JP3001933B2 - 熱安定性シトシンデアミナーゼ - Google Patents
熱安定性シトシンデアミナーゼInfo
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- JP3001933B2 JP3001933B2 JP2153799A JP15379990A JP3001933B2 JP 3001933 B2 JP3001933 B2 JP 3001933B2 JP 2153799 A JP2153799 A JP 2153799A JP 15379990 A JP15379990 A JP 15379990A JP 3001933 B2 JP3001933 B2 JP 3001933B2
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- cytosine deaminase
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- amino acid
- cdase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，一般的に酵素シトシンデアミナーゼに関す
る。さらに特定すれば，本発明は,Saccharomyces cere
visiaeに由来する熱安定性シトシンデアミナーゼの精製
および組換え産生に関する。
る。さらに特定すれば，本発明は,Saccharomyces cere
visiaeに由来する熱安定性シトシンデアミナーゼの精製
および組換え産生に関する。
（従来の技術） シトシンデアミナーゼ（CDアーゼ,EC3.5.4.1）は，次
の反応により，シトシンからウラシルへの加水分解を触
媒する。
の反応により，シトシンからウラシルへの加水分解を触
媒する。
微生物のピリミジン代謝で重要な役割をはたすこの酵
素は（Ｏ′DonovanおよびNeuhard,1970），いくつかの
異なった微生物から単離された。しかし，哺乳類細胞に
は存在しないようである（Nishiyamaら,1985）。
素は（Ｏ′DonovanおよびNeuhard,1970），いくつかの
異なった微生物から単離された。しかし，哺乳類細胞に
は存在しないようである（Nishiyamaら,1985）。
様々な微生物由来のCDアーゼの物性は，分子量，安定
性，およびサブユニットの組成の点で大きく異なること
が示されてきた。例えば,Salmonella typhimurium由来
のCDアーゼが,SDS−PAGEにより均一になるように精製さ
れたところ，それぞれが54キロダルトン（kDa）の４つ
のサブユニットから構成されていた（Westら,1982）。
一方,Escherichia Coli由来の該酵素は,200kDaの分子
量を有し,35kDaおよび46kDaのサブユニットから構成さ
れる（Katsuragiら,1986）。これらの酵素の両方とも非
常に熱安定であり,55℃において高い活性を維持してい
る。
性，およびサブユニットの組成の点で大きく異なること
が示されてきた。例えば,Salmonella typhimurium由来
のCDアーゼが,SDS−PAGEにより均一になるように精製さ
れたところ，それぞれが54キロダルトン（kDa）の４つ
のサブユニットから構成されていた（Westら,1982）。
一方,Escherichia Coli由来の該酵素は,200kDaの分子
量を有し,35kDaおよび46kDaのサブユニットから構成さ
れる（Katsuragiら,1986）。これらの酵素の両方とも非
常に熱安定であり,55℃において高い活性を維持してい
る。
パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）もまた,CDア
ーゼの供給源として使用されてきた。以前にパン酵母か
ら得られたCDアーゼは，ゲル濾過により決定されたとこ
ろ分子量34kDaを有しており（Ipataら,1971,1978）,SDS
−PAGEおよびアミノ酸分析により決定されたところ32〜
33kDaを有していた（Yergatianら,1977）。それゆえ，
以前にパン酵母から単離されたCDアーゼ酵素は，単一の
タンパクであるようである。
ーゼの供給源として使用されてきた。以前にパン酵母か
ら得られたCDアーゼは，ゲル濾過により決定されたとこ
ろ分子量34kDaを有しており（Ipataら,1971,1978）,SDS
−PAGEおよびアミノ酸分析により決定されたところ32〜
33kDaを有していた（Yergatianら,1977）。それゆえ，
以前にパン酵母から単離されたCDアーゼ酵素は，単一の
タンパクであるようである。
以前に単離されたパン酵母CDアーゼの溶液は,4℃,pH5
〜９の間で保存された場合，少なくとも48時間活性を維
持した（Ipataら,1971,1978）。しかし,37℃では，パン
酵母CDアーゼの粗試料は,1時間でその活性の半分が消失
することが示され（KreamおよびChargaff,1952），該酵
素の精製された形態では,30分の半減期を有していた（K
atsuragi,1988）。37℃における半減期は，該酵素をエ
ポキシ−アクリルビーズ上に固定することにより28日ま
で増大され得る（Katsuragiら,1987）。このように，パ
ン酵母由来のCDアーゼの熱安定性は，それが低分子量で
あることとともに，上記細菌の酵素とは異なっている。
〜９の間で保存された場合，少なくとも48時間活性を維
持した（Ipataら,1971,1978）。しかし,37℃では，パン
酵母CDアーゼの粗試料は,1時間でその活性の半分が消失
することが示され（KreamおよびChargaff,1952），該酵
素の精製された形態では,30分の半減期を有していた（K
atsuragi,1988）。37℃における半減期は，該酵素をエ
ポキシ−アクリルビーズ上に固定することにより28日ま
で増大され得る（Katsuragiら,1987）。このように，パ
ン酵母由来のCDアーゼの熱安定性は，それが低分子量で
あることとともに，上記細菌の酵素とは異なっている。
CDアーゼは，治療用としてプロドラッグ５−フルオロ
シトシン（５−FC）を制ガン剤５−フルオロウラシル
（５−FC）に変換するために使用されてきた（Katsurag
iら,1987;Nishiyamaら,1985;Sakaiら,1985;Senterら,19
87）。しかし,CDアーゼの細菌の供給源は，充分な活性
を得るために大量の培養を必要とし，そのような使用の
ためには実質的ではない（Sakaiら,1985）。加えて，微
生物の抽出物は，その受容体に望ましくない副作用をひ
きおこし得る。
シトシン（５−FC）を制ガン剤５−フルオロウラシル
（５−FC）に変換するために使用されてきた（Katsurag
iら,1987;Nishiyamaら,1985;Sakaiら,1985;Senterら,19
87）。しかし,CDアーゼの細菌の供給源は，充分な活性
を得るために大量の培養を必要とし，そのような使用の
ためには実質的ではない（Sakaiら,1985）。加えて，微
生物の抽出物は，その受容体に望ましくない副作用をひ
きおこし得る。
これらの問題を克服するために，酵母がCDアーゼの供
給源として使用され得る。しかし，以前の酵母由来の生
成物の熱不安定性のため，酵素をその使用前に固定化す
ることが必要である（Katsuragiら,1987）。したがっ
て，熱安定性の酵母CDアーゼの単離・精製により，制ガ
ン治療に使用される改善された酵素が提供される。同様
に，酵母からの熱安定性CDアーゼの遺伝子をクローニン
グすることにより，遺伝子自身に限定された変性あるい
は付加，遺伝子の発現を制御する配列，および遺伝子と
他の分子との間で作製される遺伝子融合を導入すること
ができる。そのような新しい構築物は，制ガン治療にお
ける該酵素の効率または有用性を増大させる。
給源として使用され得る。しかし，以前の酵母由来の生
成物の熱不安定性のため，酵素をその使用前に固定化す
ることが必要である（Katsuragiら,1987）。したがっ
て，熱安定性の酵母CDアーゼの単離・精製により，制ガ
ン治療に使用される改善された酵素が提供される。同様
に，酵母からの熱安定性CDアーゼの遺伝子をクローニン
グすることにより，遺伝子自身に限定された変性あるい
は付加，遺伝子の発現を制御する配列，および遺伝子と
他の分子との間で作製される遺伝子融合を導入すること
ができる。そのような新しい構築物は，制ガン治療にお
ける該酵素の効率または有用性を増大させる。
（発明の要旨） 本発明は，パン酵母由来の熱安定性CDアーゼの予期せ
ぬ発見に基づく。この酵素のアミノ酸配列分析によれ
ば，公知の他のタンパクの配列と有意な相同性が見られ
ない。
ぬ発見に基づく。この酵素のアミノ酸配列分析によれ
ば，公知の他のタンパクの配列と有意な相同性が見られ
ない。
本発明は，熱安定性CDアーゼまたはそれと機能上等価
なタンパクをコードする，単離されたヌクレオチド配列
を提供し，そして，この配列を含有し，そして該配列の
発現において効果的である組換え発現ベクター，それに
より軽質転換された宿主細胞，および組換えにより熱安
定性CDアーゼまたはその機能的等価物を産生する方法を
提供する。上記産生方法は，上記形質転換された宿主細
胞を増殖させることを包含する。
なタンパクをコードする，単離されたヌクレオチド配列
を提供し，そして，この配列を含有し，そして該配列の
発現において効果的である組換え発現ベクター，それに
より軽質転換された宿主細胞，および組換えにより熱安
定性CDアーゼまたはその機能的等価物を産生する方法を
提供する。上記産生方法は，上記形質転換された宿主細
胞を増殖させることを包含する。
好ましい実施態様では，上記ヌクレオチドは，第10図
に示される配列と実質的に同一である。
に示される配列と実質的に同一である。
好ましい実施態様では，上記組換え発現ベクターは，
前記ヌクレオチド配列が，宿主細胞と適合性の制御配列
と作動可能に連結している。
前記ヌクレオチド配列が，宿主細胞と適合性の制御配列
と作動可能に連結している。
本発明は，単離された，熱安定性CDアーゼ，またはそ
れと機能的に等価なタンパクをも提供する。
れと機能的に等価なタンパクをも提供する。
好ましい実施態様では，上記CDアーゼは，第６図また
は第10図に示されるアミノ酸配列，またはそれと実質的
に相同でありかつ機能的に等価なアミノ酸配列を包含す
る。
は第10図に示されるアミノ酸配列，またはそれと実質的
に相同でありかつ機能的に等価なアミノ酸配列を包含す
る。
本発明の好ましい実施態様では,CDアーゼは酵母から
単離される，特に好ましい実施態様では，上記CDアーゼ
はSaccharomyces cerevisiaeから単離される。
単離される，特に好ましい実施態様では，上記CDアーゼ
はSaccharomyces cerevisiaeから単離される。
本発明の別の局面，利益および用途は，当業者がこの
開示を見れば，容易に明らかとなるであろう。
開示を見れば，容易に明らかとなるであろう。
（発明の構成） 本発明を実施する場合，特にことわりがないかぎり，
タンパク化学，分子生物学，微生物学および組換えDNA
技術の通常の技術が用いられ得る。これらの技術は，当
業者の範囲内である。このような技術は，文献で充分説
明されている〔例えば,Scopes,R.K.,Protein Purificat
ion Principles and Practice,第２版,Springer−Verfa
g,1987年;Methods in Enzymology,S.ColowickおよびN.K
aplan編集,Academic Press,Inc.;Maniatis,Fritschおよ
びSambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,
第２版,1989年;Oligonucleotide Synthesis,M.J.Gait編
集,1984年参照〕。
タンパク化学，分子生物学，微生物学および組換えDNA
技術の通常の技術が用いられ得る。これらの技術は，当
業者の範囲内である。このような技術は，文献で充分説
明されている〔例えば,Scopes,R.K.,Protein Purificat
ion Principles and Practice,第２版,Springer−Verfa
g,1987年;Methods in Enzymology,S.ColowickおよびN.K
aplan編集,Academic Press,Inc.;Maniatis,Fritschおよ
びSambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,
第２版,1989年;Oligonucleotide Synthesis,M.J.Gait編
集,1984年参照〕。
A.定義 本発明を説明する際に，次の用語が用いられ得るが，
ここで使用された場合，以下に示されるように定義され
ることを意図している。
ここで使用された場合，以下に示されるように定義され
ることを意図している。
「熱に安定なシトシンデアミナーゼ」は，遊離した非
固定化状態で,37℃で12時間より長く，好ましくは37℃
で１日以上より長く，最も好ましくは37℃で８日より長
く，少なくとも50％の活性を有するCDアーゼをいう（こ
の活性は，以下で充分に説明されるアッセイにより，単
離された上記酵素の存在下で5FCから5FUへの変換をモニ
ターすることにより決定される）。
固定化状態で,37℃で12時間より長く，好ましくは37℃
で１日以上より長く，最も好ましくは37℃で８日より長
く，少なくとも50％の活性を有するCDアーゼをいう（こ
の活性は，以下で充分に説明されるアッセイにより，単
離された上記酵素の存在下で5FCから5FUへの変換をモニ
ターすることにより決定される）。
アミノ酸配列またはタンパクは，アミノ酸の少なくと
も約50％，好ましくは少なくとも約85％，および最も好
ましくは少なくとも約90〜95％が，その分子の所定の長
さにわたって一致する場合，他のアミノ酸配列またはタ
ンパクと「実質的に相同」である。さらに，そのアミノ
酸の変異は，置換，欠失または付加を包含し得る。
も約50％，好ましくは少なくとも約85％，および最も好
ましくは少なくとも約90〜95％が，その分子の所定の長
さにわたって一致する場合，他のアミノ酸配列またはタ
ンパクと「実質的に相同」である。さらに，そのアミノ
酸の変異は，置換，欠失または付加を包含し得る。
「機能上等価な」という用語は，そのようなアミノ酸
配列またはタンパクが５−FCを５−FUに変換し得る（実
施例で述べられる）上記熱に安定な酵素を産生し得る鎖
であることを明確にすることを意図する。熱に安定なCD
アーゼと機能上等価なタンパクが，本発明の図面に示さ
れるアミノ酸配列と正確に一致した配列またはその全体
の配列を持つ必要はない。むしろ，そのタンパクは，ア
ミノ酸配列の生物学的活性のある断片で構成され得る
（その活性は上で定義された）。さらに，生物学的に活
性を有するかぎり，このタンパクは，図示される配列に
対する付加，欠失または置換を包含し得る。
配列またはタンパクが５−FCを５−FUに変換し得る（実
施例で述べられる）上記熱に安定な酵素を産生し得る鎖
であることを明確にすることを意図する。熱に安定なCD
アーゼと機能上等価なタンパクが，本発明の図面に示さ
れるアミノ酸配列と正確に一致した配列またはその全体
の配列を持つ必要はない。むしろ，そのタンパクは，ア
ミノ酸配列の生物学的活性のある断片で構成され得る
（その活性は上で定義された）。さらに，生物学的に活
性を有するかぎり，このタンパクは，図示される配列に
対する付加，欠失または置換を包含し得る。
「精製されたタンパク」は，他の物質を実質的に含有
していないタンパクである。例えば，タンパクＡは,Bが
他の細胞成分およびタンパクの混合物であり，存在する
Ａ＋Ｂの合計の少なくとも約50重量％，より好ましくは
少なくとも75重量％，および最も好ましくは90〜95重量
％，または，さらに99重量％がＡの場合,Bを実質的に含
有していない。しかし「精製された」という用語は，精
製されたタンパクが誘導される方法には関係しない。し
たがって，精製されたタンパクは，組換え技術により製
造されたタンパク，合成により製造され生物から直接単
離されたタンパクであり得る。
していないタンパクである。例えば，タンパクＡは,Bが
他の細胞成分およびタンパクの混合物であり，存在する
Ａ＋Ｂの合計の少なくとも約50重量％，より好ましくは
少なくとも75重量％，および最も好ましくは90〜95重量
％，または，さらに99重量％がＡの場合,Bを実質的に含
有していない。しかし「精製された」という用語は，精
製されたタンパクが誘導される方法には関係しない。し
たがって，精製されたタンパクは，組換え技術により製
造されたタンパク，合成により製造され生物から直接単
離されたタンパクであり得る。
「ポリペプチド」および「タンパク」という用語は，
最も広い意味で用いられる。すなわち，「ペプチド」お
よび「タンパク」は，ペプチド結合によって連結された
あらゆるアミノ酸のポリマー（ジペプチドまたはこれよ
り大きいペプチド）である。従って，この用語には，オ
リゴペプチド，タンパク断片，類似体，ミューティン
（変異タンパク），融合タンパクなどが包含される。こ
の用語には，天然および組換えタンパクが包含される。
最も広い意味で用いられる。すなわち，「ペプチド」お
よび「タンパク」は，ペプチド結合によって連結された
あらゆるアミノ酸のポリマー（ジペプチドまたはこれよ
り大きいペプチド）である。従って，この用語には，オ
リゴペプチド，タンパク断片，類似体，ミューティン
（変異タンパク），融合タンパクなどが包含される。こ
の用語には，天然および組換えタンパクが包含される。
「組換え」タンパクまたはポリペプチドは，組換えヌ
クレオチド配列から発現されるタンパク，すなわち，所
望のポリペプチドをコードする外因性DNAの構築物によ
り形質転換された細胞から産生されるタンパクをいう。
クレオチド配列から発現されるタンパク，すなわち，所
望のポリペプチドをコードする外因性DNAの構築物によ
り形質転換された細胞から産生されるタンパクをいう。
CDアーゼをコードするヌクレオチド配列を特徴づける
ためにここで用いられる「組換え」という用語は，ゲノ
ム,cDNA,半合成または合成起源の核酸配列の以下のよう
なものをいう；すなわち，その核酸配列は，起源または
操作によって，天然には生じないヌクレオチド配列，ま
たは，それが天然に連結されている核酸配列以外の核酸
配列に連結されたヌクレオチド配列である。
ためにここで用いられる「組換え」という用語は，ゲノ
ム,cDNA,半合成または合成起源の核酸配列の以下のよう
なものをいう；すなわち，その核酸配列は，起源または
操作によって，天然には生じないヌクレオチド配列，ま
たは，それが天然に連結されている核酸配列以外の核酸
配列に連結されたヌクレオチド配列である。
「レプリコン」は，細胞内で，ポリヌクレオチド複製
の自律単位として挙動する，すなわち，それ自身の制御
下で複製し得る，あらゆる遺伝要素（例えば，プラスミ
ド，染色体，ウィルス）である。
の自律単位として挙動する，すなわち，それ自身の制御
下で複製し得る，あらゆる遺伝要素（例えば，プラスミ
ド，染色体，ウィルス）である。
「ベクター」は，他のポリヌクレオチドのセグメント
が結合されて，結合されたセグメントの複製および／ま
たは発現を起こすレプリコンである。「発現ベクター」
は，自律性の複製または組込みを行い得るベクターをい
い，適切な宿主内で所望のヌクレオチド配列の転写と翻
訳を行う制御配列を持っている。
が結合されて，結合されたセグメントの複製および／ま
たは発現を起こすレプリコンである。「発現ベクター」
は，自律性の複製または組込みを行い得るベクターをい
い，適切な宿主内で所望のヌクレオチド配列の転写と翻
訳を行う制御配列を持っている。
「コード配列」は，ポリペプチドに転写および／また
は翻訳されるポリヌクレオチド配列である。
は翻訳されるポリヌクレオチド配列である。
「プロモーター配列」は,RNAポリメラーゼを結合させ
て，下流の（すなわち３′方向の）コード配列の転写を
開始させることができるDNA調節領域である。
て，下流の（すなわち３′方向の）コード配列の転写を
開始させることができるDNA調節領域である。
コード配列の転写がRNAポリメラーゼのプロモーター
配列への結合によって起こる場合，コード配列は，細胞
内でプロモーター配列の「制御下」にある。次いで，得
られたmRNAの翻訳によって，コード配列内にコードされ
たポリペプチドが生成する。
配列への結合によって起こる場合，コード配列は，細胞
内でプロモーター配列の「制御下」にある。次いで，得
られたmRNAの翻訳によって，コード配列内にコードされ
たポリペプチドが生成する。
「作動可能に連結された」という用語は，その構成要
素が，その通常の機能を発揮するような配置に並置され
ていることをいう。したがって，コド配列に作動可能に
連結された制御配列は，コード配列を発現することがで
きる。
素が，その通常の機能を発揮するような配置に並置され
ていることをいう。したがって，コド配列に作動可能に
連結された制御配列は，コード配列を発現することがで
きる。
「制御配列」は，コード配列の転写および／または翻
訳を制御する配列をいう；この配列には，限定されない
が，プロモーター配列，転写の開始および終止の配列，
および翻訳の開始および終止の配列が包含され得る。さ
らに「制御配列」は，コード配列内にコードされたポリ
ペプチドのプロセッシングを制御する配列をいう。これ
らの配列には，限定されないが，分泌，プロテアーゼの
切断，およびポリペプチドのグリコシル化を制御する配
列が包含される。
訳を制御する配列をいう；この配列には，限定されない
が，プロモーター配列，転写の開始および終止の配列，
および翻訳の開始および終止の配列が包含され得る。さ
らに「制御配列」は，コード配列内にコードされたポリ
ペプチドのプロセッシングを制御する配列をいう。これ
らの配列には，限定されないが，分泌，プロテアーゼの
切断，およびポリペプチドのグリコシル化を制御する配
列が包含される。
「シグナル配列」は，コード配列の前部に位置して得
る。この配列はシグナルペプチド，すなわち，ポリペプ
チドに対するＮ末端をコードし，このシグナルペプチド
は宿主細胞と連絡し，ポリペプチドを細胞表面に向ける
か，またはポリペプチドを培地中に分泌させる。このシ
グナルタンパクは，タンパクが細胞から離れる前に宿主
細胞により切離される。シグナル配列は，原核生物およ
び真核生物に天然に存在する各種のタンパクと結合した
ものが見つけられ得る。例えば，α因子，すなわち，天
然酵母のタンパクは酵母から分泌され，そのシグナル配
列は，培地中に分泌される非相同のタンパクに連結され
得る（米国特許第4,546,082号参照）。さらに，α因子
とその類似体は，サッカロミセス（Saccharomyces）お
よびクルイベロミセス（Kluyveromyces）のような各種
の酵母から非相同タンパクを分泌させることが見出され
ている〔例えば，ヨーロッパ特許出願公開第0,301,669
号（公開日1989年２月１日）参照〕。
る。この配列はシグナルペプチド，すなわち，ポリペプ
チドに対するＮ末端をコードし，このシグナルペプチド
は宿主細胞と連絡し，ポリペプチドを細胞表面に向ける
か，またはポリペプチドを培地中に分泌させる。このシ
グナルタンパクは，タンパクが細胞から離れる前に宿主
細胞により切離される。シグナル配列は，原核生物およ
び真核生物に天然に存在する各種のタンパクと結合した
ものが見つけられ得る。例えば，α因子，すなわち，天
然酵母のタンパクは酵母から分泌され，そのシグナル配
列は，培地中に分泌される非相同のタンパクに連結され
得る（米国特許第4,546,082号参照）。さらに，α因子
とその類似体は，サッカロミセス（Saccharomyces）お
よびクルイベロミセス（Kluyveromyces）のような各種
の酵母から非相同タンパクを分泌させることが見出され
ている〔例えば，ヨーロッパ特許出願公開第0,301,669
号（公開日1989年２月１日）参照〕。
「軽質転換」は，外因性のポリヌクレオチドを宿主細
胞に挿入することである。この外因性ポリヌクレオチド
は，プラスミドとして維持され得るか，または宿主ゲノ
ム内に組込まれ得る。
胞に挿入することである。この外因性ポリヌクレオチド
は，プラスミドとして維持され得るか，または宿主ゲノ
ム内に組込まれ得る。
「組換え宿主細胞」，「宿主細胞」，「細胞」などの
微生物を表す用語は，交換可能な同意語として用いら
れ，組換えベクターまたは転移されるDNAの受容体とし
て用いられ得る，または用いられてきた細胞をいい，ト
ランスフェクトされたものとの細胞の後代が含まれる。
単一の親細胞の後代は，偶然または計画的な変異のため
に，元の親と，ゲノムまたは全NDA補体が，必ずしも完
全に同一でなくてもよいことが理解される。したがっ
て，この用語は，関連する性質（例えば，所望の遺伝子
産物をコードする構造遺伝子に連結されたクローン化遺
伝子による，必須酵素をコードする天然遺伝子の置換）
によって特徴づけられる親に充分類似した親細胞の後代
を意味する。
微生物を表す用語は，交換可能な同意語として用いら
れ，組換えベクターまたは転移されるDNAの受容体とし
て用いられ得る，または用いられてきた細胞をいい，ト
ランスフェクトされたものとの細胞の後代が含まれる。
単一の親細胞の後代は，偶然または計画的な変異のため
に，元の親と，ゲノムまたは全NDA補体が，必ずしも完
全に同一でなくてもよいことが理解される。したがっ
て，この用語は，関連する性質（例えば，所望の遺伝子
産物をコードする構造遺伝子に連結されたクローン化遺
伝子による，必須酵素をコードする天然遺伝子の置換）
によって特徴づけられる親に充分類似した親細胞の後代
を意味する。
CDアーゼの「治療に有効な量」は,CDアーゼが作用す
る基質とともに投与された時に，基質を，腫瘍細胞の成
長を阻害し得る活性のある細胞毒性薬剤に変換するのに
充分な量である。
る基質とともに投与された時に，基質を，腫瘍細胞の成
長を阻害し得る活性のある細胞毒性薬剤に変換するのに
充分な量である。
B.一般的な方法 本発明は，熱安定性を示す，酵母から単離されたCDア
ーゼに向けられる。このCDアーゼは，以前に酵母から単
離されたCDアーゼ酵素とは異なる特性を有している。新
規に単離された酵母CDアーゼは，ゲル濾過クロマトグラ
フィーで決定したところ，約32kDaである。SDS−PAGEで
は,17kDaの位置に主要バンドを示し，このことは，本発
明のCDアーゼは二量体で構成され，各サブユニットは約
17kDaの分子量を有することを示している。さらに，以
前に単離された酵母CDアーゼ酵素は,37℃では著しい不
耐熱性を示したが，本発明の精製された酵素は，この温
度で安定である。さらに，この新しいCDアーゼのアミノ
酸配列は，配列が決定された他の公知のタンパクと，有
意な配列相同性を全く示さない。この独特のCDアーゼを
コードする遺伝子のクローニングと発現によって，約47
4塩基対の長さのコード配列が得られ，予想分子量が約1
7,506ダルトンの158アミノ酸のタンパクを指定する。熱
に安定なCDアーゼは，有子嚢胞子酵母，有担子胞子酵母
および不完全酵母のメンバーを含む酵母から単離され得
る。CDアーゼは，好ましくは，サッカロミセトイデエ
（Saccharomycetoideae）のメンバーから単離され，サ
ッカロミセス（Saccharomyces）の種が好ましく．特に
サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces serevisia
e）（パン酵母）が好ましい。フライシュマン圧搾酵母
（Fleishmann's Compressed Yeast）が熱に安定なCDア
ーゼの優れた起源であることがわかったが，これはパン
類製造業者と食料品店から容易に入手できる。
ーゼに向けられる。このCDアーゼは，以前に酵母から単
離されたCDアーゼ酵素とは異なる特性を有している。新
規に単離された酵母CDアーゼは，ゲル濾過クロマトグラ
フィーで決定したところ，約32kDaである。SDS−PAGEで
は,17kDaの位置に主要バンドを示し，このことは，本発
明のCDアーゼは二量体で構成され，各サブユニットは約
17kDaの分子量を有することを示している。さらに，以
前に単離された酵母CDアーゼ酵素は,37℃では著しい不
耐熱性を示したが，本発明の精製された酵素は，この温
度で安定である。さらに，この新しいCDアーゼのアミノ
酸配列は，配列が決定された他の公知のタンパクと，有
意な配列相同性を全く示さない。この独特のCDアーゼを
コードする遺伝子のクローニングと発現によって，約47
4塩基対の長さのコード配列が得られ，予想分子量が約1
7,506ダルトンの158アミノ酸のタンパクを指定する。熱
に安定なCDアーゼは，有子嚢胞子酵母，有担子胞子酵母
および不完全酵母のメンバーを含む酵母から単離され得
る。CDアーゼは，好ましくは，サッカロミセトイデエ
（Saccharomycetoideae）のメンバーから単離され，サ
ッカロミセス（Saccharomyces）の種が好ましく．特に
サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces serevisia
e）（パン酵母）が好ましい。フライシュマン圧搾酵母
（Fleishmann's Compressed Yeast）が熱に安定なCDア
ーゼの優れた起源であることがわかったが，これはパン
類製造業者と食料品店から容易に入手できる。
本発明のCDアーゼ精製法は，すでに報告されている方
法（例えば,Katsuragiら,1987年;Katsuragiら,1986年;I
pataら,1978年;Ipataら,1971年の各文献参照）およびKa
tsuragi（1988年）の方法とは異なる方法である。具体
的に述べると，この方法は，異なる精製工程を用いてお
り，アニオン変換クロマトグラフィーと疎水性クロマト
グラフィーとの工程の間にゲル浸透カラムによる精製法
を追加（以下に述べる）するとともに，異なる精製条件
（異なる緩衝液,pH,およびEDTAやDTTのような緩衝液の
成分を包含する）を用いていることを含む。その上，以
前の方法では熱に安定な酵素は得られない。
法（例えば,Katsuragiら,1987年;Katsuragiら,1986年;I
pataら,1978年;Ipataら,1971年の各文献参照）およびKa
tsuragi（1988年）の方法とは異なる方法である。具体
的に述べると，この方法は，異なる精製工程を用いてお
り，アニオン変換クロマトグラフィーと疎水性クロマト
グラフィーとの工程の間にゲル浸透カラムによる精製法
を追加（以下に述べる）するとともに，異なる精製条件
（異なる緩衝液,pH,およびEDTAやDTTのような緩衝液の
成分を包含する）を用いていることを含む。その上，以
前の方法では熱に安定な酵素は得られない。
酵母から熱に安定なCDアーゼを精製する第１工程は,C
Dアーゼを含有する自己分解物にするために酵母細胞を
破裂させることを包含する。自己分解は，公知のいくつ
かの方法のどれを用いても行うことができる。例えば，
酵母細胞は，クニッツの方法（1947年）に従って，トル
エンで原形質を分離され得る。特に有用なのは，酵母を
酢酸エチルのような有機溶媒に暴露し，次いで緩衝液を
添加して，溶液のpHを約７に維持することである。適切
な緩衝液には，リン酸カリウム緩衝液，リン酸緩衝食塩
水，トリス緩衝液，および当該分野で公知のその他いく
つかの緩衝液が包含される。緩衝液は,CDアーゼを安定
化させるために,1〜25％の範囲にある，好ましくは15％
の濃度の硫酸アンモニウムをEDTAおよびDTT（ジチオト
レイトール）とともに含有することが好ましい。あるい
は,EDTAおよびDTTは，この緩衝液および後で使用される
緩衝液から除くことができる。EDTAを用いる場合，その
濃度は,0.1mM〜10mMの範囲にあり,5mMが好ましく，また
DTTは,0.01mM〜10mMの濃度で，好ましくは0.1mMで用い
られ得る。この混合物は数日間撹拌され,pHは約７に維
持される。細胞の破片は遠心分離により除去され得る。
Dアーゼを含有する自己分解物にするために酵母細胞を
破裂させることを包含する。自己分解は，公知のいくつ
かの方法のどれを用いても行うことができる。例えば，
酵母細胞は，クニッツの方法（1947年）に従って，トル
エンで原形質を分離され得る。特に有用なのは，酵母を
酢酸エチルのような有機溶媒に暴露し，次いで緩衝液を
添加して，溶液のpHを約７に維持することである。適切
な緩衝液には，リン酸カリウム緩衝液，リン酸緩衝食塩
水，トリス緩衝液，および当該分野で公知のその他いく
つかの緩衝液が包含される。緩衝液は,CDアーゼを安定
化させるために,1〜25％の範囲にある，好ましくは15％
の濃度の硫酸アンモニウムをEDTAおよびDTT（ジチオト
レイトール）とともに含有することが好ましい。あるい
は,EDTAおよびDTTは，この緩衝液および後で使用される
緩衝液から除くことができる。EDTAを用いる場合，その
濃度は,0.1mM〜10mMの範囲にあり,5mMが好ましく，また
DTTは,0.01mM〜10mMの濃度で，好ましくは0.1mMで用い
られ得る。この混合物は数日間撹拌され,pHは約７に維
持される。細胞の破片は遠心分離により除去され得る。
自己分解に続いて，硫酸アンモニウムを用いて，自己
分解物から全タンパクを沈澱させる。硫酸アンモニウム
は，タンパクに対するCDアーゼのより高い比を得るのに
充分な濃度で添加される。例えば，硫酸アンモニウム
は，最初60〜80％の飽和度，好ましくは70％の飽和度に
達するように添加される。EDTAは，反応混合物中に，好
ましくは１〜3g/の濃度，より好ましくは1.5〜2.0g/
で含有され，反応は数時間実施され，遠心分離した
後，沈澱が回収される。ペレットを，適切な緩衝液（例
えば,pHが約７のPBS,緩衝液は，上記のようにEDTAおよ
びDTTを含有することが好ましい）に溶解させ，次い
で，溶液を同じ緩衝液に対して透析する。透析物は，硫
酸アンモニウムを加え約50％の濃度にして,2回目の処理
が行われ得る。この場合も上記のようにEDTAを含有させ
る。沈澱は遠心分離により再び回収され，上清液に硫酸
アンモニウムを添加して，約73％飽和度にする。沈澱は
回収され,pHが約5.6〜8.5の適切な緩衝液に溶解され
る。この緩衝液としては,DTTを上記の濃度で含有するpH
8.0のトリス緩衝液が好ましい。再構成させた沈澱は，
次にこの緩衝液に対して数時間透析される。透析物から
得られたCDアーゼは，さらに，例えば，架橋アガロース
またはセルロースパッキング材を用いるアニオン交換ク
ロマトグラフィーにより精製される。ファーマシア社か
ら入手可能なＱセファロースおよびDEAEセファロースの
ようなアニオン交換体が特に適切である。適切な平衡化
緩衝液には，例えば，トリス緩衝液またはリン酸緩衝液
が包含され，溶離は，線形勾配を用いて行われる。0.1m
MのDTTを含有するpH8.0の20mMトリス緩衝液を，同緩衝
液に０〜0.3MのKClを含有させた線形勾配とともに用い
るのが特に適切である。
分解物から全タンパクを沈澱させる。硫酸アンモニウム
は，タンパクに対するCDアーゼのより高い比を得るのに
充分な濃度で添加される。例えば，硫酸アンモニウム
は，最初60〜80％の飽和度，好ましくは70％の飽和度に
達するように添加される。EDTAは，反応混合物中に，好
ましくは１〜3g/の濃度，より好ましくは1.5〜2.0g/
で含有され，反応は数時間実施され，遠心分離した
後，沈澱が回収される。ペレットを，適切な緩衝液（例
えば,pHが約７のPBS,緩衝液は，上記のようにEDTAおよ
びDTTを含有することが好ましい）に溶解させ，次い
で，溶液を同じ緩衝液に対して透析する。透析物は，硫
酸アンモニウムを加え約50％の濃度にして,2回目の処理
が行われ得る。この場合も上記のようにEDTAを含有させ
る。沈澱は遠心分離により再び回収され，上清液に硫酸
アンモニウムを添加して，約73％飽和度にする。沈澱は
回収され,pHが約5.6〜8.5の適切な緩衝液に溶解され
る。この緩衝液としては,DTTを上記の濃度で含有するpH
8.0のトリス緩衝液が好ましい。再構成させた沈澱は，
次にこの緩衝液に対して数時間透析される。透析物から
得られたCDアーゼは，さらに，例えば，架橋アガロース
またはセルロースパッキング材を用いるアニオン交換ク
ロマトグラフィーにより精製される。ファーマシア社か
ら入手可能なＱセファロースおよびDEAEセファロースの
ようなアニオン交換体が特に適切である。適切な平衡化
緩衝液には，例えば，トリス緩衝液またはリン酸緩衝液
が包含され，溶離は，線形勾配を用いて行われる。0.1m
MのDTTを含有するpH8.0の20mMトリス緩衝液を，同緩衝
液に０〜0.3MのKClを含有させた線形勾配とともに用い
るのが特に適切である。
アニオン交換クロマトグラフィーに続いて,CDアーゼ
活性（以下に述べられるようにしてアッセイされる）を
有する画分がプールされ，次いで，例えば約30,000ダル
トン（Da）以下の分子量カットオフを行うフィルターを
用いる限外濾過法により濃縮される。
活性（以下に述べられるようにしてアッセイされる）を
有する画分がプールされ，次いで，例えば約30,000ダル
トン（Da）以下の分子量カットオフを行うフィルターを
用いる限外濾過法により濃縮される。
次に，得られたCDアーゼ含有溶液は，ゲル浸透カラム
に通される。特に有用なのは，架橋されたデキストラ
ン，アガロース，またはデキストラン／ビスアクリルア
ミドのゲルがあり，セファデックスＧ−75,G−100また
はゼファクリルＳ−100が好ましい。溶離液は,pHが約７
の当該分野で公知の通常の緩衝液でよく，先に述べたDT
Tを含有するPBSが好ましい。CDアーゼ活性を有する画分
はプールされ，リン酸カリウムのような緩衝液に対して
透析される。この緩衝液は，自己分解物用緩衝液につい
て先に述べたように，約１〜2Mの硫酸アンモニウムとDE
TAとDTTとを含有することが好ましい。所望するのであ
れば,2回目のゲル浸透カラムを通され得，次いで，活性
画分は，例えば,5000Daの分子量カットオフを行うフィ
ルターを用いる限外濾過法で濃縮され得る。
に通される。特に有用なのは，架橋されたデキストラ
ン，アガロース，またはデキストラン／ビスアクリルア
ミドのゲルがあり，セファデックスＧ−75,G−100また
はゼファクリルＳ−100が好ましい。溶離液は,pHが約７
の当該分野で公知の通常の緩衝液でよく，先に述べたDT
Tを含有するPBSが好ましい。CDアーゼ活性を有する画分
はプールされ，リン酸カリウムのような緩衝液に対して
透析される。この緩衝液は，自己分解物用緩衝液につい
て先に述べたように，約１〜2Mの硫酸アンモニウムとDE
TAとDTTとを含有することが好ましい。所望するのであ
れば,2回目のゲル浸透カラムを通され得，次いで，活性
画分は，例えば,5000Daの分子量カットオフを行うフィ
ルターを用いる限外濾過法で濃縮され得る。
得られたCDアーゼ含有物質は，次に，疎水性に基づい
て物質を分離するカラムに適用され，例えば，リン酸カ
リウム緩衝液に硫酸アンモニウムを含有させた逆勾配を
用いて溶離される。CDアーゼ活性を有する画分を合わ
せ,5000Daの分子量カットオフのフィルターを用いる限
外濾過法で濃縮する。濃縮物は，その後の使用のために
凍結して保存され得る。しかし,2回目のゲル浸透カラム
処理が行われない場合，および／またはCDアーゼの比活
性が低い場合は，上で述べた他のゲル浸透カラムが使用
され得る。このようにして精製されたCDアーゼは，熱に
安定であり，それゆえ，自由な形に凍結または凍結乾燥
して保存され得る。
て物質を分離するカラムに適用され，例えば，リン酸カ
リウム緩衝液に硫酸アンモニウムを含有させた逆勾配を
用いて溶離される。CDアーゼ活性を有する画分を合わ
せ,5000Daの分子量カットオフのフィルターを用いる限
外濾過法で濃縮する。濃縮物は，その後の使用のために
凍結して保存され得る。しかし,2回目のゲル浸透カラム
処理が行われない場合，および／またはCDアーゼの比活
性が低い場合は，上で述べた他のゲル浸透カラムが使用
され得る。このようにして精製されたCDアーゼは，熱に
安定であり，それゆえ，自由な形に凍結または凍結乾燥
して保存され得る。
CDアーゼの活性は，精製中に，当該分野で公知のいく
つかの方法によりモニターされ得る。例えば,CDアーゼ
存在下でのシトシンからウラシルまたはその誘導体への
変換は，この変換に伴う286nmにおける吸光度の低下か
ら，直接分光光度アッセイによってモニターされ得る
（例えば,IpataおよびCercignani,1978年の文献参
照）。あるいは,Nishiyamaら（1985年）により記載され
た,5FCから5FUへの変換を分光光度測定法でモニターす
ることによって，活性が測定され得る。なお，この文献
は本発明に援用される。
つかの方法によりモニターされ得る。例えば,CDアーゼ
存在下でのシトシンからウラシルまたはその誘導体への
変換は，この変換に伴う286nmにおける吸光度の低下か
ら，直接分光光度アッセイによってモニターされ得る
（例えば,IpataおよびCercignani,1978年の文献参
照）。あるいは,Nishiyamaら（1985年）により記載され
た,5FCから5FUへの変換を分光光度測定法でモニターす
ることによって，活性が測定され得る。なお，この文献
は本発明に援用される。
上記の方法で精製された熱に安定なCDアーゼは，本発
明の試験のセクションで述べられたように配列が決定さ
れ，その部分的なアミノ酸配列が第６図に示され得た。
その配列は，配列が決定された他の公知のタンパクと
は，実質的な相同性を全く示さない。この情報に基づい
て，熱に安定なCDアーゼは組換え技術で製造され得る。
例えば,CDアーゼをコードするDNA配列は，得られたアミ
ノ酸配列に基づいて，適切なコドンを用いて合成により
製造され得る。一般に,CDアーゼの発現に用いられる宿
主に対して好ましいコドンが選択され得る。完全配列
は，標準法で製造されたオリゴヌクレオチドをオーバー
ラップして組み立てられる（例えば,Egde,Nature,292
巻,756頁,1981年;Nambairら,Science,223巻,1299頁,198
4年;Jayら,J.Biol.Chem.259巻,6311頁,1984年参照）。
明の試験のセクションで述べられたように配列が決定さ
れ，その部分的なアミノ酸配列が第６図に示され得た。
その配列は，配列が決定された他の公知のタンパクと
は，実質的な相同性を全く示さない。この情報に基づい
て，熱に安定なCDアーゼは組換え技術で製造され得る。
例えば,CDアーゼをコードするDNA配列は，得られたアミ
ノ酸配列に基づいて，適切なコドンを用いて合成により
製造され得る。一般に,CDアーゼの発現に用いられる宿
主に対して好ましいコドンが選択され得る。完全配列
は，標準法で製造されたオリゴヌクレオチドをオーバー
ラップして組み立てられる（例えば,Egde,Nature,292
巻,756頁,1981年;Nambairら,Science,223巻,1299頁,198
4年;Jayら,J.Biol.Chem.259巻,6311頁,1984年参照）。
あるいは，組換えの熱に安定なCDアーゼは，以下の方
法により製造され得る。決定されたアミノ酸配列の一部
分に対するコドンを含有するオリゴヌクレオチドプロー
ブが製造され得,CDアーゼをコードする遺伝子のゲノム
またはcDNAのライブラリーをスクリーニングするために
使用される。オリゴヌクレオチドプローブおよびDNAラ
イブラリーの製造，および核酸ハイブリダイゼーション
によるそれらのスクリーニングの基本的な方法は，当業
者には公知である（例えば,Oligonucleotide Synthesi
s,上記文献;T.Maniatisら，上記文献参照）。陽性のハ
イブリダイゼーションによって，スクリーニングされた
ライブラリー由来のクローンが同定されたならば，制限
酵素分析およびDNA配列決定が行われ得，特定のライブ
ラリーの挿入断片が,CDアーゼをコードする遺伝子を含
有することを確認する。さらに，ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）が増幅のために用いられ得，次いで,CDアーゼを
コードするヌクレオチド配列を検出する。この方法は,S
aikiら,1986年の文献，および米国特許第4,683,195号お
よび第4,683,202号に記載されており，その開示事項は
本発明に援用されるものである。PCRで増幅された産物
のヌクレオチド配列の分析は,Saikiら（1988年）の文献
に記載された直接配列分析法により行われ得る。あるい
は，増幅された標的配列は，配列分析の前にクローン化
され得る。酵素によって増幅されたゲノムセグメントの
直接のクローン化および直接配列分析の方法は,Scharf
ら（1986年）の文献に記載されている。この方法では,P
CRの技術に用いられるプライマーは，その５′末端の近
くが修飾され，例えば,M13配列決定ベクター中で直接ク
ローン化するために好都合な制限部位を生成される。増
幅後,PCR産物は適切な制限酵素によって切断される。そ
の制限断片はM13ベクターに連結され，例えば,JM103宿
主に形質転換され，プレートされ，次いで得られたプラ
ークは，標識されたオリゴヌクレオチドのプローブを用
いてハイブリダイゼーションによりスクリーニングされ
る。クローン化および配列分析のその他の方法は，当該
分野では公知である。
法により製造され得る。決定されたアミノ酸配列の一部
分に対するコドンを含有するオリゴヌクレオチドプロー
ブが製造され得,CDアーゼをコードする遺伝子のゲノム
またはcDNAのライブラリーをスクリーニングするために
使用される。オリゴヌクレオチドプローブおよびDNAラ
イブラリーの製造，および核酸ハイブリダイゼーション
によるそれらのスクリーニングの基本的な方法は，当業
者には公知である（例えば,Oligonucleotide Synthesi
s,上記文献;T.Maniatisら，上記文献参照）。陽性のハ
イブリダイゼーションによって，スクリーニングされた
ライブラリー由来のクローンが同定されたならば，制限
酵素分析およびDNA配列決定が行われ得，特定のライブ
ラリーの挿入断片が,CDアーゼをコードする遺伝子を含
有することを確認する。さらに，ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）が増幅のために用いられ得，次いで,CDアーゼを
コードするヌクレオチド配列を検出する。この方法は,S
aikiら,1986年の文献，および米国特許第4,683,195号お
よび第4,683,202号に記載されており，その開示事項は
本発明に援用されるものである。PCRで増幅された産物
のヌクレオチド配列の分析は,Saikiら（1988年）の文献
に記載された直接配列分析法により行われ得る。あるい
は，増幅された標的配列は，配列分析の前にクローン化
され得る。酵素によって増幅されたゲノムセグメントの
直接のクローン化および直接配列分析の方法は,Scharf
ら（1986年）の文献に記載されている。この方法では,P
CRの技術に用いられるプライマーは，その５′末端の近
くが修飾され，例えば,M13配列決定ベクター中で直接ク
ローン化するために好都合な制限部位を生成される。増
幅後,PCR産物は適切な制限酵素によって切断される。そ
の制限断片はM13ベクターに連結され，例えば,JM103宿
主に形質転換され，プレートされ，次いで得られたプラ
ークは，標識されたオリゴヌクレオチドのプローブを用
いてハイブリダイゼーションによりスクリーニングされ
る。クローン化および配列分析のその他の方法は，当該
分野では公知である。
本発明で用いられる特に好ましい方法では,2つのオリ
ゴヌクレオチドのプライマーを，部分的なアミノ酸配列
とDNA配列の「ゲスマー」（guessmer）配列を設計する
際のガイドとしてエス・セレブシエ（S.cerevisiae）由
来のコドン使用パターン（GuthrieおよびAbelson（1982
年）の文献）とを用いて合成した。これらのプライマー
を，クローン化された酵母ゲノムライブラリーDNAが鋳
型として存在するPCRに用いた。アミノ酸が，著しいコ
ドン使用のかたよりを示すCDアーゼの領域および／また
は縮重をほとんど示さないCDアーゼの領域から，オリゴ
ヌクレオチドを合成した。第１プライマーのCDA4R1は，
アミノ末端のアミノ酸配列に対応する33のヌクレオチド
を含有する42量体であった。一方，第２プライマーのCD
A5ASは，そのタンパクのカルボキシ末端の近くに位置す
る配列に相補的なヌクレオチドを含有していた。これら
のオリゴヌクレオチドの配列を第７図に示す。２つのゲ
ノムライブラリーをPCR反応における鋳型DNAとして用
い，両者が，長さが約350塩基対の単一の特異的断片を
生成することがわかった（大きさは，入手可能な対応す
るアミノ酸配列から予測した）。PCRプライマーをその
５′末端のEcoR I制限部位で設計し,PCRで生成する断片
のクローン化を容易にした。350塩基対のPCR由来の断片
をゲル電気泳動法で精製し，適切なベクターでサブクロ
ーン化してDNAの配列を決定した。
ゴヌクレオチドのプライマーを，部分的なアミノ酸配列
とDNA配列の「ゲスマー」（guessmer）配列を設計する
際のガイドとしてエス・セレブシエ（S.cerevisiae）由
来のコドン使用パターン（GuthrieおよびAbelson（1982
年）の文献）とを用いて合成した。これらのプライマー
を，クローン化された酵母ゲノムライブラリーDNAが鋳
型として存在するPCRに用いた。アミノ酸が，著しいコ
ドン使用のかたよりを示すCDアーゼの領域および／また
は縮重をほとんど示さないCDアーゼの領域から，オリゴ
ヌクレオチドを合成した。第１プライマーのCDA4R1は，
アミノ末端のアミノ酸配列に対応する33のヌクレオチド
を含有する42量体であった。一方，第２プライマーのCD
A5ASは，そのタンパクのカルボキシ末端の近くに位置す
る配列に相補的なヌクレオチドを含有していた。これら
のオリゴヌクレオチドの配列を第７図に示す。２つのゲ
ノムライブラリーをPCR反応における鋳型DNAとして用
い，両者が，長さが約350塩基対の単一の特異的断片を
生成することがわかった（大きさは，入手可能な対応す
るアミノ酸配列から予測した）。PCRプライマーをその
５′末端のEcoR I制限部位で設計し,PCRで生成する断片
のクローン化を容易にした。350塩基対のPCR由来の断片
をゲル電気泳動法で精製し，適切なベクターでサブクロ
ーン化してDNAの配列を決定した。
PCR由来の断片もまた，コロニーフィルターハイブリ
ダイゼーション法によって酵母ライブラリーをスクリー
ニングするためのCDアーゼ特異的プローブとして用い
た。ゲスマーオリゴヌクレオチドをプローブとして用い
る最初の試みは，ハイブリダイゼーション後のシグナル
／ノイズ比が低いために失敗した。可能性があるすべて
のクローンを取り出し,2回再度スクリーニングを行い，
正のハイブリダイゼーションシグナルを確認した。プラ
スミドを個々のクローンから精製し，一連の制限酵素を
個々に用いて，そして，複数個を用いて消化を行うこと
により，制限地図を作成した。
ダイゼーション法によって酵母ライブラリーをスクリー
ニングするためのCDアーゼ特異的プローブとして用い
た。ゲスマーオリゴヌクレオチドをプローブとして用い
る最初の試みは，ハイブリダイゼーション後のシグナル
／ノイズ比が低いために失敗した。可能性があるすべて
のクローンを取り出し,2回再度スクリーニングを行い，
正のハイブリダイゼーションシグナルを確認した。プラ
スミドを個々のクローンから精製し，一連の制限酵素を
個々に用いて，そして，複数個を用いて消化を行うこと
により，制限地図を作成した。
クローン化されたPCR断片と,CDアーゼをコードするゲ
ノムクローンとの両方のDNA配列分析を行った。反応条
件を変えることによって，プライマーに直接隣接する配
列から数百塩基対離れた配列までの分析が可能であっ
た。得られたDNA配列を第８図に示す。図から明らかな
ように，この配列は93％相同で23個がミスマッチであ
り,330個がマッチしていた。この配列内に見出されたOR
Fを第９図に示す。第10図は,ORF2のヌクレオチド配列お
よび推定アミノ酸配列を示す。このことにより先に決定
されたアミノ酸配列が確認され，そして，精製タンパク
の分析により得られる部分配列のいずれの端部にも，僅
かに少数のアミノ酸が付加していることが予想される。
ノムクローンとの両方のDNA配列分析を行った。反応条
件を変えることによって，プライマーに直接隣接する配
列から数百塩基対離れた配列までの分析が可能であっ
た。得られたDNA配列を第８図に示す。図から明らかな
ように，この配列は93％相同で23個がミスマッチであ
り,330個がマッチしていた。この配列内に見出されたOR
Fを第９図に示す。第10図は,ORF2のヌクレオチド配列お
よび推定アミノ酸配列を示す。このことにより先に決定
されたアミノ酸配列が確認され，そして，精製タンパク
の分析により得られる部分配列のいずれの端部にも，僅
かに少数のアミノ酸が付加していることが予想される。
このDNA配列のデータは次に,CDアーゼをコードする，
増幅されたDNAカセットを生成させるための新しいPCRプ
ライマーを設計するのに，用いられる。このようなカセ
ットは，真核もしくは原核細胞中に高レベルの遺伝子発
現を行い，かつ，癌抗原を標的にした免疫グロブリン分
子を含む（これには限定されない）生物学的に重要な他
の分子とCDアーゼ間の遺伝子融合を起こすよう設計され
た遺伝子構築物に用いることができる。
増幅されたDNAカセットを生成させるための新しいPCRプ
ライマーを設計するのに，用いられる。このようなカセ
ットは，真核もしくは原核細胞中に高レベルの遺伝子発
現を行い，かつ，癌抗原を標的にした免疫グロブリン分
子を含む（これには限定されない）生物学的に重要な他
の分子とCDアーゼ間の遺伝子融合を起こすよう設計され
た遺伝子構築物に用いることができる。
CDアーゼをコードする配列は，当該技術分野で公知の
適切ないずれのベクターもしくはレプリコンにもクロー
ン化することができる。クローン化用組換え体DNAベク
ター，およびこれらが形質転換し得る宿主細胞（大括弧
内に示す）の例としては次のようなものがある：λバク
テリオファージ〔イー・コリ（E.coli）〕,pBR322〔イ
ー・コリ〕,pACYC177〔イー・コリ〕,pKT230〔グラム陰
性菌〕,pGV1106〔グラム陰性菌〕,pLAFR1〔グラム陰性
菌〕,pME290〔イー・コリ以外のグラム陰性菌〕,pHV14
〔イー・コリ；バシラス・サチリス（Basillus subtili
s）〕,pBD9〔バシラス〕,pIJ61〔ストレプトミセス〕,p
UC6〔ストレプトミセス〕,YIp5〔サッカロミセス〕,YCp
19〔サッカロミセス〕およびウシ乳頭腫ウイルス（哺乳
類細胞〕。
適切ないずれのベクターもしくはレプリコンにもクロー
ン化することができる。クローン化用組換え体DNAベク
ター，およびこれらが形質転換し得る宿主細胞（大括弧
内に示す）の例としては次のようなものがある：λバク
テリオファージ〔イー・コリ（E.coli）〕,pBR322〔イ
ー・コリ〕,pACYC177〔イー・コリ〕,pKT230〔グラム陰
性菌〕,pGV1106〔グラム陰性菌〕,pLAFR1〔グラム陰性
菌〕,pME290〔イー・コリ以外のグラム陰性菌〕,pHV14
〔イー・コリ；バシラス・サチリス（Basillus subtili
s）〕,pBD9〔バシラス〕,pIJ61〔ストレプトミセス〕,p
UC6〔ストレプトミセス〕,YIp5〔サッカロミセス〕,YCp
19〔サッカロミセス〕およびウシ乳頭腫ウイルス（哺乳
類細胞〕。
CDアーゼタンパクのコード配列は，プロモーター，リ
ボソーム結合部位（細菌発現用）および必要に応じてオ
ペレーターの制御下に配置することができ（本明細書で
はこれらをまとめて“制御”要素と呼ぶ），その結果,C
DアーゼタンパクをコードするDNA配列は，この発現構築
物を有するベクターで形質転換された宿主細胞中でRNA
に転写される。このコード配列は，シグナルペプチドも
しくはリーダー配列を有していてもいなくてもよい。リ
ーダー配列は，翻訳後のプロセッシングにより細菌宿主
で除去され得る（例えば，米国特許第4,431,739号，第
4,425,437号および第4,338,397号参照）。
ボソーム結合部位（細菌発現用）および必要に応じてオ
ペレーターの制御下に配置することができ（本明細書で
はこれらをまとめて“制御”要素と呼ぶ），その結果,C
DアーゼタンパクをコードするDNA配列は，この発現構築
物を有するベクターで形質転換された宿主細胞中でRNA
に転写される。このコード配列は，シグナルペプチドも
しくはリーダー配列を有していてもいなくてもよい。リ
ーダー配列は，翻訳後のプロセッシングにより細菌宿主
で除去され得る（例えば，米国特許第4,431,739号，第
4,425,437号および第4,338,397号参照）。
制御配列に加えて，宿主細胞の生育に関連して発現CD
アーゼ配列の調節ができる調節配列を加えることが望ま
しい。調節配列は，当業者にとって公知のものであり，
その例には，化学的もしくは物理的刺激に対して反応
し，遺伝子の発現を開始もしくは停止させる配列が含ま
れ，それには調節化合物の存在が含まれる。他の種類の
調節要素，例えばエンハンサー配列もベクター中に存在
し得る。
アーゼ配列の調節ができる調節配列を加えることが望ま
しい。調節配列は，当業者にとって公知のものであり，
その例には，化学的もしくは物理的刺激に対して反応
し，遺伝子の発現を開始もしくは停止させる配列が含ま
れ，それには調節化合物の存在が含まれる。他の種類の
調節要素，例えばエンハンサー配列もベクター中に存在
し得る。
発現ベクターは,CDアーゼコード配列が，適切な調節
配列とともにベクター中に配置されることにより構築さ
れる。上記ベクター中での制御配列に関しての，コード
配列の位置および方向は，コード配列が制御配列の“制
御”下で転写されるような位置および配列である（つま
り制御配列の位置においてDNA分子に結合するRNAポリメ
ラーゼがコード配列を転写する）。CDアーゼをコードす
る配列を修飾することは，この目的を達成するのに望ま
しいことである。例えば，ある場合においては，この配
列を，該配列が適切な方向で制御配列に連結するように
修飾すること，つまり，読み枠を維持するように修飾す
ることが必要である。制御配列および，別の調節配列
は，上記のクローニングベクターのようなベクターに挿
入する前にコード配列に連結してもよい。あるいは，コ
ード配列は，すでに制御配列と適切な制限部位を有する
発現ベクターに直接クローン化してもよい。
配列とともにベクター中に配置されることにより構築さ
れる。上記ベクター中での制御配列に関しての，コード
配列の位置および方向は，コード配列が制御配列の“制
御”下で転写されるような位置および配列である（つま
り制御配列の位置においてDNA分子に結合するRNAポリメ
ラーゼがコード配列を転写する）。CDアーゼをコードす
る配列を修飾することは，この目的を達成するのに望ま
しいことである。例えば，ある場合においては，この配
列を，該配列が適切な方向で制御配列に連結するように
修飾すること，つまり，読み枠を維持するように修飾す
ることが必要である。制御配列および，別の調節配列
は，上記のクローニングベクターのようなベクターに挿
入する前にコード配列に連結してもよい。あるいは，コ
ード配列は，すでに制御配列と適切な制限部位を有する
発現ベクターに直接クローン化してもよい。
多くの原核発現ベクターが当該技術分野で知られてい
る。例えば，米国特許第4,440,859号，第4,436,815号，
第4,431,740号，第4,431,739号，第4,428,941号，第4,4
25,437号，第4,418,149号，第4,411,994号，第4,366,24
6号，第4,342,832号；英国特許出願GB2,121,054号,GB2,
008,123号,2,007,675号；およびヨーロッパ特許出願第1
03,395号を参照されたい。酵母発現ベクターも当該技術
分野で公知である。例えば，米国特許第4,446,235号，
第4,443,539号，第4,430,428号；ヨーロッパ特許出願第
103,409号，第100,561号および96,491号を参照された
い。哺乳類発現ベクターもまた，公知である。
る。例えば，米国特許第4,440,859号，第4,436,815号，
第4,431,740号，第4,431,739号，第4,428,941号，第4,4
25,437号，第4,418,149号，第4,411,994号，第4,366,24
6号，第4,342,832号；英国特許出願GB2,121,054号,GB2,
008,123号,2,007,675号；およびヨーロッパ特許出願第1
03,395号を参照されたい。酵母発現ベクターも当該技術
分野で公知である。例えば，米国特許第4,446,235号，
第4,443,539号，第4,430,428号；ヨーロッパ特許出願第
103,409号，第100,561号および96,491号を参照された
い。哺乳類発現ベクターもまた，公知である。
選択される発現系および宿主に依存して,CDアーゼ
は，上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を,CD
アーゼが発現される条件下で増殖させることによって製
造される。次いでこのタンパクは宿主細胞から単離され
精製される。発現系がタンパクを増殖培地内に分泌する
場合には，このタンパクは培地から直接精製され得る。
タンパクが分泌されない場合には，それは細胞溶解物か
ら単離される。適切な増殖条件および回収法の選択は，
当業者の技術範囲内にある。
は，上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を,CD
アーゼが発現される条件下で増殖させることによって製
造される。次いでこのタンパクは宿主細胞から単離され
精製される。発現系がタンパクを増殖培地内に分泌する
場合には，このタンパクは培地から直接精製され得る。
タンパクが分泌されない場合には，それは細胞溶解物か
ら単離される。適切な増殖条件および回収法の選択は，
当業者の技術範囲内にある。
酵母中でCDアーゼ配列を制御して誘発させる構築物の
１例は,CDアーゼカセットを，“フュージョネーター”
（fusionator）と呼ばれる酵母ベクターに挿入したもの
である。このベクターは，米国，ワシントン州，シアト
ルのワシントン大学，遺伝学部およびNIHから入手可能
である。このような構築物を第11図に示す。この構築物
において,CDアーゼは，その発現を，酵母由来の，高度
に発現され厳密に調節されたGAL10プロモーターの制御
下に置くポリリンカーに挿入される（Johnston,M.1987
年）。GAL10プロモーターはガラクトースに反応し，遺
伝子の高レベルの発現をその制御下で誘発する。このベ
クターはまた,DNA配列を適当に変化させることによって
CDアーゼ−lacZ融合体を創製するのに使用され得る。生
成した融合タンパクにより，誘発の定量，精製，および
生物学的分析が容易になる。これらの構築物は,Hovland
ら（1989年）の文献に記載されているような適切な酵母
株に形質転換することができる。この酵母株には，上記
のような構築物とともに用いるのが望ましいいくつかの
変異体が含まれている。特に,gal1変異体が存在し，こ
れはガラクトース利用の第１段階を触媒する酵素を減少
させ，その結果，培地中の誘発物質（ガラクトース）を
枯渇するのを防止する。regl−501変異体もまた存在
し，これは，ガラクトース遺伝子発現のグルコースによ
る抑制を排除し，培養物を増殖および生存度に最適な条
件下に置くことを可能にする。誘発は，ガラクトースを
添加して，グルコースをベースとする培地をガラクトー
ス富化させることによって容易に行われ得る。最後に，
この酵母株にはプロテアーゼが不足した変異体がいくつ
か存在し，増殖中に生成した非相同タンパクもしくはそ
の断片の安定性を増大化する。このような発現構築物
は，内因性遺伝子で得られる発現レベルを用いて，従来
不可能であった量で,CDアーゼを酵母から単離および精
製するのを促進するに違いない。
１例は,CDアーゼカセットを，“フュージョネーター”
（fusionator）と呼ばれる酵母ベクターに挿入したもの
である。このベクターは，米国，ワシントン州，シアト
ルのワシントン大学，遺伝学部およびNIHから入手可能
である。このような構築物を第11図に示す。この構築物
において,CDアーゼは，その発現を，酵母由来の，高度
に発現され厳密に調節されたGAL10プロモーターの制御
下に置くポリリンカーに挿入される（Johnston,M.1987
年）。GAL10プロモーターはガラクトースに反応し，遺
伝子の高レベルの発現をその制御下で誘発する。このベ
クターはまた,DNA配列を適当に変化させることによって
CDアーゼ−lacZ融合体を創製するのに使用され得る。生
成した融合タンパクにより，誘発の定量，精製，および
生物学的分析が容易になる。これらの構築物は,Hovland
ら（1989年）の文献に記載されているような適切な酵母
株に形質転換することができる。この酵母株には，上記
のような構築物とともに用いるのが望ましいいくつかの
変異体が含まれている。特に,gal1変異体が存在し，こ
れはガラクトース利用の第１段階を触媒する酵素を減少
させ，その結果，培地中の誘発物質（ガラクトース）を
枯渇するのを防止する。regl−501変異体もまた存在
し，これは，ガラクトース遺伝子発現のグルコースによ
る抑制を排除し，培養物を増殖および生存度に最適な条
件下に置くことを可能にする。誘発は，ガラクトースを
添加して，グルコースをベースとする培地をガラクトー
ス富化させることによって容易に行われ得る。最後に，
この酵母株にはプロテアーゼが不足した変異体がいくつ
か存在し，増殖中に生成した非相同タンパクもしくはそ
の断片の安定性を増大化する。このような発現構築物
は，内因性遺伝子で得られる発現レベルを用いて，従来
不可能であった量で,CDアーゼを酵母から単離および精
製するのを促進するに違いない。
その他の構築物が哺乳類細胞の培養系に用いるために
創製され得る。本発明の好ましい態様において,CDアー
ゼをコードするカセットは,PCR技術を用いて，オンコス
タチンＭ（Malikら,1989年）の分泌シグナルペプチドに
連結され，次に，哺乳類での発現に適切なエンハンサ
ー，プロモーター，終止およびプロセッシングのシグナ
ルを有する哺乳類発現ベクターpH3MPy（Stamenkovicら,
1990年）に挿入される。この構築物は,COS細胞にトラン
スフェクトされ（AruffoおよびSeed,1987年）血清を含
有しない培養培地が集められ，そして内因性酵素活性を
欠いた系内でCDアーゼ活性が分析される。同様に,CDア
ーゼおよび他の関連分子との遺伝子融合を行うためのcD
NA構築物が標準法で構築され,COS細胞にトランスフェク
トされ，次に細胞抽出物もしくは上澄液が，タンパクと
その活性について分析される。
創製され得る。本発明の好ましい態様において,CDアー
ゼをコードするカセットは,PCR技術を用いて，オンコス
タチンＭ（Malikら,1989年）の分泌シグナルペプチドに
連結され，次に，哺乳類での発現に適切なエンハンサ
ー，プロモーター，終止およびプロセッシングのシグナ
ルを有する哺乳類発現ベクターpH3MPy（Stamenkovicら,
1990年）に挿入される。この構築物は,COS細胞にトラン
スフェクトされ（AruffoおよびSeed,1987年）血清を含
有しない培養培地が集められ，そして内因性酵素活性を
欠いた系内でCDアーゼ活性が分析される。同様に,CDア
ーゼおよび他の関連分子との遺伝子融合を行うためのcD
NA構築物が標準法で構築され,COS細胞にトランスフェク
トされ，次に細胞抽出物もしくは上澄液が，タンパクと
その活性について分析される。
他の遺伝子融合体もまた,CDアーゼの組換えによる生
産に用いられる。例えば,CDアーゼをコードするヌクレ
オチド配列もしくは機能性変異体もしくはその断片は,c
DNAがコードし，癌抗原を標的とする免疫グロブリン分
子に融合され得，抗体酵素融合タンパクが形成され得
る。腫瘍細胞上で優先的に発現する決定因子を認識する
モノクローナル抗体が得られている（Hellstromら,1984
年）。従って，選択された腫瘍細胞を特異的に標的とす
る融合タンパクが創生され得る。例えば，米国特許第4,
906,562号およびHellstrom,1985年の文献を参照された
い。次にこの酵素は，腫瘍細胞部位に直接作用して，前
駆薬剤5FCを抗腫瘍剤5FUに変換することができる。目的
とする酵素をコードする遺伝子と，癌細胞を標的にした
抗体とのゲノム融合体によって,2つのタンパクの化学的
結合が不要となる。同様に，目的とする２つの分子間の
cDNA構築物は，非相同発現系内でのこのような構築物の
フレキシビリティを増大することができる。
産に用いられる。例えば,CDアーゼをコードするヌクレ
オチド配列もしくは機能性変異体もしくはその断片は,c
DNAがコードし，癌抗原を標的とする免疫グロブリン分
子に融合され得，抗体酵素融合タンパクが形成され得
る。腫瘍細胞上で優先的に発現する決定因子を認識する
モノクローナル抗体が得られている（Hellstromら,1984
年）。従って，選択された腫瘍細胞を特異的に標的とす
る融合タンパクが創生され得る。例えば，米国特許第4,
906,562号およびHellstrom,1985年の文献を参照された
い。次にこの酵素は，腫瘍細胞部位に直接作用して，前
駆薬剤5FCを抗腫瘍剤5FUに変換することができる。目的
とする酵素をコードする遺伝子と，癌細胞を標的にした
抗体とのゲノム融合体によって,2つのタンパクの化学的
結合が不要となる。同様に，目的とする２つの分子間の
cDNA構築物は，非相同発現系内でのこのような構築物の
フレキシビリティを増大することができる。
ある系においては，癌抗体のＨ鎖のcDNAは，この抗体
を産生する細胞系から得られる。このcDNAの全部または
一部をコードするPCRフラグメントは，当業者に公知の
方法により得ることができる。２つのカセットの枠内融
合は，いくつかの位置における標準的技術により可能で
あり，得られた融合遺伝子は，望ましい生物学的活性に
ついてタンパクの産生を試験した。この抗体分子のＬ鎖
部分をコードするcDNAを有する２番目のプラスミドのコ
トランスフェクションにより，活性型CDアーゼ酵素に融
合した生物学的に活性な抗体フラグメントを単離でき
る。このようにして，望ましい位置に対するこの酵素の
標的化が達成される。
を産生する細胞系から得られる。このcDNAの全部または
一部をコードするPCRフラグメントは，当業者に公知の
方法により得ることができる。２つのカセットの枠内融
合は，いくつかの位置における標準的技術により可能で
あり，得られた融合遺伝子は，望ましい生物学的活性に
ついてタンパクの産生を試験した。この抗体分子のＬ鎖
部分をコードするcDNAを有する２番目のプラスミドのコ
トランスフェクションにより，活性型CDアーゼ酵素に融
合した生物学的に活性な抗体フラグメントを単離でき
る。このようにして，望ましい位置に対するこの酵素の
標的化が達成される。
機能的には同等の熱安定性CDアーゼの変異体または類
似体を作ることも望ましい。変異体または類似体は,CD
アーゼをコードする配列部分の欠失，配列の挿入，およ
び／またはこの配列内の１個またはそれ以上の核酸の置
換により，調製され得る。ヌクレオチド配列を修飾する
方法，例えば，部位特異的変異法またはPCRオリゴヌク
レオチド変異法は，当業者に公知である。例えば,T.マ
ニアティスらを参照されたい。
似体を作ることも望ましい。変異体または類似体は,CD
アーゼをコードする配列部分の欠失，配列の挿入，およ
び／またはこの配列内の１個またはそれ以上の核酸の置
換により，調製され得る。ヌクレオチド配列を修飾する
方法，例えば，部位特異的変異法またはPCRオリゴヌク
レオチド変異法は，当業者に公知である。例えば,T.マ
ニアティスらを参照されたい。
本発明のCDアーゼは，既知のアミノ酸配列または目的
とする遺伝子のDNA配列から得たアミノ酸配列を用いた
固相ペプチド合成法のような化学的合成によっても生産
される。このような方法は，当業者に既知である。
とする遺伝子のDNA配列から得たアミノ酸配列を用いた
固相ペプチド合成法のような化学的合成によっても生産
される。このような方法は，当業者に既知である。
熱安定性CDアーゼは，化学療法剤として用いることが
できる。特に，この酵素は，インビボにおいて，プロド
ラッグである5FCを抗癌剤である5FUに変換し得る。従っ
て,CDアーゼは,5FCと共投与することができる。例え
ば，腫瘍部位または近傍に外科的にCDアーゼを置き,5FC
を経口投与する（例えば,Katsuragiら,1987,が記載して
いる）ことにより共投与することが可能である。上記文
献は，参考文献として，ここに引用する。あるいは，こ
の酵素は，これらの腫瘍に特異的な抗体を用いて腫瘍に
対して,CDアーゼ／抗体複合体を標的移送することによ
り，腫瘍部位へ運ぶことができる。この複合体は，化学
的方法によっても，または，上記のように，適当な免疫
グロブリンとCDアーゼ遺伝子との遺伝子融合物を構築す
ることにより遺伝子操作的にも生産することができる。
できる。特に，この酵素は，インビボにおいて，プロド
ラッグである5FCを抗癌剤である5FUに変換し得る。従っ
て,CDアーゼは,5FCと共投与することができる。例え
ば，腫瘍部位または近傍に外科的にCDアーゼを置き,5FC
を経口投与する（例えば,Katsuragiら,1987,が記載して
いる）ことにより共投与することが可能である。上記文
献は，参考文献として，ここに引用する。あるいは，こ
の酵素は，これらの腫瘍に特異的な抗体を用いて腫瘍に
対して,CDアーゼ／抗体複合体を標的移送することによ
り，腫瘍部位へ運ぶことができる。この複合体は，化学
的方法によっても，または，上記のように，適当な免疫
グロブリンとCDアーゼ遺伝子との遺伝子融合物を構築す
ることにより遺伝子操作的にも生産することができる。
（実施例） 本発明を実施するための特定の実施例を以下に示す。
この実施例は，例示を目的としたものであり，本発明の
範囲を制限することを意図していない。
この実施例は，例示を目的としたものであり，本発明の
範囲を制限することを意図していない。
実施例１ 酵素精製，活性測定，およびCDアーゼ特徴づけ CDアーゼは，以下の方法を用いて，フレイシュマンの
圧搾パン酵母から精製した。精製の全工程は,4℃で行わ
れた。酵素活性は,5′フルオロシトシン（5FC）の3mMリ
ン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を用いて,37℃で測定さ
れた（ニシヤマら,1985）。この文献の開示内容は，す
べて参考文献としてここに含まれている。酵素溶液を加
え，その反応経過を,0.1N HClで消光したアリクォット
について分光光度計でモニターした。255/290の吸光度
比を用いて,5−フルオロウラシル（5FU）の生成量を算
出した。酵素活性の１単位は,37℃において,1分間に１
μmolの5FUが生成される活性と定義される。タンパク濃
度は，ピアース（ロックフォード，イリノイ）から入手
したBCAアッセイを用いて測定された。各精製工程後,SD
S−PAGEを用いてタンパク組成を調べた。
圧搾パン酵母から精製した。精製の全工程は,4℃で行わ
れた。酵素活性は,5′フルオロシトシン（5FC）の3mMリ
ン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を用いて,37℃で測定さ
れた（ニシヤマら,1985）。この文献の開示内容は，す
べて参考文献としてここに含まれている。酵素溶液を加
え，その反応経過を,0.1N HClで消光したアリクォット
について分光光度計でモニターした。255/290の吸光度
比を用いて,5−フルオロウラシル（5FU）の生成量を算
出した。酵素活性の１単位は,37℃において,1分間に１
μmolの5FUが生成される活性と定義される。タンパク濃
度は，ピアース（ロックフォード，イリノイ）から入手
したBCAアッセイを用いて測定された。各精製工程後,SD
S−PAGEを用いてタンパク組成を調べた。
工程1.酵母自己融解物の調整 パン酵母（2.25kg）にエチルアセテート（225ml）を
加え,30分間攪拌した。これに,15％硫酸アンモニウム,5
mM EDTA,および0.1mMジチオスレイトール（DTT）を含有
する50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.2を2.25加えた。
この混合物を３日間攪拌し，固形のトリヒドロキシメチ
ルアミノメタン（Tris）を用いて毎日pH7.2に調整し
た。細胞残屑は,10,000rpm15分間の遠心分離により取り
除いた。
加え,30分間攪拌した。これに,15％硫酸アンモニウム,5
mM EDTA,および0.1mMジチオスレイトール（DTT）を含有
する50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.2を2.25加えた。
この混合物を３日間攪拌し，固形のトリヒドロキシメチ
ルアミノメタン（Tris）を用いて毎日pH7.2に調整し
た。細胞残屑は,10,000rpm15分間の遠心分離により取り
除いた。
工程2.硫酸アンモニウム分画 EDTA（1.8g/）および硫酸アンモニウム（371g/）
を加えて，工程１の上清から，すべてのタンパクを沈澱
させ，そして，硫酸アンモニウムの最終濃度を,70％飽
和とした。この溶液を４℃で約16時間置き，その後沈澱
物を遠心分離で採集した。このペレットを,5mM EDTAお
よび0.1mM DTTを含有する50mMリン酸カリウム緩衝液pH
7.2に溶解させ，この緩衝液に対する透析を約12〜16時
間行なった。
を加えて，工程１の上清から，すべてのタンパクを沈澱
させ，そして，硫酸アンモニウムの最終濃度を,70％飽
和とした。この溶液を４℃で約16時間置き，その後沈澱
物を遠心分離で採集した。このペレットを,5mM EDTAお
よび0.1mM DTTを含有する50mMリン酸カリウム緩衝液pH
7.2に溶解させ，この緩衝液に対する透析を約12〜16時
間行なった。
この透析物にEDTA（1.8g/）を加え,50％飽和となる
よう硫酸アンモニウムを加えた（314g硫酸アンモニウム
／透析物）。１時間後，沈澱物を遠心分離し，さら
に，最終硫酸アンモニウム濃度が73％飽和となるように
硫酸アンモニウムを上清に加えた。沈澱物を採集し,0.1
mM DTTを含有する20mM Tris緩衝液pH8.0の１に溶解さ
せ，この緩衝液を用いて約12〜16時間よく透析した。
よう硫酸アンモニウムを加えた（314g硫酸アンモニウム
／透析物）。１時間後，沈澱物を遠心分離し，さら
に，最終硫酸アンモニウム濃度が73％飽和となるように
硫酸アンモニウムを上清に加えた。沈澱物を採集し,0.1
mM DTTを含有する20mM Tris緩衝液pH8.0の１に溶解さ
せ，この緩衝液を用いて約12〜16時間よく透析した。
工程3.陰イオン交換クロマトグラフィー 工程２の透析物を,0.1mM DTTを含有する20mM Tris緩
衝液pH8.0で平衡化した4.8×25cmQ−セファロース（フ
ァーマシア）カラムに付した。カラムを洗浄後，酵素
を，上記緩衝液中０−0.3M KClの線型勾配によって溶出
した。CDアーゼ活性を有する画分をプールし，限外濾過
（アミコン,PM30フィルター）により約15mlに濃縮し
た。
衝液pH8.0で平衡化した4.8×25cmQ−セファロース（フ
ァーマシア）カラムに付した。カラムを洗浄後，酵素
を，上記緩衝液中０−0.3M KClの線型勾配によって溶出
した。CDアーゼ活性を有する画分をプールし，限外濾過
（アミコン,PM30フィルター）により約15mlに濃縮し
た。
工程4.ゲル浸透クロマトグラフィー 工程３のCDアーゼを含む溶液をＧ−75セファデックス
カラム（2.5×100cm）に付し,0.1mM DTTを含有するPBS
で溶出した。CDアーゼ活性を有する画分をプールし，次
いで,1.8M硫酸アンモニウム,5mM EDTA,0.1mM DTTを含む
100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の４に対し透析し
た。
カラム（2.5×100cm）に付し,0.1mM DTTを含有するPBS
で溶出した。CDアーゼ活性を有する画分をプールし，次
いで,1.8M硫酸アンモニウム,5mM EDTA,0.1mM DTTを含む
100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の４に対し透析し
た。
工程5.疎水性相互作用クロマトグラフィー 工程４の物質を,1.8M硫酸アンモニウム,5mM EDTAおよ
び0.1mM DTTを含有する100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.
0で平衡化した2.5×15cmオクチル−セファロース（ファ
ーマシア）カラムに付した。カラムをこの緩衝液で洗浄
し，酵素を，上記リン酸緩衝液中1.8〜0M硫酸アンモニ
ウムの線型勾配で溶出した。CDアーゼ活性を有する画分
を集めて，限外濾過（アミコン,YM5フィルター）で濃縮
した。
び0.1mM DTTを含有する100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.
0で平衡化した2.5×15cmオクチル−セファロース（ファ
ーマシア）カラムに付した。カラムをこの緩衝液で洗浄
し，酵素を，上記リン酸緩衝液中1.8〜0M硫酸アンモニ
ウムの線型勾配で溶出した。CDアーゼ活性を有する画分
を集めて，限外濾過（アミコン,YM5フィルター）で濃縮
した。
工程6.ゲル浸透クロマトグラフィー 工程５の物質の，溶出液としてPBSを用いたＧ−75セ
ファデックス上の最終的ゲル濾過は，工程４に示したよ
うにして行なわれた。精製酵素は，限外濾過で濃縮さ
れ，−70℃で保存された。
ファデックス上の最終的ゲル濾過は，工程４に示したよ
うにして行なわれた。精製酵素は，限外濾過で濃縮さ
れ，−70℃で保存された。
工程毎の精製結果を，表１に示す。各精製工程毎にタ
ンパク組成を調べるために用いられたSDS−PAGEプロフ
ィールを，第１図に示す。最終酵素調製物は，約17kDa
の大きなバンドと約19kDaの小さなバンドからなる。
ンパク組成を調べるために用いられたSDS−PAGEプロフ
ィールを，第１図に示す。最終酵素調製物は，約17kDa
の大きなバンドと約19kDaの小さなバンドからなる。
CDアーゼの分子量は，この精製酵素をリボヌクレアー
ゼＡ（13.7kDa），キモトリプシノーゲンＡ（25kDa），
卵白アルブミン（43kDa）とともにＧ−50セファデック
スカラムにかけることにより測定された。画分は，総タ
ンパクを測定するために280nmの吸光度をモニターさ
れ，基質として5FCを用いて,CDアーゼ活性をモニターさ
れた。CDアーゼ酵素活性は，約32kDaに中心があった
（第２図Ａ）。この酵素は，キャリブレーションスタン
ダードなしでカラムに付した場合全く同じ容量で溶出し
た（第２図Ｂ）。
ゼＡ（13.7kDa），キモトリプシノーゲンＡ（25kDa），
卵白アルブミン（43kDa）とともにＧ−50セファデック
スカラムにかけることにより測定された。画分は，総タ
ンパクを測定するために280nmの吸光度をモニターさ
れ，基質として5FCを用いて,CDアーゼ活性をモニターさ
れた。CDアーゼ酵素活性は，約32kDaに中心があった
（第２図Ａ）。この酵素は，キャリブレーションスタン
ダードなしでカラムに付した場合全く同じ容量で溶出し
た（第２図Ｂ）。
精製CDアーゼの37℃リン酸緩衝生理食塩水中pH7.2で
の安定性は，基質として5FCを用いて測定された。酵素
活性のゆっくりとした減少が，インキュベーションの延
長と共にみられた（第３図）。これらの条件下では,5.2
日後に酵素活性の半分が失われた。インキュベーション
の最初の４時間では，酵素活性の明らかな低下はなかっ
た。（第３図挿入図）。
の安定性は，基質として5FCを用いて測定された。酵素
活性のゆっくりとした減少が，インキュベーションの延
長と共にみられた（第３図）。これらの条件下では,5.2
日後に酵素活性の半分が失われた。インキュベーション
の最初の４時間では，酵素活性の明らかな低下はなかっ
た。（第３図挿入図）。
実施例２ CDアーゼのアミノ酸配列 CDアーゼの配列解析に用いた試薬は，アプライド バ
イオシステム社から入手した。逆相HPLCに用いた溶媒
は，ブルディックアンドジャクソンから入手した。４−
ビニルピリジンは，アルドリッチケミカル社から,CNBr
はコダックから入手し，他のすべての化学物質は試薬用
であった。黄色ブドウ球菌由来のエンドプロテイナーゼ
Glu−Ｃは，マイルズ ラボラトリーから入手した。Pse
udomanasfragiのエンドプロテイナーゼAsp−Ｎおよびエ
ンドプロテイナーゼLys−Ｃは，ベーリンガーマンハイ
ムから入手した。
イオシステム社から入手した。逆相HPLCに用いた溶媒
は，ブルディックアンドジャクソンから入手した。４−
ビニルピリジンは，アルドリッチケミカル社から,CNBr
はコダックから入手し，他のすべての化学物質は試薬用
であった。黄色ブドウ球菌由来のエンドプロテイナーゼ
Glu−Ｃは，マイルズ ラボラトリーから入手した。Pse
udomanasfragiのエンドプロテイナーゼAsp−Ｎおよびエ
ンドプロテイナーゼLys−Ｃは，ベーリンガーマンハイ
ムから入手した。
自動配列分析は,RUN470−ＬまたはPRO470−Ｌプログ
ラムを用いて，モデル475Aアミノ酸シークエンサー（AB
I）により行なわれた。全部で1.5mgのBio Brene（ABI）
を分析し，試料を分析する前に，エドマン分解を2,3回
行なった。チアゾリノン誘導体の，フェニルチオヒダン
トインアミノ酸への変換は,61℃において,25％TFAを用
いて行なわれた。フェニルチオヒダントインアミノ酸誘
導体は，開始緩衝液として５％（v/v）テトラヒドロフ
ランを含有する酢酸ナトリウム緩衝液を用いたPTHC18カ
ラム（2.1×220mm,ABI）の逆相HPLCにより，そして，制
限緩衝液として500nMジメチルフェニルチオウレア（AB
I）を含有するアセトニトリル緩衝液を用い，モデル120
A PHT分析機（ABI）で分離した。
ラムを用いて，モデル475Aアミノ酸シークエンサー（AB
I）により行なわれた。全部で1.5mgのBio Brene（ABI）
を分析し，試料を分析する前に，エドマン分解を2,3回
行なった。チアゾリノン誘導体の，フェニルチオヒダン
トインアミノ酸への変換は,61℃において,25％TFAを用
いて行なわれた。フェニルチオヒダントインアミノ酸誘
導体は，開始緩衝液として５％（v/v）テトラヒドロフ
ランを含有する酢酸ナトリウム緩衝液を用いたPTHC18カ
ラム（2.1×220mm,ABI）の逆相HPLCにより，そして，制
限緩衝液として500nMジメチルフェニルチオウレア（AB
I）を含有するアセトニトリル緩衝液を用い，モデル120
A PHT分析機（ABI）で分離した。
CDアーゼおよびペプチドを，モデル130A分離システム
（アプライドバイオシステム社）による逆相HPLCを用い
て精製した。分離は,RP−300カラム（2.1×30mm;ABI）
上で40℃において行なった。タンパクおよびペプチドフ
ラグメントの溶出のために,0.1ml/分で２時間に渡る,0.
1％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液中のアセントニトリ
ル０〜60％の線型勾配を用いた。CNBrペプチド，エンド
プロテイナーゼLys−Ｃペプチド，エンドプロテイナー
ゼGlu−C,およびエンドプロテイナーゼAsp−Ｎペプチド
は，それ以上に精製しないで，配列分析に用いた。
（アプライドバイオシステム社）による逆相HPLCを用い
て精製した。分離は,RP−300カラム（2.1×30mm;ABI）
上で40℃において行なった。タンパクおよびペプチドフ
ラグメントの溶出のために,0.1ml/分で２時間に渡る,0.
1％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液中のアセントニトリ
ル０〜60％の線型勾配を用いた。CNBrペプチド，エンド
プロテイナーゼLys−Ｃペプチド，エンドプロテイナー
ゼGlu−C,およびエンドプロテイナーゼAsp−Ｎペプチド
は，それ以上に精製しないで，配列分析に用いた。
CDアーゼの４−ビニルピリジンとの反応 実施例１の工程６から得たCDアーゼを，以下の方法に
従い,4−ビニルピリジンを加えることにりよ変性させ
た。CDアーゼを,6Mグアニジン−HCl,0.1％Na2EDTAを含
有する0.4M Tris−HCl緩衝液pH8.5の0.1ml中の20mMジチ
オスレイトールにより,50℃で２時間還元した後,100mM
の４−ビニルピリジンで室温にて一晩反応させた。この
反応混合液を,20％TFAを用いてpH2.0に酸性化し，上記
の逆相HPLCにより，脱塩および精製を行った。
従い,4−ビニルピリジンを加えることにりよ変性させ
た。CDアーゼを,6Mグアニジン−HCl,0.1％Na2EDTAを含
有する0.4M Tris−HCl緩衝液pH8.5の0.1ml中の20mMジチ
オスレイトールにより,50℃で２時間還元した後,100mM
の４−ビニルピリジンで室温にて一晩反応させた。この
反応混合液を,20％TFAを用いてpH2.0に酸性化し，上記
の逆相HPLCにより，脱塩および精製を行った。
得られた産物のHPLC分析により,2つの異なるピークが
認められ（第４図），これらはSDS−PAGEにより分離さ
れ，再度分析された（第５図）。小さい方ピーク（プー
ルＡ）は，第１図の19kDaのバンドに対応し，大きい方
のピークは,17kDaのバンドに対応した。
認められ（第４図），これらはSDS−PAGEにより分離さ
れ，再度分析された（第５図）。小さい方ピーク（プー
ルＡ）は，第１図の19kDaのバンドに対応し，大きい方
のピークは,17kDaのバンドに対応した。
アミノ酸フェニルチオヒダントイン誘導体の同定法に
より，プールＡ（第４図）のタンパクのアミノ末端アミ
ノ酸配列が,27残基まで得られた。この配列は，パン酵
母スーパーオキサイドジスムターゼ（ECl.15.1.1,スタ
インマン,1980）のＮ末端配列と同一であることが見出
された。このことは，精製CDアーゼのゲル中でみられた
小さなバンド（第１図，第５図）の同一性を立証した。
より，プールＡ（第４図）のタンパクのアミノ末端アミ
ノ酸配列が,27残基まで得られた。この配列は，パン酵
母スーパーオキサイドジスムターゼ（ECl.15.1.1,スタ
インマン,1980）のＮ末端配列と同一であることが見出
された。このことは，精製CDアーゼのゲル中でみられた
小さなバンド（第１図，第５図）の同一性を立証した。
第４図の大きなピーク（プールＢ）のエドマン分解か
らアミノ酸配列を得ることができなかったことから,CD
アーゼのアミノ末端がブロックされていることが示唆さ
れる。そのため,CDアーゼの部分的アミノ酸配列を，以
下に示す通り，酵素的にあるいは臭化シアノゲン分解に
よる選択されたフラグメントの配列解析により得た。
らアミノ酸配列を得ることができなかったことから,CD
アーゼのアミノ末端がブロックされていることが示唆さ
れる。そのため,CDアーゼの部分的アミノ酸配列を，以
下に示す通り，酵素的にあるいは臭化シアノゲン分解に
よる選択されたフラグメントの配列解析により得た。
CDアーゼの酵素的および化学的分解 ４−ビニルピリジンで変性されたCDアーゼのエンドプ
ロティナーゼLys−ＣおよびエンドフロティナーゼGlu−
Ｃによる分解を,0.1M Tris酢酸緩衝液（pH8.0）40μ
中37℃で約12〜16時間行った。酵素／基質比は，それぞ
れ1:10（wt/wt）であった。エンドプロティナーゼAsp−
Ｎ分解は，酵素／基質比1:100,37℃，約12〜16時間で同
様の方法で行われた。酵素的消化物は,20％TFAでpH2.0
に酸性化され，逆相HPLCで分離された。
ロティナーゼLys−ＣおよびエンドフロティナーゼGlu−
Ｃによる分解を,0.1M Tris酢酸緩衝液（pH8.0）40μ
中37℃で約12〜16時間行った。酵素／基質比は，それぞ
れ1:10（wt/wt）であった。エンドプロティナーゼAsp−
Ｎ分解は，酵素／基質比1:100,37℃，約12〜16時間で同
様の方法で行われた。酵素的消化物は,20％TFAでpH2.0
に酸性化され，逆相HPLCで分離された。
臭化シアノゲン（CNBr）は,CDアーゼをメチオニン残
基で切断するために用いた。４−ビニルピリジンで変性
されたCDアーゼ（2.25nmol）は,70％ギ酸40μで再構
成され,200倍モルを越えるCNBrを含有する70％ギ酸を加
えた。反応を,35℃で２時間進行させた後，室温で約12
〜16時間行った。この消化物を水で希釈し，減圧乾燥に
より過剰のCNBrを取り除いた。逆相HPLC分析のための溶
液は,1％TFA中で調製された。
基で切断するために用いた。４−ビニルピリジンで変性
されたCDアーゼ（2.25nmol）は,70％ギ酸40μで再構
成され,200倍モルを越えるCNBrを含有する70％ギ酸を加
えた。反応を,35℃で２時間進行させた後，室温で約12
〜16時間行った。この消化物を水で希釈し，減圧乾燥に
より過剰のCNBrを取り除いた。逆相HPLC分析のための溶
液は,1％TFA中で調製された。
第６図に，臭化シアノゲン分解，およびエンドプロテ
ィナーゼGlu−C,エンドプロティナーゼLys−Ｃおよびエ
ンドプロティナーゼAsp−Ｎの酵素を用いたタンパク分
解から得られたフラグメントに基づいた,CDアーゼの部
分的アミノ酸配列を示す。154個にわたるアミノ酸が，
このタンパクの大部分を含有することが確認された。ア
ミノ酸残基の番号付けは，未だ同定されていないアミノ
末端付近のアミノ酸を含んでいない。この部分的CDアー
ゼ配列を，マウスのアデノシンデアミナーゼ（ユング
ら,1985）およびパン酵母dCMPデアミナーゼ（マッキン
トッシュとハイネス,1986）を含む他の既知の配列と比
較すると，本質的な相同性はみられなかった。
ィナーゼGlu−C,エンドプロティナーゼLys−Ｃおよびエ
ンドプロティナーゼAsp−Ｎの酵素を用いたタンパク分
解から得られたフラグメントに基づいた,CDアーゼの部
分的アミノ酸配列を示す。154個にわたるアミノ酸が，
このタンパクの大部分を含有することが確認された。ア
ミノ酸残基の番号付けは，未だ同定されていないアミノ
末端付近のアミノ酸を含んでいない。この部分的CDアー
ゼ配列を，マウスのアデノシンデアミナーゼ（ユング
ら,1985）およびパン酵母dCMPデアミナーゼ（マッキン
トッシュとハイネス,1986）を含む他の既知の配列と比
較すると，本質的な相同性はみられなかった。
実施例３ CDアーゼ遺伝子のクローニングと発現 CDアーゼをコードする遺伝子をS.cerevisiae（パン酵
母）の実験室株から単離し，以下の方法を用いて，哺乳
類細胞系で発現させた。
母）の実験室株から単離し，以下の方法を用いて，哺乳
類細胞系で発現させた。
工程1:PCRを用いたCDアーゼ特異的プローブの作製 オリゴヌクレオチドプライマーは，部分的アミノ酸配
列と,DNA配列の「ゲスマー（guessmer）」セグメントを
設計するガイドとしてS.cerevisiae（グスリーとアベル
ソン,1982）由来のコドン使用パターンを用い，自動DNA
合成装置により合成された。これらのオリゴヌクレオチ
ドは,PCRのプライマーとして用いられ，クローニングし
た酵母ゲノムライブラリーDNAが鋳型として存在した。
列と,DNA配列の「ゲスマー（guessmer）」セグメントを
設計するガイドとしてS.cerevisiae（グスリーとアベル
ソン,1982）由来のコドン使用パターンを用い，自動DNA
合成装置により合成された。これらのオリゴヌクレオチ
ドは,PCRのプライマーとして用いられ，クローニングし
た酵母ゲノムライブラリーDNAが鋳型として存在した。
CDA4R1およびCDA5ASと呼ばれるプライマーは，共に33
ヌクレオチド配列を含む42量体であり，それぞれCDアー
ゼのセンス鎖およびアンチセンス鎖に対応する。各オリ
ゴヌクレオチドの残基は,EcoR Iの制限酵素切断部位を
コードした。この２つのプライマーを配列を，第７図に
示す。
ヌクレオチド配列を含む42量体であり，それぞれCDアー
ゼのセンス鎖およびアンチセンス鎖に対応する。各オリ
ゴヌクレオチドの残基は,EcoR Iの制限酵素切断部位を
コードした。この２つのプライマーを配列を，第７図に
示す。
両プライマーは,1回の反応あたり50または100pmol存
在した。PCR反応の鋳型DNAとして用いた２つの遺伝子ラ
イブラリーは,Sau3Aの部分的制限酵素分解の後,CV13ま
たはYCp50シャトルベクターのいずれかのBamH I部位へ
導入することによって酵母ゲノムDNAから構築された。
これら２つのベクターおよびそのゲノムライブラリー
は，一般的に当該技術分野で入手可能であり，ワシント
ン大学の遺伝子学部から入手した。両ライブラリーは，
既に細菌ホストに形質転換されたものを入手した。ライ
ブラリーDNAは，アルカリ溶解プラスミド調製法により
単離され，セシウムクライド−エチジウムブロマイド密
度勾配の遠心分離によりその後精製された。PCR反応は,
CsCl精製の酵母由来CV13またはYCp50ゲノムライブラリ
ーDNA1μg,各プライマー50または100pmol,10×PCR反応
緩衝液（ストラタジーン）の1/10容量,1.25mM dNTP（A,
G,T,C）の16/100容量,PCR用蒸留水，およびTaq DNAポリ
メラーゼ0.5μ（5U/μストラタジーン）を用いて調
製され，最終容量100μとされた。反応は，滅菌した
微量遠沈管内にて，蒸発を防ぐための75μの精製鉱油
層の下で行われた。PCR反応を，パーキン−エルマーシ
ータス温度周期反応器の中で，以下の温度変化を包含す
る30周期プラグラムにおいて進行させた。すなわち，変
性のために94℃30秒間，アニーリングのために55℃の45
秒間，伸展させるために72℃を1.5分間（90秒間）の工
程周期である。
在した。PCR反応の鋳型DNAとして用いた２つの遺伝子ラ
イブラリーは,Sau3Aの部分的制限酵素分解の後,CV13ま
たはYCp50シャトルベクターのいずれかのBamH I部位へ
導入することによって酵母ゲノムDNAから構築された。
これら２つのベクターおよびそのゲノムライブラリー
は，一般的に当該技術分野で入手可能であり，ワシント
ン大学の遺伝子学部から入手した。両ライブラリーは，
既に細菌ホストに形質転換されたものを入手した。ライ
ブラリーDNAは，アルカリ溶解プラスミド調製法により
単離され，セシウムクライド−エチジウムブロマイド密
度勾配の遠心分離によりその後精製された。PCR反応は,
CsCl精製の酵母由来CV13またはYCp50ゲノムライブラリ
ーDNA1μg,各プライマー50または100pmol,10×PCR反応
緩衝液（ストラタジーン）の1/10容量,1.25mM dNTP（A,
G,T,C）の16/100容量,PCR用蒸留水，およびTaq DNAポリ
メラーゼ0.5μ（5U/μストラタジーン）を用いて調
製され，最終容量100μとされた。反応は，滅菌した
微量遠沈管内にて，蒸発を防ぐための75μの精製鉱油
層の下で行われた。PCR反応を，パーキン−エルマーシ
ータス温度周期反応器の中で，以下の温度変化を包含す
る30周期プラグラムにおいて進行させた。すなわち，変
性のために94℃30秒間，アニーリングのために55℃の45
秒間，伸展させるために72℃を1.5分間（90秒間）の工
程周期である。
PCR反応液の一部をアガロースゲルで分析し,CDアーゼ
のほとんどをコードする，予想された350塩基対フラグ
メントを確認した。350塩基対フラグメントは，次に，
予備的アガロースゲル電気泳動の後に，プライマーと，
調製物と異なるフラグメントとを除くために，ジーンク
リーンキット（BIO101）のプロトコルおよび試薬を用い
て溶出することにより精製された。
のほとんどをコードする，予想された350塩基対フラグ
メントを確認した。350塩基対フラグメントは，次に，
予備的アガロースゲル電気泳動の後に，プライマーと，
調製物と異なるフラグメントとを除くために，ジーンク
リーンキット（BIO101）のプロトコルおよび試薬を用い
て溶出することにより精製された。
工程2:配列決定のためのPCRフラグメントのサブクロー
ニング 工程１によるPCRプライマーは，作製したフラグメン
トのすべてのクローニングを促進するために,EcoR I制
限部位の５′末端を操作した。PCRによるフラグメント
の精製350塩基対の一部は，制限酵素EcoR Iで消化し,Ec
oR I切断したファージシドベクターpBSII−SK+（ストラ
タジーン）に連結した。制限酵素は，ベリーンガーマン
ハイムバイオケミカルズ（BMB）から入手した。消化に
は,37℃で２時間インキュベートし，続いてフェノー
ル：クロロホルム：イソアミルアルコールの等量混合液
で抽出後，エタノール沈澱を行った。フラグメントを，
再度TE（10mM Tris−HCl,pH8.0,1mM EDTA pH8.0）に懸
濁し,T4 DNAリガーゼ（BMB）を用いてともに連結した。
コンピテントJM109細菌は，結合反応の1/5を形質転換
し，その適当な希釈液を,XGal（ジメチルホルノアミド
中の２％保存液（50μＭ）およびIPTG（100mM保存液の1
0μ）を補足したLB＋アンピシリン（100μg/ml）プレ
ートにプレート化した。白色コロニーを取り出し，サム
ブルックら（1989）に示されたプロトコルに従って，小
規模プラスミド調製を行った。プラスミドは,EcoR Iで
消化することにより,350塩基対挿入物についてスクリー
ニングされた。いくつかの異なる単離物を取り出し，プ
ラスミドDNAを単離精製し，さらにDNA配列分析に付し
た。
ニング 工程１によるPCRプライマーは，作製したフラグメン
トのすべてのクローニングを促進するために,EcoR I制
限部位の５′末端を操作した。PCRによるフラグメント
の精製350塩基対の一部は，制限酵素EcoR Iで消化し,Ec
oR I切断したファージシドベクターpBSII−SK+（ストラ
タジーン）に連結した。制限酵素は，ベリーンガーマン
ハイムバイオケミカルズ（BMB）から入手した。消化に
は,37℃で２時間インキュベートし，続いてフェノー
ル：クロロホルム：イソアミルアルコールの等量混合液
で抽出後，エタノール沈澱を行った。フラグメントを，
再度TE（10mM Tris−HCl,pH8.0,1mM EDTA pH8.0）に懸
濁し,T4 DNAリガーゼ（BMB）を用いてともに連結した。
コンピテントJM109細菌は，結合反応の1/5を形質転換
し，その適当な希釈液を,XGal（ジメチルホルノアミド
中の２％保存液（50μＭ）およびIPTG（100mM保存液の1
0μ）を補足したLB＋アンピシリン（100μg/ml）プレ
ートにプレート化した。白色コロニーを取り出し，サム
ブルックら（1989）に示されたプロトコルに従って，小
規模プラスミド調製を行った。プラスミドは,EcoR Iで
消化することにより,350塩基対挿入物についてスクリー
ニングされた。いくつかの異なる単離物を取り出し，プ
ラスミドDNAを単離精製し，さらにDNA配列分析に付し
た。
工程3:酵母ゲノムライブラリーのスクリーニングのため
のCDアーゼ特異的プローブとしてのPCRフラグメントの
使用 工程１で得られたPCRフグメントは，遺伝子を含むク
ローンに対してゲノムライブラリーをスクリーニングす
る際に,CDアーゼをコードする配列を検出するためのプ
ローブとしても用いられた。精製フラグメントを，α−
32P−dCTPおよびベーリンガーマンハイムバイオケミカ
ルズ製のプライマーDNA無作為ラベリングキットを用い
て標識した。酵母ライブラリーを,LB＋アンピシリン培
地で一晩増殖させ，その希釈液をLB＋アンピシリン培地
プレート上にプレート化し，プレートあたり250〜2000
コロニーの密度のコロニーを得た。コロニーの取り上げ
は，シュリーシャーアンドシュエル製の0.45μｍニトロ
セルロース円形または正方形フィルターを用いて行っ
た。フィルターは，フィルターのコロニー側を，ファッ
トマン3MM紙の上に乗せ，固定するため10％SDSに６分
間，変性させるために1.5M NaOH,1.5M NaClに５分間，
中和するために0.5M NaCl,0.5M Tris−HCl pH7.4に５
分間浸し，そして,2×SSCに５分間浸した後，スタータ
リンカー（ストラタジーン）を用いて説明書の指示通り
にUV架橋を行って処理された。次に，フィルターを２×
SSCに５分間浸し,5×SSC,0.5％SDS,1mM EDTA中50℃で予
備洗浄を行った。
のCDアーゼ特異的プローブとしてのPCRフラグメントの
使用 工程１で得られたPCRフグメントは，遺伝子を含むク
ローンに対してゲノムライブラリーをスクリーニングす
る際に,CDアーゼをコードする配列を検出するためのプ
ローブとしても用いられた。精製フラグメントを，α−
32P−dCTPおよびベーリンガーマンハイムバイオケミカ
ルズ製のプライマーDNA無作為ラベリングキットを用い
て標識した。酵母ライブラリーを,LB＋アンピシリン培
地で一晩増殖させ，その希釈液をLB＋アンピシリン培地
プレート上にプレート化し，プレートあたり250〜2000
コロニーの密度のコロニーを得た。コロニーの取り上げ
は，シュリーシャーアンドシュエル製の0.45μｍニトロ
セルロース円形または正方形フィルターを用いて行っ
た。フィルターは，フィルターのコロニー側を，ファッ
トマン3MM紙の上に乗せ，固定するため10％SDSに６分
間，変性させるために1.5M NaOH,1.5M NaClに５分間，
中和するために0.5M NaCl,0.5M Tris−HCl pH7.4に５
分間浸し，そして,2×SSCに５分間浸した後，スタータ
リンカー（ストラタジーン）を用いて説明書の指示通り
にUV架橋を行って処理された。次に，フィルターを２×
SSCに５分間浸し,5×SSC,0.5％SDS,1mM EDTA中50℃で予
備洗浄を行った。
プレハイブリダイゼーションは,12フィルター入りの
バッグ毎に20ml溶液が入る，ヒートシール可能なプラス
チックバッグの中で行った。プレハイブリダイゼーショ
ン溶液は50％ホルムアノデヒド,6×SSC,0.01M NaP pH
6.8,1mM EDTA（pH8.0）,0.5％SDS,100μg/mlの変性サケ
精子DNA,および５×デンハート溶液を含有した。プラス
チックバッグを,42℃の水浴中に浸し,12〜16時間インキ
ュベートした。ラベルしたプローブは，プッシュ−カラ
ム（ストラタジーン）からの溶出により，導入されてい
ないヌクレオチドから精製された。プローブを，約106c
pm/ml液体となるように加え，ハイブリダイゼーション
のために42℃で12〜16時間インキュベートした。
バッグ毎に20ml溶液が入る，ヒートシール可能なプラス
チックバッグの中で行った。プレハイブリダイゼーショ
ン溶液は50％ホルムアノデヒド,6×SSC,0.01M NaP pH
6.8,1mM EDTA（pH8.0）,0.5％SDS,100μg/mlの変性サケ
精子DNA,および５×デンハート溶液を含有した。プラス
チックバッグを,42℃の水浴中に浸し,12〜16時間インキ
ュベートした。ラベルしたプローブは，プッシュ−カラ
ム（ストラタジーン）からの溶出により，導入されてい
ないヌクレオチドから精製された。プローブを，約106c
pm/ml液体となるように加え，ハイブリダイゼーション
のために42℃で12〜16時間インキュベートした。
フィルターを，室温で２×SSC,0.1％SDS中で数回洗浄
した後,55℃で１時間１×SSC,0.1％SDS中で洗浄した。
フィルターを風乾し，サランラップで包み，−70℃で一
晩，強化スクリーンと共に,X線フィルムにさらした。オ
ートラジオグラフは，ハイブリダイゼーションの陽性信
号を示すクローンを選別するために，フィルターとマス
タープレートとを並べて行った。陽性クローンは，プラ
スミドを単離するまでに，上記方法で２回以上再スクリ
ーニングされた。プラスミドDNAは，クロラムフェニコ
ール増幅されたLB＋アンピシリン培養物500mlの増殖に
より単離され，その後，サムブルックら（1989年）の示
したアルカリ溶解法を用いて精製された。セシウムクロ
ライドエチジウムブロマイド平衡遠心分離により精製さ
れるプラスミドもあるが，その他は,PZ253カラム（５′
→３′）から溶出された後，ポリエチレングリコール沈
澱，フェノール：クロロホルム抽出，そしてエタノール
沈澱が行われた。
した後,55℃で１時間１×SSC,0.1％SDS中で洗浄した。
フィルターを風乾し，サランラップで包み，−70℃で一
晩，強化スクリーンと共に,X線フィルムにさらした。オ
ートラジオグラフは，ハイブリダイゼーションの陽性信
号を示すクローンを選別するために，フィルターとマス
タープレートとを並べて行った。陽性クローンは，プラ
スミドを単離するまでに，上記方法で２回以上再スクリ
ーニングされた。プラスミドDNAは，クロラムフェニコ
ール増幅されたLB＋アンピシリン培養物500mlの増殖に
より単離され，その後，サムブルックら（1989年）の示
したアルカリ溶解法を用いて精製された。セシウムクロ
ライドエチジウムブロマイド平衡遠心分離により精製さ
れるプラスミドもあるが，その他は,PZ253カラム（５′
→３′）から溶出された後，ポリエチレングリコール沈
澱，フェノール：クロロホルム抽出，そしてエタノール
沈澱が行われた。
工程4:PCR由来で，ゲノムCDアーゼをコードするクロー
ンの配列決定 オリゴヌクレオチド18量子体のいくつかを，合成する
か，あるいは,PCRとゲノムCDアーゼクローン由来のDNA
の配列決定のために用いた。一部のプライマーは，コー
ド鎖から配列を作製し，その他は，相補的DNA鎖から配
列を得た。配列決定反応は，シークエナーゼバージョン
2.0キット（ユナイテッドステイツバイオケミカル）が
提供するプロトコルと試薬に従って行った。DNAは，配
列決定反応の前に,0.2N NaOH中でアルカリ変性により変
性された。ラベルした反応混合液の希釈と，反応時間
は，目的とする配列の領域に依存して変化された。大部
分の反応は,1つの反応当り１〜1.5pmolの鋳型DNAとプラ
イマーを,10〜15μCiのα−35S−dATPと共に用いた。試
料を８％ポリアクリルアミド−尿素シークエンシングゲ
ルに担持し，解析されるべき配列に応じて,1〜７時間実
施した。ゲルを,10％メタノール,10％酢酸にて30分間固
定させ，減圧ポンプに接続したスラブ−ゲル乾燥器を用
いて,80℃45分間乾燥させた。乾燥したゲルを，室温で1
8〜72時間コダックXAR−５フィルムにさらした。配列
は，手動で読まれた。配列データの整合と分析は，ジー
ンプロソフト（リバーサイドサイエンティフィック，シ
アトル，ワシントン州）を用いたコンピュータにより行
われた。第８図は，ゲノムCDアーゼをコードするクロー
ンの核酸配列を示す。第10図は，予測されるアミノ酸配
列を示す。図に見られるように，コード配列は，約474
塩基対からなり,158アミノ酸のタンパクを特定する。そ
のため,CDアーゼの予測される分子量は，約17,506ダル
トンとなる。
ンの配列決定 オリゴヌクレオチド18量子体のいくつかを，合成する
か，あるいは,PCRとゲノムCDアーゼクローン由来のDNA
の配列決定のために用いた。一部のプライマーは，コー
ド鎖から配列を作製し，その他は，相補的DNA鎖から配
列を得た。配列決定反応は，シークエナーゼバージョン
2.0キット（ユナイテッドステイツバイオケミカル）が
提供するプロトコルと試薬に従って行った。DNAは，配
列決定反応の前に,0.2N NaOH中でアルカリ変性により変
性された。ラベルした反応混合液の希釈と，反応時間
は，目的とする配列の領域に依存して変化された。大部
分の反応は,1つの反応当り１〜1.5pmolの鋳型DNAとプラ
イマーを,10〜15μCiのα−35S−dATPと共に用いた。試
料を８％ポリアクリルアミド−尿素シークエンシングゲ
ルに担持し，解析されるべき配列に応じて,1〜７時間実
施した。ゲルを,10％メタノール,10％酢酸にて30分間固
定させ，減圧ポンプに接続したスラブ−ゲル乾燥器を用
いて,80℃45分間乾燥させた。乾燥したゲルを，室温で1
8〜72時間コダックXAR−５フィルムにさらした。配列
は，手動で読まれた。配列データの整合と分析は，ジー
ンプロソフト（リバーサイドサイエンティフィック，シ
アトル，ワシントン州）を用いたコンピュータにより行
われた。第８図は，ゲノムCDアーゼをコードするクロー
ンの核酸配列を示す。第10図は，予測されるアミノ酸配
列を示す。図に見られるように，コード配列は，約474
塩基対からなり,158アミノ酸のタンパクを特定する。そ
のため,CDアーゼの予測される分子量は，約17,506ダル
トンとなる。
工程5:酵母および哺乳類系における発現のためのCDアー
ゼをコードするカセットの構築 工程４で得られたDNA配列を用いて,CDアーゼをコード
するPCRで作製されたカセットのためのオリゴヌクレオ
チドプライマーを設計した。これらのオリゴヌクレオチ
ドの一部は，分泌シグナルペプチドおよびクローニング
または発現において用いられる制限酵素切断部位等の追
加配列を有していた。オリゴヌクレオチドプライマー
は，適当な配列を末端に追加してPCRフラグメントを作
製するために,2つひと組で用いられた。
ゼをコードするカセットの構築 工程４で得られたDNA配列を用いて,CDアーゼをコード
するPCRで作製されたカセットのためのオリゴヌクレオ
チドプライマーを設計した。これらのオリゴヌクレオチ
ドの一部は，分泌シグナルペプチドおよびクローニング
または発現において用いられる制限酵素切断部位等の追
加配列を有していた。オリゴヌクレオチドプライマー
は，適当な配列を末端に追加してPCRフラグメントを作
製するために,2つひと組で用いられた。
特に,CDアーゼをコードするカセットは,CDアーゼ特異
的配列とクローニングのための制限酵素切断部位をコー
ドする追加配列の両方を含む２つのプライマーを用い
て,PCRにより構築された。５′プライマーは,45塩基の
相同配列を含む65量体であり，制限酵素Hind III,Sal
I,およびNco Iの切断部位を含む５′末端に結合した。C
Dアーゼのゲノムコピーの５′末端とは完全に同一では
なかった。３′プライマーは,39量子体で,5′末端にXba
I末端が結合した,CDアーゼのＣ末端のアンチセンス鎖
と同一であった。用いられた鋳型は,1反応あたり約1ng
のCDアーゼのゲノムクローンであった。各プライマー
は,75pmol濃度存在した。PCR反応は，工程１に示すよう
に行われた。
的配列とクローニングのための制限酵素切断部位をコー
ドする追加配列の両方を含む２つのプライマーを用い
て,PCRにより構築された。５′プライマーは,45塩基の
相同配列を含む65量体であり，制限酵素Hind III,Sal
I,およびNco Iの切断部位を含む５′末端に結合した。C
Dアーゼのゲノムコピーの５′末端とは完全に同一では
なかった。３′プライマーは,39量子体で,5′末端にXba
I末端が結合した,CDアーゼのＣ末端のアンチセンス鎖
と同一であった。用いられた鋳型は,1反応あたり約1ng
のCDアーゼのゲノムクローンであった。各プライマー
は,75pmol濃度存在した。PCR反応は，工程１に示すよう
に行われた。
PCR反応産物は，クロロホルムによる抽出およびエタ
ノール沈澱により精製された。その後DNAは，制限酵素H
ind IIiおよびXba Iにより消化され，ゲル電気泳動にか
けられ，ジーンクリーン（BIO101）を説明書に従って用
いて溶出することにより精製された。
ノール沈澱により精製された。その後DNAは，制限酵素H
ind IIiおよびXba Iにより消化され，ゲル電気泳動にか
けられ，ジーンクリーン（BIO101）を説明書に従って用
いて溶出することにより精製された。
工程6:哺乳類系におけるCDアーゼの発現 工程５で精製されたフラグメントを,Hind III−Xba I
で消化したCDM8またはpH3Mプラスミドベクターに連結
し，宿主細菌であるM1061の中に形質転換させた（アル
フォおよびシード,1987）。pH3Mベクターの遺伝子地図
を第12図に示す。その構造を確認するために,20の形質
転換体を取り出し，プラスミド調製物の小規模アルカリ
溶解を行い，その一部をHind III＋Xba Iで消化した。
３つの調製物のうち残るプラスミドは,DEAE−デキスト
ラントランスフェクション法（アウスベルら編，分子生
物学の最新プロトコル）により,COS細胞のトランスフェ
クションに用いた。
で消化したCDM8またはpH3Mプラスミドベクターに連結
し，宿主細菌であるM1061の中に形質転換させた（アル
フォおよびシード,1987）。pH3Mベクターの遺伝子地図
を第12図に示す。その構造を確認するために,20の形質
転換体を取り出し，プラスミド調製物の小規模アルカリ
溶解を行い，その一部をHind III＋Xba Iで消化した。
３つの調製物のうち残るプラスミドは,DEAE−デキスト
ラントランスフェクション法（アウスベルら編，分子生
物学の最新プロトコル）により,COS細胞のトランスフェ
クションに用いた。
簡潔に説明すると,3.5×105COS細胞をDMEM/10％ウシ
胎仔血清（FBS）の6cm培養皿にプレート化し,6％CO2中3
7℃で一晩インキュベートした。この小調製物から得たD
NAには最終容量が100μとなるように,PBSおよび50mg/
mlDEAE−デキストランを，以下に示した量で加えた。
胎仔血清（FBS）の6cm培養皿にプレート化し,6％CO2中3
7℃で一晩インキュベートした。この小調製物から得たD
NAには最終容量が100μとなるように,PBSおよび50mg/
mlDEAE−デキストランを，以下に示した量で加えた。
各トランスフェクションは,2試料ずつ行われた。１日
経た培養培地を，培養皿から吸引し,1回の洗浄あたり2m
lのPBSで，細胞を３回洗浄したDMEM−クロロキントラン
スフェクション培地を,1.7ml/プレート加え,DNAカクテ
ルを培地中に滴下した。トンランスフェクショは,3時間
インキュベートし，培地を取り除き，細胞にFBSM10％DM
SOで２分間ショックを与えた後，血清を含まない培地で
３回洗浄し,1プレートあたり3.5mlのDMEM/10％PBS中で
３日間インキュベートした。
経た培養培地を，培養皿から吸引し,1回の洗浄あたり2m
lのPBSで，細胞を３回洗浄したDMEM−クロロキントラン
スフェクション培地を,1.7ml/プレート加え,DNAカクテ
ルを培地中に滴下した。トンランスフェクショは,3時間
インキュベートし，培地を取り除き，細胞にFBSM10％DM
SOで２分間ショックを与えた後，血清を含まない培地で
３回洗浄し,1プレートあたり3.5mlのDMEM/10％PBS中で
３日間インキュベートした。
工程7:組換え体発現産物の特徴付け 1.ラジオイムノ沈降反応 ラジオイムノ沈降反応（RIPS）に用いる工程６で得ら
れたプレートは200μCi/ml35S−メチオニンを含む用時
調製したDMEM/10％FBS中で約12〜16時間インキュベート
した。
れたプレートは200μCi/ml35S−メチオニンを含む用時
調製したDMEM/10％FBS中で約12〜16時間インキュベート
した。
RIPSは,37℃約12〜16時間のインキュベーションの
後，ラベルした培地を吸引し，各培養皿に１％OG−PORI
PAE緩衝液（50mM Na2HPO4,1％デオキシコール酸ナトリ
ウム,1％トリトンＸ−100,0.1％SDS,150mM NaCl,5mM ED
TA,5mM EGTA,2mM PMSF,および１μg/mlアプロチニン＝
１％オクトグルコシドを加えたPO4−RIPAE）を加え，氷
冷中で10分間インキュベートした。分解物を10mlオーク
リッジ遠沈管に写し,40,000rpm,4℃で40分間遠心分離し
た上清を氷冷下２本の微量遠沈管に移した（0.4ml/チュ
ーブ）。BB1トランスフェクタントは,2μｇの抗体と共
にインキュベートしたが，他のトランスフェクタントに
は,17.5μまたは31.5μｇのウサギ抗CDアーゼポリク
ローナル抗血清を加えた。RIPSを，氷冷下１時間インキ
ュベートした。BB1チューブには２番目の抗体としてヒ
ツジ抗マウス抗体を加え，氷冷下20分間インキュベート
した。
後，ラベルした培地を吸引し，各培養皿に１％OG−PORI
PAE緩衝液（50mM Na2HPO4,1％デオキシコール酸ナトリ
ウム,1％トリトンＸ−100,0.1％SDS,150mM NaCl,5mM ED
TA,5mM EGTA,2mM PMSF,および１μg/mlアプロチニン＝
１％オクトグルコシドを加えたPO4−RIPAE）を加え，氷
冷中で10分間インキュベートした。分解物を10mlオーク
リッジ遠沈管に写し,40,000rpm,4℃で40分間遠心分離し
た上清を氷冷下２本の微量遠沈管に移した（0.4ml/チュ
ーブ）。BB1トランスフェクタントは,2μｇの抗体と共
にインキュベートしたが，他のトランスフェクタントに
は,17.5μまたは31.5μｇのウサギ抗CDアーゼポリク
ローナル抗血清を加えた。RIPSを，氷冷下１時間インキ
ュベートした。BB1チューブには２番目の抗体としてヒ
ツジ抗マウス抗体を加え，氷冷下20分間インキュベート
した。
黄色ブドウ球菌（カルビオケム）を,0.5％NP−40/TES
緩衝液（700μ）で洗浄後,0.05％NP−40/TES緩衝液で
洗浄し，最終的には1mg/ml卵白アルブミンを含むPO4−R
IPAE緩衝液（TES,即ち50mM Tris−HCl,pH7.4,1mMEDTA,1
50mM NaCl）に再度懸濁した。洗浄した黄色ブドウ球菌
の50μをRIP物質に加え，氷冷下10分間インキュベー
トした。RIPSは，微量遠沈管内でペレット化され,0.5ml
TNEN（20mM Tris−HCl pH8.0,100mM NaCl,1mM EDTA,0.5
％ NP−40）で３回洗浄された。元の400μの２試料か
ら得た最終ペレットは,35μ還元または35μ非還元S
DS−PAGE用緩衝液に再度懸濁させた。試料をバイオ−ラ
ッドの低分子量タンパクマーカーとともに10−20％SDS
−PAGE勾配ゲルに担持させ,300ボルト約２時間の電気泳
動を行った。ゲルは，クマシーブルーで１時間染色し,1
0％メタノール,5％酢酸で約12〜16時間脱色し,30分間発
色を強めるためにさらした後，水で３回洗浄し,60℃で
１時間乾燥した。ゲルを４時間Ｘ線フィルムにさらす
と，擬似対照に17,000ダルトンのバンドが認められ,BB1
試料では,17,000ダルトンのバンドは認められなかった
が,45,000ダルトン付近に特異的なバンドがみられた。
３つのトランスフェクタントにはすべて，約17,000ダル
トンに特異的なバンドが認められた。
緩衝液（700μ）で洗浄後,0.05％NP−40/TES緩衝液で
洗浄し，最終的には1mg/ml卵白アルブミンを含むPO4−R
IPAE緩衝液（TES,即ち50mM Tris−HCl,pH7.4,1mMEDTA,1
50mM NaCl）に再度懸濁した。洗浄した黄色ブドウ球菌
の50μをRIP物質に加え，氷冷下10分間インキュベー
トした。RIPSは，微量遠沈管内でペレット化され,0.5ml
TNEN（20mM Tris−HCl pH8.0,100mM NaCl,1mM EDTA,0.5
％ NP−40）で３回洗浄された。元の400μの２試料か
ら得た最終ペレットは,35μ還元または35μ非還元S
DS−PAGE用緩衝液に再度懸濁させた。試料をバイオ−ラ
ッドの低分子量タンパクマーカーとともに10−20％SDS
−PAGE勾配ゲルに担持させ,300ボルト約２時間の電気泳
動を行った。ゲルは，クマシーブルーで１時間染色し,1
0％メタノール,5％酢酸で約12〜16時間脱色し,30分間発
色を強めるためにさらした後，水で３回洗浄し,60℃で
１時間乾燥した。ゲルを４時間Ｘ線フィルムにさらす
と，擬似対照に17,000ダルトンのバンドが認められ,BB1
試料では,17,000ダルトンのバンドは認められなかった
が,45,000ダルトン付近に特異的なバンドがみられた。
３つのトランスフェクタントにはすべて，約17,000ダル
トンに特異的なバンドが認められた。
2.ウェスタン分析： 工程６でえられた２重のトランスフェクションプレー
トは，ラベルしないままにしておき,3日間のインキュベ
ーション後に回収した。培地を吸引して捨て，細胞をPB
Sで洗浄した後,1μg/mlアプロチニンおよび30μg/mlPMS
Fを含む10mMTris−HCl（pH8.0）0.5ml中に懸濁した。細
胞は，滅菌スクレーパを用いて培養皿から取り除き，氷
冷下で滅菌微量遠沈管に移した。各懸濁液を，氷冷下２
〜15秒間最強で超音波処理した。この分解物を氷冷微量
遠沈管で20分間遠心分離することにより細胞残渣を取り
除き，上清を新しいチューブに移した。酵素アッセイ
は，以下の通りに行った。
トは，ラベルしないままにしておき,3日間のインキュベ
ーション後に回収した。培地を吸引して捨て，細胞をPB
Sで洗浄した後,1μg/mlアプロチニンおよび30μg/mlPMS
Fを含む10mMTris−HCl（pH8.0）0.5ml中に懸濁した。細
胞は，滅菌スクレーパを用いて培養皿から取り除き，氷
冷下で滅菌微量遠沈管に移した。各懸濁液を，氷冷下２
〜15秒間最強で超音波処理した。この分解物を氷冷微量
遠沈管で20分間遠心分離することにより細胞残渣を取り
除き，上清を新しいチューブに移した。酵素アッセイ
は，以下の通りに行った。
これらの分解物の一部を，精製CDアーゼに対して生じ
たポリクローナルウサギ抗血清を用いたウェスタンブロ
ットにも用いた。希釈していないトランスフェクタント
分解物の25μを,RIPSに示したようにSDS−PAGE電気泳
動に付した。ただし，濃度標準として，精製CDアーゼ酵
素の一連の希釈物をゲルに担持させた。500ng/レーンの
濃縮したCDアーゼは,100ng,20ng,4ng,0.8ng/レーンと５
倍ずつ希釈された。その後このゲルを,CSHクローニング
マニュアル（サムブルックら,1989）のプロトコルに従
って，ニトロセルロールフィルターに電気ブロットし
た。
たポリクローナルウサギ抗血清を用いたウェスタンブロ
ットにも用いた。希釈していないトランスフェクタント
分解物の25μを,RIPSに示したようにSDS−PAGE電気泳
動に付した。ただし，濃度標準として，精製CDアーゼ酵
素の一連の希釈物をゲルに担持させた。500ng/レーンの
濃縮したCDアーゼは,100ng,20ng,4ng,0.8ng/レーンと５
倍ずつ希釈された。その後このゲルを,CSHクローニング
マニュアル（サムブルックら,1989）のプロトコルに従
って，ニトロセルロールフィルターに電気ブロットし
た。
ブロットは，ブロットー（Blotto,すなわちPBS＋１％
脱脂乳＋0.5％NP−40）中１時間でブロックされた。2.5
μg/mlポリクローナルウサギ抗CDアーゼ血清を含む用時
調製したブロットーを，このフィルターに加え，室温で
１時間インキュベートした。フィルターは，ブロットー
中で５分間３回洗浄した後，アルカリホスファターゼ接
合体（ベーリンガーマンハイムバイオケミカル）を1:10
00でブロットー中に希釈したものの中でインキュベート
した。過剰な抗体接合体をブロットー中で３回洗浄する
ことにより取り除き，最後にアルカリホスファターゼ基
質緩衝液（100mM Tris−HCl pH9.5,100mM NaCl,5mM MgC
l2）で洗浄した。その後フィルターを発色させるため
に,12mgブロモコリンドリルリン酸と7mgニトロブルーテ
トラゾリウムを加えた40mlの基質緩衝液中に15分間イン
キュベートした。反応は，フィルターを蒸留水で洗浄す
ることにより停止した。
脱脂乳＋0.5％NP−40）中１時間でブロックされた。2.5
μg/mlポリクローナルウサギ抗CDアーゼ血清を含む用時
調製したブロットーを，このフィルターに加え，室温で
１時間インキュベートした。フィルターは，ブロットー
中で５分間３回洗浄した後，アルカリホスファターゼ接
合体（ベーリンガーマンハイムバイオケミカル）を1:10
00でブロットー中に希釈したものの中でインキュベート
した。過剰な抗体接合体をブロットー中で３回洗浄する
ことにより取り除き，最後にアルカリホスファターゼ基
質緩衝液（100mM Tris−HCl pH9.5,100mM NaCl,5mM MgC
l2）で洗浄した。その後フィルターを発色させるため
に,12mgブロモコリンドリルリン酸と7mgニトロブルーテ
トラゾリウムを加えた40mlの基質緩衝液中に15分間イン
キュベートした。反応は，フィルターを蒸留水で洗浄す
ることにより停止した。
発色を行うと,3つのトランスフェクションすべてに約
17,000ダルトンのバンドがみられ，その強度は，精製CD
アーゼの濃度標準の0.8ngより大きく4ngより小さかっ
た。
17,000ダルトンのバンドがみられ，その強度は，精製CD
アーゼの濃度標準の0.8ngより大きく4ngより小さかっ
た。
3.組換えで発現したCDアーゼの活性測定 上記形質転換されたCOS細胞からの抽出物について,5
−フルオロシトシン（５−FC）から５−フルオロウラシ
ル（５−FU）の変換を測定した。CDアーゼ（１−1,1−
4,2−６）を含むトランスフェクタント（３×105細
胞），擬似トランスフェクション，または対照プラスミ
ドトランスフェクション（BB1）を,10mM Tris緩衝液0.5
ml中で超音波処理し，遠心分離した。各上清100μと
１μg/mlのCDアーゼ溶液を,170μのリン酸緩衝生理食
塩水（PBS）と,30mM 5−FC溶液30μとに加えた。これ
により,3mM 5−FCの反応混合液300μを得た。対照反
応として，酵素を入れない反応も行った。
−フルオロシトシン（５−FC）から５−フルオロウラシ
ル（５−FU）の変換を測定した。CDアーゼ（１−1,1−
4,2−６）を含むトランスフェクタント（３×105細
胞），擬似トランスフェクション，または対照プラスミ
ドトランスフェクション（BB1）を,10mM Tris緩衝液0.5
ml中で超音波処理し，遠心分離した。各上清100μと
１μg/mlのCDアーゼ溶液を,170μのリン酸緩衝生理食
塩水（PBS）と,30mM 5−FC溶液30μとに加えた。これ
により,3mM 5−FCの反応混合液300μを得た。対照反
応として，酵素を入れない反応も行った。
これらの試験管を,37℃で24時間インキュベートした
後，各溶液50μを取り,0.1N HCl 1mlで反応をクエン
チングした。これらの試料を,255および290nmでUV分光
光度計を用いて測定した。
後，各溶液50μを取り,0.1N HCl 1mlで反応をクエン
チングした。これらの試料を,255および290nmでUV分光
光度計を用いて測定した。
（0.1191×OD290−0.02485×OD255）×20＝mM 5−FC および （0.1849×OD255−0.04907×OD290）×20＝mM 5−FU の式を用いて,5−FCから５−FUに変換した量を算出し
た。次いで，元の細胞抽出物中の活性単位数を計算した
（１単位＝５−FCから５−FUへ１μmol/分変換）。擬似
およびBB1トランスフェクション，および酵素なしの反
応では，活性が認められず,CDアーゼの３つのトランス
フェクタントはすべて活性であった。トランスフェクタ
ント１−１は,0.41×10-3単位,1−４は0.54×10-3単
位，そして,2−６は0.26×10-3単位であった。CDアーゼ
１μg/mlの対照アッセイでは,5−FCすべてが５−FUに変
換した。精製CDアーゼの活性を40U/mgとすると,10ng
（１−１）,13.5ng（１−４），および7.3ng（２−６）
の活性型CDアーゼが発現したことになる。
た。次いで，元の細胞抽出物中の活性単位数を計算した
（１単位＝５−FCから５−FUへ１μmol/分変換）。擬似
およびBB1トランスフェクション，および酵素なしの反
応では，活性が認められず,CDアーゼの３つのトランス
フェクタントはすべて活性であった。トランスフェクタ
ント１−１は,0.41×10-3単位,1−４は0.54×10-3単
位，そして,2−６は0.26×10-3単位であった。CDアーゼ
１μg/mlの対照アッセイでは,5−FCすべてが５−FUに変
換した。精製CDアーゼの活性を40U/mgとすると,10ng
（１−１）,13.5ng（１−４），および7.3ng（２−６）
の活性型CDアーゼが発現したことになる。
同じ試料について，別のアッセイ法も行った。上清50
μまたはCDアーゼ１μg/ml,130μPBS,20μ30mM 5
−FC,および,1μCi〔3H〕５−FCを各アッセイ試験管に
入れた。これらの反応は24時間インキュベートし，蒸発
乾固後残渣を20μメタノールに溶解し，シリカゲル薄
層クロマトフラフィー（TLC）板上にスポットして行っ
た。薄層板は,96:4アセトン／水で展開された。このと
き,5−FCおよび５−FUのRfはそれぞれ0.2および0.8であ
った。TLC板の適当な部分を切り取り，シンチレーショ
ンカウンターでカウントし，各試料中の５−FCおよび５
−FUの相対量を測定した。擬似およびBB1アッセイでは,
5−FCが得られず，トランスフェクタントすべてで,5−F
Cの14％が５−FUに変換していた。これは，試料あたり
0.6×10-3単位ということになり,UV実験で算出した量を
立証している。CDアーゼ１μg/mlの対照反応では,5−FC
すべてが５−FUに変換した。
μまたはCDアーゼ１μg/ml,130μPBS,20μ30mM 5
−FC,および,1μCi〔3H〕５−FCを各アッセイ試験管に
入れた。これらの反応は24時間インキュベートし，蒸発
乾固後残渣を20μメタノールに溶解し，シリカゲル薄
層クロマトフラフィー（TLC）板上にスポットして行っ
た。薄層板は,96:4アセトン／水で展開された。このと
き,5−FCおよび５−FUのRfはそれぞれ0.2および0.8であ
った。TLC板の適当な部分を切り取り，シンチレーショ
ンカウンターでカウントし，各試料中の５−FCおよび５
−FUの相対量を測定した。擬似およびBB1アッセイでは,
5−FCが得られず，トランスフェクタントすべてで,5−F
Cの14％が５−FUに変換していた。これは，試料あたり
0.6×10-3単位ということになり,UV実験で算出した量を
立証している。CDアーゼ１μg/mlの対照反応では,5−FC
すべてが５−FUに変換した。
実験は,CDアーゼトランスフェクタントが，実際に活
性型酵素を発現していることを示している。このこと
は，ウェスタンブロット分析と考え合わせて，組換え酵
素の比活性が酵母から単離したそれと同等であることを
示している。
性型酵素を発現していることを示している。このこと
は，ウェスタンブロット分析と考え合わせて，組換え酵
素の比活性が酵母から単離したそれと同等であることを
示している。
このように，熱安定性CDアーゼならびにその精製方法
と組換え製造方法を開示した。本発明の好ましい実施態
様をある程度詳細に示したが，これは例示であって，制
限するものではなく，特許請求の範囲に定義された本発
明の意図および範囲から離れることなしに明らかな変更
をなし得ることは理解されている。
と組換え製造方法を開示した。本発明の好ましい実施態
様をある程度詳細に示したが，これは例示であって，制
限するものではなく，特許請求の範囲に定義された本発
明の意図および範囲から離れることなしに明らかな変更
をなし得ることは理解されている。
（発明の要約） 熱安定性シトシンデアミナーゼ（CDアーゼ），および
それをコードする遺伝子，ならびに，それを単離し，精
製し，そして組換えにより産生する方法が開示される。
熱安定性CDアーゼは,Saccharomyces cerevisiaeから単
離され得る。酵母の単離された酵素は，約32kDaの分子
量を有し（ゲル濾過クロマトグラフィーにより決定され
た），それぞれが約17kDaの分子量を有する,2つのサブ
ユニットから構成されている。よく精製された熱安定性
酵母CDアーゼは，他の公知の配列決定されたタンパクと
有意な配列の相同性を示さない。
それをコードする遺伝子，ならびに，それを単離し，精
製し，そして組換えにより産生する方法が開示される。
熱安定性CDアーゼは,Saccharomyces cerevisiaeから単
離され得る。酵母の単離された酵素は，約32kDaの分子
量を有し（ゲル濾過クロマトグラフィーにより決定され
た），それぞれが約17kDaの分子量を有する,2つのサブ
ユニットから構成されている。よく精製された熱安定性
酵母CDアーゼは，他の公知の配列決定されたタンパクと
有意な配列の相同性を示さない。
参照文献 Aruffo,A.およびSeed,B.,PNAS（USA）84:8573−857
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−1730。
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07。
07。
以下の図面は，本発明の開示内容の一部を構成する。 第１図は,CDアーゼのSDS−PAGE分析（非還元条件下,14
％ポリアクリルアミド）を示す図である。各レーンに示
される物質は，次のものである。レーン１および9,マー
カータンパク：レーン2,実施例１の工程からの自己分解
上清；レーン3,実施例１の工程２の（NH4）2SO4沈澱（7
0％）後の生成物；レーン4,実施例１の工程２の（NH4）
2SO4沈澱（50〜73％）後の生成物；レーン5,実施例１の
工程３のＱ−セファロースクロマトグラフィー後誘導さ
れた生成物；レーン6,実施例１の工程４のＧ−75カラム
後の生成物；レーン7,実施例１の工程５のオクチル−セ
ファロース精製後の生成物；レーン8,実施例１の工程６
の２回目のＧ−75カラム後得られる最終精製物。 第２図は,G−50セファデックスカラム（1.5×100cm）か
らのCDアーゼの溶離プロフィールを示す図である。
（Ａ）精製されたCDアーゼ27Uは，リボヌクレアーゼＡ
（2mg），卵白アルブミン（2mg），およびキモトリプシ
ノーゲンＡ（1mg）と混合され,PBSで溶離された。画分
は，全タンパク含量を決定するため280nmでモニターさ
れ,CDアーゼ活性を決定するため基質として5FCを使用し
ながら290nmでモニターされた。（Ｂ）キャリブレーシ
ョンスタンダードを用いない，上記Ｇ−50セファデック
スカラムからのCDアーゼの溶離。 第３図は,37℃におけるCDアーゼの安定性を示す図であ
る。PBS（プロテアーゼを含有しないBSA（1mg/ml）を含
有）中のCDアーゼ（72U/mg）は，ポリプロピレンチュー
ブ中で37℃でインキュベートされた。様々な期間におい
て,CDアーゼ活性が，酵素溶液10μを使用して決定さ
れた。 第４図は,HPLCで精製されたCDアーゼのプロフィールを
示す図である。水平なバーは，アミノ酸配列分析のため
にプールされた画分を示す。 第５図は,HPLC精製後のCDアーゼのSDS−PAGE分析（還元
条件下,15％ポリアクリルアミド）を示す図である。レ
ーン1,プールA;レーン2,プールＢ。 第６図は,CDアーゼの部分的なアミノ酸配列を示す図で
ある。CNBr（Ｍシリーズ），エンドプロテイナーゼGlu
−Ｃ（Ｅシリーズ），エンドプロテイナーゼLys−Ｃ
（Ｋシリーズ），およびエンドプロテイナーゼAsp−Ｎ
（Ｄシリーズ）による開裂から得られたペプチドを示
す。 第７図は，プライマーCDA4R1およびCDA5ASのヌクレオチ
ド配列，それに対応するアミノ酸配列，およびCDアーゼ
アミノ酸配列中におけるこれらのプライマーの相対的な
位置を示す図である。CDA4R1はセンス鎖上の５′から
３′に向かい，一方CDA5ASはアンチセンス鎖上の５′か
ら３′に向かう。 第８図は,CDアーゼをコードするゲノムクローン由来のD
NAのヌクレオチド配列を示す図である。 第９図は,CDアーゼのゲノム配列中に見られるオープン
リーディングフレーム（ORFs）を示す図である。 第10図は,ORF2のヌクレオチド配列およびそれに対応す
るアミノ酸配列を示す図である。ヌクレオチド配列から
予言されたが，ペプチド配列上に見出されなかった，さ
らに別のアミノ酸が，太字で強調され，開始および停止
コドンが四角で囲まれている。 第11図は,CDアーゼ遺伝子を含有するプラスミド発現ベ
クター「フュージョネーター（fusionator）」を示す図
である。 第12図は,pH3Mベクターの制限地図を示す図である。
％ポリアクリルアミド）を示す図である。各レーンに示
される物質は，次のものである。レーン１および9,マー
カータンパク：レーン2,実施例１の工程からの自己分解
上清；レーン3,実施例１の工程２の（NH4）2SO4沈澱（7
0％）後の生成物；レーン4,実施例１の工程２の（NH4）
2SO4沈澱（50〜73％）後の生成物；レーン5,実施例１の
工程３のＱ−セファロースクロマトグラフィー後誘導さ
れた生成物；レーン6,実施例１の工程４のＧ−75カラム
後の生成物；レーン7,実施例１の工程５のオクチル−セ
ファロース精製後の生成物；レーン8,実施例１の工程６
の２回目のＧ−75カラム後得られる最終精製物。 第２図は,G−50セファデックスカラム（1.5×100cm）か
らのCDアーゼの溶離プロフィールを示す図である。
（Ａ）精製されたCDアーゼ27Uは，リボヌクレアーゼＡ
（2mg），卵白アルブミン（2mg），およびキモトリプシ
ノーゲンＡ（1mg）と混合され,PBSで溶離された。画分
は，全タンパク含量を決定するため280nmでモニターさ
れ,CDアーゼ活性を決定するため基質として5FCを使用し
ながら290nmでモニターされた。（Ｂ）キャリブレーシ
ョンスタンダードを用いない，上記Ｇ−50セファデック
スカラムからのCDアーゼの溶離。 第３図は,37℃におけるCDアーゼの安定性を示す図であ
る。PBS（プロテアーゼを含有しないBSA（1mg/ml）を含
有）中のCDアーゼ（72U/mg）は，ポリプロピレンチュー
ブ中で37℃でインキュベートされた。様々な期間におい
て,CDアーゼ活性が，酵素溶液10μを使用して決定さ
れた。 第４図は,HPLCで精製されたCDアーゼのプロフィールを
示す図である。水平なバーは，アミノ酸配列分析のため
にプールされた画分を示す。 第５図は,HPLC精製後のCDアーゼのSDS−PAGE分析（還元
条件下,15％ポリアクリルアミド）を示す図である。レ
ーン1,プールA;レーン2,プールＢ。 第６図は,CDアーゼの部分的なアミノ酸配列を示す図で
ある。CNBr（Ｍシリーズ），エンドプロテイナーゼGlu
−Ｃ（Ｅシリーズ），エンドプロテイナーゼLys−Ｃ
（Ｋシリーズ），およびエンドプロテイナーゼAsp−Ｎ
（Ｄシリーズ）による開裂から得られたペプチドを示
す。 第７図は，プライマーCDA4R1およびCDA5ASのヌクレオチ
ド配列，それに対応するアミノ酸配列，およびCDアーゼ
アミノ酸配列中におけるこれらのプライマーの相対的な
位置を示す図である。CDA4R1はセンス鎖上の５′から
３′に向かい，一方CDA5ASはアンチセンス鎖上の５′か
ら３′に向かう。 第８図は,CDアーゼをコードするゲノムクローン由来のD
NAのヌクレオチド配列を示す図である。 第９図は,CDアーゼのゲノム配列中に見られるオープン
リーディングフレーム（ORFs）を示す図である。 第10図は,ORF2のヌクレオチド配列およびそれに対応す
るアミノ酸配列を示す図である。ヌクレオチド配列から
予言されたが，ペプチド配列上に見出されなかった，さ
らに別のアミノ酸が，太字で強調され，開始および停止
コドンが四角で囲まれている。 第11図は,CDアーゼ遺伝子を含有するプラスミド発現ベ
クター「フュージョネーター（fusionator）」を示す図
である。 第12図は,pH3Mベクターの制限地図を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピーター チョン―ダグ スー アメリカ合衆国 ワシントン 98040 エス．イー．マーサー アイランド，84 ティエイチ アベニュー 6001 (72)発明者 ハンス マークワート アメリカ合衆国 ワシントン 98040 マーサー アイランド，エス．イー．46 ティエイチ ストリート 9222 (72)発明者 マーサ エス．ヘイデン アメリカ合衆国 ワシントン 98148 シアトル，エス．ナンバー19，アンバウ ム ブールバード 17340 (72)発明者 ピーター リンズレー アメリカ合衆国 ワシントン 98119 ダブリュ．シアトル，９ティエイチ ア ベニュー 2430 (56)参考文献 Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, Ｖｏｌ．50，Ｎｏ．７（1986）ｐ．1721 −1730 Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, Ｖｏｌ．53，Ｎｏ．５（1989）ｐ．1313 −1319 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 9/78 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／Ｇ ＥＮＥＳＥＱ Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＰＩＲ
Claims (18)
- 【請求項１】以下のアミノ酸配列： または からなる熱安定性シトシンデアミナーゼ、または該シト
シンデアミナーゼの活性フラグメントをコードする単離
されたヌクレオチドであって、該シトシンデアミナーゼ
または該活性フラグメントは、遊離した非固定化状態
で、37℃で12時間よりも長い時間、少なくとも50％の活
性を有し、該活性は、該シトシンデアミナーゼまたは該
活性フラグメントの存在下で5FCの5FUへの変換をモニタ
ーすることにより決定される、ヌクレオチド。 - 【請求項２】以下のアミノ酸配列： または 中に、１つまたは数個のアミノ酸欠失、置換、および／
または付加を有するアミノ酸配列からなる熱安定性シト
シンデアミナーゼ、または該シトシンデアミナーゼの活
性フラグメントをコードする単離されたヌクレオチドで
あって、該シトシンデアミナーゼまたは該活性フラグメ
ントは、遊離した非固定化状態で、37℃で12時間よりも
長い時間、少なくとも50％の活性を有し、該活性は、該
シトシンデアミナーゼまたは該活性フラグメントの存在
下で5FCの5FUへの変換をモニターすることにより決定さ
れる、ヌクレオチド。 - 【請求項３】以下のヌクレオチド配列： を含む、熱安定性シトシンデアミナーゼをコードする単
離されたヌクレオチドであって、該シトシンデアミナー
ゼは、遊離した非固定化状態で、37℃で12時間よりも長
い時間、少なくとも50％の活性を有し、該活性は、該シ
トシンデアミナーゼの存在下で5FCの5FUへの変換をモニ
ターすることにより決定される、ヌクレオチド。 - 【請求項４】以下のヌクレオチド配列： の相補鎖に、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチドを含む、
熱安定性シトシンデアミナーゼをコードする単離された
ヌクレオチドであって、該シトシンデアミナーゼは、遊
離した非固定化状態で、37℃で12時間よりも長い時間、
少なくとも50％の活性を有し、該活性は、該シトシンデ
アミナーゼの存在下で5FCの5FUへの変換をモニターする
ことにより決定される、ヌクレオチド。 - 【請求項５】以下のアミノ酸配列： または からなるポリペプチドを含む熱安定性シトシンデアミナ
ーゼをコードする単離されたヌクレオチドであって、該
シトシンデアミナーゼは、遊離した非固定化状態で、37
℃で12時間よりも長い時間、少なくとも50％の活性を有
し、該活性は、該シトシンデアミナーゼの存在下で5FC
の5FUへの変換をモニターすることにより決定され、該
活性は、該ポリペプチドに由来する、ヌクレオチド。 - 【請求項６】以下のアミノ酸配列： または 中に、１つまたは数個のアミノ酸欠失、置換、および／
または付加を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
を含む熱安定性シトシンデアミナーゼをコードする単離
されたヌクレオチドであって、該シトシンデアミナーゼ
は、遊離した非固定化状態で、37℃で12時間よりも長い
時間、少なくとも50％の活性を有し、該活性は、該シト
シンデアミナーゼの存在下で5FCの5FUへの変換をモニタ
ーすることにより決定され、該活性は、該ポリペプチド
に由来する、ヌクレオチド。 - 【請求項７】請求項１〜６のいずれかに記載のヌクレオ
チドを含有し、そして該ヌクレオチドの発現において効
果的である、組換え発現ベクター。 - 【請求項８】前記ヌクレオチドが、宿主細胞と適合性の
制御配列と作動可能に連結している、請求項７に記載の
組換え発現ベクター。 - 【請求項９】請求項７または８に記載の組換え発現ベク
ターで形質転換された宿主細胞。 - 【請求項１０】請求項９に記載の宿主細胞を増殖させる
ことを包含する、組換え熱安定性シトシンデアミナーゼ
を産生する方法。 - 【請求項１１】以下のアミノ酸配列： または からなる単離された熱安定性シトシンデアミナーゼ、ま
たは該シトシンデアミナーゼの活性フラグメントであっ
て、該シトシンデアミナーゼまたは該活性フラグメント
は、遊離した非固定化状態で、37℃で12時間よりも長い
時間、少なくとも50％の活性を有し、該活性は、該シト
シンデアミナーゼまたは該活性フラグメントの存在下で
5FCの5FUへの変換をモニターすることにより決定され
る、単離された熱安定性シトシンデアミナーゼ、または
該シトシンデアミナーゼの活性フラグメント。 - 【請求項１２】以下のアミノ酸配列： または 中に、１つまたは数個のアミノ酸欠失、置換、および／
または付加を有するアミノ酸配列からなる単離された熱
安定性シトシンデアミナーゼ、または該シトシンデアミ
ナーゼの活性フラグメントであって、該シトシンデアミ
ナーゼまたは該活性フラグメントは、遊離した非固定化
状態で、37℃で12時間よりも長い時間、少なくとも50％
の活性を有し、該活性は、該シトシンデアミナーゼまた
は該活性フラグメントの存在下で5F5の5FUへの変換をモ
ニターすることにより決定される、単離された熱安定性
シトシンデアミナーゼ、または該シトシンデアミナーゼ
の活性フラグメント。 - 【請求項１３】以下のアミノ酸配列： または からなるか、または以下のヌクレオチド配列： の相補鎖に、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによっ
てコードされるアミノ酸配列からなる、単離された熱安
定性シトシンデアミナーゼ、または該シトシンデアミナ
ーゼの活性フラグメントであって、該シトシンデアミナ
ーゼまたは該活性フラグメントは、遊離した非固定化状
態で、37℃で12時間よりも長い時間、少なくとも50％の
活性を有し、該活性は、該シトシンデアミナーゼまたは
該活性フラグメントの存在下で5FCの5FUへの変換をモニ
ターすることにより決定される、単離された熱安定性シ
トシンデアミナーゼ、または該シトシンデアミナーゼの
活性フラグメント。 - 【請求項１４】以下のアミノ酸配列： または からなるポリペプチドを含む単離された熱安定性シトシ
ンデアミナーゼであって、該シトシンデアミナーゼは、
遊離した非固定化状態で、37℃で12時間よりも長い時
間、少なくとも50％の活性を有し、該活性は、該シトシ
ンデアミナーゼの存在下で5FCの5FUへの変換をモニター
することにより決定され、該活性は、該ポリペプチドに
由来する、単離された熱安定性シトシンデアミナーゼ。 - 【請求項１５】以下のアミノ酸配列： または 中に、１つまたは数個のアミノ酸欠失、置換、および／
または付加を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
を含む単離された熱安定性シトシンデアミナーゼであっ
て、該シトシンデアミナーゼは、遊離した非固定化状態
で、37℃で12時間よりも長い時間、少なくとも50％の活
性を有し、該活性は、該シトシンデアミナーゼの存在下
で5FCの5FUへの変換をモニターすることにより決定さ
れ、該活性は、該ポリペプチドに由来する、単離された
熱安定性シトシンデアミナーゼ。 - 【請求項１６】以下のアミノ酸配列： または からなるポリペプチドを含む単離された熱安定性シトシ
ンデアミナーゼ、または以下のヌクレオチド配列： の相補鎖に、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによっ
てコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含
む単離された熱安定性シトシンデアミナーゼであって、
該シトシンデアミナーゼは、遊離した非固定化状態で、
37℃で12時間よりも長い時間、少なくとも50％の活性を
有し、該活性は、該シトシンデアミナーゼの存在下で5F
Cの5FUへの変換をモニターすることにより決定され、該
活性は、該ポリペプチドに由来する、単離された熱安定
性シトシンデアミナーゼ。 - 【請求項１７】酵母から単離される、請求項11〜16のい
ずれかに記載のシトシンデアミナーゼ。 - 【請求項１８】Saccharomyces cerevisiaeから単離され
る、請求項17に記載のシトシンデアミナーゼ。
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