flere 18-mer oligonukleotider ble syntetisert eller oppstilt for sekvensering av DNA fra PCR og genomiske CDase kloner. Noen primere dannet sekvens fra den kodende tråden, mens andre ga sekvens fra den komplementære tråden. Sekvenser-ingsreaksjoner ble utført ifølge protokollene og reagensene tilført med Sequenase Version 2,0 Kit (United States Biochemical). DNA ble denaturert ved alkalisk denaturering ved 0,2 NaOH før sekvenseringsreaksjonene. Fortynninger av reaksjonsblanding for merking og reaksjonstider ble variert avhengig av regionen som det var ønsket sekvens av. I de fleste reaksjonene ble 1-1.5 pmol templat DNA og primere anvendt med 10-15 pCi a-^^S-dATP pr. reaksjon. PRøver ble applisert på 8$ polyakrylamid-urea sekvenseringsgeler og kjørt i 1-7 timer avhengig av sekvensen som blir avlest. Geler ble fiksert i 10$ metanol, 10$ eddiksyre i 10 minutter og tørket ved 80°C i 45 minutter ved anvendelse av en Slab-Gel tørker koblet til en vakuumpumpe. Tørkede geler ble utsatt for Kodak XAR-5 film ved romtemperatur i 18-72 timer. Sekvenser ble avlest manuelt. Oppstilling og analyser av sekvensdata ble utført av datamaskin ved anvendelse av Gene Pro Software (Riverside Scientific, Seattle, Washington). Figur 8 viser nukleotidsekvensen til genomiske CDase-kodende kloner. Figur 10 viser antatt aminosyresekvens. Som figurene viser består den kodende sekvensen av omtrent 474 basepar og spesifiserer et protein med 158 aminosyrer. Antatt molekylvekt til CDase tilveiebragt på denne måten er omtrent 17,506 dalton.

Trinn 5: Konstruksjon av CDase- kodende kassetter for ekspressjon i gjær og pattedvrsvstemer

DNA sekvensen tilveiebragt fra trinn 4 ble anvendt for konstruering av oligonukleotidprimere for PCR-dannede kassetter kodende for CDase. Noen av disse oligonukleotidene inkorporerte ytterligere sekvenser så som sekretoriske signalpeptider og restriksjonsseter for anvendelse ved kloning eller ekspressjon. 01igonukleotidprimere ble anvendt i par for å danne PCR fragmenter hvor hensiktsmessige sekvenser var blitt tilsatt til endene.

En kassett kodende for CDase ble konstruert ved PCR ved anvendelse av to primere inneholdende både CDase spesifikk sekvens og ytterligere sekvens kodende for restriksjonsseter for kloning. 5' primeren var 65-mer inneholdende 45 baser med sekvens homolog men ikke fullstendig identisk med 5' enden til den genomiske kopien av CDase koblet til en 5' hale inneholdende restriksjonssetene Eindlll, Sali og Ncol. 3' primeren var en 39-mer identisk med minustråden ved den C-terminale enden av CDases, med en Xbal hale koblet til 5' enden derav. Templatet som ble anvendt var den genomiske klonen av CDase ved omtrent 1 ng pr. reaksjon. Hver primer var tilstede i en konsentrasjon på 75 pmol. PCR reaksjonene ble utført som beskrevet i trinn 1.

PCR reaksjonsproduktene ble renset ved ekstrahering med kloroform og etanolprecipitering. DNA ble deretter spaltet med restriksjonsenzymene Eindlll og Xbal, utsatt for gelelektroforese og grenset ved eluering med GeneClean (B10101) ifølge forhandlerens instruksjoner.

Trinn 6: Ekspressjon av CDase i et pattedyrsystem Renset fragment fra trinn 5 ble legert til Hindlll-Xbal spaltet CDM8 eller pH3M plasmidvektor og transformert inn i bakteriell vert MC1061 (Aruffo og Seed, 1987). Et kart av pH3M vektoren er vist i Figur 12. Tyve transformanter ble plukket, plasmidprepareringer i liten skala ved alkalisk lysering ble utført og aliquoter spaltet med Hindlll+Xbal for å verifisere strukturen. Gjenværende plasmid fra tre av prepareringene ble anvendt for transfeksjoner av COS celler vde bruk av DEAE-Dextran transfeksjonsmetoden (Ausubel, et al., eds. Current Protocols in Molecular Blology).

3.5X10<5>COS celler ble sådd ut på 6 cm kulturskåler i DMED/IOÆ fetalt bovint serum (FBS) og inkubert over natt i 6$ CO2ved 37°C. DNA fra mini-preparatene ble blandet som en cocktail med PBS og 50 mg/ml DEAE-Dextran til et totalt volum på 100 pl i mengdene angitt nedenfor.

CDase Transfektanter

Hver transfeksjon ble utført i duplikat. Dagsgammelt kulturmedium ble sugd opp fra skålene og cellene ble vasket tre ganger i 2 ml PBS pr. vask. DMEM-kloroquine trans-feksjonsmedium ble tilsatt til 1.7 ml/skål, og DNA cocktailen ble dråpevis tilsatt til mediet. Transfeksjoner ble inkubert i 3 timer, medium fjernet, cellene utsatt for sjokk med FBS/10$ DMSO i 2 minutter, vasket tre ganger i serumfritt medium og inkubert 3 dager i 3.5 ml DMEM/10$ PBS pr. skål.

Trinn 7: Karakterisering av rekombinant ekspressjons-produkter

1. Radioimmunprecipitasjoner:

Skålene fra trinn 6 som skulle bli anvendt for radio-immunprecipitasjon (RIPS) ble inkubert i omtrent 12 til 16 timer i frisk DMEM/10$ FBS inneholdende 200 pCi/ml<35>S-metionin.

RIPS ble utført ved oppsuging av merket medium etter omtrent 12 til 16 timers inkubasjon ved 37°C, tilsetning av 1 ml 1$ 0G-P04RIPAE (50 mm Na2HP04, 1$ Nadeoxycholat, 1$ triton X-100, 0,1$ SDS, 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 5 mm EGTA, 2 mm PMSF og 1 pg/ml aprotinin=P04-RIPAEmed oktoglukosid tilsatt til 1$) buffer til hver kulturskål, og inkubering i 10 minutter på is. Lysater ble overført til 10 ml Oak Ridge sentrifuger-ingsrør og sentrifugert ved 40.000 rpm, 4°C i 40 minutter. Supernatanter ble overført til to mikrosentrifugerør på is (0.4 ml/rør). BB1 transf ektanter ble inkubert med 2 pg antistoff, mens 17.5 pl eller 31.5 pg kanin antiCDase polyklonalt antisera ble tilsatt til de andre transfektantene. RIPS ble inkubert på is i 1 time. Geit anti-mus ble tilsatt til BB1 røret som sekundært antistoff og inkubert 20 minutter på is.

Staphylococcus aureus (Calbiochem) ble vasket (700 pl) i 0,5$ NP-40/TES buffer, deretter i 0,05$ NP-40/TES buffer og til slutt resuspendert i P04-RIPAE buffer med 1 mg/ml ovalbumin (TES-50 mm Tis-ECl, pH 7,4, 1 mm EDTA, 150 mm NaCl). Femti pl aliquoter av vasket StaphA bakterier ble tilsatt til RIP materialet og inkubert i 10 minutter på is. RIPS ble pelletert i mikrosentrifuge og vasket tre ganger i 0.5 ml TNEN (20 mm Tris-HCl pH 8.0, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 0,5$ NP-40). Pelletene til slutt fra opprinnelige 400 pl duplikat-prøver ble resuspendert i enten 35 pl reduserende eller 35 pl ikke-reduserende SDS-PAGE løpende buffer. Prøver ble applisert på en 10-20$ SDS-PAGE gradient gel sammen med proteinmarkører med lav molekylvekt fra Bio-Rad og elektro-forert ved 300 volt i omtrent 2 timer. Geler ble farget i Coomassie blå i 1 time, avfarget i 10$ metanol, 5$ eddiksyre i omtrent 12-16 timer, utsatt for forsterker i 30 minutter og deretter vasket tre ganger i vann før tørking ved 60° C i 1 time. 4 timers utsetting av gelen for røntgenfilm demon-strerte ikke 17.000 daltonbåndet i kontrollprøvene, ikke 17.000 daltonbåndet i BB1 prøvene men et spesifikt bånd rundt 45.000 dalton i BB1 prøvene, mens alle tre transfektantene viste et spesifikt bånd ved omtrent 17.000 dalton.

2. Western analyser:

Transfeksjonsskåler i duplikat fra trinn 6 ble beholdt umerkede og høstet etter inkubasjonsperioden på tre dager. Mediet ble sugd av, cellene vasket i PBS, deretter suspendert i 0,5 ml 10 mm Tris-HCl (pH 8,0) inneholdende 1 pg/ml aprotinin og 30 pg/ml PMSF. Cellene ble fjernet fra kulturskålene ved anvendelse av sterile skraperedskaper og utført til sterile mikrosentrifugerør på is. Hver suspensjon ble sonikert på is i utbrudd på 2-15 sekunder med full kraft. Lysatene ble sentrifugert i 20 minutter i et avkjølt mikrosentrifugerør for å fjerne celledebris, og super-natantene ble overført til nye rør. Enzymanalyser ble utført som beskrevet nedenfor.

Aliquoter fra disse lysatene ble også anvendt for å utføre Western blottinger ved anvendelse av polyklonalt kanin antiserum tilveiebragt mot renset CDase. 25 pl aliquoter av ufortynnede transfektant lysater ble utsatt for SDS-PAGE elektroforese som beskrevet for RIPS, med unntagelse av at fortynninger i serie av renset CDase enzym ble applisert på gelen som konsentrasjonsstandarder. Konsentrert CDase ved 500 ng/kolonne "ble fortynnet i 5-ganger porsjoner til 100 ng, 20 ng, 4 ng og 0,8 ng/kolonne. Gelen ble deretter elektro-blottet til et nitrocellulosefilter ifølge protokollene i CSH kloningsmanualen (Sambrook et al., 1989).

Blottene ble blokkert i Blott i 1 time (Blotto=PBS + 1$ ikke-fet melk + 0,5$ NP-40). Frisk Blotto inneholdende 2.5 pg/ml polyklonalt kanin antiCDase sera ble tilsatt til filteret og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Filteret ble vasket tre ganger i 5 minutter i Blotto, etterfulgt av en inkubasjon i alkalisk fosfatase konjugat (Boehringer Mannheim Biochemicals) fortynnet 1:1.000 i Blotto. Antistoff konjugat i overskudd ble fjernet med tre vaskinger i Blotto og tilslutt en vask i alkalisk fosfatasesubstrat buffer (100 mm Tris-HCl pH 9,5, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl^). Filteret ble deretter inkubert i 15 minutter i 40 ml av substratbuffer tilsatt 12 mg bromkorindolyl fosfat og 7 mg nitroblå tetrazolium for å utvikle fargen. Reaksjonene ble stoppet ved vasking av filteret i destillert vann.

Ved fargeutvikling viste de tre transfektantene alle bånd som migrerte ved omtrent 17.000 dalton med intensiteter høyere enn 0.8 ng og mindre enn 4 ng konsentrasjonsstandarder for renset CDase. 3. Målinger av aktivitet til rekombinant uttrykt CDase Omdanning av 5-fluorcytosin (5-FC) til 5-fluoruracil (5-FU) ble målt i ekstraktene fra overfor transformerte COS celler. Transfektanter (3 x IO<5>celler hver) inneholdende CDase (1-1, 1-4, 2-6), kontrolltransfeksjon eller kontroll plasmid transfeksjon (BB1) ble sonikert i 0.5 ml 10 mm TRIS buffer og sentrifugert. Til 100 pl av hver supernatant og 1 pg/ml oppløsning av CDase ble 170 pl fosfatbufret saltvann (PBS) og 30 pm av en 30 mm 5-FC oppløsning tilsatt. Dette ga en 300 pl reaksjonsblanding med 3 mm 5-FC. En kontrollreaksjon uten enzym ble også utført.

Disse rørene ble inkubert i 24 timer ved 37°C, 50 pl av hver oppløsning ble tatt ut og reaksjonen ble stoppet i 1 ml 0.1 N HC1. Disse prøvene ble målt på et UV spektrofotometer ved 255 og 290 nm. Ved dannelse av ligningene: (0.1191 X O<D>290- 0.02485 X OD255) X 20 = mm 5-FC og (0.1849 X OD255 -<0>.04907 X OD290) X 20 = mm 5-FU,

ble mengden av omdanning av 5-FC til 5-FU målt. Antall aktivitetsenheter i opprinnelig celleekstrakt ble deretter kalkulert (1 enhet = 1 pmol/min omdanning av 5-FC til 5-FU). Kontrollprøven og BB1 transfeksjonene samt reaksjonen uten enzym viste ingen aktivitet, mens alle tre transfektantene viste CDase aktivitet. Transfektant 1-1 hadde 0.41 X IO"<3>enheter, 1-4 hadde 0.54 X IO"<3>enheter og 2-6 hadde 0.26 X 10"<3>enheter. Kontrollanalysen med 1 pg/ml CDase omdannet all 5-FC til 5-FU. Forutsatt at ren CDase har en aktivitet på 40 U/mg, ble 10 ng (1-1), 13,5 ng (1-4) og 7,3 ng (2-6) aktivt CDase uttrykt.

De samme prøvene ble også undersøkt i en uavhengig analyse. Hvert analyserør omfattet 50 pl supernatant eller 1 pg/ml CDase, 130 pl PBS, 20 pl 30 mm 5-FC og 1 uCi [<3>H] 5-FC. Disse reaksjonene ble inkubert i 24 timer, avdampet til en rest som på ny ble oppløst i 20 pl metanol, og applisert på silikagel tynnsjiktskromatografi (TLC) plater. Platene ble utviklet i 96:4 aceton/vann, hvori Rf' for 5-FC og 5-FU er 0.2 og 0.8, respektivt. Hensiktsmessige deler av TLC platene ble kuttet ut og plassert inn i scintillasjonsvæske. Disse ble talt i en scintillasjonsteller og relative mengder av 5-FC og 5-FU i hver prøve ble bestemt. Blankprøvene og BB1 analysene ga ikke 5-FU, mens alle transfektantene omdannet 14$ 5-FC til 5-FU. Dette kan overføres til 0.6 X IO-<3>enheter pr. prøve, som derved bekrefter mengdene beregnet i UV eksperimentet. Kontrollreaksjon med 1 pg/ml CDase omdannet all 5-FC til 5-FU.

Eksperimenter viser at CDase transfektanter uttrykker aktivt enzym. Dette, sammen med Western blot analyser, viser at den spesifikke aktiviteten til rekombinantenzymet er lik det som blir isolert fra gjær.

En termisk stabil CDase er blitt beskrevet, samt fremgangsmåter for rensing og rekombinant produsering av samme.

Referanser.

Aruffo, A., og Seed, B., PNAS( USA) 84:8573-8577.

Ausubel, F.M., et al. (eds.), .1988 Current Protocols in Molecular Biolo<gy>. (Green Publishing Associates, N.Y.). Edge, (1981) Nature 292:756.

Guthrie, C, og Abelson, J., (1982) The Molecular Biology og the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression.

pp. 487-528, (J. Strathern et al. eds., CSH).

Hellstrom, (1984) Monoclonal Antibodies and Cancer.

pp. 31-47 (Wright et al., eds., Marcel Dekker, Inc., N.Y.). Hellstrom, K.E., og Hellstrom, I., (1985) Monoclonal Antibodies for Tumor Detecting and Drug Targeting.

pp. 17-51 (Baldwin et al., eds., Academic Press, N.Y.). Hovland, P., et al., (1989) Gene 83:57-64.

Ipata, P.L., et al., (1971) Biochemistry 10:4270-4276.

Ipata, P.L. og Cercignani, G. (1978) Meth. Enz. 51:394-401. Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Johnston, M. (1987) Microbiol. Rev..51:458-476.

Katsuragi, T. (1988) Personal communication.

Katsuragi, T., et al., (1986) A<g>ric. Biol. Chem. 50:1721-1730.

Katsuragi, T., et al., (1987) App. Biochem. Biotech. 16:61-69.

Kream, J. og Chargaff, E. (1952) J. Amer. Chem. Soc. 74:5157-5160.

Kunitz, M.J. (1947) J. Gen. Physiol. 29:393.

Malik, N., et al., (1989) MCB 9:22847-2853.

Mclntosh, E.M. og Haynes, R.H. (1986) Mol. Cell Biol. 6:1711-1721.

Nishiyama, T. , et al., (1985 ) Cancer Res. 45:1753-1761. 0'Donovan, G.A. og Neuhard, J. (1970) Bact. Rev.

34_:278-343.

Sakai, T., et al., (1985) J. Biotech. 2:13-21.

Sakai, T., et al., (1986) Nature 324:163.

Sakai, T., et al., (1988) Science 239:487-491.

Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

2. utg. (1989) (CSH Press).

Scharf, et al., (1986) Science 233:1076.

Scopes, R.K. Protein Purification Principles and Practlce 2. utg. (Springer Verlag 1987).

Senter, P.D. et al., (1987) U.S. Patent App. 081 382. Stamenkovic, 1990 (in press).

Steinman, H.M. (1980) J. Biol. Chem. 255:6758-6765♦

West, T.P., et al., (1982) Biochim. Biophvs. Acta 719:251-258.

Yergatian, S., et al., (1977) Ex<p>erientia 33:1570-1571. Yeung, C.Y., et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:10299-10307.

Claims (5)

1. Isolert nukleinsyre molekyl kodende for en termisk stabil cytosin deaminase,karakterisert vedat nukleinsyremolekyler koder for cytosin deaminase med aminosyresekvens som angitt i figur 10, eller koder for et protein funksjonelt ekvivalent dertil med samme biologiske aktivitet som forblir minst 50$ aktiv i fri, ikke-immobilisert tilstand i mer enn 12 timer ved 37° C, som bestemt ved registrering av omdanningen av 5-fluorcytosin til 5-fluoruracil.

2. Rekombinant ekspresjonsvektor,karakterisertved at den omfatter og effektivt kan uttrykke nukleinsyremolekyl ifølge krav 1.

3. Rekombinant ekspressjonsvektor ifølge krav 2, karakter isert ved at nukleinsyremolekylet er operabelt koblet til kontrollsekvenser kompatible med en vertscelle.

4. Vertsceller,karakterisert vedat de er transformert med rekombinant ekspresjonsvektor ifølge krav 3.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant termisk stabil cytosin deaminase omfattende en aminosyresekvens som angitt i figurene 6 eller 10, eller et protein funksjonelt ekvivalent dertil med samme biologiske aktivitet som forblir minst 50$ aktiv i fri, ikke-immobilisert tilstand i mer enn 12 timer ved 37°C, bestemt ved registrering av omdanningen av 5-fluorcytosin til 5-fluoruracil,karakterisertved at den omfatter: (a) tilveiebringing av en vertscelle ifølge krav 4; (b) dyrking av nevnte vertscelle under betingelser som tilveiebringer ekspresjon av cytosin deaminasen; og (c) isolering og rensing av nevnte cytosin deaminase. Sammendrag Termisk stabil cytosin deaminase (CDase), og genet som koder for denne samt fremgangsmåter for isolering, rensing og rekombinant fremstilling derav er beskrevet. Termisk stabil CDase kan bli isolert fra Saccharomyces cerevisiae. Enzym isolert fra gjær har en molekylvekt på omtrent 32 kDa, bestemt ved gelfiltreringskromatografi, og består av to subenheter, hver med en molekylvekt på omtrent 17 kDa. Termisk stabil gjær CDase renset på denne måten viser ingen signifikant sekvenshomologi med andre kjente sekvenserte proteiner.