JPH07274970A - 組換えベクターと、この組換えベクターを保持する形 質転換体、およびこの形質転換体による抗菌性ペプチ ドの製造方法 - Google Patents
組換えベクターと、この組換えベクターを保持する形 質転換体、およびこの形質転換体による抗菌性ペプチ ドの製造方法Info
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- JPH07274970A JPH07274970A JP6085244A JP8524494A JPH07274970A JP H07274970 A JPH07274970 A JP H07274970A JP 6085244 A JP6085244 A JP 6085244A JP 8524494 A JP8524494 A JP 8524494A JP H07274970 A JPH07274970 A JP H07274970A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規な抗菌性ペプチド（ラクトフェリシン
類）をコードする組換えベクター、この組換えベクター
を保持する形質転換体およびそれを用いた抗菌性ペプチ
ド（ラクトフェリシン類）の製造方法を提供する。 【構成】 抗菌性ペプチド（ラクトフェリシン類）をコ
ードするＤＮＡ配列を含み、かつ、このＤＮＡ配列の発
現を制御するｔａｃプロモーターを有する組換えベクタ
ーｐＧＥＸＬＦを図１に示すように構築し、これを組込
んだ大腸菌を培養した後、ＩＰＴＧの添加により発現制
御を解除して培養し、抗菌性ペプチド（ラクトフェリシ
ン類）を採取することを特徴とする抗菌性ペプチドの製
造方法。 【効果】 抗菌性ペプチド（ラクトフェリシン類）を安
価かつ簡便に大量供給することができる。
類）をコードする組換えベクター、この組換えベクター
を保持する形質転換体およびそれを用いた抗菌性ペプチ
ド（ラクトフェリシン類）の製造方法を提供する。 【構成】 抗菌性ペプチド（ラクトフェリシン類）をコ
ードするＤＮＡ配列を含み、かつ、このＤＮＡ配列の発
現を制御するｔａｃプロモーターを有する組換えベクタ
ーｐＧＥＸＬＦを図１に示すように構築し、これを組込
んだ大腸菌を培養した後、ＩＰＴＧの添加により発現制
御を解除して培養し、抗菌性ペプチド（ラクトフェリシ
ン類）を採取することを特徴とする抗菌性ペプチドの製
造方法。 【効果】 抗菌性ペプチド（ラクトフェリシン類）を安
価かつ簡便に大量供給することができる。
Description
【産業上の利用分野】この発明は、抗菌性ペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を挿入結合した組換えベクター、こ
の組換えベクターを保持する形質転換体、およびこの形
質転換体による抗菌性ペプチドの製造方法に関するもの
である。
ードするＤＮＡ配列を挿入結合した組換えベクター、こ
の組換えベクターを保持する形質転換体、およびこの形
質転換体による抗菌性ペプチドの製造方法に関するもの
である。
【従来の技術】従来より、種々の微生物に対して抗菌作
用を有するペプチドについて多数の発明が知られてい
る。例えば、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に有効な
ホスホノトリペプチド（特開昭５７−１０６６８９号公
報）、ホスホノジペプチド誘導体（特開昭５８−１３５
９４号公報）、環状ペプチド誘導体（特開昭５８−２１
３７４４号公報）、抗菌および抗ウイルス作用を示すペ
プチド（特開昭５９−５１２４７号公報）、酵母に有効
なポリペプチド（特開昭６０−１３０５９９号公報）、
グラム陽性菌に有効な糖ペプチド誘導体（特開昭６０−
１７２９９８号公報、特開昭６１−２５１６９９号公
報、特開昭６３−４４５９８号公報）、グラム陽性菌に
有効なオリゴペプチド（特開昭６２−２２７９８号公
報）、ペプチド系抗生物質（特開昭６２−５１６９７号
公報、特開昭６３−１７８９７号公報）、その他北米産
カブトガニの血球から抽出した抗菌性ペプチド（特開平
２−５３７９９号公報）、蜜蜂の血リンパから単離した
抗菌性ペプチド（特表平２−５０００８４号公報）等で
ある。一方、ラクトフェリンは涙、唾液、末梢血、乳汁
等に含まれている天然の鉄結合性蛋白質であり、大腸
菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌等の有害微生物に
対して抗菌作用を示すことが知られている［ジャーナル
・オブ・ペディアトリクス（Journal of Pediatrics)、
第９４巻、第１ページ、１９７９年］。この発明の発明
者らはラクトフェリンの加水分解物から、特定のアミノ
酸配列を有し、ラクトフェリンの鉄結合能とは無関係
に、ラクトフェリンに比較して高い抗菌性を有する抗菌
性ペプチドを発見している［ジャーナル・オブ・デイリ
ー・サイエンス(Journal of Dairy Science)、第７４
巻、第４１３７ページ、１９９１年］。
用を有するペプチドについて多数の発明が知られてい
る。例えば、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に有効な
ホスホノトリペプチド（特開昭５７−１０６６８９号公
報）、ホスホノジペプチド誘導体（特開昭５８−１３５
９４号公報）、環状ペプチド誘導体（特開昭５８−２１
３７４４号公報）、抗菌および抗ウイルス作用を示すペ
プチド（特開昭５９−５１２４７号公報）、酵母に有効
なポリペプチド（特開昭６０−１３０５９９号公報）、
グラム陽性菌に有効な糖ペプチド誘導体（特開昭６０−
１７２９９８号公報、特開昭６１−２５１６９９号公
報、特開昭６３−４４５９８号公報）、グラム陽性菌に
有効なオリゴペプチド（特開昭６２−２２７９８号公
報）、ペプチド系抗生物質（特開昭６２−５１６９７号
公報、特開昭６３−１７８９７号公報）、その他北米産
カブトガニの血球から抽出した抗菌性ペプチド（特開平
２−５３７９９号公報）、蜜蜂の血リンパから単離した
抗菌性ペプチド（特表平２−５０００８４号公報）等で
ある。一方、ラクトフェリンは涙、唾液、末梢血、乳汁
等に含まれている天然の鉄結合性蛋白質であり、大腸
菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌等の有害微生物に
対して抗菌作用を示すことが知られている［ジャーナル
・オブ・ペディアトリクス（Journal of Pediatrics)、
第９４巻、第１ページ、１９７９年］。この発明の発明
者らはラクトフェリンの加水分解物から、特定のアミノ
酸配列を有し、ラクトフェリンの鉄結合能とは無関係
に、ラクトフェリンに比較して高い抗菌性を有する抗菌
性ペプチドを発見している［ジャーナル・オブ・デイリ
ー・サイエンス(Journal of Dairy Science)、第７４
巻、第４１３７ページ、１９９１年］。
【発明が解決しようとする課題】上記の抗菌性ペプチド
は、これまでは化学合成またはラクトフェリンの加水分
解物からの分離により生産されていた（特開平５−７８
３９２号公報、特開平５−９２９９４号公報、特開平５
−１４８２９５号公報、特開平５−１４８２９６号公報
および特開平５−１４８２９７号公報）。しかしなが
ら、これらの方法による抗菌性ペプチドの生産は、高価
かつ繁雑であり、生産量も少ないため、これらのペプチ
ドをより安価、簡便、かつ大量製造することが望まれて
いた。また、天然型蛋白質であるヒトラクトフェリンに
ついては、そのｃＤＮＡ配列および真核細胞発現系を用
いるヒトラクトフェリンおよびその機能的等価物の遺伝
子組換技術を利用した生産方法が開示されている（特表
平４−５０５１０１号公報）が、生産されたラクトフェ
リンの存在は、抗ヒトラクトフェリン抗体を用いたウエ
スタン免疫ブロット分析および相対的分子量測定によっ
て確認されているようにごく少量にすぎず、工業的規模
での生産は行われていない。この発明は、以上のとおり
の事情に鑑みてなされたものであり、抗菌性ペプチドを
より安価、簡便かつ大量に製造するための新しい遺伝子
工学材料と、これらの材料を用いた抗菌性ペプチドの製
造方法を提供することを目的としている。
は、これまでは化学合成またはラクトフェリンの加水分
解物からの分離により生産されていた（特開平５−７８
３９２号公報、特開平５−９２９９４号公報、特開平５
−１４８２９５号公報、特開平５−１４８２９６号公報
および特開平５−１４８２９７号公報）。しかしなが
ら、これらの方法による抗菌性ペプチドの生産は、高価
かつ繁雑であり、生産量も少ないため、これらのペプチ
ドをより安価、簡便、かつ大量製造することが望まれて
いた。また、天然型蛋白質であるヒトラクトフェリンに
ついては、そのｃＤＮＡ配列および真核細胞発現系を用
いるヒトラクトフェリンおよびその機能的等価物の遺伝
子組換技術を利用した生産方法が開示されている（特表
平４−５０５１０１号公報）が、生産されたラクトフェ
リンの存在は、抗ヒトラクトフェリン抗体を用いたウエ
スタン免疫ブロット分析および相対的分子量測定によっ
て確認されているようにごく少量にすぎず、工業的規模
での生産は行われていない。この発明は、以上のとおり
の事情に鑑みてなされたものであり、抗菌性ペプチドを
より安価、簡便かつ大量に製造するための新しい遺伝子
工学材料と、これらの材料を用いた抗菌性ペプチドの製
造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、ベクターに少なくとも配列番号
１記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入結
合した組換えベクターを提供する。またこの発明は、ベ
クターに少なくとも配列番号１記載のアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列を挿入結合した組換えベクターを保
持する形質転換体を提供する。さらにこの発明は、ベク
ターに少なくとも配列番号１記載のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ配列を挿入結合した組換えベクターを保持
する形質転換体を培養し、配列番号１記載のアミノ酸配
列を含むペプチドを採取することを特徴とする抗菌性ペ
プチドの製造方法をも提供する。以下、この発明の構成
と好ましい態様について詳しく説明する。なお、以下の
説明において、抗菌活性を有するペプチドをまとめてラ
クトフェリシン類（「ラクトフェリシン」は森永乳業株
式会社が所有する登録商標である）と記載することがあ
る。また、アミノ酸およびペプチドはアイユーピーエー
シーーアイユービー生化学命名委員会（IUPAC-IUB CBN)
で採用された略記法に基づいて表示され、例えば次の略
号を使用する。。 Ala ：L-アラニン残基 Arg ：L-アルギニン残基 Asn ：L-アスパラギン残基 Asp ：L-アスパラギン酸残基 Cys ：L-システイン残基 Gln ：L-グルタミン残基 Glu ：L-グルタミン酸残基 Gly ：L-グリシン残基 His ：L-ヒスチジン残基 Ile ：L-イソロイシン残基 Leu ：L-ロイシン残基 Lys ：L-リジン残基 Met ：L-メチオニン残基 Phe ：L-フェニルアラニン残基 Pro ：L-プロリン残基 Ser ：L-セリン残基 Thr ：L-スレオニン残基 Trp ：L-トリプトファン残基 Tyr ：L-チロシン残基 Val ：L-バリン残基 先ず、この発明の組換えベクターは、 （１）ラクトフェリシン類をコードするＤＮＡ配列の合
成 （２）（１）の工程で合成したＤＮＡ配列の発現ベクタ
ーへの挿入 の手順により構築することができる。次にそれらの手順
について説明する。 （１）ラクトフェリシン類をコードするＤＮＡ配列の合
成 同一アミノ酸に対応するコドンが数種ある場合、生物種
（宿主となる微生物等の種類）によってその選択パター
ンに相違のあることが知られている［細胞工学、第２
巻、第１５４１〜１５５３ページ、１９８３年］。そこ
でこの発明においては、ラクトフェリシン類を生産させ
る生物種に汎用されているコドンを選択し、それらに対
応したＤＮＡ配列を常法により合成した。なお、このよ
うなＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列は、少なくとも
配列番号１記載のアミノ酸配列を含むものであるが、こ
の配列は、抗菌性ペプチド（ラクトフェリシン類）のコ
ード領域を含み、ラクトフェリンの鉄結合ドメインを含
まないことを特徴とする以外は特に限定されるものでは
ない。ただし、配列両端の制限酵素切断部位を除いた長
さを１８０塩基対までとすることがより望ましい。ま
た、ラクトフェリシン類をそのＮ末端またはＣ末端で適
当な蛋白質Ｐと融合体を形成する形で生産する場合は、
ラクトフェリシン類と蛋白質Ｐのそれぞれをコードする
ＤＮＡ配列の境界に適当なプロテアーゼ（トロンビン、
ファクターＸａ等）または化学物質による認識切断部位
をコードするＤＮＡ配列を予め付加する。 （２）前記（１）で合成したＤＮＡ配列の発現ベクター
への挿入 （１）の工程で合成したＤＮＡ配列を挿入するベクター
は、ラクトフェリシン類を生産させる生物種（宿主とな
る微生物等の種類）によって適宜選択される。これらの
ベクターとしては公知のプラスミドｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＫ
ＯＭ１、ｐＲＳＶＮｏｔ等が例示され、これらから常法
により誘導された各種ベクターを含む各種公知のベクタ
ーを適宜利用することができる。多くの場合、これらの
ベクターは大腸菌のシャトル・ベクターであるので、組
換えベクターの構築は、前記（１）の工程で合成したＤ
ＮＡ配列をイン・ビトロでベクターに連結し、のち一旦
大腸菌に導入することによって行うことができる。これ
により、挿入ＤＮＡ配列の塩基配列の確認、および構築
した組換えベクターの増幅・調製が容易になる。なお、
大腸菌用のベクターの構築は（１）の工程で合成したＤ
ＮＡ配列をイン・ビトロで前記大腸菌用に選択されたベ
クターに連結することのみによっても行うことができ
る。なお、使用する発現ベクターは、組み込まれたＤＮ
Ａ配列の発現に関与するプロモーターが制御されるも
の、または常に働くもののいずれでも良いが、ラクトフ
ェリシン類の発現量を考慮するならば、組み込まれたＤ
ＮＡ配列の発現に関与するプロモーターが制御されるも
のがより望ましい。また、生産されるラクトフェリシン
類が培地中に分泌されるように、組み込まれたＤＮＡ配
列からできる物質がシグナル配列を有するものであって
も良い。生産される物質の分子量が小さい場合には、発
現産物が適当な蛋白質と融合体を形成する形のものを用
いることもできる。次に、この発明の組換えベクターを
用いたラクトフェリシン類の製造方法について説明す
る。組換えベクターを用いたラクトフェリシン類の製造
は、 （１）組換えベクターを保持する形質転換体の作成 （２）前記（１）の工程で作成した形質転換体がラクト
フェリシン類を生産することの確認 （３）前記（２）の工程でラクトフェリシン類を生産す
ることが確認された形質転換体の培養 （４）前記（３）の工程で得られた培養液からのラクト
フェリシン類の精製 により行われる。次に、それぞれの手順について説明す
る。 （１）組換えベクターを保持する形質転換体の作成 組換えベクターの導入方法は、それを導入する生物種
（宿主となる微生物等の種類）によって異なる。例え
ば、宿主として大腸菌を用いる場合は常法の塩化カルシ
ウム法、酵母を用いる場合は常法のプロトプラトス法
［ＤＮＡクローニング(DNA Cloning) 、第２巻、第２５
ページ、ＩＲＬプレス(IRL Press) 、１９８５年］また
はリチウム法、動物細胞を用いる場合は、リン酸カルシ
ウム法［モレキュラー・クローニング(Molecular Cloni
ng) 、第２版、第３巻、第１６章、第３３ページ、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(C
old Spring Harbor Laboratory Press) 、１９８９年］
またはエレクトロポレーション法［モレキュラー・クロ
ーニング(Molecular Cloning) 、第２版、第３巻、第１
６章、第５４ページ、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laborato
ry Press) 、１９８９年］等を用いることができる。組
換えベクターを保持する形質転換体の選別は、使用した
ベクターが保有する選択マーカー遺伝子に基づく薬剤耐
性またはアミノ酸非要求性等の形質獲得の有無を、薬剤
添加培地またはアミノ酸非含有培地等で調べることによ
り行うことができる。 （２）（１）の工程で作成した形質転換体がラクトフェ
リシン類を生産することの確認 前記（１）で作成した形質転換体のラクトフェリシン類
生産の確認は、この形質転換体の培養上清または無細胞
抽出液を、例えば市販の抗ラクトフェリン抗体を用いて
ＥＬＩＳＡ法［生物化学実験法１５・免疫学入門、第１
５０ページ、学会出版センター、１９８３年］、ウェス
タン・ブロッティング法［モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning) 、第２版、第３巻、第１８章、第
６０ページ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s) 、１９８９年］等により調べる等して行うことがで
きる。また、生産される物質は抗菌活性を有するので、
この形質転換体の培養上清もしくは細胞抽出物中の抗菌
活性を測定することによっても確認することが可能であ
る。 （３）前記（２）の工程でラクトフェリシン類を生産す
ることが確認された形質転換体の培養 形質転換体の培養は、その生物種（宿主となる微生物等
の種類）および使用したベクターにより各々に適した方
法を用いる。例えば、組み込まれたＤＮＡ配列の発現に
関与するプロモーターが常に働くベクターを使用し、生
物種が大腸菌の場合は、形質転換体の選択に用いた薬剤
を含有する２×ＴＹ培地［１．６％バクトトリプトン、
１．０％酵母エキスおよび０．５％塩化ナトリウムから
なる。モレキュラー・クローニング (Molecular Clonin
g)、第２版、第３巻、付録Ａ、第３ページ、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス (Cold S
pring Harbor Laboratory Press)、１９８９年］等を用
いて通常３７℃で定常増殖期まで培養することにより、
ラクトフェリシン類の生産が行われる。同様のプロモー
ターが常に働くベクターを使用し、生物種がパン酵母サ
ッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)の場合は、形質転換体の選択に用いたアミノ酸または
核酸を除いた最小合成培地［０．６７％バクトイースト
ナイトロジェンベース（アミノ酸無）、２％グルコース
からなる。メソッズ・イン・エンザイモロジー (Method
s in Enzymology)、第１９４巻、第１４ページ、アカデ
ミック・プレス(Academic Press)、１９９１年］等を用
いて３０℃で定常増殖期まで培養することにより、ラク
トフェリシン類の生産が行われる。生物種が動物細胞の
場合は、１０％子牛血清および形質転換体の選択に用い
た薬剤を含有するダルベッコ改変イーグル最小培地［Ｄ
ＭＥＭ；ウイロロジー(Virology)、第８巻、第３９６ペ
ージ、１９５９年］等を用いて３７℃で３〜４日間培養
することにより、ラクトフェリシン類の生産が行われ
る。なお、組み込まれたＤＮＡ配列の発現に関与するプ
ロモーターが制御されるベクターを使用する場合には、
その制御を解除して、挿入ＤＮＡ配列を発現させるため
に、各プロモーターの性質に応じて培養温度を変化させ
るか、制御を解除する物質を添加する必要がある。例え
ば、ラムダファージ右側プロモーターならば、その誘導
（制御解除）によってラクトフェリシン類を生産させる
ためには、３０℃で初期定常増殖期まで培養し、のち培
養温度を４２℃に上昇して更に９０分間培養する必要が
あり、ラクトースプロモーターならば、その誘導（制御
解除）によってラクトフェリシン類を生産させるために
は、３７℃（酵母の場合は３０℃）で初期定常増殖期ま
で培養し、のち終濃度０．１〜１．０ｍＭのイソプロピ
ル β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して
更に４時間培養する必要がある。 （４）前記（３）の工程で得た培養液からのラクトフェ
リシン類の精製 この方法も形質転換体の作成に使用したベクターおよび
宿主により各々に適当した方法を用いる必要がある。例
えば、Ｎ末端に分泌シグナル配列を付加した形のラクト
フェリシン類を生産する組換えベクターを導入した大腸
菌からラクトフェリシン類を精製する場合には、培養液
を遠心して集菌し、ショ糖溶液に懸濁して浸透圧ショッ
クをかけ、菌体のペリプラズム中のラクトフェリシン類
を溶出させ、続いてゲル濾過または逆相クロマトグラフ
ィー等で分画精製することによってラクトフェリシン類
の精製を行う。同様のベクターを導入したS. cerevisia
e または動物細胞からラクトフェリシン類を精製する場
合には、培養液を遠心してラクトフェリシン類が分泌含
有されている培養上清を取得し、続いてゲル濾過または
逆相クロマトグラフィー等で分画精製することによって
ラクトフェリシン類を精製する。次に、Ｎ末端またはＣ
末端においてプロテアーゼまたは化学物質の認識切断部
位を介して適当な蛋白質Ｐと融合体を形成する形で生産
されるラクトフェリシン類を精製する場合には、培養液
を遠心して集菌した後、超音波やホモジェナイザーを用
いて菌体を破砕し、再び遠心してラクトフェリシン類と
蛋白質Ｐとの融合蛋白を含む無細胞抽出液を取得し、続
いてゲル濾過または蛋白質Ｐに対するアフィニティを利
用したアフィニティーカラムを用いて融合蛋白を単離し
た後、融合蛋白を、付加されているプロテアーゼもしく
は化学物質の認識切断部位に対応するプロテアーゼまた
は化学物質を用いて切断し、ラクトフェリシン類を逆相
クロマトグラフィー等で分画精製することによってラク
トフェリシン類の精製を行う。また、ベクターの形質に
よらずに、大腸菌を宿主として、ラクトフェリシン類が
大量に生産された場合には、産生した蛋白質が菌体内で
凝集して顆粒体を形成することがある。この場合には、
培養液を遠心して集菌した後、超音波やホモジェナイザ
ーを用いて菌体を破砕し、再び遠心して顆粒体を取得
し、６Ｍ塩酸グアニジンまたは８Ｍ尿素を加えて蛋白質
を可溶化した後、バッファー添加または透析等により塩
酸グアニジンまたは尿素の濃度を下げた上で、ゲル濾過
等の処理を行うことによってラクトフェリシン類を精製
することができる。次に試験例を示してこの発明をさら
に詳しく説明する。 試験例１ この試験は、ラクトフェリシン類の発現が（１）恒常的
である場合と（２）ＩＰＴＧにより制御される場合とに
おいて、発現の効率および宿主に与える影響を比較する
ために行った。後記する実施例８と同様に、後記する実
施例７で構築した動物細胞系組換えベクターｐＲＳＶＬ
Ｆがlac オペレーターを含むことを利用して実施した。
すなわち、（１）の場合には、宿主としてハムスターＣ
ＨＯ細胞を用い、この細胞にリン酸カルシウム法により
上記組換えベクターを導入し、導入後の細胞を４８時間
培養し、ラクトフェリシン類を発現させた。（２）の場
合には、予めｐ３′ＳＳを導入し、ＩＰＴＧによる制御
解除が可能なlacIリプレッサーを発現するＣＨＯ細胞を
用い、この細胞にリン酸カルシウム法によりベクターを
導入し、導入後の細胞を３６時間培養し、１ｍＭのＩＰ
ＴＧを添加して更に１２時間培養して、ラクトフェリシ
ン類を発現させた。前記（１）および（２）それぞれに
おけるラクトフェリシン類の発現量を、ニンヒドリン法
［アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical B
iochemistry ）、第４９巻、第９５ページ、１９７２
年］により測定して比較した。宿主に与える影響につい
ては、前記のとおり宿主細胞が異なる以外は、形質導入
の条件を同一として、形質導入に用いた総細胞に対する
ラクトフェリシン類発現細胞の得られる割合（形質導入
効率）を比較した。この試験の結果は表１に示すとおり
である。表１から明らかなように、動物細胞系における
ラクトフェリシン類の発現は、宿主細胞の増殖が飽和状
態に達した後に制御が開始する（２）の条件の方が、宿
主に悪影響を及ぼすことがなく、形質導入体が得られや
すく、ラクトフェリシン類の発現量も多いことが判明し
た。
を解決するものとして、ベクターに少なくとも配列番号
１記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入結
合した組換えベクターを提供する。またこの発明は、ベ
クターに少なくとも配列番号１記載のアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列を挿入結合した組換えベクターを保
持する形質転換体を提供する。さらにこの発明は、ベク
ターに少なくとも配列番号１記載のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ配列を挿入結合した組換えベクターを保持
する形質転換体を培養し、配列番号１記載のアミノ酸配
列を含むペプチドを採取することを特徴とする抗菌性ペ
プチドの製造方法をも提供する。以下、この発明の構成
と好ましい態様について詳しく説明する。なお、以下の
説明において、抗菌活性を有するペプチドをまとめてラ
クトフェリシン類（「ラクトフェリシン」は森永乳業株
式会社が所有する登録商標である）と記載することがあ
る。また、アミノ酸およびペプチドはアイユーピーエー
シーーアイユービー生化学命名委員会（IUPAC-IUB CBN)
で採用された略記法に基づいて表示され、例えば次の略
号を使用する。。 Ala ：L-アラニン残基 Arg ：L-アルギニン残基 Asn ：L-アスパラギン残基 Asp ：L-アスパラギン酸残基 Cys ：L-システイン残基 Gln ：L-グルタミン残基 Glu ：L-グルタミン酸残基 Gly ：L-グリシン残基 His ：L-ヒスチジン残基 Ile ：L-イソロイシン残基 Leu ：L-ロイシン残基 Lys ：L-リジン残基 Met ：L-メチオニン残基 Phe ：L-フェニルアラニン残基 Pro ：L-プロリン残基 Ser ：L-セリン残基 Thr ：L-スレオニン残基 Trp ：L-トリプトファン残基 Tyr ：L-チロシン残基 Val ：L-バリン残基 先ず、この発明の組換えベクターは、 （１）ラクトフェリシン類をコードするＤＮＡ配列の合
成 （２）（１）の工程で合成したＤＮＡ配列の発現ベクタ
ーへの挿入 の手順により構築することができる。次にそれらの手順
について説明する。 （１）ラクトフェリシン類をコードするＤＮＡ配列の合
成 同一アミノ酸に対応するコドンが数種ある場合、生物種
（宿主となる微生物等の種類）によってその選択パター
ンに相違のあることが知られている［細胞工学、第２
巻、第１５４１〜１５５３ページ、１９８３年］。そこ
でこの発明においては、ラクトフェリシン類を生産させ
る生物種に汎用されているコドンを選択し、それらに対
応したＤＮＡ配列を常法により合成した。なお、このよ
うなＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列は、少なくとも
配列番号１記載のアミノ酸配列を含むものであるが、こ
の配列は、抗菌性ペプチド（ラクトフェリシン類）のコ
ード領域を含み、ラクトフェリンの鉄結合ドメインを含
まないことを特徴とする以外は特に限定されるものでは
ない。ただし、配列両端の制限酵素切断部位を除いた長
さを１８０塩基対までとすることがより望ましい。ま
た、ラクトフェリシン類をそのＮ末端またはＣ末端で適
当な蛋白質Ｐと融合体を形成する形で生産する場合は、
ラクトフェリシン類と蛋白質Ｐのそれぞれをコードする
ＤＮＡ配列の境界に適当なプロテアーゼ（トロンビン、
ファクターＸａ等）または化学物質による認識切断部位
をコードするＤＮＡ配列を予め付加する。 （２）前記（１）で合成したＤＮＡ配列の発現ベクター
への挿入 （１）の工程で合成したＤＮＡ配列を挿入するベクター
は、ラクトフェリシン類を生産させる生物種（宿主とな
る微生物等の種類）によって適宜選択される。これらの
ベクターとしては公知のプラスミドｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＫ
ＯＭ１、ｐＲＳＶＮｏｔ等が例示され、これらから常法
により誘導された各種ベクターを含む各種公知のベクタ
ーを適宜利用することができる。多くの場合、これらの
ベクターは大腸菌のシャトル・ベクターであるので、組
換えベクターの構築は、前記（１）の工程で合成したＤ
ＮＡ配列をイン・ビトロでベクターに連結し、のち一旦
大腸菌に導入することによって行うことができる。これ
により、挿入ＤＮＡ配列の塩基配列の確認、および構築
した組換えベクターの増幅・調製が容易になる。なお、
大腸菌用のベクターの構築は（１）の工程で合成したＤ
ＮＡ配列をイン・ビトロで前記大腸菌用に選択されたベ
クターに連結することのみによっても行うことができ
る。なお、使用する発現ベクターは、組み込まれたＤＮ
Ａ配列の発現に関与するプロモーターが制御されるも
の、または常に働くもののいずれでも良いが、ラクトフ
ェリシン類の発現量を考慮するならば、組み込まれたＤ
ＮＡ配列の発現に関与するプロモーターが制御されるも
のがより望ましい。また、生産されるラクトフェリシン
類が培地中に分泌されるように、組み込まれたＤＮＡ配
列からできる物質がシグナル配列を有するものであって
も良い。生産される物質の分子量が小さい場合には、発
現産物が適当な蛋白質と融合体を形成する形のものを用
いることもできる。次に、この発明の組換えベクターを
用いたラクトフェリシン類の製造方法について説明す
る。組換えベクターを用いたラクトフェリシン類の製造
は、 （１）組換えベクターを保持する形質転換体の作成 （２）前記（１）の工程で作成した形質転換体がラクト
フェリシン類を生産することの確認 （３）前記（２）の工程でラクトフェリシン類を生産す
ることが確認された形質転換体の培養 （４）前記（３）の工程で得られた培養液からのラクト
フェリシン類の精製 により行われる。次に、それぞれの手順について説明す
る。 （１）組換えベクターを保持する形質転換体の作成 組換えベクターの導入方法は、それを導入する生物種
（宿主となる微生物等の種類）によって異なる。例え
ば、宿主として大腸菌を用いる場合は常法の塩化カルシ
ウム法、酵母を用いる場合は常法のプロトプラトス法
［ＤＮＡクローニング(DNA Cloning) 、第２巻、第２５
ページ、ＩＲＬプレス(IRL Press) 、１９８５年］また
はリチウム法、動物細胞を用いる場合は、リン酸カルシ
ウム法［モレキュラー・クローニング(Molecular Cloni
ng) 、第２版、第３巻、第１６章、第３３ページ、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(C
old Spring Harbor Laboratory Press) 、１９８９年］
またはエレクトロポレーション法［モレキュラー・クロ
ーニング(Molecular Cloning) 、第２版、第３巻、第１
６章、第５４ページ、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laborato
ry Press) 、１９８９年］等を用いることができる。組
換えベクターを保持する形質転換体の選別は、使用した
ベクターが保有する選択マーカー遺伝子に基づく薬剤耐
性またはアミノ酸非要求性等の形質獲得の有無を、薬剤
添加培地またはアミノ酸非含有培地等で調べることによ
り行うことができる。 （２）（１）の工程で作成した形質転換体がラクトフェ
リシン類を生産することの確認 前記（１）で作成した形質転換体のラクトフェリシン類
生産の確認は、この形質転換体の培養上清または無細胞
抽出液を、例えば市販の抗ラクトフェリン抗体を用いて
ＥＬＩＳＡ法［生物化学実験法１５・免疫学入門、第１
５０ページ、学会出版センター、１９８３年］、ウェス
タン・ブロッティング法［モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning) 、第２版、第３巻、第１８章、第
６０ページ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s) 、１９８９年］等により調べる等して行うことがで
きる。また、生産される物質は抗菌活性を有するので、
この形質転換体の培養上清もしくは細胞抽出物中の抗菌
活性を測定することによっても確認することが可能であ
る。 （３）前記（２）の工程でラクトフェリシン類を生産す
ることが確認された形質転換体の培養 形質転換体の培養は、その生物種（宿主となる微生物等
の種類）および使用したベクターにより各々に適した方
法を用いる。例えば、組み込まれたＤＮＡ配列の発現に
関与するプロモーターが常に働くベクターを使用し、生
物種が大腸菌の場合は、形質転換体の選択に用いた薬剤
を含有する２×ＴＹ培地［１．６％バクトトリプトン、
１．０％酵母エキスおよび０．５％塩化ナトリウムから
なる。モレキュラー・クローニング (Molecular Clonin
g)、第２版、第３巻、付録Ａ、第３ページ、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス (Cold S
pring Harbor Laboratory Press)、１９８９年］等を用
いて通常３７℃で定常増殖期まで培養することにより、
ラクトフェリシン類の生産が行われる。同様のプロモー
ターが常に働くベクターを使用し、生物種がパン酵母サ
ッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)の場合は、形質転換体の選択に用いたアミノ酸または
核酸を除いた最小合成培地［０．６７％バクトイースト
ナイトロジェンベース（アミノ酸無）、２％グルコース
からなる。メソッズ・イン・エンザイモロジー (Method
s in Enzymology)、第１９４巻、第１４ページ、アカデ
ミック・プレス(Academic Press)、１９９１年］等を用
いて３０℃で定常増殖期まで培養することにより、ラク
トフェリシン類の生産が行われる。生物種が動物細胞の
場合は、１０％子牛血清および形質転換体の選択に用い
た薬剤を含有するダルベッコ改変イーグル最小培地［Ｄ
ＭＥＭ；ウイロロジー(Virology)、第８巻、第３９６ペ
ージ、１９５９年］等を用いて３７℃で３〜４日間培養
することにより、ラクトフェリシン類の生産が行われ
る。なお、組み込まれたＤＮＡ配列の発現に関与するプ
ロモーターが制御されるベクターを使用する場合には、
その制御を解除して、挿入ＤＮＡ配列を発現させるため
に、各プロモーターの性質に応じて培養温度を変化させ
るか、制御を解除する物質を添加する必要がある。例え
ば、ラムダファージ右側プロモーターならば、その誘導
（制御解除）によってラクトフェリシン類を生産させる
ためには、３０℃で初期定常増殖期まで培養し、のち培
養温度を４２℃に上昇して更に９０分間培養する必要が
あり、ラクトースプロモーターならば、その誘導（制御
解除）によってラクトフェリシン類を生産させるために
は、３７℃（酵母の場合は３０℃）で初期定常増殖期ま
で培養し、のち終濃度０．１〜１．０ｍＭのイソプロピ
ル β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して
更に４時間培養する必要がある。 （４）前記（３）の工程で得た培養液からのラクトフェ
リシン類の精製 この方法も形質転換体の作成に使用したベクターおよび
宿主により各々に適当した方法を用いる必要がある。例
えば、Ｎ末端に分泌シグナル配列を付加した形のラクト
フェリシン類を生産する組換えベクターを導入した大腸
菌からラクトフェリシン類を精製する場合には、培養液
を遠心して集菌し、ショ糖溶液に懸濁して浸透圧ショッ
クをかけ、菌体のペリプラズム中のラクトフェリシン類
を溶出させ、続いてゲル濾過または逆相クロマトグラフ
ィー等で分画精製することによってラクトフェリシン類
の精製を行う。同様のベクターを導入したS. cerevisia
e または動物細胞からラクトフェリシン類を精製する場
合には、培養液を遠心してラクトフェリシン類が分泌含
有されている培養上清を取得し、続いてゲル濾過または
逆相クロマトグラフィー等で分画精製することによって
ラクトフェリシン類を精製する。次に、Ｎ末端またはＣ
末端においてプロテアーゼまたは化学物質の認識切断部
位を介して適当な蛋白質Ｐと融合体を形成する形で生産
されるラクトフェリシン類を精製する場合には、培養液
を遠心して集菌した後、超音波やホモジェナイザーを用
いて菌体を破砕し、再び遠心してラクトフェリシン類と
蛋白質Ｐとの融合蛋白を含む無細胞抽出液を取得し、続
いてゲル濾過または蛋白質Ｐに対するアフィニティを利
用したアフィニティーカラムを用いて融合蛋白を単離し
た後、融合蛋白を、付加されているプロテアーゼもしく
は化学物質の認識切断部位に対応するプロテアーゼまた
は化学物質を用いて切断し、ラクトフェリシン類を逆相
クロマトグラフィー等で分画精製することによってラク
トフェリシン類の精製を行う。また、ベクターの形質に
よらずに、大腸菌を宿主として、ラクトフェリシン類が
大量に生産された場合には、産生した蛋白質が菌体内で
凝集して顆粒体を形成することがある。この場合には、
培養液を遠心して集菌した後、超音波やホモジェナイザ
ーを用いて菌体を破砕し、再び遠心して顆粒体を取得
し、６Ｍ塩酸グアニジンまたは８Ｍ尿素を加えて蛋白質
を可溶化した後、バッファー添加または透析等により塩
酸グアニジンまたは尿素の濃度を下げた上で、ゲル濾過
等の処理を行うことによってラクトフェリシン類を精製
することができる。次に試験例を示してこの発明をさら
に詳しく説明する。 試験例１ この試験は、ラクトフェリシン類の発現が（１）恒常的
である場合と（２）ＩＰＴＧにより制御される場合とに
おいて、発現の効率および宿主に与える影響を比較する
ために行った。後記する実施例８と同様に、後記する実
施例７で構築した動物細胞系組換えベクターｐＲＳＶＬ
Ｆがlac オペレーターを含むことを利用して実施した。
すなわち、（１）の場合には、宿主としてハムスターＣ
ＨＯ細胞を用い、この細胞にリン酸カルシウム法により
上記組換えベクターを導入し、導入後の細胞を４８時間
培養し、ラクトフェリシン類を発現させた。（２）の場
合には、予めｐ３′ＳＳを導入し、ＩＰＴＧによる制御
解除が可能なlacIリプレッサーを発現するＣＨＯ細胞を
用い、この細胞にリン酸カルシウム法によりベクターを
導入し、導入後の細胞を３６時間培養し、１ｍＭのＩＰ
ＴＧを添加して更に１２時間培養して、ラクトフェリシ
ン類を発現させた。前記（１）および（２）それぞれに
おけるラクトフェリシン類の発現量を、ニンヒドリン法
［アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical B
iochemistry ）、第４９巻、第９５ページ、１９７２
年］により測定して比較した。宿主に与える影響につい
ては、前記のとおり宿主細胞が異なる以外は、形質導入
の条件を同一として、形質導入に用いた総細胞に対する
ラクトフェリシン類発現細胞の得られる割合（形質導入
効率）を比較した。この試験の結果は表１に示すとおり
である。表１から明らかなように、動物細胞系における
ラクトフェリシン類の発現は、宿主細胞の増殖が飽和状
態に達した後に制御が開始する（２）の条件の方が、宿
主に悪影響を及ぼすことがなく、形質導入体が得られや
すく、ラクトフェリシン類の発現量も多いことが判明し
た。
【表１】 次に実施例を示してこの発明を更に詳細かつ具体的に説
明するが、この発明は以下の例に限定されるものではな
い。なお、試薬の出所について明示していない物は、全
てナカライテスク社製であり、同じ試薬が複数種ある場
合には特級を用いた。
明するが、この発明は以下の例に限定されるものではな
い。なお、試薬の出所について明示していない物は、全
てナカライテスク社製であり、同じ試薬が複数種ある場
合には特級を用いた。
実施例１（大腸菌（エシェリキア・コリ( Escherichia
coli) ）系ベクターを用いた組換えベクターの構築） （１）ラクトフェリシン類をコードするＤＮＡ配列の合
成 大腸菌によく用いられるコドンを選択使用して、ヒトラ
クトフェリン配列の一部である配列番号１記載のアミノ
酸配列を含む配列番号５記載のアミノ酸配列、およびそ
の上流に付加するプロテアーゼであるファクターＸａの
認識切断部位（配列番号７記載のアミノ酸配列）をコー
ドする配列番号８記載の核酸配列からなるＤＮＡ配列を
合成した。なお、このＤＮＡ配列には、配列番号８にも
小文字記号で示したように、５′末端に制限酵素BamHＩ
により切断されてできる配列を、また３′末端には終止
コドンおよび制限酵素HincIIにより切断されてできる配
列を付加した。このＤＮＡ配列は、自動ＤＮＡ合成機
（アプライド・バイオシステムズ社製。モデル３８１
Ａ）を用いて、ホスフォアミダイト法［テトラヘドロン
・レター(Tetrahedron Letter)、第２１巻、第７１９ペ
ージ、１９８０年］により化学的に合成した。合成は、
配列番号９記載の塩基配列を有するＥ−１〜２およびＦ
−１〜２の４本のオリゴヌヌクレオチドに分割して行
い、合成されたオリゴヌクレオチドのＣＰＧ樹脂（アプ
ライド・バイオシステムズ社）からの切り出しおよび保
護基脱離は、同社のマニュアルに従った。各オリゴヌク
レオチドの分離精製は、オリゴヌクレオチド精製カート
リッジ（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い
た。 （２）前記（１）の工程で合成したＤＮＡ配列の挿入に
よる組換えベクターの構築 前記（１）の工程で合成した配列番号９記載のオリゴヌ
クレオチド４本の内、Ｅ−２およびＦ−１各２０ｐｍｏ
ｌの５′末端をＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（東洋
紡績社製）を用いて、同社のプロトコールに従ってそれ
ぞれ別々にリン酸化し、のち９５℃で５分間加熱してＴ
４キナーゼを変性させ、１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムを加えて一旦エタノール沈殿させた。次いでＥ−２に
はＦ−２の、Ｆ−１にはＥ−１の水溶液を等モル加えて
混合し、９５℃で１５分間加熱し、徐々に冷却してアニ
ール化した。得られた２本のアニーリング体と、ＩＰＴ
Ｇによる誘導（制御解除）が可能なｔａｃプロモーター
を有し、マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子を含む
公知のプラスミドｐＧＥＸ２Ｔ（ファルマシア社製）の
BamHIおよびSmaIサイトを切断したものとを（使用した
制限酵素は全て東洋紡績社製）、ＤＮＡライゲーション
・キット（宝酒造社製）を用いて、イン・ビトロで連結
し、組換えベクターｐＧＥＸＬＦを構築した（図１参
照）。これを大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡績社製）に塩
化カルシウム法［モレキュラー・クローニング (Molecu
lar Cloning)、第２版、第１巻、第７４ページ、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス (Co
ld Spring Harbor Laboratory Press)、1989年］を用い
て導入し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン（シグマ社製）
含有ＬＢ寒天培地［１％バクトトリプトン（ディフコ社
製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、０．５％
塩化ナトリウム、１．５％寒天（ディフコ社製）］を用
いて形質転換体を選別した。その結果、ＤＮＡ１μｇ当
たり１×１０5個のコロニーが得られた。これらのう
ち、５つのクローン（ＬＦＪＭＥ１〜５株と命名した）
について、ラクトフェリシン類をコードするＤＮＡ配列
およびベクターとの接続部分の塩基配列が、所定のもの
であることをシークエナーゼ・バージョン２．０ ＤＮ
Ａシークエンシング・キット［（Sequenase Version 2.
0 DNA Sequencing Kit；ユナイテッド・ステイツ・バイ
オケミカル(United States Biochemical) 社製］を用い
て確認した。 実施例２（実施例１で作出した組換えベクターを用いた
ラクトフェリシン類の製造） （１）実施例１で作成した組換えベクターを保持する形
質転換体の作成 実施例１で得たＬＦＪＭＥ１株を５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン含有ＬＢ培地で３７℃で一晩培養し、常法のアル
カリ変性法［モレキュラー・クローニング (Molecular
Cloning)、第２版、第１巻、第１章、第２５ページ、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス
(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、１９８９
年］により、組換えベクターｐＧＥＸＬＦを増幅・調製
した。このベクターを、常法の塩化カルシウム法を用い
て大腸菌ＨＢ１０１株（東洋紡績社製）に導入し、５０
μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天培地を用いて形質
転換体を選別した結果、ＤＮＡ１μｇ当たり１×１０8
個のコロニーが得られた。これらのうち、１５のクロー
ン（ＬＦＨＢ１〜１５株と命名した。）について、アル
カリ変性法によりプラスミドＤＮＡを調製し、トリス酢
酸バッファーを用いた０．７％アガロース・ゲル電気泳
動［モレキュラー・クローニング (Molecular Clonin
g)、第２版、第１巻、第６章、第９ページ、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス (Cold S
pring Harbor Laboratory Press)、１９８９年］により
その存在を確認した。 （２）前記（１）の工程で作成した形質転換体がラクト
フェリシン類を生産することの確認 前記（１）でプラスミドの存在を確認したＬＦＨＢ１〜
１５株のうちＬＦＨＢ１〜８株を、それぞれ５ｍｌの５
０μｇ／ｍｌアンピシリン含有２×ＴＹ培地を用いて３
７℃で初期定常増殖期まで培養した後、終濃度０．１ｍ
ＭのＩＰＴＧを添加して更に４時間培養し、遠心して集
菌し、ＰＢＳバッファー［１５０ｍＭ塩化ナトリウム、
１６ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４ｍＭリン酸二水素
ナトリウム（ｐＨ７．３）］２５０μｌに懸濁し、菌体
を超音波破砕後再び遠心した結果、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ラクトフェリシン類融
合蛋白を含むと予想される顆粒体を得た。この顆粒体に
６Ｍ塩酸グアニジン−１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸
を加えて室温で２時間撹拌して蛋白質を可溶化し、ＰＢ
Ｓバッファーで５倍希釈した。ヒトラクトフェリシン類
は抗ヒトラクトフェリン抗体と免疫的に結合することが
知られているので、ウサギ抗ヒトラクトフェリン・ポリ
クローナル抗体ＩｇＧ画分（カッペル社製）とＥＬＩＳ
Ａ法［生物化学実験法１５・免疫学入門、第１５０ペー
ジ、学会出版センター、１９８３年］とを用いて、実際
に上述の顆粒体可溶化液にＧＳＴ−ラクトフェリシン類
融合蛋白が含まれていることを確認した。 （３）前記（２）の工程でラクトフェリシン類を生産す
ることが確認された形質転換体の培養 前記（２）でＧＳＴ−ラクトフェリシン類融合蛋白を生
産することが確認された形質転換体ＬＦＨＢ１〜８株の
うち、ＬＦＨＢ１株を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含
有２×ＴＹ培地により３７℃で前培養し、培養液を同一
組成の培地２ｌに１％容量添加し、５ｌの培養槽で通気
しながら３７℃で初期定常増殖期まで培養し、終濃度
０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して更に４時間培養した。 （４）前記（３）の工程で得た培養液からのラクトフェ
リシン類の精製 前記（３）の工程で得た培養液を遠心して、集菌し、１
００ｍｌのＰＢＳバッファーに懸濁した菌体を超音波破
砕し、終濃度１％のトライトンＸ−１００を加えた後１
２，０００×ｇで２０分間遠心して顆粒体を得た。この
顆粒体に２０ｍｌの６Ｍ塩酸グアニジン−１０ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸を加えて室温で２時間撹拌して蛋白
質を可溶化し、のちＰＢＳバッファーで５０倍希釈し
た。この顆粒体可溶化液を孔径０．４５μｍの無菌濾過
膜を用いて濾過し、２０ｍｌずつＰＢＳバッファーで平
衡化したゲル濾過用ＦＰＬＣカラム Superde75 HR26/60
0(ファルマシア社製。１０ｍｍ×３００ｍｍ）にかけ、
ＰＢＳバッファーを２．６ｍｌ／分の流速で流して５０
〜６０分後の溶出分画を回収し、遠心濃縮器セントリプ
レップー１０（アミコン社製）を用いて遠心濃縮した。
次に、終濃度５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）−１００ｍ
Ｍ塩化ナトリウム−１ｍＭ塩化カルシウム存在下で、蛋
白質重量に対し０．５％のファクターＸａ（ニューイン
グランド・バイオラボス社製）１．０ｍｇ／ｍｌを加え
室温で一晩かけて、ＧＳＴ−ラクトフェリシン類融合蛋
白を切断し、得られたラクトフェリシン類をシリカ系Ｔ
ＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー社製）を担体とする
逆相高速液体クロマトグラフィーにより分画精製して電
気泳動的に均一な画分（蛋白質量として約２０ｍｇ）を
得た。 実施例３（大腸菌系ベクターを用いた組換えベクターの
構築） （１）ラクトフェリシン類をコードするＤＮＡ配列の合
成 大腸菌によく用いられるコドンを選択使用して、ラクト
フェリシン類のうち、ヒトラクトフェリン配列の一部で
ある配列番号１記載のアミノ酸配列を含む配列番号６記
載のアミノ酸配列、およびその上流に付加するプロテア
ーゼであるファクターＸａの認識切断部位（配列番号７
記載のアミノ酸配列）をコードする配列番号１０記載の
ＤＮＡ配列を合成した。またこのＤＮＡ配列には、５′
末端に BalＩで切断されてできる配列を、３′末端に終
止コドンおよびBamHＩで切断されてできる配列を付加し
た。このＤＮＡ配列は、実施例１の（１）項と同様に自
動ＤＮＡ合成機を用いて化学的に合成した。合成は、配
列番号１１記載の塩基配列を有するＬ−１〜４およびＭ
−１〜４の８本のオリゴヌヌクレオチドに分割して行
い、以下実施例１の（１）項と同様にして精製した。 （２）前記（１）の工程で合成したＤＮＡ配列の挿入に
よる組換えベクターの構築 前記（１）の工程で合成した配列番号１１記載のオリゴ
ヌクレオチド８本の内、Ｌ−２、Ｌ−３、Ｌ−４、Ｍ−
１、Ｍ−２、およびＭ−３各２０ｐｍｏｌの５´末端を
実施例１の（２）項と同様にしてそれぞれ別々にリン酸
化した後、エタノール沈殿させた。次いでＬ−２にはＭ
−２の、Ｌ−３にはＭ−３の、Ｌ−４にはＭ−４の、ま
たＭ−１にはＬ−１の水溶液を等モル加えて混合し、実
施例１の（２）項と同様にしてアニール化した。得られ
た４本のアニーリング体（二本鎖ＤＮＡ断片）をＬ−１
／Ｍ−１とＬ−２／Ｍ−２、並びにＬ−３／Ｍ−３とＬ
−４／Ｍ−４の二つに分け、それぞれを実施例１の
（２）項と同じくＤＮＡライゲーション・キット（宝酒
造社製）を用いてイン・ビトロで連結した。反応終了
後、各反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度６％）により分離し、エチジウムブロマイド染色法
による泳動パターン観察結果より目的の大きさ（９３塩
基対＋２０塩基および７０塩基対＋２０塩基）のバンド
部分を切り出し、エレクトロ・エリューション法により
目的とする２本のＤＮＡ断片を回収した。回収した試料
に対してフェノール抽出を行い、エタノール沈殿により
目的のＤＮＡを精製した。得られた２種のＤＮＡ断片
と、実施例１の（２）項で用いたのと同じプラスミドｐ
ＧＥＸ２ＴのBalIおよびBamHＩサイトを切断し上述と同
様に切り出し、電気泳動によって放出される 465塩基対
のＤＮＡ断片を除いたものとを（使用した制限酵素は全
て東洋紡績社製）、実施例１の（２）項と同様にしてイ
ン・ビトロで連結し、組換えベクターｐＧＥＸＬＮＬを
構築した（図２参照）。これを実施例１の（２）項と同
様に、大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡績社製）に導入し、
得られたコロニーの内３つのクローン（ＬＮＬＥ１〜３
株と命名した。）について、塩基配列を確認した。 実施例４（実施例３で作出した組換えベクターを用いた
ラクトフェリシン類の製造） （１）実施例３で作成した組換えベクターを保持する形
質転換体の作成 実施例２の（１）項と同様にして、実施例３で得たＬＮ
ＬＥ１株から組換えベクターｐＧＥＸＬＮＬを増幅・調
製した。このベクターＤＮＡを、実施例２の（１）項と
同様にして大腸菌ＨＢ１０１株（東洋紡績社製）に導入
し、形質転換体を得た。これらのうち、１０のクローン
（ＬＮＬＨＢ１〜１０株と命名した。）について、実施
例２の（１）項と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製
し、電気泳動によりその存在を確認した。 （２）前記（１）の工程で作成した形質転換体がラクト
フェリシン類を生産することの確認 前記（１）でプラスミドの存在を確認したＬＮＬＨＢ１
〜１０株のうちＬＮＬＨＢ１〜６株について、実施例２
の（２）項と同様にしてそれらがラクトフェリシン類を
生産することを確認した。以下、実施例２と同一の方法
によりラクトフェリシン類約３５ｍｇを得た。 実施例５（酵母系ベクターを用いた組換えベクターの構
築） （１）ラクトフェリシン類をコードするＤＮＡ配列の合
成 酵母によく用いられるコドンを使用して、ヒトラクトフ
ェリン配列の一部である配列番号１記載のアミノ酸配列
を含む配列番号５記載のアミノ酸配列、およびその上流
に付加するプロテアーゼであるファクターＸａの認識切
断部位（配列番号７記載のアミノ酸配列）をコードする
配列番号１２記載のＤＮＡ配列を合成した。またこのＤ
ＮＡ配列には、５′末端にBamHＩで切断されてできる配
列を、３′末端に終止コドンおよび SalＩで切断されて
できる配列を付加した。合成は、配列番号１３で示した
塩基配列を有するＳ−１〜２およびＴ−１〜２の４本の
オリゴヌクレオチドに分割して行い、以下実施例１の
（１）項と同様の方法により行った。 （２）前記（１）の工程で合成したＤＮＡ配列の挿入に
よる組換えベクターの構築 前記（１）の工程で合成した配列番号１３記載のオリゴ
ヌクレオチド４本の内、Ｓ−２およびＴ−１各２０ｐｍ
ｏｌの５´末端を、実施例１の（２）項と同様の方法に
よりリン酸化、エタノール沈殿し、Ｓ−２にはＴ−２
の、Ｔ−１にはＳ−１の水溶液を等モル加えて混合し、
実施例１の（２）項と同様の方法によりアニール化し
た。糖源がグルコースの培地では発現せず、ガラクトー
スの培地で発現（制御解除）するＧＡＬ１プロモーター
を有し、マーカーとしてウラシル産生遺伝子を含むプラ
スミドｐＫＯＭ２の BglIIおよびSalIサイトを切断し
（使用した制限酵素は全て東洋紡績社製）、このプラス
ミドＤＮＡと、前記で得られた２本のアニーリング体と
を、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造社製）を用
いてイン・ビトロで連結し、組換えベクターｐＫＯＭＬ
Ｆを構築した（図３参照）。これを大腸菌ＪＭ１０９株
（東洋紡績社製）に実施例１の（２）項と同一の塩化カ
ルシウム法を用いて導入し、５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ン含有ＬＢ寒天培地を用いて形質転換体を選別した。そ
の結果、ＤＮＡ１μｇ当たり３×１０4個のコロニーが
得られた。これらのうち、５つのクローン（ＬＦＪＭＹ
１〜５株と命名した。）について、ラクトフェリシン類
本体およびベクターとの接続部分の塩基配列が所定の通
りであることを実施例１の（２）項と同様にシークエナ
ーゼ・バージョン2.0 ＤＮＡシークエンシング・キット
を用いて確認した。 実施例６（実施例５で作出した組換えベクターを用いた
ラクトフェリシン類の製造） （１）実施例５で作成した組換えベクターを保持する形
質転換体の作成 実施例３で得られたＬＦＪＭＹ１株から、実施例２の
（１）項と同一の方法により組換えベクターｐＫＯＭＬ
Ｆを増幅・調製した。このベクターＤＮＡを、常法のリ
チウム法［ＤＮＡクローニング (DNA Cloning)、第２
巻、第５３ページ、ＩＲＬプレス (IRL Press)、１９８
５年］を用いてサッカロミセス・セルビシエ（ S. cere
visiae）ＩＮＶＳＣ２株（インビトロゲン社製）に導入
し、ウラシル非含有最小合成培地［５０μｇ／ｍｌのＬ
−ヒスチジン、２％カザミノ酸（ディフコ社製）、０．
６７％バクトイーストナイトロジェンベース（アミノ酸
無。ディフコ社製）、２％グルコース、２％寒天（ディ
フコ社製）］を用いて３０℃で培養し、形質転換体を選
択したところ、ＤＮＡ１μｇ当たり２００個のコロニー
が得られた。 （２）前記（１）の工程で作成した形質転換体がラクト
フェリシン類を生産することの確認 前記（１）で得た形質転換体のうち１２株を選んで（Ｌ
ＦＳＣ１〜１２株と命名。）糖源を２％グルコースから
２％ラフィノースに変えたウラシル非含有最小合成培地
５ｍｌを用いて３０℃で４０時間培養し、のち終濃度３
％ガラクトースを添加してさらに８時間培養した。培養
液を遠心して集菌し、スフェロプラストバッファー（１
２．５μｇ／ｍｌザイモリアーゼ、１Ｍソルビトール、
１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＥＤＴ
Ａ）１ｍｌに懸濁し、３０℃で１時間保温してスフェロ
プラスト化し、遠心してこれを集め、ＰＢＳバッファー
［１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１６ｍＭリン酸水素二ナ
トリウム、４ｍＭリン酸二水素ナトリウム（ｐＨ７．
３）］５００μｌに再び懸濁し、スフェロプラストを超
音波破砕後再び遠心してＧＳＴ−ラクトフェリシン類融
合蛋白を含むと予想される無細胞抽出液を得た。次い
で、実施例２の（２）と同様に、ウサギ抗ヒトラクトフ
ェリン・ポリクローナル抗体IgＧ画分（カッペル社製）
とＥＬＩＳＡ法とを用いて、実際に前記無細胞抽出液に
ＧＳＴ−ラクトフェリシン類融合蛋白が含まれているこ
とを確認した。 （３）前記（２）の工程でラクトフェリシン類を生産す
ることが確認された形質転換体の培養 前記（２）でＧＳＴ−ラクトフェリシン類融合蛋白を生
産することが確認された形質転換体ＬＦＳＣ１〜１２株
のうち、ＬＦＳＣ１株を、糖源を２％グルコースから２
％ラフィノースに変えたウラシル非含有最小合成培地、
３０℃で前培養し、培養液を同一組成の培地２ｌに１％
容量添加し、５ｌの培養槽で通気しながら３０℃で６０
時間培養し、のち終濃度３％ガラクトースを添加してさ
らに１２時間培養した。 （４）前記（３）の工程で得た培養液からのラクトフェ
リシン類の精製 前記（３）の工程で得た培養液を遠心して集菌し、２０
０ｍｌのＰＢＳバッファーに混濁した菌体を超音波破砕
し、１２，０００×ｇで２０分間遠心して無細胞抽出液
を得た。この無細胞抽出液をＧＳＴのアフィニティーカ
ラムであるグルタチオンセファロース４Ｂカラム（ファ
ルマシア社製）にかけＰＢＳバッファーで洗った後、溶
出バッファー［５ｍＭ還元型グルタチオン−５０ｍＭト
リス（ｐＨ８．０）］を用いてＧＳＴ−ラクトフェリン
類融合蛋白を溶出し、実施例２の（４）項と同様に蛋白
質重量に対し０．５％のファクターＸａを加え、室温で
一晩かけて該ＧＳＴ−ラクトフェリシン類融合蛋白を切
断し、得られたラクトフェリシン類をＯＤＳ−１２０Ｔ
（東ソー社製）を担体とする逆相高速液体クロマトグラ
フィーにより分画精製し、電気泳動的に均一な画分（蛋
白質量として約４ｍｇ）を得た。 実施例７（動物細胞系ベクターを用いた組換えベクター
の構築） 実施例１で作成したｐＧＥＸＬＦを制限酵素 BalI およ
び EcoRI（使用した制限酵素は全て東洋紡績社製）で切
断して得られるＧＳＴの８１番目のメチオニン残基以降
とラクトフェリシン類（配列番号５記載のアミノ酸配列
を含む抗菌性ペプチド）との融合蛋白のコード配列を含
む５６５塩基対のＤＮＡ配列の両端をＤＮＡブランティ
ング・キット（宝酒造社製）を用いて平滑化し、ＤＮＡ
ライゲーション・キット（宝酒造社製）を用いてNotIリ
ンカー（宝酒造社製）をイン・ビトロで連結し、制限酵
素NotI（東洋紡績社製）で切断してNotIサイトを付与し
たＤＮＡ配列と、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターおよびイ
ントロン領域に lacオペレーター配列を含みマーカーと
してネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＲＳＶ
Ｎｏｔ（ストラタジーン社製）のNotIサイトを制限酵素
NotI（東洋紡績社製）により切断し、アルカリフォスフ
ァターゼ（東洋紡績社製）を用いて５´末端を脱リン酸
化したものとを、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒
造社製）を用いて、イン・ビトロで連結し、組換えベク
ターｐＲＳＶＬＦを構築した（図４参照）。これを大腸
菌ＪＭ１０９株（東洋紡績社製）に実施例１の（２）項
と同一の塩化カルシウム法により導入し、５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリン含有ＬＢ寒天培地を用いて形質転換体を
選択した。その結果、ＤＮＡ１μｇ当たり８×１０6 個
のコロニーが得られた。これらのうち、１２のクローン
（ＬＦＪＭＭ１〜１２株と命名した。）について、実施
例１の（２）項と同様の方法でプラスミドＤＮＡを調製
し、これを制限酵素NotI（東洋紡績社製）によりNotI切
断することにより挿入断片の存在を確認した。 実施例８（実施例７で作出した組換えベクターを用いた
ラクトフェリシン類の製造） （１）実施例７で作成した組換えベクターを保持する形
質転換体が生育可能であることの確認 実施例７で得たＬＦＪＭＭ１株から、実施例２の（１）
項と同様の方法により組換えベクターｐＲＳＶＬＦを増
幅・調製した。このベクターＤＮＡを、ＩＰＴＧによる
制御解除が可能なlacIリプレッサー遺伝子を保持するプ
ラスミドｐ３´ＳＳ（ストラタジーン社製）と共に、プ
ラスミドｐ３´ＳＳとｐＲＳＶＮｏｔを含むキットであ
るラック・スイッチ・インデューシブル・マンマリアン
・エクスプレッション・システム［（LAC SWITCH Induc
ible Mammalian Expression System）、ストラタジーン
社製］のプロトコール（instruction manual）に従っ
て、リン酸カルシウム法［モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning) 、第２版、第３巻、第１６章、第
３３ページ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s) 、１９８９年］を用いて、ハムスターＣＨＯ（ＣＨ
Ｏ−Ｋ１）細胞（大日本製薬社製）に導入し、培地とし
て、１０％子牛血清含有ＤＭＥＭを用いて３７℃、ＣＯ
2インキュベーター中で１８時間培養した後、培地を新
鮮なものに交換して２４時間培養し、１ｍＭのＩＰＴＧ
を添加してさらに１２時間培養した。この培養プレート
の細胞を３．７％フォルムアルデヒドで固定し［細胞工
学実験プロトコール、第２０４ページ、秀潤社、１９９
１年］、ウサギ抗ヒトラクトフェリン・ポリクローナル
抗体IgＧ画分（カッペル社製）を１次抗体として抗ウサ
ギ・イミュンブロット・キットＨＲＰ（バイオラッド社
製）を用いて免疫化学細胞染色を行った。この結果、全
細胞中６％の細胞がＧＳＴの８１番目のメチオニン残基
以降とラクトフェリシン類との融合蛋白を生産している
ことを確認した。また、このことから、融合蛋白を生産
する株が生育可能であることも確認できた。 （２）実施例７で作成した組換えベクターを保持する形
質転換体の作成 前記（１）で調製した組換えベクターｐＲＳＶＬＦを、
リン酸カルシウム法を用いて、予めストラタジーン社の
プロトコールに基づいて調製したｐ３´ＳＳを導入して
lac リプレッサーを安定的に発現するＣＨＯ細胞に導入
し、１０％子牛血清含有ＤＭＥＭを用いて３７℃、ＣＯ
2インキュベーター中で１８時間培養し、培地を１０％
子牛血清および４００μｇ／ｍｌのジェネティシン硫酸
塩（Ｇ４１８。ネオマイシンと同等の効果を有する抗生
物質）を含有するＤＭＥＭに交換し、以後この選択培地
を３日毎に交換しながら、更に２週間培養して、１２０
個のコロニーを得た。 （３）前記（２）の工程で作成した形質転換体がラクト
フェリシン類を生産するることの確認 前記（２）で得た形質転換体のうち５０株を選択して
（ＬＦＣＨＯ１〜５０株と命名。）９６穴プレートに移
して培養し、各穴の培養物の一部を別の９６穴プレート
の対応する各穴に移してレプリカプレートを作成した。
次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを添加してさらに１２時間培
養したこのレプリカプレートを前記（１）と同様に、ウ
サギ抗ヒトラクトフェリン・ポリクローナル抗体IgＧ画
分（カッペル社製）を用いて免疫化学的に細胞染色し、
６株（ＬＦＣＨＯ７株、同１３株、同１９株、同２４
株、同３９株、および同４８株）について、ＧＳＴの８
１番目のメチオニン残基以降とラクトフェリシン類との
融合蛋白を生産していることを確認した。 （４）前記（３）の工程でラクトフェリシン類を生産す
ることが確認された形質転換体の培養 前記（３）でＧＳＴの８１番目のメチオニン残基以降と
ラクトフェリシン類との融合蛋白を生産することが確認
された形質転換体６株のうち、ＬＦＣＨＯ７株を、１０
％子牛血清および４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有す
る１００ｍｌのＤＭＥＭを用い、３７℃、ＣＯ2インキ
ュベーター中で前培養し、培養液を同一組成の培地１ｌ
に１０％容量添加し、回転ボトル中で３７℃、ＣＯ2イ
ンキュベーター中で３日間培養した後、１ｍＭのＩＰＴ
Ｇを添加してさらに１２時間培養した。 （５）前記（４）の工程で得た培養液からのラクトフェ
リシン類の精製 前記（４）の工程で得た培養液を遠心して細胞を集め、
５０ｍｌのＰＢＳバッファーに懸濁した細胞を超音波破
砕し、１０，０００×ｇで２０分間遠心して無細胞抽出
液を得た。この無細胞抽出液をSephadexＧ-150（ファル
マシア社製）を担体とするゲル濾過カラム（２５ｍｍ
径、２０ｃｍ長）にかけて分画し、電気泳動パターンに
よりＧＳＴの８１番目のメチオニン残基以降とラクトフ
ェリシン類との融合蛋白を含む画分を同定した。次に、
実施例２の（４）項と同様にして蛋白質重量に対し０．
５％のファクターＸａを加え室温で一晩かけて融合蛋白
を切断し、得られたラクトフェリシン類をＯＤＳ−１２
０Ｔ（東ソー社製）を担体とする逆相高速液体クロマト
グラフィーにより分画精製して電気泳動的に均一な画分
（蛋白質量として約３ｍｇ）を得た。
coli) ）系ベクターを用いた組換えベクターの構築） （１）ラクトフェリシン類をコードするＤＮＡ配列の合
成 大腸菌によく用いられるコドンを選択使用して、ヒトラ
クトフェリン配列の一部である配列番号１記載のアミノ
酸配列を含む配列番号５記載のアミノ酸配列、およびそ
の上流に付加するプロテアーゼであるファクターＸａの
認識切断部位（配列番号７記載のアミノ酸配列）をコー
ドする配列番号８記載の核酸配列からなるＤＮＡ配列を
合成した。なお、このＤＮＡ配列には、配列番号８にも
小文字記号で示したように、５′末端に制限酵素BamHＩ
により切断されてできる配列を、また３′末端には終止
コドンおよび制限酵素HincIIにより切断されてできる配
列を付加した。このＤＮＡ配列は、自動ＤＮＡ合成機
（アプライド・バイオシステムズ社製。モデル３８１
Ａ）を用いて、ホスフォアミダイト法［テトラヘドロン
・レター(Tetrahedron Letter)、第２１巻、第７１９ペ
ージ、１９８０年］により化学的に合成した。合成は、
配列番号９記載の塩基配列を有するＥ−１〜２およびＦ
−１〜２の４本のオリゴヌヌクレオチドに分割して行
い、合成されたオリゴヌクレオチドのＣＰＧ樹脂（アプ
ライド・バイオシステムズ社）からの切り出しおよび保
護基脱離は、同社のマニュアルに従った。各オリゴヌク
レオチドの分離精製は、オリゴヌクレオチド精製カート
リッジ（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い
た。 （２）前記（１）の工程で合成したＤＮＡ配列の挿入に
よる組換えベクターの構築 前記（１）の工程で合成した配列番号９記載のオリゴヌ
クレオチド４本の内、Ｅ−２およびＦ−１各２０ｐｍｏ
ｌの５′末端をＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（東洋
紡績社製）を用いて、同社のプロトコールに従ってそれ
ぞれ別々にリン酸化し、のち９５℃で５分間加熱してＴ
４キナーゼを変性させ、１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムを加えて一旦エタノール沈殿させた。次いでＥ−２に
はＦ−２の、Ｆ−１にはＥ−１の水溶液を等モル加えて
混合し、９５℃で１５分間加熱し、徐々に冷却してアニ
ール化した。得られた２本のアニーリング体と、ＩＰＴ
Ｇによる誘導（制御解除）が可能なｔａｃプロモーター
を有し、マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子を含む
公知のプラスミドｐＧＥＸ２Ｔ（ファルマシア社製）の
BamHIおよびSmaIサイトを切断したものとを（使用した
制限酵素は全て東洋紡績社製）、ＤＮＡライゲーション
・キット（宝酒造社製）を用いて、イン・ビトロで連結
し、組換えベクターｐＧＥＸＬＦを構築した（図１参
照）。これを大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡績社製）に塩
化カルシウム法［モレキュラー・クローニング (Molecu
lar Cloning)、第２版、第１巻、第７４ページ、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス (Co
ld Spring Harbor Laboratory Press)、1989年］を用い
て導入し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン（シグマ社製）
含有ＬＢ寒天培地［１％バクトトリプトン（ディフコ社
製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、０．５％
塩化ナトリウム、１．５％寒天（ディフコ社製）］を用
いて形質転換体を選別した。その結果、ＤＮＡ１μｇ当
たり１×１０5個のコロニーが得られた。これらのう
ち、５つのクローン（ＬＦＪＭＥ１〜５株と命名した）
について、ラクトフェリシン類をコードするＤＮＡ配列
およびベクターとの接続部分の塩基配列が、所定のもの
であることをシークエナーゼ・バージョン２．０ ＤＮ
Ａシークエンシング・キット［（Sequenase Version 2.
0 DNA Sequencing Kit；ユナイテッド・ステイツ・バイ
オケミカル(United States Biochemical) 社製］を用い
て確認した。 実施例２（実施例１で作出した組換えベクターを用いた
ラクトフェリシン類の製造） （１）実施例１で作成した組換えベクターを保持する形
質転換体の作成 実施例１で得たＬＦＪＭＥ１株を５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン含有ＬＢ培地で３７℃で一晩培養し、常法のアル
カリ変性法［モレキュラー・クローニング (Molecular
Cloning)、第２版、第１巻、第１章、第２５ページ、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス
(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、１９８９
年］により、組換えベクターｐＧＥＸＬＦを増幅・調製
した。このベクターを、常法の塩化カルシウム法を用い
て大腸菌ＨＢ１０１株（東洋紡績社製）に導入し、５０
μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天培地を用いて形質
転換体を選別した結果、ＤＮＡ１μｇ当たり１×１０8
個のコロニーが得られた。これらのうち、１５のクロー
ン（ＬＦＨＢ１〜１５株と命名した。）について、アル
カリ変性法によりプラスミドＤＮＡを調製し、トリス酢
酸バッファーを用いた０．７％アガロース・ゲル電気泳
動［モレキュラー・クローニング (Molecular Clonin
g)、第２版、第１巻、第６章、第９ページ、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス (Cold S
pring Harbor Laboratory Press)、１９８９年］により
その存在を確認した。 （２）前記（１）の工程で作成した形質転換体がラクト
フェリシン類を生産することの確認 前記（１）でプラスミドの存在を確認したＬＦＨＢ１〜
１５株のうちＬＦＨＢ１〜８株を、それぞれ５ｍｌの５
０μｇ／ｍｌアンピシリン含有２×ＴＹ培地を用いて３
７℃で初期定常増殖期まで培養した後、終濃度０．１ｍ
ＭのＩＰＴＧを添加して更に４時間培養し、遠心して集
菌し、ＰＢＳバッファー［１５０ｍＭ塩化ナトリウム、
１６ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４ｍＭリン酸二水素
ナトリウム（ｐＨ７．３）］２５０μｌに懸濁し、菌体
を超音波破砕後再び遠心した結果、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ラクトフェリシン類融
合蛋白を含むと予想される顆粒体を得た。この顆粒体に
６Ｍ塩酸グアニジン−１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸
を加えて室温で２時間撹拌して蛋白質を可溶化し、ＰＢ
Ｓバッファーで５倍希釈した。ヒトラクトフェリシン類
は抗ヒトラクトフェリン抗体と免疫的に結合することが
知られているので、ウサギ抗ヒトラクトフェリン・ポリ
クローナル抗体ＩｇＧ画分（カッペル社製）とＥＬＩＳ
Ａ法［生物化学実験法１５・免疫学入門、第１５０ペー
ジ、学会出版センター、１９８３年］とを用いて、実際
に上述の顆粒体可溶化液にＧＳＴ−ラクトフェリシン類
融合蛋白が含まれていることを確認した。 （３）前記（２）の工程でラクトフェリシン類を生産す
ることが確認された形質転換体の培養 前記（２）でＧＳＴ−ラクトフェリシン類融合蛋白を生
産することが確認された形質転換体ＬＦＨＢ１〜８株の
うち、ＬＦＨＢ１株を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含
有２×ＴＹ培地により３７℃で前培養し、培養液を同一
組成の培地２ｌに１％容量添加し、５ｌの培養槽で通気
しながら３７℃で初期定常増殖期まで培養し、終濃度
０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して更に４時間培養した。 （４）前記（３）の工程で得た培養液からのラクトフェ
リシン類の精製 前記（３）の工程で得た培養液を遠心して、集菌し、１
００ｍｌのＰＢＳバッファーに懸濁した菌体を超音波破
砕し、終濃度１％のトライトンＸ−１００を加えた後１
２，０００×ｇで２０分間遠心して顆粒体を得た。この
顆粒体に２０ｍｌの６Ｍ塩酸グアニジン−１０ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸を加えて室温で２時間撹拌して蛋白
質を可溶化し、のちＰＢＳバッファーで５０倍希釈し
た。この顆粒体可溶化液を孔径０．４５μｍの無菌濾過
膜を用いて濾過し、２０ｍｌずつＰＢＳバッファーで平
衡化したゲル濾過用ＦＰＬＣカラム Superde75 HR26/60
0(ファルマシア社製。１０ｍｍ×３００ｍｍ）にかけ、
ＰＢＳバッファーを２．６ｍｌ／分の流速で流して５０
〜６０分後の溶出分画を回収し、遠心濃縮器セントリプ
レップー１０（アミコン社製）を用いて遠心濃縮した。
次に、終濃度５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）−１００ｍ
Ｍ塩化ナトリウム−１ｍＭ塩化カルシウム存在下で、蛋
白質重量に対し０．５％のファクターＸａ（ニューイン
グランド・バイオラボス社製）１．０ｍｇ／ｍｌを加え
室温で一晩かけて、ＧＳＴ−ラクトフェリシン類融合蛋
白を切断し、得られたラクトフェリシン類をシリカ系Ｔ
ＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー社製）を担体とする
逆相高速液体クロマトグラフィーにより分画精製して電
気泳動的に均一な画分（蛋白質量として約２０ｍｇ）を
得た。 実施例３（大腸菌系ベクターを用いた組換えベクターの
構築） （１）ラクトフェリシン類をコードするＤＮＡ配列の合
成 大腸菌によく用いられるコドンを選択使用して、ラクト
フェリシン類のうち、ヒトラクトフェリン配列の一部で
ある配列番号１記載のアミノ酸配列を含む配列番号６記
載のアミノ酸配列、およびその上流に付加するプロテア
ーゼであるファクターＸａの認識切断部位（配列番号７
記載のアミノ酸配列）をコードする配列番号１０記載の
ＤＮＡ配列を合成した。またこのＤＮＡ配列には、５′
末端に BalＩで切断されてできる配列を、３′末端に終
止コドンおよびBamHＩで切断されてできる配列を付加し
た。このＤＮＡ配列は、実施例１の（１）項と同様に自
動ＤＮＡ合成機を用いて化学的に合成した。合成は、配
列番号１１記載の塩基配列を有するＬ−１〜４およびＭ
−１〜４の８本のオリゴヌヌクレオチドに分割して行
い、以下実施例１の（１）項と同様にして精製した。 （２）前記（１）の工程で合成したＤＮＡ配列の挿入に
よる組換えベクターの構築 前記（１）の工程で合成した配列番号１１記載のオリゴ
ヌクレオチド８本の内、Ｌ−２、Ｌ−３、Ｌ−４、Ｍ−
１、Ｍ−２、およびＭ−３各２０ｐｍｏｌの５´末端を
実施例１の（２）項と同様にしてそれぞれ別々にリン酸
化した後、エタノール沈殿させた。次いでＬ−２にはＭ
−２の、Ｌ−３にはＭ−３の、Ｌ−４にはＭ−４の、ま
たＭ−１にはＬ−１の水溶液を等モル加えて混合し、実
施例１の（２）項と同様にしてアニール化した。得られ
た４本のアニーリング体（二本鎖ＤＮＡ断片）をＬ−１
／Ｍ−１とＬ−２／Ｍ−２、並びにＬ−３／Ｍ−３とＬ
−４／Ｍ−４の二つに分け、それぞれを実施例１の
（２）項と同じくＤＮＡライゲーション・キット（宝酒
造社製）を用いてイン・ビトロで連結した。反応終了
後、各反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度６％）により分離し、エチジウムブロマイド染色法
による泳動パターン観察結果より目的の大きさ（９３塩
基対＋２０塩基および７０塩基対＋２０塩基）のバンド
部分を切り出し、エレクトロ・エリューション法により
目的とする２本のＤＮＡ断片を回収した。回収した試料
に対してフェノール抽出を行い、エタノール沈殿により
目的のＤＮＡを精製した。得られた２種のＤＮＡ断片
と、実施例１の（２）項で用いたのと同じプラスミドｐ
ＧＥＸ２ＴのBalIおよびBamHＩサイトを切断し上述と同
様に切り出し、電気泳動によって放出される 465塩基対
のＤＮＡ断片を除いたものとを（使用した制限酵素は全
て東洋紡績社製）、実施例１の（２）項と同様にしてイ
ン・ビトロで連結し、組換えベクターｐＧＥＸＬＮＬを
構築した（図２参照）。これを実施例１の（２）項と同
様に、大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡績社製）に導入し、
得られたコロニーの内３つのクローン（ＬＮＬＥ１〜３
株と命名した。）について、塩基配列を確認した。 実施例４（実施例３で作出した組換えベクターを用いた
ラクトフェリシン類の製造） （１）実施例３で作成した組換えベクターを保持する形
質転換体の作成 実施例２の（１）項と同様にして、実施例３で得たＬＮ
ＬＥ１株から組換えベクターｐＧＥＸＬＮＬを増幅・調
製した。このベクターＤＮＡを、実施例２の（１）項と
同様にして大腸菌ＨＢ１０１株（東洋紡績社製）に導入
し、形質転換体を得た。これらのうち、１０のクローン
（ＬＮＬＨＢ１〜１０株と命名した。）について、実施
例２の（１）項と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製
し、電気泳動によりその存在を確認した。 （２）前記（１）の工程で作成した形質転換体がラクト
フェリシン類を生産することの確認 前記（１）でプラスミドの存在を確認したＬＮＬＨＢ１
〜１０株のうちＬＮＬＨＢ１〜６株について、実施例２
の（２）項と同様にしてそれらがラクトフェリシン類を
生産することを確認した。以下、実施例２と同一の方法
によりラクトフェリシン類約３５ｍｇを得た。 実施例５（酵母系ベクターを用いた組換えベクターの構
築） （１）ラクトフェリシン類をコードするＤＮＡ配列の合
成 酵母によく用いられるコドンを使用して、ヒトラクトフ
ェリン配列の一部である配列番号１記載のアミノ酸配列
を含む配列番号５記載のアミノ酸配列、およびその上流
に付加するプロテアーゼであるファクターＸａの認識切
断部位（配列番号７記載のアミノ酸配列）をコードする
配列番号１２記載のＤＮＡ配列を合成した。またこのＤ
ＮＡ配列には、５′末端にBamHＩで切断されてできる配
列を、３′末端に終止コドンおよび SalＩで切断されて
できる配列を付加した。合成は、配列番号１３で示した
塩基配列を有するＳ−１〜２およびＴ−１〜２の４本の
オリゴヌクレオチドに分割して行い、以下実施例１の
（１）項と同様の方法により行った。 （２）前記（１）の工程で合成したＤＮＡ配列の挿入に
よる組換えベクターの構築 前記（１）の工程で合成した配列番号１３記載のオリゴ
ヌクレオチド４本の内、Ｓ−２およびＴ−１各２０ｐｍ
ｏｌの５´末端を、実施例１の（２）項と同様の方法に
よりリン酸化、エタノール沈殿し、Ｓ−２にはＴ−２
の、Ｔ−１にはＳ−１の水溶液を等モル加えて混合し、
実施例１の（２）項と同様の方法によりアニール化し
た。糖源がグルコースの培地では発現せず、ガラクトー
スの培地で発現（制御解除）するＧＡＬ１プロモーター
を有し、マーカーとしてウラシル産生遺伝子を含むプラ
スミドｐＫＯＭ２の BglIIおよびSalIサイトを切断し
（使用した制限酵素は全て東洋紡績社製）、このプラス
ミドＤＮＡと、前記で得られた２本のアニーリング体と
を、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造社製）を用
いてイン・ビトロで連結し、組換えベクターｐＫＯＭＬ
Ｆを構築した（図３参照）。これを大腸菌ＪＭ１０９株
（東洋紡績社製）に実施例１の（２）項と同一の塩化カ
ルシウム法を用いて導入し、５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ン含有ＬＢ寒天培地を用いて形質転換体を選別した。そ
の結果、ＤＮＡ１μｇ当たり３×１０4個のコロニーが
得られた。これらのうち、５つのクローン（ＬＦＪＭＹ
１〜５株と命名した。）について、ラクトフェリシン類
本体およびベクターとの接続部分の塩基配列が所定の通
りであることを実施例１の（２）項と同様にシークエナ
ーゼ・バージョン2.0 ＤＮＡシークエンシング・キット
を用いて確認した。 実施例６（実施例５で作出した組換えベクターを用いた
ラクトフェリシン類の製造） （１）実施例５で作成した組換えベクターを保持する形
質転換体の作成 実施例３で得られたＬＦＪＭＹ１株から、実施例２の
（１）項と同一の方法により組換えベクターｐＫＯＭＬ
Ｆを増幅・調製した。このベクターＤＮＡを、常法のリ
チウム法［ＤＮＡクローニング (DNA Cloning)、第２
巻、第５３ページ、ＩＲＬプレス (IRL Press)、１９８
５年］を用いてサッカロミセス・セルビシエ（ S. cere
visiae）ＩＮＶＳＣ２株（インビトロゲン社製）に導入
し、ウラシル非含有最小合成培地［５０μｇ／ｍｌのＬ
−ヒスチジン、２％カザミノ酸（ディフコ社製）、０．
６７％バクトイーストナイトロジェンベース（アミノ酸
無。ディフコ社製）、２％グルコース、２％寒天（ディ
フコ社製）］を用いて３０℃で培養し、形質転換体を選
択したところ、ＤＮＡ１μｇ当たり２００個のコロニー
が得られた。 （２）前記（１）の工程で作成した形質転換体がラクト
フェリシン類を生産することの確認 前記（１）で得た形質転換体のうち１２株を選んで（Ｌ
ＦＳＣ１〜１２株と命名。）糖源を２％グルコースから
２％ラフィノースに変えたウラシル非含有最小合成培地
５ｍｌを用いて３０℃で４０時間培養し、のち終濃度３
％ガラクトースを添加してさらに８時間培養した。培養
液を遠心して集菌し、スフェロプラストバッファー（１
２．５μｇ／ｍｌザイモリアーゼ、１Ｍソルビトール、
１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＥＤＴ
Ａ）１ｍｌに懸濁し、３０℃で１時間保温してスフェロ
プラスト化し、遠心してこれを集め、ＰＢＳバッファー
［１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１６ｍＭリン酸水素二ナ
トリウム、４ｍＭリン酸二水素ナトリウム（ｐＨ７．
３）］５００μｌに再び懸濁し、スフェロプラストを超
音波破砕後再び遠心してＧＳＴ−ラクトフェリシン類融
合蛋白を含むと予想される無細胞抽出液を得た。次い
で、実施例２の（２）と同様に、ウサギ抗ヒトラクトフ
ェリン・ポリクローナル抗体IgＧ画分（カッペル社製）
とＥＬＩＳＡ法とを用いて、実際に前記無細胞抽出液に
ＧＳＴ−ラクトフェリシン類融合蛋白が含まれているこ
とを確認した。 （３）前記（２）の工程でラクトフェリシン類を生産す
ることが確認された形質転換体の培養 前記（２）でＧＳＴ−ラクトフェリシン類融合蛋白を生
産することが確認された形質転換体ＬＦＳＣ１〜１２株
のうち、ＬＦＳＣ１株を、糖源を２％グルコースから２
％ラフィノースに変えたウラシル非含有最小合成培地、
３０℃で前培養し、培養液を同一組成の培地２ｌに１％
容量添加し、５ｌの培養槽で通気しながら３０℃で６０
時間培養し、のち終濃度３％ガラクトースを添加してさ
らに１２時間培養した。 （４）前記（３）の工程で得た培養液からのラクトフェ
リシン類の精製 前記（３）の工程で得た培養液を遠心して集菌し、２０
０ｍｌのＰＢＳバッファーに混濁した菌体を超音波破砕
し、１２，０００×ｇで２０分間遠心して無細胞抽出液
を得た。この無細胞抽出液をＧＳＴのアフィニティーカ
ラムであるグルタチオンセファロース４Ｂカラム（ファ
ルマシア社製）にかけＰＢＳバッファーで洗った後、溶
出バッファー［５ｍＭ還元型グルタチオン−５０ｍＭト
リス（ｐＨ８．０）］を用いてＧＳＴ−ラクトフェリン
類融合蛋白を溶出し、実施例２の（４）項と同様に蛋白
質重量に対し０．５％のファクターＸａを加え、室温で
一晩かけて該ＧＳＴ−ラクトフェリシン類融合蛋白を切
断し、得られたラクトフェリシン類をＯＤＳ−１２０Ｔ
（東ソー社製）を担体とする逆相高速液体クロマトグラ
フィーにより分画精製し、電気泳動的に均一な画分（蛋
白質量として約４ｍｇ）を得た。 実施例７（動物細胞系ベクターを用いた組換えベクター
の構築） 実施例１で作成したｐＧＥＸＬＦを制限酵素 BalI およ
び EcoRI（使用した制限酵素は全て東洋紡績社製）で切
断して得られるＧＳＴの８１番目のメチオニン残基以降
とラクトフェリシン類（配列番号５記載のアミノ酸配列
を含む抗菌性ペプチド）との融合蛋白のコード配列を含
む５６５塩基対のＤＮＡ配列の両端をＤＮＡブランティ
ング・キット（宝酒造社製）を用いて平滑化し、ＤＮＡ
ライゲーション・キット（宝酒造社製）を用いてNotIリ
ンカー（宝酒造社製）をイン・ビトロで連結し、制限酵
素NotI（東洋紡績社製）で切断してNotIサイトを付与し
たＤＮＡ配列と、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターおよびイ
ントロン領域に lacオペレーター配列を含みマーカーと
してネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＲＳＶ
Ｎｏｔ（ストラタジーン社製）のNotIサイトを制限酵素
NotI（東洋紡績社製）により切断し、アルカリフォスフ
ァターゼ（東洋紡績社製）を用いて５´末端を脱リン酸
化したものとを、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒
造社製）を用いて、イン・ビトロで連結し、組換えベク
ターｐＲＳＶＬＦを構築した（図４参照）。これを大腸
菌ＪＭ１０９株（東洋紡績社製）に実施例１の（２）項
と同一の塩化カルシウム法により導入し、５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリン含有ＬＢ寒天培地を用いて形質転換体を
選択した。その結果、ＤＮＡ１μｇ当たり８×１０6 個
のコロニーが得られた。これらのうち、１２のクローン
（ＬＦＪＭＭ１〜１２株と命名した。）について、実施
例１の（２）項と同様の方法でプラスミドＤＮＡを調製
し、これを制限酵素NotI（東洋紡績社製）によりNotI切
断することにより挿入断片の存在を確認した。 実施例８（実施例７で作出した組換えベクターを用いた
ラクトフェリシン類の製造） （１）実施例７で作成した組換えベクターを保持する形
質転換体が生育可能であることの確認 実施例７で得たＬＦＪＭＭ１株から、実施例２の（１）
項と同様の方法により組換えベクターｐＲＳＶＬＦを増
幅・調製した。このベクターＤＮＡを、ＩＰＴＧによる
制御解除が可能なlacIリプレッサー遺伝子を保持するプ
ラスミドｐ３´ＳＳ（ストラタジーン社製）と共に、プ
ラスミドｐ３´ＳＳとｐＲＳＶＮｏｔを含むキットであ
るラック・スイッチ・インデューシブル・マンマリアン
・エクスプレッション・システム［（LAC SWITCH Induc
ible Mammalian Expression System）、ストラタジーン
社製］のプロトコール（instruction manual）に従っ
て、リン酸カルシウム法［モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning) 、第２版、第３巻、第１６章、第
３３ページ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s) 、１９８９年］を用いて、ハムスターＣＨＯ（ＣＨ
Ｏ−Ｋ１）細胞（大日本製薬社製）に導入し、培地とし
て、１０％子牛血清含有ＤＭＥＭを用いて３７℃、ＣＯ
2インキュベーター中で１８時間培養した後、培地を新
鮮なものに交換して２４時間培養し、１ｍＭのＩＰＴＧ
を添加してさらに１２時間培養した。この培養プレート
の細胞を３．７％フォルムアルデヒドで固定し［細胞工
学実験プロトコール、第２０４ページ、秀潤社、１９９
１年］、ウサギ抗ヒトラクトフェリン・ポリクローナル
抗体IgＧ画分（カッペル社製）を１次抗体として抗ウサ
ギ・イミュンブロット・キットＨＲＰ（バイオラッド社
製）を用いて免疫化学細胞染色を行った。この結果、全
細胞中６％の細胞がＧＳＴの８１番目のメチオニン残基
以降とラクトフェリシン類との融合蛋白を生産している
ことを確認した。また、このことから、融合蛋白を生産
する株が生育可能であることも確認できた。 （２）実施例７で作成した組換えベクターを保持する形
質転換体の作成 前記（１）で調製した組換えベクターｐＲＳＶＬＦを、
リン酸カルシウム法を用いて、予めストラタジーン社の
プロトコールに基づいて調製したｐ３´ＳＳを導入して
lac リプレッサーを安定的に発現するＣＨＯ細胞に導入
し、１０％子牛血清含有ＤＭＥＭを用いて３７℃、ＣＯ
2インキュベーター中で１８時間培養し、培地を１０％
子牛血清および４００μｇ／ｍｌのジェネティシン硫酸
塩（Ｇ４１８。ネオマイシンと同等の効果を有する抗生
物質）を含有するＤＭＥＭに交換し、以後この選択培地
を３日毎に交換しながら、更に２週間培養して、１２０
個のコロニーを得た。 （３）前記（２）の工程で作成した形質転換体がラクト
フェリシン類を生産するることの確認 前記（２）で得た形質転換体のうち５０株を選択して
（ＬＦＣＨＯ１〜５０株と命名。）９６穴プレートに移
して培養し、各穴の培養物の一部を別の９６穴プレート
の対応する各穴に移してレプリカプレートを作成した。
次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを添加してさらに１２時間培
養したこのレプリカプレートを前記（１）と同様に、ウ
サギ抗ヒトラクトフェリン・ポリクローナル抗体IgＧ画
分（カッペル社製）を用いて免疫化学的に細胞染色し、
６株（ＬＦＣＨＯ７株、同１３株、同１９株、同２４
株、同３９株、および同４８株）について、ＧＳＴの８
１番目のメチオニン残基以降とラクトフェリシン類との
融合蛋白を生産していることを確認した。 （４）前記（３）の工程でラクトフェリシン類を生産す
ることが確認された形質転換体の培養 前記（３）でＧＳＴの８１番目のメチオニン残基以降と
ラクトフェリシン類との融合蛋白を生産することが確認
された形質転換体６株のうち、ＬＦＣＨＯ７株を、１０
％子牛血清および４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有す
る１００ｍｌのＤＭＥＭを用い、３７℃、ＣＯ2インキ
ュベーター中で前培養し、培養液を同一組成の培地１ｌ
に１０％容量添加し、回転ボトル中で３７℃、ＣＯ2イ
ンキュベーター中で３日間培養した後、１ｍＭのＩＰＴ
Ｇを添加してさらに１２時間培養した。 （５）前記（４）の工程で得た培養液からのラクトフェ
リシン類の精製 前記（４）の工程で得た培養液を遠心して細胞を集め、
５０ｍｌのＰＢＳバッファーに懸濁した細胞を超音波破
砕し、１０，０００×ｇで２０分間遠心して無細胞抽出
液を得た。この無細胞抽出液をSephadexＧ-150（ファル
マシア社製）を担体とするゲル濾過カラム（２５ｍｍ
径、２０ｃｍ長）にかけて分画し、電気泳動パターンに
よりＧＳＴの８１番目のメチオニン残基以降とラクトフ
ェリシン類との融合蛋白を含む画分を同定した。次に、
実施例２の（４）項と同様にして蛋白質重量に対し０．
５％のファクターＸａを加え室温で一晩かけて融合蛋白
を切断し、得られたラクトフェリシン類をＯＤＳ−１２
０Ｔ（東ソー社製）を担体とする逆相高速液体クロマト
グラフィーにより分画精製して電気泳動的に均一な画分
（蛋白質量として約３ｍｇ）を得た。
【発明の効果】以上、詳しく説明したとおり、この発明
によって、抗菌性ペプチド（ラクトフェリシン類）をコ
ードするＤＮＡ配列を挿入結合した組換えベクターと、
この組換えベクターを保持する形質転換体、およびこの
形質転換体によるラクトフェリシン類の製造方法が提供
される。これによって天然型ラクトフェリンに比して優
れて高い抗菌性を有するラクトフェリシン類を、安価か
つ簡便に大量供給することが可能となる。
によって、抗菌性ペプチド（ラクトフェリシン類）をコ
ードするＤＮＡ配列を挿入結合した組換えベクターと、
この組換えベクターを保持する形質転換体、およびこの
形質転換体によるラクトフェリシン類の製造方法が提供
される。これによって天然型ラクトフェリンに比して優
れて高い抗菌性を有するラクトフェリシン類を、安価か
つ簡便に大量供給することが可能となる。
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチドおよびこのペプチドをフラグ
メントとして含むペプチド。下記配列においてX01 はL-
アラニン残基，L-アルギニン残基、L-アスパラギン残
基、L-アスパラギン酸残基、L-システイン残基、L-グル
タミン残基、L-グルタミン酸残基、L-グリシン残基、L-
ヒスチジン残基、L-イソロイシン残基、L-ロイシン残
基、L-リジン残基、L-メチオニン残基、L-フェニルアラ
ニン残基、L-プロリン残基、L-セリン残基、L-スレオニ
ン残基、L-トリプトファン残基、L-チロシン残基または
L-バリン残基を示し、X02 はL-アルギニン残基またはL-
リジン残基を示す。 配列番号：２ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：Homo（ヒト） 配列番号：３ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：Bos （ウシ） 配列番号：４ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：Mus （マウス） 配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：Homo（ヒト） 配列 Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly 1 5 10 15 Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser 20 25 配列番号：６ 配列の長さ：５４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：Homo（ヒト） 配列 Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser Gln Pro 1 5 10 15 Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val 20 25 30 Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln 35 40 45 Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg 50 配列番号：７ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Glu Gly Arg 1 配列番号：８ 配列の長さ：９０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列 ↓ 60 gatccATCGAAGGTC GTACTAAATG CTTCCAGTGG CAGCGTAACA TGCGTAAAGT ACGTGGTCCG gTAGCTTCCAG CATGATTTAC GAAGGTCACC GTCGCATTGT ACGCATTTCA TGCACCAGGC BamHI ↑ 90 CCGGTTTCTT GCATCAAACG TGACTCCTAAgtc GGCCAAAGAA CGTAGTTTGC ACTGAGGATTcag HincII ［注１］↓又は↑：オリゴヌクレオチド作成のための切
断位置 ［注２］制限酵素名：プラスミドベクターへの連結のた
めに設けた制限酵素切断部位に作用する制限酵素名 ［注３］英小文字：プラスミドベクターへの連結のため
に設けた制限酵素切断部位（塩基配列） 配列番号：９ 配列の長さ：３５（Ｅ−１）、６３（Ｅ−２）、５４
（Ｆ−１）、４０（Ｆ−２） 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列 Ｅ−１5´-GATCC ATCGAAGGTC GTACTAAATG CTTCCAGTGG -3 ´ ２ CAGCGTAACA TGCGTAAAGT ACGTGGTCCG CCGGTTTCTT GCATCAAACG TGACTCCTAA GTC Ｆ−１3´-G TAGCTTCCAG CATGATTTAC GAAGGTCACC GTCGCATTGT ACGCATTTCA TGC-5 ´ ２ ACCAGGC GGCCAAAGAA CGTAGTTTGC ACTGAGGATTCAG 配列番号：１０ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列 ↓ 60 ccaTCATCGAAGG TCGTGGCCGT CGTCGTCGTT CTGTTCAGTG GTGCGCAGTA TCCCAGCCGG ggtAGTAGCTTCC AGCACCGGCA GCAGCAGCAA GACAAGTCAC CACGCGTCAT AGGGTCGGCC BalI ↑ ↓ 120 AAGCTACCAA ATGCTTCCAG TGGCAGCGTA ACATGCGTAA AGTACGTGGC CCGCCGGTTT TTCGATGGTT TACGAAGGTC ACCGTCGCAT TGTACGCATT TCATGCACCG GGCGGCCAAA ↑ ↓ 180 CTTGCATCAA ACGTGACTCC CCGATCCAGT GTATCCAGGC AATCGCGGAA AACCGTTAAg GAACGTAGTT TGCACTGAGG GGCTAGGTCA CATAGGACCG TTAGCGCCTT TTGGCAATTcctag ↑ BamHI ［注１］↓又は↑：オリゴヌクレオチド作成のための切
断位置 ［注２］制限酵素名：プラスミドベクターへの連結のた
めに設けた制限酵素切断部位に作用する制限酵素名 ［注３］英小文字：プラスミドベクターへの連結のため
に設けた制限酵素切断部位（塩基配列） 配列番号：１１ 配列の長さ：４３（Ｌ−１）、５０（Ｌ−２）、５０
（Ｌ−３）、４０（Ｌ−４）、６３（Ｍ−１）、５０
（Ｍ−２）、５０（Ｍ−３）、２４（Ｍ−４） 配列
の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列 Ｌ−１5´-CCA TCATCGAAGG TCGTGGCCGT CGTCGTCGTT CTGTTCAGTG -3 ´ ２ GTGCGCAGTA TCCCAGCCGG AAGCTACCAA ATGCTTCCAG TGGCAGCGTA ３ ACATGCGTAA AGTACGTGGC CCGCCGGTTT CTTGCATCAA ACGTGACTCC ４ CCGATCCAGT GTATCCAGGC AATCGCGGAA AACCGTTAAG Ｍ−１3´-GGT AGTAGCTTCC AGCACCGGCA GCAGCAGCAA GACAAGTCAC CACGCGTCAT AGGGTCGGCC -5 ´ ２ TTCGATGGTT TACGAAGGTC ACCGTCGCAT TGTACGCATT TCATGCACCG ３ GGCGGCCAAA GAACGTAGTT TGCACTGAGG GGCTAGGTCA CATAGGACCG ４ TTAGCGCCTT TTGGCAATTC CTAG 配列番号：１２ 配列の長さ：９０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列 ↓ 60 gatccATCGAAGGTA GAACTAAGTG TTTCCAATGG CAAAGAAACA TGAGAAAGGT TAGAGGTCCA gTAGCTTCCAT CTTGATTCAC AAAGGTTACC GTTTCTTTGT ACTCTTTCCT ATCTCCAGGT BamHI ↑ 90 CCAGTTTCTT GTATCAAGAG AGACTCCTAAg GGTCAAAGAA CATAGTTCTC TCTGAGGATTcagct SalI ［注１］↓又は↑：オリゴヌクレオチド作成のための切
断位置 ［注２］制限酵素名：プラスミドベクターへの連結のた
めに設けた制限酵素切断部位に作用する制限酵素名 ［注３］英小文字：プラスミドベクターへの連結のため
に設けた制限酵素切断部位（塩基配列） 配列番号：１３ 配列の長さ：３５（Ｓ−１）、６１（Ｓ−２）、５４
（Ｔ−１）、４２（Ｔ−２） 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列 Ｓ−１5´-GATCC ATCGAAGGTA GAACTAAGTG TTTCCAATGG -3 ´ ２ CAAAGAAACA TGAGAAAGGT TAGAGGTCCA CCAGTTTCTT GTATCAAGAG AGACTCCTAA G Ｔ−１3´-G TAGCTTCCAT CTTGATTCAC AAAGGTTACC GTTTCTTTGT ACTCTTTCCT ATC-5 ´ ２ TCCAGGT GGTCAAAGAA CATAGTTCTC TCTGAGGATT CAGCT
メントとして含むペプチド。下記配列においてX01 はL-
アラニン残基，L-アルギニン残基、L-アスパラギン残
基、L-アスパラギン酸残基、L-システイン残基、L-グル
タミン残基、L-グルタミン酸残基、L-グリシン残基、L-
ヒスチジン残基、L-イソロイシン残基、L-ロイシン残
基、L-リジン残基、L-メチオニン残基、L-フェニルアラ
ニン残基、L-プロリン残基、L-セリン残基、L-スレオニ
ン残基、L-トリプトファン残基、L-チロシン残基または
L-バリン残基を示し、X02 はL-アルギニン残基またはL-
リジン残基を示す。 配列番号：２ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：Homo（ヒト） 配列番号：３ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：Bos （ウシ） 配列番号：４ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：Mus （マウス） 配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：Homo（ヒト） 配列 Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly 1 5 10 15 Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser 20 25 配列番号：６ 配列の長さ：５４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：Homo（ヒト） 配列 Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser Gln Pro 1 5 10 15 Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val 20 25 30 Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln 35 40 45 Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg 50 配列番号：７ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Glu Gly Arg 1 配列番号：８ 配列の長さ：９０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列 ↓ 60 gatccATCGAAGGTC GTACTAAATG CTTCCAGTGG CAGCGTAACA TGCGTAAAGT ACGTGGTCCG gTAGCTTCCAG CATGATTTAC GAAGGTCACC GTCGCATTGT ACGCATTTCA TGCACCAGGC BamHI ↑ 90 CCGGTTTCTT GCATCAAACG TGACTCCTAAgtc GGCCAAAGAA CGTAGTTTGC ACTGAGGATTcag HincII ［注１］↓又は↑：オリゴヌクレオチド作成のための切
断位置 ［注２］制限酵素名：プラスミドベクターへの連結のた
めに設けた制限酵素切断部位に作用する制限酵素名 ［注３］英小文字：プラスミドベクターへの連結のため
に設けた制限酵素切断部位（塩基配列） 配列番号：９ 配列の長さ：３５（Ｅ−１）、６３（Ｅ−２）、５４
（Ｆ−１）、４０（Ｆ−２） 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列 Ｅ−１5´-GATCC ATCGAAGGTC GTACTAAATG CTTCCAGTGG -3 ´ ２ CAGCGTAACA TGCGTAAAGT ACGTGGTCCG CCGGTTTCTT GCATCAAACG TGACTCCTAA GTC Ｆ−１3´-G TAGCTTCCAG CATGATTTAC GAAGGTCACC GTCGCATTGT ACGCATTTCA TGC-5 ´ ２ ACCAGGC GGCCAAAGAA CGTAGTTTGC ACTGAGGATTCAG 配列番号：１０ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列 ↓ 60 ccaTCATCGAAGG TCGTGGCCGT CGTCGTCGTT CTGTTCAGTG GTGCGCAGTA TCCCAGCCGG ggtAGTAGCTTCC AGCACCGGCA GCAGCAGCAA GACAAGTCAC CACGCGTCAT AGGGTCGGCC BalI ↑ ↓ 120 AAGCTACCAA ATGCTTCCAG TGGCAGCGTA ACATGCGTAA AGTACGTGGC CCGCCGGTTT TTCGATGGTT TACGAAGGTC ACCGTCGCAT TGTACGCATT TCATGCACCG GGCGGCCAAA ↑ ↓ 180 CTTGCATCAA ACGTGACTCC CCGATCCAGT GTATCCAGGC AATCGCGGAA AACCGTTAAg GAACGTAGTT TGCACTGAGG GGCTAGGTCA CATAGGACCG TTAGCGCCTT TTGGCAATTcctag ↑ BamHI ［注１］↓又は↑：オリゴヌクレオチド作成のための切
断位置 ［注２］制限酵素名：プラスミドベクターへの連結のた
めに設けた制限酵素切断部位に作用する制限酵素名 ［注３］英小文字：プラスミドベクターへの連結のため
に設けた制限酵素切断部位（塩基配列） 配列番号：１１ 配列の長さ：４３（Ｌ−１）、５０（Ｌ−２）、５０
（Ｌ−３）、４０（Ｌ−４）、６３（Ｍ−１）、５０
（Ｍ−２）、５０（Ｍ−３）、２４（Ｍ−４） 配列
の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列 Ｌ−１5´-CCA TCATCGAAGG TCGTGGCCGT CGTCGTCGTT CTGTTCAGTG -3 ´ ２ GTGCGCAGTA TCCCAGCCGG AAGCTACCAA ATGCTTCCAG TGGCAGCGTA ３ ACATGCGTAA AGTACGTGGC CCGCCGGTTT CTTGCATCAA ACGTGACTCC ４ CCGATCCAGT GTATCCAGGC AATCGCGGAA AACCGTTAAG Ｍ−１3´-GGT AGTAGCTTCC AGCACCGGCA GCAGCAGCAA GACAAGTCAC CACGCGTCAT AGGGTCGGCC -5 ´ ２ TTCGATGGTT TACGAAGGTC ACCGTCGCAT TGTACGCATT TCATGCACCG ３ GGCGGCCAAA GAACGTAGTT TGCACTGAGG GGCTAGGTCA CATAGGACCG ４ TTAGCGCCTT TTGGCAATTC CTAG 配列番号：１２ 配列の長さ：９０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列 ↓ 60 gatccATCGAAGGTA GAACTAAGTG TTTCCAATGG CAAAGAAACA TGAGAAAGGT TAGAGGTCCA gTAGCTTCCAT CTTGATTCAC AAAGGTTACC GTTTCTTTGT ACTCTTTCCT ATCTCCAGGT BamHI ↑ 90 CCAGTTTCTT GTATCAAGAG AGACTCCTAAg GGTCAAAGAA CATAGTTCTC TCTGAGGATTcagct SalI ［注１］↓又は↑：オリゴヌクレオチド作成のための切
断位置 ［注２］制限酵素名：プラスミドベクターへの連結のた
めに設けた制限酵素切断部位に作用する制限酵素名 ［注３］英小文字：プラスミドベクターへの連結のため
に設けた制限酵素切断部位（塩基配列） 配列番号：１３ 配列の長さ：３５（Ｓ−１）、６１（Ｓ−２）、５４
（Ｔ−１）、４２（Ｔ−２） 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列 Ｓ−１5´-GATCC ATCGAAGGTA GAACTAAGTG TTTCCAATGG -3 ´ ２ CAAAGAAACA TGAGAAAGGT TAGAGGTCCA CCAGTTTCTT GTATCAAGAG AGACTCCTAA G Ｔ−１3´-G TAGCTTCCAT CTTGATTCAC AAAGGTTACC GTTTCTTTGT ACTCTTTCCT ATC-5 ´ ２ TCCAGGT GGTCAAAGAA CATAGTTCTC TCTGAGGATT CAGCT
【図１】プラスミドｐＧＥＸＬＦの構築のフロー・シー
トを示す。
トを示す。
【図２】プラスミドｐＧＥＸＬＮＬの構築のフロー・シ
ートを示す。
ートを示す。
【図３】プラスミドｐＫＯＭＬＦの構築のフロー・シー
トを示す。
トを示す。
【図４】プラスミドｐＲＳＶＬＦの構築のフロー・シー
トを示す。
トを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/79 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/19 8828−4Ｂ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 児島 友子 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社食品総合研究所内
Claims (21)
- 【請求項１】 ベクターに少なくとも配列番号１記載の
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入結合した組
換えベクター。 - 【請求項２】 ベクターの発現制御配列下流に少なくと
も配列番号１記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列を挿入結合した組換えベクター。 - 【請求項３】 ベクターが、大腸菌系ベクターであり、
大腸菌において複製および発現する請求項１または２の
組換えベクター。 - 【請求項４】 ベクターが、酵母系シャトルベクターで
あり、酵母および大腸菌において複製し、かつ酵母にお
いて発現する請求項１または２の組換えベクター。 - 【請求項５】 ベクターが、動物細胞系シャトルベクタ
ーであり、動物細胞および大腸菌において複製し、かつ
動物細胞において発現する請求項１または２の組換えベ
クター。 - 【請求項６】 大腸菌系ベクターｐＧＥＸ２Ｔのｔａｃ
プロモーター配列下流に配列番号５記載のアミノ酸配列
をコードとするＤＮＡ配列を挿入結合した組換えベクタ
ーｐＧＥＸＬＦ。 - 【請求項７】 大腸菌系ベクターｐＧＥＸ２Ｔのｔａｃ
プロモーター配列下流に配列番号６記載のアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ配列を挿入結合した組換えベクター
ｐＧＥＸＬＮＬ。 - 【請求項８】 酵母系シャトルベクターｐＫＯＭ２のＧ
ＡＬ１プロモーター配列下流に配列番号５記載のアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入結合した組換えベ
クターｐＫＯＭＬＦ。 - 【請求項９】 動物系シャトルベクターｐＲＳＶＮｏｔ
のＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター配列下流に配列番号５記
載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入結合し
た組換えベクターｐＲＳＶＬＦ。 - 【請求項１０】 ベクターに少なくとも配列番号１記載
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入結合した
組換えベクターを保持する形質転換体。 - 【請求項１１】 ベクターに少なくとも配列番号１記載
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入結合した
組換えベクターを保持し、このベクターの挿入ＤＮＡ配
列に対する発現制御能を有する形質転換体。 - 【請求項１２】 ベクターの発現制御配列下流に少なく
とも配列番号１記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列を挿入結合した組換えベクターを保持する形質転換
体。 - 【請求項１３】 形質転換体が、大腸菌、酵母または動
物細胞である請求項１０、１１、または１２の形質転換
体。 - 【請求項１４】 ベクターに少なくとも配列番号１記載
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入結合した
組換えベクターを保持する形質転換体を培養し、配列番
号１記載のアミノ酸配列を含むペプチドを採取すること
を特徴とする抗菌性ペプチドの製造方法。 - 【請求項１５】 ベクターに少なくとも配列番号１記載
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入結合した
組換えベクターを保持し、このベクターの挿入ＤＮＡ配
列に対する発現制御能を有する形質転換体を培養し、次
いでその発現制御を解除して形質転換体を培養し、配列
番号１記載のアミノ酸配列を含むペプチドを採取するこ
とを特徴とする抗菌性ペプチドの製造方法。 - 【請求項１６】 ベクターの発現制御配列下流に少なく
とも配列番号１記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列を挿入結合した組換えベクターを保持する形質転換
体を培養し、次いでその発現制御能を解除して形質転換
体を培養し、配列番号１記載のアミノ酸配列を含むペプ
チドを採取することを特徴とする抗菌性ペプチドの製造
方法。 - 【請求項１７】 形質転換体が、大腸菌、酵母または動
物細胞である請求項１４、１５、または１６の抗菌性ペ
プチドの製造方法。 - 【請求項１８】 大腸菌ベクターｐＧＥＸ２Ｔのｔａｃ
プロモーター配列下流に配列番号５記載のアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ配列を挿入結合した組換えベクター
ｐＧＥＸＬＦを保持するエシェリキア・コリ(Escherich
ia coli)の形質転換体を培養し、次いでＩＰＴＧの添加
によりその発現制御を解除して形質転換体を培養し、配
列番号５記載のアミノ酸配列を含むペプチドを採取する
ことを特徴とする抗菌性ペプチドの製造方法。 - 【請求項１９】 大腸菌系ベクターｐＧＥＸ２Ｔのｔａ
ｃプロモーター配列下流に配列番号６記載のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ配列を挿入結合した組換えベクタ
ーｐＧＥＸＬＮＬを保持するエシェリキア・コリ（Esch
erichia coli）の形質転換体を培養し、次いでＩＰＴＧ
の添加によりその発現制御を解除して形質転換体を培養
し、配列番号６記載のアミノ酸配列を含むペプチドを採
取することを特徴とする抗菌性ペプチドの製造方法。 - 【請求項２０】 酵母系シャトルベクターｐＫＯＭ２の
ＧＡＬ１プロモーター配列下流に配列番号５記載のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入結合した組換え
ベクターｐＫＯＭＬＦを保持するサッカロミセス・セル
ビシェ（Saccharomyces cerevisiae) の形質転換体を培
養し、次いでガラクトースの添加によりその発現制御を
解除して形質転換体を培養し、配列番号５記載のアミノ
酸配列を含むペプチドを採取することを特徴とする抗菌
性ペプチドの製造方法。 - 【請求項２１】 動物系シャトルベクターｐＲＳＶＮｏ
ｔのＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター配列下流に配列番号５
記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入結合
した組換えベクターｐＲＳＶＬＦを保持し、かつこのベ
クターの挿入ＤＮＡ配列の発現を制御するlacIリプレッ
サー配列を含むプラスミドｐ３′ＳＳを保持するハムス
ターＣＨＯ細胞の形質転換体を培養し、次いでＩＰＴＧ
の添加によりその発現制御を解除して形質転換体を培養
し、配列番号５記載のアミノ酸配列を含むペプチドを採
取することを特徴とする抗菌性ペプチドの製造方法。
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|---|---|---|---|
| JP08524494A JP3529423B2 (ja) | 1994-04-01 | 1994-04-01 | 抗菌性ペプチドの製造方法 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998006860A1 (en) * | 1996-08-14 | 1998-02-19 | Novartis Ag | Peptide with inhibitory activity towards plant pathogenic fungi |
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-
1994
- 1994-04-01 JP JP08524494A patent/JP3529423B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| US7803757B2 (en) | 1998-07-06 | 2010-09-28 | Pharmasurgics In Sweden Ab | Peptides based on the sequence of human lactoferrin and their use |
| WO2009050279A1 (en) | 2007-10-19 | 2009-04-23 | Pharmasurgics In Sweden Ab | Peptides based on the sequence of human lactoferrin and their use |
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| WO2012101157A1 (en) | 2011-01-26 | 2012-08-02 | Pharmasurgics In Sweden Ab | Human lactoferrin derived peptides and there use |
| WO2012101156A2 (en) | 2011-01-26 | 2012-08-02 | Pharmasurgics In Sweden Ab | New synthetic peptides and their use |
| US8846608B2 (en) | 2011-01-26 | 2014-09-30 | Pergamum Ab | Human lactoferrin derived peptides and their use |
| US9132165B2 (en) | 2011-01-26 | 2015-09-15 | Pergamum Ab | Synthetic peptides and their use |
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