CZ283492B6 - Způsob výroby rekombinované tepelně stálé cytosindeaminasy - Google Patents

Abstract

Řešení se týká tepelně stálé cytosindeaminázy a jejího kódového řetězce, dále její izolace, čištění a také produkce rekombinantního enzymu. Tepelně stálý enzym je možno izolovat z kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Takto izolovaný enzym má molekulovou hmotnost přibližně 32 000 při stanovení chromatografií na gelu a je tvořen dvěma podjednotkami, z nichž každá má molekulovou hmotnost přibližně 17 000. Takto získaný tepelně stálý enzym nemá žádnou podstatnou homologii s jinými známými bílkovinami se známým řetězcem.ŕ

Description

Izolovaný řetězec nukleotidů kódující tepelně stálou cytosindeaminázu, rekombinantní vektor pro jeho expresi a buňky transformované tímto vektorem, tepelně stálá cytosindeamináza a způsob její výroby

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby enzymu cytosindeamináza, čištění tohoto enzymu a produkce tepelně stálého enzymu při použití rekombinantního materiálu ze Saccharomyces cerevisiae.

Dosavadní stav techniky

Cytosindeamináza (CDasa, EC 3.5.4.1) katazyluje hydrolýzu cytosinu na uráčil podle reakčního schéma

nh2			0
^CH	cytosindeamináza	II HfT XCH 1 II CH H
J!h H	r	---► Λ
	h2o	nh3

cytosin (4-amino-2-oxopyrimidin) uráčil (2,4-dioxopyrimidin).

Enzym, který hraje důležitou úlohu při mikrobiálním metabolismu pyridinu, byl popsán v publikaci O' Donovan G.A. a Neuhard J., 1970, Bact. Rev. 34:278 - 343). Enzym byl izolován z několika různých mikroorganismů, dosud však nebylo prokázáno, že by se vyskytoval v buňkách savců (Nishiyama R. a další, 1985, Cancer Res. 45:1753 - 1761).

Fyzikální vlastnosti enzymů z různých organismů se podstatně liší zejména molekulovou hmotností, stabilitou a složením podjednotek. Například byl čištěn enzym ze Salmonella typhimurium pomocí SDS-PAGE až do homogenity a bylo prokázáno, že je tvořen čtyřmi podjednotkami, z nichž každá má molekulovou hmotnost 54 kDa, jak bylo popsáno v publikaci West T. P. a další, 1982, Biochim. Biophys. Acta 719, 251 - 258. Dále byl čištěn enzym z E. Coli, který má molekulovou hmotnost 200 kDa a je tvořen podjednotkami s molekulovou hmotností 35 a 46 kDa podle publikace Katsuragi a další, 1986, Agric. Biol. Chem. 50:1721 - 1730. Oba uvedené enzymy jsou stálé při vyšší teplotě a udržují si vysokou účinnost i pri teplotě 55 °C.

Jako zdroj tohoto enzymu byly užity rovněž pekařské kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Enzym, získaný z tohoto zdroje má 34 kDa molekulovou hmotnost, jak bylo stanoveno filtrací na gelu podle publikací Ipata P. L. a další, 1971, Biochemistry, 10:4270 - 4276 a Ipata P. L. a Cercignani G., 1978, Meth. Enz. 51:394 - 401. Podle SDS-PAGE a podle analýzy aminokyselin má enzym molekulovou hmotnost 32 až 33 kDa podle publikace Yergatian S. a další, 1977, Experientia 33:1570 - 1571. Tento enzym je tedy patrně monomerní bílkovina.

Roztoky izolovaného enzymu z kvasinek si udržují svoji účinnost alespoň 48 hodin při skladování při teplotě 4 °C v rozmezí pH 5 až 9, jak bylo popsáno v svrchu uvedených

- 1 CZ 283492 B6 publikacích Ipaty a dalších, 1971 a 1978. Avšak při teplotě 37 °C ztrácí surový enzym z kvasinek polovinu své účinnosti v průběhu 1 hodiny, jak bylo popsáno v publikaci Kream J. a Chargaff E., 1952, J. Amer. Chem. Soc., 74:5157 - 5160, čištěná forma enzymu má poločas 30 minut (Katsuragi, 1988, osobní sdělení). Poločas při teplotě 37 °C je možno zvýšit na 28 dnů tak, že se enzym imobilizuje na epoxyakrylových kuličkách, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Katsuragi a další, 1987. To znamená, že tepelná nestálost enzymu z kvasinek a jeho nízká molekulová hmotnost tento enzym odlišuje od dříve popsaných bakteriálních enzymů.

Uvedený enzym se užívá k léčebným účelům, zejména pro přeměnu prekursoru, 5-fluorcytosinu (5-FC) na protinádorovou látku 5-fluoruracil (5-FU), jak bylo popsáno ve shora uvedených publikacích Katsuragi a kol., 1987, Nishiyama a kol., 1985 a Sakai T. a kol. 1985, J. Biotech. 2:13 až 21 Senter P. D. a kol., 1987, US patentová přihláška č. 081382. Avšak bakteriální zdroje enzymu jsou pro toto použití nevýhodné vzhledem k tomu, že je zapotřebí kultivace ve velkém měřítku k získání dostatečného množství enzymu, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Sakai a kol., 1985. Mimoto mohou mikrobiální extrakty působit u nemocných nežádoucí vedlejší účinky.

K překonání těchto problémů se jako zdroje enzymu mohou užít kvasinky. Je však zapotřebí před použitím enzymu odstranit jeho tepelnou nestálost, jak bylo popsáno ve shora uvedené publikaci Katsuragi a kol., 1987. Izolace a čištění tepelně stálého enzymu z kvasinek tedy poskytuje zdokonalený enzym pro použití k léčbě nádorů. Mimoto dovoluje klonování genu pro tepelně stálý enzym z kvasinek uskutečnit určité změny vlastního genu, řetězců, které řídí jeho expresi a mimoto je možno spojit gen s jinými molekulami. Tyto nové konstrukce zvyšují účinnost nebo použitelnost enzymu pro léčbu zhoubných nádorů.

Vynález je založen na překvapivém objevu tepelně stálého enzymu z kvasinek. Analýza řetězce aminokyselin tohoto enzymu neprokazuje žádnou podstatnou homologii se známými řetězci jiných bílkovin.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je izolovaný řetězec nukleotidů, který je kódem pro tepelně stálou cytosindeaminázu se sledem

START

ATG

GTG

ACA

GGG GGA ATG

GCA

AGC

AAG TGG

GAT

CAG

AAG

GGT

ATG

211

M

V

T

G

G

M

A

S

K

W

D

Q

K

G

M

GAC

ATT

GCC

TAT

GAG

GAG

GCG

GCC

TTA

GGT

TAC

AAA

GAG

GGT

GGT

256

D

I

A

Y

E

E

A

A

L

G

Y

K

E

G

G

GTT

CCT

ATT

GGC

GGA

TGT

CTT

ATC

AAT

AAC

AAA

GAC

GGA

AGT

GTT

301

V

P

I

G

G

C

L

I

N

N

K

D

G

S

V

CTC

GGT

CGT

GGT

CAC

AAC

ATG

AGA

TTT

CAA

AAG

GGT

TCC

GCC

ACA

346

G

R

G

H

N

M

R

F

Q

K

G

S

A

T

CTA

CAT

GGT

GAG

ATC

TCC

ACT

TTG

GAA AAC

TGT

GGG

AGA

TTA

GAG

391

L

H

G

E

I

s

T

L

E

N

C

G

R

L

E

GGC

AAA

GTG

TAC

AAA GAT

ACC

ACT

TTG

TAT

ACG

ACG

CTG

TCT

CCA

436

G

K

V

Y

K

D

T

T

L

Y

T

T

L

S

P

TGC

GAC

ATG

TGT

ACA

GGT

GCC

ATC

ATC

ATG

TAT

GGT

ATT

CCA

CGC

481

-2CZ 283492 B6

c

D

M

c

T

G

A

I

1

M

Y

G

I

P

R

TGT

GTT

GTC

GGT

GAG AAC

GTT

AAT

TTC

AAA

AGT

AAG GGC

GAG

AAA

526

C

V

V

G

E

N

V

N

F

K

S

K.

G

E

K

TAT

TTA

CAA

ACT

AGA

GGT

CAC

GAG GTT

GTT

GTT

GTT

GAC

GAT

GAG

571

Y

L

Q

T

R

G

H

E

V

V

V

V

D

D

E

AGG TGT

AAA

AAG

ATC

ATG

AAA CAA

TTT

ATC

GAT

GAA

AGA CCT

CAG

616

R

C

K

K

I

M

K

Q

F

I

D

E

R

P

Q

GAT

TGG

TTT

GAA GAT

ATT

GGT

GAG

TAG

641

D

W

F

F

D

1

G

E

STOP

Vynález se rovněž týká rekombinantních vektorů pro expresi, které obsahují uvedený nukleotidový řetězec a pomocí nichž je možno dosáhnout exprese tohoto řetězce, dále se vynález týká hostitelských buněk, transformovaných pomocí uvedeného vektoru a způsobu výroby rekombinantní, tepelně stálé CD-ázy nebo jejího funkčního ekvivalentu.

Vynález se rovněž týká izolované, tepelně stálé CD-ázy nebo funkčně ekvivalentní bílkoviny. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu jde o enzym, který byl izolován ze Saccharomyces cerevisiae.

Vynález bude podrobněji popsán v souvislosti s přiloženými výkresy.

Popis výkresů

Na obr. 1 je znázorněna analýza CD-ázy na SDS-PAGE, šlo o 14% polyakrylamid za neredukčních podmínek. V drahách 1 a 9 jsou značící bílkoviny. V dráze 2 je supematant ze stupně 1, příkladu 1 po autolýze. V dráze 3 je produkt po vysrážení 70% síranem amonným ze stupně 2, příkladu 1. V dráze 4 je produkt po vysrážení 50 až 73% síranem amonným ze stupně 2, příkladu 1. V dráze 5 je produkt, získaný chromatografií na Q-Sepharose ve stupni 3, příkladu 1. V dráze 6 je produkt po průchodu sloupcem G-75 v stupni 4, příkladu 1. V dráze 7 je produkt po čištění pomocí oktyl-Sepharose ve stupni 5, příkladu 1. V dráze 8 je konečný produkt, získaný po druhém průchodu sloupcem G-75 ve stupni 6, příkladu 1.

Na obr. 2 je znázorněn průběh eluce CD-ázy ze sloupce G-50 Sephadex s rozměrem 1,5 x 100 cm. V části A bylo smíseno 27 jednotek čištěné CD-ázy se 2 mg ribonukleázy A, 2 mg ovalbuminu a 1 mg chymotrypsinogenu a sloupec byl vymýván PBS. Frakce byly sledovány při 280 nm ke stanovení celkovéhu obsahu bílkoviny a při 290 nm při použití 5FC jako substrátu ke stanovení účinnosti CD-ázy. V části B je znázorněna eluce enzymu ze sloupce G-5D Sephadex bez kalibračních standardů.

Na obr. 3 je znázorněna stálost enzymu při teplotě 37 °C. Enzym s účinností 72 jednotek/mg v PBS s obsahem BSA bez proteázy v množství 1 mg/ml byl inkubován při teplotě 37 °C v polypropylenové zkumavce. V různých intervalech byla stanovena účinnost enzymu při použití 10 μΐ roztoku enzymu.

Na obr. 4 je znázorněn profil enzymu, čištěného HPLC. Horizontální úsečky znázorňují frakce, které byly spojeny pro analýzu řetězce aminokyselin.

Na obr. 5 je znázorněna analýza enzymu pomocí SDS-PAGE po čištění HPLC při použití 15% polyakrylamidu za redukčních podmínek. V dráze 1 je frakce A z obr. 4, v dráze 2 frakce B z obr. 4.

Na obr. 6 je znázorněn částečně řetězec aminokyselin enzymu. Jsou znázorněny peptidy, získané po štěpení CNBr (série M), endoproteinázou Glu-C (série E), endoproteinázou Lys-C (série K) a endoproteinázou Asp-H (série D).

Na obr. 7 jsou znázorněny nukleotidové řetězce příměrů CDA4R1 aCDA5AS, odpovídající řetězce aminokyselin a relativní polohy těchto primerů v řetězci aminokyselin pro CD-ázu. Primer CDA4R1 je orientován ve směru 5' ke 3' ve směru řetězce a primer CDA5AS je orientován 5’ až 3' proti smyslu řetězce.

Na obr. 8 je znázorněn nukleotidový řetězec DNA, odvozené od klonu genomu, který je kódovým řetězcem pro uvedený enzym.

Na obr. 9 jsou znázorněny otevřené řetězce ve směru odečítání v řetězci genomu pro enzym.

Na obr. 10 je znázorněn nukleotidový řetězec a odpovídající řetězec aminokyselin pro řetězce z obr. 9. Další aminokyseliny, které je možno předpovědět: z řetězce nukleotidů, které však nebyly prokázány při stanovení řetězce peptidu, jsou rovněž zaznamenány na zakončeních řetězce, kodony START a STOP jsou označeny rámečkem.

Na obr. 11 je znázorněn plasmid jako vektor pro expresi s obsahem genu pro CD-ázu.

Na obr. 12 je znázorněna mapa restrikčních míst pro vektor pH3M.

Při provádění způsobu podle vynálezu bude užíváno, není-li výslovně uvedeno jinak, běžných postupů z chemie bílkovin, molekulární biologie, mikrobiologie a technologie s použitím rekombinantní DNA. Tyto postupy byly podrobně popsány v literatuře, souhrnnými publikacemi jsou například Scopes R. K., Protein Purification Principles and Practice, 2. vadání, (SpringerVerlag 1987), Methods in Enzymology, S. Colowick and N. Kaplan eds., Academie Press. Inc., 30 Maniatis, Fritsch and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, 1989, Oligonucleotide Synthesis. M. J. Gait ed. 1984).

A. Definice

V průběhu popisné části bude užito některých pojmů, které budou dále podrobněji definovány.

Tepelně stálá cytosindeamináza je CD-áza, která zůstává ve volném, neimobilizovaném stavu stálá alespoň z 50 % po dobu více než 12 hodin, s výhodou více než 1 den a zvláště více než 3 dny při teplotě 37 °C při stanovení přeměnou 5FC na 5FU za přítomnosti izolovaného enzymu, 40 jak bude dále vysvětleno.

Řetězce aminokyselin nebo bílkoviny jsou v podstatě homologní sjiným řetězcem aminokyseliny nebo bílkoviny v případě, že se shoduje alespoň 50 %, s výhodou alespoň 85 % a zvláště alespoň 90 až 95 % aminokyselin v definovaném úseku molekuly. Mimoto mohou 45 odlišné aminokyseliny zahrnovat substituce, vypuštění nebo přidání aminokyselin.

Pod pojmem funkční ekvivalent se rozumí skutečnost, že řetězec aminokyseliny nebo bílkoviny definuje úsek, při jehož použití se získá tepelně stálý enzym tak, jak bylo svrchu popsáno, to znamená enzym schopný přeměnit 5-FC na 5-FU, jak bude dále popsáno 50 v příkladech. Bílkovina, která je funkčním ekvivalentem tepelně stálé CD-ázy, nemusí mít přesný nebo úplný řetězec aminokyselin tohoto enzymu tak, jak je uveden na výkresech. Bílkovina může být tvořena biologicky účinným fragmentem enzymu. Mimoto může bílkovina obsahovat přidané nebo nahrazené aminokyseliny, nebo z ní mohou být některé aminokyseliny vypuštěny, pokud bílkovina zůstává biologicky účinná.

-4CZ 283492 B6

Čištěná bílkovina je v podstatě prostá jiných látek. Například bílkovina A je v podstatě prostá bílkoviny B, která je směsí jiných buněčných složek a bílkovin tehdy, když alespoň 50% hmotnostních, s výhodou 75 a zvláště 90 až 95 nebo až 99 % hmotnostních směsi tvoří složka A. Tento pojem však neuvádí, jakým způsobem byla bílkovina získána. To znamená, že čištěná bílkovina může být získána rekombinantní technikou, produkována synteticky nebo přímo izolována z organismu, v němž se přirozeně vyskytuje.

Pojmy polypeptid a bílkovina jsou užity ve svém nejširším smyslu, to znamená, že jde o jakýkoliv polymer aminokyselin, alespoň dipeptid, vázaný peptidovou vazbou. Může tedy jít o oligopeptidy, fragmenty bílkovin, analogy, muteiny, složené bílkoviny a podobně. Pojem zahrnuje nativní i rekombinantní bílkoviny.

Rekombinantní bílkoviny nebo polypeptidy jsou takové látky, kjejichž expresi došlo na základě rekombinantního řetězce nukleotidů, to znamená, že jsou produkovány buňkami, trans formovanými exogenní konstrukcí DNA, která je kódem pro požadovaný polypeptid.

Pod pojmem rekombinantní se rozumí nukleotidový řetězec, který je kódem pro CD-ázu, jde tedy o nukleovou kyselinu genomu, cDNA semisyntetického nebo syntetického původu, která vzhledem ke svému původu nebo k následným manipulacím je nukleotidovým řetězcem, který se přirozeně nevyskytuje nebo řetězcem nukleotidů, který je vázán na nukleovou kyselinu, odlišnou od kyseliny, k níž je přirozeně vázán.

Pojem replikon je jakýkoliv genetický prvek, například plasmid. chromoson, nebo virus, který se v buňce chová jako autonomní jednotka polynukleotidové replikace, to znamená, že je schopen replikace pod vlastním řízením.

Pojem vektor znamená replikon, s nímž je spojen další polynukleotidový segment tak, aby došlo k replikaci a/nebo expresi připojeného úseku.

Vektor pro expresi je vektor, schopný autonomní replikace nebo integrace, obsahující řídicí řetězec, který řídí transkripci a translaci požadovaného nukleotidového řetězce v příslušném hostiteli.

Kódový řetězec je polynukleotidový řetězec, schopný transkripce a/nebo translace na polypeptid.

Řetězec promotoru je řídící oblast DNA, schopná vázat RNA-polymerázu a zahájit transkripci kódového řetězce ve směru smyslu řetězce, tj. k zakončení 3'.

Kódový řetězec je pod řízením promotorového řetězce v buňce v případě, že dochází k transkripci kódového řetězce při vazbě RNA-polymerázy na řetězec promotoru a k translaci výsledné mRNA na polypeptid, pro nějž je kódem kódový řetězec.

Pod pojmem operativně vázaný se rozumí poloha, v níž jsou složky uloženy tak, že se uskuteční jejich obvyklá funkce. To znamená, že řídicí řetězec, operativně vázaný na kódový řetězec je schopen zajistit expresi kódového řetězce.

Řídicí řetězec je řetězec, který řídí transkripci a/nebo translaci kódového řetězce. Může jít například o řetězec promotoru, řetězec pro zahájení a ukončení transkripce nebo zahájení a ukončení translace. Mimoto může jít o řetězce, které řídí zpracování polypeptidu, pro nějž je kódem kódový řetězec. Může tedy jít také o řetězce, které řídí vylučování peptidu, jeho štěpení proteázou a jeho glykosilaci.

-5CZ 283492 B6

Signální řetězec je řetězec, zařazený před kódovým řetězcem. Je kódem pro signální peptid, Nterminální vzhledem k polypeptidu, který určuje v hostitelské buňce přesun plypeptidu na povrch buňky nebo jeho vylučování do prostředí. Tento signální polypeptid je hostitelskou buňkou odštěpen dříve, než bílkovina opustí buňku. Signální řetězce je možno nalézt ve spojení s celou řadou nativních bílkovin u prokaryotických i eukaryotických organismů. Například faktor alfa, nativní bílkovina kvasinek, se z kvasinek vylučuje a její signální řetězec může být připojen k heterologní bílkovině, která má být vylučována do prostředí, jak bylo popsáno v US patentovém spisu č. 4 546 082. Mimoto bylo prokázáno, že pomocí alfa-faktoru a jeho analogů je možno dosáhnou sekrece heterologních bílkovin u různých kvasinek, například Saccharomyces a Kluyveromyces, například podle evropské patentové přihlášky č. 0 301 669, zveřejněné 1. února 1989.

Transformace je zařazení exogenního polynukleotidu do hostitelské buňky. Tento exogenní polynukleotid může být udržován jako plasmid nebo je možno jej integrovat do genomu hostitele.

Pod pojmem rekombinantní hostitelské buňky, hostitelské buňky a podobně se rozumí buňky, které mohou být nebojsou užívány jako příjemci rekombinantních vektorů nebo jiné přenášené DHA a zahrnují potomstvo původních buněk, u nichž byla proveden transfekce. Je zřejmé, že potomstvo jediné původní buňky nemusí být zcela identické, pokud jde o celkovou DNA nebo DNA genomu, s původní buňkou vzhledem k možnosti náhodné nebo i úmyslné mutace. Tento pojem tedy označuje potomstvo původní buňky, které je dostatečně podobné původí buňce, pokud jde o požadovanou vlastost, například o substituci nativního genu, který je kódem pro určitý enzym klonovaným genem, vázaným na strukturní gen, který je kódem pro požadovaný výsledný produkt.

Therapeuticky účinné množství CD-ázy je množství, které je dostatečné k převedení příslušného substrátu na účinnou cytotoxickou látku, která způsobí inhibici růstu buněk zhoubného nádoru.

B. Obecné postupy

Vynález se týká CD-ázy z kvasinek s tepelnou stálostí. Tento enzym má vlastnosti, které jej odlišují od dříve izolovaných enzymů z kvasinek. Molekulová hmotnost nově izolovaného enzy mu z kvasinek je přibližně 32 kDa při stanovení chromatografií na gelu. Při SDS-PAGE je možno pozorovat hlavní pás s molekulovou hmotností 17 kDa, což znamená, že enzym je dimerem, jehož každá podjednotka má molekulovou hmotnost přibližně 17 kDa. Mimoto byly dříve izolované enzy my z kvasinek vysoce tepelně labilní při teplotě 37 °C, zatímco čištěný enzym podle vynálezu je při této teplotě stálý. Mimoto nemá řetězec aminokyselin tohoto nového enzymu žádnou významnou homologii s řetězcem jiných známých bílkovin. Při klonování a expresi genu, který je kódem pro tento nový enzym se získá kódový řetězec s délkou přibližně 474 párů bází, který je kódem pro bílkovinu o 158 aminokyselinách s molekulovou hmotností přibližně 17 506. Tepelně stálý enzym je možno izolovat z kvasinek včetně ascosporogenních, basidiosporogenních a nedokonalých kvasinek. S výhodou se enzym izoluje z čeledi Saccharomycetoideae, Saccharomyces sp., s výhodou ze Saccharomyces cerevisiae. Velmi dobrým zdrojem enzy mu je běžné lisované pekařské droždí (Fleischmann), které se běžně dodává a je možno jej získat v každé pekárně a v běžných potravinářských obchodech.

Běžný způsob čištění tohoto enzymu se liší od svrchu uvedených postupů podle publikací Katsuragi a další, 1986, 1987 a 1988 a Ipata a další, 1971 a 1978. Při tomto postupu se užívá různých způsobů čištění včetně dalšího čištění na gelu, které je zařazeno mezi chromatografií na aniontoměniči a hydrofobní chromatografií, tak jak bude dále popsáno, liší se také podmínky

-6CZ 283492 B6 čištění včetně použití různých pufrů, různého pH a různých složek pufrů, například EDTA a DTT. Mimoto dříve známými postupy není možno získat enzym s dobrou tepelnou stabilitou.

První stupeň čištění tepelně stálého enzymu z kvasinek zahrnuje rozrušení kvasinkových buněk, čímž se získá autolyzát s obsahem CD-ázy. Autolýzu je možno provést několika známými postupy. Je například možno dosáhnout plasmolýzy působením toluenu způsobem podle publikace Kunitz M. J., 1947, J. Gen. Physiol., 29:393. Zvláště vhodné je působení organického rozpouštědla jako ethylacetátu s následným přidáním pufru k udržení pH roztoku na hodnotě přibližně 7. Vhodným pufrem je pufr s obsahem fosforečnanu draselného, fyziologický roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrem. Tris-pufr a některé další známé pufry. Pufr s výhodou obsahuje síran amonný v koncentraci 1 až 25, s výhodou 15 % a také EDTA a dithiothreitol DTT ke stabilizaci enzymu. Je také možno v pufrech EDTA a DTT vynechat. Koncentrace EDTA je v případě použití 0,1 až 10, s výhodou 5 mM, koncentrace DTT je 0,01 až 10, s výhodou 0,1 mM. Směs se míchá několik dnů a současně se pH udržuje na hodnotě 7. Buněčná drť se odstraní odstředěním.

Po autolýze se bílkovina vysráží z autolyzátu síranem amonným, který se přidává v koncentraci, která může zajistit vyšší podíl enzymu v bílkovině. Je například možno přidat síran amonný nejprve do nasycení 60 až 80 %, s výhodou 70 %. Do reakční směsi se s výhodou přidá EDTA v množství 1 až 3, zejména 1, 5 až 2,0 g/1, reakce se nechá probíhat několik hodin a sraženina se oddělí odstředěním. Usazenina se rozpustí ve vhodném pufru, například PBS při pH přibližně 7,0, pufr s výhodou obsahuje EDTA a DTT jako svrchu, pak se roztok dialyzuje proti témuž pufru. Dialyzát je možno podruhé zpracovat síranem amonným do dosažení koncentrace přibližně 50 % za přítomnosti EDTA jako svrchu. Sraženina se opět oddělí odstředěním a přidá se síran amonný do nasycení přibližně 73 % v supematantu. Sraženina se oddělí a rozpustí ve vhodném pufru o pH 6,5 až 8,5, s výhodou vTris-pufru o pH 8,0 s obsahem DTT ve svrchu uvedené koncentraci. Rekonstituovaná sraženina se pak dialyzuje několik hodin proti tomuto pufru. Enzym je možno z dialyzátu dále čistit chromatografíí na aniontoměniči, například při použití zesítěné agarósy nebo celulósy. Zvláště vhodné jsou aniontoměniče Q-Sepharose a DEAE-Sepharose (Pharmacia). Vhodnými pufry k dosažení rovnovážného stavu jsou například Tris-pufr nebo fosfátový pufr, přičemž eluce se provádí při použití lineárního gradientu. Zvláště vhodné je použití 20 mM Tris s obsahem 0,1 mM DTT o pH 8,0 s lineárním gradientem 0 - 0,3 M KC1 v tomto pufru.

Po chromatografíí na aniontoměniči se frakce s obsahem enzymu spojí a zahustí ultrafiltrací například při použití filtru, který odděluje látky od molekulové hmotnosti 30 000 nebo nižší.

Pak se roztok s obsahem enzymu nechá projít sloupcem, obsahujícím gel. Zvláště vhodným materiálem je zesítěný dextran, agarosa nebo dextran/bisakrylamidové gely, s výhodou Sephadex G-75, G-100 nebo Sephacryl S-300. Elučním činidlem může být jakýkoliv běžný známý pufr o pH 7, s výhodou jde o svrchu popsaný pufr s obsahem PBS a DTT. Frakce s obsahem enzymu se spojí adialyzují proti pufru, například s fosforečnanem draselným. Pufr s výhodou obsahuje 1 až 2 M síranu amonného a mimoto EDTA a DTT, jak bylo svrchu popsáno při pufru pro autolyzát. V případě potřeby je možno užít ještě druhého sloupce s obsahem gelu, účinné frakce se zahustí ultrafiltrací při použití filtru, který oddělí látky s molekulovou hmotností od například 5000.

Pak se materiál s obsahem enzymu nanese na sloupec, který odděluje látky na základě hydrofobnosti, sloupec se vymývá například reverzním gradientem síranu amonného v pufru s obsahem fosfátu draselného. Frakce s obsahem enzymu se spojí a zahustí ultrafiltrací při použití filtru, který odděluje látky od molekulové hmotnosti 5000. Koncentrát je možno skladovat před dalším použitím ve zmrazeném stavu. Avšak v případě, že nebyla provedena druhá filtrace na gelu a/nebo v případě, že specifická účinnost enzymu je nízká, je možno provést

-7CZ 283492 B6 další filtraci na gelu stejně jako svrchu. Takto čištěný enzym je tepelně stálý a je proto možno jej skladovat ve volné formě ve zmrazeném nebo lyofilizováném stavu.

Účinnost enzymu je možno v průběhu čištění sledovat známým způsobem. Je například možno 5 sledovat přeměnu cytosinu na uráčil nebo jeho deriváty za přítomnosti enzymu přímo spektrofotometricky z poklesu absorbce při 286 nm po dosažení přeměny, jak bylo popsáno v publikaci Ipata P. L. aCercignani G., 1978, Meth. Enz. 51:394 - 401. Účinnost je možno stanovit také sledováním přeměny 5FC na 5FU spektrofotometricky způsobem, který byl popsán ve svrchu uvedené publikaci Nishiyama a další, 1985.

Byl stanoven řetězec tepelně stálé CD-ázy, čištěné tímto způsobem a také parciální řetězec aminokyselin, který je znázorněn na obr. 6. Tento řetězec nemá podstatnou homologii s žádným dosud známým proteinem, jehož řetězec byl stanoven. Na základě těchto informací je možno tepelně stálou CD-ázu získat rekombinantním postupem. Je například možno synteticky připravit 15 kódový řetězec DNA pro tento enzym, v závislosti na řetězci aminokyselin, při použití příslušných kodonů, obecně se postupuje tak, že se zařadí výhodné kodony pro předpokládaného hostitele pro expresi enzymu. Úplný řetězec se pak sestaví známým způsobem, například podle publikací Edge, 1981, Nátuře 292:756, Nambair a další, 1984, Science 223:1299, Jay a další, 1984, J. Biol. Chem. 259:6311.

Rekombinantní, tepelně stálý enzym je možno připravit také tak, že se připraví oligonukleotidové sondy s obsahem kodonů pro část stanoveného řetězce aminokyselin a pak se sledují sestavy cDNA nebo genomu na gen, který je kódem pro tento enzym. Základní postupy pro přípravu sond a sestav DNA a sledováním nukleových kyselin hybridizací jsou známé metody, které jsou 25 popsány například ve svrchu uvedené publikaci Oligonucleotide Synthesis, a ve svrchu uvedené publikaci T. Maniatise a dalších. Jakmile byl identifikován určitý klon ze sledované sestavy pomocí pozitivní hybridizace, je možno provést analýzu pomocí restrikčních enzymů a stanovení řetězce DNA, aby bylo možno potvrdit, že opravdu sestava obsahuje gen pro uvedený enzym. Mimoto je možno užít PCR k amplifíkaci a detekci kódového řetězce pro enzym. Tento postup 30 byl popsán ve svrchu uvedené publikaci Saiki a další, 1986 a v US patentových spisech č. 4 683 195 a 4 683 202. Analýzu nukleotidového řetězce pro produkty, amplifikované pomocí PCR je možno provést přímou analýzou řetězce podle svrchu uvedené publikace Saiki a další, 1988. Je také možno postupovat tak, že se amplifikovaný řetězec před analýzou klonuje. Postup pro přímé klonování a analýzu řetězce enzymaticky amplifikovaných segmentů genomu byl 35 popsán v publikaci Scharf a další, 1986, Science 233:1076. Při tomto postupu se modifikují primery, užité při PCR v blízkosti svého 5’-zakončení, tak, aby vznikla vhodná místa působení restrikčních enzymů například pro přímé klonování ve vektoru M13. Po amplifíkaci se produkty PCR rozštěpí vhodnými restrikčními enzymy. Restrikční fragmenty se uloží do vektoru M13 a užijí k transformaci hostitelských buněk, například JM 103, buňky se pěstují na plotnách 40 a výsledné kolonie se sledují na hybridizací při použití značené oligonukleotidové sondy.

V oboru je znám ještě větší počet jiných metod pro klonování a pro analýzu řetězce.

Při zvláště výhodném provedení vynálezu byly syntetizovány dva oligonukleotidové primery při použití parciálního řetězce aminokyselin a použití nejvhodnějších kodonů podle publikace 45 Guthrie C., a Abelson J., 1982, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression, str. 487 - 528, (J. N. Strathem a další, CSH). Při tomto postupu byly užity primery pro PCR, v nichž byla DNA sestavy genomu kvasinek užita jako templát. Oligonukleotidy byly syntetizovány z těch oblastí enzymu, v nichž vykazuje řetězec aminokyselin význačné použití určitých zastupujících kodonů a/nebo degeneraci řetězce. První primer, 50 CDA4R1 byl 42-mer s obsahem 33 nukleotidů, odpovídajících aminoterminálnímu řetězci aminokyselin, druhý primer CDA5AS obsahoval nukleotidy, komplementární k řetězci v blízkosti karboxyterminálního zakončení bílkoviny. Řetězec těchto oligonukleotidů je znázorněn na obr. 7. Jako templát pro reakce PCR byly užity dvě sestavy DNA genomu, přičemž v obou byl nalezen jediný specifický fragment o délce přibližně 350 párů bází, to znamená, že

-8CZ 283492 B6 jde o předpokládaný rozměr podle řetězce aminokyselin. PCR primery byly konstruovány s místem působení enzymu EcoRI na svém 5’-zakončení, čímž se usnadní klonování fragmentů, získaných při PCR. Fragment o 350 párech bází byl čištěn elektroforézou na gelu a subklonován v příslušném vektoru pro stanovení řetězce DNA.

Fragment, získaný PCR se užije také jako specifická sonda k vyšetření sestavy DNA z kvasnic hybridizační technikou při použití kolonií a filtru. Počáteční pokusy pro použití oligonukleotidů, získaných podle svrchu vedené publikace Guthrie a Abelson, 1982 selhaly vzhledem k nízkému poměru signálu a šumu po hybridizaci. Všechny potenciální klony byly znovu vyšetřeny k ověření pozitivního hybridizačního signálu. Z jednotlivých klonů byly čištěny plasmidy a byla zjištěna místa působení restrikčních enzymů štěpením příslušnými enzymy jednotlivě nebo ve směsích.

Jak klonované fragmenty PCR, tak klony genomu, které jsou kódovými řetězci pro enzym byly podrobeny analýze řetězce DNA. Variace v reakčních podmínkách dovolovaly analýzu řetězce těsně za primerem až do vzdálenosti několik set párů bází. Získaný řetězec DNA je znázorněn na obr. 8. Je zřejmé, že řetězce mají 93 % homologii, to znamená, že 330 bází je stejných a 23 odlišných, otevřené řetězce jsou znázorněny na obr. 9. Na obr. 10 je znázorněn nukleotidový řetězec a odvozený řetězec aminokyselin pro druhý z otevřených řetězců z obr. 9, řetězec potvrzuje původně stanovený řetězec aminokyselin a předpovídá přidání pouze několika aminokyselin na každém zakončení na základě analýzy čištěné bílkoviny.

Údaje o řetězci DNA pak byly použity ke konstrukci nových PCR primerů pro získání kazet amplifikované DNA. která je kódem pro enzym. Tyto kazety je možno užít v genetických konstrukcích, jimiž má být dosaženo vysoké exprese genu v prokaryontních nebo eukaryontních buňkách, a spojení genu enzymu s jinými molekulami s biologickým účinkem, jako jsou například molekuly imunoglobulinu, které jsou cíleně zaměřeny proti antigenům nádorových buněk.

Kódový řetězec pro enzym je možno klonovat vjakémkoliv vhodném známém vektoru nebo replikonu. Příkladem vektorů typu rekombinantní DNA a příkladem hostitelských buněk mohou být následující buňky: bakteriofág lambda (E. coli), pBR322, (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (gram-negativní bakterie), pGVHOó (gram-negativní bakterie), pLAFRl (gramnegativní bakterie), pME290 (gram-negativní bakterie s výjimkou E. coli), pHV14 (E. coli a Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (SaccharomYces), YCpl9 (Saccharomyces) a virus papilomu skotu (buňky savců).

Kódový řetězec pro enzym je možno uložit pod řízení promotoru, místa pro vazbu ribosomu v případě bakteriální exprese a popřípadě operátoru, splečně jde o řídicí prvky. Tímto způsobem je možno dosáhnout transkripce kódové DNA pro enzym do RNA hostitelské buňky, transformované vektorem s obsahem této konstrukce pro expresi. Kódový řetězec může a nemusí obsahovat signální peptid nebo signální řetězec pro tento peptid. Tento řetězec je možno odstranit v bakteriálním hostiteli při zpracování po translaci, jak bylo popsáno v US patentových spisech č. 4 431 739, 4 425 437 a 4 338 397.

Mimo řídicích řetězců může být žádoucí přidat ještě další regulační řetězce, které upravují expresi řetězce pro enzym realtivně k růstu hostitelské buňky. Tyto řetězce jsou známé a mohou způsobit počátek nebo přerušení exprese na základě chemického nebo fyzikálního popudu včetně přítomnosti regulační látky. Ve vektoru mohou být přítomny ještě další regulační prvky, například ty, které podporují expresi.

Vektor pro expresi se konstruuje tak, že kódový řetězec pro enzym je ve vektoru uložen spolu s příslušnými regulačními řetězci, přičemž poloha a orientace kódového řetězce vzhledem k řídicím řetězcům je taková, že k transkripci kódového řetězce dochází pod řízením řídicích

-9CZ 283492 B6 řetězců, to znamená, že RNA-polymeráza, která se váže na molekulu DNA v místě řídicího řetězce způsobí transkripci kódového řetězce. K tomuto účelu může být vhodné poněkud modifikovat kódový řetězec pro enzym. Může být například připojen k řídicímu řetězci ve správné orientaci. Řídicí řetězce a další regulační řetězce je možno navázat na kódový řetězec 5 před jeho uložením do vhodného vektoru. Je také možno klonovat kódový řetězec přímo ve vektoru pro expresi, který již obsahuje řídicí řetězce a místo působení příslušného restrikčního enzymu.

Je známa řada vektorů pro expresi v prokaryontních buňkách, tyto vektory byly popsány například v US patentových spisech č. 4 440 859, 4 436 815, 4 431 740, 4 431739, 4 428 941, 4 425 437, 4 418 149, 4 411994, 4 366 246, 4 342 832 a také v britských patentových spisech č. 2 121054, 2 008 123, a 2 007 675 a také v evropském patentovém spisu č. 103 395. Vektory pro expresi v kvasinkách jsou popsány například v US patentových spisech č. 4 446 235, 4 443 539, 4 430 428 a v evropských patentových spisech č. 103 409, 100 561 a 96 491. Jsou rovněž známy vektory pro expresi v buňkách savců.

V závislosti na použitém systému pro expresi a na zvoleném hostiteli je produkován enzym rostoucími hostitelskými buňkami, transformovanými svrchu popsaným vektorem pro expresi za podmínek, při nichž může k expresi enzymu dojít. Enzym se pak izoluje z hostitelských buněk a čistí. V případě, že dochází k sekreci bílkoviny do prostředí, je možno enzym čistit přímo z tohoto prostředí. V případě, že k sekreci enzymu nedochází, je nutno jej izolovat z rozrušených buněk. Výběr příslušných podmínek pro pěstování hostitelských buněk a vhodné postupy pro izolaci enzymu může provést každý odborník.

Příkladem jedné z konstrukcí pro řízenou indukci řetězce pro CD-ázu v kvasinkách, je uložení příslušné kazety pro tento enzym do vektoru, vhodného pro kvasinky, někdy je tento nazýván fusionator. Tento vektor je možno získat od Department of Genetics, University of Washington, Seattle, Washington, a od NIH. Jeho konstrukce je znázorněna na obr. 11. V této konstrukci je řetězec pro enzym uložen do řetězce, schopného většího počtu vazeb tak, že k expresi dochází pod řízením vysoce účinného a regulovaného promotoru GAL10 z kvasinek, tak jak byl popsán v publikaci Johnston M., 1987, Microbiol. Rev., 51:458 - 476. Tento promotor odpovídá na přítomnost galaktózy a při jeho použití dochází k indukci vysoké exprese genu pod jeho řízením. Tento vektor je také možno užít k vytvoření složeného genu pro CD-ázu-lacZ při provedení příslušných malých změn v řetězci DNA. Složená bílkovina může usnadnit stanovení indukce, čištění a biochemickou analýzu produktu. Tyto konstrukce mohou být užity k transformaci vhodného kmene kvasinek, například podle publikace Hovland O. a další, 1989, Gene, 83:57 - 64. Tento kmen kvasinek zahrnuje řadu mutací, které jej činí výhodným pro použití se svrchu uvedenou konstrukcí. Specificky obsahuje kmen mutaci gall, což je příčinou deficience pro enzym, který katalyzuje první stupeň využití galaktózy, takže nedochází k vy čerpání galaktózy, která je indukční látkou, ze živného prostředí. Kmen rovněž obsahuje mutaci regl-501, která brání potlačení tvorby glukózy při expresi genu pro galaktózu a dovoluje tím pěstování kultury za optimálních podmínek pro růst a životnost buněk. Indukci je možno snadno provést přidáním galaktózy do prostředí, bohatého na glukózu. Mimoto je ve kmeni přítomno několik mutací, omezujících tvorbu proteázy, čímž se zvyšuje stálost jakékoliv heterologní bílkoviny nebo fragmentu, produkovaného v průběhu růstu. Exprese konstrukce tohoto typu může usnadnit izolaci a čištění enzymu z kvasinek v množství, které bylo dříve nedosažitelné při expresi, dosahované pouze při použití endogenního genu.

Je možno vytvořit ještě další konstrukce pro použití v kulturách buněk savců. V jednom z výhodných provedení vynálezu se kazeta, která je kódem pro enzym spojí pomocí PCR se sekretorickým signálním peptidem pro oncostatin M podle publikace Malik N. a další, 1989, MCB, 9:2847 - 2853. Tuto konstrukci pak je možno uložit do vektoru pro expresi pH3MPy (Stamenkovic, 1990, v tisku). Vektor obsahuje příslušné podpůrné řetězce, promotory, signály pro ukončení a pro zpracování po expresi u savců. Tuto konstrukci je možno přenést do buněk

- 10CZ 283492 B6

COS podle publikace Aruffo A. a Seed B., PNAS (USA), 84:8573 - 8577, prostředí, prosté séra, se izoluje a sleduje na účinnost enzymu v systému, který neobsahuje endogenní enzym. Podobně je možno konstruovat cDNA pro složené geny, které jsou kódem pro enzym a další molekuly, postup se provádí obvyklým způsobem, produkt se užije k transfekci buněk COS a extrakty buněk nebo vzorky živného prostředí se zkouší na přítomnost bílkovin a jejich účinnost.

Další složené geny mohou rovněž najít své použití při rekombinantní produkci enzymu. Je například možno kódový řetězec pro CD-ázu nebo jeho funkční mutantu nebo fragment spojit s řetězcem, který je kódem pro molekuly imunoglobulinu proti antigenu nádorových buněk, čímž se získá složená bílkovina, která obsahuje protilátku i enzym. Byly získány monoklonální protilátky, které rozpoznávají determinanty, uložené přednostně v nádorových buňkách, jak bylo popsáno v publikaci Hellstrom K. E. a Hellstrom 1., 1985, Monoclonal Antibodies for Tumor Detecting and Drug Targeting, str. 17 až 51 (Baldwin a další, vyd., Academie Press. N. Y.). Složené bílkoviny tedy mohou být specificky zaměřeny proti nádorovým buňkám, tak jak bylo popsáno například v US patentovém spisu č. 4 906 562 a v publikaci Hellstrom, 1984, Monoclonal Antibodies and Cancer, str. 31 - 47, (Wright a další, vyd. Marcel Dekker. Inc., N. Y.). Enzym tak může působit přímo na nádorové buňky převedením 5FC na protinádorovou látku 5FU. Složený gen pro enzym a pro protilátku proti nádorovým buňkám vylučuje nutnost chemické vazby obou uvedených bílkovin. Podobně konstrukce cDNA pro obě tyto molekuly může usnadnit expresi v heterologním systému pro expresi.

V jednom ze systémů se získá cDNA pro dlouhý řetězec protilátky proti nádorovým buňkám z buněčné linie, která tuto protilátku produkuje. Pak je možno obvyklým způsobem vytvořit PC R-fragmenty, které jsou kódem pro celý řetězec této cDNA nebo pro jeho část. Pak je možno dosáhnout spojení dvou kazet ve správném směru známým způsobem na několika místech a výslednou složenou konstrukci podrobit zkouškám na produkci bílkoviny s požadovaným biologickým účinkem. Současná transfekce druhým plasmidem, v němž je uložena kódová cDNA pro kratší část řetězce protilátky dovoluje izolaci biologicky účinného fragmentu protilátky, vázaného na účinným enzym. Tímto způsobem lze dosáhnout cíleného přívodu enzymu do určitého místa.

Je také žádoucí získat mutanty a analogy tepelně stálého enzymu, které by byly funkčními ekvivalenty tohoto enzymu. Tyto mutanty nebo analogy je možno připravit odstraněním části kódového řetězce pro enzym, zařazením dalšího řetězce a/nebo náhradou jednoho nebo většího počtu nukleotidů v řetězci. Postupy pro modifikaci nukleotidových řetězců, například cílená mutagenese nebo mutagenese pomocí PCR-oligonukleotidů je v oboru známa a byla popsána například ve svrchu uvedené publikaci Maniatise a dalších.

Enzym podle vynálezu je možno získat také chemickou syntézou peptidů na pevné fázi, při použití známých řetězců aminokyselin nebo řetězců, odvozených od příslušného řetězce DNA odpovídajícího genu. Tyto metody jsou rovněž v oboru známy.

Tepelně stálý enzym je možno užít jako chemotherapeutickou látku. Zejména je možno tento enzym užít in vivo k převedení prekursoru 5FC na protinádorově účinnou látku 5FU. Znamená to, že enzym je možno například podat současně s prekursorem 5FC, například tak, že se chirurgicky uloží enzym do místa nebo do blízkosti místa, v němž se nachází nádor a 5FC se podá perorálně, jak bylo popsáno v publikaci Katsuragi T. a další, 1987, App. Biochem. Biotech., 16:61 - 69. Je také možno postupovat tak, že se enzym přivádí do místa, v němž se nachází nádor ve formě komplexu s protilátkou, specifickou pro příslušný nádor. Tento komplex je možno vyrobit chemickými postupy nebo geneticky tak, že se vytvoří složený gen, obsahující gen pro příslušný imunoglobulin a gen pro enzym, jak bylo popsáno svrchu.

Specifická provedení vynálezu budou popsána v následujících příkladech. Tato provedení jsou uvedena pouze k osvětlení vynálezu a nemají nijak sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

- 11 CZ 283492 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Čištění enzymu, stanovení jeho účinnosti a vlastností

Enzym byl čištěn z pekařského droždí (Fleishmann) následujícím způsobem. Všechny stupně čištění byly prováděny při teplotě 4 °C. Účinnost enzymu byla stanovena při použití 5'-fluorcytosinu 5FC v koncentraci 3 mM ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem PBS při teplotě 37 °C podle svrchu uvedené publikace Nishiyama a další, 1985. Pak byly přidány roztoky enzymu a průběh reakce byl sledován fotometricky na podílech, v nichž byla reakce zastavena přidáním 0,1 N kyseliny chlorovodíkové. Bylo užito absorpčního poměru 255/290 nm k měření množství vzniklého 5-fluoruracilu 5FU. Jednotka enzymatické účinnosti se stanoví ve formně 1 mikromolu 5FU, který vznikne za minutu při teplotě 37 °C. Koncentrace bílkoviny se měří metodou BCA (Pierce, Rockford, IL). Ke sledování složení bílkoviny po každém čisticím stupni bylo užito SDS-PAGE.

Stupeň I: Příprava autolyzátu kvasinek

2,25 kg pekařského droždí se smísí s 225 ml ethylacetátu a směs se 30 minut míchá. Pak se ke směsi přidá 2,25 litrů 50 mM pufru s fosforečnanem draselným o pH 7,2 s obsahem 15 % síranu amonného, 5 mM EDTA a 0,1 mM dithiothreitolu DTT. Směs se míchá 3 dny apH se denně upravuje na 7,2 přidáním pevného trihydroxymethylaminomethanu (Tris). Buněčná drť se oddělí odstředěním 15 minut při 10 000 ot/min.

Stupeň 2: Frakcionace síranem amonným

Veškerá bílkovina se ze supematantu ze stupně 1 vy sráží přidáním 1,8 g/1 EDTA a 371 g/1 síranu amonného, takže výsledná koncentrace síranu amonného byla 70 % nasycení. Roztok byl udržován 16 hodin na teplotě 4 °C, načež se sraženina oddělí odstředěním. Usazenina se rozpustí v 1,5 1 50 mM pufru s fosforečnanem draselným o pH 7,2 s obsahem 5 mM EDTA a 0,1 mM DTT a pak se materiál dialyzuje proti pufru 12 až 16 hodin.

K dialyzátu se přidá 1,8 g/1 EDTA a pak se přidá síran amonný do 50% nasycení, tj. 314 g síranu amonného na litr dialyzátu. Po jedné hodině se sraženina oddělí odstředěním a k supematantu se přidá další síran amonný, takže jeho koncentrace je 73 % nasycení. Sraženina se oddělí, rozpustí se v 1 litru 20 mM Tris-pufru o pH 8,0 s obsahem 0,1 mM DTT a pak se materiál dialyzuje proti tomuto pufru přibližně 12 až 16 hodin.

Stupeň 3: Chromatografie na aniontoměniči

Dialyzát ze stupně 2 se nanese na sloupec Q-Sepharose (Pharmacia) s rozměrem 4,8 x 25 cm, v rovnovážném stavu v 20 mM Tris-pufru s obsahem 0,1 mM DTT o pH 8,0. Sloupec se promyje a enzym se vymývá při použití lineárního gradientu 0 až 0,3 M KC1 ve svrchu uvedeném pufru. Frakce s obsahem enzy mu se spojí a odpaří a zahustí na přibližně 15 ml ultrafiltracť při použití filtru Amicon, PM 30.

- 12CZ 283492 B6

Stupeň 4: Chromatografie na gelu

Roztok s obsahem enzymu ze stupně 3 se nanese na sloupec, naplněný prostředkem Sephadex G75 s rozměrem 2,5 x 100 cm, sloupec se vymývá PBS s obsahem 0,1 mM DTT. Frakce s obsahem enzymu se spojí a pak se dialyzují proti 4 1 100 mM pufru o pH 7,0 s obsahem 1,8 M síranu amonného, 5 mM EDTA a 0,1 mM DTT.

Stupeň 5: Chromatografie s hydrofobní interakcí

Materiál ze stupně 4 se nanese na sloupec s rozměrem 2,5 x 15 cm s obsahem oktyl-Sepharose (Pharmacia) v rovnovážném stavu v 100 mM fosforečnanu draselného o pH 7,0 s obsahem 1,8 M síranu amonného, 5 mM EDTA a 0,1 mM DTT. Sloupec se promývá pufrem, enzym se vymývá při použití lineárního gradientu 1,8 až 0 M síranu amonného ve svrchu uvedeném pufru. Frakce s obsahem enzymu se spojí a zahustí ultrafiltrací při použití filtru Amicon, YM5.

Stupeň 6: Chromatografie na gelu

Konečná filtrace materiálu ze stupně 5 na Sephadexu G-75 při použití PBS jako elučního činidla se provádí způsobem podle příkladu 4. Čištěný enzym se zahustí ultrafiltrací a skladuje při -70 °C.

Postupné výsledky, získané při tomto čištění jsou uvedeny v následující tabulce 1. Výsledky SDS-PAGE jsou znázorněny na obr. 1. Konečný prostředek s obsahem enzymu byl charakterizován větším pásem s molekulovou hmotností přibližně 17 000 a menším pásem s molekulovou hmotností přibližně 19 000.

Tabulka 1

Čištění CD-ázy z 2,25 kg pekařského droždí

stupeň	bílkovina celkem mg1	celková účinnost U2	specifická účinnost U/mg	násobek čištění
bezbuněčný extrakt	120 000	1750	0,014	1
(NH4)2SO4	36 000	1274	0,035	2,5
Q-Sepharose	4 200	685	0,16	11,4
G-75 Sephadex	184	648	3,5	250
oktyl-Sepharose	20	495	25	1800
G-7 5-Sephadex	6	394	67	4800

Koncentrace bílkoviny byla stanovena při použití BCA (Pierce).

Jednotka účinnosti enzymu je definována jako 1 mikromol 5-FU, který se vytvoří za minutu při teplotě 37 °C.

Molekulová hmotnost enzymu byla stanovena tak, že čištěný enzym byl nanesen na sloupec Sephadexu G-50 spolu s ribonukleázou A s molekulovou hmotností 13,7 kDa, chymotrypsinogenem A (25 kDa), a ovalbuminem (43 kDa). Frakce byly sledovány při 280 nm k zjištění celkové bílkoviny a mimoto na účinnost emzymu při použití 5FC jako substrátu. Účinný enzym má molekulovou hmotnost přibližně 32 000, jak je zřejmé zobr. 2A. Enzym byl vymýván ze sloupce v přesně stejném objemu v případě, že byl nanesen do sloupce bez kalibračních standardů, jak je zřejmé z obr. 28.

- 13CZ 283492 B6

Stálost čištěného enzymu při teplotě 37 °C v PBS při pH 7,2 byla stanovena při použití 5FC jako substrátu. Jak je zřejmé z obr. 3, bylo možno pozorovat po delší inkubaci pomalé snižování účinnosti enzymu. Za těchto podmínek ztrácel enzym polovinu své účinnosti po 5,2 dnech. První 4 hodiny inklubace nedošlo k žádné zjevné ztrátě enzymatické účinnosti.

Příklad 2

Řetězec aminokyselin CD-ázy

Reakční činidla, použitá pro stanovení řetězce enzymu byla získána od Applied Biosystems, lne. Rozpouštědla, užitá pro HPLC v reverzní fázi byla získána od Burdick and Jackson. 4vinylpyridin byl získán od Aldrich Chemical Co., CNBr od Kodak, všechny ostatní chemické látky byly analyticky čisté. Endoproteináza Glu-C ze Staphylococcus aureus byla získána od Miles Laboratories. Endoproteináza Asp-N ze Pseudomonas fragi a endoproteináza Lys-C byly získány od fy Boehringer Mannheim.

Automatická analýza řetězce byla provedena na zařízení pro toto stanovení model 475A (ABI) při použití programů RUN470-L nebo PRO470-L. Bylo naneseno celkem 1,5 mg prostředku BioBrene (ABI) a byly provedeny dva nebo tři předběžné cykly Edmanovy degradace před nanesením vzorku. Přeměna thiazolínových derivátů na fenylthiohydantoinové aminokyseliny byla prováděna při použití 25% kyseliny trifluoroctové TFA při teplotě 61 °C. Fenylthiohydantoinové deriváty byly odděleny pomocí HPLC v reverzní fázi na sloupci PTH Cl8 s rozměrem 2,1 x 220 mm (ABI) při použití pufru s octanem sodným s obsahem 5 % objemových tetrahydrofuranu jako počátečního pufru a acetonitrilu s obsahem 500 nM dimethylfenylthiomočoviny (ABI) jako limitujícího pufru, postup byl prováděn na PTH-analyzátoru model 120 A (ABI).

Enzym a jeho peptidové fragmenty byly čištěny pomocí HPLC v reverzní fázi na dělicím systému model 130A (Applied Biosystems, lne.). K dělení byl užit při teplotě 40 °C sloupec RP300 s rozměrem 2,1 x 30 mm (ABI). K eluci byl užit lineární gradient 0 až 60 % acetonitrilu v 0.1% vodném roztoku TFA, postup byl prováděn 2 hodiny rychlostí 0,1 ml/min. Tímto způsobem byly získány bílkoviny a peptidové fragmenty, CNBr-peptidy, peptidy, získané působením endoproteináz Lys-C, Glu-C a Asp-N, byly užity pro analýzu řetězce bez dalšího čištění.

Reakce enzymu s 4-vinylpyridinem

Enzym z příkladu 1, stupeň 6 byl modifikován navázáním 4-vinylpyridinu následujícím způsobem. CD-áza byla redukována působením 20 mM dithiothreitolu v 0,1 ml, 0,4 M Tris-pufru s HC1 o pH 8,5, pufr obsahoval 6M guanidinhydrochloridu, 0,1 % sodné soli EDTA, postup byl prováděn 2 hodiny při 50 °C, pak byla provedena reakce se 100 mM 4-vinylpyridinu přes noc při teplotě místnosti. Pak byla reakční směs okyselena na pH 2,0 přidáním 20% TFA, produkt byl zbaven solí a čištěn HPLC na reverzní fázi svrchu uvedeným způsobem.

Při HPLC výsledného produktu bylo možno prokázat dva vrcholy, jak je zřejmé z obr. 4. Tyto vrcholy byly izolovány a znovu analyzovány na SDS-PAGE, výsledek je znázorněn na obr. 5. Menší vrchol, tj. vzorek A odpovídal pásu s molekulovou hmotností 19 000 na obr. 1, větší vrchol odpovídá pásu s molekulovou hmotností 17 000.

Aminoterminální řetězec aminokyselin pro bílkovinu ve vzorku A z obr. 4 bylo možno získat identifikací fenylthiohydantoinových derivátů aminokyselin až do zbytku 27. Bylo prokázáno, že

- 14CZ 283492 B6 řetězec je totožný s N-terminálním řetězcem superoxiddismutázy z kvasnic (EC 1.15.1.1, Steinman Η. M., 1980, J. Biol. Chem., 255:6758 - 6765. Tímto způsobem byla prokázána identita menšího pásu, kterou je možno pozorovat v enzymu po čištění na gelu, jak je znázorněno na obr. 1 a 5.

Při Edmanově degradaci většího vrcholu z obr. 4, tj. vzorku B nebylo možno získat žádný řetězec aminokyselin, takže aminoterminální řetězec enzymu byl patrně blokován. Parciální řetězec byl tedy získán tak, že byly analyzovány fragmenty řetězce po degradaci enzymy a bromkyanem, jak bude dále popsáno.

Enzymatické a chemické štěpení enzymu

Štěpení enzymu, který byl modifikován 4-vinylpyridinem bylo prováděno působením endoproteináz Lys-C a Glu-C ve 40 mikrolitrech 0,1 M Tris-pufru s kyselinou octovou o pH 8,0 při teplotě 37 °C celkem 12 až 16 hodin. Poměr enzymu a substrátu byl 1 : 10, šlo o hmotnostní poměr. Štěpení endoproteinázou Asp-N bylo provedeno podobným způsobem při hmotnostním poměru enzymu k substrátu 1 : 100 při teplotě 37 °C celkem 12 až 16 hodin. Směs po štěpení byla okyselena 20% TFA na pH 2,0 a její složky pak byly děleny pomocí HPLC v reverzní fázi.

Ke štěpení enzymu v místech methionylových zbytků byl užit bromkyan. 2,25 nmol enzymu, modifikovaného 4-vinylpyridinem bylo rekonstituováno ve 40 mikrolitrech 70% kyseliny mravenčí a pak byl přidán 200násobný molámí přebytek bromkyanu v 70% kyselině mravenčí. Reakce probíhala 2 hodiny při teplotě 35 °C a pak 12 až 16 hodin při teplotě místnosti. Pak byla směs zředěna vodou a materiál byl sušen ve vakuu k odstranění přebytečného bromkyanu. Roztok pro analýzu HPLC v reverzní fázi byl připraven v 1% TFA.

Na obr. 6 je znázorněn parciální řetězec aminokyselin enzymu, sestavený na základě fragmentů, získaných při štěpení bromkyanem a při proteolytickém štěpení při použití endoproteináz Glu-C, Lys-C a Asp-N. Byl identifikován řetězec 154 aminokyselin, které tvoří převážnou část bílkovin. V těchto zbytcích aminokyselin nejsou zahrnuty aminokyseliny, které se nacházejí v blízkosti Nterminálního zakončení a které dosud nebyly identifikovány. Při srovnání částečného řetězce pro enzym s jakýmkoliv jiným známým řetězcem, včetně řetězce pro adenosindeaminázu myši podle publikace Yeung C. Y. a další, 1985, J. Biol. Chem., 260:10299- 10307, a řetězce pro dCMPdeaminázu z kvasnic, podle publikace Mclntosh E. M. a Haynes R. H., 1986, Mol. Cell Biol. 6, 1711 - 1721, nebylo možno prokázat žádnou podstatnou homologii řetězce.

Příklad 3

Klonování a exprese genu pro CD-ázu

Gen pro uvedený enzym byl izolován z laboratorních kmenů S. cerevisiae a jeho exprese bylo dosaženo v buněčné linii savců při použití následujícího postupu:

Stupeň 1: Získání specifické sondy pro enzym při použití PCR

Na automatickém syntetizátoru DNA byly syntetizovány dva oligonukleotidové primery při použití parciálního řetězce aminokyselin a příslušných kodonů S. cerevisiae podle publikace Guthrie C. a Abelson J., 1982, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expresssion, str. 487 - 528, (J. N. Strathem a další, vyd. CSH), tyto informace byly užity jako vodítko pro konstrukci segmentů řetězce DNA. Uvedené oligonukleotidy pak byly užity jako primery při PCR, jako templát byla užita klonovaná sestava DNA genomu kvasinek. Oba primery, CDA4R1 a CDA5AS byly 42-mery s obsahem 33 nukleotidů, což odpovídá řetězci

- 15 CZ 283492 B6

CD-ázy, a to dvojitému řetězci s řetězcem ve smyslu i proti smyslu řetězce. Zbytek je kódem pro místo působení restrikčního enzymu EcORI. Řetězce obou primerů jsou znázorněny na obr. Ί.

Oba primery byly přítomny v množství 50 nebo 100 pmol v reakční směsi. Byly konstruovány dvě sestavy genomu. které byly užity jako templát při PCR-reakcích. Tyto sestavy byly konstruovány z DNA genomu kvasinek částečným rozštěpením enzymem Sau2A s následným navázáním do míst štěpení enzymem BamHI do vektoru CV13 nebo YCp50. Oba vektory a obě sestavy genomu jsou běžně přístupné (Department of Genetics at the University of Washington). Obě sestavy již byly získány včetně transformovaného bakteriálního hostitele. Sestavy DNA byly izolovány působením zásady a pak byly čištěny odstředěním při použití gradientu chloridu česného a ethidium bromidu. Pak byly provedeny PCR-reakce při použití 1 mikrogramu sestavy DNA genomu z kvasinek vCV13 nebo YCp5D po čištění CsCl, 50 nebo 100 pmol každého primeru, 1/10 objemu lOx pufru k provedení PCR (Stratagene), 16/100 objemu 1,25 mM dNTP (A, G, T, C), destilovaná voda pro provedení PCR a 0,5 mikrolitrů Taq DNA polymerázy s účinností 5U/mikrolítrů (Stratagene) do konečného objemu 100 mikrolitrů. Reakce byly prováděny ve sterilních zkumavkách pro mikroodstředivku pod vrstvou čištěného minerálního oleje 75 mikrolitrů, aby nedošlo k odpařování. PCR-reakce byly prováděny v zařízení PerkinElmer Cetus Thermal Cycler při použití programu s 30 cykly při následujících teplotách: první stupeň 3D sekund při teplotě 94 °C k denaturaci, pak 45 sekund při teplotě 55 °C ke spojení a 90 sekund při teplotě 72 °C k dosažení extense.

Podíly z PCR-reakce byly analyzovány na agarozovém gelu, aby bylo možno prokázat přítomnost předpokládaného řetězce o 350 párech bází, který je kódem pro převážnou část enzymu. Fragment o 350 párech bází se pak čistí preparativní elektroforézou na agarosovém gelu s následnou elucí při použití postupu areakčních činidel, dodávaných ve formě sestavy GeneClean kit (BIO101) k odstranění primerů a heterologních fragmentů ze získaného materiálu.

Stupeň 2: Subklonování PCR-fragmentu k analýze řetězce

PCR-primery ze stupně 1 byly upraveny tak, že na jejich 5’-zakončení bylo uloženo místo působení enzymu EcoRI k usnadnění klonování. Pak byl podíl čištěného fragmentu o 350 párech bází rozštěpen enzymem EcoRI a uložen do vektoru pBSII-SK’ (Stratagene), rozštěpeného týmž enzymem. Restrikční enzymy byly získány od Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB). Rozštěpený materiál byl inkubován 2 hodiny při teplotě 37 °C, načež byla provedena extrakce týmž objemem směsi fenolu, chloroformu a isoamylalkoholu, pak byl materiál vysrážen ethanolem. Vzniklé fragmenty byly znovu uvedeny do suspenze v pufru TE s obsahem 10 mM Tris-HCl o pH 8,0 a 1 mM EDTA o pH 8,0, načež byly fragmenty navázány při použití T4 DNA ligázy (BMB). Kompetentní bakterie JMI09 byly transformovány 1/5 vazné reakční směsi a příslušná zředění byla nanesena na plotny LB+ampicillin v množství 100 mikrogramů/ml. prostředí bylo doplněno enzymem XGal, 50 mikrolitrů 2 % zásobního roztoku v dimethylformamidu a IPTG, 10 mikrolitrů zásobního roztoku s koncentrací 100 mM. Bílé kolonie byly odebrány a byly připraveny malé vzorky plasmidu podle publikace Sambrook J. a další. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, 1989, CSH Press. Pak byly plasmidv sledovány na přítomnost fragmentu o 350 párech bází rozštěpením enzymem EcORI. Bylo získáno 7 rozdílných produktů. DNA plasmidu byla izolována a čištěna a získané řetězce DNA byly analyzovány.

Stupeň 3: Použití PCR-fragmentu jako sondy, specifické pro CD-ázu při vyšetření sestaxy genomu kvasinek

PCR-fragment, získaný ve stupni 1, byl rovněž užit jako sonda pro detekci kódového řetězce pro CD-ázu při vyšetřování sestav genomu na klony, které tento gen obsahují. Čištěný fragment byl označen použitím alfa-^j2P-dCTP a značící sestavou s obsahem náhodných primerů DNA (BMB). Sestavy genomu kvasinek byly pěstovány přes noc na svrchu uvedeném prostředí LB+amp

- 16CZ 283492 B6 a vhodná ředění byla nanášena na plotny s obsahem téhož prostředí, bylo dosaženo hustoty kolonií 250 až 2000 kolonií na plotnu. Kolonie byly odebírány při použití kroužků nebo čtverečků z nitrocelulózy s průměrem 0,45 mikrometrů, (Schliecher a Schuell). Filtry byly zpracovány tak, že byly uloženy stranou, na níž byla odebraná kolonie na papír Whatman 3MM, nasycený 10% SDS na 5 minut k fixaci, pak bylo užito 0,5 M NaOH a 1,5 M NaCl na 5 minut kdenaturaci, pak 1,5 M NaCl a 0,5 M Tris-HCl o pH 7,4 na 5 minut k neutralizaci a pak bylo užito 2x SSC na 5 minut před použitím ultrafialového světla spolu s prostředkem Statalinker (Stratagene) podle návodu výrobce. Pak byly filtry ponořeny do 2x SSC na 5 minut a předem promyty v 5x SSC s 0,5% SDS a 1 mM EDTA pri 50 °C.

Předběžná hybridizace byla provedena v sáčcích z plastické hmoty, zatavitelných teplem a obsahujících 20 ml roztoku při obsahu 12 filtrů v jednom sáčku. Roztok pro předběžnou hybridizaci obsahoval 50 % formamidu, 6x SSC, 0,01 M NaP o pH 6,8, lmM EDTA o pH 8,0, 0,5% SDS, 100 mikrogramů/ml DNA z denaturovaného spermatu lososa a 5x Oenhardtův roztok. Pak byly sáčky z plastické hmoty uloženy do vodní lázně s teplotou 42 °C a inkubovány 12 až 16 hodin. Značená sonda byla očištěna od nezařazených nukleotidů elucí na sloupci PushColumns (Stratagene). Sonda byla přidána v množství přibližně 10⁶ impulsů za minutu/ml a inkubace za účelem hybridizace byla prováděna 12 až 16 hodin při 42 °C.

Filtry byly několikrát promyty 2x SSC s 0,1 % SDS při teplotě místnosti, pak byly promyty hodinu při teplotě 55 °C při použití lx SSC, s 0,1 % SDS. Pak byly filtry usušeny na vzduchu, zabaleny do saranu a vystaveny přes noc na rentgenologický film při teplotě -70 °C při použití zesilujícího stínítka. Autoradiografické záznamy byly porovnány s filtry a plotnami a byly vybrány klony s pozitivním hybridizačním signálem. Pozitivní klony byly analyzovány ještě dvakrát stejným způsobem před izolací plasmidu. DNA plasmidu byla izolována v kulturách, amplifikovaných za přítomnosti chloramfenikolu na 500 ml LB+ampicillin a pak byl materiál čištěn působením zásady stejně jako ve svrchu uvedené publikaci Sambrook a další, 1989. Některé plasmidy byly čištěny odstředěním při použití gradientu chloridu česného aethidiumbromidu, některé další plasmidy byly čištěny chromatografií na sloupcích PZ253 (5' -> 3') s následným vysrážením směsí polyethylenglykolu, fenolu a chloroformu a pak ethanolem.

Stupeň 4: Analýza řetězce klonů, které jsou v genomu kódem pro CD-ázu, odvozených od PCR

Několik 18-memích nukleotidů bylo syntetizováno nebo opatřeno za účelem analýzy řetězce DNA ze svrchu uvedených klonů. Některé primery poskytly části kódového řetězce, jiné části komplementzámího řetězce. Reakce při analýze řetězce byly prováděny podle návodu výrobce a při použití dodaných reakčních činidel pro sestavu Sequenase Version 2,0 Kit (United States Biochemical). DNA byla denaturována v 0,2 N NaOH před analýzou řetězce. Ředění a značící složky směsi i doba reakce byly měněny v závislosti na oblasti, v níž se řetězec nacházel. Pro většinu reakcí bylo užito 1 - 1,5 pmol DNA jako templátu, primery byly užity v množství 10 až 15 pCi alfa-³⁵S-dATP v jedné reakční směsi. Vzorky byly naneseny na 8% polyakrylamidový gel s močovinou a analýza probíhala 1 až 7 hodin. Pak byly gely fixovány ve směsi s obsahem 10 % methanolu a 10 % kyseliny octové celkem 30 minut a pak sušeny 45 minut při teplotě 80 °C při použití sušicího zařízení (Slab-Gel), připojeného na vakuové čerpadlo. Sušené gely byly užity k expozici filmu Kodak XAR-5 pri teplotě místnosti celkem 18 až 72 hodin. Odečítání bylo prováděno ručně. Srovnání a analýza získaných údajů byly prováděny na počítači při použití programu Gene Pro (Riverside Scientific, Seattle, Washington). Na obr. 8 je znázorněn nukleotidový řetězec klonů genomu, které jsou kódem pro CD-ázu. Na obr. 10 je znázorněn odpovídající řetězec aminokyselin. Jak je zřejmé, je kódový řetězec tvořen přibližně 474 páry bází a je kódem pro bílkovinu s obsahem 158 zbytků aminokyselin. Předpokládaná molekulová hmotnost takto získaného enzymu je 17 506.

- 17CZ 283492 B6

Stupeň 5: Konstrukce kazet, které jsou kódem pro CD-ázu pro expresi v kvasinkách a v systémech savců

Řetězec DNA, získaný ve stupni 4 byl užit ke konstrukci oligonukleotidových primerů pro kazety, které jsou kódem pro CD-ázu a byly získány na základě PCR. Některé z těchto oligonukleotidů obsahovaly další řetězce, například signální peptidy pro sekreci a místa působení restrikčních enzymů pro použití při klonování nebo při expresi. Oligonukleotidové primery byly užity v párech k získání PCR-fragmentů za přidání příslušných řetězců na jejich zakončení.

Specificky byl postup prováděn tak, že kazeta, která je kódem pro enzym, byla konstruována pomocí PCR při použití dvou primerů, které obsahovaly jak specifický řetězec pro CD-ázu, tak přídatný řetězec s místem působení restrikčního enzymu pro klonování. 5'-primer byl 65-mer s obsahem 45 bází řetězce, který byl homologní, avšak nikoliv zcela totožný s 5'-zakončení kopie genomu pro CD-ázu, dále bylo do řetězce zařazeno místo působení enzymů HindlII, SalII a Ncol. 3'-primer byl 39-mer, který byl totožný s řetězcem opačného směru na C-terminálním zakončení enzymu, s místem působení enzymu Xbal na svém 5'-zakončení. Použitým templátem byl klon genomu pro enzym v množství přibližně 1 ng v každém vzorku. Každý primer byl přítomen v koncentraci 75 pmol. PCR-reakce byly prováděny způsobem podle stupně 1.

PCR-reakční produkty byly čištěny extrakcí chloroformem a srážením z ethanolu. Pak byla DNA postupně štěpena restrikčními enzymy HindlII a Xbal, podrobena elektroforéze na gelu a čištěna při použití GeneClean (B10101) podle instrukcí výrobce.

Stupeň 6: Exprese enzymu v buňkách savců

Čištěný fragment ze stupně 5 byl navázán na vektor CDM8 nebo pH3M, rozštěpený enzymy HindlII-Ibal a materiál byl užit k transformaci bakteriálního hostitele MC1061 podle svrchu uvedené publikace Aruffo a Seed, 1987. Mapa míst působení restrikčních enzymů pro vektor pH3M je znázorněna na obr. 12. Bylo izolováno dvacet transformantů, v malém měřítku byly pomocí zásady získány preparáty plasmidu a vzorky byly rozštěpeny HindlII+Xbal k ověření struktury. Zbývající plasmid ze tří vzorků byl užit ktransfekci buněk COS při použití DEAEdextranu podle publikace Ausubel F. M., a další, eds., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, N. Y.

3,5 x 10’ buněk COS bylo naneseno na plotny s průměrem 5 cm s obsahem prostředí DMEM s 10 % fetálního séra skotu FBS a směs byla inkubována přes noc při teplotě 37 °C v atmosféře se 6 % oxidu uhličitého. DNA ze svrchu uvedených vzorků byla smísena s PBS a 50 mg/ml DEAE-dextranu na celkový objem 100 mikrolitrů v množstvích, která jsou uvedena v následující tabulce.

vzorek DNA FBS DEAE-dextran μΐ μΐ 50 mg/ml, μΐ kontroly

Sham	0	80	20
BB1	4	76	20
Transfekce
(CD-áza)
1-1	13	67	20
1-4	13	67	20
2-6	13	67	20

- 18CZ 283492 B6

Každá transfekce byla provedena dvakrát. Jeden den staré živné prostředí kultury bylo odsáto z ploten a buňky byly promyty třikrát vždy při použití 2 ml PBS. Transfekční prostředí s obsahem DMEM a chlorochinu bylo přidáno v množství 1,7 ml/plotna a pak byla přidána po kapkách svrchu uvedená směs s obsahem DNA. Směsi byly inkubovány k transfekci 3 hodiny, prostředí bylo odstraněno, k buňkám bylo na 2 minuty přidáno prostředí FBS s 10% DMSO (šok), buňky byly třikrát promyty prostředím bez séra a pak byly inkubovány 3 dny ve 3,5 ml prostředí DMEM s 10 % PBS na plotnu.

Stupeň 7: Charakterizace rekombinantních produktů exprese

1. Radioimunoprecipitace

K této zkoušce RIPS byly užity plotny ze stupně 6, které byly inkubovány 12 až 16 hodin v čerstvém prostředí DMEM s 10 % FBS s obsahem 200 pCi/ml ³⁵S-methioninu.

Metoda RIPS byla provedena tak, že značené prostředí bylo odstáto po inkubaci 12 až 16 hodin při teplotě 38 °C, byl přidán 1 ml 1% OG-PO4RIPAE s obsahem 50 mM hydrogenfosforečnanusodného, 1 % deoxycholátu sodného, 1 % tritonu X-100, 0,1 % SDS, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 2 mM PMSF a 1 mikrogram/ml aprotininu s oktoglukosidem, přidaným do koncentrace 1 %, načež byla směs inkubována 10 minut v ledu. Rozrušené buňky se přenesou do zkumavek pro odstředivku v objemem 10 ml (Oak Ridge) a odstředí se při 40 000 ot/min, teplotě 4 °C celkem 40 minut. Supematanty se přenesou do dvou zkumavek pro mikroodstředivku, uložených v ledu, v množství 0,4 ml/zkumavka. Materiál po transfekci BB1 se inkubuje s 2 mikrogramy protilátky a k ostatnímu materiálu po transfekci se přidá 17,5 mikrolitrů nebo 31,5 mikrogramů polyklonálního antiséra proti CD-áze králíka. Zkouška RIPS se inkubuje v ledu 1 hodinu. Pak se přidá do zkumavky BB1 jako druhá protilátka kozí protilátka proti myšímu materiálu a směs se inkubuje 20 minut v ledu.

Staphylococcus aureus (Calbiochem) se promyje 700 mikrolitry 0,5 % pufru NP-40/TES, pak 0,05 % pufrem NP-40/TES a nakonec se buňky uvedou do suspenze v pufru PO4-RIPAE s 1 mg/ml ovalbuminu. TES = 50 mM Tris-HCl o pH 7,4 s 1 mM EDTA, 150 mM NaCl. Pak se podíly promytých bakterií po 50 mikrolitrech přidají k materiálu RIP a inkubují 10 minut v ledu. Materiál po zkoušce RIPS se odstředí v mikroodstředivce a třikrát se promyje vždy 0,5 ml TNEN s obsahem 20 mM Tris-HCl o pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40. Poslední usazenina z původních dvojitých vzorků s objemem 400 mikrolitrů se znovu uvede do suspenze v 35 mikrolitrech redukčního nebo neredukčního pufru k provedení SDS-PAGE. Vzorky se nanesou v 10 až 20 % gradientu na gel SDS-PAGE spolu se značícími látkami s nízkou molekulovou hmotností (BioRad) a elektroforéza se provádí při napětí 300 V přibližně 2 hodiny. Gely se barví modří Coomassie celkem 1 hodinu, pak se odbarví v 10% methanolu s5% kyseliny octové přibližně 12 až 16 hodin, vystaví se na 30 minut zesilujícímu činidlu, pak se třikrát promyjí vodou a pak se 1 hodinu suší při teplotě 60 °C. Po 4 hodinách uložení na rentgenologický film je možno pozorovat, že vzorky sham ani vzorky BB1 neobsahují pás s molekulovou hmotností 17 000, avšak vzorky BB1 obsahují specifický pás s molekulovou hmotností 45 000, všechny tři vzorky po transfekci obsahovaly specifický pás s molekulovou hmotností přibližně 17 000.

2. Analýza Western blot

Dvojnásobně provedené plotny po transfekci ze stupně 6 byly ponechány neoznačené a po inkubaci 3 dny byl materiál odebrán. Prostředí bylo odsáto, buňky byly promyty PBS, pak uvedeny do suspenze v 0.5 ml 10 mM Tris-HCl o pH 8,0 s obsahem 1 mikrogram/ml aprotininu a 30 mikrogramů/ml PMSF. Buňky byly z misek odebírány sterilní kličkou a přeneseny do sterilních zkumavek pro mikroodstředivku, uložených v ledu. Každá ze suspenzí byla zpracována

- 19CZ 283492 B6 až 15 sekund ultrazvukem při nejvyšší intenzitě. Rozrušené buňky byly odstředěny 20 minut v chlazené odstředivce k odstranění buněčné drti a supematanty byly přeneseny do čistých zkumavek. Pak byly provedeny enzymatické zkoušky, jak bude dále uvedeno.

Podíly materiálu byly rovněž užity k provedení zkoušky Western blot při použití polyklonálního králičího antiséra proti čištěné CD-áze. Podíly po 25 mikrolitrech nezředěných rozrušených buněk po transfekci byly podrobeny elektroforéze na SDS-PAGE stejně jako při zkoušce RIPS až na to, že na gel bylo naneseno jako standard sériové ředění čištěného enzymu. Koncentrované CD-áza v množství 500 ng/dráha byla zředěna vždy pětinásobně na 100 ng, 20 ng, 4 ng a 0,8 ng/dráha. Pak byla provedena zkouška při použití nitrocelulózového filtru podle svrchu uvedené publikace Sambrook a další, 1989.

Odebraný materiál byl uložen na jednu hodinu do prostředí Blotto s obsahem PBS + 1 % odstředěného mléka + 0,5 % NP-40. Čerstvé prostředí Blotto s obsahem 2,5 mikrogram/ml polyklonálního králičího séra proti enzymu bylo k filtru přidáno a směs byla 1 hodinu inkubována při teplotě místnosti. Pak byl filtr třikrát promyt vždy 5 minut v prostředí Blotto a pak byl inkubován v konjugátu alkalické fosfatázy (Boehringer Mannheim Biochemicals), zředěném v poměru 1 : 1000 v prostředí Blotto. Přebytek konjugátu s protilátkou byl odstraněn trojím promytím v Blotto a konečným promytím v pufru pro substrát pro alkalickou fosfatázu s obsahem 100 mM Tris-HCl o pH 9,5 se 100 mM NaCl a 5 mM chloridu hořečnatého. Pak byl filtr inkubován 15 minut ve 40 ml pufru pro substrát s 12 mg bromchorindolyl fosfátu a 7 mg tetrazoliové nitromodři k vybarvení. Reakce byla zastavena omytím filtru destilovanou vodou.

Po zbarvení bylo možno prokázat, že všechny tři vzorky po transfekci obsahovaly pásy s molekulovou hmotností přibližně 17 000 při koncentraci vyšší než 0,8 ng a nižší než 4 ng pro čištěný enzym.

3. Měření účinnosti rekombinantní CD-ázy, získané expresí

Přeměna 5-fluorcytosinu 5-FC na 5-fluoruracil 5-FU byla měřena v extraktech transformovaných buněk COS, jak bylo popsáno svrchu. Vzorky buněk po transfekci vždy v množství x 10⁵ buněk s obsahem CD-ázy, tj. vzorky 1-1, 1-4, 2-6, po transfekci sham nebo po kontrolní transfekci BB1 byly zpracovány ultrazvukem v 0,5 ml 10 mM Tris-pufru a pak odstředěny. Ke 100 mikrolitrům supematantu s 1 mikrogram/ml CD-ázy bylo přidáno 170 mikrolitrů chloridu sodného s fosfátovým pufrem, PBS, a 30 mikrolitrů roztoku 30 mM 5-FC. Tím bylo získáno 300 mikrolitrů reakční směsi s koncentrací 3 mM 5-FC. Byla provedena také kontrolní reakce bez enzymu.

Zkumavky byly inkubovány 24 hodin při teplotě 37 °C, pak bylo odebráno 50 mikrolitrů každého roztoku a reakce byla zastavena přidáním 1 ml 0,1 N kyseliny chlorovodíkové. Vzorky byly měřeny na spektrofotometru v ultrafialovém světle při 255 a 290 nm. Při použití rovnic (0,1191 x OD₂₉₀ - 0,02485 x OD₂₅₅) x 20 = mM 5-FC a (0,1849 x OD₂₅₅ - 0,04907 x OD₂₉₀) x 20 = mM 5-FU, bylo měřeno množství 5-FC, které bylo přeměněno na 5-FU. Pak byl pomocí počítače stanoven počet jednotek účinnosti v původním buněčném extraktu. Jedna jednotka je to množství enzymu, které za 1 minutu přemění 1 mikromol 5-FC na 5-FU. Při transfekci sham a BB1 a při kontrolní reakci bez enzymu nebylo možno prokázat žádnou účinnost, zatímco všechny tři vzorky pro transfekci byly účinné. Účinnost vzorku 1-1 byla 0,41 x 10‘³ jednotek, účinnost vzorku 1-4 byla 0,54 x 10'³ jednotek a účinnost vzorku 2-6 byla 0,26 x 10'³ jednotek. Kontrolní vzorek s obsahem 1 mikrogram/ml enzy mu převedl veškeré množství 5-FC na 5-FU. V případě, že čistý enzym má

-20CZ 283492 B6 účinnost 40 jednotek/mg, obsahoval vzorek 1-1 10 ng enzymu, vzorek 1-4 obsahoval 13,5 ng enzymu a vzorek 2-6 obsahoval 7,3 ng enzymu, získaného expresí.

Tytéž vzorky byly také zkoumány další nezávislou zkouškou. Do každé zkumavky bylo vloženo 50 mikrolitrů svrchu uvedeného supematantu nebo 1 mikrogram/ml enzymu a mimoto 130 mikrolitrů PBS, 20 mikrolitrů 30 mM 5-FC a 1 μθ ³H-5-FC. Reakční směsi byly inkubovány 24 hodin, pak byly odpařeny a odparky byly rozpuštěny ve 20 mikrolitrech methanolu a získaný materiál byl analyzován chromatografií na tenké vrstvě silikagelu. Desky byly vyvíjeny směsí acetonu a vody v objemovém poměru 96 : 4, Rf pro 5-FC je 0,2 a pro 5-FU je 0,8. Příslušné části desek byly vyříznuty a uloženy do scintilační kapaliny. Impulsy byly počítány na scintilačním počítači a bylo stanoveno relativní množství 5-FC a 5-FU v každém vzorku. Ve vzorku po transfekci sham aBBl nebylo možno prokázat žádný 5-FU, kdežto všechny tři vzorky po transfekci genem pro enzym převáděly 14% 5-FC na 5-FU. Tento výsledek znamená účinnost 0,6 x 10‘³ jednotek ve vzorku, což potvrzuje množství, vypočítané při spektrofotometrii. Kontrolní reakce s obsahem 1 μg/ml enzymu vedla k převedení veškerého množství 5-FC na 5-FU.

Tyto pokusy prokazují, že buňky po transfekci produkují v důsledku exprese účinný enzym. Ve spojení s analýzou Western blot je možno prokázat, že specifická účinnost rekombinantního enzymu je obdobná účinnosti enzymu, izolovaného z kvasinek.

Je tedy zřejmé, že byla produkována tepelně stálá CD-áza, která byla čištěna, a bylo dosaženo produkce rekombinantního enzymu. Vynález objasňují výhodná provedení, do rozsahu vynálezu však spadají rovněž modifikace popsaných provedení.

Průmyslová využitelnost

Způsob výroby rekombinantní tepelně stálé cytosindeaminázy, které lze použít pro výrobu farmaceutických prostředků pro léčbu zhoubných nádorů.

Claims (5)

1. Izolovaný řetězec nukleotidů, který je kódem pro tepelně stálou cytosindeaminázu se sledem

START

ATG GTG ACA GGG GGA ATG GCA AGC AAG TGG GAT CAG AAG GGT ATG 211 M V T G G M A S K W D Q K G M GAC ATT GCC TAT GAG GAG GCG GCC TTA GGT TAC AAA GAG GGT GGT 256 D I A Y E E A A L G Y K E G G GTT CCT ATT GGC GGA TGT CTT ATC AAT AAC AAA GAC GGA AGT GTT 301 V P I G G C L I N N K D G S V CTC GGT CGT GGT CAC AAC ATG AGA TTT CAA AAG GGT TCC GCC ACA 346 L G R G H N M R F Q K G S A T CTA CAT GGT GAG ATC TCC ACT TTG GAA AAC TGT GGG AGA TTA GAG 391 L H G E I s T L E N C G R L E

-21 CZ 283492 B6

GGC G AAA K GTG TAC AAA GAT ACC ACT TTG TAT ACG ACG CTG TCT CCA 436 V Y K D T T L Y T T L S P TGC GAC ATG TGT ACA GGT GCC ATC ATC ATG TAT GGT ATT CCA CGC 481 C D M C T G A I I M Y G I P R TGT GTT GTC GGT GAG AAC GTT AAT TTC AAA AGT AAG GGC GAG AAA 526 C V V G E N V N F K S K G E K. TÁT TTA CAA ACT AGA GGT CAC GAG GTT GTT GTT GTT GAC GAT GAG 571 Y L Q T R G H E V V V V D D E AGG TGT AAA AAG ATC ATG AAA CAA TTT ATC GAT GAA AGA CCT CAG 616 R C K K. I M K Q F I D E R P Q GAT TGG TTT GAA GAT ATT GGT GAG TAG 641 D W F F D I G E STOP

2. Rekombinantní vektor pro expresi, obsahující nukleotidový řetězec podle nároku 1 operativně vázaný na řídicí řetězce, účinný při expresi nukleotidového řetězce v savčích, bakteriálních a kvasinkových buňkách.

3. Savčí, bakteriální a kvasinkové buňky, transformované rekombinantním expresním vektorem podle nároku 2.

4. Způsob výroby rekombinantní tepelně stálé cytosindeaminázy, vyznačující se tím, že se pěstuje hostitelská buňka podle nároku 3.

5. Tepelně stálá cytosindeamináza izolovaná ze Saccharomyces cerevisiae tvořená řetězcem aminokyselin

M V T G G M A S K W D Q K G M D I A Y E E A A L G Y K E G G 30 V P I G G C L I N N K. D G S V L G R G H N M R F Q K G S A T 60 L H G E I S T L E N C G R L E G K V Y K D T T L Y T T L S P 90 C D M C T G A I I Μ Y G I P R C V V G E N V N F K s K G E K 120 Y L Q T R G H E V V V V D D E R c K. K I M K Q F I D E R P Q 150 D W F E D I G E