CN1052263C - 热稳定性胞嘧啶脱氨酶 - Google Patents

Abstract

本文公开了热稳定胞嘧啶脱氨酶(CDase)和它的编码基因，以及它们的分离，纯化和重组生产方法。该热稳定性胞嘧啶脱氨酶可以从啤酒酵母中分离出来，该酵母分离酶通过凝胶过滤色谱分析测定，具有大约32千道尔顿的分子量，并且由两个亚单位组成，每个亚单位的分子量约为17千道尔顿。如此纯化的热稳定性酵母胞嘧啶脱氨酶与其他已知序列的蛋白质没有表现出明显的序列同源性。

Description

热稳定性胞嘧啶脱氨酶

本发明大体上涉及胞嘧啶脱氨酶，更明确地说本发明涉及到纯化和重组生产一种从啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中获得的热稳定性胞嘧啶脱氨酶。

胞嘧啶脱氨酶(CDase，EC，3.5.4.1)催化下列反应使胞嘧啶水解成尿嘧啶。

已经从几种不同的微生物中分离出这种在微生物嘧啶代谢中起着重要作用的酶(O′Donovan and Neuhard，1970)，但是没有发现存在于哺乳动物细胞中(Nishiyama et al.，1985)。

从各种微生物中得到的胞嘧啶脱氨酶(CDase)的物理性质在分子量、稳定性和亚单位组成方面表现出明显的差异性。例如从鼠伤寒沙门氏菌中得到的胞嘧啶脱氨酶已被纯化成同种(通过SDS-PAGE)，是由4个分别为54千道尔顿(KDa)的亚单位组成(West等，1982)，而从大肠杆菌(Escherichia coli)中得到的这种酶具有200千道尔顿(KDa)的分子量，是由35和46千道尔顿(KDa)的亚单位组成(Katsuragi等，1986)。这些酶都具有高度的热稳定性，并且在55℃时保持高活性。

啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)也可以作为胞嘧啶脱氨酶的一个来源，以前从该酵母中得到的胞嘧啶脱氨酶的分子量，用凝胶过滤法测定为34千道尔顿(KDa)(Ipata等，1971，1978)，而通过SDS-PAGE和氨基酸分析测定为32—33千道尔顿(KDa)(Yergatian等，1977)。因而从前从啤酒酵母中分离出的这种胞嘧啶脱氨酶(CDase)是一种单体蛋白。

以前分离到的啤酒酵母胞嘧啶脱氨酶溶液，在4℃ PH为5-9之间存放时活性至少保持48小时(Ipata等，1971，1978)。但是在37℃下，一种啤酒酵母胞嘧啶脱氨酶的粗制品在1小时内活性失去一半(Kream and Chargaff，1952)，而这种酶的纯制品具有30分钟的半衰期(Katsuragi，1988)。通过将这种酶固定在环氧丙烯酸(epoxyacrylic)串珠上可以使其在37℃的半衰期提高到28天(Katsuragi et al.，1987)。因此，可以通过啤酒酵母胞嘧啶脱氨酶的热不稳定性和它的低分子量，将它与早期所描述的细菌酶区分开。

在治疗学上已经使用胞嘧啶脱氨酶。将前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)转化成抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶(5-FU)(Katsuragi et al.，1987；Nishiyama etal.，1985；Sakai et al.，1985；Senteret al.，1987)。尽管如此，由于需要大量地培养才获得足够的活性，在这种应用当中以细菌作为胞嘧啶脱氨酶的来源是不现实的(Sakai et al.，1985)。另外，微生物提取物给受体带来一些不好的副作用。

使用酵母作为胞嘧啶脱氨酶的来源可以克服这些问题。但是，以往从酵母中所得产品由于具热不稳定性在使用之前需要将这种酶进行固定(Katsuragi et al.，1987)。因此，分离和纯化一种热稳定性酵母胞嘧啶脱氨酶，可以提供一种应用于抗肿瘤治疗中改良酶。同样，对来自酵母的热稳定性胞嘧啶脱氨酶基因的克隆，可以向该基因本身或控制其表达的序列中掺入特定的变体或附加物，以及在该基因和其他分子之间进行基因融合。这样新的结构可以增强该酶在抗肿瘤治疗中的疗效或作用。

本发明基于从啤酒酵母中意外地发现了一种热稳定性的胞嘧啶脱氨酶。对于这种酶的氨基酸顺序分析显示与其他已知蛋白质的顺序没有明显的同源性。

本发明涉及一种编码热稳定性胞嘧啶脱氨酶或一种功能上等同的蛋白质的离体的核苷酸序列，和含有并且有效表达这种顺序的重组体表达载体，被转化的宿主细胞，以及利用重组体制备热稳定性胞嘧啶脱氨酶或它的功能等同物的方法。

本发明还涉及到分离到的热稳定性胞嘧啶脱氨酶，或一种功能上与它等同的蛋白质。其中一个优选实例是从啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中分离到的胞嘧啶脱氨酶。

另外，根据本公开说明书，本发明与本领域内的普通技术具有相同的利益和作用。

在做为本说明书一部分的附图当中：

图1表示胞嘧啶脱氨酶的SDS-PAGE分析(在非还原性条件下14％的聚丙烯酰胺)。每条谱带所代表的物质如下：谱带1和9，标记蛋白质；谱带2，来自实施例1中步骤1的自溶上清液；谱带3，实施例1中步骤2的(NH₄)₂SO₄沉淀(70％)后的产物；谱带4，实施例1中步骤2的(NH₄)₃SO₄(50-73％)沉淀后的产物；谱带5，实施例1中步骤3的Q-sepharoso层析分析后得到的产物；谱带6，实施例1中步骤4过G-75柱子之后的产物；谱带7，实施例1中步骤5的octyl-Sepharose纯化后的产物；谱带8，实施例1中步骤6的第二个G-75柱子纯化后的最终产物。

图2表示胞嘧啶脱氨酶从一个G-50 Sephadex柱子(1.5×100CM)中的洗脱后的轮廓图。(A)将27单位(U)的纯化胞嘧啶脱氨酶和核糖核酸酶A(2mg)，卵白蛋白(2mg)和胰凝乳蛋白酶原A(1mg)混合，并用PBS洗脱。在280nm下测定分馏物以确定总蛋白含量，并在290nm下用5FC做为底物测定胞嘧啶脱氨酶的活性。(B)在没有校准标准的情况下从上述的G-50 Sephadex柱子中洗脱胞嘧啶脱氨酶。

图3表示胞嘧啶脱氨酶在37℃时的稳定性。将含胞嘧啶脱氨酶(72U/mg)和无蛋白酶的BSA(1mg/ml)的PBS在37℃下于聚丙烯试管中进行温育。在不同时间间隔内取10μl的酶溶液测定胞嘧啶脱氨酶的活性。

图4表示HPLC纯化的胞嘧啶脱氨酶的横线表示收集用来进行氨基酸顺序分析的部分。

图5表示在HPLC纯化之后对胞嘧啶脱氨酶的SDS-PAGE分析(还原性条件下15％的聚丙烯酰胺)。谱带1，收集物A，谱带2，收集物B。

图6描绘了胞嘧啶脱氨酶的部分氨基酸顺序。表示用CNBr(M-series)，内切蛋白酶GLu-C(E-series)，内切蛋白酶Lys-C(K-series)和内切蛋白酶Asp-N(D-series)切割所得到的肽段。

图7表示引物CDA4R1和CDA与AS的核苷酸序列，相应的氨基酸顺序，和这些引物在胞嘧啶脱氨酶氨基酸顺序中的相对位置。CDA4R1的定向是在有意义链上从5′到3′，而CDA5AS的定向是在反义链上从5′到3′。

图8表示从编码胞嘧啶脱氨酶的基因组克隆中得到的核苷酸序列。

图9表示存在于胞嘧啶脱氨酶的基因组序列中的开放阅读框架(ORFS)。

图10表示ORF_a的核苷酸顺序和相应的氨基酸顺序。从该核苷酸顺序推知但在肽序列分析中没有测到的一些附加氨基酸以黑体字加以突出表示，而起始和终止密码子则以方框划出。

图11表示含有胞嘧啶脱氨酶基因的质粒表达载体“融合体(fusionator)”。

图12表示PH3M载体的结构图。

本发明在实施中，除了另外说明之外，将运用现有技术中蛋白质化学、分子生物学、微生物学和重组DNA技术中的常规方法。这些方法在参考文献中有充分的解释说明。见，如，Scopes，R、K.，蛋白质纯化原理和操作(Protein PurificationPrinciples and Practice)，第二版。(Springer-Verlag 1987)；酶学方法(Methods inEnzymology)(S.colowick and N.Kaplaneds.，Academie Press.lnc.)；maniatis，Fritsch和Sambrook，分子克隆；一种实验室手册(Molecular Cloning；A laboratory Manual)，第二版(1989)；寡聚核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)(M.J.Gait ed.1984)。

在描述本发明过程中，将使用下列术语，在这里它们的含义如下所述。

“热稳定性胞嘧啶脱氨酶”是指一种在游离，非固定状态下于37℃放置超过12小时，尤其是于37℃超过1天，最好于37℃超过3天仍保留至少50％活性的胞嘧啶脱氨酶，可通过下面更为详细描述的方法在该离体酶存在下测定5FC向5FU的转化来测定其活性。

当至少大约50％，尤其至少大约85％，最好至少大约90-95％的氨基酸和该分子的一特定长度相匹配时，一种氨基酸顺序或蛋白质与另一种氨基酸顺序和蛋白质是“基本上同源。”另外，氨基酸变异可包括取代、缺失或增加。

术语“功能上等同”是指该氨基酸系列或蛋白质定义一条链，该链产生一种如上所述的热稳定性酶，并能象实施例中所描述的将5-FC转化成5-FU。一种功能上等同于热稳性胞嘧啶脱氨酶的蛋白质不需要具有图中所描述的精确的或全部氨基酸系列。再者，该蛋白质可以包括一个生物活性片段，该活性定义如上。另外，该蛋白质可包含所描绘系列的累加、缺失或取代变异体，只要该蛋白质保留了生物活性即可。

一种“纯化蛋白质”是一种基本上不含其他物质的蛋白质，例如，蛋白质A基本上不含B，而B是一种其他细胞成份和蛋白质的混合物，当A中有B存在时，A至少约占总重量的50％，优选是至少75％，最好是90-95％或甚至99％重量时，该物质是A。但“被纯化”并不是指获得蛋白质的方法。因此，一种纯化蛋白质可以是一种通过重组方法制备的，合成产生的，或从一种天然含有该蛋白质的微生物中直接分离出来的蛋白质。

术语“多肽”和“蛋白质”使用其最广泛的含义，例如任何通过肽键连接的氨基酸聚合体(二肽或更大的肽)。因此，该术语包括寡聚肽，蛋白质片段，类似物，突变蛋白质，融合蛋白质等等。该术语包括天然和重组蛋白质。

“重组”蛋白质或多肽是指由一种重组核苷酸序列表达的蛋白质；例如指由编码所需多肽的外源DNA结构转化后的细胞中产生的。

这里所用术语“重组体”表示编码胞嘧啶脱氨酶的核苷酶序列的特征，是指基因组、CDNA、半合成或合成起端的核酸，该核酸既可以是一种不存在自然界的核苷酸序列或者是一种依靠它的起端或控制连结到核酸上而不是自然连结上的核苷酸序列。

“复制子”是指与细胞内存在的多核苷酸复制的一个自主单位起相同作用的任何遗传因素(例如，质粒，染色体，病毒)；如：能够在其自已控制下进行复制。

“载体”是一种复制子，它可连接上另外一个多核苷酸片段并促使该片段复制和/或表达。“表达载体”是指一种能够自主复制或整合的载体，它含有能指引所期望的核苷酸序列在合适的宿主内进行转录和转译的控制序列。

“编码顺序”是指一种能被翻译成和/或转译成为一种多肽的多核苷酸顺序。

“启动子顺序“是一种能够结合RNA聚合酶并能启动下游的(即沿3′方向)编码顺序转录的DNA调节区。

在细胞内一个编码序列是受启动子序列控制的，当RNA聚合酶结合到启动序列上时编码序列进行转录，所得mRNA的转译即产生一个由编码序列编码的多肽。

“合用性连接”是指将几种成份并置形成一定结构，使它们行使正常的功能。因此，合用性连接到一个编码顺序上的控制顺序能够实现该编码顺序的表达。

“控制序列”是指控制编码序列转录和/或翻译的那些序列；这些可以包括，但不局限于此，启动序列，转录起始和终止序列，和翻译起始与终止序列。另外，“控制序列”指那些能控制由编码序列编码产生的多肽的加工过程序列；这些可以包括，但不局限于此，控制多肽的分泌、蛋白酶切割和糖基化的序列。

“信号顺序”位于编码顺序之前。这个顺序编码一种信号肽，即多肽的N-末端，它传送到宿主细胞以指引该多肽朝向细胞表面或使该多肽分泌到介质中。这个信号肽在蛋白质离开细胞之前被宿主细胞切掉。可以发现信号顺序和各种天然存在于原核生物或真核生物的蛋白质连接在一起。例如，α-因子，一种天然酵母蛋白，是从酵母中分泌出来的，它的信号顺序可以被连结到异源蛋白质上分泌到介质中去(见美国专利4,546,082)。再者，已经发现这种α-因子和它的类似物可以从几种酵母，如酵母属和克鲁弗氏酵母属中分泌异源蛋白(见，如欧洲公开专利No，0301669，公开日1989年2月1日)。

“转化”是指外原性多核苷酸插入宿主细胞内。该外原性多核苷酸可以保持为一种质粒，或者也可以被整合到宿主基因组中去。

“重组宿主细胞”，“宿主细胞”，“细胞”和其他表示微生物的这种术语是可以交换使用的，是指那些可以，或者已经被用作重组载体或其他被转化的DNA的受体的细胞，并包括被转染的原始细胞的后代。应当指出的是，由于偶然或有意地突变，一种单亲代细胞的后代不一定与原来亲代细胞完全相同。因此，这些术语表示那些尽可能有类似于亲代相关特征的亲代细胞的后代，例如，用一种连接到可编码所需基因产物的结构基因上的克隆基因来替代一种可编码原发酶的天然基因。

胞嘧啶脱氨酶的“治疗有效量”是指当CDase与该酶的作用低物联合用药时，与该酶的量足以将该底物转化成一种能抑制肿瘤细胞生长的有效细胞毒性因子。

本发明涉及到一种具有热稳定性的从酵母中分离出来的胞嘧啶脱氨酶。这种胞嘧啶脱氨酶具有能与以前从酵母中分离出的胞嘧啶脱氨酶相区别的特性有所不同。通过凝胶过滤层析法测定新分离的酵母胞嘧啶脱氨酶的分子量大约是32KDa。通过SDS-PAGE分析显示在17KDa有一大的谱带，表明该胞嘧啶脱氨酶由一个二聚体构成，每个亚单位的分子量大约17KDa。另外，以往分离的酵母胞嘧啶脱氨酶当处于37℃时已表现出高度的热不稳定性，而本发明的纯化酶在这个温度下是稳定的。再者，该新胞嘧啶脱氨酶的氨基酸顺序与其他已知序列蛋白质没有明显的同源性。编码这一独特胞嘧啶脱氨酶的基因的克隆和表达可产生一个大约474碱基对长度的编码序列，由此产生一个有158个氨基酸和预计分子量大约为17,506道尔顿的蛋白质。热稳定性胞嘧啶脱氨酶可从酵母，包括形成子囊孢子和担孢子的成员，和半知酵母菌中分离。尤其是胞嘧啶脱氨酶可从酵母菌亚纲(Saccharomycetoidease)族，较优选的是酵母属内的各个种，特别是啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中分离。已发现弗莱施曼氏浓缩酵母(Fleishman′s  Compressed yeast)可以做为热稳定性胞嘧啶脱氨酶的极好来源，而且是在商业上从面包厂和杂货店容易得到的。

本发明纯化胞嘧啶脱氨酶的方法与已报道的方法不同(见，如，Katsuragi et al.，1987；Katsuragi etal.，1986；Ipata et al.，1978；Ipataet al.，1971)和Katsuragi，1988年的方法也不同。特别是，该方法使用了不同的纯化步骤，包括在阴离子交换和疏水色谱分析步骤之间有一个附加的凝胶渗透柱子纯化过程(如下所述)，以及纯化条件也不同，包括不同种类的缓冲液、PH值和各种缓冲液组份，如EDTA和DTT。再者，现有方法不能够提供一种热稳定性酶。

从酵母中纯化热稳定性胞嘧啶脱氨酶过程的第一步包括将酵母细胞破碎以提供一种含有胞嘧啶脱氨酶的自溶产物。可以运用现有技术中几种已知方法的任何一种来完成自体溶解。例如，可根据Kumitz的方法(1947)用甲苯将酵母细胞质壁分离。特别有用的是将酵母暴露于有机溶剂如乙酸乙酯中，之后加入一种缓冲液使该溶液保持大约PH7。适宜的缓冲液包括磷酸钾缓冲液，生理盐水处理的磷酸，Tris缓冲液，和几种其他现有技术中常用的缓冲液。优选的缓冲液是含有浓度范围1-25％，尤其是15％的硫酸铵和EDTA与二硫苏糖醇(DTT)以稳定胞嘧啶脱氨酶。再者，EDTA和DTT可以从这种和后面的缓冲液中去掉。如果加上EDTA，它的浓度范围是0.1mM到10mM，优选的是5mM，而DTT加入的浓度可从0.01mM到10mM，优选的是0.1mM。将这种混合物搅拌几天，PH保持在大约7。细胞碎片可通过离心去掉。

自体溶解之后，用硫酸铵将总蛋自从自溶产物中沉淀。要加入足够浓度的硫酸铵，以得到一个较高的胞嘧啶脱氨酶与蛋白质的比率。例如，首先加入硫酸铵达到60-80％的饱和度，最好达到70％的饱和度。较优选的是在反应物中加入EDTA，浓度是1-3g/l，更优选的是1.5-2.0g/l，使该反应持续几个小时，在离心之后收集沉淀物。将该沉淀物溶于一个PH大约7.0的合适缓冲液中，如PBS。如上所述，该缓冲液最好含有EDTA和DTT，而且该溶液在相同缓冲液进行透析。可在如上所述的EDTA存在下用硫酸铵对透析液进行第二次处理，使其浓度达到50％。通过离心再收集沉淀物，并将硫酸铵加入到上清液中，达到73％的饱和度。收集沉淀物并将它溶于一种PH大约6.5-8.5合适的缓冲液中，优选的是一种PH为8.0含有如上所述浓度的DTT的Tris缓冲液中。在这种缓冲液中使该重新得到的沉淀物进行透析几小时。可以使用，如一种交联琼脂糖或纤维素包裹物质通过阴离子交换色谱分析法纯化从该渗析液中获得的胞嘧啶脱氨酶。尤其合适的是阴离子交换剂如从药店得到的Q-Sepharose和DEAE-Sepharose。合适的平衡缓冲液包括如Tris或磷酸盐缓冲液，同时运用一个线性梯度浓度完成洗脱。使用PH＝8.0含有0.1mM DTT的20mM Tris液，具有0-0.3M KCl的线性梯度浓度的这种缓冲液为最佳优选方案。

阴离子交换色谱分析之后，收集含有胞嘧啶脱氨酶活性的部分(活性测定见后)，并使用一种阻止分子量约为30,000道尔顿(Da)或更小分子通过的过滤器，进行超过滤，浓缩该收集部分。

然后，将含有胞嘧啶脱氨酶的该溶液通过凝胶渗透柱子。尤为适用的是交联葡聚糖、琼脂糖、或葡聚糖/二丙烯酰胺凝胶，较优选的是Sephadex G-75，G-100或Sephacryl S-300。洗脱液可以是现有技术中已知的常用缓冲液，优选的如以前所述的PH约为7含有DTT的PBS。收集含有胞嘧啶脱氨酶活性的部分，并用一种缓冲液如磷酸钾进行渗析。优选的缓冲液含有1-2M硫酸铵和上面所述自溶产物缓冲液EDTA与DTT。如果需要还可以走第二个凝胶渗透柱，并使用一种阻止分子量如为5000Da通过的过滤器通过超过滤法将活性部分进行浓缩。

之后，将含有胞嘧啶脱氨酶的物质置于一个可根据疏水性分离物质的柱子上，并使用一个如在磷酸钾缓冲液中的硫酸铵反向梯度浓度进行洗脱。将具有胞嘧啶脱氨酶的部分混合在一起，并使用一种阻止分子量为5000Da分子通过的过滤器的超过滤法进行浓缩。该浓缩物可以冷冻储存供下一步使用。但是，如果没有走第二个凝胶渗透柱子和/或如果胞嘧啶脱氨酶的特有活性较低，可以再走一个如上所述的凝胶渗透柱子。如此纯化的胞嘧啶脱氨酶具有热稳定性，并且可以游离形式冷冻或冻干保存。

在纯化过程中可通过几种现有技术中已知的方法来测定胞嘧啶脱氨酶的活性。例如，在胞嘧啶脱氨酶的存在下，促使胞嘧啶转化为尿嘧啶或它的衍生物，转化可以通过一种直接分光光度测定法，测定转化之后在286nm的吸收值。(见，如，Ipata和Cercignani，1978)，或者，用Nishiyama等人于1985年所描述的分光光度法测定5FC向5FU的转化来测定酶活性，本发明引用了此方法。

如实验部分所述，已经对用这种方法纯化的热稳定性胞嘧啶脱氨酶进行了序列分析，部分氨基酸序列显示于图6。该序列与其他已知序列的蛋白质没有表现出实质上的同源性。根据这个信息，可以通过重组生产热稳定性胞嘧啶脱氨酶。例如，根据得到的氨基酸序列，使用合适的密码子，用合成的方法制备编码胞嘧啶脱氨酶的DNA序列。一般地说可以为计划用于表达胞嘧啶脱氨酶的宿主选择理想的密码子。可以从通过标准方法制备的重迭寡聚核苷酸中装配成完整的序列。(见，如，Edge(1981)自然杂志(Nature)292：756；Nambair et al.(1984)科学杂志(Science)223：1299；Jay et al.(1984)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)259：6311。)

或者，按下述方法制备重组体热稳定性胞嘧啶脱氨酶。先制备含有对应于一部份确定氨基酸顺序的密码子的寡聚核苷酸探针，并用来筛选基因组或cDNA的基因库以得到编码胞嘧啶脱氨酶的基因。制备寡聚核苷酸探针和DNA基因库及通过核酸杂交进行筛选是现有技术中的普通技术人员是已知的。见，如，寡聚核苷酸合成，如上所述T，Maniatis et al，如上所述，一旦通过正杂交方法从筛选到的基因中识别出一个克隆，即可进行限制酶分析和DNA序列分析，以确定含有编码胞嘧啶脱氨酶的基因的特定基因库。另外，可用聚合酶链反应(PCR)来扩增并最后检测编码胞嘧啶脱氨酶的核苷酸序列。对此方法的描述见Saiki et al.(1986)和美国专利Nos.4,683,195和4,683,202，本发明参考了其公开内容。可以通过如Saiki et al(1988)所述的直接序列分析法来完成PCR-扩增产物的核苷酸序列分析。或者，在序列分析之前对放大的靶序列进行克隆。Scharf etal.(1986)曾描述了一种对酶学方法放大的基因组片段进行直接克隆和序列分析的方法。在该方法中，对PCR方法中所用的引物在接近其5′-端处进行修饰以得到合适限制性位点可直接用于，如，M13序列分析载体内克隆。扩增之后，用合适的限制性酶对PCR产物进行切割。将限制性片段连接到M13载体上，并转化到如一个JM103宿主中，并在平板上培养出来，用一个标记的寡聚核苷酸探针通过杂交筛选所得的的噬菌斑。其他一些克隆和顺序分析方法在现有技术中是已知的。

本发明的一个特别优选方法是，使用来自啤酒酵母(S.Cerevisiae)(Guthrie和Alelson，1982))部分氨基酸顺序和密码子惯用类型，做为设计DNA序列的“guessmer”序列的向导来合成两个寡聚核苷酸引物。将这些引物用于聚合酶链反应(PCRS)，在该反应中被克隆的酵母基因组文库DNA作为模板。从胞嘧啶脱氨酶中氨基酸表现出明显的密码子习惯偏向和/或没有简并的区域中合成该寡聚核苷酸。第一引物，CDA4R1，是一个含有33个对应于氨基末端氨基酸序列的核苷酸的42聚体，而第二个，CDA5AS，则含有与蛋白质羧基端附近序列互补的核苷酸。这些寡聚核苷酸序列见图7。在PCR反应中使用两个基因组文库做为模板DNA，并且发现二者都可产生一个大约350碱基对长度的单一特异片段，其大小可从能够得到的相应氨基酸序列中推测出来，将PCR引物在5′端用EcoRI的限制性位点进行处理以促进PCR所得片段的克隆。通过凝胶电泳法对该350碱基对长的PCR所得片段进行纯化，并克隆到一个合适载体中进行DNA序列分析。

也可以将PCR得到的片段用作一种胞嘧啶脱氨酶特异探针，通过菌落过滤杂交方法对酵母文库进行筛选。最初企图使用guessmer寡聚核苷酸做为探针失败了，原因是杂交后有一个低信号：干扰率。将所有潜在的克隆挑选出来并重新筛选两次，以验证正杂交信号。从单一克隆中纯化质粒，并用一系列限制性酶单独或在各种多级消化反应中进行消化，绘制出限制性图谱。

将被克隆的PCR片段和编码胞嘧啶脱氨酶的基因组克隆进行DNA顺序分析。反应条件的变化可以使对直接邻近于引物的序列的分析达到几百个碱基对之长。所得到的DNA顺序见图8。可以看出，该顺序有93％是同源的，有23个没有配对和330个配对的碱基。存在于这个序列中的ORFs见图9。图10表示ORE₂的核苷酸序列和推断的氨基酸顺序，进一步证实以往确定的氨基酸顺序，并且推测在通过分析该纯化蛋白质而得到的部分顺序的任何一端所加上的一些氨基酸。

接着运用DNA序列数据设计新的PCR引物以形成编码胞嘧啶脱氨酶的放大的DNA盒。可以将这种盒运用于被计划在原核生物或真核生物细胞内产生高水平的基因表达的遗传结构中，并在胞嘧啶脱氨酶和其他生物学意义上的分子包括抗肿瘤抗原靶子的免疫球蛋白分子之间产生基因融合。

将编码胞嘧啶脱氨酶的序列克隆到现有技术中已知的任何合适载体或复制子中。例如用于克隆的重组DNA载体和它们转化的宿主细胞(圆括弧内表示)包括λ(E.Coli)，噬菌体PBR₃₂₂(E.Coli)，PACYC 177(E.Coli)，PKT₂₃₀(革兰氏阴性细菌)，PGV₁₁₀₆(革兰氏阴性细菌)，PLAFR1(革兰氏阴性细菌)，PME₂₉₀(除E.Coli外的革兰氏阴细菌)，PHV₁₄(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌E.Coli andBacillus Subtilis)pBD9(芽孢杆菌Bacillus)，PIJ61(链霉菌属Streptomyces)，PUC6(Streptomyces)，YIP5(酵母属)，YCP₁₉(酵母属)和中乳头状瘤病毒(哺乳动物细胞)。

可以将胞嘧啶脱氨酶蛋白质的编码顺序置于一种启动子、核糖体连接位点(用于细菌表达)和可任意选择的一种操纵子(这里是指“控制”因素)的控制之下，以便在含有这个表达结构的载体转化的宿主细胞内将编码该蛋白质的DNA序列转录成RNA。这一编码顺序可以含有或者不含有一个信号肽或前导序列。在翻译后加工过程中该前导序列被细菌宿主去掉。见.如，美国专利Nos.4,431,739；4,425,437；4,338,397。

除了控制序列外，最好再加上调节序列，以随着宿主细胞的生长调节和表达胞嘧啶脱氨酶编码序列。这些调节序列对于现有技术中的那些普通技术人员是已知的，例如，包括那些可以使基因的表达因化学或物理刺激而启动或中止的调节顺序，并包括一种调节化合物的存在。载体中也可以存在有其他类型的调节因素，如强化因子顺序。

构建一种表达载体，以使该胞嘧啶脱氨酶编码顺序和合适的调节顺序一起位于载体上，并将该编码顺序相对于控制顺序定位和定向，以使该编码顺序在控制顺序的控制之下转录。(也就是说，结合到控制顺序上的DNA分子的RNA聚合酶转录该编码顺序)。修饰该编码胞嘧啶脱氨酶的顺序可以按需要达到这一目的。例如，在有些情况下，必须修饰该顺序以便使它以合适的方向连接到控制顺序上，如，以保留该阅读框架。在编码序列插入到载体，如上面所述说的克隆载体之前，可以先将控制顺序和其他调节顺序连接到编码顺序上。或者，可以将该编码顺序直接克隆到一个已经含有控制顺序和一个合适限制性位点的表达载体中。

很多原核生物表达载体在现有技术中是已知的。见，如，美国专利No，4,440,859；4,436,815；4,431,740；4,431,739；4,428,941；4,425,437；4,418,419；4,411,994；4,366,246；4,342,832；并见英国专利申请GB2,121,054；GB2,008,123；GB2,007,675，和欧洲专利申请103,395。酵母表达载体在现有技术中也是已知的。见，如，美国专利No，4,446,235；4,443,539；4,430,428；并见欧洲专利申请103,409；100,561；96,491。哺乳动物表达载体也是已知的。

依靠表达系统和所选择的宿主，在胞嘧啶脱氨酶可被表达的条件下，通过如上所述的表达载体转化的宿主细胞的生长可产生胞嘧啶脱氨酶。然后从宿主细胞中分离该蛋白质并纯化。如果该表达系统将蛋白质分泌到生长培养基中，则可直接从培养基中纯化该蛋白质。如果宿主没有分泌该蛋白质，则可从细胞溶解产物中分酶蛋白质。所选择的适宜生长条件和获得产物的方法，属于现有技术范围。

例如，在酵母内控制诱导胞嘧啶脱氨酶的构造。包括将胞嘧啶脱氨酶编码盒插入到一个称为“融合体”(fusionator)的酵母载体中。这种载体可以从华盛顿大学遣传工程系，Seattle，Washington，和NIH得到。这一构造设计描绘于图11中。其中，将胞嘧啶脱氨酶插到一个多重连接体中，使它的表达处于来自酵母的高水平表达和严谨型调节的GAL10启动子控制之下(Johnston，M，1981)。这种GAL10启动子受半乳糖的感应，诱导在它的控制下进行基因的高水平表达。也可以使用这种载体通过DNA顺序合适的交换产生一个CDase——LacZ基因融合。产生的这种融合蛋白质可以使诱导纯化的定量测定和生化分析简便化。可以将这种结构转化到一种合适的酵母菌株中，如Hovland等所描述的菌株(1989)。这种酵母菌株产生许多突变以便能与如上所述的结构相适应使用。特别是，存在一种损伤(galI)突变，它可导致催化半乳糖利用过程第一步的酶缺失，从而限制了诱导剂(半乳糖)在培养基中的减少。还有一种regl-501突变，它可以消除对半乳糖基因表达的葡萄糖抑制，并且在最后生长和生存条件下，建立培养组织。向富含葡萄糖的培养基中加入半乳糖可容易地进行诱导。最后，该菌株中还存在有几种蛋白酶缺乏突变，以增加在生长过程产生的任何异种蛋白质或片段的稳定性。这种表达结构由于得到了内源性基因表达水平，将以过去不可能达到的量的胞嘧啶脱氨酶从酵母中的分离和纯化。

可以制备其它的结构用于哺乳动物细胞培养系统。本发明的一个优选方案中，运用PCR方法将编码胞嘧啶脱氨酶的基因盒连接到用于制瘤素M的促进分泌的信号肽上(Malik，et al.，1989)，然后被插入含有用于哺乳动物表达的合适强化因子、启动子、末端、和后加工信号哺乳动物表达载体PH3MPY中(Stamenkovic，et al.，1990)。可以将该结构转染到COS细胞中，(Aruffo和Seed，1987)收集不含血清的培养基并在不含内源性酶活性的系统中测定胞嘧啶脱氨酶活性。同样，也可以运用标准方法构造用于在胞嘧啶脱氨酶和其他意义分子之间形成基因融合的cDNA结构，并转架到COS细胞中，测定细胞提取物或上清液的蛋白质及其活性。

在胞嘧啶脱氨酶的重组生产过程中还可以使用其他的基因融合。例如，可将一个编码胞嘧啶脱氨酶的核苷酸顺序或一个功能性突变体或它的片段。融合到cDNA编码的作为抗肿瘤抗原靶分子的免疫球蛋白分子上，以产生一种抗体——酶融合蛋白质。已经得到能够识别在癌细胞中优先表达的遗传因素的单克隆抗体(Hellstron，et al.，1984)。因此，可以制备能专门攻击选择癌细胞的融合蛋白质。见，如，美国专利No，4,906,562和Hellstrom and Hellstrom，1985。这种酶能够直接作用于癌细胞位点，将前体药物5FC转化成抗肿瘤药5FU。在编码这种有意义酶的基因和靶击抗肿瘤细胞的抗体之间形成基因组融合，不需要进行两种蛋白质的化学组合。同样，两种有意义分子间的CDNA结构能增加这种结构在异源表达系统中的灵活性。

其中一个系统中，编码一种癌抗体重链的cDNA是从产生这种抗体的细胞系中得到的。通过类似于现技术中的方法产生编码全部或部分这种cDNA的PCR片段。可以通过常规方法在几个位置进行两个基因盒的框架内融合，并且对得到的融合体进行测定，以确定是否有具备所需生物活性的蛋白质产生。与携带有可编码抗体分子轻链部分的DNA的第二个质粒共同转染，可分离一种融合到活性胞嘧啶脱氨酶上的生物活性抗体片段。因此，可以使该酶到达所需要的位置。也可以生产功能上等同的热稳定性胞嘧啶脱氨酶的突变体或类似物。可以通过使编码胞嘧啶脱氨酶的序列的部分缺失，或插入一个序列，和/或通过在该序列中取代一个或几个核苷酸来制备突变体或类似物。用于修饰核苷酸序列的方法，如定位诱变成PCR寡聚核苷酸诱变，对于现有技术中的普通技术人员是已知的。见，如，T.Maniatis，et al。

还可以通过化学合成方法如固相肽合成法，运用已知的氨基酸序列或从有意义基因的DNA序列中得到的氨基酸序列，来制备本发明的胞嘧啶脱氨酶。这种方法对于现有技术的熟练人员是已知的。

热稳定性胞嘧啶脱氨酶可以用作一种化学治疗药物。特别是，使用这种酶可以在体内将前体药物5FC转化成抗癌药物5FU。因此，可以将胞嘧啶脱氨酶和5FC共同使用，如Katsurgi等人1987年所述的，通过手术方法将胞嘧啶脱氨酶放在肿瘤部位或周围，并口服5FC，本文参考了其公开内容。或者，使用对这些肿瘤具特异性的抗体，通过一种胞嘧啶脱氨酶/抗体复合体特异性结合到肿瘤部位，将这种酶传递到肿瘤部位。可以通过化学方法，或者通过如上所述的在合适兔疫球蛋白基因和胞嘧啶脱氨酶基因之间形成基因融合的遗传学方法，来制备这种复合物。

下面是实施本发明的具体实施例。这些实施例仅用来解释本发明，并不在任何方面限制本发明的范围。

                      实施例1

胞嘧啶脱氨酶的纯化、活性测定及其定性

运用下述方法从Fleishann′s浓缩啤酒酵母中纯化胞嘧啶脱氨酶。纯化过程中的全部步骤都在4℃下进行。用5′氟胞嘧啶(5FC)在3mM磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中37℃下测定该酶的活性(Nishiyama，et al.，1985)，本发明参考该文献的全部内容。加入酶溶液，取等分试样量用0.1N HCl中止反应，然后用分光光度法测定检测该反应过程。以255/290的吸收比率确定形成5氟尿嘧啶(5FU)的量。在37℃每分钟形成1umol 5FU时定义为1单位酶活性。运用Pierce提供的BCA方法测定蛋白质浓度(Rockford，IL)。运用SDS-PAGE测定每个纯化步骤I后的蛋白质组成。

步骤1：制备酵母自溶产物

将啤酒酵母(2.25kg)和乙酸乙酯(225ml)混合并搅拌30分钟。向这个混合液中加入2.25升的50mM磷酸钾缓冲液，PH为7.2，该缓冲液中含有15％硫酸铵，5mM EDTA和0.1mM二硫苏糖醇(DTT)，将该混合液搅拌3天，每天用固体三羟甲基氨基甲烷(Tris)调节PH至7.2。通过在10，000rpm下离心15分钟去掉细胞碎片。

步骤2：硫酸铵分级分离

在步骤1的上清液中加入EDTA(1.8g/l)和硫酸铵(371g/l)而使总蛋白沉淀，以致最终硫酸铵浓度为70％饱和度。将该溶液置于4℃大约16小时，之后通过离心收集沉淀物。将沉淀物溶于1.5l的50mM PH为7.2的磷酸钾缓冲液中，该缓冲液含有5mM EDTA和0.1mM DTT，并用这种缓冲液进行透析持续大约12到16小时。

向该透析液中加入EDTA(1.8g/l)，并加入硫酸铵达到50％饱和度(314g硫酸铵/每升透析液)。1小时之后，将沉淀物离心，并向上清液中再加入硫酸铵使硫酸铵的最终浓度为73％饱和度。收集沉淀物，并将其溶于1升的20mM PH为8.0的Tris缓冲液中，该缓冲液中含有0.1mM DTT，用这种缓冲液进行充分透析大约12到16小时。

步骤3：阴离子交换色谱分析

将步骤2得到透析液置于一个4.8×25cm的Q-Sepharose(Pharmacia)柱子上，该柱子用含有0.1mM DTT PH为8.0的20mM Tris液中进行平衡。冲洗该柱子，并用含有0～0.3M KCl的一个线性梯度浓度的上述缓冲液对该酶进行洗脱。收集含有胞嘧啶脱氨酶活性的部分，并通过超过滤法(Amico，PM30filter)浓缩至大约15ml。

步骤4：凝胶渗透色谱分析

将步骤3得到的含有胞嘧啶脱氨酶的溶液置于一个G-75Sephadex柱子(2.5×100cm)，并用含有0.1mMDTT的PBS进行洗脱。收集含有胞嘧啶脱氨酶活性的部分，然后用4升含有1.8M硫酸铵，5mM EDTA和0.1mM DTT PH为7.0的100mM磷酸钾缓冲液进行透析。

步骤5：疏水交互作用色谱分析

将步骤4得到的物质置于一个2.5×15cm的Octyl-Sepharose(pharmacia)柱子上，该柱用含1.8M硫酸铵5mM EDTA和0.1mM DTT PH为7.0的100mM磷酸钾进行平衡，用这种缓冲液洗该柱子，并用含有1.8-0M硫酸铵的一个线性梯度浓度上述磷酸盐缓冲液对该酶进行洗脱。将含有胞嘧啶脱氨酶活性的部分混合，并通过超过滤法(Amicon YM 5filter)进行浓缩。

步骤6：凝胶渗透色谱分析

按照步骤4所述的方法将步骤5得到的物质置于G-75Sephadex上用PBS做为洗脱液进行最后的凝胶过滤。通过超过滤法浓缩该纯化酶并储存于-70℃。

纯化过程每一步骤的结果见表1。用来监测每个纯化步骤之后蛋白质成份的SDS-PAGE概况见图1。最后得到酶制剂由一条大约17KDa的主谱带和一条大约19KDa的次谱带组成。

                        表1

                  从2.25kg的啤酒酵母中纯化胞嘧啶脱氨酶

                  总蛋白     总活性     比活性    合并步    骤              (mg)¹     (U)²     (U/mg)     纯化不含细胞的提取物      120,000    1750       0.014     1(NH₄)₂SO₄         36,000     1274       0.035     2.5Q-Sepharose           4,200      685        0.16      11.4G-75 Sephadex         184        648        3.5       250Octyl-Sepharose       20         495        25        1,800G-75 Sephadex         6          394        67        4,800

1.用BCA(pierce)测定的蛋白浓度。

2.在37℃每分钟形成1μmol的5-FU定义为一个酶活性单位。

将纯化的酶和核糖核酸酶A(13.7KDa)，糜蛋白酶原A(25KDa)和卵清蛋白(43KDa)一起置于一个G-50Sephadex柱子上来测定胞嘧啶脱氨酶的分子量。在280nm处检测收集的流出样品以测定总蛋白，并用5FC做为底物测定胞嘧啶脱氨酶的活性。胞嘧啶脱氨酶活性成分集中在大约32KDa处(图2A)。在没有校正标准下将相同体积的酶置于柱子上仔细地洗脱该酶(图2B)。

用5FC做为底物测定纯化胞嘧啶脱氨酶在37℃于PH为7.2的磷酸盐缓冲的生理盐水溶液中的稳定性。在一段延长温育时间后发现该酶活性缓慢降低。(图3)。在这些条件下，5.2天之后该酶的活性丧失一半。在温育的前4个小时酶活性没有明显丧失(图3的插图)。

                     实施例2

胞嘧啶脱氨酶的氨基酸顺序

用于胞嘧啶脱氨酶序列分析的试剂从应用生物系统股份有限公司(Applied Biosystems，Inc.)获得。用于反相HPLC的溶剂由Burdick和Jackson提供。4-乙烯吡啶从Aldrich化学公司获得，CNBr来自Kodak，并且所有其他的化学药品都是试剂级。从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中得到的蛋白内切酶Glu-C从Mile实验室获得。由脆假单胞菌fragi(Pseudomonas fragi)得到的蛋白内切酶ASP-N和蛋白内切酶Lys-C从Boehringer Mannheim获得。

运用RuN470-L或PRO470-L程序在475A型氨基酸顺序分析仪(ABI)上进行自动顺序分析。在使用样本之前用总量1.5mg的BioBrene(ABI)先进行2到3轮的Edman降解。在61℃用25％的TFA将噻唑啉酮衍生物转化成乙内酰苯硫脲氨基酸。用一种含有5％(V/V)氧杂环戊烷的醋酸钠缓冲液作为起始缓冲液，并用一种含有500nM二甲基硫脲的乙腈作为限制缓冲液，在120A型PTB分析仪(ABI)上通过在一个PTHC18柱子(2.1×220mm，ABI)上进行反相HPLC来分离乙内酰苯硫脲氨基酸衍生物。

用反相HPLC在一个130A型分离系统(应用生物系统股份有限公司)上纯化胞嘧啶脱氨酶和肽片段。在40℃于一个RP-300柱子上(2.1×30mn；ABI)进行分离。用一个在0.1％含水的三氟乙酸中0-60％乙腈的线性梯度浓度以0.1ml/分钟的速度洗脱蛋白质和肽片段持续2小时。用CNBr肽，蛋白内切酶Lys-C肽，蛋白内切酶Glu-C，和蛋白内切酶Asp-N肽进行顺序分析，而不再进行进一步的纯化。

胞嘧啶脱氨酶与4-乙烯吡啶的反应

通过以下列方式加入4-乙烯吡啶对实施例1中步骤6得到的胞嘧啶脱氨酶进行修饰。在含有6M盐酸胍，0.1％Na₂EDTA，PH为8.5的0.1ml的0.4M Tris——盐酸缓冲液中，用20mM二硫苏糖醇在50℃下对胞嘧啶脱氨酶还原2小时，然后再和100mM 4——乙烯吡啶在室温下反应一夜。用20％TFA使该反应混合物酸化达到PH2.0，并通过上述的反相HPLC进行脱盐和纯化。

对所得产物的HPLC分析提示存在有两个明显的峰(图4)，通过SDS-PAGE对这两个峰进行分离和再分析(图5)。较小的峰(A部分)与图1的19KDa谱带相一致，而较大的峰与17KDa谱带相一致。通过识别氨基酸乙内酰苯硫脲衍生物达到残基27，可以获得A收集部分(图4)中蛋白质的氨基末端氨基酸顺序。发现该顺序与啤酒酵母过氧化歧化酶(EC1.15.1.1，Sternman，1980)的N-末端顺序相同。这个结果与在纯化的胞嘧啶凝胶中见到的较小谱带(图1，5)相一致。

从图4(B收集部分)大峰的Edman降解中没有得到氨基酸顺序，说明胞嘧啶脱氨酶的氨基末端被阻遏了。胞嘧啶脱氨酶的这部分氨基酸顺序通过从如下所述酶和溴化氰降解过程所选择片段的序列分析而得到。

胞嘧啶脱氨酶的酶切割和化学切割

在40ul的0.1M Tris——乙酸缓冲液(PH8.0)中于37℃下，用蛋白内切酶Lys——C和蛋白内切酶Glu——C对用4——乙烯吡啶修饰过的胞嘧啶脱氨酶进行切割大约12——16小时。酶/底物的比率为相应的1∶10(Wt/Wt)。在37℃下用同样的方法以酶/底物比率1∶100，用蛋白内切酶ASP——N切割大约12——16小时。用20％TFA对酶消化液进行酸化至PH2.0并用反相HPLC进行分离。

用溴化氰(CNBr)在甲硫氨酰基处对胞嘧啶脱氨酶进行切割。在40ul的70％甲酸中，并且在70％甲酸中加入超过200倍的CNBr，对用4——乙烯吡啶修饰过的胞嘧啶脱氨酶(2.25nmol)进行再构成。该反应在35℃持续2小时，然后，再在室温下反应大约12——16小时。用水稀释消化液，并且真空干燥以去除多余的CNBr。在1％TFA中制备用于反相HPLC分析的溶液。

图6表示的是，以溴化氰切割、和运用酶、蛋白内切酶Glu-C，蛋白内切酶Lys——C和蛋白内切酶Asp-N进行蛋白水解切割得到的片段为基础的胞嘧啶脱氨酶的部分氨基酸顺序。已识别出一个154氨基酸段，它包括了该蛋白的大部分。这些氨基酸残基的号码不包括尚未识别出的那些接近于氨基末端的氨基酸。将该部分胞嘧啶脱氨酶顺序与任何其他已知顺序比较，包括鼠腺苷脱氨酶(Yeung et al.，1985)和啤酒酵母dCMP脱氨酶(McIntosh和Haynes，1986)，没有发现任何本质上的同源性。

                   实施例3

胞嘧啶脱氨酶基因的克隆和表达

运用下列方法从啤酒酵母(baker′s yeast)的实验室菌株中分离编码胞嘧啶脱氨酶的基因，并在哺乳动物细胞系中表达该基因：

步骤1  运用PCR产生胞嘧啶脱氨酶特异性探针

运用部分氨基酸顺序和来自啤酒酵母(S.Cerevisiae)的密码子习惯用类型(Guthrie and Abe(So.1982))做为设计DNA顺序“guessmer”(推测)片段向导，在自动DNA合成仪上合成寡聚核苷酸引物，然后在以克隆的酵母基因组文库DNA做为模板的PCRs过程中，运用这些寡聚核苷酸作为引物。

称之为CDA4R1和CDA5AS的引物，都是分别与胞嘧啶脱氨酶有意义链和反意义链含有33个核苷酸序列的42聚体相对应。每个寡聚核苷酸的剩余部分为EcoRI的限制酶位点提供密码。两个引物的顺序表示见图7。

在每个反应中只需50或100pmols的两种引物存在。将酵母基因组DNA通过Sau3A部分限制消化并连接到CVB或YCP50往复载体的BamHI位点上，构建成在PCR反应中用作模板DNA的两个基因组文库。一般情况下这两个载体和基因组库对于本领域的技术人员来说是可得到的，并且可以从华盛顿大学的遗传学系获得。得到的两个基因文库已经转化到细菌宿主中的。通过碱性溶解质粒制剂来分离DNA文库，接着通过氯化铯——溴化乙锭嘧度梯度离心进行纯化。用1ug来自酵母的CsCl纯化CV₁₃或YCP50基因组库DNA，50或100_pmols的每种引物，1/10体积的10X PCR反应缓冲液(Stratagene)，16/100体积的1.25mM dNTP′S(A.G.T.C)，PCR级蒸馏水，和0.5ul的Taq DNA聚合酶(5u/ul，Stratagene)，最终体积为100ul进行PCR反应。该反应在无菌微量离心试管中进行，它的上面有一个75ul的纯化矿物油层以防止蒸发。PCR反应在一个Perkin-Elmer Cetus热循环器中用30-循环程序按下列温度移动进行反应；94℃进行30秒钟作为一个步骤循环产生变性，55℃进行45秒钟的退火，并在72℃延长1.5分钟(90秒)。对来自PCR反应的等分试样在琼脂糖凝胶上进行分析，以证实所推断的编码胞嘧啶脱氨酶大多数的350碱基对片段的存在。通过制备琼酯糖凝胶电泳对350碱基对片段进行纯化，然后运用现有技术和带有基因清除药盒(BIO101)的试剂进行洗脱，以从该制备物中去除引物和异源性片段。

步骤2  亚克隆PCR片段以进行序列分析

对从步骤1得到PCR引物在其5′端用EcoRI切割位点进行处理，以促使产生的任何片段克隆。用限制酶EcoRI对来自PCR的纯化350bP片段的试验是进行消化，并连按到EcoRI切割的噬菌体中间载体PBSII——SK⁺(Stratageme)上。该限制酶从Boehringer Mannheim Biochemicals(BMB)获得。将消化液在37℃保温2小时，接着用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇萃取和乙醇沉淀。将该片段再悬浮于TE(10mMTris-HCl PH8.0，1mM EDTA PH8.0)中，并用T₄ DNA连接酶(BMB)连接在一起。将1/5的连接反应物对感受性JM109细菌进行纯化，及将恰当的稀释液置于补充有XGal(50ul的2％二甲替甲酰胺制剂)和IPTG(10ul的100mM制剂)的LB+氨苄青霉素平板上进行培养。采集白色菌落并根据SambrooK等提供的方法(1989)，制备小量质粒。通过用EeoRI消化筛选出的质粒以获得350bp插入物。收集几种分离菌，并分离和纯化质粒DNA，然后进行DNA序列分析。

步骤3 用PCR片段做为胞嘧啶脱氨酶特异性探针来筛选酵母基因组文库。

从步骤1得到的PCR片段，也被用作在筛选基因组文库寻找含有编码CDase基因克隆的过程中，用于检测胞嘧啶脱氨酶编码序列的探针。用α-³²P-dCTP和来自BoehringerMannheim Biochemicals的标记药盒的随机引物DNA对该纯化片段进行标记。将酵母文库在LB+氨苄青霉素中生长一夜，并将稀释液置于LB+氨苄青霉素平板上培养，得到每个平板上250-2000个菌落的菌落密度。用由Schiecher和Schuell提供的0.45um的园形或方形消化纤维来收集菌落。将滤纸上有菌落面朝上置于Whatman 3MM滤纸上按下列步骤进行处理，按照产品说明书的方法用10％SDS饱和5分钟进行固定，在0.5M NaOH，1.5M NaCl中放置5分钟使其变性，在1.5M NaCl，0.5M Tris HCl PH7.4放置5分钟进行中和，并在2x SSC中放置5分钟，然后用一个Statalinker Stratagene进行UV-交连。然后将滤纸在2XSSC中浸泡5分钟，并在5×SSC，0.5％SDS，1mM EDTA中于50℃进行预冲洗。

在可加热密封的塑料袋中进行预杂交，每个袋中含有20ml12个滤纸的溶液。预杂交溶液含有50％甲醛胺，6×SSC，0.01M NaP PH6.8，1mM EDTA(PH8.0)，0.5％SDS，100μg/ml变性的结精子DNA和5×Denhardt′s溶液。将塑料袋在42℃的水浴中浸泡并保温大约12到16小时。通过从Push -Colunr(Stratagener)中洗脱未结合的核苷酸中纯化B标记的探针。以大约10⁶cpm/ml液体将探针加入，并在42℃保温大约12-16小时进行杂交。

在室温下将滤纸在2×SSC，0.1％SDS中冲洗几次，接着在1×SSC，0.1％SDS中于55℃下洗1小时。将滤纸空气干燥，用萨冉树脂包层将其包裹，然后将其暴露于X光胶片于-70℃过夜，进行强化筛选。将放射自显影胶片与滤纸和主平板对齐，以选择表现有正杂交信号的克隆。在分离质粒之前，用上述方法对阳性克隆再筛选至少两次。在氯霉素放大的500ml LB+氨苄青霉素培养基中生长，然后用如Sambrook等人，1989年所述的碱性溶菌方法进行纯化，来分离质粒DNA。有些质粒需要通过氯化铯溴化乙锭平衡离心法进行纯化，而另外一些则要从PZ253柱子中(5′—→3′)洗脱，接着用聚乙烯乙二醇沉淀，用苯酚∶氯仿提取，并用乙醇进行沉淀。

步骤4 PCR产生克隆和编码胞嘧啶脱氨酶基因组克隆的序列分析

合成或购买一些18聚体寡聚核苷酸，用于对来自PCR和编码胞嘧啶脱氨酶基因组克隆进行序列分析。有些引物产生来自编码链的序列，而另外一些则产生来自互补链的序列。运用现有技术和Sequenase Version 2.0药盒及试剂(美国生化公司United State Biochemical)来进行顺序分析反应。在顺序分析反应之前通过在0.2N NaOH中进行碱性变性反应使DNA变性。根据所需顺序的区域来调节标记反应混合物的稀释度和反应时间。将样本置于8％聚丙烯酰胺——尿素序列分析凝胶上，并根据所要阅读的顺序使之走1-7小时。将凝胶在10％的甲醇，10％乙酸中固定30分钟，然后用与一个真空泵相连的Slab-Gel干燥器在80℃下干燥45分钟。将干燥的凝胶在室温下暴露于柯达XAR-5胶片18-72小时，人工阅读其顺序。通过计算机运用基因程序软件(Gene Pro Software)(Riverside Scientific，Seattle，Washington)进行顺序数据分析和校正。图8表示的是编码胞嘧啶脱氨酶基因组克隆的核苷酸顺序。图10表示的是推测的氨基酸顺序。如图所示，该编码顺序由大约474个碱基对组成，特异性地对应于一种158个氨基酸的蛋白质。如此得到的胞嘧啶脱氨酶的分子量预计大约是17,506道尔顿。

步骤5：构造用于在酵母和哺乳动物系统内表达的胞嘧啶脱氨酶——编码基因盒。

运用从步骤4得到的DNA顺序来设计用于PCR产生的编码胞嘧啶脱氨酶的基因盒的寡聚核苷酸引物。这些寡聚核苷酸中有些已经掺入到其他的顺序如分泌信号肽和在克隆和表达过程中使用的限制性位点。将寡聚核苷酸引物配对使用来产生末端上加有合适顺序的PCR片段。

特别是，运用含有胞嘧啶脱氨酶特异性顺序和编码用于克隆的切割位点的附加顺序的两种引物，通过PCR来构造一种编码胞嘧啶脱氨酶的基因盒。该5′引物是一个含有45残基顺序的35聚体，该顺序与连接到一个含有切割位点Hind III，SalI，和Nco I的5′尾部的胞嘧啶脱氨酶基因组拷贝的5′端同源，但是不完全相同。该3′引物是一个与胞嘧啶脱氨酶C-末端上反义链相同的39聚体，其5′端带有一个Xba I端。用作模板的是胞嘧啶脱氨酶基因组克隆每次反应大约使用1mg。每个引物的浓度为75pmol。PCR反应如步骤1所述的方法进行。

通过用氯仿提取和乙醇沉淀来纯化PCR反应产物。接着用限制酶Hind III和Xba I对DNA进行消化，进行凝胶电泳，并根据厂家说明用Geneclean(B10101)洗脱来进行纯化。

步骤6：在一种哺乳动物系统内表达胞嘧啶脱氨酶

将从步骤5得到的纯化片段连接到HindIII-XbaI消化的CDM8或PH3M质粒载体上，并转化到细菌宿主MC1061(Aruffo and Seed，1987)中去。图12表示了PH3M载体的结构图。收集20个转化体，进行小量的线性质粒溶解，用HindIII+XbaI对等分试样进行消化以改变结构。运用从三个制备产物中得到的剩余质粒，通过DEAE-Dextran转染方法来对COS细胞进行转染(Ausubel，et al，eds.分子生物学中的常用方法Current protocols in MolecularBiology)。

简言之，将3.5×10⁵ COS细胞放入6cm的培养皿上，其中含有DMEM/10％胎牛血清(FBS)，并将其在6％CO₂中于37℃下培养过夜。将从小量制备物中得到的DNA以下列剂量与PBS和50mg/ml DEAE-Dextran混合成一种合剂，最终总量为100μl。样  本              DNA      FBS           DEAE-Dextran

                                         (50mg/ml)对照组假转化体            0μl     80μl             20μlBB1                 4μl     76μl             20μl胞嘧啶脱氨酶转染体1-1                13μl     67μl             20μl1-4                13μl     67μl             20μl2-6                13μl     67μl             20μl

每次转染重复进行一次，将生长一天的培养基从培养皿中吸出，并以每次2ml的PBS洗该细胞三次。将DMEM-氯奎转染培养基加入1.7ml/平板，然后将DNA合剂滴加到培养基中。将转染反应物培养3小时，去除培养基，将该细胞在FBS/10％DMSO中振荡2分钟，在不含血清的培养基中洗三次，然后在每个平板有3.5ml的DMEM/10％PBS中培养3天。

步骤7：使重组表达产物的特征

将步骤6中平板用于放射免疫沉淀反应(RIPS)在含有200uci/ml ³⁵S-蛋氨酸的新鲜DMEM/10％FBS中培养大约12到16小时。

RIPS通过下列步骤进行

将在37℃保温大约12-16小时后的标记培养基吸出，加入1ml 1％OG-PO4RIPAE(50mM Na₂HPO₄，1％Nadeoxycholate，1％triton X-100，0.1％SDS，150mM NaCl，5mM EDTA，5mM EGTA，2mM PMSF，和1μg/ml aprotinin＝PO4-RIPAE加入1％的八葡糖苷)缓冲液于每个培养皿中，在冰上保持10分钟。将细胞溶解产物转移到10ml OaK Ridge离心管中，并在4℃以40,000rpm离心40分钟。将上清液转移到放在冰上的两个微量离心试管中(0.4ml/每管)。用2μg抗体和BB1转染体一起培养，而将17.5μl或31.5μg的兔抗胞嘧啶脱氨酶多克隆抗血清加入到其他的转染体。将RIPS在冰上保持1小时，将羊抗鼠抗体做为第二种抗体加入到BB1试管中，并在冰上保持20分钟。

将金黄色葡萄球(Calbiochem)在0.5％NP-40)TES缓冲液洗涤重复一次，最后将其再悬浮于含有1mg/ml卵清蛋白的PO4-RIPAE缓冲液中(TES＝50mMTris-HCl，PH7.4，1mM EDTA，150mM NaCl)。将50微升试验量的冲洗过的金黄色葡萄球菌加入到RIP物质中，并在冰上保持10分钟。通过微量离心使RIP沉淀，并将其在0.5ml TNEN(20mM Tris-HCl PH8.0，100mM NaCl，1mM EDTA，0.5％NP-40)中冲洗三次。将从起始400μl复制样本中得到的最终沉淀物再悬浮于35μl还原或35μl未还原SDS-PAGE运载缓冲液中。将样本和来自Bio-Rad的低分子量蛋白标志置于10-20％SDS-PAGE梯度凝胶上，并在300伏下电泳大约2小时。将凝胶在考马斯兰(Coomassie Blue)中染色1小时，并在10％的甲醇、5％乙酸中脱色12到16小时，并进行强化30分钟，然后在水中冲洗三次，之后在60℃下干燥1小时。将凝胶在X光胶片上暴光4小时，在Sham样本中没有发现17,000道尔顿谱带，在BB1样本中没有发现17,000道尔顿谱带，但是在BB1样本中发现一个45,000道尔顿范围的特定谱带，而所有三种转染体都表现出一个在大约17,000道尔顿的特定谱带。

2.Western分析：

将从步骤6得到的重复转染平板不进行标记，并在三天的培养之后收集。吸去培养基，在PBS中冲洗细胞，然后将其悬浮于含有1ug/ml aprotintin和30ng/ml PMSF的0.5ml 10mM Tris-HCl(PH 8.0)中。用无菌刮器从培养皿中取下细胞，并转移到放在冰上的无菌微量离心管中，将每种悬浮液在冰上以2-15秒的脉冲用全功率进行超声波处理。将溶解产物在冷冻微量离心机中离心20分钟以去掉细胞碎片，将上清液转移到新鲜试管中。按下述方法进行酶测定。

也可以使用从这些溶解产物中得到试验量，运用抗纯化胞嘧啶脱氨酶的多克隆兔抗血清进行Western吸印试验。按照用于RIPS的方法，将25微升试验量的未稀释转染体溶解产物进行SDS-PAGE电泳，而将纯化胞嘧啶脱氨酶的系列稀释液置于凝胶做为浓度标准。将500ng/通道的浓缩胞嘧啶脱氨酶以5倍的增加量稀释成100ng，20ng，4ng和0.8ng/每通道。按照CSH克隆手册(Sambrook et al.1989)中的方法将该凝胶电吸印到一个硝化纤维素滤膜上。

在Blotto中将吸印反应阻遏1小时(Blotto＝PBS+1％脱脂牛奶+0.5％NP-40)。将含有2.5ug/ml多克隆兔抗胞嘧啶脱氨酶血清的新鲜Blotto(Fresh Blotto)加入到该滤膜上，并在室温下保持1小时，将该滤纸在Blotto中冲洗三次共5分钟，接着在以Blotto稀释1∶1000的碱性磷酸酶结合物(Boehringe Mannheim Biochemicals)中孵育。通过在Blotto中冲洗三次，最后在碱性磷酸酶底物缓冲液(100mMTris-HCl PH9.5，100mM NaCl，5mM MgCl₂)中冲洗一次，来去掉多余的抗体结合物。将该滤膜在40ml的底物缓冲液中保湿15分钟，并在该缓冲液中加入12mg溴氯吲哚(bromochorindolyl)磷酸盐和7mg的氮兰四唑以使其显色。用蒸馏水冲洗该滤纸终止其反应。

根据颜色显影，三个转染体都表现出在大约17,000道尔顿的迁移带，其强度大于0.8ng而小于4ng的纯化胞嘧啶脱氨酶浓度标准。

3.重组表达的胞嘧啶脱氨酶的活性测定

在上面转化的COS细胞提取物中测定5-氟胞嘧啶(5-FC)向5-氟尿嘧啶(5-FU)的转化。将含有胞嘧啶脱氨酶(1-1，1-4，2-6)的转染体(3×10⁵个细胞/每种)，假转染反应物或对照质粒转染反应物(BB1)在0.5ml 10mM Tris缓冲液中进行超声波处理然后离心。向100ul的每种上清液和1ug/ml胞嘧啶脱氨酶溶液中加入170ul的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和30ul的30mM 5-FC溶液。这样得到一种300ul含有3mM 5-FC的反应混合物。并且进行一种没有酶的对照反应。

将这些试管在37℃保湿24小时，之后取每种溶液各50ul，并在1ml的0.1N HCl中终止其反应。在一种UV分光光度计上于255和290nm处测定这些样本。运用下列等式计算5-FC向5-FU的转化量

(0.1191×OD₂₉₀-0.02485×OD₂₅₅)×

20＝mM 5-FC

和

(0.1849×OD₂₅₅-0.04907×OD₂₉₀)×

20＝mM 5-FU

用计算机计算原始细胞提取物中活性单位的数据(1单位＝1umol/分钟5-FC向5-FU的转化量)。假转染反应、BB1转染反应和无酶的反应不产生酶活性，而全部三种胞嘧啶脱氨酶转染体都表现出酶活性。转染体1-1具有0.41×10^-3单位，1-4具有0.54×10^-3单位，2-6具有0.26×10^-3单位。用1ug/ml胞嘧啶脱氨酶进行的对照测定将所有5-FC转化成了5-FU。假定纯胞嘧啶脱氨酶的活性是40u/mg，这三种活性胞嘧啶脱氨酶表示10ng(1-1)，13.5ng(1-4)，和7.3ng(2-6)。

也可以对这些相同样本进行单独测定。每个测定管中含有50ul的上清液或1ug/ml胞嘧啶脱氨酶，130ul PBS，20ul30mM5-FC，和1u Ci〔³H〕5-FC。将这些反应物培养24小时，使其蒸发，将蒸发残留物再溶解在20ul的甲醇中，将样本点到硅凝胶薄层层析分析(TLC)板上。将该平板在96∶4的丙酮/水中进行显色，丙酮/水溶液中对于5-FC向5-FU转化的Rf′5分别是0.2和0.8。将TLC平板上切下合适的部分并将其置于闪烁液体中。将这样本在闪烁计数器中计数并测定每个样本中5-FC和5-FU的相对量。假转染组和BB1组测定没有产生5-FU，而所有转染体将14％的5-FC转化成5-FU。这个数据核算为0.6×10^-3单位/每样本。证实了在UV实验中计算出的量。使用1ug/ml胞嘧啶脱氨酶的对照反应将全部的5-FC转化成了5-FU。

实验表明胞嘧啶脱氨酶转染体确实表达了活性酶。这个实验与Western吸印分析都说明该重组酶的比活性与从酵母中分酶出的酶活性是相同的。

因此，本文公开了一种热稳定性胞嘧啶脱氨酶及纯化和重组生产该酶的方法。尽管本发明详细描述了优选的实施例，但是应当明白的是，这只是解释但不限制由附加权利要求所要求的发明范围，而且在不脱离本发明精神情况下可以进行明显的变化。

Claims (7)

1.一种产生编码热稳定性胞嘧啶脱氨酶的核酸的方法，其特征在于，该胞嘧啶脱氨酶是啤酒酵母的胞嘧啶脱氨酶而且其氨基酸序列如图6或图10所示，该方法包括：

(a)以啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae的基因组文库为模板进行聚合酶链反应，以扩增出编码热稳定性胞嘧啶脱氨酶的核酸分子；

(b)分离出步骤(a)中扩增出的核酸分子，该核酸分子编码氨基酸序列如图6或图10所示胞嘧啶脱氨酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增出的核酸分子的核苷酸序列如图10所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中分离核酸分子是通过制备性的琼脂糖凝胶电泳进行。

4.一种产生热稳定性胞嘧啶脱氨酶的方法，其特征在于，该胞嘧啶脱氨酶是啤酒酵母的胞嘧啶脱氨酶，该方法包括：

制备啤酒酵母的自溶产物；

然后从该自溶产物中分离纯化出啤酒酵母胞嘧啶脱氨酶，该胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如图6或图10所示。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，制备啤酒酵母的自溶产物的步骤是通过：

(a)将啤酒酵母与乙酸乙酯混合，并加入磷酸钾缓冲液，其中该缓冲液含有硫酸铵、EDTA和二硫苏糖醇，从而制得啤酒酵母的自溶产物；

而且啤酒酵母胞嘧啶脱氨酶的分离纯化的步骤是通过：

(b)离心步骤(a)中的自溶产物，收集上清液以去除细胞碎片，然后使上清液中存在的蛋白质沉淀；

(c)将该蛋白质沉淀溶解在含有EDTA和二硫苏糖醇的缓冲液中；

(d)对沉淀物溶解后形成的溶液进行硫酸铵分级，从而使胞嘧啶脱氨酶与蛋白质的比例高于在蛋白质沉淀中的比例；

(e)将步骤(d)中形成的沉淀溶解在pH8.0的Tris缓冲液中，以从中去除多余的硫酸铵；

(f)在阴离子交换柱上进行阴离子交换色谱，其中洗脱液为含有二硫苏糖醇的pH为8的Tris缓冲液，且线性梯度为0-0.3M KCl，然后从阴离子交换柱上收集含有热稳定性胞嘧啶脱氨酶的部分；

(g)将所述的含有胞嘧啶脱氨酶的部分置于凝胶柱，用含有二硫苏糖醇的缓冲液洗脱，从该凝胶柱收集含胞嘧啶脱氨酶的部分，用pH7且含有硫酸铵、EDTA和二硫苏糖醇的缓冲液对该含有胞嘧啶脱氨酶的部分进行透析，以产生含胞嘧啶脱氨酶的透析液；

(h)用pH7且含有硫酸铵、EDTA和二硫苏糖醇的缓冲液，对该含胞嘧啶脱氨酶的透析液进行疏水交互作用色谱，用1.8-0M硫酸铵线性梯度洗脱胞嘧啶脱氨酶，然后收集含胞嘧啶脱氨酶的部分；和

(i)对步骤(h)的含胞嘧啶脱氨酶的部分，通过凝胶渗透柱，使用含二硫苏糖醇的缓冲液进行凝胶渗透色谱，从而产生纯化的胞嘧啶脱氨酶。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(a)、(c)、(f)、(g)、(h)、(i)中二硫苏糖醇的浓度为0.1mM，在步骤(a)、(c)、(g)和(h)中EDTA的浓度为5mM。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中硫酸铵的浓度按重量/体积计为15％，在步骤(g)和(h)中硫酸铵的浓度为1.8M。

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