HU217102B - Tisztított neurotróf faktor és eljárás előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya ciliáris neűrőtróf faktőr (CNTF) és eljáráselőállítására rekőmbináns DNS-módszerrel, valamint az előállítőttrekőmbináns CNTF tisztítása. A nagy mennyiségben előállítőttrekőmbináns neűrőtróf faktőr biőlógiai aktivitása megegyezik azeredeti főrrásból izőláltéval. A CNTF klónőzását egy új tisztításieljárás teszi lehetővé, amelynek segítségével a nyersidegsejtkivőnatból 25 000- szeresen tisztítőtt CNTF-et lehetelőállítani, amely preparátűm már csak egyetlen fehérjét tartalmaz. ŕ

Description

A jelen találmány tárgyai neurotróf faktorok, elsősorban a ciliáris neurotróf faktor (CNTF), valamint eljárás a CNTF tisztítására és a rekombináns CNTF előállítására.

Számos lelki és fizikai rokkantság származik az idegrendszerben lévő ideg- vagy gliasejtek elpusztulásából. Az ideg- vagy gliasejtek pusztulását okozhatják neurodegeneratív betegségek, például az Alzheimer-kór, a Parkinson-kór és a szklerózis multiplex, okozhatja trombózisból származó iszkémiás állapot, traumás sérülés vagy a természetes öregedési folyamat.

A neurotróf faktorok olyan molekulaosztályba tartoznak, amelyek elősegítik az ideg- vagy gliasejtek túlélését és funkcionális aktivitását. Létezik olyan bizonyíték, amely azt sugallja, hogy a neurotróf faktorok hasznosak lehetnek a fentiekben felsorolt állapotok következtében beálló ideg- vagy gliasejtek pusztulás, illetve helytelen működés megelőzését szolgáló kezelésben [Appel, Ann. Neurology, 10,499 (1981)].

A neurotróf faktorok közül a legjobban jellemzett az idegnövekedési faktor (NGF). Az NGF-ről igazolták, hogy az Alzheimer-betegség és az öregedés következtében elpusztuló előagy kolinerg idegsejtjeinek neurotróf faktora. Ezeknek az idegsejteknek az elvesztését tekintik általában felelősnek az Alzheimer-betegség és az öregedés következtében a megismerő-, észlelőképességben bekövetkező hiányosságokért.

Az állatokkal végzett kísérletek igazolták, hogy az NGF megelőzi az előagy kolinerg idegsejtjeinek pusztulását a traumás sérülések után, és az NGF képes megfordítani a felismerőképességben az öregedéssel beálló változásokat [Hefti and Weiner, Ann. Neurology, 20, 275 (1986); Fischer et al., Natúré, 329, 65 (1987)]. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy ennek a neurotróf faktornak potenciális klinikai alkalmazására van lehetőség emberekben az előagy kolinerg idegsejtjeinek betegség, sérülés vagy öregedés következtében beálló pusztulásából eredő, a megismerő-, észlelőképességben bekövetkező kezelésében.

A neurotróf faktorok alkalmazásának komplikációját jelenti, hogy az idegsejteknek csak ahhoz a szubpopulációjához rendelkeznek specifitással, amelyek a megfelelő membránreceptorokkal rendelkeznek. A sejtben a legtöbb idegsejtből hiányoznak az NGF-receptorok, és látszólag nem reagálnak erre a neurotróf faktorra. Ezért kritikus fontossága van annak, hogy új neurotróf faktorokat fedezzünk fel, amelyek támogatják a különböző típusú ideg- vagy gliasejteknek a túlélését.

Új neurotróf faktorokat azon az alapon keresnek, hogy képesek olyan idegsejtek túlélését biztosítani tenyészetben, amelyek nem reagálnak az NGF-re. Egy széles körben alkalmazott vizsgálati módszert azon az alapon terveztek meg, hogy olyan faktorokat fedezzenek fel, amelyek a váz- és sima izomzatot beidegző ciliáris motomeuronok túlélését segítik elő. Ezek a ciliáris ganglion idegsejtek a paraszimpatikus idegrendszerhez tartoznak, és túlélésüket az NGF nem támogatja.

A ciliáris ganglion ídegsejtek túlélését elősegítő faktorok jelenlétét számos szövetben és fajban leírták. Ezek közül a ciliáris ganglion neutrotróf aktivitások közül számos rendelkezik az alábbi hasonló kémiai és biológiai tulajdonságokkal:

1. az aktivitás az ülőidegben van jelen nagy koncentrációban;

2. a neurotróf-akti vitás kibírja, ha az ionos detergens (SDS) és redukáló ágens β-merkapto-etanol (BME) vagy ditiotreitol hatásának tesszük ki elektroforézis során SDS-poliakrilamid redukáló gélben; és

3. az ilyen gélben az aktivitás 24-28 kD látszólagos molekulasúllyal vándorol [Collins, Developmental Biology, 109, 255-258 (1985); Manthorpe et al., Brain Research, 367,282-286 (1986)].

Ezen hasonló tulajdonságok alapján azt javasolták, hogy az azonos vagy szoros rokonságban lévő molekulák, tipikusan „ciliáris neurotróf faktor” vagy (CNTF) néven hivatkoznak rájuk, a felelősek a ciliáris ganglion neurotróf aktivitásért. Tehát a CNTF szakkifejezés egy olyan definíció, amely olyan, a fenti tulajdonságokkal rendelkező ágensekre vonatkozik, amelyek elősegítik a ciliáris ganglion idegsejtek túlélését tenyészetekben. Mivel nincs elegendő adat ahhoz, hogy megállapítsuk, hogy az ezekért az aktivitásokért felelős fehérjék azonosak, ezért a CNTF-eket a szövet- és fajspecifitásuk alapján különböztetjük meg. így, ha a használt faj nyúl, akkor a nevezéktan szerint a nyúlülőideg CNTF (nyúl SN-CNTF).

Az ülőideg CNTF-et látszólag a perifériális idegekben, például az ülőidegekben találjuk legnagyobb koncentrációban. A sejtekből az idegekbe sérülés hatására kerül ki. Az SN-CNTF támogatja az összes vizsgált perifériális idegrendszeri idegsejt túlélését és növekedését, beleértve az érzékelő, a szimpatikus és paraszimpatikus idegsejteket is. így az SN-CNTF szélesebb idegsejtválaszt vált ki, mint az NGF. Egy patkány SN-CNTF-ről mostanában mutatták ki, hogy a központi idegrendszerben szabályozza specifikus típusú gliasejtek képződését [Hughes et al., Natúré, 335,70 (1988)].

A fentiekben említett bizonyítékok alapján az a legésszerűbb hipotézis, hogy az ülőideg SN-CNTF az idegrendszer sérülésre adott válaszának egy komponense. Egy sérült ideg sejtjeiből kibocsátott SN-CNTF-ről elvárható, hogy elősegíti a sérült idegsejtek túlélését és újranövését, és szabályozza a gliasejteknek a regenerálódáshoz szükséges funkcionális aktivitását. Ezek a megfontolások azt mutatják, hogy az SN-CNTF terápiás értékkel is rendelkezhet, az idegrendszer betegség vagy sérülés következtében beálló rongálódásának csökkentésében.

Annak ellenére, hogy az SN-CNTF széles körű tudományos érdeklődést váltott ki, a megfelelő mennyiségű anyag természetes forrásból való tisztításának nehézsége és a humán-SN-CNTF hozzáférhetetlensége gátolta azokat a kísérleteket, amelyeknek az volt a célja, hogy demonstrálja az anyag értékét az idegsejtek életképességének betegség vagy sérülés során való fenntartásában. Patkány-SN-CNTF tisztítására tett korai kísérletek eredményeként a specifikus aktivitás szempontjából sikerült egy 800-szoros dúsítást elérni egy nyers idegkivonatból [Matnhorpe et al., Brain Research, 367, 282-286 (1986)].

HU 217 102 Β

A nyolcszázszoros specifikus aktivitásnövekedés azonban nem bizonyult elegendőnek ahhoz, hogy egyetlen fehérjét kapjunk. A Manthorpe és munkatársai által leírt módszerrel tisztított, megnövekedett specifikus aktivitást mutató termék nem elég tiszta, mivel több fehérjét tartalmaz. Arra lenne szükség, hogy az SN-CNTFnek olyan mértékű tisztítását érjük el, hogy egyetlen, a megfelelő biológiai aktivitással rendelkező fehérjét kapjunk. Ha egyszer egy ilyen fehéijét kapunk, akkor a szekvenálással kapott adatok sokkal pontosabbak lesznek, Az „egyetlen fehérje” szakkifejezés alatt a továbbiakban és a mellékelt igénypontokban olyan polipeptidet vagy polipeptidsorozatot értünk, amely azonos aminosavszekvenciával rendelkezik az aktív helyén. Más szóval, ha kettő vagy több polipeptidnél az operatív rész aminosavszekvenciája azonos, akkor a fenti definíció szerint „egyetlen fehérjének” minősülnek, még ha a hosszukat vagy töltésüket illetően van is bennük minimális heterogenitás.

A jelen találmány egyik tárgya javított eljárás SN-CNTF tisztítására.

A jelen találmány másik tárgya olyan, eddig még el nem ért mértékben tisztított SN-CNTF, amely egyetlen fehérjéből áll.

A találmány tárgya továbbá olyan próbák készítése, amelyek megkönnyítik a cDNS és genomiális könyvtárak átvizsgálását, abból a célból, hogy SN-CNTF-et kódoló állati vagy emberi géneket tudjunk klónozni.

A találmány tárgya továbbá az állati és emberi CNTF-nek megfelelő nukleinsav- és aminosavszekvencia előállítása.

A találmány tárgya továbbá rekombináns expressziós rendszer előállítása, amelyben az állati vagy emberi CNTF fehérjét kódoló nukleinsavszekvenciát lehet használni állati vagy emberi CNTF előállítására.

Ezeket és a további célokat úgy érhetjük el, hogy olyan módszert alkalmazunk, amellyel nyers kivonathoz képest 25 000-szeres specifikus aktivitású CNTF-et állítunk elő. A több mint 25 000-szeres aktivitású SN-CNTF is a találmány részét képezi.

A jelen találmány szerinti néhány előnyös megvalósítási mód szerint SN-CNTF-próbákat állítunk elő, cDNS és genomiális könyvtárak SN-CNTF-szekvenciák után való átvizsgálása céljából.

A jelen találmány egyes előnyös megvalósítási módjainak más előnyös jellemzői szerint nyúl- és emberi CNTF aminosav- és nukleinsavszekvenciákat adunk meg.

A jelen találmány egyes előnyös megvalósítási módjainak más előnyös jellemzői szerint egy rekombináns expressziós rendszert adunk meg, amellyel biológiailag aktív állati vagy humán CNTF előállítására képes.

A jelen találmány egyes előnyös megvalósítási módjainak más előnyös jellemzői szerint az SN-CNTF tisztítására adunk meg eljárást, amely a következő lépésekből áll: savas kezelés, ammónium-szulfátos frakcionálás, kromatofokuszálás, a preparátum SDS-poliakrilamid gélen való futtatása és fordított fázisú HPLC.

A jelen találmány egyes előnyös megvalósítási módjainak más előnyös jellemzői szerint további tisztítási lépéseket adunk meg, amelyekben hidrofób interakciós kromatográfiát alkalmazunk közvetlenül a kromatofokuszálás előtt és után.

Nyilvánvaló, hogy mind az előző általános leírás, mind az alábbi részletes leírás csak példa értékű, és nem jelenti az igénypontok szerinti találmány korlátozását. A kísérő ábrák, amelyek a szabadalmi leírás részét képezik, a találmány egyes megvalósítási módjait illusztrálják, és a leírással együtt szolgálják a találmány elvének magyarázatát.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábrán láthatjuk a Mono-P-oszlopon végzett kromatográfia eredményeit.

A 2. ábrán láthatjuk az SDS-poliakrilamid gélelektroforézis után kapott hét csík neurotróf aktivitása változásának ábrázolását az eluátumban.

A 3. ábrán láthatjuk a fordított fázisú kromatográfia eredményeit.

A 4. ábrán láthatjuk az ezüsttel festett SDS-poliakrilamid gél eredményeit, amelyeket a 3. ábrán bemutatott neurotróf aktivitási csíkot és a szomszédos frakciókat tartalmazó mintákról kaptunk.

Az 5. ábrán láthatjuk az eluált peptidek endoproteáz Asp-N-nel való emésztése után kapott profilját.

A 6. ábrán láthatjuk az eluált peptidek endoproteáz Lys-C-vel való emésztése után kapott profilját,

A 7. ábrán láthatjuk az ammónium-szulfát-ffakció fenil-Sepharose HlC-oszlopon végzett kromatografálásának eredményeit.

A 8. ábrán láthatjuk a Mono-P kromatofokuszált frakció alkil-Superose FPLC-HIC-oszlopon végzett kromatografálásának eredményeit.

A 9. ábrán láthatjuk a preparatív SDS-poliakrilamid frakció C8 fordított fázisú HPLC-oszlopon végzett kromatografálásának eredményeit. Az A panelen láthatjuk az eredeti tisztítási eljárással kapott eredményeket. A B panelen láthatjuk a jelenlegi tisztítási eljárással kapott eredményeket, a két HIC kromatográfiás lépés hozzáadása után.

A 10. ábrán láthatjuk a fordított fázisban tisztított SN-CNTF SDS-poliakrilamid és Westem-blot elemzésének eredményeit. Mindkét panelben az 1-es csík tartalmazza a fehérjemolekulasúly-standardokat (SIGMA SDS-7). A 2-es csík tartalmazza a tisztított SN-CNTFet. Az A panelen láthatók az ezüstfestés eredményei. A B panelen láthatók az affinitástisztított anti-peptid-A antitesttel végzett Westem-blot eredményei.

A 11. ábrán láthatjuk a nyúl SN-CNTF-et kódoló nukleinsavszekvenciát. Ennek a nukleinsavszekvenciának a transzlációjával kapjuk a megfelelő aminosavszekvenciát, amelyet alulra írtunk egybetűs kódot használva. Az aláhúzott szekvenciákat az SN-CNTF fehéije aminosavszekvenciájának meghatározásával megerősítettük.

A 12. ábrán láthatjuk a humán CNTF-et kódoló nukleinsav és a megfelelő aminosav szekvenciáját. A humán szekvenciák a vonalak között vannak. Ahol a nyúlnukleinsav-, illetve aminosavszekvencia különbözik az emberétől, ott az eltérést alulra, illetve felülre íijuk.

A 13. ábrán láthatjuk a pCMVXVPL2 expressziós vektor előállítását.

HU 217 102 Β

A 14. ábrán láthatjuk a CNTF expresszálására használt CNTF-Synl/3 készítését. Az ábra nem mérethelyes. A részletes kísérleti eredmények a 7. példában találhatók.

A 15. ábrán láthatjuk a CNTF expresszálására használt CNTF-Syn2/3 készítését. Az ábra nem mérethelyes. A részletes kísérleti eredmények a 7. példában találhatók.

A 16. ábrán láthatjuk a CNTF-Synl/3 és CNTF-Syn2/3 készítésénél használt 1-4. szintetikus oligonukleotidokat.

A 17. ábrán láthatjuk a CNTF-Syn2/3 készítésénél használt 5-10. szintetikus oligonukleotidokat.

A 18. ábrán láthatjuk a pT5T bakteriális expressziós vektor bizonyos tulajdonságait, amely vektor a CNTF expresszálására alkalmas DNS-inszertet tartalmaz. Az ábra nem mérethelyes. A részletes kísérleti eredmények a 7. példában találhatók.

A 19. ábrán láthatjuk a pT3XI-2 bakteriális expressziós vektor bizonyos tulajdonságait, amely vektor a CNTF expresszálására alkalmas DNS-inszertet tartalmaz. Az ábra nem mérethelyes. A részletes kísérleti eredmények a 7. példában találhatók.

A 20. ábrán egy SDS-poliakrilamid-redukáló gélt látunk, amelyben a különböző expressziós konstrukciókkal transzformált sejtek kivonatait elektroforetizáltuk és Coomassie Blue-val festettük.

A 21. ábrán egy SDS-poliakrilamid-redukáló gélt látunk, amelyben a különböző expressziós konstrukciókkal transzformált sejtek kivonatait elektroforetizáltuk és immunoblottoltuk affinitás-tisztított anti-CNTF peptid A antitesttel.

A 22. ábrán a pT5T:CNTF-Synl/3 vagy pT3XI-2:CNTF-Syn2/3 konstrukciót expresszáló baktériumsejtek felülúszóiból készített sorozathígítások biológiai vizsgálatát látjuk. Az ábra a pT5T:CNTF-Synl/3 felülúszó redukáló SDS-poliakrilamid gélben készült csíkjai extraktumának biológiai vizsgálatát mutatja, közvetlenül a gél 24 kD tartománya fölött és alatt.

Az előnyös megvalósítási mód leírása

Az alábbiakban részletesen hivatkozunk a jelen találmány előnyös megvalósítási módjaira, amelyek a példákkal együtt a találmány elveinek magyarázatát szolgálják.

Amint az előzőekben említettük, a jelen találmány tárgya egy SN-CNTF, amelyet egy nyers kivonatból legalább 25 000-szeres töménységűre tisztítottunk. Ez az SN-CNTF egyetlen fehérje az előzőekben ismertetett meghatározás szerint. Mint egyetlen fehérjemolekulának, az SN-CNTF-nek meghatározható az aminosavszekvenciája, és DNS-próbák tervezésére használható, amelyeket genomiális vagy cDNS-klónok előállítására használunk az SN-CNTF rekombináns előállítása céljából.

Az SN-CNTF-nek mint egyetlen fehérjének az aminosavszekvenciáját részlegesen meghatároztuk. A szekvencia az alábbi: -I-R-S-D—L-T-A— L-T-E-S-Y-V-K-H-Q-G-L-N-K-N D-G-V-P-M-A-G

K-L-W-G-L-K.

A többi aminosavszekvenciát a 2. példában előállított tisztított nyúl-SN-CNTF-ből határoztuk meg. Ez a további aminosavszekvencia lehetővé teszi, hogy a fentiekben megadott néhány aminosavszekvenciát egyetlen nagy peptidben helyezzük el (2. példa). Ezt az egyetlen peptidszekvenciát használtuk arra, hogy három degenerált oligonukleotidpróbát (#1, 13 és 7 a 4. példában) állítsunk elő, amelyek nagyon hasznosak a polimeráz láncreakció indítómolekuláiként, mivel egymáshoz viszonyított helyzetük ismert.

A nyúl- és humán CNTF-et kódoló nukleinsav(mRNS-ekvivalens) szekvenciákat meghatároztuk, és a 11., valamint a 12. ábrán mutatjuk be.

A biológiailag aktív CNTF időleges expressziójához egy rekombináns expressziós rendszert fejlesztettünk ki, ezt az 5. példában közöljük.

Emellett a jelen találmány tárgya javított eljárás SN-CNTF tisztítására. Jóllehet a jelen találmány tárgya bármely forrásból származó SN-CNTF, az alábbi leírásban a nyálból izolált SN-CNTF-ről lesz szó.

Röviden, a jelen módszer egy előnyös megvalósítási módja szerint porított nyúlülőideget használunk kiindulási anyagként. A nyers extraktumot ezután centrifugáljuk. A felülúszót savanyítjuk, majd a keletkező csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszót ezután NaOH-dal titráljuk, és a keletkező csapadékot ismét centrifugálással távolítjuk el.

A pH-kicsapások után telített ammónium-szulfát-oldatot adunk a felülúszóhoz, majd a csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. Ammónium-szulfátnak a felülúszóhoz való további hozzáadásával az SN-CNTF legnagyobb részét tartalmazó fehéijeffakció-csapadékot kapunk.

A fenti preparátumot Mono-P kromatofokuszáló FPLC-oszlopra visszük. Az oszlopfrakciókat gyűjtjük és vizsgáljuk a pH-jukat és a CNTF-aktivitásukat. Az 1. ábrán jelzett, csúcs SN-CNTF aktivitással rendelkező frakciókat az alábbiakban ismertetett módon kezeljük tovább.

A Mono-P-oszlopon többszöri futtatással kapott fókuszált frakciókat SDS-poliakrilamid lapgélen elektroforetizáljuk. A 22-27 kD mólsúlytartománynak megfelelő géltartományt a gél teljes hosszában kivágjuk és több csíkra vágjuk. Az egyes csíkokat még kisebb darabokra vágjuk, és a fehérjéket elektroforetikusan eluáljuk. Az eluált fehérjéket összegyűjtjük, majd a legmagasabb aktivitással rendelkező frakciót fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk. Ezt az eljárást az alábbi példákban részletesebben ismertetjük.

Emellett a jelen találmány olyan további lépésekre is vonatkozik, amelyek beépíthetők a fenti tisztítási eljárásba, hogy lehetővé tegyük több kiindulási anyag kényelmes feldolgozását. Ezen további lépések egy előnyös megvalósítási mód szerint magukban foglalják egy hidrofób kölcsönhatásos, fenil-Sepharose-on végzett kromatográfiás lépés beiktatását az ammónium-szulfátos frakcionálás és a kromatofokuszálás közé, míg egy FPLC alkil-Superose-oszlopon végzett hidrofób interakciós kromatografálást iktatunk a kromatofokuszálás és a preparatív SDS-poliakrilamid gélelektroforézis közé (1. példa).

HU 217 102 Β

A jelen találmány szerinti módszerrel olyan SN-CNTF-et állítunk elő tisztított formában, amelynek a specifikus aktivitása 25 000-szeresre nőtt a nyers kivonathoz viszonyítva. Emellett a végtermék egyetlen fehéijét tartalmaz. Ez egy több mint 30-szoros növekedést jelent az SN-CNTF-hez viszonyítva, amely többféle fehérjét tartalmaz, amint azt a fentiekben ismertetett, Manthorpe és munkatársai által közölt tisztítási eljárással kaptak. Mivel az SN-CNTF részlegesen inaktiválódik a fordított fázisú HPLC-n, a jelen találmány szerint számított legalább 25 000-szeres tisztítás egy maximális tisztítást jelent, a valódi tisztítás 100 000-szeres vagy még nagyobb lehet. Ez a megnövekedett tisztítási fok megkönnyíti az SN-CNTF aminosavszekvenciájának meghatározását. A jelen találmány szerint elegendő aminosavszekvenciát sikerült meghatározni ahhoz, hogy oligonukleotid-próbákat állítsunk elő, amelyek megkönnyítik a cDNS és genomiális könyvtárak átvizsgálását, abból a célból, hogy állati és emberi SN-CNTF-et kódoló géneket klónozzunk.

A jelen találmány szerinti módszerrel sikerült meghatározni a nyúl és emberi CNTF kódoló (mRNS-ekvivalens) szekvenciáját.

Amint azt az alábbiakban részletesebben tárgyaljuk, ezek a gének viszont lehetővé teszik azt, hogy nagy mennyiségben állítsuk elő

1. az állati SN-CNTF-et, amely alkalmas arra, hogy vizsgáljuk, miképpen lehet vele kezelni az idegrendszer sérülését állati modelleken, és

2. a humán SN-CNTF-et, amely alkalmas arra, hogy gyógyászati készítményekbe tegyük, amelyeket az emberi idegrendszer kezelésére használhatunk.

A jelen találmány szerinti módszerekkel sikerült biológiailag aktív állati CNTF-et előállítani rekombináns expressziós rendszerben.

Ezekkel a tisztított fehéijékkel meghatározható a prominens peptidek aminosavszekvenciája. A fehéijéket először Asp-N endoproteázzal, Lys-C endoproteázzal, Glu-C endoproteázzal vagy kimotripszinnel kezeljük. Az emésztés után a prominens peptidek aminosavszekvenciája meghatározható egy Applied Biosystems gázfázisú fehéijeszekvenátor alkalmazásával.

A tisztított SN-CNTF-fel reagáló antitesteket használjuk az expressziós könyvtárak átvizsgálására, hogy megkapjuk azokat a géneket, amelyek SN-CNTF-et kódolnak. Olyan szintetikus peptidek szintetizálhatok egy Applied Biosystems automata fehéijeszintetizátorral, amelyek megfelelnek az SN-CNTF régiói szekvenciájának. Ezeket a peptideket használhatjuk az antitestek előállítására. A szintetikus peptidek elleni antitesteket állítunk elő, és Westem-blot elemzéssel kimutatható, hogy reagálnak a tisztított CNTF-fel (10. ábra).

A fenti munka végső célja a humán SN-CNTF klónozása és expresszálása, hogy a humán gyógyászatban alkalmazható preparátumokat készítsünk. Ha egyszer a genomiális szekvencia ismert, akkor az SN-CNTF-et kódoló géneket állati vagy baktériumsejtekben expresszálhatjuk. A CNTF-et kódoló nyúl- és humán génszekvenciákat meghatározzuk. Egy tranziens expressziós rendszert fejlesztettünk ki, amely alkalmas biológiailag aktív CNTF előállítására.

Az alábbiakban egy rekombináns DNS-módszert írunk le a CNTF előállítására. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a természetes CNTF aktív hely funkcióival bizonyos módon ekvivalens aktív helyeket emberből izoláljuk. Egy természetes vagy szintetikus DNS-szekvencia használható a CNTF előállításának irányítására. Ez a módszer az alábbiakból áll:

a) egy olyan DNS-szekvencia izolálása, amely képes egy gazdasejtet úgy irányítani, hogy CNTF-aktivitással rendelkező fehérje keletkezzen;

b) a DNS-szekvenciát egy olyan vektorba klónozzuk, amelyet át tudunk vinni egy gazdasejtbe, és ott szaporítani tudjuk, és ez a vektor a DNS-szekvencia expresszálásához szükséges elemeket tartalmaz;

c) a szintetikus DNS-szekvenciát és működtetőelemeket tartalmazó vektort olyan gazdasejtbe visszük át, amely képes a CNTF-et kódoló DNS-t expresszálni;

d) a gazdasejteket olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek megfelelnek a vektor sokszorozódásának és a CNTF expressziójának;

e) kinyerjük a CNTF-et; és

f) lehetővé tesszük a CNTF számára, hogy aktív harmadlagos szerkezetet vegyen fel, amikor CNTFaktivitással rendelkezik.

A jelen találmány egy megvalósítási módja szerint a rekombináns CNTF termelésére használt, részlegesen vagy teljesen szintetikus DNS-szekvencia tartalmazhat a természetes DNS-szekvenciától eltérő nukleotidokat. A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az eltérő nukleotidokat tartalmazó DNS-szekvencia azért az állati vagy humán CNTF génnel azonos primer szerkezetű polipeptidet kódol. Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint az eltérő nukleotidokat tartalmazó DNS-szekvencia olyan polipeptidet kódol, amelynek az elsődleges szerkezete szoros kapcsolatban van a természetes CNTF szerkezetével, és amely legalább egy olyan CNTF biológiai aktivitással rendelkezik, mint amelyet az alábbiakban ismertetünk.

A jelen találmány egy megvalósítási módja szerint a natív CNTF-et kódoló DNS-szekvenciát úgy módosítjuk, hogy elősegítsük expresszióját egy gazdaszervezetben vagy sejtben. Ilyen módosítások lehetnek az alábbiak:

a) ha a természetes DNS-szekvencia genomiális szekvencia, akkor megszakító, nem kódoló szekvenciák (intronok) eltávolítása lehet szükséges, ha az expressziót mikroorganizmusban végezzük;

b) a nukleinsavszekvencia megváltoztatása, hogy a különböző restrikciós enzimek által felismert szekvenciákat iktassunk be, ezzel megkönnyítve a további ligálást, klónozást és mutagenezist;

c) a nukleinsavszekvencia megváltoztatása olyan kodonok előállítására, amelyeket a gazdaszervezet vagy gazdasejt előnyben részesít a rekombináns fehéije előállítása során;

d) a nukleinsavszekvenciákat olyan opcionális elemekhez kapcsoljuk, amelyek a DNS-nek a gazda5

HU 217 102 Β szervezetben vagy gazdasejtben való fenntartásához vagy expressziójához szükségesek.

A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint az expresszálandó DNS-t a fentiek szerint állítjuk elő, és olyan expressziós vektorba építjük be, amely képes fennmaradni a gazdaszervezetben vagy gazdasejtben, és a CNTF expresszióját irányítja. Az ilyen vektorok bizonyos előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek egy bizonyos gazdaszervezetben vagy gazdasejtben való expresszióhoz vannak kialakítva:

c) Mikroorganizmusok, főleg Escherichia coli

A jelen találmányban való felhasználásra alkalmas vektorok közé olyan vektorok tartoznak, amelyekbe egy, a fentiek szerinti DNS-szekvenciát lehet beépíteni, bármely előnyös vagy megkívánt operációs elemmel együtt, és amely vektort ezt követően be lehet juttatni egy gazdasejtbe, és az replikálódik ilyen sejtekben. Azok az előnyös vektorok, amelyekben a restrikciós hasítási helyek jól dokumentáltak, és amelyek tartalmazzák azokat az operációs elemeket, amelyek a DNSszekvencia transzkripciójához előnyösek vagy szükségesek. Azonban a jelen találmánynak bizonyos olyan megvalósítási módjai is elképzelhetők, amelyek jelenleg még fel nem fedezett vektorokat alkalmaznak, és amelyek néhány, az alábbiakban ismertetett DNS-szekvenciát tartalmaznak. Részletesebben, előnyös, ha az összes ilyen vektor tartalmaz néhányat az alábbi jellemzők közül:

1. minimális számú gazdaszervezet-szekvenciát tartalmaz;

2. stabilan fenntartható és szaporítható a kiválasztott gazdaszervezetben;

3. képes nagy kópiaszámban fennmaradni a kiválasztott gazdaszervezetben;

4. egy szabályozható promotert tartalmaz, amely olyan helyzetben van, hogy képes előidézni a kiválasztott gén transzkripcióját;

5. legalább egy olyan marker-DNS-szekvenciával rendelkezik, amely egy olyan szelektálható tulajdonságot kódol, amely a DNS-szekvencia beépülési helyétől eltérő helyre van beépítve; és

6. a transzkripció leállítására képes DNS-szekvenciát tartalmaz.

Különböző előnyös megvalósítási módok szerint ezek a jelen találmány szerinti DNS-szekvenciákat tartalmazó és expresszálni képes klónozóvektorok különböző operációs elemeket tartalmaznak. Ezek az „operációs elemek”, amint azt az alábbiakban tárgyaljuk, legalább egy promotert, egy Shine-Dalgamo-szekvenciát és iniciálókodont, valamint legalább egy terminátor kodont tartalmaznak. Ezek az „operációs elemek” előnyösen tartalmazhatnak néhányat az alábbiak közül: legalább egy operátor, legalább egy leaderszekvencia az intracelluláris térből exportálandó fehéqékhez, legalább egy gént egy szabályozófehérje számára, és bármely olyan DNS-szekvenciát, amely szükséges vagy előnyös a vektor-DNS megfelelő transzkripciójához és az azt követő transzlációjához.

Ezek közül az operációs elemek közül néhány jelen lehet mindegyik, a jelen találmány szerinti előnyös vektorban. Az is megfontolandó, hogy bármely, esetleg szükséges operációs elem hozzáadható ezekhez a vektorokhoz, a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerek alkalmazásával, különösen az alábbi kitanítás fényében.

A gyakorlatban lehetséges ezeket a vektorokat olyan módon előállítani, amely lehetővé teszi, hogy könnyen izoláljuk, összeállítsuk, kicseréljük őket. Ez megkönnyíti számos funkcionális gén összerakását ezeknek az elemeknek, valamint a DNS-szekvenciának a kombinálásával. Továbbá ezek az elemek egynél több gazdaszervezetben is alkalmazhatók. Emellett az is megfontolandó, hogy a vektorok bizonyos előnyös megvalósítási módokban olyan DNS-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek képesek regulátorokként működni („operátorok”), valamint más, regulátor fehérjéket kódoló DNS-szekvenciákat.

(i) Regulátorok

Ezek a regulátorok egy megvalósítási mód szerint arra szolgálnak, hogy megelőzzék a DNS-szekvencia expresszióját bizonyos környezeti körülmények között, valamint más környezeti körülmények között tegyék lehetővé a DNS-szekvencia által kódolt fehérje transzkripcióját és ezt követő expresszióját. Pontosabban előnyös, ha a szabályozószakaszok be vannak építve a vektorba oly módon, hogy a DNS-szekvencia expressziója nem történik meg, vagy nagyon alacsony szinten megy végbe, például izopropil-tio-béta-D-galaktozid (IPTG) távollétében. Ebben a helyzetben a DNS-szekvenciát tartalmazó mikroorganizmust a szükséges sűrűségig lehet növeszteni, mielőtt a CNTF expresszióját iniciálnánk. E szerint a megvalósítási mód szerint a kiválasztott fehéije expresszióját azzal indukáljuk, hogy a mikroorganizmus környezetéhez olyan anyagot adunk, amely képes előidézni a DNS-szekvencia expresszióját, miután a kívánt sűrűséget elértük.

(ii) Promoterek

Az expressziós vektorok olyan promotereket kell hogy tartalmazzanak, amelyeket a gazdaszervezet képes a saját fehérjéi expressziójára használni. Jóllehet általánosan a laktóz operon rendszert használják, más mikrobiális promotereket is izoláltak és jellemeztek, ezzel lehetővé téve, hogy a szakterületen jártas szakember a rekombináns CNTF expressziójára használja őket.

(iii) Transzkripciós terminátor

Az alábbiakban megfontolásra kerülő terminátorok a vektor stabilizálását szolgálják. Pontosabban, ezeket a szekvenciákat Rosenberg és Court hják le [Rosenberg, M. and Court, D., Ann. Rév. Génét., 13, 319-353 (1979)], az alábbiakban referenciának használjuk ezeket, és a jelen találmányban való alkalmazását megfontoljuk.

(iv) Nem transzlálódó szekvencia

Megjegyzendő, hogy a jelen találmány előnyös megvalósítási módja szerint az is szükséges lehet, hogy elkészítsük a kódolórégió 3’- vagy 5’-végét, hogy ezzel lehetővé tegyük a 3’ vagy 5’ nem transzlálódó szekvencia beépülését a géntranszkriptumba. Ezek közé a nem transzlálódó szekvenciák közé tartoznak azok is, amelyek stabilizálják az mRNS-t [Schmeissner U.,

HU 217 102 Β

McKenney K., Rosenberg M. and Court D., in J. Mól. Bioi., 176, 39-53 (1984)], amelyre az alábbiakban hivatkozni fogunk.

(v) Riboszomális kötőhelyek

Az idegen fehérjék mikrobiális expressziója bizonyos operációs elemeket igényel, amelyek közé tartozik, de nem korlátozódik erre a riboszomális kötőhely. Egy riboszomális kötőhely egy olyan szekvencia, amelyet a riboszóma felismer, és a fehérjeszintézis iniciálásának helyeként működik [Gold L. et al., Ann. Rév. Microbio., 35, 557-580; vagy Marquis, D. M. et al., Gene, 42, 175-183 (1986)], mindkét közleményre hivatkozunk az alábbiakban. Az előnyös riboszomális kötőhely szekvenciája az alábbi:

GAGGCGCAAAAA.

(vi) Leaderszekvencia és transzlációs csatoló

Emellett az is előnyös, ha egy megfelelő szekréciós leader- (szignál) szekvencia is jelen van a DNS-szekvencia 5’-végénél [Watson, Μ. E., Nucleic Acids Research, 12, 5145-5163, erre többször hivatkozunk a továbbiakban], ha a fehérjét szekretálni akarjuk a citoplazmából. A leaderszekvenciát kódoló DNS-nek olyan pozícióban kell lennie, amely lehetővé teszi fúziós fehérje előállítását, ekkor a leaderszekvencia a CNTF közvetlen szomszédságában van, ahhoz kovalensen kapcsolódik, azaz nem lehet transzkripciós vagy transzlációs szignálszekvencia a két kódoló DNS-szekvencia között. A leaderszekvencia jelenléte kívánatos az alábbi okok egyike-másika miatt. Először, a leaderszekvencia jelenléte megkönnyítheti a CNTF-nek a gazdaszervezet által való feldolgozását. Pontosabban, a leaderszekvencia irányíthatja a kezdeti transzlációs termék közvetlen hasítását egy leader peptidázzal, hogy eltávolítsuk a leaderszekvenciát, és a fehéqét a potenciális aktivitással rendelkező aminosavszekvenciával hagyjuk. Másodszor, a leaderszekvencia jelenléte megkönnyítheti a CNTF tisztítását azáltal, hogy a fehéqét kivezeti a sejt citoplazmájából. A gazdamikroorganizmusok néhány fajtájában egy megfelelő leaderszekvencia jelenléte lehetővé teszi a kész fehérjének a periplazmatikus térbe való távozását, amint az például az Escherichia coli esetében történik. Bizonyos Escherichia coli, Saccharomyces és Bacillus törzsek esetében a megfelelő leaderszekvencia lehetővé teszi, hogy a fehéqe a sejtmembránon keresztüljusson, bele az extracelluláris közegbe. Ebben a helyzetben a fehérje az extracelluláris fehéqék közül tisztítandó. Harmadszor, a jelen találmány szerint előállított néhány fehéqe esetében a leaderszekvencia jelenléte szükséges lehet ahhoz, hogy a kész fehéqét olyan környezetbe lokalizálja, ahol felveheti az aktív struktúráját, amely struktúra hordozza a megfelelő fehéijeaktivitást.

A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint egy további DNS-szekvencia található a CNTFet kódoló DNS-szekvencia előtt. Ez a szekvencia mint transzlációs csatoló működik, azaz egy olyan DNSszekvencia, amely által kódolt RNS a riboszómákat közvetlenül a vele folytonos inhibitor RNS riboszomális kötőhelye mellé irányítja. A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a transzlációs csatoló az alábbi DNS-szekvenciából származik: TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG, a szakterületen jártas szakember számára ismert módon.

(vi) Transzlációs terminátor

Az alábbiakban megfontolásra kerülő transzlációs terminátorok szerepe az, hogy az mRNS transzlációját leállítják. Lehetnek természetes eredetűek [Kohli J., Mól. Gén. Génét., 182, 430-439] vagy szintetikusak [Petterson R. F., Gene, 24, 15—27 (1983)], mindkét publikációra hivatkozunk az alábbiakban.

(vii) Szelekciós marker

Az is előnyös továbbá, ha a klónozóvektor tartalmaz egy szelektálható markert, például rezisztenciamarkert vagy más bélyeget, amely a gazdamikroorganizmusban egy szelekcióra alkalmas tulajdonság expresszióját okozza. A jelen találmány egy megvalósítási módja szerint az ampicillinrezisztencia-markert tartalmazza a vektor, míg más plazmidokban a tetraciklin- vagy kloramfenikol-rezisztenciát kódoló gén található.

Egy ilyen antibiotikumrezisztencia vagy más szelektálható bélyeg célja részben az, hogy megkönnyítsük a transzformánsok szelekcióját. Emellett egy ilyen szelektálható marker jelenléte a klónozóvektorban arra is jó, hogy megakadályozza a fertőző mikroorganizmusok elszaporodását a tenyészfolyadékban. Ebben a megvalósítási módban a transzformált mikroorganizmus tiszta tenyészetét úgy kapjuk meg, hogy a mikroorganizmust a túléléshez szükséges indukált fenotípust igénylő körülmények között növesztjük.

Az alábbiakban tárgyalt operációs elemeket a szakterületen jártas szakember rutinszerűen választja ki a szakirodalom és az alábbi kitanítás alapján. Ezeknek az operációs elemeknek a példáit B. Lewin foglalja össze [Genes, Wiley and Sons, New York (1983)], amelyre a továbbiakban hivatkozunk. A megfelelő operációs elemek különböző példái találhatók meg a fentiekben tárgyalt vektorokban és világíthatók meg az említett vektorok alapvető jellemzőit tárgyaló közlemények összefoglalásával.

Az előbb tárgyalt vektorok összes szükséges és kívánt komponenseinek szintézisével és izolálásával a vektort a szakterületen jártas szakember számára általánosan ismert módszerrel össze lehet állítani. Az ilyen vektorok összeállítása a szakterületen jártas szakember számára alapvető ismeret, és nem kell hozzá el nem várható kísérletezés. Például hasonló DNS-szekvenciákat ligáltunk megfelelő klónozóvektorokba [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)], amely szakkönyvet a továbbiakban is idézünk.

A jelen találmány szerinti klónozóvektorok készítéséhez azt is meg kell jegyezni, hogy a DNS-szekvenciák és a csatlakozó operációs elemek több példányban is beépíthetők az egyes vektorokba. Egy ilyen megvalósítási mód szerint a gazdaszervezet a vektorra számítva nagyobb mennyiségű CNTF-et termel. A vektorba beépíthető DNS-szekvencia másolatainak számát csak az

HU 217 102 Β korlátozza, hogy a keletkező vektort mérete következtében képesek vagyunk-e átvinni egy megfelelő gazdaszervezetbe, és ott képes-e replikálódni, valamint RNS-t szintetizálni.

b) Más mikroorganizmusok

Az Escherichia colitól eltérő mikroorganizmusokban használható vektorokat is megfontoljuk ebben a szabadalmi leírásban. Ezeket a vektorokat az 1. táblázatban közöljük. Emellett bizonyos előnyös vektorokat az alábbiakban tárgyalunk.

I. táblázat

Gazdaszervezet	Szabályozott promoterek	Indukálószer	Transzkripciós terminátor	mRNS- stabilizálás	Transzkripciós starthely cs leaderpeptid	Marker	RS-kötőhely
E. coli	Lac (1), Tac (2) lambda pL Trp (5)	IPTG hőmérséklet-emelés IAA-adagolás vagy triptofánelvonás	rmB (6) rmC (7)	ompA (8) lambda int (9) trp (10)	bla(ll) ompA (12) phoS	ampicillin (14) tetraciklin (14, 15) kloramfenikol (16)
Bacillus	*alfa-amiláz (17) *subtilisin (18) , P-43 (19), spac-126	E. coli IPTG	rm rm BT.T (20)		B. amy neutrális proteáz (21), B. amy alfa amiláz (22), B. subt subtilisin (23)	KanR (24) CamR (25)	B. amy neutrális proteáz, B. amy alfa amliáz (22)
Pseudomonas	Trp (27) (E. coli) Lac (E. coli) Tac (E. coli)	IAA-hozzáadás vagy triptofánmegvonás IPTG			foszfolipáz C (28) exotoxinA (29)	szulfonamid (30) sztreptomicin (30)	Trp (E. coli)
Élesztő	Gál 1(31) 10(32) Adhl (33) 11(34) Pho 5	Glükózmegvonás és galaktóz, galaktóz, glükózmegvonás, foszfátmegvonás	Cyc 1 Una Alfa faktor Sac2		Invertáz (36) Savas foszfatáz (36) Alfa faktor	Ura 3 (37) Leu 2 (38) His 3 Táp 1

* nincs szabályozva

A zárójelben lévő számok az alább következő irodalomjegyzék egyes cikkeit jelentik.

1. Backman, K., Ptashne, M. and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73,4174-4178 (1976).

2. deBoer, H. A., Comstock, L. J. and Vasser, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 21-25 (1983).

3. Shimatake, H. and Rosenberg, M., Natúré, 292, 128-132 (1981).

4. Derom, C., Gheysen, D. and Fiers, W., Gene, 17, 45-54(1982).

5. Halleweli, R. A. and Emtage, S., Gene, 9, 27-47 (1980).

6. Brosius, J., Dűli, T. J., Sleeter, D. D. and Noller, H. F„ J. Mól. Bioi., 148, 107-127 (1981).

7. Normanly, J., Ogden, R. C., Horváth, S. J. and Abelson, J., Natúré, 321,213-219 (1986).

8. Belasco, J. G., Nilsson, G., von Gabain, A. and Cohen, S. N„ Cell, 46, 245-251 (1986).

9. Schmeissner, U., McKenney, K., Rosenberg M. and Court, D. J., Mól. Bioi., 176, 39-53 (1984).

10. Mott, J. E., Galloway, J. L. and Platt, T., EMBO J., 4, 1887-1891 (1985).

11. Koshland, D. and Botstein, D., Cell, 20, 749-760 (1980).

12. Morva, N. R., Kakamura, K. and Inouye, M. J., Mól. Bioi., 143, 317-328 (1980).

13. Surin, Β. P., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Shaw, D. C., Cox, G. B. and Rosenberg, H. J., Bacteriol. 157, 772-778(1984).

14. Sutcliffe, J. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 3737-3741 (1978).

15. Peden, K. W. C., Gene, 22, 277-280 (1983).

16. Alton, N. K. and Vapnek, D., Natúré, 282, 864-869 (1979).

17. Yang, M., Galizzi, A. and Henner, D., Nuc. Acids Rés., 772,237-248(1983).

18. Wong, S.-L., Price, C. W., Goldfarb, D. S. and Dói, R. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1184-1188 (1984).

19. Wang, P.-Z. and Dói, R. H., J. Bioi. Chem., 257, 8619-8625 (1984).

HU 217 102 Β

20. Lin, C.-K., Quinn, L. A., Rodriguez, R. L., J. Cell

Biochem. Suppl., (9B), p. 198 (1985).

21. Vasantha, N., Thompson, L. D., Rhodes, C., Banner,

C., Nagle, J. and Filpula, D. J. Bact., 1593., 881-819 (1984).

22. Palva, I., Sarvas, M., Lehtovaara, P., Sibazkov, M. and Kaariainen, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5582-5586(1982).

23. Wong, S.-L., Pricee, C. W., Goldfarb, D. S. and Dói, R. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1184-1188 (1984).

24. Sullivan, M. A., Yasbin, R. E. and Young, F. E., Gene, 29,21-46(1984).

25. Vasantha, N., Thompson, L. D., Rhodes, C., Banner, C. Nagle, J. and Filula, D. J. Bact., 1593., 811-819(1984).

26. Yansura, D. G. and Henner, D. J., PNAS, 81, 439-443 (1984).

27. Gray, G. L., McKeown, K. A., Jones, A. J. S., Seeburg, P. H. and Heyneker, H. L., Biotechnology, 161-165 (1984).

28. Lory, S. and Tai, P. C., Gene, 22,95-101 (1983).

29. Liu, Ρ. V., J. Infect. Dis., 130, (suppl), 594-599 (1974).

30. Wood, D. G., Hollinger, M. F. and Tindol, Μ. B., J. Bact., 745,1448-1451 (1981).

31. St. John, Τ. P. and Davis, R. W., J. Mól. Bioi., 752, 285-315 (1981).

32. Hopper, J. E. and Rowe, L. B., J. Bioi. Chem., 253, 7566-7569 (1978).

33. Denis, C. L., Ferguson, J. and Young, Ε. T., J. Bioi. Chem., 258, 1165-1171 (1983).

34. Lutsdorf, L. and Megnet, R., Archs. Biochem. Biophys., 126, 933-944 (1968).

35. Meyhack, B., Bajwa, N., Rudolph, H. and Hinnen,

A., EMBO J., 6, 675-680 (1982).

36. Watson, Μ. E., Nucleic Acid Research, 72, 5145-5164(1984).

37. Gerband, C. and Guerineau, M., Curr. Génét., 7, 219-228 (1980).

38. Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., P:roc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929-1933 (1978).

39. Jabbar, M. A., Sivasubramanian, N. and Nayak, D. P„ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 2019-2023 (1985).

(i) Pseudomonas vektorok

Számos, sok különböző Gram-negatív baktériumban önállóan replikálódni képes vektorplazmidot tekintünk előnyösnek klónozóvektorként a Pseduomonas nemzetségbe tartozó gazdaszervezetek esetében. Ezek közül néhányat már leírtak [Tait R. C., Close T. C., Lundquist R. C., Hagiya M., Rodriguez R. L. és Kado, C. I., Biotechnology, 269-275 (1983)]; Panapoulos N. J., Genetic Engineering in the Plánt Sciences, Praeger Publishers, New York, New York, 163-185 (1981); valamint Sakaguchi K., Current Topic in Microbiology and Immunology, 96, 31-45 (1982)], ezekre az alábbiakban hivatkozunk.

Egy különösen előnyös konstrukcióban az RSF1010 plazmidot és származékait használjuk [Bagdasarian M.,

Bagdasarian Μ. M., Coleman S. és Timmis K. N., Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Timmis K. N. and Puhler A. szerkesztő, Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979)], amely publikációra a továbbiakban is hivatkozunk. Az RSF1010 előnye az, hogy viszonylag kicsi, nagy kópiaszámú plazmid, amely könnyen transzformálható és stabilan fenntartható Escherichia coli és Pseudomonas fajokban. Ebben a rendszerben előnyös a Tac expressziós rendszer alkalmazása, amint azt Escherichia colira leírták, mivel úgy tűnik, hogy az Escherichia coli trp promotert könnyen felismeri a Pseudomonas RNS-polimeráz [Sakaguchi, K., Current Topics in Microbiology and Immunology, 96, 31-45 (1982); Gray G. L., McKeown K. A., Jones A. J. S., Seeburg P. H. és Heyneker H. L., Biotechnology, 161-165 (1984. február)], amely publikációkra a továbbiakban is hivatkozunk. A transzkripciós aktivitást tovább maximalizálhatjuk, ehhez az kell, hogy a promotert egy másik, például Escherichia coli vagy Pseudomonas aeruginosa promoterrel cseréljük ki. Emellett az Escherichia coli lacl génjét is tartalmazhatja a promoter a szabályozás befolyásolására.

A transzlációt hozzákapcsolhatjuk bármely Pseudomonas fehéije transzlációjának iniciálásához, valamint a választott típusú, erősen expresszálódó fehéijék iniciációs helyéhez, hogy az inhibitor intracelluláris expresszióját előidézzük.

Azokban az esetekben, amikor a Pseudomonas gazdaszervezet restrikció mínusz törzsei nem elérhetők, akkor az Escherichia coliból izolált plazmidkonstrukciók transzformációs hatékonysága alacsony. Ezért kívánatos, hogy a kiválasztott gazdaszervezet transzformálása előtt a Pseudomonas klónozóvektort egy másik, r- m+ fajban passzáljuk [Bagdasarian M., Bagdasarian Μ. M., Coleman S. és Timmis K. N., Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Timmis K. N. and Puhler A. szerkesztő, 411 -422 Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979)], amely publikációra a továbbiakban is hivatkozunk.

(ii) Bacillusvektorok

A Bacillus nembe tartozó gazdaszervezetek esetében egy előnyös expressziós rendszer a pUBllO plazmid mint klónozóvektor használatán alapul. Csakúgy, mint más klónozórendszerekben, Bacillusban is lehetséges a jelen találmány szerinti CNTF-et expresszálni, akár intracelluláris, akár extracelluláris formában. A jelen megvalósítási mód magában foglalja mindkét rendszert. A mind Bacillusban, mind Escherichia coliban replikálódó ingázó vektorok elérhetők a konstrukciók, valamint a különböző gének vizsgálata számára [Dubnau D., Gryczan T., Contente S. és Shivakumar A. G., Genetic Engineering, 2, Setlow and Hollander eds., Plenum Press, New York, New York, 115-131 (1980)], amely publikációra a továbbiakban hivatkozunk. A CNTF Bacillus sutbilisben való expressziójához és szekréciójához előnyösen az alfa-amiláz szignálszekvenciáját kapcsoljuk a fehéije kódolórégiójához. Intracelluláris CNTF szintéziséhez a hordozható DNS-szekvenciát transzláció szempontjából csatoljuk az alfa-amiláz leaderszekvenciához.

HU 217 102 Β

Akármelyik ilyen konstrukció transzkripcióját előnyösen az alfa-amiláz promoter vagy annak származéka irányítja. A származék a természetes alfa-amiláz RNS-polimeráz felismerőszekvenciáját tartalmazza, de tartalmazza a lac operátor régiót is. A hasonló, penicillináz gén promoterből és a lac operátorból álló hibrid promoterekről igazolták, hogy Bacillusban szabályozható módon működnek [Yansura G. G. and Henner, Genetics and Biotechnology of Bacilli, Ganesan A. T. and Hoch J. A., eds., Academic Press, 249-263 (1984)], amely publikációra az alábbiakban hivatkozunk. Az Escherichia coli lacl génjét is tartalmazza a plazmid, hogy befolyásolja a szabályozást.

(iii) Clostridium vektorok

A Clostridiumban való expresszió céljára egy előnyös konstrukció található a pJU12 plazmidban [Squires C. H. et al., J. Bacteriol, 159, 465-471 (1984), a továbbiakban hivatkozunk erre a publikációra], C. perfringensbe transzformálva [Heefner D. L. et al., J. Bacteriol., 159,460-464 (1984), a továbbiakban hivatkozunk erre a publikációra]. A transzkripciót a tetraciklinrezisztencia-gén promotere vezérli. A transzláció ugyanennek a tetraciklinrezisztencia-génnek a Shine-Dalgamo-szekvenciájához kapcsolódik, analóg módon a más gazdaszervezetekben alkalmazható vektorokra leírt eljárásokkal.

(iv) Elesztővektorok

Az élesztőbe bejuttatott idegen DNS fenntartását számos módon befolyásolhatjuk [Botstein D. and Davis R. W., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strather, Jones and Broach, eds., 607-636 (1982)], a publikációra a továbbiakban hivatkozunk.

A Saccharomyces nembe tartozó gazdaszervezetekben való felhasználáshoz egy előnyös expressziós rendszer a CNTF gént a 2 mikronos plazmidon tartalmazza. A 2 mikronos plazmid előnyei közé tartozik a viszonylag magas kópiaszám és stabilitás, cir’ törzsekbe bejuttatva. Ezek a vektorok előnyösen tartalmazzák a pBR322 plazmid replikációs origóját és legalább egy antibiotikumrezisztencia-markert, ezzel lehetővé téve Escherichia coliban a replikációt és szelekciót. A plazmid emellett előnyösen tartalmazza a kétmikronos szekvenciát és az élesztő LEU2 génjét, amik ugyanazt a célt szolgálják LEU2 defektív élesztő mutánsokban.

Ha az a célunk, hogy a rekombináns CNTF-et végül élesztőben expresszáljuk, előnyös, ha a klónozóvektort először Escherichia coli baktériumba transzformáljuk, ahol a vektor replikálódik, és ahonnan a vektort amplifikálás után kinyerhetjük, tisztíthatjuk. A vektort ezután élesztőbe vihetjük át a CNTF expresszálása céljából.

c) Emlőssejtek

A CNTF-et kódoló cDNS vagy genomiális DNS szolgáltatja a CNTF emlőssejtben való expressziójához a gént. Tartalmaznia kell egy olyan szekvenciát, amely hatékonyan kötődik a riboszómákhoz [Kozák, Nucleic Acids Reserach, 15, 8125-8132 (1987)], a publikációra hivatkozunk a továbbiakban. A CNTF-et kódoló DNS-t hordozó restrikciós fragmentet beépíthetjük egy olyan expressziós vektorba, amely tartalmaz egy transzkripciós promotert és egy transzkripciós enhanszerszekvenciát [Guarente L., Cell, 52, 303-305 (1988); Kadonaga J. T. et al., Cell, 57, 1079-1090 (1987)], mindkét publikációra hivatkozunk a továbbiakban. A promoter lehet szabályozható, mint például a pMSG plazmid esetében (Pharmacia CAT. No. 227450601), ha az inhibitor konstitutív expressziója hátráltatja a sejt növekedését. A vektor rendelkezhet egy teljes poliadenilezési jellel [Ausubel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987)], amely publikációra a továbbiakban hivatkozunk, hogy az erről a vektorról átíródott mRNS helyesen processzálódjon. Végezetül a vektor rendelkezik a pBR322-ből egy replikációs origóval és egy antibiotikumrezisztencia-génnel, ezzel lehetővé téve a replikációt és szelekciót Escherichia coliban.

Abból a célból, hogy egy stabil, CNTF-et termelő sejtvonalat szelektáljunk, az expressziós vektor tartalmazhat egy szelekciós marker gént, például egy antibiotikumrezisztencia-gént vagy hordozhat egy deficiens sejtvonalat komplementáló gént, például a dihidrofolát reduktáz (dhfr) gént egy dhfr- sejtvonal transzformálására [Ausubel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987)]. Egy másik módszer szerint egy külön, a szelektálható markert hordozó plazmidot kotranszformálunk az expressziós vektorral együtt.

Gazdasejt/transzformálás

Az így előállított vektort egy megfelelő gazdasejtbe transzformáljuk. Ezek a gazdasejtek lehetnek mikroorganizmus- vagy emlőssejtek.

a) Mikroorganizmusok

Az a véleményünk, hogy bármely olyan mikroorganizmus választható, amely képes idegen DNS-t felvenni és a géneket expresszálni, és hozzá való operációs elemek választhatók. Miután kiválasztottunk egy gazdaszervezetet, a vektort átvisszük a gazdaszervezetbe a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerrel. Az ilyen módszerekre példák találhatók az alábbi kiadványban: Advanced Bacterial Genetics by R. W. Davies et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980), amely publikációra a továbbiakban hivatkozunk. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a transzformáció alacsony hőmérsékleten játszódik le, mivel a hőmérséklet-szabályozást használjuk eszközként a génexpresszió szabályozására az operációs elemek alkalmazásán keresztül. Egy másik megvalósítási mód szerint, ha ozmotikus szabályozókat építünk a vektorba, akkor szükséges a sókoncentráció szabályozása a transzformáció során, hogy biztosítsuk az idegen gének megfelelő szabályozását.

Előnyös, ha a gazdamikroorganizmus fakultatív anaerob vagy aerob mikroorganizmus. A jelen módszerben használható gazdaszervezetek közé tartoznak a baktériumok és élesztők. Az élesztők lehetnek a Saccharomyces nembe tartozók, különösen a Saccharomyces cerevisiae. A specifikus baktériumok közé tartoznak a Bacillus, Escherichia coli és Pseudomonas nemzetségbe tartozók, főleg a Bacillus subtilis és Escherichia coli. A további gazdasejteket az I. táblázatban soroljuk fel.

HU 217 102 Β

b) Emlőssejtek

A vektort számos technikával juttathatjuk be emlőssejtekbe, például kalcium-foszfát:DNS koprecipitációval, elektroporációval vagy protoplaszt fúzióval. Az előnyös módszer a kalcium-foszfátos koprecipitáció [Ausubel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987)].

Számos stabil, transzformálható, transzkripciós processzálásra, a DNS-szekvencia transzlációjára és CNTF fehérje termelésére képes sejttípus létezik. A sejttípusok azonban eltérőek lehetnek a fehérjék glikozilezése és az aminosavcsoportok poszttranszlációs módosítása szempontjából. Tehát az ideális sejttípus az, amelyik a természetes molekulával azonos rekombináns CNTF-et termel.

A gazdasejteket olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek megfelelnek a CNTF expressziójának. Ezek a körülmények általában a gazdasejtre specifikusak, és a szakterületen jártas szakember számára könnyen meghatározhatók a publikációk fényében, amelyek az ilyen sejtek növesztési körülményeit és egyéb kitanításokat tartalmaznak. Például a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed., Williams and Wilkins Company, Baltimore Maryland, amely publikációra a továbbiakban hivatkozunk, információkat tartalmaz a baktériumok tenyésztésére. Hasonló, az élesztők és emlőssejtek tenyésztésére vonatkozó információk találhatók a Pollack, R. Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (1975) kiadványban, amelyre a továbbiakban hivatkozunk.

Bármely, a DNS-szekvencia expressziójának szabályozásához szükséges körülmény, a vektorban jelen lévő vagy oda beépített operációs elemektől függően, működik a transzformációs és tenyésztési lépéseknél. Egy megvalósítási mód szerint a sejteket nagy sűrűségig növesztjük a megfelelő szabályozási körülmények között, amelyek gátolják a DNS-szekvencia expresszióját. Amikor megközelítettük az optimális sejtsűrűséget, akkor a környezeti körülményeket olyanokra választjuk meg, amelyek a DNS-szekvencia expressziójához kellenek. Tehát az elképzelés az, hogy a CNTF-termelés a gazdasejtek közel optimális sűrűségre való növesztése utáni időszakban történik, majd az eredményt azután kapjuk meg, hogy az expresszióhoz szükséges körülményeket indukáltuk.

A jelen találmány egy megvalósítási módja szerint a rekombináns CNTF-et egy gazdasejtben vagy gazdaszervezetben való expresszió után tisztítjuk. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a rekombináns CNTF-et egy mikroorganizmusban, főleg Escherichia coliban való expresszió után tisztítjuk. A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a CNTF biológiailag aktív állapotban van jelen a baktériumtenyészetekből való kinyerés után. Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint a CNTF-nek hagyjuk, hogy felvegye az aktív szerkezetét a tisztítási eljárás egy bizonyos lépésében.

A rekombináns fehérje tisztításához az alábbi lépések használhatók előnyösen:

anioncserélő kromatográfia (Mono-Q, Mono-S és/vagy DEAE-Sepharose), gélpermeációs kromatográfia (Superose), kromatofokuszálás (Mono-P) és hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (oktil- és/vagy fenil-Sepharose).

Nyilvánvaló, hogy a szakterületen jártas szakember számára a jelen találmány kitanításának alkalmazása egy bizonyos problémára vagy körülményre nem jelent nehézséget.

Az alábbi példákat azzal a céllal adjuk meg, hogy a jelen találmány bizonyos előnyös megvalósítási módjait illusztrálják, és nem korlátozzák a találmányt az igénypont szerint.

I. példa

Fehérjekészítés

A. Anyagok

Felnőtt nyulak ülőidegeit a Pel-Freez Biologicals, Rogers, Arkansas cégtől szereztük be. Az ultratiszta ammónium-szulfátot a Schwartz/Mann Biotech, Cleveland, Ohio cégtől szereztük be. A fenil-metil-szulfonilfluoridot (PMSF), az epszilon-amino-kapronsavat, benzamidint, pepsztatint, ditiotreitolt (DTT), poli-L-omitint (P3655) és a 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólium-bromidot (MTT) a Sigma Chemical Companies, St. Louis, Missouri cégtől vásároltuk. A Mono-P kromatofokuszáló FPLC-oszlopokat a Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey cégtől vásároltuk. A C8 fordított fázisú HPLC-oszlopokat a Synchrom, Inc., Lafayette, Indiana cégtől vásároltuk. Az acetonitrilt a J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, New Jersey cégtől vásároltuk. A trifluor-ecetsavat a Pierce Chemicals, Rockford, Illinois cégtől vásároltuk. Az Asp-N és Lys-C endoproteázokat a Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana cégtől vásároltuk. A boqumagzatszérumot a Hyclone Laboratories, Loga, Utah cégtől vásároltuk. A táptalajokat és sóoldatokat az Irvine Scientific, Santa Ana, Califomia cégtől vásároltuk. A tenyésztőcsészéket a Costar, Cambridge, Massachusetts cégtől vásároltuk. A utility-grade patogénmentes megtermékenyített csirkeembrió tojásokat a Spafas, Roanoake, Illinois cégtől vásároltuk.

B. Az SN-CNTF vizsgálata

A primer csirkeembrió ciliáris ganglionokat az előzőeken leírt módon izoláljuk [Collins, Develop. Bioi., 65, 50 (1978); Mathorpe et al., Develop. Brain Rés., 25, 191 (1986)]. Röviden, a ciliáris ganglionokat eltávolítjuk a megtermékenyített, patogénmentes tyúktojásokból, amelyeket 9-10 napig 38 °C-on inkubáltunk párásított atmoszférában. A ganglionokat kémiailag disszociáltatjuk oly módon, hogy először 10 percig 37 °C-ra Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatba helyezzük (kétértékű kationok nélkül), amely 10 mM HEPES-puffert tartalmaz, majd a fentiek szerint módosított Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban hozzáadunk 0,125% baktotripszin 1:250 oldatot (Difco, Detroit, Michigan) és 12 percig 37 °C-on tartjuk. A tripszinizálást 10% végkoncentrációban hozzáadott boíjúmagzatszérum hozzáadásával állítjuk le.

Ezután a kezelés után a ganglionokat egy olyan oldatba visszük át, amelynek összetétele Dulbecco magas

HU 217 102 Β glükóztartalmú módosított Eagle-táptalaj, bikarbónát nélkül, ezenkívül tartalmaz még 10% boíjúmagzatszérumot és 10 mM HEPES-t (pH=7,2), és mechanikusan, triturálással feltárjuk oly módon, hogy körülbelül tízszer átbocsátjuk egy Pasteur-pipettán, amelynek a hegyét lánggal olyan átmérőre állítottuk be, hogy 2 másodpercig tart, amíg megtöltjük a pipettát.

A disszociált ganglionokat azután táptalajra szélesztjük (Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalaj, kiegészítve 10% borjúmagzatszérummal, 4 mM glutaminnal, 60 mg/1 penicillin-G-vel, 25 mmol HEPES-sel, pH=7,2) 100 mm átmérőjű szövettenyészető csészékben (40 disszociált ganglion per csésze), és három óra hosszat itt tartjuk. Az előszélesztést azért végezzük, hogy a nem neuronális sejteket, amelyek a csészéhez tapadnak, elválasszuk az idegsejtektől, amelyek nem tapadnak ki. Három óra elteltével a nem tapadó idegsejteket centrifugálással kinyerjük, táptalajban szuszpendáljuk, majd 50 μΐ/lyuk mennyiségben egy 96 lyukas mikrotiter szövettenyésztő lemez egyik felébe szétmérjük, 1500 idegsejt per lyuk mennyiségben. A mikrotiter lyukakat előzőleg 1 mg/ml koncentrációjú poli-L-omitin 10 mmólos nátrium-borát pH=8,4 oldatával éjszakán át 4 °C-on kezeljük, desztillált vízzel mossuk és levegőn szárítjuk.

A neurotróf aktivitásra vizsgált minta sorozathígításából 10 μΐ-t hozzáadunk az egyes lyukakhoz, majd a lemezeket 20 órán át 37 °C-on inkubáljuk nedvesített, 7,5% CO₂-t tartalmazó atmoszférában. 18 óra elteltével Dulbecco-féle magas glükóztartalmú Eagle-táptalaj bikarbónát nélkül, 10 mM HEPES pH=7,2 összetételű oldatban készült 1,5 mg/ml koncentrációjú MTT tetrazólium festékoldatból 15 μΐ-t adunk az egyes lyukakhoz, majd a tenyészeteket 4 órára visszatesszük a 37 °C-os inkubátorba. Ezután minden liter izopropanolhoz 6,7 ml 12 molos sósavat adunk, ebből az oldatból 75 μΐ-t adunk mindegyik lukhoz, a lyukakban a sejtek tartalmát harmincszor trituráljuk, hogy feltöijük a sejteket és szuszpendáljuk a festéket. Meghatározzuk az 570 nm-es abszorbanciaértéket minden egyes lukban, egy 690 nm-en mért referenciaértékhez viszonyítva, automata mikrotiterleolvasót alkalmazva (Dynatech, Chantilly, Virginia). Azoknak a sejteknek az abszorbanciáját, amelyek nem kaptak neurotróf aktivitású anyagot (negatív kontrollok), kivonjuk a mintát tartalmazó lyukak abszorbanciájából. A kapott abszorbanciaérték arányos az élő sejtek számával az egyes lyukakban, meghatározás szerint a festéket redukálni képes idegsejtek számával. A neurotróf-aktivitás trófikus egységeinek számát úgy határozzuk meg, mint annak a hígításnak a reciproka, amely az idegsejtek maximális túlélésének 50%-át okozza. A trófikus aktivitás koncentrációját trófikus egységekben mérve milliliterenként úgy kapjuk meg, hogy az összes trófikus egységszámot elosztjuk a vizsgálati térfogattal (60 μΐ). A specifikus aktivitást úgy határozzuk meg, hogy a trófikus egységek számát a mintában mérhető fehérje mennyiségével osztjuk.

C. Az SN- CNTF tisztítása

Mindegyik alábbi lépés végén a preparátumot vagy azonnal feldolgozzuk, vagy -70 °C-on tároljuk maximum egy hétig a felhasználás előtt.

1. lépés

Nyers extraktum készítése

Száz gramm nedves súlyú nyúlülőideget (körülbelül 300 ideg) megolvasztunk, és egy Polytron rotációs homogenizátorral (Kinematica, Switzerland) elporitunk 1 percig, 10 térfogat (súly/térfogat) vizes oldatban, amely 10 mM EDTA-t, 1 mM epszilon-amino-kapronsavat, 1 mM benzamidint és 0,1 mM PMSFT-et tartalmaz, majd 30 percig 4 °C-on 140 000 g-vel centrifugáljuk. A felülúszót üveggyapoton szüljük át, hogy a lebegő lipideket eltávolítsuk.

2. lépés

Savas kezelés és ammónium-szulfátos frakcionálás

Az előzőekben említett centrifugálási lépéseket 17000 g-vel megismételjük 20 percig, és minden műveletet 4 °C-on végzünk, hacsak külön nem említjük. A nyers kivonatot centrifugáljuk. A felülúszót pH=3,6ra savanyítjuk 5 normál sósavval, majd a kapott csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszó pH-ját 6,3-ra állítjuk 1 normál NaOH-dal, majd a keletkező csapadékot ismét centrifugálással távolítjuk el. Az említett felülúszóhoz telített ammónium-szulfátot adunk 30% telítés eléréséig, majd a csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. Ammónium-szulfát további felülúszóhoz való adagolásával 60%-os telítést kapunk, ennek eredményeképpen kicsapunk egy olyan fehérjefrakciót, amely az SN-CNTF-aktivitás legnagyobb részét tartalmazza. A csapadékot 20 mM nátriumoldatban (pH=6,7) oldjuk, amely tartalmaz még 1 mM EDTA-t, 0,1 mM PMSF-et és 0,1 mM pepsztatint, ezzel 8-13 mg/ml fehéijekoncentrációt állítunk be.

3. lépés

Kromatofokuszálás

A fenti preparátumot éjszakán át dializáljuk 500szoros térfogatú 10 mM-os nátrium-foszfát-oldattal (pH=6,7) szemben, a puffer egyszeri cseréjével, majd 30 percig 140 000 g-vel centrifugáljuk. A felülúszót 0,22 μιη-es pórusméretű nejlonszűrőn bocsátjuk át, majd 3 2 ml-es injektálással Mono-P kromatofokuszáló FPLC-oszlopra visszük (az ágytérfogat 4 ml), amelyet 25 mmólos bisz-TRIS-HCl pH=5,8 pufferrel hoztuk egyensúlyba. Az oszlopot ugyanezzel a pufferrel mossuk, amíg az elfolyó lé 280 nm-en mért abszorbanciája vissza nem tér az alapvonalra. A mintát ezután polipufferrel kromatografáljuk (pH=4,0, a Pharmacia PB74 1 - 10-es hígítása).

Az oszlopról lejövő frakciókat összegyűjtjük, és CNTF-aktivitásukat megmérjük. Az 1. ábrán láthatjuk a Mono-P-oszlopon végzett kromatográfia eredményeit. Az eluált fehérjék profilját a 280 nm-en mért optikai sűrűség (O. D.) formájában ábrázoljuk. Ugyanezen az ábrán látható még az egyes frakciókban mérhető pH és SN-CNTF-aktivitás értéke. A vonallal jelzett, csúcs SN-CNTF-aktivitást mutató frakciókat (pH=5 körül) egyesítjük, majd szilárd ammónium-szulfáttal kezeljük (95%-os telítésig), majd az üledéket centrifugálással kinyerjük, telített ammónium-szulfát-oldatban oldjuk, majd ismét centrifugáljuk, a polipuffer eltávolítása céljából. A csapadékot elegendő mennyiségű 10 mM-os nátrium-foszfát-pufferben oldjuk pH=6,7, 3-5 mg/ml

HU 217 102 Β fehérje-végkoncentrációt beállítva (a továbbiakban a „fókuszált frakció” néven említjük). Tipikus esetben az eredeti, nyers kivonat 1 literét futtatjuk nyolc menetben a Mono-P-oszlopon.

4. lépés

Szulfát (SDS) gélelektroforézis

A Mono-P-oszlopon való több menetben végzett futás után kapott fókuszált frakciókat egyesítjük, majd 100szoros térfogatú 10 mM-os nátrium-foszfát-pufferrel (pH=6,7) dializáljuk 8 órán át, a puffért egyszer cserélve, majd 15%-os redukáló SDS-poliakrilamid lapgélen futtatjuk Laemmli (1970) módszere szerint. Mindegyik elválasztógél 0,3 cm vastag, 14 cm magas és 11,5 cm széles. Az egyes gélekre 5,5 mg fehéijét viszünk fel.

Az elektroforézist 15 °C-on végezzük 40 mA/gél feszültséggel, amíg a 20 kD méretű, előre festett molekulasúly standard el nem éri az elválasztógél alját.

Az egyes fehéijék csíkjainak felfedésére a lapgél teljes szélességében, a gélt vízzel előnedvesített nitro-cellulóz-lappal borítjuk (0,45 pm pórusméret, tekercs formában vásárolható a Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts cégnél), majd 2 lap előnedvesített és 2 lap száraz kromatográfiás papírt teszünk rá (3 membrán Chr, Whatman, Hillsboro, Oregon), végül egy üveglapot és egy 500 ml-es üvegpalackot terhelésnek. 30-45 perc elteltével a gél körvonalait vízben nem oldódó tintával felrajzoljuk a nitro-cellulóz-papírra. A papírt háromszor mossuk 10 mM-os TRIS-HC1 pH=8,0 pufferrel, amely 0,15 mol/1 NaCl-t és 0,3% NP40 detergenst tartalmaz, majd 15-30 percig festjük Kohinoor Rapidograph Ink 1:1000 hígításával (irodaszerboltokban kapható) a fenti pufferben.

Az eredeti gélt egy üveglapra tesszük, majd az üveg alatt lévő festett nitro-cellulóz-lapon lévő, rajzolt körvonalával illesztjük. A 22-27 kD tartományban lévő molekulasúlynak megfelelő gélrégiót az előre festett molekulasúly-standardoknak (BRL, Bethesda, MD) megfelelően állapítjuk meg, amelyeket a gél két szélén, vékony csíkokban futtatunk. Ezt a régiót a gél teljes szélességében kivágjuk, majd 7 db 2,5 membrános párhuzamos csíkra vágjuk, a festett nitro-cellulóz-lapon látható görbületnek megfelelően. Az egyes gélcsíkokat kisebb darabokra vágjuk (2,5x2 membrán), majd a fehéijéket elektroforézissel eluáljuk 6 órán át a Laemmli futtatópuffer 1:1 arányú hígításával, egy elektroforetikus koncentrátort alkalmazva (ISCO, Lincoln, Nebraska). A kioldott fehérjéket 0,2 ml térfogatban nyerjük ki. A 2. ábrán láthatjuk a neurotróf aktivitás eloszlását a 7 csík eluátumában (a-g-vel jelölve a csökkenő molekulasúly szerint). A legmagasabb aktivitást mutató frakciót (d csík) tovább tisztítjuk fordított fázisú HPLC-vel.

5. lépés

Fordított fázisú HPLC

A gél eluátumához ditiotreitolt (DTT) és 10%-os trifluor-ecetsavat adunk, annyit, hogy a végkoncentráció 2%, illetve 0,3% legyen. A mintát 0,22 pm-es nejlonszűrőn szűrjük át, C8 fordított fázisú HPLC-oszlopra visszük, majd egy H₂O/0,l% TFA:acetonitril/0,l% TFA gradienssel eluáljuk. A frakciókat szilikonozott csövekbe tesszük, amelyek 5 pl 0,4%-os Tween 20 detergenst tartalmaznak. Az egyes frakciók alikvot részeiben vizsgáljuk a neurotróf aktivitást. A fehérjekoncentrációt a 215 nm-en mért abszorbanciával jelezzük, erre visszük rá a neurotróf aktivitást. A maximális SN-CNTF-aktivitást mutató frakciókat (3. ábra, 37-40-es frakció) egyesítjük a szekvenáláshoz a 2. példában leírtak szerint. Egy külön preparátumban a csúcs CNTF-aktivitást tartalmazó és a szomszédos frakciókat, amelyek megfelelnek a 3. ábrán a 36-44-es frakciónak, szintén ezüsttel festett redukáló SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elemezzük (4. ábra).

Két további kromatográfiás lépést is elvégzünk. Ezek megerősítik a fenti CNTF-preparátumok tisztaságát.

A két további lépésben a hidrofóbiás kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HIC) elvét alkalmazzuk. Az első HlC-lépés egy szokványos oszlopkromatográfiás eljárás, amelyet a 2. lépés (pH és ammónium-szulfát frakcionálás) után illesztünk be. Az ammónium-szulfátos kicsapás után feloldott anyagot tovább hígítjuk 10 mM-os nátrium-foszfát-pufferben (pH = 6,7, B puffer), egészen addig, amíg az ionerősség (vezetőképességi mérés alapján) azonos a B pufferével, amely 0,3 mol/1 ammónium-szulfátot és 5% izopropanolt tartalmaz (A puffer). A hígított mintához ezután izopropanolt adunk 5% végkoncentrációban, majd az elegyet fenil-Sepharose CL4B-oszlopra visszük (Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey), amelyet előzőleg A pufferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszlop töltettérfogatának minden milliliterére maximum 3 mg mintafehéijét viszünk fel. Egy liter nyers ülőideg-kivonat tipikusan 50 ml térfogatban oldható vissza az ammónium-szulfátcsapadékból, ezt azután 70-100 ml-re hígítjuk a fentiek szerint, és egy 110 ml-es fenil-Sepharose-oszlopra visszük. Az oszlopot ezután lépésenként eluáljuk, 3 töltettérfogat A pufferrel kezdve, majd 3 töltettérfogat B pufferrel folytatva, ezt követően 2 töltettérfogat olyan B puffért alkalmazunk, amely 50% etilénglikolt tartalmaz (C puffer), végül 5 töltettérfogat vízzel mossuk. A leoldott anyagból 18 ml-es frakciókat szedünk.

A 7. ábrán láthatók egy ilyen kromatográfiás futtatás eredményei. Az eluált fehéijék profilját folyamatosan követjük a 280 nm-en mért optikai sűrűséggel (folyamatos vonal). Az O. D. vonalra rajzolva látjuk az eluált SN-CNTF bioaktivitás profilját az egyes frakciókban (x-ekkel kapcsolt vonal), amint azt a ciliáris ganglionok túlélési vizsgálatával méljük, a fenti B. pont szerint. Az SN-CNTF bioaktivitás a C pufferrel való eluálás során jelentkezik. A bioaktivitás tömegét tartalmazó oszlopfrakciókat (vonal jelzi a 7. ábrán) egyesítjük, és túlnyomásos dialízissel töményítjük, Amicon YM-10 membránt alkalmazva (Amicon Division, W. R. Grace and Co., Danvers, MA), az eredeti térfogatnak körülbelül az egytizedére, ami általában 2,5-3,0 mf/ml fehéije-végkoncentrációt eredményez. A koncentrátumot összesen 6 óra hosszat dializáljuk, 55-szörös térfogatú B pufferrel szemben, háromszori cserével. A dializált anyagot egy 0,2 pm-es pórusátmérőjű Acrodisc szűrőn bocsátjuk át (Gelman Sciences, In., Ann Arbor, MI), majd többszöri, 2 ml-enkénti injektálással egy Mono-P kromatofokuszáló oszlopra visszük, a fenti C. pont 3. lépése szerint.

HU 217 102 Β

Enélkül a HIC-oszlopos lépés nélkül 1 liter nyers ülőideg-kivonat 8 futtatást igényel a Mono-P kromatofokuszáló oszlopon, amint azt az eredeti szabadalmi leírásban közöltük, az oszlop korlátozott kapacitása miatt. A HIC lépés bevezetésével 1 liter nyers kivonatot egyetlen kromatofokuszálással fel lehet dolgozni.

A második HIC lépést az eredeti sorrend szerinti 3. lépés (kromatofokuszálás Mono-P-oszlopon) után illesztjük be. Minden 1 ml kromatofokuszált anyaghoz (3-5 mg/ml fehérje) 2 ml 50 mmólos foszfátpuffert adunk (pH=6,7), amely 15 mól ammónium-szulfátot tartalmaz (D puffer). A keveréket ezután 0,2 μιη-es Acrodisc szűrőn bocsátjuk keresztül, majd többszöri, 2 ml-es injektálással alkil-Superose HR10/10 FPLC-oszlopra (Pharmacia) visszük fel, amelyet D pufferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot addig mossuk D pufferrel, amíg az elfolyó lé abszorbanciája az O. D. 280 alapján visszatér az alapvonalra. Az oszlopot ezután 60 ml lineáris gradienssel eluáljuk, amelynek összetétele a D puffertől az E pufféiig változik (50 mM foszfátpuffer pH=6,7), és 1 ml-es frakciókat szedünk.

A 8. ábrán láthatjuk egy ilyen FPLC-HIC-oszloppal végzett kísérlet eredményeit. A folyamatos vonal az O. D. 280 alapján mért eluált fehérjeprofilt mutatja. Ezen ábrázoljuk az egyes gradiensfrakciókban mért SN-CNTF biológiai aktivitást. A biológiai aktivitással rendelkező frakciókat (a 8. ábrán vonallal jelezzük) egyesítjük, majd Centricon—10 koncentrátorban betöményítjük 0,5 ml restrikciós. A mintát 2 ml B puffer hozzáadásával hígítjuk a felső tartóban, majd újra koncentráljuk centrifugálással 0,5 ml térfogatra. A hígítást és újra koncentrálást még kétszer megismételjük, majd a végül kapott, betöményített mintát redukáló SDS-poliakrilamid preparatív lapgélen futtatjuk a fentiek szerint, azzal a különbséggel, hogy az előzetes dialízis nem szükséges.

A 9. ábrán a fordított fázisú HPLC-vel végzett végső tisztítási lépést hasonlítjuk össze a kezdő tisztítási eljárásban (felső panel) és a két HlC-lépés hozzáadása utáni (alsó panel) tisztítási eljárásban. Mindegyik panelben látható az eluált fehérjék profilja (a folyamatos vonal jelentése a 280 nm-en mért O. D.-érték), majd az erre felvitt SN-CNTF biológiai aktivitás értéke (az xekkel jelzett vonal). Az ábrából nyilvánvaló, hogy az új tisztítási eljárásban sokkal kevesebb szennyező fehéije található a fordított fázisú HPLC-oszlopra felvitt mintában. Fontos megjegyezni, hogy az új eljárással előállított CNTF specifikus aktivitása a kísérleti hibák határain belül azonos a korábbi eljárással előállított CNTF specifikus aktivitásával (1. táblázat), jelezve, hogy az eredeti, az előzőkben leírt módon CNTF-et homogenitásig tisztítottuk. Az új tisztítási eljárásnak az az előnye, hogy 8 liter kiindulási anyagot ugyanolyan egyszerűen lehet feldolgozni, mint az eredeti eljárással 1 litert.

2. példa

A tisztított neurotróffaktor szekvenálása

A csúcs SN-CNTF-aktivitással rendelkező frakciókat (#37-40, 3. ábra) egyesítjük, majd 50 μΐ-re töményítjük egy vákuumbepárló centrifugában. A tömény minta 0,14% Tween 20-at tartalmaz. Ezt hígítjuk 1% ammónium-hidrogén-karbonáttal 350 μΐ végtérfogatra, majd Asp-N endoproteázzal, illetve Lys-C endoproteázzal kezeljük éjszakán át 37 °C-on. Az elegyet körülbelül 50-100 μΐ-re töményítjük be egy vákuumbepárló centrifugában, majd egy 1 ml-es mintahurkon keresztül egy keskeny lukú Aquapore RP-300 C8 fordított fázisú HPLC-oszlopra visszük (Brownlee Labs), 2,1x220 membrán, egy H₂O/0,l% TFA:acetonitril/0,1% TFA gradienssel eluáljuk. A peptidtartalmú frakciókat kézzel gyűjtjük Eppendorf-csövekbe, a 215 nm-en mért abszorpció alapján. Az 5. ábrán látjuk az eluált peptid Asp-N endoproteázos emésztés után kapott profilját, a 215 nm-es abszorbancia alapján meghatározva. A 6. ábrán láthatjuk az eluált peptidek Lys-C endoproteázos emésztés után kapott profilját, a redukciót és karboxi-metilezést követően. A fontos peptidek aminosavszekvenciáját Applied Biosystems gázfázisú fehéijeszekvenátorral határozzuk meg.

A további aminosavszekvenciát kimotripszín és Glu-C endoproteáz hasító enzimekkel (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) végzett emésztés után kapjuk meg. Ez az újabb fehétjeszekvencia lehetővé teszi, hogy a fentiekben leírt aminosavszekvenciákat nagyobb peptidekké rakjuk össze, az átlapoló aminosavszakaszok alapján. Az új aminosavszekvenciákat és az előző szekvenciákkal összekapcsoltakat az alábbiakban adjuk meg:

H-S-A-L-T-P-H-R-R-E

L-A-R-K-I-R-S-D-L-T-A-L-T-E-SY-V-K-H-Q-G-L-N-K-N-I-NL-D-SV-D-G-V-P-M-A

D-Q-Q-V-H-F-T-P-A-E-G

D-G-L-F-E-K-K-L-W-G-L-K-V-L-QE-L-S-H-W-T-V

D-L-R-V-I

3. példa

A neurotróf faktor elleni antitestek előállítása

A tisztított nyúl-SN-CNTF-fel reagáló antitestek hasznosak az expressziós könyvtárak átvizsgálásában, a nyúl-SN-CNTF-et kódoló gén kiválasztása céljából. Emellett a biológiai aktivitását semlegesítő antitesteket élő állatokban használják, a neurotróf faktor biológiai szerepének meghatározásához.

Az ilyen antitestek előállításához olyan szintetikus peptideket szintetizálunk, amelyek megfelelnek az SN-CNTF szekvenciája régióinak, egy Applied Biosystems automatizált fehéijeszintetizátor alkalmazásával. Ezeket a szintetikus peptideket kovalens kötéssel kötjük hordozó fehéijéhez, a furócsiga-hemocianinhoz. A konjugált peptidet tengerimalacokba injekciózzuk komplett Freund-féle adjuvánssal együtt, erősítőkezeléseket alkalmazva 3 és 6 héttel később inkomplett adjuvánsban. Mindegyik tengerimalacból szérummintákat veszünk, és Westem-blottban használjuk tisztított SN-CNTF-fel szemben, hogy meghatározzuk, vajon a szérumban lévő antitest reagál-e a tisztított fehéijével. A Westem-vizsgálatban pozitívnak bizonyuló szérumokat tovább vizsgáljuk, hogy képesek-e semlegesíteni

HU 217 102 Β a neurotróf aktivitást a tisztításra használt biológiai vizsgálatban. A Westem-blottban vagy a semlegesítésben pozitívnak bizonyuló szérumokat tovább vizsgáljuk az alábbiak szerint:

1. a szérumot a hordozó fürócsiga-hemocianinin fehérével együtt abszorbeáljuk, abból a célból, hogy a hordozó fehéije elleni antitesteket eltávolítsuk, majd a szérumokat az előzőkben említett vizsgálatokkal újra vizsgáljuk;

2. az IgG antitestfrakciót a szérumból standard módszerrel tisztítjuk, és az említett vizsgálatokkal teszteljük.

Mindegyik említett lépéssel poliklonális antitestet kapunk, amely elég tiszta ahhoz, hogy az SN-CNTF-et kódoló hírvivő RNS-t és gént klónozzuk az expressziós könyvtárból.

Az antitesteket nyulakban állítjuk elő a nyúlSN-CNTF aminosavszekvencia egy részének megfelelő „A” szintetikus peptiddel szemben, amelyet a 2. példában adunk meg (E-S-Y-V-K-H-Q-G-LN-K-N). A módszereket az alábbiakban, ebben a példában adjuk meg. Az A szintetikus peptiddel szembeni, affinitás-tisztított antitesteket (anti-A-peptid antitestek) úgy állítjuk elő, hogy immunizált nyúl antiszérumát kovalensen kapcsolt szintetikus A peptidet tartalmazó affinitásoszlopon bocsátjuk át, majd a megkötött antitesteket leoldjuk. A frakcionálatlan immun antiszérum titere körülbelül 10⁵ ELISA-tesztben, A peptidet használva a lyukak borítására; a Westem-blot elemzéshez 1:50 végső hígításban használjuk. Az affinitástisztított anti-A-peptid antitestet, amelyet az alábbiak szerint állítunk elő, használjuk a Western-blot elemzésben 80 pg/ml végkoncentrációban.

Mind az anti-A-peptid antiszérumról, mind a tisztított antitestekről kimutatjuk, hogy kölcsönhatásba lépnek a tisztított nyúl-SN-CNTF-fel a tisztított CNTF redukáló SDS-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) Westem-blottolása során.

Az ugyanebből a nyűiből származó pre-immun szérum nem lépett kölcsönhatásba ilyen körülmények között az SN-CNTF-fel. A végső fordított fázisú HPLC-tisztítási lépésből származó CNTF csúcsfrakciójából származó alikvot részeket két külön csíkban futtatjuk SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel. A tisztított CNTF mindegyik csíkja mellett molekulasúly-markereket futtatunk.

A gélt két részre vágjuk, mindegyik tartalmaz egy tisztított CNTF-et és egy szomszédos, molekulasúlymarker fehéijéket tartalmazó csíkot. A két darab közül az egyiket ezüsttel festjük a fehéijék azonosítása céljából (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), majd a másikat Westem-blottal vizsgáljuk [Towbin et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 76, 4350 (1979)], olyan fehéijék azonosítása céljából, amelyek az affinitástisztított anti-A-peptid antitestekkel reagálnak.

A 10. ábrán a csíkok bal oldali panelje azt demonstrálja, hogy a fordított fázisú kromatográfiával tisztított CNTF csúcs frakciója két szorosan egymás mellett levő fehéijecsíkot tartalmaz, amelyek körülbelül 25 000 dalton molekulasúlynak megfelelő helyen futnak, és a redukáló SDS-poliakrilamid gélen körülbelül 500 dalton választja el őket. Ha az ezüsttel festett géleket tisztított CNTF-fel túlterheljük, akkor gyakran nem lehetséges a két csíkot elválasztani, mint a 4. ábrán.

A 10. ábrán a csíkok jobb oldali panelje azt demonstrálja, hogy mindkét említett csíkot felismerik és megfestik az affinitástisztított anti-A-peptid antitestek. Ez a felismerés specifikus, mivel a jobboldali pár legbaloldalibb sávjában lévő nem rokon marker fehéijéket nem ismerik fel az anti-A-peptid antitestek, jóllehet magas koncentrációban vannak jelen, amint azt a baloldali, ezüsttel festett csíkokon láthatjuk (10. ábra). Az ugyanebből a nyálból származó pre-immun szérum szintén nem ismeri fel a tisztított CNTF két csíkját. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CNTF-nek legalább két különböző formája létezik, amelyek a redukáló SDS-poliakrilamid gélen körülbelül 500 dalton különbséget mutatnak.

Az anti-A-peptid antitestek készítéséhez a szintetikus A fehéijét a fűrócsiga, hemocianinhoz (KLH) konjugáljuk, hogy megnöveljük antigenicitását. A konjugáláshoz 1 mg A peptidet és 1 mg KLH-t (Calbiochem, La Jolla, CA) 50%-os glicerines oldatát oldjuk 0,5 ml PBSben (20 mM nátrium-foszfát-puffer pH=7,4, amely 0,15 mol/1 NaCl-t tartalmaz). 10% glutáraldehidet adunk hozzá cseppenként, kevertetés közben 1% végkoncentráció eléréséig, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékleten hagyjuk állni éjszakán át kevertetés közben, majd PBS-sel 5 ml-re hígítjuk. A konjugálási elegyet 1:2 arányban komplett Freund-féle adjuvánssal emulgeáljuk, majd több ponton szubkután két Uj-Zéland fehér nyúl hátába injekciózzuk, körülbelül 100 gg A peptid per nyúl mennyiségben. Három hét elteltével mindegyik nyúl egy erősítődózist kap (50 gg konjugált A peptid nem komplett Freund-féle adjuvánsban). Ezután hasonló erősítőinjekciókat adunk be 2 hetes intervallumokban, amíg az antiszérum ELISA-vizsgálatban legalább 100000-es titert ad [Tainer et al., Natúré, 312, 127 (1984)], A peptiddel borított lyukakat használva. A szérumokat a fülvénákból vett vérből állítjuk elő az első injekció után 5 héttel, majd utána kéthetenként. A szérumokat -70 °C-on tároljuk.

Egy peptidaffinitási oszlop elkészítéséhez az A peptidet kovalensen hozzákötjük egy kromatográfiás oszloptöltethez, az alábbiak szerint: 0,4 ml, 4 mol/1 guanidin-hidrokloridot tartalmazó PBS-ben oldott 8 mg A pepiidhez 4,5 ml 0,1 mol/l-es NaHCO₃ (pH=8,0) és 0,5 mol/1 NaCl-oldatot adunk. Egy gramm fagyasztva szárított aktivált CH Sepharose 4B-t (Pharmacia) 200 ml mM-os sósavval mosunk és duzzasztunk, majd azonnal átvisszük az A peptid oldatába.

A keveréket éjszakán át 4 °C-on rázatjuk. A gélt ezután klinikai centrifugában ülepítjük, majd a felülúszót megőrizzük, abból a célból, hogy meghatározzuk az A peptid töltethez kapcsolódott mennyiségét. Tizenöt ml 0,1 mol/l-es TRIS-HC1 pH=8,0 puffért adunk a gélüledékhez, majd szobahőmérsékleten inkubáljuk óra hosszat, hogy a reagálatlan kapcsoló csoportok mennyiségét meghatározzuk a tölteten. A gélt ezután oszlopba töltjük (3 ml-es ágytérfogat), majd háromszor mossuk az alábbi pufferekkel:

1. 10 ágytérfogat 0,1 mólos acetátpuffer pH=4,0, amely 0,5 mol/1 NaCl-t tartalmaz;

HU 217 102 Β

2. 0,1 mol/1 TRIS-HC1 pH = 8,0 puffer, amely 0,5 mol/1 NaCl-t tartalmaz.

Az oszlopot végül 0,02% nátrium-azidot tartalmazó PBVS-sel hozzuk egyensúlyba. Az A peptidoldatban és a konjugálás utáni felülúszóban lévő szabad aminocsoportok koncentrációja közötti különbséget meghatározzuk, fluoreszkamin felhasználásával [Chen et al., Arch. Biochem. Biophys., 189, 241 (1978); Nowicki, Anal. Letters, 12, 1019 (1979)]. Ez az elemzés azt mutatja, hogy a peptid 92-95%-a hiányzik az oldatból és a Sepharose gélhez kötődött.

Az anti-A-peptid antitest affinitástisztítása előtt 8 ml immunizált nyúlszérumot dializálunk éjszakán át 2 liter PBS-sel szemben. Az A-peptid Sepharose-oszlopot egymás után mossuk 10-10 ágytérfogat mennyiségben az alábbi oldatokkal: 0,1 mol/1 glicin-HCl pH=2,5, PBS, 0,1 mol/1 trietil-amin pH=ll,5, majd PBS. A dializált szérumot ezután háromszor átengedjük az oszlopon, hogy biztosítsuk az anti-A-peptid antitestek megkötődését. Az oszlopot ezután 20 ágytérfogat mennyiségű PBSsel mossuk, majd 4-4 ágytérfogatnyi mennyiséggel az alábbi oldatokból: 0,1 mol/1 glicin-HCl pH=2,5, PBS, 0,1 mol/1 trietil-amin pH=ll,5, majd PBS. Egy ml-es frakciókat szedünk. A glicines és trietil-aminos mosásokból származó eluátumokat azonnal semlegesítjük 1 mol/1 TRIS-HC1 pH=9, illetve pH=7 pufferrel, majd alikvot részekben vizsgáljuk anti-A-peptid antitesteket ELISA esszével, A pepiiddel borított falú lyukakat alkalmazva. A legmagasabb titerű frakciókat (tipikusan a glicin és trietil-amin elúciók kezdetétől számított 3 ágytérfogaton belül) egyesítjük, majd PBS-sel szemben dializáljuk. A lebegő szilárd részeket rövid centrifugálással eltávolítjuk, majd az affinitástisztított anti-A-peptid felülúszót -70 °C-on tároljuk.

4. példa

Az SN- CNTF gén klónozása

Az ismertetett munka végső célja a humán SN-CNTF gén klónozása, abból a célból, hogy a humán gyógyászati készítményekben való alkalmazáshoz megfelelő anyagot állítsunk elő. Mivel a kapott peptidszekvenciák a nyúlSN-CNTF-nek felelnek meg, és a nyúl-, valamint az emberi szekvenciák nem feltétlenül azonosak, ezért körültekintően először a nyúlgén kiónjait izoláljuk a fehéijeszekvenciák alapján készített szintetikus oligonukleotidokkal végzett hibridizálással, és a nyúlklónokat használjuk hibridizációs próbaként a humán gén keresésekor.

Mind a genomiális, mind a hírvivő RNS (mRNS), nyúl- és humán SN-CNTF-et kódoló szekvenciát előállítjuk. Az mRNS-szekvenciák hasznosak a fehéije expressziójához, míg a genomiális szekvencia az SN-CNTF gén szerkezetének és szabályozásának megismeréséhez szükséges. Ezeknek a szekvenciáknak az előállításához az ülőidegből készített emberi és nyúl genomiális könyvtárakat, valamint az mRNS-ről készített emberi és nyúl cDNS-könyvtárakat átvizsgáljuk. A nyúl- vagy humán SN-CNTF szekvenciájának megfelelő gén előállítása során az is lehetséges, hogy a szerkezetileg szoros kapcsolatban álló géneket is levizsgáljuk, amelyek ezen neurotróf faktorcsaládnak további tagjait jelentik.

A) Az SN-CNTF gén

Az SN-CNTF-et kódoló nyúl genomiális szekvencia izolálásához egy nyúl genomiális könyvtárat (Clontech) szélesztünk Escherichia coli nm538 törzsre, majd körülbelül 1 000 000 rekombináns kiónt vizsgálunk át. A nyúl SN-CNTF fehéijeszekvenciának azokat a részeit, amelyeket a legkisebb számú kodonnal lehet leírni, visszafordítjuk DNS-szekvenciára, és a megfelelő degenerált próbákat megszintetizáljuk. A nyúl-oligonukleotidokat kináz reakcióval jelöljük, Maniatis és munkatársai standard eljárását alkalmazva [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)]. A DNS kináz az US Biochemical Corp.-tői származik, és a gamma-jelzett ATP-t az ICN-tői szerezzük be. Az oligonukleotidokat legalább 1000 000 cmp per pikomol specifikus aktivitásúra jelezzük.

A genomiális könyvtár szélesztésével körülbelül 1 millió tarfoltot viszünk át nitro-cellulóz-lapokra. A lapokat Maniatis és munkatársai módszerével dolgozzuk fel [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)], majd éjszakán át radioaktívan jelzett oligonukleotid-próbával hibridizáljuk. A hibridizációs keverék összetétele: 6xSSC, 2χDenhardt-oldat, 0,05% nátrium-pirofoszfát, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 100 pg élesztő tRNS, pH= 8,0. A hibridizálás hőmérséklete néhány fokkal az oligonukleotid kiszámított Tm pontja alatt van. Azokat a kiónokat, amelyek a fehérjeszekvencia különböző régiói alapján készült próbákkal hibridizálnak, tarfolttisztításnak vetjük alá, majd a hibridizáló régiókat didezoxi terminációs módszerrel szekvenáljuk [Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 5463 (1977)], Sequenase kit felhasználásával (US Biochemical Corp.), azzal a céllal, hogy azonosítsuk azokat a kiónokat, amelyek az SN-CNTF fehéijeszekvenciát kódolják.

B) Az SN-CNTF mRNS-szekvencia

Az ossz celluláris RNS-t nyúl- és emberi ülőidegből állítjuk elő. A szövetet egy guanídium-tiocianát/bétamerkapto-etanol-oldatban homogenizáljuk, majd az RNS-t cézium-klorid-gradiensen keresztül ülepítve tisztítjuk [Glison et al., Biochemistry, 13, 2633 (1974)]. A poliadenilezett RNS-t oligo(dT)-cellulózon végzett kromatográfiával szelektáljuk [Avid and Leder, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 69, 408 (1972)]. A mennyiségi RNS blott hibridizációs elemzést „ellenértelmű” (antisense) oligonukleotid-próbákkal végezzük, hogy megbecsüljük az SN-CNTF-szekvenciák arányát az egyes RNS-preparátumokban, és ezzel megbecsüljük azt, hogy hány független kiónt kell átvizsgálni ahhoz, hogy legalább 99%-os valószínűséggel kapjunk CNTF-klónokat. Elegendő mennyiségű kétszálú komplementer DNS-t Gubler és Hoffinan szerint szintetizálunk [Gubbler and Hoffinan, Gene, 25, 263 (1983)], majd a <j)gem2 vektorba (Promega Biotech) építjük be [Palazzolo andMeyerowitz, Gene, 52, 197 (1987)].

A nyúl-SN-CNTF-et kódoló kiónokat a rekombináns fág tarfoltokkal végzett hibridizálással azonosítjuk, az előzőkben leírt módon. A kiónok azonosságát a

HU 217 102 Β nukleotidszekvencia meghatározásával igazoljuk, a teljes ismert fehérjeszekvenciávai való összehasonlítás alapján. A humán ülőideg cDNS-próbákkal végzett vizsgálatok [Feinberg and Vogelstein, Anal. Biochem., 132, 6 (1983)] sokkal megbízhatóbbak a fajok közötti kereszthibridizálás kimutatásában, mint a kisebb, a nyúl-cDNS-könyvtár vizsgálatában alkalmazott oligonukleotidok alkalmazása.

A polimeráz-láncreakciót (PCR) [Saiki et al., Science, 239, 487 (1988)] használjuk a nyúl CNTF aminosavszekvenciáknak megfelelő DNS-fragmensek megsokszorozására. Az ilyen DNS-ffagmenseket humán és nyúl genomiális DNS-ből, valamint nyúlülőideg és szimpatikus ganglion cDNS-ből sokszorozzuk meg. A megsokszorozott DNS-szekvenciákat szubklónozzuk, és standard módszerrel szekvenáljuk [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν. Y. (1982)].

A PCR-rel kapott DNS-fragmenseket arra is használjuk, hogy nyúlülőideg cDNS-klónokat és humán genomiális könyvtárat átvizsgáljunk velük. Egy pozitív nyúl cDNS-klónt és pozitív humán genomiális kló5 nokat megtisztítunk és részlegesen szekvenálunk. A nyúl vagy humán CNTF kódoló (mRNS-nek megfelelő) szekvenciának megfelelő nyílt leolvasási keret szekvenciája megerősíti a PCR-rel kapott kódoló régió fragmensek szekvenciáját. Az így kapott, nyúl- és hu10 mán CNTF-et kódoló szekvenciákat all., illetve 12. ábrán mutatjuk be.

A nyúl-SN-CNTF-ből kapott aminosavszekvencia részeit visszafordítjuk az 1., 13., 7. és 12. sorszámú degenerált nukleotidokra, valamint a 3., 14., 8., illetve

17-es sorszámú komplementereikre. Az aminosavszekvenciákat (felül) és a megfelelő érdemes, illetve ellenértelmű degenerált oligonukleotidokat (alul) adjuk meg az alábbiakban:

Y-V-K-H-Q-G-L-N-K-N-1 -N-L-D-S-V-D-G-V-P-M-A (5’) ***U****** ****₁₃m*»* *****₇***** _(3>) (3’) ****3****** ****i4***** *****₈***** ₍₅,_}

K-L-W-G-L-K-V-L-Q-E-L-S (5’) * * * * 1 2* * * * * (3’) (3’) ****17***** (5’)

Mindegyik degenerált oligonukleotid értelmes szálának megadjuk a nukleotidszekvenciáját az alábbiakban (ahol N bármely nukleotidot jelenthet):

#1 5’-TA(T/C) GTN AA(A/G) CA(T/C) CA(A/G) GG-3’ #13 5’-AA(T/C) AA(A/G) AA(T/C) AT(A/T/C) AA(T/C) (C/T)T-3’ #7 5’-GA(T/C) GGN GTN CCN ATG GC-3’ #12A 5’-AA(A/G) TT(A/G) TGG GGN TT(A/G) AA-3’ #12B 5’-AA(A/G) TT(A/G) TGG GGN CTN AA-3’ #12C 5’-AA(A/G) CTN TGG GGN TT(A/G) AA-3’ #12D 5’-AA(A/G) CTN TGG GGN CTN AA-3’

Az egyes polimeráz láncreakciók végrehajtásához sek amplifikálódnak, amelyeknek a szekvenciája megvagy humán, vagy nyúl genomiális DNS-t használunk templátként és a #1, illetve #8 vagy a #1, illetve #17-es oligonukleotidokat használjuk indítómolekulaként, abból a célból, hogy megsokszorozzuk a humán és nyúlCNTF gének megfelelő régióit. A reakciótermékek Southem-blottjai (a #13 oligonukleotidot használva próbaként) felfedik egy körülbelül 66 bp méretű (#1 és #8) és egy körülbelül 366 bp méretű (#1 és #17) jelzett csík jelenlétét.

Az előzőkben leírt PCR-reakciókkal azonos reakciókat végzünk vagy nyúlülőideg vagy ganglion mRNSből készített cDNS felhasználásával. Az RNS-t nyúlülőidegből vagy szimpatikus ganglionokból állítjuk elő, majd egy oligo (dT) oszlopon bocsátjuk át, hogy az előzőekben leírt módon szelektáljuk az mRNS-t. A komplementer cDNS-t (cDNS) reverz transzkriptázzal állítjuk elő, az mRNS-t használva templátként és oligo(dT)-t indítómolekulaként. Ha a PCR-t úgy hajtjuk végre, hogy vagy cDNS-t használunk templátként és vagy a #1 és #8 vagy a #1 és #17 oligonukleotidokat használjuk indító molekulaként, akkor azok a fragmen40 egyezik a nyúl genomiális cDNS-ből sokszorozott fragmensek szekvenciájával (11. ábra). Ez azt jelzi, hogy nincsenek intronok a CNTF gén fehérjét kódoló régiójában a #1 és #17 oligonukleotidok között.

Egy másik stratégiát is alkalmaztunk, hogy a nyúl45 CNTF kódoló (hírvivő RNS ekvivalens) szekvenciájából többet megkapjunk: kétszálú cDNS-t állítunk elő nyúlülőideg mRNS-t használva templátként és egy oligo-dT/Notl linker adaptert indítómolekulaként. Ezt követően egy EcoRI/XmnI linker adaptert (5’-AAT50 TCGAACCCCTTCG-3’) adunk a kétszálú cDNS 5’végéhez tompavég ligálással [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)]. A polimeráz láncreakciót ennek a cDNS-nek mint templátnak és a #8 oligonukleotidnak, valamint az EcoRI/XmnI linker adapternek mint indítómolekulának a felhasználásával hajtjuk végre. A reakciótermék Southem-blottjával (próbaként a radioaktívan jelzett #13 oligonukleotidot használjuk) kiderült, hogy egy körülbelül 200 bp méretű jelzett csík létezik.

HU 217 102 Β

A nyúl-CNTF cDNS-klónjai előállításához egy cDNS-könyvtárat hozunk létre nyúlülőideg poli(A) mRNS-ből az előzőekben leírt módon, azzal a különbséggel, hogy a 0gem2 helyett a lambdagtlO vektort (Stratagene) használjuk. Ebből a könyvtárból körülbelül 4χ 10⁶ tarfoltot vizsgálunk át egy olyan próba alkalmazásával, amelyet úgy állítunk elő, hogy templátként nyúl szimpatikus ganglion cDNS-t, indítómolekulaként a #8 oligonukleotidot és az EcoRI/XmnI linkért használva (lásd fent) előállított PCR-fragmens Ml3 szubklónját véletlenszerűen jelezzük.

Az egyetlen primer pozitívot tarfolttisztításnak vetjük alá egy harmadik szűrővizsgálatban. EcoRI restrikciós enzimmel való emésztés után az ebből a klónból származó DNS három fragmenst eredményez a lambda karok mellett: körülbelül 2,0, 1,5 és 0,6 kb hosszúságúak. Az

I, 5 kb méretű fragmens Southem-blott elemzésével kimutatható, hogy más, előzőekben említett CNTF specifikus oligonukleotidokhoz és PCR-ffagmensekhez is hibridizál. Ennek az 1,5 kb méretű cDNS-fragmensnek a DNS-szekvenciájából kiderül, hogy a nyúl-CNTF teljes kódolószekvenciáját tartalmazza (11. ábra).

A humán CNTF genomiális DNS-klónjai előállításához a humán genomiális DNS-könyvtár körülbelül 3xl0⁶, lambdaEMBL3 vektorban lévő tarfoltját vizsgáljuk át egy olyan próbával, amelyet úgy állítunk elő, hogy humán genomiális DNS-t használva templátként és a #1, illetve #17 oligonukleotidokat használva indítómolekulaként (lásd az előzőkben) előállítunk egy PCR-fragmenst, és ennek Ml3 aminosavszubklónját véletlenszerűen jelezzük. A primer pozitívak közül hatot tarfolttisztításnak vetettük alá, majd egy további vizsgálatban az derült ki, további CNTF specifikus oligonukleotidokhoz és PCR-fragmensekhez hibridizálnak. Az egyik klónból egy 0,6 kb méretű, a #13 oligonukleotidhoz hibridizálódó BamHI restrikciós fragmenst szubklónozunk BamHI restrikciós enzimmel emésztett M13mpl9 fágban, majd szekvenáljuk.

A nyúl kiindulási anyagból PCR-rel kapott fragmensek DNS-szekvenciáit az átlapolószekvenciák alapján kombinálva kapjuk meg all. ábrán bemutatott nyúl-SN-CNTF kódoló (mRNS-ekvivalens) szekvenciáját. A humán genomiális DNS-ből és humán genomiális klónokból PCR-rel kapott fragmensek DNSszekvenciáit az átlapolószekvenciák alapján kombinálva kapjuk a humán SN-CNTF 12. ábrán bemutatott kódolószekvenciáját. A nyúl és az ember CNTF nukleinsav-szekvenciája körülbelül 89%-ban azonos (12. ábra), jelezve, hogy a nyúl- és emberi szekvenciák homológ CNTF-et kódoló génekből származnak. Amint az a

II. ábrán látható, a nyúl-CNTF nukleinsavszekvenciájának egyes részeit megerősítik a korábbi példákban kapott, tisztított SN-CNTF fehérje aminosavszekvenciái.

A polimeráz láncreakciót az előzőekben leírt templátokkal és indítómolekulákkal hajtjuk végre. A reakció programja az alábbi:

denaturálóciklus: 1 perc 95 °C-on illesztőciklus: 1,5 perc 40 °C-on növekedési ciklus: 4 perc 72 °C-on

A reakciót 30 ciklusban hajtjuk végre. A reakciótermékeket 2%-os agarózgélen elektroforetizáljuk, majd Zeta-Bind-membránokra visszük át (BioRad, Richmond, CA) a Southem-blott céljára. A CNTF kódolószekvencia megsokszorozott részeinek azonosításához a Southem-blottokat radioaktív izotóppal jelzett oligonukleotiddal mint próbával vizsgáljuk át, amelyről a CNTF fehérjeszekvencia alapján ismert, hogy a reakció indításához használt oligonukleotidok között fekszik. A Southem-blott után kapott jelzett csíkokat kivágjuk az eredeti gélből, és klónozáshoz készítjük elő oly módon, hogy a végeket a DNS-polímeráz Klenowfragmensével kezeljük (New England Biolabs, Beverly, MA), mind a négy dNTP jelenlétében, majd a DNS-t T4 polinukleotid kinázzal (US Biochemical Corp., Cleveland, OH) és ATP-vel kináz reakcióba visszük. A megfelelő DNS-darabokat ezután M13mpl0, Smal restrikciós enzimmel emésztett, defoszforilezett vektorba szubklónozzuk (kereskedelmi forgalomban hozzáférhető az Amersham Corp.-nél, Arlington Heights, IL). Az érdekes fágokat tartalmazó rekombináns fágokat Benton és Davis vizsgálati módszerével [Science, 196, 180 (1977)] azonosítjuk, a #13 oligonukleotidot használva próbaként. Ezeket a rekombináns kiónokat megfelelő mennyiségben elszaporítjuk, hogy elegendő egyszálú DNS-t kapjunk a szekvenáláshoz, majd ezután a didezoxi láncterminációs módszerrel szekvenáljuk [Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 5463 (1977)].

Amikor hosszú, véletlenszerűen jelzett DNS-próbákat használunk, akkor az alábbi hibridizációs körülményeket alkalmazzuk: 5xSSCP, 2χDenhardt-oldat, 2 mM EDTA, 0,05% nátrium-pirofoszfát, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS), 250 pg/ml heringsperma DNS (nem specifikus kompetitor), pH=8,0. A hibridizálást 65 °C-on végezzük, majd a biottokat vagy membránokat 65 °C-on mossuk 0,1 χ SSCP és 0,1% összetételű oldatban. A rövidebb oligonukleotid-próbák esetében a hibridizációs körülmények az alábbiak: 6χ SSCP, 2 χ Denhardt-oldat, 2 mM EDTA, 0,05% nátriumpirofoszfát, 0,1% SDS, 100 pg/ml élesztő tRNS (nem specifikus kompetitor), pH=8,0. A hibridizálás hőmérséklete, valamint a biottok és membránok mosásának körülményeit egyenként igazítjuk az egyes oligonukleotid-próbák GC-tartalmához [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν. Y. (1982)].

5. példa

Az SN-CNTF-et kódoló gének expressziója állati sejtekben

Az SN-CNTF állati sejtekben való expressziója az alábbi lépéseket követeli meg:

a) egy expressziós vektor előállítása

b) egy gazdasejtvonal megválasztása

c) az expressziós vektor bejuttatása a gazdasejtekbe, és

d) a rekombináns gazdasejtek manipulálása, annak érdekében, hogy az SN-CNTF expressziója szintjét megnöveljük

HU 217 102 Β

a) Az állati sejtekben való felhasználásra tervezett SN-CNTF expressziós vektorok különböző típusúak lehetnek, beleértve az erős konstitutív expressziós vektorokat, az indukálható génkonstrukciókat, valamint azokat, amelyeket bizonyos sejttípusokban való expresszálás céljára terveztek. Mindegyik esetben a promotereket és más génszabályozó régiókat, például az enhanszereket (akár indukálható, akár nem), a poliadenilezési szignálokat a cDNS-szekvenciákhoz viszonyítva a megfelelő helyre helyezzük. Az ilyen konstrukciókra az alábbi példákat mutatjuk be:

1. Egy erős konstitutív promoter régiót használó a simian vírus (SV40) génszabályozó szignáljaival kell elkészíteni, olyan elrendezésben, mint amely a pSV2CAT plazmidban található [Gorman et al., Mól. Cell. Bioi., 2, 1044-1051 (1982)], a publikációt a továbbiakban referenciának tekintjük. Ezt a plazmidot kell manipulálni oly módon, hogy a kloramfenikol-acetil-transzferázt (CAT) kódoló szekvenciát az SN-CNTF DNS-szakasszal helyettesítjük standard molekuláris biológiai módszerekkel [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)].

2. Egy indukálható génkonstrukciót kell készíteni, az egér metallotionein gén (MT-1) promoter régióját tartalmazó PMK plazmid [Brinster et al., Cell, 27, 228-231 (1981)] felhasználásával. Ezt a plazmidot használhatjuk kiindulási anyagként, és manipulálhatjuk oly módon, hogy egy fémmel indukálható génkonstrukciót kapjunk.

b) Számos állati sejtet kell alkalmazni az SN-CNTF expressziójához az előzőkben leírt vektorok alkalmazásával, az aktív fehéije előállítása céljából. Két potenciális sejtvonal, amelyeket jól jellemeztek azon tulajdonságaik alapján, hogy idegen gének expresszióját elősegítik, az egér Ltk' és az aranyhörcsög petefészek (CHO) dhfr- sejtek, jóllehet az SN-CNTF expressziója nem korlátozódik ezekre a sejtvonalakra.

Az előzőkben említett, expresszióra használható sejtvonalak mellett alkalmazható sejtek közé tartozik még a majomvesesejt COS-7, amely alkalmas a tranziens expresszióra, valamint a humán embrionális vesesejt 293.

c) A vektor-DNS-t be kell juttatni ezekbe a sejtvonalakba, a számos ismert géntranszfer technika egyikének alkalmazásával. Az alkalmazott módszerek közé tartozik például a kalcium-foszfát-DNS precipitációs technika [Graham and A. S. van dér Eb, Virology, 52, 456-467 (1973)], amikor is az SN-CNTF expressziós vektort együtt csapják ki egy második, szelektálható markert tartalmazó expressziós vektorral. Az Ltk^- sejtek transzfekciója esetében a szelektálható marker a timidin-kináz gén, a szelekciót Wigler és munkatársai módszerével végezzük [Cell, 16, 777-785 (1979)], a CHO dhfr- sejtek esetében a szelektálható marker dihidrofolát-reduktáz (DHFR), amelynek a szelekcióját Ringold és munkatársai módszerével végezzük [J. Mól. Appl. Génét., 1, 165-175 (1981)].

d) Az SN-CNTF konstrukciókat expresszáló sejteket olyan körülmények között kell növeszteni, amelyek megnövelik az SN-CNTF termelési szintjét. A metallotionein promoter konstrukciót hordozó sejteket nehézfémek, például kadmium jelenlétében lehet növeszteni, ami az MT-1 promoter ötszörösre nőtt alkalmazásához vezet [Mayo et al., Cell, 29,99-108], ennek következtében az SN-CNTF-szint arányos emelkedése történik. Az SN-CNTF expressziós vektorokat tartalmazó sejteket (akár SV40, akár MT -1 alapú), a DHFR expressziós vektorral együtt átvihetjük a génsokszorozó eljáráson [Ringold et al., J. Mól. Appl. Génét., 1, 165-175 (1981)], metotrexátot, a DHFR kompetitív antagonistáját alkalmazva. Ez a sejtekben jelen lévő DHFR gének megnövekedett kópiaszámához vezet, és ezzel egy időben az SN-CNTF gének megnövekedett kópiaszámához, és ennek következménye, hogy a sejtek több SN-CNTF fehéijét termelnek.

Egy további expressziós vektort (pCMVXVPL2) is használunk, hogy a nyúl CNTF kódoló szekvenciát ideiglenesen expresszáljuk COS-7 sejtekben. Ez a plazmidvektor a citomegalovírus (CMV) közvetlen korai promoterét és enhanszer-szekvenciáját tartalmazza [Boshardt et al., Cell, 41, 521-530 (1985)]. Ezt a plazmidot a 13. ábrán látható módon lehet előállítani. A poliadenilezési szekvencia a simian vírus-40 (SMV40) szekvenciákból származik [Reddy et al., Science, 200, 494-502 (1978)]. Az SV40 replikációs origót tartalmazza ez a plazmid, hogy megkönnyítse a COS sejtekben való alkalmazását a tranziens expressziós vizsgálatokban.

A nyúl-SN-CNTF-et az alábbiak szerint expresszáljuk a COS-7 sejtekben:

A nyúlülőideg teljes kódolórégióját tartalmazó nyúlülőideg-cDNS-klón (4. példa) 1,5 kb méretű restrikciós fragmensét klónozzuk az EcoRI restrikciós enzimmel emésztett pCMVXVPL2 expressziós vektorban. Azt a kiónt választjuk ki, amely SacI és BamHI restrikciós enzimmel emésztve, az 1,5 kb méretű EcoRI fragmensnek a CNTF expressziója szempontjából a vektorba való megfelelő orientációjú beépülése következtében várt méretű restrikciós fragmenseket adja. Az ebből a konstrukcióból származó plazmid-DNS-t a lúgos lízis módszerrel állítjuk elő, majd CsCl ultracentrifugálással tisztítjuk [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)]. Ezt a DNS-t visszük át COS-7 sejtekbe Sompayrac és Dánná módszerével [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78, 7575-7578 (1981)]. Kontrollként megfelelő COS sejttenyészeteket transzferálunk az inszertet nem tartalmazó vektor-DNS-sel.

A transzfekció után negyvennyolc órával a rétegző táptalajt és a sejtüledéket összegyűjtjük. A sejtüledéket feltárjuk, jégen röviden besugározva ultrahanggal 20 mM nátrium-foszfát (pH = 6,7), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF és 0,1 pmol/l pepsztatin összetételű pufferben. Mind a sejtkivonatból, mind a rétegző táptalajból sorozathígítást készítünk, és megvizsgáljuk biológiai aktivitását a ganglion túlélési vizsgálatban.

A CNTF cDNS-fragmenst tartalmazó vektorokkal transzfektált sejtekből származó sejtírivonatok titere körülbelül 15 000 TU/ml a biológiai vizsgálatokban, és kö19

HU 217 102 Β rülbelül 50 ng/ml CNTF-et tartalmaznak Westem-blottal végzett elemzés szerint. Sem a csak a vektorral transzfektált tenyészetek sejtkivonatai, sem bármely vektor felülrétegző táptalaja nem mutatott kimutatható biológiai aktivitást vagy Westem-blottal kimutatható CNTF-et. Ez az eredmény tisztán igazolja, hogy az általunk klónozott CNTF cDNS egy olyan fehérjét kódol, amely az autentikus SN-CNTF várt biológiai aktivitásával rendelkezik.

6. példa

Az SN- CNTF tisztítása a rekombináns állati sejtekből

Mivel az SN-CNTF-et várhatóan hasonló sejtek szintetizálják, mint a természetes anyagot, azt várjuk, hogy az előzőkben leírt módszerek a természetes fehérje tisztítására lehetővé teszik a hasonló tisztítást és a rekombináns fehérje jellemzését.

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerinti eljárások és termékek különbözőképpen módosíthatók és variálhatók. Ezért az a szándékunk, hogy a jelen találmány lefedje a módosításokat, variációkat, azzal a feltétellel, hogy azok az igénypontok oltalmi körébe tartoznak, azzal ekvivalensek. Az SN-CNTF szakkifejezés szándékaink szerint az összes fajra vonatkozik, hacsak a szakkifejezést nem előzi meg közvetlenül egy fajmegjelölés.

7. példa

A humán rekombináns CNTF előállítása

A jelen találmány egy megvalósítási módja szerint a humán rekombináns CNTF előállítására létrehoztunk egy rendszert Escherichia coliban. Az expresszálandó DNS elkészítéséhez két eltérő módszert és két különböző expressziós vektort használunk. Mindegyik expressziós rendszer variáns oldható CNTF fehérjét eredményez nagy mennyiségben, amely biológiailag aktív a baktérium sejtkivonatban. Az ezeknek a termelési rendszereknek a létrehozási módszereit írjuk le az alábbiakban. Meg kell jegyezni, hogy az alábbiakban egy zárójelben megadott tulajdonság (például [233]) arra a sorszámú bázisra vonatkozik, amelynél a tulajdonság kezdődik az ATG iniciációs kodon A bázisa [1] után a humán CNTF-et kódoló szekvenciában (12. ábra).

1. DNS előállítása a CNTF expressziójához

Az 5 ’-vég előállításának stratégiája (14. ábra)

A 4. példából származó, EMBL3 lambda fágban lévő CNTF humán genomiális DNS-klónt Sáli és HindlII restrikciós enzimmel emésztjük, majd egy 4,3 kb méretű fragmenst gélen tisztítunk, amely fragmens a HindlII hely előtt [233] tartalmazza a CNTF kódolószekvenciát. Ez a 4,3 kb méretű fragmens tartalmaz még egyetlen, körülbelül 1,3 kb méretű intront [114-115] a kódolószekvenciában. Hogy lehetővé tegyük az expressziót baktériumsejtekben, az intront helyspecifrkus mutagenezissel in vitro eltávolítjuk, egy szintetikus oligonukleotidot alkalmazva [J. A. McClary, F. Whitney, J. Geisselsoder, Biotechniques, 7,282-289 (1989)].

A) Introndeléció helyspecijikus mutagenezissel, phagemid vektort és genetikai szelekciót alkalmazva

A helyspecifikus mutagenezist azért hajtjuk végre, hogy kihasítsuk a körülbelül 1,3 kb méretű intront a Bluescript SK M13(-) vektorba (Stratagene) szubklónozott 4,3 kb méretű Sall/HindlII DNS-fragmensből. Ezt a vektort azért választjuk, mivel képes befogadni a nagyméretű (körülbelül 4,3 kb) Sall/HindlII inszertumot. A phagemid vektorok olyan plazmidvektorok, amelyek az fl bakteriofág intergenikus régióját tartalmazzák, és ez a régió lehetővé teszi az egyszálú DNS formában való kimentést. A phagemid vektorok emellett számos előnnyel rendelkeznek még az egyszálú Ml3 bakteriofág vektorokkal szemben. Mivel a phagemid vektorok mérete kisebb, mint az Ml 3 vektorok fele (amelyek körülbelül 2,3 kb-nál kisebb inszertumokat tudnak elfogadni), nagyobb inszertumok klónozhatok könnyebben a phagemidekbe, és a spontán deléciók valószínűsége csökken. A phagemidek egyéb előnyei közé tartozik még, hogy az inszertumot közvetlenül a kétszálú, supercoiled DNS-ről közvetlenül meg lehet határozni, azáltal egyszerűsödik a jellemzésük.

A mutagenezist a Muta-Gene in vitro mutagenezis kittel végezzük (BioRad). A mutagenezishez való templát készítésénél a gazdasjet az Escherichia coli CJ236 törzs (genotípus: dut, ung, thi, relA, pCJ105[cap^r]). A CJ236 egy kloramfenikollal szelektálható F’ faktort hordoz, ezzel lehetővé teszi az egyszálú phagemid DNS kimentését egy, a jelen találmányban alkalmazott megfelelő helper fág, az R408 felhasználásával. A kimentett egyszálú phagemid DNS részlegesen uracillal van helyettesítve, a CJ236 dut (dUTP-áz) és ung (uracil N-glikoziláz) mutációi következtében. Az uracillal helyettesített és mutagenezisre használt templát DNS szelektíven tönkremegy, ha olyan gazdasejtbe transzformáljuk, amely vad típusú ung fókuszokat tartalmaz, ebben az esetben például a DH5a, ezzel lehetővé teszi az újonnan szintetizált, mutáns DNS preferált replikációját.

A mutagenezis végrehajtásához a gélen tisztított 4,3 kb méretű Sall/HindlII fragmenst Sall/HindlII restrikciós enzimmel emésztett és gélen tisztított Bluescript SK M13(-) vektorba ligáljuk. A ligáit DNS-t Hanahan módszerével kompetenssé tett CJ236 sejtekbe juttatjuk be [J. Mól. Bioi., 166, 557 (1983)]. A transzformánsokat 50 pg/ml ampicillint (a phagemid szelektálására) és 30 pg/ml kloramfenikolt (az F’ faktor megtartásának szelektálására) tartalmazó lemezeken szelektáljuk. A transzformánsokban leellenőrizzük a megfelelő inszertum jelenlétét, a transzformánsok DNS-ének restrikciós enzimes emésztésével. Egy, a megfelelő inszertumot tartalmazó transzformánst (pSHM-D19) használunk a további mutagenezis kísérletben.

A pSHM-D 19-ből származó egyszálú templátot kimentjük, helper tágként az R408 fágot alkalmazva. A CJ236-ot tartalmazó pSHM-D19 sejteket Luria-táptalajban növesztjük, amely 50 pg/ml ampicillint és 30 μ g/ml kloramfenikolt tartalmaz, körülbelül A₆₀₀ értékig. A sejteket R408 helper tággal fertőzzük, 20-as fertőzési multiplicitással, majd 8-14 óra hosszat rázatjuk 37 °C-on. Az egyszálú templátot a kimentett phagemidekből extraháljuk.

HU 217 102 Β

A helyspecifikus introndeléciós mutagenezist egy 71 tagú oligonukleotiddal végezzük (1-es oligonukleotid a 16. ábrán). Az 1-es oligonukleotid 1-30 bázisa komplementer a kódolószállal, az intron mögött közvetlenül 3’-irányban, a 31-71-es bázisok pedig a CNTF genomiális DNS-ből kivágandó intron előtt közvetlenül 5’irányban. A mutagenezisben való felhasználás céljára az oligonukleotidot T4 polinukleotid kinázzal foszforilezzük. A mutagenezis reakciókat a BioRad MutaGene kitjével végezzük, a gyártó előírásai szerint, azzal a kivétellel, hogy a mutagenezis során keletkező DNS-t használjuk Escherichia coli DH5_a sejtek transzformálására. A deléciós mutánsokat a DNS-ek restrikciós térképezésével, valamint a megfelelő restrikciós térképpel rendelkező mutánsok DNS-ének szekvenálásával jellemezzük. A pMCN-21 egy megfelelő delécióval rendelkező intronmentes mutáns a Bluescript phagemidben.

B) A CNTF gén 5 ’-végének rekonstrukciója az expresszióhoz

A CNTF kódolószekvenciájának az 5’-végét helyreállítjuk, azzal a céllal, hogy bizonyos változásokat hajtsunk végre, olyanokat, amelyek nem változtatják meg a kódolt aminosavakat, de amelyek valószínűleg megnövelik az expresszió hatékonyságát baktériumokban. A részlegesen átfedő, komplementer 2-es és 3-as oligonukleotidokat (16. ábra) megszintetizáljuk, gélen tisztítjuk, majd egymáshoz illesztjük. A 2-es oligonukleotid a humán CNTF-ben az Nhel restrikciós hasítási helytől [66] upstream irányban lévő aminosavakat kódolja. A 2-es oligonukleotid kódolószekvenciája számos olyan bázist tartalmaz, amelyek eltérnek a humán génben találhatóktól (a 12. és 16. ábrák összehasonlításából látható). Ezeket a változásokat azért tettük egyrészt, hogy a humán kodonhasznosítást az Escherichia coli által előnyben részesítettre változtassuk [deBoer and Kastelein, From Gene to Protein: Steps Dictating the Maximai Level of Gene Expression, Davis and Reznikoff, eds., 225-283 (1986), Butterworths, New York], másrészt pedig azért, hogy egy BglII restrikciós hasítási helyet hozzunk létre (16. ábra) a szekvenciában, azzal a céllal, hogy megkönnyítsük a további genetikai manipulációkat. A 2-es oligonukleotid egy transzlációs csatolót is kódol az 5’-vég irányban (16. ábra), hogy elősegítsük a hatékony transzlációt. Az egymáshoz illesztett 2-es és 3-as oligonukleotidok egy BamHI túlnyúló véggel rendelkeznek az 5’-végen és egy Nhel túlnyúló véggel a 3’-végen, a további ligálás és klónozás megkönnyítése céljából (14-16. ábra). A humán CNTF gén DNS-szekvenciájának átvizsgálása egyetlen Nhel restrikciós hasítási helyet mutat [66] (12. ábra). Ezért a 2-es és 3-as oligonukleotidokat úgy terveztük, hogy Nhel túlnyúló véget tartalmazzanak, amely lehetővé teszi, hogy a gén Nhel restrikciós enzimmel való emésztése után megmaradó 3 ’-véghez kapcsoljuk őket.

C) A 2-es és 3-as oligonukleotidok hozzákapcsolása az intron nélküli szekvenciához

A 2-es és 3-as oligonukleotidokat, amelyek a CNTF újjáépített amino-terminálisát tartalmazzák, egymáshoz illesztjük, és az Nhel restrikciós enzimmel emésztett pMCN-2 plazmidba ligáljuk. A ligáit DNS-t ezután

BamHI és HindlII restrikciós enzimmel emésztjük, hogy a CNTF-Synl néven említett DNS-szekvenciát, amely az Escherichia coliban való expresszióhoz szükséges szekvenciákat tartalmazza és a humán CNTF-et kódoló szekvenciát tartalmaz, a HindlII restrikciós hasítási hely előtt [233].

A 2. stratégia az 5 '-vég klónozásához (15. ábra)

Egy másik stratégiát is végigvihetünk, amely szerint az intront nem távolítjuk el helyspecifikus mutagenezissel, ehelyett egy teljesen szintetikus DNS-szekvenciát állítunk elő, amely a HindlII restrikciós hasítási [233] helytől 5’-irányban lévő CNTF-et kódolja, az intron nélkül. Ennek a szintetikus DNS-konstrukciónak az előállításához a 17. ábrán látható 5-10. oligonukleotidokat szintetizáljuk. A következő oligonukleotidokat tervezzük meg, amelyek részlegesen átfedő, kétszálú párokat képeznek: 5&6, 7&8, 9&10. Mindegyik kétszálú pár egyszálú túlnyúló végeket tartalmaz, ami lehetővé teszi, hogy az 5&6-7&8-9&10 sorrendben egymáshoz ligáljuk őket. Az oligonukleotidokat gélen tisztítjuk, egymáshoz illesztjük, majd összeligáljuk, így kapunk egyetlen 261 bp méretű kétszálú DNS oligonukleotidot, a továbbiakban CNTF-Syn2 néven hivatkozunk rá. Ez a szintetikus DNS tartalmaz még:

1. megváltoztatott kodonokat, amelyek illeszkednek az Escherichia coli kodonhasznosításához (a 12. és 17. ábrák összehasonlítása alapján);

2. a fentiekben alkalmazott 5’ transzlációs csatolót (16. és 17. ábra); és

3. egy BamHI 5’ túlnyúló véget és egy 3’ HindlII túlnyúló véget a ligálás és klónozás megkönnyítése céljából (17. ábra).

Az expressziós konstrukció 3’-végének előállítása (14. vagy 15. ábra)

A 4. példából származó, EMBL3 lambda fágban lévő CNTF humán genomiális DNS-klónt HindlII restrikciós enzimmel emésztjük, majd egy 2,1 kb méretű fragmenst gélen tisztítunk, amely fragmens a HindlII hely után [233] tartalmazza a CNTF-kódolószekvenciát. Ezt a 2,1 kb méretű fragmenst a HindlII restrikciós enzimmel emésztett pEMBL8 plazmidba [Dente et al., Nucleic Acids Research, 11, 1645 (1983)] klónozzuk. A 2,1 kb méretű inszertbe egy Spel restrikciós hasítási helyet építünk be helyspecifikus mutagenezissel, a CNTF-kódolószekvencia stopkodonja után 13 bázispárral, a 4-es szintetikus oligonukleotid felhasználásával (16. ábra). A mutáltatott plazmidot HindlII és Spel restrikciós enzimmel emésztjük, hogy felszabadítsuk a downstream kódolófragmenst, ezt azután gélen tisztítjuk, és a továbbiakban CNTF-Syn3 néven említjük (a humán CNTF kódolószekvenciáját tartalmazza a HindlII hely után [233]).

A teljes expressziós konstrukció előállítása

A CNTF-Synl fragmenst a CNTF-Syn3-hoz ligáljuk, így állítjuk elő a CNTF-Synl/3 konstrukciót (14. ábra), majd a CNTF-Syn2-t a CNTF-Syn3-hoz ligáljuk, így állítjuk elő a CNTF-Syn2/3 konstrukciót (15. ábra), azzal a céllal, hogy két alternatív DNS-szekvenciát állítsunk elő, mindegyik a humán CNTF-et kódolja, és a DNS-szekvencia megfelelő módosításokkal

HU 217 102 Β rendelkezik ahhoz, hogy elősegítse az Escherichia coliban való hatékony expressziót. Ezeket a DNS-fragmenseket azután Escherichia coliban expresszáljuk, miután szubklónoztuk:

A) egy pT5T jelű baktérium expressziós vektorba (a vektor a T7 fág promoterére alapul); vagy

B) egy pT3XI-2 jelű baktérium expressziós vektorba [a vektor a hibrid laktóz és triptofán operon promoterére alapul (‘Tac’)].

2. A CNTF expressziója, a „T7 promoter” expressziós rendszerre alapozva (lásd a 17. ábrát a vektor tulajdonságait illetően)

ATCGATGATA AGCTGCAAA CATGAGAATT GAGCTCCCCG GAGATCCTTA GCGAAGCTA

Clal

AGGATTTTTT TTAGATCT

BglII

B) A teljes expressziós vektor előállítása

A gélen tisztított vektort BamHI és Spei restrikciós enzimekkel linearizáljuk. A CNTF-Syn 1/3 szekvenciát összekeveijük a linearizált vektorral, majd összeligáljuk, így kapjuk a pT5T:CNTF-Synl/3 konstrukciót. (Lásd a 14. ábrát a vektorkonstrukció általános menetéről.)

C) A rekombináns humán CNTF expressziója Escherichia coliban

A pT5T: CNTF-Syn 1/3 konstrukciót Escherichia coli BL21 (DE3) törzsbe transzformáljuk expresszálás céljából. Ezt a törzset Studier és Moffat írta le [J. Mól. Bioi., 189, 113-130 (1986)], tartalmazza a T7 RNS polimerázt az IPTG-vei indukálható lac promoter szabályozása alatt egy nem kivágható lizogén lambda bakteriofágon. 10 transzformánst vizsgálunk le, ezek közül kettőről derült ki, hogy egy IPTG-vel indukálható fehéijét expresszál, amely a CNTF-nek megfelelő molekulasúlytartományban vándorol (körülbelül 24 kD). Ennek a két kiónnak a jele pT5T:CNTF-Synl/3-5a és 5c. A pT5T:CNTF-Synl/3-5a és 5c szekvenálása megerősítette, hogy a rekombinánsok szekvenciája helyes.

A rekombináns CNTF magas szintű expresszióját úgy érjük el, hogy a sejteket 15 μ g/ml tetraciklinnel kiegészített Luria táptalajban tenyésztjük, amíg a 0,5-0,8 A₆₀₀ sejtsűrűségértéket elérjük. A sejteket 1,5-4 óra hosszat növesztjük, IPTG nélkül („indukálatlan”) vagy 1,0 mM végkoncentrációjú IPTG jelenlétében („indukált”). Az IPTG (izopropil^-D-tiogalaktopiranozid) a lac operon inducere, amelynek jelenléte eredményezi az expressziós vektor T7 polimeráza indirekt aktiválását és a CNTF expressziójának megnövekedett mértékét.

D) Az expresszált fehérje elemzése SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel, majd ezt követő Coomassie Blue festéssel vagy immun-blottal

A sejteket rövid centrifugálással nyeljük ki, majd közvetlenül SDS-poliakrilamid gél mintapufferben szuszpendáljuk (összetétele: 0,025% brómfenolkék, 10% glicerin, 1% β-merkapto-etanol, 2% SDS, 0,0625 mM TRIS-HC1 pH=6,8), majd két percig forraljuk (20. és 21. ábra). A pT5T:CNTF-Synl/3-5a

A) A pT5T ismertetése

A T7 promoter alapú pT5T expressziós vektor lényegében megegyezik a pJU1003-mal [Squires et al., J. Bioi. Chem., 263, 16297-16 302 (1988)], azzal az elté5 réssel, hogy van egy rövid szakasz a T7 promoter egyetlen BglII restrikciós hasítási helye és a tetraciklin génben lévő Clal restrikciós hasítási hely között. Ennek a DNS-nek a szekvenciája az alábbi:

konstrukcióval transzformált és IPTG-vel 2 óra hosszat indukált sejtekben (5. sáv, 20. ábra) van egy Coomassie Blue festékkel sötéten festődő csík, amely a CNTF-től várható pozícióban fut (körülbelül 24 kD). Ha a sejteket IPTG nélkül növesztjük (4. csík, 20. ábra), akkor ebből a csíkból sokkal kevesebb van, amint az várható egy olyan fehérjétől, amely a lac operon szabályozása alatt áll. A CNTF inszertumot nem tartalmazó pT5T vektorral transzformált sejtek nem mutatják ezt a csíkot, akár indukáltak (3. sáv, 20. ábra), akár nem indukáltak (2. sáv, 20. ábra). Az 1-es sáv molekulasúly-standardokat tartalmaz.

Egy azonos SDS-poliakrilamid gélt viszünk át nitrocellulózra és immun-blottoljuk affinitástisztított, CNTF A peptid (E-S-Y-V-K-H-Q-L-N-K-N) elleni antitestekkel. A pT5T:CNTF-Synl/3-5a konstrukció35 val transzformált és 2 óra hosszat IPTG-vel indukált sejtekben (5. sáv, 21. ábra) van egy csík, amelyet felismert az affinitástisztított, CNTF A peptid (E-S-Y-V-KH-Q-L-N-K-N) elleni antitest, és a CNTF-től várható pozícióban fut (körülbelül 24 kD). Ha a sejteket IPTG nélkül növesztjük (4. sáv, 21. ábra), akkor ebből a csíkból jóval kevesebb van. A CNTF inszertumot nem tartalmazó pT5T vektorral transzformált sejtek nem mutatják ezt a csíkot, akár indukáltak (3. sáv, 20. ábra), akár nem indukáltak (2. sáv, 20. ábra). Az 1-es sáv molekula45 súly-standardokat tartalmaz.

Emellett a pT5T:CNTF-Synl/3-5a konstrukcióval transzformált és IPTG-vel 2 óra hosszat indukált sejteket feltárjuk oly módon, hogy háromszor átnyomjuk egy French press berendezésen. A nyers sejtli50 zátum egy alikvot részét felülúszóra és üledékre választjuk szét centrifugálással (20000/perc, Beckman JA20 rotorban, 15 perc). A nyers lizátum alikvot részeit, a felülúszót és az üledéket, amelyek ugyanazt a mennyiségű kiindulási sejtszuszpenziót képviselik, szintén ugyanolyan SDS-poliakrilamid gélen futtatjuk, nitrocellulóz membránra átvisszük és affinitástisztított anti-A-peptid antitesttel immun-blottoljuk. A lizátum felülúszó (8. sáv, 21. ábra) sokkal több immunológiailag reagáló CNTF-et tartalmaz, mint a lizátum üledéke (9. sáv, 21. ábra). A felülúszó CNTF-szintje összeha22

HU 217 102 Β sonlítható a frakcionálatlan lizátumban lévővel (7. sáv,

21. ábra).

E) Az expresszált CNTF biológiai aktivitása

A rövid centrifúgálással összegyűjtött sejteket 20 mM TRIS-HC1 pH=8,2 pufferben szuszpendáljuk a 5 sejtszuszpenzió eredeti térfogata ’/is-öd részében, French press berendezésen háromszor átnyomva feltáljuk, majd a nyers sejtlizátumot felülúszó és üledék frakciókra választjuk szét centrifúgálással (20 000/perc, Beckman JA-20 rotor, 15 perc). A sejt-felülúszófrakcióból készült sorozathígításokat megvizsgáljuk, hogy képesek-e a ciliáris ganglion idegsejtek túlélését elősegíteni (lásd az

1. példát). A felülúszó jelentős biológiai aktivitást mutatott egészen 1:1000 000 hígításig (22. ábra). A rekombináns humán CNTF specifikus aktivitását 275/TU/ng-re 15 becsüljük, a biológiai aktivitás és az immunblottok alapján meghatározott CNTF fehéijemennyiség alapján. Ez a specifikus aktivitás körülbelül kétszerese a tisztított nyúlCNTF fehérje specifikus aktivitásának, jelezve, hogy a rekombináns CNTF biológiailag aktív a baktérium-sejt- 20 kivonatokban. A CNTF inszertumot nem tartalmazó pT5T-vel transzformált sejtek lizátumai nem mutatnak kimutatható biológiai aktivitást.

A felülúszót is elektroforetizáljuk egy 15%-os poliakrilamid redukáló SDS-gélen, majd 1 mm széles szele- 25 tekre vágjuk, amelyeket éjszakán át extrahálunk 4 °C-on sejttenyésztő táptalajban rázatva, és a biológiai aktivitást az 1. példában leírtak alapján határozzuk meg. A 22. ábra azt illusztrálja, hogy van egy csúcs biológiai aktivitás a CNTF-től elvárható 24 kD-nak megfelelő frakcióban.

F) Az expresszált CNTF aminosavszekvenciája

A 24 kD körüli régiót egy olyan SDS-poliakrilamid gélből vágjuk ki, amely hasonlít a 20. ábra készítéséhez használthoz, de nincs Coomassie Blue-val festve. Ezt az anyagot Edman-degradációval szekvenáljuk egy Applied Biosystems Protein Sequencer berendezésben (a 2. példában leírtak alapján). Az alábbi aminosavszekvenciát kapjuk:

AFTEHSPLTPHRRDL[?] S......

A kérdőjel a humán szekvenciában egy C-nek felel meg (12. ábra), amely nem mutatható ki ezzel a módszerrel. Ez a szekvencia megfelel annak, amit a humán 10 CNTF-től vártunk (12. ábra), és további bizonyítékokat szolgáltat arra, hogy a CNTF megfelelően expresszálódik. Azt is jelzi még, hogy az aminoterminális metionin lehasad az expresszió során, és az alanint hagyja aminoterminális aminosavként az expresszált fehérjében.

A fenti eredmények azt mutatják, hogy immunológiailag keresztreakciót adó CNTF-et expresszáltunk magas szinten, biológiailag aktív formában, és annak legnagyobb része oldható a baktériumsejtek feltárása után.

3. A CNTF expressziója olyan expressziós vektor alkalmazásával, amely egy hibrid laktóz és triptofán promoter ('Tac j rendszeren alapul (a vektorok tulajdonságait lásd a 19. ábrán)

A) A pT3XI—2 leírása (apKK223-3 módosítása) Ehhez a konstrukcióhoz a kiindulási plazmid a Pharmaciától vásárolt pKK223-3 plazmid. A pKK223-3 plazmid a tetraciklinrezisztenciát kódoló gén egy darabját tartalmazza. Ezt a nem működő gént helyettesítjük egy komplett, a pBR322 plazmidból származó teljes tetraciklin génnel. A pKK223-3 plazmidot teljesen 30 megemésztjük Sphl restrikciós enzimmel, majd részlegesen megemésztjük BamHI restrikciós enzimmel. Egy 4,4 kb méretű fragmenst gélen tisztítunk, majd kombináljuk az alábbi szekvenciájú szintetikus adapterrel:

5’ GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT 3’ 3’ ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 5’ valamint egy 539 bázispár méretű Clal, Sphl emésztéssel a pBR322 (PLBiochemicals, 27-4891-01) tetraciklinrezisztencia-génből kapott DNS-fragmenssel. A kapott plazmid jele pCJl.

Ezután egy, a New England Biolabstól vásárolt Xhol linkért építünk be a pCJl plazmid PvuII hasítási helyére, így kapjuk a pCJX-1 plazmidot. Ez az inszerció tönkreteszi a rop gént, amely a plazmid kópiaszámát szabályozza. Egy, a pMC9 plazmidból [Calos et al., Proceedings of the National Academy of

Sciences, USA, 80, 3015-3019 (1983)] származó lacl gént tartalmazó EcoRI fragmenst ezután az alábbi szek40 venciájú Xhol és EcoRI adapterek felhasználásával beillesztjük az Xhol helyre:

5’ TCGAGTCTAGA 3’

3’ CAGATCTTTAA 5’

Ezután a pKK223-3 plazmid EcoRI és PstI hasítási helyei közötti polilinkerszekvenciát helyettesítjük az alábbi szekvenciájú polilinkerszekvenciával:

5’ AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA 3’ 3’ GGGCCC ATGGTCTAGA CTCGAGTGAT CAG 5’

Az így kapott vektor jele pCJXI-1.

Végül a tetraciklinrezisztencia-gént egy hasonló génnel helyettesítjük, amelyben a HindlII, BamHI és Sáli restrikciós enzimek felismerési helyeit biszulfit mutagenezissel elrontjuk. Az alábbi eljárást alkalmazzuk a pBR322 plazmid tetraciklinrezisztencia-génjének mutagenezisére. A pBR322 plazmidot HindlII restrikciós enzimmel emésztjük, majd nátrium-biszulfittal mutagenizáljuk [Shortle and Nathans, Proceedings of the

National Academy of Sciences, USA, 5, 2170-2174 (1978)]. A mutagenizált DNS-t összeligáljuk, hogy cirkuláris DNS-t kapjunk, majd HindlII enzimmel emésztjük, hogy a mutagenezist elkerülő plazmidokat linearizáljuk. Az Escherichia coli JM109 törzset [YanischPerron et al., Gene, 33, 103-109 (1985)] transzformáljuk a plazmiddal, majd szelektív táptalajra szélesztjük. A plazmidokat tetraciklinrezisztens telepekből izoláljuk, és megvizsgáljuk, hogy a tetraciklinrezisztencia-génből

HU 217 102 Β elveszett-e a HindlII hasítási hely. A sikeresen mutált plazmid jele pTl. Egy hasonló eljárást hajtunk végre a pTl-en a BamHI hasítási helyen, így kapjuk a pT2 plazmidot. A pT2 plazmidot ezután úgy mutagenizáljuk, hogy eltávolítsuk a Sáli hasítási helyet, így kapjuk a pT3 plazmidot. A mutált tetraciklinrezisztencia-gént hordozó pT3 Clal/BsmI fragmenst izoláljuk, majd a pCJXI-1 homológ fragmense helyettesítésére használjuk. A mutáns tetraciklinrezisztencia-gén még mindig egy funkcionális fehérjét kódol.

C) A pT3XI-2—§10TC3FGFsyn kialakítása (a tac promoter vektor előállítása a CNTF-hez)

Először az alap fibroblaszt növekedési faktor „génjét” szintetizáljuk meg. Ez a „gén” ugyanazt a szekvenciát kódolja, mint amelyet az FGF-re Sommer és munkatársai közöltek [Biochem. Biophys. Rés.

Commun., 141, 67 (1987)], de azokat a kodonokat használja, amelyek nagy gyakorisággal találhatók az

Escherichia coli magas szinten expresszálódó génjeiben. Ennek a génnek olyan a szerkezete, hogy a kódoló részt megelőzi [Squires et al., J. Bioi. Chem., 263, 16297-16 302 (1988)], hogy biztosítsuk a hatékony iniciációt és transzációt.

Az FGF szintetikus gént először az M13mpl8-ba építjük be az EcoRI és HindlII restrikciós hasítási helyek közé, majd megszekvenáljuk. A gén szerkezete az alábbi:

AATTCAGGA TCCGATCGTG CAGGATGATT AAATGGGTAC CATGGCTGCT GGCTCCATCA _GTCCT AGGCTAGCAC CTCCTACTAA TTTACCCATG GTACCGACGA

CCGAGGTAGT

EcoRI BamHI RBS_FCF start

3-as transzlációs csatoló

CTACCCTGCC GGCACTGCCG GAAGACGGTG GCTCCGGTGC TTTCCCGCCG GGCCACTTCA

GATGGGACGG CCGTGACGGC CTTCTGCCAC CGAGGCCACG AAAGGGCGGC CCGGTGAAGT

AAGACCCGAA ACGTCTGTAC TGTAAAAACG GTGGCTTCTT CCTGCGTATC CACCCGGATG

TTCTGGGCTT TGCAGACATG ACATTTTTGC CACCGAAGAA GGACGCATAG CTGGGCCTAC

GTCGTGTCGA CGGCGTACGT GAAAAAAGCG ACCCGCACA TCAAACTGCA GCTGCAGGCTG

CAGCACAGCT TGCCGCATGC ACTTTTTTCC TGGGCGTGT AGTTTGACGT CGACGTCCGAC

AAGAACGTG GTGTTGTATC TATCAAAGGC GTTTGCGGCAA ACCGTTACCT GGCTATGAAAG

TTCTTGCAC CACAACATAG ATAGTTTCCG CAAACGCGTT TGGCAATGGA CCGATACTTTC

AAGACGGTC GTCTGCTGGC TAGCAAATGT GTAACTGACG AATGTTTCTT CTTCGAACGTC

TTCTGCCAG CAGACGACCG ATCGTTTACA CATTGACTGC TTACAAAGAA GAAGCTTGCAG

TGGAAAGCA ACAACTACAA CACCTACCGT TCTCGTAAAT ACACTTCTTG GTACGTTGCTC

ACCTTTCGT TGTTGATGTT GTGGATGGCA AGAGCATTTA TGTGAAGAAC CATGCAACGAG

TGAAACGTA CCGGCCAGTA CAAACTGGGT TCCAAAACTG GCCCGGGTCA GAAAGCAATCC

ACTTTGCAT GGCCGGTCAT GTTTGACCCA AGGTTTTGAC CGGGCCCAGT CTTTCGTTAGG

TGTTCCTGC CGATGAGCGC TAAATCTTAA ACTAGTA

ACAAGGACG GCTACTCGCG ATTTAGAATT TGATCATTCGA

FGF stop HindlII

A gén vonatkozó jellemzőit kiemeltük.

Ezután BamHI és HindlII restrikciós enzimes emésztéssel izoláljuk és BamHI/HindlII restrikciós enzimmel emésztett pJU1003 vektorba építjük be [Squires et al., J. Bioi. Chem., 263, 16297-16302 (1988)], így kapjuk a pJU 1001003-synFGF konstrukciót. Ezt a plazmidot Xbal és HindlII restrikciós enzimmel emésztjük, majd az FGF gént hordozó Xbal/HindlII fragmenst izoláljuk. Ezt a fragmenst Egáljuk az EcoRI és HindlII restrikciós enzimmel emésztett pT3XI-2 vektorba, egy EcoRI-Xbal linker alkalmazásával:

HU 217 102 Β

5’ pATT TCC ACA ACG 3’ GG TGT TGC

Az új plazmid jele pT3XI-2-<)>10TC3FGFsyn.

D) A CNTF expressziós konstrukció beépítése a Tac promoter vektorba

A pT3XI-2-(J)10TC3FGFsyn konstrukciót BamHI és Spel restrikciós enzimmel emésztjük, ennek eredménye a

7.4 kb méretű expressziós vektor linezirálása és a körülbelül 0,5 kb méretű FGF DNS-ffagmens felszabadulása. Külön reakcióelegyben a CNTF-Synl/3 és CNTF-Syn2/3 konstrukciókat is ligáljuk a gélen tisztított BamHI/Spel restrikciós enzimmel emésztett vektor DNS-fragmensbe, ennek eredménye a pT3XI-2: CNTF-Synl/3, illetve pT3XI-2: CNTF- -Synl/3 jelű plazmid.

E) Expresszié Escherichia coliban

A pT3XI-2:CNTF-Synl/3 konstrukciót egy fágrezisztens Escherichia coli Körülbelül törzsbe, a JM 107-be transzformáljuk. Tizennégy transzformánst tenyésztünk, és vizsgáljuk a CNTF expressziójukat SDS-poliakrilamid gélelektroforézíssel és Coomassie Blue festéssel. Négy transzformáns mutatott sötéten festődéi csíkot a CNTF-nek megfelelő pozícióban. A rekominbáns CNTF magas szintű expresszióját úgy étjük el, hogy a sejteket Luria táptalajban növesztjük 15 pg/ml tetraciklin jelenlétében, 0,8 A₆₀₀-nak megfelelő sejtsűrűségig. IPTG-t adunk hozzá 1,0 mM végkoncentrációban, és a sejteket két óra hosszat hagyjuk növekedni. Mind a négy transzformáns körülbelül ugyanazt a CNTF-sűrűséget mutatja Coomassie festékkel festett és immun-blottal értékelt géleken. Ezekben a transzformánsokban a CNTF látszólagos szintje a gélek alapján körülbelül egynegyede annak, mint amit az előzőkben leírtak alapján növesztett pT5T:CNTF-Synl/3-5a mutatott. Ennek a négy transzformánsnak a DNS-ét restrikciós módszerekkel térképezve megállapíthatjuk, hogy mindegyik tartalmazza a humán CNTF gént.

A pT3XI-2:CNTF-Syn2/3-at expresszálás céljából Escherichia coli TG1 törzsbe transzformáljuk. A transzformánsokat úgy szelektáljuk, hogy 15 μ g/ml tetraciklint tartalmazó LB agarra szélesztjük a tenyészetet. Négy transzformánst, a pT3XI-2:CNTF-Syn2/3-A-t, -B-t, -C-t és -D-t kiválasztunk, majd felnövesztjük őket, és tulajdonságaikat restrikciós enzimes térképezéssel igazoljuk. Egy transzformánst, a pT3XI:CNTF-Syn2/3A-at a további vizsgálatokhoz kiválasztjuk. Ezt a transzformánst éjszakán át növesztjük 500 ml 2XYT táptalajban 10 pg/ml tetraciklin és 1 mM IPTG jelenlétében. A sejteket az előzőkben leírt módon centrifugálással kinyeijük, és 1 mM EDTA-t, 0,1 mM PMSF-et és 0,1 mM pepsztatint tartalmazó 10 mM-os foszfátpufferben feltárjuk oly módon, hogy jégen 15 másodpercig szonikáljuk mikroheggyel, az energiát #3-ra állítva. 15 percig centrifugáljuk egy mikrocentrifugával, majd a felülúszót összegyűjtjük, és biológiai aktivitását a ciliáris ganglion túlélési vizsgálattal analizáljuk (1. példa). Jelentős biológiai aktivitás van abban a felülúszóban (22. ábra), amely

1.5 mg/ml fehérjét tartalmaz.

A bemutatott eredmények azt mutatják, hogy két különböző DNS-konstrukció két különböző expTCC CT 3’

AGG GAG ATCp 5’ ressziósvektor-rendszerben lehetővé teszi a biológiailag aktív CNTF expresszióját, amely SDS-poliakrilamid gélelektroforézíssel megfelelő módon vándorol, a CNTF elleni, affinitástisztított antitestek felismerik, és megfelelő aminoterminális aminosavszekvenciával rendelkezik.

4. A rekombináns CNTF tisztítása

A pT5T:CNTF-Synl/3-5a-ból kis mennyiségű oltóanyagot éjszakán át 37 °C-on növesztünk 10 μg/ml tetraciklint tartalmazó Luria táptalajban. Ebből a sejtszuszpenzióból 7 ml-t adunk Luria táptalajhoz nagy lombikokban, és 37 °C-on rázatjuk, amíg az A₆₀₀-érték el nem éri a 0,5 értéket. Ezután IPTG-t adunk hozzá 0,5 mM végkoncentrációban a CNTF expressziójának indukálására, és a növesztést addig folytatjuk, amíg az A₆₀₀ az 1,2-es értéket el nem éri, ami általában 4-6 órát vesz igénybe. A sejteket centrifugálással nyerjük ki (JA-20 rotor, 7000/perc, 5 perc 4 °C-on, majd egyszer mossuk centrifugálással 50 mM-os foszfátpufferben (pH=8,0, A puffer) 4 °C-on. A felülúszót eltávolítjuk, és a sejtüledéket -20 °C-on lefagyasztjuk.

A sejtpasztát B pufferben szuszpendáljuk (A puffer, amely 1 mM EGTA-t [etilénglikol-bisz(amino-etil-éter)Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetraecetsav]) és 1 mM EDTA-t tartalmaz (etilén-diamin-tetraecetsav), 0,5 g pasztát számítva 1 ml pufferre 4 °C-on, majd háromszor átnyomjuk egy French press berendezésen, a baktériumok feltárása céljából. Polietilén-imint (PEI) adunk hozzá 0,25% végkoncentrációban, majd 30 percig rázatjuk 4 °C-on. A csapadékot centrifugálással eltávolítjuk (15 perc maximális sebességgel egy mikrofugában). Ez a lépés rendszerint csökkenti a nukleinsavtartalmat, amit az A₂₆₀/A₂₈₀ arány mérésével lehet követni, a csökkenés mértéke 25%-ról kevesebb, mint 5%-ra.

A mintát ezután felvisszük egy B pufferrel egyensúlyba hozott Q-Sepharose (Pharmacia) oszlopra. A CNTF annyira fő komponense a French préssel feltárt sejtlizátumnak, hogy a kromatográfia során az oszlopfrakciókban követhető Coomassie Blue-val festett SDSpoliakrilamid gélelektroforézíssel. A CNTF egy erős, Coomassie-val festődő, körülbelül 24 kD méretű csík. Ennek a vizsgálatnak az alkalmazásával a CNTF-et át lehet mosni a Q-Sepharose-oszlopon B pufferben.

A CNTF protein nagy mennyiségét tartalmazó átfolyó frakciókat egyesítjük, C pufferrel szemben dializáljuk (5 mM foszfátpuffer, pH=8,0, tartalmaz még 1 mM EGTA-t és 1 mM EDTA-t), majd C pufferrel egyensúlyba hozott Q-Sepharose-oszlopra visszük. Az oszlopot C pufferrel mossuk, amíg az A_2g0-érték az alapvonalra tér vissza, jelezve, hogy a nem tapadó fehérjéket keresztülmostuk az oszlopon. A C pufferben a CNTF kötődik a Q-Sepharose-oszlophoz, ahonnan 0-0,1 mol/l-es NaCl gradienssel eluálható C pufferben. A CNTF körülbelül 40 mM NaCl-nél oldódik le az oszlopról, és 90%-nál nagyobb a tisztasága, amint az megítélhető a csúcs CNTF-frakciók Coomassie-val festett SDS-poliakrilamid gélelektroforézisével.

HU 217 102 Β

8. példa

SN-CNTF készítmény előállítása

Feloldunk 8500 mg szacharózt 70 ml injektálható vízben, rázatás közben, majd sorrendben a következő összetevőket adjuk az oldathoz: 200 mg tromethamine, 10 mg EDTA, 200 mg poliszorbát-80, valamint 400 mg cisztein, a hozzáadott anyagokat az oldatban feloldjuk, a pH-t 7,6 ±0,2 értékre állítjuk 1 N nátriumhidroxid-oldat vagy 1 N sósavoldat alkalmazásával. Ezután az oldathoz 30 ml injektálható vizet (USP) adunk, majd a konténert lezárjuk, nitrogénnel (USP) átöblítjük, majd az elegyet lassan kevertetjük, legalább 10 percen keresztül, és ily módon homogén oldatot állítunk elő. Az így előállított oldószerhez lassan 50 mg SN-CNTFet adunk, majd az oldatot 0,2 μιη-es „Millipore Durapore” szűrőn átszűrjük, 2-10 °C-on

9. példa

Az SN-CNTF-készítmény liofilizálása

A 8. példa szerint előállított SN-CNTF készítményből 1,2 ml-es részleteket 3 ml-es I. típusú üvegedényekbe helyezünk, és a reakcióedényeket liofilizáló kupakkal zárjuk le, az egyes liofilizáló edények az alábbi összetevőket tartalmazzák: 0,5 mg/ml rhSN-CNTF, 85 mg/ml szacharóz, 2 mg/ml poliszorbát-80, 4 mg/ml L-cisztein, 0,1 mg/ml EDTA, 2 mg/ml tromethamine, pH=7,6. A készítményt tartalmazó liofilizáló edényeket fagyasztva szárító kamrákba helyezzük (FTS System Inc.), melyet a fagyasztás megkezdése előtt 5 °C-on ekvilibrálunk.

A szobahőmérsékletű készítményeket 30 perc alatt hűtjük -5 °C-ra, majd 3 órán keresztül -5 °C-on tároljuk. A hőmérsékletet ezután 2 óra 15 perc alatt -40 °Cra csökkentjük, majd a készítményeket 3 órán keresztül -45 °C-on tartjuk. A hőmérsékletet ezután 1 óra alatt -10 °C-ra emeljük, majd a készítményeket 4 órán keresztül -10 °C-on tartjuk. Ezután a hőmérsékletet 2 óra alatt —45 °C-ra csökkentjük, és a készítményeket 4 órán keresztül -45 °C-on tartjuk. A kamrát evakuáljuk, a nyomást 100 mTorr értéken tartjuk nitrogénáram alkalmazásával. A készítményeket további 4 órán át -45 °C-on tartjuk, majd a hőmérsékletet 8 óra 20 perc alatt -25 °C-ra emeljük, és a készítményeket 20 órán keresztül -25 °C-on tároljuk. A hőmérsékletet ezután 9 óra 10 perc alatt +30 °C-ra emeljük, és a készítményeket 25 órán keresztül +30 °C-on tartjuk.

A kamra nyomását ezután 380 mTorr-ra emeljük nitrogén alkalmazásával, 15 perc alatt, majd az edényeket bezárjuk. A hőmérsékletet ezután 1 óra 25 perc alatt + 5 °C-ra csökkentjük, és a termék felhasználásáig, maximum 24 órán keresztül a készítményeket ezen a hőmérsékleten tartjuk.

A fagyasztva szárított port 5 °C-on és 25 °C-on tároljuk, és injektáláshoz 1 ml injektálható vízben vesszük fel, amely pH=7,6±0,3 értékre van pufferelve.

Claims (33)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Tisztított ülőideg neurotróf faktor (SN-CNTF) fehérje, azzal jellemezve, hogy specifikus aktivitása 25 000-szer nagyobb, mint a természetes ülőideg-kivonaté, és/vagy aktivitása 2xl0⁸ TU/mg-nál nagyobb.

   (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti tisztított ülőideg ciliáris neurotróf faktor (SN-CNTF) fehéije, azzal jellemezve, hogy nyúl eredetű. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
3. 3. Az 1. igénypont szerinti tisztított ülőideg ciliáris neurotróf faktor (SN-CNTF) fehérje, azzal jellemezve, hogy emberi eredetű. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti tisztított ülőideg neurotróf faktor (SN-CNTF) fehérje, azzal jellemezve, hogy a következő sajátságokkal bír:

   (i) molekulasúlya SDS-poliakrilamid gélelektroforézis alapján körülbelül 25 000-nek adódik;

   (ii) specifikus aktivitása nagyobb, mint 2χ 10⁸ trofikus egység milligrammonként;

   (iii) a biológiai aktivitása rezisztens SDS-sel és redukálóanyagokkal szemben. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti tisztított ülőideg neurotróf faktor (SN-CNTF) fehérjepreparátum, azzal jellemezve, hogy egyetlen fehérjét tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
6. 6. Eljárás ülőideg ciliáris neurotróf faktor tisztítására ülőideg-kivonatból, azzal jellemezve, hogy az idegkivonat-készítményt savas kezelésnek és ammónium-szulfátos frakcionálásnak vetjük alá, a savas kezelésnek és ammónium-szulfátos frakcionálásnak alávetett készítményt kromatofokuszáljuk, a preparátumot SDS-poliakrilamid gélben megfuttatjuk, majd fordított fázisú HPLC-eljárásnak vetjük alá. (Elsőbbsége: 1989. január 5.)
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítmény SDS-poliakrilamid gélben történő futtatása előtt az alábbi, további tisztítási lépéseket hajtjuk végre:

   hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatografálás, az ammónium-szulfátos frakcionálás és a kromatofokuszálás között;

   hidrofób kölcsönhatáson alapuló FPLC-kromatografálás a kromatofokuszálás és a preparativ SDS-poliakrilamid gélelektroforézis között. (Elsőbbsége: 1989. január 5.)
8. 8. A 11. vagy 12. ábra szerinti SN-CNTF-et kódoló nukleinsavszekvenciák, valamint ezen szekvenciák komplementereivel hibridizálódni képes, az SN-CNTF legalább egy biológiai funkciójával rendelkező polipeptidet kódoló nukleinsavszekvenciák. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
9. 9. A 8. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy humán SN-CNTF-et kódol. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
10. 10. A 8. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy nyúl eredetű SN-CNTF-et kódol. (Módosítási elsőbbsége: 1994. júlilus 1.)
11. 11. Eljárás a 8. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciájú molekula vagy annak részlete előállítására, azzal jellemezve, hogy a molekulát természetes forrásból

    HU 217 102 Β izoláljuk és/vagy kémiai szintézis útján előállítjuk. (Elsőbbsége: 1989. szeptember 8.)
12. 12. SN-CNTF aminosavszekvencia, azzal jellemezve, hogy all. vagy 12. ábrán van bemutatva. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
13. 13. A 11. igénypont szerinti aminosavszekvencia, azzal jellemezve, hogy emberi eredetű. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
14. 14. A 11. igénypont szerinti aminosavszekvencia, azzal jellemezve, hogy nyúl eredetű. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
15. 15. Eljárás a 12. igénypont szerinti aminosavszekvenciájú molekula vagy annak részlete előállítására, azzal jellemezve, hogy a szekvenciát természetes forrásból izoláljuk és/vagy kémiai szintézis útján előállítjuk. (Elsőbbsége: 1989. szeptember 8.)
16. 16. Rekombináns expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy biológiailag aktív SN-CNTF előállítására alkalmas. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
17. 17. A 16. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy az expresszió állati eredetű sejtekben történik. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
18. 18. A 16. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy az expresszió baktériumsejtekben történik. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
19. 19. Eljárás a 17. igénypont szerinti expressziós rendszer előállítására, azzal jellemezve, hogy 8. igénypont szerinti szekvenciájú nukleinsavmolekulát alkalmas expressziós rendszerbe klónozunk. (Elsőbbsége: 1989. szeptember 8.)
20. 20. Eljárás a 18. igénypont szerinti expressziós rendszer előállítására, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti szekvenciájú nukleinsavmolekulát alkalmas expressziós rendszerbe klónozunk. (Elsőbbsége: 1989. december 28.)
21. 21. A 4. igénypont szerinti SN-CNTF, azzal jellemezve, hogy az SN-CNTF rekombináns DNS-eljárassal lett előállítva. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
22. 22. Eljárás aktív rekombináns SN-CNTF előállítására, azzal jellemezve, hogy:

    (i) olyan eukarióta vagy prokarióta gazdasejteket tenyésztünk SN-CNTF termelődésére alkalmas körülmények között, melyek olyan vektorral vannak transzformálva, amely tartalmaz egy SN-CNTF-aktivitású fehéijét kódoló struktúrgént, ami funkcionálisan hozzá van kapcsolva olyan expressziós szabályozószekvenciákhoz, melyek képesek az alkalmazott gazdasejtben fehérjék expresszióját vezérelni;

    (ii) a termelődött SN-CNTF-et begyűjtjük; és (iii) hagyjuk, hogy a termelődött SN-CNTF CNTFaktivitással bíró tercier szerkezetet vegyen fel. (Elsőbbsége: 1989. december 28.)
23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán SN-CNTF-et kódoló vektort tartalmazó gazdasejteket tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1989. december 28.)
24. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy a CNTF-Syn 1/3-szekvenciában található nukleinsavakat magában foglaló vektort tartalmazó gazdasejteket tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1989. december 28.)
25. 25. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a CNTF-Syn2/3-szekvenciában található nukleinsavakat magában foglaló vektort tartalmazó gazdasejteket tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1989. december 28.)
26. 26. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan fiziológiailag aktív SN-CNTF-et kódoló vektort tartalmazó gazdasejteket tenyésztünk, mely vektor olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely olyan polipeptidet kódol, melynek aminosavszekvenciája legalább annyira hasonlít az SN-CNTF-éhez, hogy az SN-CNTF legalább egy biológiai sajátságával rendelkezik. (Elsőbbsége: 1989. december 28.)
27. 27. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként mikroorganizmust tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1989. december 28.)
28. 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Escherichia coli sejteket tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1989. december 28.)
29. 29. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként emlőssejteket tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1989. december 28.)
30. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlőssejtekként kínaihörcsög-petefészeksej tekét (CHO-sejteket) tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1989. december 28.)
31. 31. Tisztított SN-CNTF, azzal jellemezve, hogy rekombináns. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
32. 32. Készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti anyagot és egy vagy több gyógyászatilag szokásosan alkalmazott hordozóés/vagy segédanyagot tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
33. 33. Eljárás a 32. igénypont szerinti készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti anyagot és egy vagy több gyógyászatilag szokásosan alkalmazott hordozó- és/vagy segédanyagot elegyítünk. (Elsőbbsége: 1989. január 5.)