HU211309A9 - Új polipeptid és előállítása - Google Patents

Description

A találmány új polipeptidre, az ezt kódoló DNS-szekvenciára, valamint annak alkalmazására vonatkozik.

A felhámi növekedési faktor (továbbiakban EGF) és az idegi növekedési faktor (továbbiakban NGF) felfedezése óta számos sejt növekedési faktorát izolálták és szerkezetüket is felderítették.

A növekedési faktorok a sejtdifferenciálódás mechanizmusának és a sejtosztódás mechanizmusának felderítésére alkalmazhatók, és némelyikük - beleértve a humán EGF-et is - várhatólag gyógyszerként is használható. Ennek megfelelően az utóbbi években egyre inkább ennek tanulmányozása került előtérbe.

Annak ellenére, hogy a humán NGF gént már izolálták, a szakirodalomban nem ismertették a humán NGF előállítását nagy mennyiségekben, rekombináns DNS módszerek alkalmazásával.

Ha egy új polipeptidet sikerül előállítani, amely állati sejtek növekedését elősegíti, ezzel új vizsgálatokat lehel végezni. Az ismert növekedési faktorokhoz hasonló aktivitással rendelkező ilyen új polipeptidek esetleg gyógyszerként is alkalmazhatók.

Egy ilyen új peptid felfedezésére próbaként az NGFet kódoló DNS-szekvenciát alkalmaztuk, és egy humán glioma cDNS könyvtárából klónoztunk egy ezzel hibridizáló DNS-szekvenciát. Ennek eredményeként sikerült egy olyan DNS-szekvenciát (cDNS) kapnunk, amely egy új polipeptidet kódolt. A találmány szerinti cDNS egy gazdasejtben expresszálva ezt az új polipeptidet termeli. Ezt a polipeptidet ezután reagensként alkalmazhatjuk állati sejtek differenciálódásának, szaporodásának és túlélésének tanulmányozására. Ez a polipeptid ezenkívül gyógyszerként is alkalmazható. A fenti felismerésen alapuló további vizsgálatok eredményeképpen jutottunkéi a találmány szerinti megoldáshoz.

A találmány egyik tárgya tehát egy új polipeptid, amely kutatási célokra reagensként, valamint gyógyszerként is alkalmazható. A találmány további tárgya az alábbi leírásból és ábrákból tűnik ki.

A találmány tárgyát képezi:

1) egy (I) polipeptid, amely az alábbi (II) képletű aminosav-szekvenciát tartalmazza egy molekulájában: TyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCys

AspSerGluSerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlalle

AspIleArgGlyHisGln ValThrValLeuGlyGluIleLys

ThrGlyAsnSerProValLysGlnTyr PheTyrGluThrArg

CysLysGluAlaArgProValLysAsnGlyCysArg

Glylle

AspAspLysHi s TrpAs nS e rG1nCys LysThrSerGlnThr

Tyr ValArgAlaLeuThrSerGluAsnAsnLysLeuValGly

TrpArgTrpIle ArglleAspThrSerCysValCysAlaLeu

SerArgLysIleGlyArg X (II) [azt a (II) képletű aminosav-szekvenciát, amelyben X egy kémiai kötést jelent, a továbbiakban (II) képletű aminosav-szekvenciának is nevezzük az egyszerűség kedvéért],

2) a fenti 1) pontban ismertetett polipeptidet kódoló DNS,

3) a fenti 2) pontban ismertetett DNS-szekvenciát tartalmazó vektor.

4) a fenti 3) pontban ismertetett vektorral transzformált transzformáns, és

5) eljárás az (I) képletű polipeptid előállítására, oly módon, hogy a fenti 4) pontban ismertetett transzformánst tenyészközegben tenyésztjük, amelynek során az 1) pontban ismertetett polipeptid a tenyészlében képződik és felhalmozódik.

Az ábrákat röviden alább ismertetjük. Az

1. ábra az 1. példa szerint előállított, a pUNK5 plazmidban egy (I) polipeptid cDNS-t tartalmazó DNS restrikciós enzim térképe; a

2. ábra az 1. példa szerint előállított, (I) polipeptid cDNS-t a pUNK5 plazmidban tartalmazó DNS nukleotid-szekvenciáját, és az ebből transzlatált aminosav-szekvenciát mutatja; a

3. ábrában az 1. példa szerint előállított, találmány szerinti (I) polipeptid aminosav-szekvenciáját (felső sor) a humán PNGF aminosav-szekvenciájával (alsó sor) hasonlítjuk össze; a

4. ábra a 2. példa szerint előállított, a pHNT2 plazmidban egy (I) polipeptid cDNS-t tartalmazó DNS restrikciós enzim térképe; az

5. ábra az 2. példa szerint előállított, (I) polipeptid cDNS-t a pHNT2 plazmidban tartalmazó DNS nukleotid-szekvenciáját, és az ebből transzlatált aminosav-szekvenciát mutatja; a

6. ábra sematikusan mutatja az Escherichia coliban működő pENGFT102 (I) polipeptid expressziós vektor szerkesztését a 3. példában leírtak szeri ni; a

7. ábra sematikusan mutatja az állati sejtekben működő pNTK26 és pNTL145 (I) polipeptid expressziós vektorok szerkesztését az 5. példa szerint; a

8. ábra sematikusan mutatja az állati sejtekben működő pNTSIOl (I) polipeptid expressziós vektor szerkesztését a 6. példa szerint; a

9. ábra sematikusan mutatja az élesztőben működő pANT341T (I) polipeptid expressziós vektor szerkesztését a 8. példa szerint; a

10. ábrán látható grafikonban a 12. példa szerint előállított egyes minták hatását szemléltetjük csirke embrió szenzoros idegsejtek életben maradására; a

11. ábra mutatja a 13. példa szerint előállított, patkányból származó (I) polipeptid gén nukleotid-szekvenciáját, és az abból transzlatált aminosav-szekvenciát; a

12. ábra sematikusan mutatja a pTB 1139 (I) polipeptid expressziós vektor szerkesztését a 15. példa szerint.

A találmány szerinti (I) polipeptid egy olyan polipeptidet jelent, amely a [II] képletű aminosav-szekvenciát tartalmazza, valamint egy olyan polipeptidet jelent,

HU 211 309 A9 amely a [II] képletű aminosav-szekvencia C-terminálisához kapcsolva egy további treonin-maradékot tartalmaz. A találmány szerinti (I) polipeptidek közé tartoznak azok is, amelyek a [II] képletű aminosav-szekvencia N-terminálisához és/vagy C-terminálisához kapcsolva több aminosav-maradékot tartalmaznak. A fenti polipeptideken kívül a találmány szerinti (I) polipeptidek közé tartoznak a fenti polipeptidek részei is, amelyek a fenti polipeptidekkel azonos aktivitással rendelkeznek, valamint azok a polipeptidek, amelyekben a fenti aminosav-szekvenciák részei egy vagy több eltérő aminosavval vagy aminosavszekvenciával vannak helyettesítve, vagy amelyekben a fenti aminosav-szekvenciákhoz vagy szekvenciákba egy vagy több eltérő aminosav vagy aminosav-szekvencia van kapcsolva vagy invertálva, és amelyek a fenti polipeptidekkel azonos aktivitással rendelkeznek.

A (II') képletű aminosav-szekvenciát tartalmazó (I) polipeptidet - amelyben a (II) képletű aminosav-szekvencia C-terminálisához egy treonin van kapcsolva E. coli transzformánsokban állítottuk elő az alábbiakban ismertetett példák szerint.

TyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCys

AspSerGlu SerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlalle

AspIleArgGlyHisGln ValThrValLeuGlyGluIleLys

ThrGlyAsnSerProValLysGlnTyr PheTyrGluThrArg

CysLysGluAlaArgProValLysAsnGlyCysArg Glylle

AspAspLysHisTrpAsnSerGlnCysLysThrSerGlnThr

Tyr ValArgAlaLeuThrSerGluAsnAsnLysLeuValGly

TrpArgTrpIle ArglleAspThrSerCysValCysAlaLeu

SerArgLysIleGlyArgThr (II')

A(II) vagy (II') képletű aminosav szekvenciát tartalmazó (I) polipeptidet állati sejt transzformánsokban is expresszálhatjuk.

Ha az (I) polipeptidet rekombináns DNS módszerek alkalmazásával állítjuk elő, az (I) polipeptidet kódoló gén előtti iniciáló ATG kodonnak megfelelő metionin-maradék hozzáadódhat az (I) polipeptid N-terminálisához.

A találmány szerinti (I) polipeptidet kódoló DNS-t például az alábbi eljárással állíthatjuk elő:

1) az (I) polipeptidet termelő sejtekből izoláljuk a messenger RNS-t (mRNS).

2) Az mRNS-ről egyszálú komplementer DNS-t (cDNS-t) szintetizálunk, majd szintetizáljuk a kettős szálú DNS-t.

3) A komplementer DNS-t egy plazmidba vagy fágba bevisszük.

4) Az így kapott rekombináns fággal vagy plazmiddal transzformálunk egy gazdasejtet.

5) Az így kapott transzformánsokat tenyésztjük, a kívánt DNS-t tartalmazó plazmidot vagy fágot a transzformánsokból megfelelő eljárással, például plakk-hibridizációval vagy kolónia-hibridizációval izoláljuk.

6) A kívánt klónozott DNS-szekvenciát a plazmádból vagy a fágból kivágjuk.

7) A klónozott DNS-t megfelelő plazmidba szubklónozzuk.

Az (I) polipeptidet kódoló m RNS-t (I) polipeptidet termelő sejtekből, például állati sejtekből, szövetekből és szervekből, így például emberi vagy patkányból származó sejtekből, szövetekből vagy szervekből, különösen humán gliómákból, humán glia sejtekből, humán placentáből, patkány gliómákból, veséből, májból, szívből, agyból, lépből, csecsemőmirigyből, tüdőből és szubmandibuláris mirigyből állíthatjuk elő.

Az (I) polipeptidet termelő sejtekből az mRNS előállítására alkalmas eljárások közé tartozik például a guanidin-tiocianátos eljárás [J. M. Chirgwin és munkatársai, Biochemistry 18, 5294 (1979)] és a hasonlók.

Az így kapott mRNS-t templátként alkalmazva, reverz transzkriptáz alkalmazásával szintetizáljuk a cDNSt, például H. Okayama és munkatársai [Molecular and Cellular Biology 2, 161 (1979); ibid 3, 280 (1983)] vagy U. Gubler és B. J. Hoffman [Gene 25, 263 (1983)] eljárása szerint. A fenti módon kapott cDNS-t plazmidba bevive állítjuk elő a humán cDNS könyvtárakat.

A cDNS bevitelére alkalmas plazmidok például a pBR322 [Gene 2, 95 (1977)], a pBR325 [Gene 4, 121 (1978)], a pUC12 [Gene 19, 259 (1982)], a pUC13 [Gene 19, 259 (1982)], a pUC18 [Gene 33, 103 (1985)], a pUC19 [Gene 33, 103 (1985)], a pUC118 [Methods in Enzymology 153, 3 (1987)] és a pUCl 19 [Methods in Enzymology 153, (1987)]. Azonban egyéb plazmidok is alkalmazhatók, amennyiben azok a gazdasejtben replikálhatók és fenntarthatók. A cDNS bevitelére alkalmas fág vektorok közé tartozik például a λ gtl 1 [R. Young és R. Davis: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.

A. 80, 1194 (1983)]. Azonban egyéb fág vektorok is alkalmazhatók, ha a gazdasejtben szaporodni képesek.

A cDNS plazmidba történő inszertálására alkalmas eljárásokat például T. Maniatis és munkatársai ismertetnek [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 239. oldal (1982)]. A cDNS fág vektorba való inszertálására alkalmas eljárások közé tartozik például T. V. Hyunh és munkatársai által ismertetett eljárás [DNA Cloning, A Practical Approach 1, 49 (1985)]. Az így kapott plazmid vagy fág vektort megfelelő sejtbe, például E. coli sejtbe visszük be. A fent említett E. coli például E. coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.

S. A. 60, 160 (1968)], JM103 [Nucl. Acids Rés. 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology 41, 459 (1969)] és C600 [Genetics 39, 440 (1954)] lehet.

A gazdasejt plazmiddal történő transzformálására megfelelő eljárás például a kalcium-kloridos eljárás, vagy a kalcium-klorid/rudibium-kloridos eljárás [T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 249. oldal (1982)]. Ezenkívül például a fág vektorokat in vitro pakoló eljárás alkalmazásával juttathatjuk be a megsokszorozott E. coliba.

Az (I) polipeptid cDNS-t tartalmazó cDNS könyvtárakat a fent említett eljárásokkal állíthatjuk elő. Ezek azonban kereskedelmi forgalomban lévő termékként is

HU 211 309 A9 hozzáférhetők. így például humán glioma eredetű cDNS könyvtár és humán placenta eredetű cDNS könyvtár a Clontech Laboratories, Inc.-től (U. S. A.) szerezhető be. Az (I) polipeptid cDNS klónozására a cDNS könyvtárból megfelelő eljárás például a plakk-hibridizációs eljárás jelzett próba alkalmazásával, vagy a kolónia-hibridizációs eljárás (T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Próbaként bármely olyan DNS alkalmazható a fenti hibridizációs eljárásban, amely az (I) polipeptidet kódoló DNS-ekkel hibridizálható. Ilyen DNS például az NGF-et teljes egészében vagy részben kódoló cDNS, genomiális DNS, kémiailag szintetizált DNS és az NGF aminosav-szekvenciája alapján kémiailag szintetizált oligonukleotidok. A fent említett NGF-ekre példaként említjük az egér NGF-et (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 68, 2417 (1971); Natúré 302, 538 (1983)], a humán NGF-et [Natúré 303, 821 (1983)] és az egyéb állatokból származó NGF-eket.

A fenti módon klónozott, (I) polipeptidet kódoló cDNS-t ezután - ha szükséges - például pBR322, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, pUC118 és pUC119 plazmidokba szubklónozhatjuk az (I) polipeptid cDNS expresszálására.

Az így kapott DNS nukleotid-szekvenciáját például Maxam-Gilbert módszerrel [A. M. Maxam és W. Gilbert: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 560 (1977)] vagy didezoxi eljárással [J. Messing és munkatársai, Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)] határozhatjuk meg, az (I) polipepúd cDNS létezésének megerősítésére. Ennek eredményeként, ha az (I) polipeptidet kódoló teljes régió nincs lefedve, a le nem fedett régiók előállítására a cDNS-t ismét klónozhatjuk plakk-hibridizációval, próbaként ezt a DNSfragmenst alkalmazva, vagy kolónia-hibridizációval.

A fent ismertetett módon kapjuk az (I) polipeptidet kódoló DNS-t.

A fenti eljárásokon kívül a találmány szerinti (I) polipeptidet kódoló DNS-szakaszt tartalmazó DNS-t humán, patkány, egér és hasonló eredetű genomiális DNS könyvtárakból is előállíthatjuk klónozással. Ezenkívül az (I) polipeptidet kódoló DNS-t kémiai szintézissel is előállíthatjuk az (I) polipeptid aminosavszekvenciája alapján, amelyet a fenti módon klónozott DNS nukleotid-szekvenciájából, a DNS nukleotidszekvenciájának meghatározásával határoztunk meg.

A találmány szerinti (I) polipeptidet kódoló DNSként bármely DNS alkalmazható, amely az (I) polipeptidet kódolja. Szemléltető példaként említjük az alábbi (III) képletű nukleotid-szekvenciával rendelkező DNSt, valamint azt a DNS-t, amelyben a (ΠΙ) képletű nukleotid-szekvencia 3'-végéhez egy további ACA szekvencia van kapcsolva.

TACGCGGAGC ATAAGAGTCA CCGAGGGGAG TACTCGGTAT GTGACAGTGA GAGTCTGTGG GTGACCGACA AGTCATCGGC CATCGACATT CGGGGACACC AGGTCACGGT GCTGGGGGAG ATCAAAACGG GCAACTCTCC CGTCAAACAA TATTTTTATG AAACGCGATG TAAGGAAGCC AGGCCGGTCA AAAACGGTTG CAGGGGTATT GATGATAAAC ACTGGAACTC TCAGTGCAAA

ACATCCCAAA CCTACGTCCG AGCACTGACT

TCAGAGAACA ATAAACTCGT GGGCTGGCGG

TGGATACGGA TAGACACGTC CTGTGTGTGT

GCCTTGTCGA GAAAAATCGG AAGA (III) (ezt a nukleotid-szekvenciát a továbbiakban röviden (III) képletnek nevezzük.)

Bizonyos esetekben az ezen a DNS-t alkotó nukleotid-szekvencia egyes részei eltávolíthatók vagy helyettesíthetők. Ezenkívül egy vagy több további bázis kapcsolható vagy inszertálható a fenti DNS-hez, illetve DNS-be. A bázisok eltávolítását, helyettesítését vagy addícióját előnyösen kodonegységenként hajtjuk végre, amelyek a megfelelő aminosavat vagy aminosavakat expresszálják.

A fenti módon kapott, (I) polipeptidet kódoló DNSt ebben a formájában alkalmazhatjuk, vagy kívánt esetben egy restrikciós enzimmel kivághatjuk, a kívánt alkalmazástól függően.

A találmány szerinti (I) polipeptid előállítására alkalmas eljárások az alábbiak: 1) az (I) polipeptid izolálása állati szervezetből, beleértve az emberi szervezetet is, 2) az (I) polipeptid előállítása peptid-szintézissel. és 3) az (I) polipeptid előállítása gén-rekombináció alkalmazásával. A harmadik eljárás iparilag előnyös.

Az (I) polipeptid rekombináns DNS eljárásokkal való előállítására expressziós rendszerként (gazda-vektor rendszerként) például baktériumok, aktynomycetesek, élesztők, penészgombák, rovar sejtek és állati sejtek expressziós rendszereit alkalmazhatjuk.

A megfelelő expressziós eljárások közé tartozik a) a géntermékek előállítása és felhalmozása a sejtekben, b) a géntermékek kiválasztása a sejtekből, és felhalmozása a tenyészközegben, és c) a géntermékek kiválasztása a periplazmába.

Az (I) polipeptid b) és c) eljárással való kiválasztására egy szignál-peptidet kódoló DNS-t, vagy egy szignál-peptidet és egy propeptidet (prepro) kódoló DNS-t ligálhatunk az (I) polipeptidet kódoló DNS 5'-végéhez. A fent említett szignál-peptidként bármely peptid alkalmazható, amely képes az (I) polipeptid kiválasztását indukálni. A fenti szignál-peptidekre példaként említhetjük az E. coli enterotoxin és annak mutánsai szignál-peplidjeit, a Bacillus amyloliquefaciens semleges proteáz és az a-amiláz szignál-peptidjeit, a Bacillus brevis középső fal proteinjeinek szignál-peptidjeit, a Saccharomyces cerevisiae invertáz, foszfatáz, α-faktor és gyilkos faktor szignál-peptidjeit, az Aspergillus awamori glukoamiláz szignál-peptidjét, az (I) polipeptid szignál-peptidjét, a tojásfehérje lizozim és annak mutánsai szignál-peptidjét, a humán interleukin-2 szignál-peptidjét, és a humán, egér, patkány, csirke és szarvasmarha eredetű NGF-ek szignál-peptidjeit. Az alkalmas propeptidekre példaként említhetjük az S. cerevisiae α-faktor és gyilkos faktor propeptidjeit, az A. awamori glükoamiláz propeptidjét, az (I) polipeptid propeptidjét, és a humán endotelin és a humán, egér, patkány, csirke és szarvasmarha eredetű NGF-ek propeptidjeit.

A fenti eljárásokon kívül az (I) polipeptidet úgy is előállíthatjuk, hogy előállítjuk az (I) polipeptid és egy másik protein fúziós proteinjét, majd egy megfelelő proteázzal hasítjuk.

HU 211 309 A9

Az (I) polipeptidet kódoló DNS szakaszt tartalmazó fenti DNS, azaz az (I) polipeptidet kódoló DNS, az (I) polipeptidet és a szignál-peptidet kódoló DNS, vagy a szignál-peptidet, a propeptidet és az (I) polipeptidet kódoló DNS 5'-végéhez egy iniciációs kodon kapcsolható, és ezek után egy terminációs kodont kapcsolhatunk a DNS-hez. A kapott DNS-t egy promoter után vektorba illeszthetjük, ezáltal megszerkeszthetjük az (1) polipeptid expressziós vektort.

Az (I) polipeptid expressziójára alkalmazott vektorként bármely vektor alkalmazható, amennyiben az a választott gazdasejtekben működőképes. Az E. coli expressziós vektorokra példaként említhetjük a pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 plazmidokat és ezek származékait. Bacillus subtilis expressziós vektorokra példaként említhetjük a pUBllO, pC194, pE194, pTB5 plazmidokat és ezek származékait, a Bacillus brevis expressziós vektor például pUBllO, pHY481, pCl94, pHY500, pNU200 plazmid vagy ezek származéka lehet. S. cerevisiae expressziós vektorokra példaként említjük a pSH19, pSH15 plazmidot és ezek származékait, míg a Schizosaccharomyces pombe expressziós vektorokra példa a pDB248, pPA-4 és ezek származékai. Az állati sejt expressziós vektorok közé tartoznak a retrovírus vektorok, a vaccinia vírus vektorok, a szarvasmarha papilloma vírus vektorok és az SV40-sorozatba tartozó vektorok (például a pKSV-10, psV2-dhfr és pTB389).

Promoterként bármely promoter megfelel, amely a választott gazdasejtekben funkcionál.

így például, ha E. coli vektorokat alkalmazunk, megfelelő promoter például a trp promoter, a lac promoter, a tac promoter, a PL promoter, a recA promoter és a T7 promoter. Ha B. subtilis vektorokat alkalmazunk, megfelelő promoter például az SPO1 promoter, a Pl promoter és a semleges proteáz gén promoter. Ha B. brevis vektorokat alkalmazunk, megfelelő promoter például az extracelluláris fő protein gén promoter és az SPO1 promoter. Ha S. cerevisiae vektorokat alkalmazunk, megfelelő promoter például a GLD promoter, a pH05 promoter, a GAL 10 promoter, a GÁLI promoter, a PGK promoter és az ocfaktor promoter. Ha S. pombe vektorokat alkalmazunk, megfelelő promoter például a GLD promoter és egy SV40 promoter. Ha állati sejt vektorokat alkalmazunk, megfelelő promoter például az SV40 promoter, az LTR promoter és a metallotionein promoter.

Az expresszió hatékonyságának fokozására előnyösen élesztőben egy terminátort (például egy PGK termi nátort) alkalmazunk az (I) polipeptidet kódoló DNS után, míg állati sejtben előnyösen egy erősítőt, egy RNS illesztés jelet, egy poliA addíciós jelet, vagy egy választott markert alkalmazunk.

A találmány szerinti expressziós vektor megszerkesztésére alkalmas eljárások ismertek [lásd például Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)].

A fenti módon előállított (I) polipeptid expressziós vektort alkalmazva transzformálhatjuk a gazdasejteket.

Gazdasejtként megfelelnek például a baktériumok, így az E. coli, B. subtilis és B. brevis, az actynomycetesek, például a Streptomyces lividans, az élesztők, például az S. cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe és Pichia pastoris, a penészgombák, például az Aspergillus orizae, Aspergillus nidulans és az Aspergillus niger, és az állati sejtek, például a majom eredetű COS-7 sejt, a Verő sejt, az aranyhörcsög ovárium sejt (CHO) és az egér L sejt.

Közelebbről, megfelelő E. coli törzsek például a DH1, JM103, JA221, HB101, C600, MV1184 és ezek mutánsai. Megfelelő B. subtilis törzsek például az MI 114,1A274 és ezek mutánsai. Megfelelő B. brevis törzsek például a 47, 47-5, HPD31 és ezek mutánsai. Megfelelő S. cerevisiae törzsek például az AH22R^-, NA473AP-, TB39Pés ezek mutánsai. Megfelelő S. pombe törzsek például az ATCC38399, TH168 és ezek mutánsai.

A gazdasejtek transzformálására szolgáló eljárások a találmány szerinti DNS-szekvencia, például az (I) polipeptid expressziós plazmid alkalmazásával a szakirodalomból ismertek.

Az E. colit például Cohen és munkatársai módszerével transzformálhatjuk [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.

A., 69, 2110 (1972)]. AB. subtilist például protoplaszt eljárással (Molecular & General Genetics 168, 111 (1979)] vagy kompetens eljárással [J. Mól. Bioi. 56, 209 (1971)] transzformálhatjuk. A B. brevis például Takahashi és munkatársai [J. Bacteriol. 156, 1130 (1983)] eljárásával transzformálható. A S. cerevisiae és a S. pombe például Hinnen [Proc. Natl. Acad. Sci. U.

S. A. 75, 1929 (1978)] eljárásával, vagy a lítiumos eljárással [J. Bacteriol. 153, 163 (1983)] transzformálható. Az állati sejtek például Graham [Virology 52, 456 (1973)] módszerével transzformálhatok.

A fent említett módon kaphatjuk a találmány szerinti (I) polipeptidet kódoló DNS-szakaszt tartalmazó DNS-sel transzformált transzformánsokat.

A baktérium, actynomycetes, élesztő- vagy penészgomba gazdasejtekből származó transzformánsokat tenyésztésére, a tenyészközegként folyékony közeget alkalmazhatunk. A közeg a transzformáns szaporodásához szükséges szénforrásokat, nitrogénforrásokat, szervetlen vegyületeket vagy egyéb tápanyagokat tartalmaz. Szénforrásként megfelel például a glükóz, dextrin, oldható keményítő és szacharóz. Nitrogénforrásként alkalmazhatunk például szervetlen vagy szerves anyagokat, így például ammóniumsókat, nitrátokat, aminosavakat, kukoricalekvárt, peptont, kazeint, húskivonatokat, szójalisztet és keményítőextraktum oldatot. Megfelelő szervetlen vegyületek például a kalcium-klorid, nátrium-dihidrogénfoszfát és a magnézium-klorid.

A közeg pH-ja előnyösen mintegy 5-8.

Ha a gazdasejt E. coli, tenyésztőközegként előnyösen például glükózt és kazeinhidrolizátumot (Casamino Acids) tartalmazó M9 tápközeget alkalmazunk (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)]. A tenyésztést rendszerint 14-43 “C-on végezzük, körülbelül 3-24 órán keresztül, kívánt esetben levegőztetés vagy rázás alkalmazásával.

Ha a gazdasejt Bacillus, a tenyésztést rendszerint körülbelül 30-40 °C-on, körülbelül 16-96 órán keresztül végezzük, kívánt esetben levegőztetés vagy keverés közben.

HU 211 309 A9

Ha élesztő transzformánsokat tenyésztünk, közegként például Burkholder minimál tápközeget (K. L. Bostian és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4505 (1980)] alkalmazunk. A közeg pH-ját előnyösen 5 és 8 közöttire állítjuk. A tenyésztést rendszerint körülbelül 20-35 °C-on, 24-44 órán keresztül végezzük, kívánt esetben levegőztetés vagy rázás közben.

Állati sejt transzformánsok tenyésztésére, megfelelő közeg például az MÉM közeg, amely körülbelül 5-20% magzati borjúszérumot tartalmaz [Science, 722, 501 (1952)], a DMEM közeg [Virology, 8, 396 (1959)], az RPMI1640 közeg [J. Am. Med. Assoc. 799, 519 (1967)] és a 199-es közeg [Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 73, 1 (1950)]. A pH előnyösen 6-8. A tenyésztést rendszerint körülbelül 30-40 °C-on, 15-60 órán keresztül végezzük, kívánt esetben levegőztetés vagy rázás közben.

A találmány szerinti (I) polipeptid vagy a sejteken belül, vagy azokon kívül termelődik és halmozódik fel.

Ha az intracelluláris (I) polipeptidet extraháljuk a tenyésztett sejtekből, a sejteket ismert módon összegyűjtjük a tenyésztés után. Ezután az összegyűjtött sejteket megfelelő, protein denaturáló szert, például karbamidot vagy guanidin-hidrokloridot vagy felületaktív szert, például Triton Χ-100-at tartalmazó pufferben szuszpendáljuk, majd centrifugálással kapjuk az (I) polipeptidet tartalmazó felülúszót. Úgy is eljárhatunk, hogy az összegyűjtött sejteket ultrahangos kezeléssel, enzimes kezeléssel, például lizozimmel, vagy fagyasztással és felolvasztással elroncsoljuk, majd centrifugálással kapjuk az (I) polipeptidet tartalmazó felülúszót.

A tenyészet felülúszójában lévő, vagy a sejtekben termelődött és felhalmozódott (I) polipeptidet ismert tisztítási eljárások megfelelő kombinálásával tisztíthatjuk. A fenti ismert tisztítási eljárások közé tartoznak például az oldhatósági különbségeken alapuló eljárások, például a sóval végzett kicsapás és az oldószeres kicsapás; a főleg a móltömegek különbségén alapuló eljárások, például a dialízis, ultraszűrés, gélszűréses kromatográfia és SDSpoli(akril-amid) gél-elektroforézis; az elektromos töltéskülönbségen alapuló eljárások, például az ioncserélő oszlopkromatográfia; a specifikus affinitáson alapuló eljárások, például az affinitási kromatográfia; az eltérő hidrofób jellegen alapuló eljárások, például a fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia, és az izoelektromos pontok különbségén alapuló eljárások, például az izoelektrofókuszáló elektroforézis.

Ha az így kapott (I) polipeptid aktivitással rendelkezik, akkor ezen formájában alkalmazható. Ha nem mutat aktivitást, akkor enzimatikus vagy nem enzimatikus aktiválás után alkalmazható.

A találmány szerinti (I) polipeptid aktivitását enzim immunvizsgálattal, radioimmunvizsgálattal és hasonlókkal lehet meghatározni.

Az (I) polipeptid állati sejtek differenciálódását és szaporodását elősegítő, állati sejtek életbenmaradását elősegítő, génexpressziót fokozó, és proteinek és enzimek képződését indukáló aktivitással rendelkezik. Ezért az (I) polipeptid aktivitását a fenti funkciók kimutatásával vizsgálhatjuk. Mivel az (I) polipeptid az NGF-ral homológ, aktivitása és funkciói az NGF-éhoz hasonlóak. A fenti aktivitások és funkciók példájaként említhetjük a neurit kinövés elősegítését PC12 sejtekben [L. A. Green, Brain Research 133, 350 (1977); R. Heumann és munkatársai, Experimental Cell Research 145, 179 (1983)] és a csirke embrió érző ganglionok (dorsalis gyökér ganglion) túlélését elősegítő funkciót [A. M. Davies és R. M. Lindsay, Developmental Biology 777,62 (1985)].

A találmány szerinti (I) polipeptid reagensként alkalmazható állati sejtek differenciálódására, szaporodására és életbenmaradására vonatkozó vizsgálatokban. Ha az (I) polipeptidet a fenti vizsgálatokra alkalmazzuk, az (I) polipeptidet előnyösen például 0,1-1000 ng/ml, még előnyösebben körülbelül 1-100 ng/ml végkoncentrációban adjuk az állaü sejtek tenyésztésére alkalmazott közeghez. Az állati sejteket az (I) polipeptidet tartalmazó tenyészközegben tenyésztve meghatározhatjuk az állati sejtek differenciálódásának, szaporodásának és életbenmaradásának mértékét.

Az (I) polipepüd sérült szövetek és szervek regenerálódásában is szerepet játszik, ezért az (I) polipeptidet gyógyszerként is alkalmazhatjuk.

Ezenkívül az (I) polipeptidet kódoló DNS-t próbaként alkalmazhatjuk az (I) polipeptid mRNS meghatározására és detektálására, és az NGF gének klónozására.

Ha az (I) polipeptidet kódoló DNS-t próbaként alkalmazzuk, az (I) polipeptidet kódoló DNS 0,5 pg-ját (körülbelül 300 bp) [a-³²P]dCTP-vel (>400 Ci/mmol) (Amersham, UK) jelezzük, az Amersham által gyártott nick-transzlációs készlet alkalmazásával (körülbelül 10⁷ cpm). Plakk-hibridizációval végzett klónozásnál a hibridizációt szűrőnként 0,005 pg (10⁵ cpm) fenti jelzett próbával hajtjuk végre.

A leírásban a bázisok, aminosavak és egyéb vegyületek rövidítésére a IUPAC-IUB által ajánlott nevezéktant, vagy a szakemberek által szokásosan alkalmazott rövidítéseket használjuk. így például az alábbi rövidítéseket alkalmaztuk. Ha az aminosavak optikailag aktív izomerekként létezhetnek, a rövidítések az L-formát jelentik, hacsak azt ettől eltérően nem említjük.

DNS: dezoxiribonukleinsav

A:	adenin
C:	citozin
G:	guanin
T:	timin
Alá:	alanin
Arg	arginin
Asn:	aszparagin
Asp:	aszparaginsav
Cys:	cisztein
Gin:	glutamin
Glu:	glutaminsav
Gly:	glicin
His:	hisztidin
Ile:	izoleucin
Leu:	leucin
Lys:	lizin
Met:	metionzin
Phe:	fenilalanin
Pro:	prolin
Ser:	szerin

HU 211 309 A9

Thr:	treonin
Trp:	triptofán
Tyr:	tirozin
Val	valin
Boc:	terc-butil-oxi-karbonil
MeBzl:	p-metil-benzil
Bzl:	benzil
-P:	polisztirol gyanta szilárd fázisú peptid szintézishez
PAM:	p-(oxi-metil)-fenil-acetamido-metil-gyanta
AcOH:	ecetsav
OBzl:	benzil-észter
Tos:	tozil
Br-z:	2-bróm-benzil-oxi-karbonil
Cl-z:	2-klór-benzil-oxi-karbonil.
Az 1.	referencia példában kapott mikroorganizmuso-

kát, és a példákban kapott transzformánsokat az Institute fór Fermentation, Osaka, Japán (IFO), valamint a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRI) intézményeknél helyeztük letétbe a Budapesti Szerződésnek megfelelően. A deponálási számokat és a dátumokat az 1. táblázatban foglaljuk össze.

1. táblázat

Mikroorganizmus	IFO	FRI
Escherichia coli MV1184/pUNK5 (1. példa)	IFO 14 831 (1989. február 10.)	FERM BP-2304 (1989. február 22.)
Escherichia coli BL2KDE3)/ pENGFT 102 (4. példa)	IFO 14 874 (1989. május 11.)	FERM Bp-2420 (1989. május 17.)
Escherichia coli DHL/pNTL145 (5. példa)	IFO 14 873 (1989. május 11.)	FERM BP-2421 (1989. május 17.)
Saccharomyces cerevisiae TB39p'(l. példa)	IFO 10 467 (1989. április 24.)	FERM BP-2399 (1989. április 25.)
Saccharomyces cerevisiae TB39p7pAN T341T (9. példa)	IFO 10 475 (1989. július 18.)	FERM BP-2530 (1989. július 26.)
Escherichia coli BL21(DE3)/ pLysS, pENGFT 102(10. példa)	IFO 14 903 (1989. július 14.)	FERM BP-2529 (1989. július 26.)
Escherichia coli DHl/pRNT18 (13. példa)	IFO 14 934 (1989. szeptember?.)	FERM BP-2618 (1989. szeptember 30.)
L-H14—1 (15. példa)	IFO 50 223 (1990. január 30.)	FERM BP-2754 (1990. február 7.)

A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi referencia példákkal és példákkal szemléltetjük.

1. referencia példa

S. cerevisiae TB390p~ előállítása

Az S. cerevisiae NA74-3A (a, pho9, his4, leu2) (IFO 10 430, FERM BP-1947) törzset [amely a 6328 3716/1988 számon publikált japán szabadalmi leírásból (az EP-317 209A megfelelője) ismert] S. cerevisiae DK-13D (a, leu2, trpl, his3) törzzsel [Molecular and Cellular Biology 4, 771 (1984)] kereszteztük. Egy így kapott törzset etidium-bromiddal kezelve kaptuk a légzési deficiens S. cerevisiae TB39p“ (a, MAta, leu2, his3, pho9, p) törzset (IFO 10467, FERM BP-2399).

2. referencia példa

Anti-N-terminális peptid antitest előállítása

1) H-yr-Ala-Glu-His-Lys-Ser-His-Arg-Gly-Glu-TyrSer- Val-Cys-OH szintézise

A fenti pepiidet szilárd fázisú szintézissel állítottuk elő, Model 430A automata peptid-szintetizátor (Applied Biosystems) alkalmazásával. Programként a Standard 1 programot alkalmaztuk. A szintézist alapvetően az R. B. Merrifield által leírt eljárással [Adv. Enzymol. 32, 221— 296 (1969)] összhangban végeztük. Gyantaként

0,5 mmol/g Boc-Cys(MeBzl)PAM-P-t alkalmaztunk, és a szintézist a karboxil-terminálisból kiindulva hajtottuk végre a szekvenciának megfelelően. Boc-aminosavként az alábbiakat alkalmaztuk: Boc-Val, Boc-Ser(Bzl), BocTyr(Br-Z), Boc-Glu(OBzl), Boc-Gly, Boc-Arg(Tos), Boc-His(Tos), Boc-Lys(Cl-Z) és Boc-Ala. A peptidgyantát az amino-terminális tirozinig szintetizáltuk, majd a szintetizátorból kivettük és szárítottuk.

g peptid-gyantához 1,5 ml p-krezolt és 0,5 ml

1,2-etánditiolt adtunk, majd hozzáadtunk körülbelül 8 ml cseppfolyós hidrogén-fluoridot, és 0 °C-on 2 órán keresztül reagáltattuk. A reakció befejezése után a hidrogén-fluoridot vákuumban, exszikkátorban eltávolítottuk, 0,1 %-os, dietil-éteres 2-merkapto-etanollal, majd dietil-éterrel mosva eltávolítottuk a reagensek fő tömegét. A peptidet 10 ml 3%-os ecetsavval extraháltuk és az extrahált oldatban lévő gyantát szűréssel eltávolítottuk. A szűrletet gélszűréses kromatográfiás eljárással tisztítottuk Sephadex G-25 oszlopon. A gélszűréses kromatográfiát az alábbi körülmények közölt végeztük: oszlopméret: 2,8x60 cm; detektálásra alkalmazott hullámhossz: 280 nm; oldószer: 3% ecetsav; átfolyási sebesség: 40 ml/óra.

A peptidet tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük és liofilizáltuk. Az így kapott porszerű mintát fordított fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tovább tisztítottuk az alábbi körülmények között: oszlop: YMC pack, A-324 ODS 10x250 mm; oszlophőmérséklet: 25 °C; A eluens: 0,1% trifluor-ecetsav/99,9% desztillált víz; B eluens: 0,1% trifluor-ecetsav/99,9% acetonitril; elúciós program: 0 perc (90% A+10% B), 30 perc (60% A+40% B); elúciós sebesség: 2 ml/perc; detektálásra alkalmazott hullámhossz: 230 nm.

A fenti körülmények között 23,0 perc retenciós idővel eluálódó főcsúcs-frakciókat összegyűjtöttük, és Bio RÁD AGlx8 oszlopon (AcOH típus, 1,8x5 cm) vezettük át. A mosófolyadékokat is összegyűjtöttük.

HU 211 309 A9

Ezután az acetonitrilt desztillálással eltávolítottuk, majd liofilizáltunk. így 56 mg fehér port kaptunk. A kapott termék a fenti körülmények közötti nagynyomású folyadékkromatográfiával 23,0 percnél egyetlen éles csúcsot mutatott.

Szabad SH-csoportok meghatározása G. L. Elman [Arch Biochem. Biophys. 82, Ί0-ΊΊ (1959)] módszere szerint: 114%.

Aminosav-analízis értékek: Ser 1,65(2); Glu 2,13(2); Gly 1,00(1); Alá 1,04(1); l/2Cys 0,82(1); Val 1,03(1); Tyr 1,97(2); Lys 0,95(1); His 1,72(2); Arg 1,00( 1) Visszanyerés: 74%.

Az l/2Cys értéket perhangyasavas oxidálással határoztuk meg. A zárójelbe tett értékek az elméleti értékeket jelentik.

2) N-tenninális peptid és hemocianin konjugátumának előállítása ml 0,2 mól/1 koncentrációjú foszfát pufferben (pH 7,3) feloldottunk 5 mg fenti 1) lépés szerint előállított N-terminális peptidet és 10 mg hemocianint, majd cseppenként, keverés közben hozzáadtunk 400 μΐ 2,5%-os glutáraldehidet amelyet jeges vízben lehűtöttünk. Az elegyet jeges hűtés közben 3 órán keresztül kevertük, majd desztillált vízzel szemben dializálva kaptuk az N-terminális peptid és a hemocianin konjugátumát.

3) N-terminális peptid és marhaszérum albumin konjugátumának előállítása ml 0,1 mól/1 koncentrációjú foszfát pufferhez (pH 7,5) 12 mg marhaszérum albumint (BSA) adtunk (A oldat). 200 μΐ dimetil-formamidhoz 11,2 mg N-(T-maleimid-butil-oxi)-szukcinimidet (GMBS) adtunk (B oldat). Miközben az A oldatot keverővei kevertük, és cseppenként hozzáadtuk a B oldatot, és a kapott elegyet 30 °C-on 30 percen keresztül reagáltattuk. Ezután a reakcióterméket Sephadex G-25 oszlopon (1,5x20 cm) tisztítottuk, eluensként 0,1 mólll koncentrációjú foszfát puffer (pH 6,5)/0,1 mól/1 NaCl elegyet alkalmaztunk. így marhaszérum albumint kaptunk, amelybe maleimidcsoportokat vittünk be.

0,1 mól/1 foszfát puffer/5 mmol/1 EDTA elegyében feloldottunk 5 mg fenti 1) lépés szerint előállított peptidet, majd hozzáadtunk 20 mg maleimidcsoportokat tartalmazó marhaszérum albumint (az össztérfogat nem több, mint 5 ml), és az elegyet 30 °C-on 60 percen keresztül reagáltattuk. Ezután foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) az elegy térfogatát 12 ml-re kiegészítettük, így kaptuk az N-terminális peptid és a marhaszérum albumin konjugátumát.

4) Anti-(I) polipeptid N-terminális peptid előállítása

A fenti 2) lépésben kapott N-terminális peptid/hemocianin konjugátumot Freund-féle teljes adjuvánssal alaposan összekevertük, és a kapott elegyet nyulakba injektáltuk szubkután módon. Ezután 2-hetes időközökben a fenti 3) lépés szerint előállított N-terminális peptid/marhaszérum albumin konjugátumot Freundféle nem teljes adjuvánssal elegyítettük, és ugyanezekbe a nyulakba beinjektáltuk.

A fenti módon immunizált nyulakból vett vért centrifugálva kaptuk az (I) polipeptid N-terminális peptid elleni antitestet.

1. példa (í) polipeptid cDNS klónozása

Nz Escherichia coli Y1090 törzset humán gliomából származó gtll cDNS könyvtárral (Clontech Laboratories, Inc.) fertőztük, majd mintegy 6xl0⁵ fágot szélesztettünk egy NZCYM tápközeget tartalmazó agar lemezre [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)], és 37 °C-on 5 órán keresztül tenyésztettük. Ezután a lemezre nylon membránt helyeztünk, majd 1 perc elteltével eltávolítottuk. Ezt a nylon membránt 0,5 mól/1 NaOH/1,5 mól/1 NaCl elegyben, majd 1,5 mól/1 NaCl/0,5 mól/1 Tris-HCl (pH 8,0) elegyben, és ezután 2xSSC-ben [lásd Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] áztattuk. Levegőn való szárítás után a membránt 2 órán keresztül 80 °C-on állni hagytuk.

Kémiailag szintetizáltunk egy körülbelül 0,38 kb bosszúságú DNS-t, amely a humán pGF-et kódolja [Natúré 303, 821 (1983)], és nick transzlációs módszerrel [a-³²P]dCTP-vel jelezve előállítottunk egy próbát. A fenti módon kapott nylon membránt és a próbát alkalmazva ismert módon elvégeztük a hibridizációt [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Közelebbről, a nylon membránt a próbát tartalmazó hibridizációs oldatba áztattuk, és 65 °C-on tartottuk 16 órán keresztül. A nylon membránt szobahőmérsékleten 2xSSC/0,1% SDS eleggyel mostuk, majd 60 °C-on lxSSC/0,1% SDS-sel mostuk. Ezután a pozitív kiónokat autoradiográfiásan detektáltuk.

Az így kapott βΰΝ1321 klónból EcoRI-gyel kivágtunk egy cDNS-szakaszt, és a pUCl 18 plazmid (Takara Shuzo) EcoRI helyére inszertálva kaptuk a pUNK5 plazmidot. Az így kapott pUNK5 plazmidot alkalmazva transzformáltuk az E. coli MV1184 (Takara Shuzo) sejteket Cohen és munkatársai fent ismertetett eljárásával. Ily módon kaptuk az E. coli MV1184/pUNK5 transzformánsokat (IFO 14832, FERM BP-2304).

Az 1. ábra mutatja pUNK5 plazmidba illesztett (I) polipeptid cDNS-t tartalmazó cDNS-szakasz (amelynek teljes hosszúsága körülbelül 0,78 kb) restrikciós enzim térképét. Az 1. ábrán [ | mutatja a nem transzlatált régiót, V//Á mutatja a propeptid kódoló régiót és IIIIIlii mutatja a polipeptidet kódoló régiót, amely polipeptid C-terminálisán egy treonin maradékkal megnövelt (II) képletű aminosav-szekvenciát tartalmaz.

A fenti módon előállított cDNS-szakasz nukleotidszekvenciáját didezoxi módszerrel határoztuk meg [Messing és munkatársai, Nucl. Acid. Rés. 9, 309 (1981)]. A 2. ábra mutatja a meghatározott nukleotid-szekvenciát és az általa transzlatált aminosav-szekvenciát. A 2. ábrán a 1 -es helyzettől az aminosav szekvencia N-terminálisáig terje8

HU 211 309 A9 dő szakasz a propeptid része, és az 1-es helyzettől a 118as helyzetig, vagy az 1-es helyzettől a 119-es helyzetig terjedő szakasz mutatja a (Π) képletű aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet, illetve a (Π) képletű aminosav-szekvencia C-terminálisán még egy treonin-maradékot tartalmazó polipeptidet.

A 3. ábra mutatja a fenti módon meghatározott (I) polipeptid aminosav-szekvenciáját a humán PNGF aminosav-szekvenciájával [Ullrich és munkatársai, Natúré 303, 821 (1983)] összehasonlítva. A 3. ábrán a felső sor mutatja az (I) polipeptid 119 aminosavjának szekvenciáját, és az alsó sorban látható a humán PNGF aminosav-szekvenciája. Az azonos aminosav maradékokat tartalmazó részek be vannak keretezve. Az ábrán ,egy kémiai kötést jelent.

A fenti összehasonlításból kitűnik, hogy a találmány szerinti (I) polipeptid 119 aminosavjának szekvenciája körülbelül 60%-ban homológ a humán PNGF aminosav-szekvenciájával.

Ezenkívül, ha az (I) polipeptid fenti módon meghatározott 119 aminosavjának szekvenciáját az egér βΝΰΕ aminosav szekvenciájával [Angeletti és munkatársai, Proceedings of National Academy of Sciences, U. S. A. 68, 2417 (1971)] hasonlítjuk össze, akkor az mintegy 60% homológiával rendelkezik.

A fenti összehasonlítás alapján a találmány szerinti (1) polipeptid új polipeptidnek tekintendő.

2. példa (l) polipeptid cDNS újraklónozása

Próbaként az 1. példa szerint előállított, a pUNK5 plazmidba inszertált (I) polipeptid cDNS-szakasz 5'terminális végét tartalmazó EcoRI-AhalII fragmenst alkalmazva egy humán glioma eredetű cDNS könyvtárat (Clontech Laboratories, Inc.) az 1. példában leírtakhoz hasonlóan klónoztunk. A pozitív kiónok egyikéből, a λΗΝΤ31-ből EcoRI-gyel kivágott cDNS-szakaszt a pUC 119 plazmid (Takara Shuzo) EcoRI helyére inszertálva kaptuk a pHNT2 plazmidot. A 4. ábra mutatja a pHNT2 plazmidba inszertált (I) polipeptid cDNS (körülbelül 1,1 kb) restrikciós enzim térképét. A

4. ábrán [ΠΡΙΙ] mutatja a szignál-peptidet kódoló régiót, mutatja a propeptidet kódoló régiót és a [ | mutatja a (II) képletű aminosav-szekvencia

C-terminálisán egy treonin maradékot is tartalmazó polipeptidet kódoló régiót.

A fentiek szerint kapott cDNS-szakasz nukleotidszekvenciáját fentebb ismertetett didezoxi eljárással határoztuk meg. Az 5. ábra mutatja a meghatározott nukleotid szekvenciát, és az abból transzlatált aminosav-szekvenciát. Az 5. ábrán „szignál” jelenti a szignál-peptidet, „pro” jelenti a propeptidet és „érett” jelenti az (I) polipeptidet (érett protein).

3. példa

Escheriahin coliban működő (!) polipeptid expressziós vektor szerkesztése A pUNK5 plazmidba inszertált (I) polipeptid cDNS (előállítása az 1. példa szerint) egy Seal helyet tartalmaz az (I) polipeptid N-terminális végétől számított 11.

tirozin-maradékot kódoló régió közelében, és egy Nsil helyet 50 bázissal az (I) polipeptid terminációs kodonja után (lásd 2., 4. és 5. ábrát). A pUNK5 plazmidból egy 0,3 kb hosszúságú Scal-Nsil szakaszt izoláltunk, és ahhoz T4 DNS-ligázzal ligáltuk az NGFTE-1 (35mer), NGFTE-2 (33mer), NGFTE-3 (7mer) és NGFTE-4 (15mer) adaptereket, majd Ndel és BamHI restrikciós enzimekkel kezeltük. így kaptunk egy 0,3 kb hosszúságú Ndel-BamHI fragmenst (lásd 6. ábrát).

A fent említett adapterek szerkezete a következő NGFTE-1: 5' TATGTACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGGGGAGT 3' 35mer

NGFTE-2: 5' ACTCCCCTCGGTGACTCTTATGCTCCGCGTACA 3' 33mer

NGFTE-3: 5' TGCCAGG 3' 7mer

NGFTE-4: 5' GATCCCTGGCATGCA 3' 15 mer

Az egy T7 promotert tartalmazó p ET-3C expressziós vektort [Rosenberg és munkatársai, Gene 56, 125 (1987)] Ndel és BamHI enzimekkel hasonló módon hasítva izoláltunk egy 4,4 kb hosszúságú NdelBamHI fragmenst.

A fenti módon kapott 4,4 kb hosszúságú NdelBamHI fragmenst T4 DNS-ligázzal ligáltuk a 0,3 kb hosszúságú Ndel-BamHI fragmenssel, majd a ligáit fragmenst E. coli DHl-be inszertálva előállítottunk egy transzformánst. A kapott ampicillin-rezisztens E. coli DHl/pENGFT102 transzformánsból izolált plazmidot pENGFT 102-nek neveztük (6. ábra).

4. példa

Transzformáns izolálása és expresszió

A 3. példa szerint előállított pENGFT102 (I) polipeptid expressziós vektor alkalmazásával transzformálva az E. coli B121(DE3) törzset [Gene, 56, 125 (1987)] kaptuk az E. coli B121(DE3)/pENGFT102 transzformánst (IFO 14874, FERM BP-2420).

Az E. coli BL21 (DE3)/pENGFT102 transzformánst egy kémcsőben 5 ml, 50 gg/ml ampicillint és 0,2% glükózt tartalmazó LB tápközegben tenyésztettük 37 °C-on 16 órán keresztül. A kapott tenyészetből 1 mlt átvittünk egy 200 ml-es lombikba, amely 20 ml azonos tápközeget tartalmazott, és a tenyésztést 37 °C-on folytattuk. Amikor a Klett-érték 170-200 lett, a tenyészethez 0,4 mmól/1 végkoncentrációban IPTG-t adtunk, és a tenyésztést 3 órán keresztül tovább folytattuk. A 30 μΐ tenyészetből összegyűjtött sejteket minta pufferben [összetétele: 50 mmól/1 Tris-HCl (pH 6,8), 2 mmól/1 EDTA, 1% SDS, 1% merkapto-etanol, 8% glicerin, 0,025% bróm-fenol kék) szuszpendáltuk, és 5 percen keresztül melegítettük, majd 0,1 % SDS-t tartalmazó 16%-os poli(akril-amid) gélen elektroforetizáltuk. Az elektroforézis után a géleket Coomassie Brilliant Blue-val festettük. Ennek eredményeként az E. coli BL21(DE3)/pENGFTl02-ben kimutattunk egy 15 kilodalton (kDa) móltömegű proteint, amelyet nem lehetett kimutatni E. coli BL21(DE3)/pET-3C-ben, amelyet úgy kaptunk, hogy az E. coli BL21(DE3)-at a fenti pET-3C vektor alkalmazásával transzformáltuk. A 15 kDa móltömegű protein mennyisége az összes proteinnek mintegy 10%-a. Ezt a proteint Western blotting

HU 211 309 A9 eljárással is kimutattuk nyúl anti-egér NGF antitest alkalmazásával (Collaborative Research, Inc. U. S. A.).

5. példa

Állati sejtekben működő(I) polipeptid expressziós vektor szerkesztése

A 2. példa szerint előállított pHNT2 plazmidból izoláltunk egy 1,1 kb hosszúságú EcoRI fragmenst, amely az (I) polipeptid cDNS-t tartalmazza. A pTB389 expressziós vektort (leírása a 64-2572/1989 számon publikált japán szabadalmi leírásban, amely az EP251 244A megfelelője) hasonló módon EcoRI-vei hasítottuk. A kapott fragmenst T4 DNS-ligázzal ligáltuk a fenti (I) polipeptid cDNS-t tartalmazó 1,1 kb hosszúságú EcoRI fragmenshez, majd a ligációs elegyet alkalmaztuk E. coli DH1 transzformálására [Molecular Cloning A Laboraroty Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 505. oldal (1982)]. A kapott ampicillin-rezisztens transzformánsból (E. coli DHl/pNTK26) egy plazmidot izoláltunk, amelyet pNTK26-nak neveztünk.

Egy 1,1 kb hosszúságú Clal-HindlII fragmenst [amely egy Abelson egér leukémia vírus (A-MuLV) LTR régiót tartalmaz] izoláltunk a pTB5O5 plazmidból (leírása a 62-175 182/1987 számon publikált japán szabadalmi leírásban, amely az EP-225 701 A-nak felel meg). A pNTK26 plazmidot hasonlóképpen hasítottuk a Clal és HindlII restrikciós enzimekkel, és a kisebb fragmenst eltávolítottuk. Ezután a kapott fragmenst T4 DNS-ligázzal ligáltuk a fenti 1,1 kb hosszúságú, az A-MuLV LTR régiót tartalmazó, Clal-HindlII fragmenshez. és a ligáló elegyet használtuk E. coli DH1 transzformálására, így kaptunk egy ampicillin-rezisztens transzformánst [E. coli DHl/pNTL145 (IFO 14873, FERM BP—2421)]. Az így kapott transzformánsból izoláltuk a pNTL145 plazmidot (7. ábra).

6. példa

Állati sejtekben működő(1) polipeptid expressziós vektor szerkesztése

A 2. példa szerint előállított pHNT2 plazmidból izoláltunk egy 0,83 kb hosszúságú EcoRI-AhalII fragmenst, amely az (I) polipeptid cDNS-ben tartalmazza a szignál-peptidet, a propeptidet és az (I) polipeptidet kódoló régiókat (az Aha III hely helyzetére vonatkozóan lásd a 4. és 5. ábrát). A kapott fragmens 5'-végét (EcoRI) Klenow-fragmenssel ragadóssá tettük, majd annak mindegyik végéhez T4 ligázzal egy pCCTCGAGG Xhol linkért ligáltunk, majd Xho-val kezeltük. így egy 0,86 kb hosszúságú Xhol fragmenst kapunk.

Az állati sejtekben működőképes pKSV-10 expressziós vektort (Pharmacia) BglII restrikciós enzimmel hasítottuk, majd a kapott fragmens mindkét végét (Xhol) Klenow-fragmenssel ragadóssá tettük. Ezután hozzáadtuk a fent említett Xhol linkért, és a kapott fragmenst ligáltuk a fenti 0,86 kb hosszúságú Xhol fragmenssel T4 DNS-ligáz segítségével. A ligáit fragmenst alkalmaztuk E. coli DH1 transzformálására. A kapott ampicillin-rezisztens transzformánsból (E. coli DHl/pNTSIOl) izoláltuk a pNTSIOl plazmidot (8. ábra).

7. példa (I) polipeptid cDNS expresszálása állati sejtekben Majom COS-7 sejteket 10% magzati borjúszérumot tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle tápközegben (DMEM közeg) (Flow Laboratories) tenyésztettünk egy sejtrétegben, majd a tápközeget ugyanezen lápközeggel kicseréltük. A csere után 4 órával ismert eljárással [Graham és munkatársai, Virology 52, 456 (1973)] előállítottuk a pTB389 expressziós vektort, 10 gg pNTK26 (I) polipeptid expressziós vektort, illetve a pNTL145 (I) polipeptid expressziós vektort tartalmazó kalcium-foszfát géleket, és ezeket a sejtekhez adva állítottuk elő a COS7/pTB389, COS-7/pNTK26, illetve COS-7/pNTL145 transzformánsokat. Ezeket a sejteket szén-dioxidos inkubátorban 4 órán keresztül tenyésztettük, majd glicerinnel kezeltük [Gorman és munkatársai, Science 227, 551 (1983)], és 3 napon keresztül tenyésztettük. Az így kapott tenyészeteket centrifugálva előállítottuk a tenyészetek felülúszóit. PC 12 sejteket a megfelelő felülúszók jelenlétében tenyésztettünk a Brain Research 133, 350 (1977), illetve Experimental Cell Research 745, 179 (1983) irodalmi helyeken ismertetett eljárások szerint, és kiszámítottuk azon sejtek százalékos arányát, amelyek neuritjai legalább kétszer nagyobbak, mint a sejtek átmérője. Az eredményeket a 2. táblázatban ismertetjük.

2. táblázat

Vektor	Tenyészet felülúszó (μΐ)	Neuritokkal rendelkező sejtek aránya (%)
pTB389	40	11
pNTK26	40	17
pNTL145	40	20

A fent ismertetett eljáráshoz hasonlóan előállított tenyészet felülúszójának alkalmazásával megvizsgáltuk az együtt tenyésztett szeptális és bazális előagy-neuronok acetil-kolin (ACh) tartalmára kifejtett hatást [M. Kakihana és M. Suno: Nerve Chemistry 27, 166 (1988)].

A szeptális és bazális előagyat 17-napos magzati agyakból kimetszettük, és az idegsejteket Hatanaka és munkatársai módszere szerint [Develop. Brain Rés. 30, 47 (1986)] izoláltuk. A sejteket 100 gg/ml poli-L-ornitinnel előkezelt 48 rezervoáros lemezre oltottuk le körülbelül lxlO⁶ sejt/cm²/rezervoár sűrűségben, és 500 μΙ szérummentes DME/F12/N2 tápközegben 24 órán keresztül tenyésztettük. A közeget leszívtuk, majd 500 μΐ DME/F12/10% FCS-t és a vizsgálati minta felülúszót adtuk hozzá. 2 nap elteltével a tenyészközeget 750 ml azonos tápközeggel kicseréltük, és ismét hozzáadtuk a felülúszót, majd a tenyésztést 2 napon keresztül folytattuk. A felülúszót kétféle módon adagoltuk, mégpedig az első 2-napos tenyésztéshez 50 μΐ felülúszót, míg a második 2-napos tenyésztéshez 75 μΐ felülúszót adagoltunk, 10% végkoncentrációban. Ha egér NGF-et (7S-NGF) alkalmaztunk (gyártja a Wako Junyaku) ezt 0,1% ovalbumin/PBS-sel hígítottuk, és 10 μΙ-t adagoltunk belőle.

HU 211 309 A9

A felülúszó beadagolása után 4 nappal a felülúszót leszívattuk, és 500 μΐ lehűtött 0,3 n PCA-t és 2060 pmol/20 μΐ EHC-t (etil-homokolint) adtunk a rezervoárba az ACh mérések elvégzésére. Óvatos keverés után az oldat 500 μΐ-jét Eppendorf mikrokémcsőbe vittük át. A soronkövetkező műveleteket a fent idézett eljárásokkal összhangban hajtottuk végre, és az ACh mennyiségét HPLC/ECD (nagynyomású folyadékkromatográfia/elektrokémiai detektáló rendszer) alkalmazásával mértük. Az ACh extrahálása után a sejteket 500 μΐ 1 n NaOH-ban oldottuk, és a protein mennyiségét meghatároztuk (Bio-RAD protein-meghatározás). A statisztikai kiértékelést Dunnett-féle t-teszttel végeztük.

Az eredményeket a 3. táblázatban közöljük.

Kísérlet	Minta	Rezervoárok száma	Acetil-kolin tartalom (pmol/mg protein)
1.	Egér NGF 0 ng/ml	6	492+31
Egér NFG 0,1 ng/ml	6	526+14
Egér NGF 1 ng/ml	6	600+31
Egér NGF 10 ng/ml	6	775+29
COS-7/pTB389 felülúszója (10%)	6	582+22
COS-7/pNTL145 felülúszója (10%)	6	652+13
9	COS-7/pTB389 felülúszója (10%)	4	332+7
COS-7/pNTL145 felülúszója (10%)	6	395+7

8. példa

Élesztőben működő (1) polipeptid expressziós vektor szerkesztése

A pGEL1255 humán lizozim expressziós vektort (előállítása az EP 255 233 számon publikált szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint) HindlII-mal hasítottuk, és a kapott fragmenst Klenow-fragmens alkalmazásával ragadóssá tettük, majd T4 DNS-ligázzal ligáivá előállítottuk a pGEL125H plazmidot, amely nem tartalmazott HindUI helyet. Ezután a pGEL125H plazmidot Xhol-gyel hasítottuk és a kapott fragmenst 5'TCGAGGCCA Xhol-HindiII

CCGGTTCGA5' adapterrel ligáltuk, T4DNS-ligáz alkalmazásával, így egy 8,3 kb hosszúságú Hindffi-BamHI fragmenst kaptunk. A p69A plazmidból [Cell, 30, 933 (1982)] izoláltunk egy α-faktor gént tartalmazó, 1,6 kb hosszúságú EcoRI fragmenst, és Klenow-fragmenssel ragadóssá tettük. Ezután a kapott fragmenst az 5'CCGGATCCGG3' BamHI linkerrel ligáltuk T4 DNS-ligáz alkalmazásával, majd BamHI-gyel és HindlII-mal kezeltük. Az így kapott, 0,9 kb hosszúságú BamHI HindUI fragmenst (amely az α-faktor gén promoterét és egy prepro régiót kódoló DNS-t tartalmaz) a fenti 8,3 kb HindlII-BamHI fragmenssel ligáltuk, T4 DNS-ligázzal, és ezzel a reakcióeleggyel transzformáltuk az E. coli DH1 sejteket. A kapott ampicillin-rezisztens transzformánsokból izolált plazmidot pALFA103-nak (9,2 kb) neveztük.

Az α-faktor gén promoterét és a prepro régiót kódoló DNS szekvenciát tartalmazó 0,9 kb hosszúságú BamHI-HindlII fragmenst izoláltuk, majd az M13mpl8 fág vektorba inszertáltuk. Annak érdekében, hogy egy új HindUI helyet alakítsunk ki 24 bázissal a pro régiót kódoló DNS 3'-vége (HindUI hely) előtt, a szerin TCT kodonját a pro régió 81-es helyzetében AGC-vé alakítottuk. Közelebbről, az 5'TTTATCCAAGCTTACCCCTTC3' primer és a fenti 0,9 kb BamHI-HindlII fragmenst tartalmazó M13mpl8 fág vektor alkalmazásával hely-irányított mutagenezist hajtottunk végre Amersham készletet használva a kívánt klón előállítására. A kapott kiónból izoláltunk egy 0,9 kb hosszúságú BamHI-HindlII fragmenst, amely 24 bázispárral rövidebb, mint a mutagenezist megelőzően volt, és ezt ligáltuk a fent ismertetett pGEL125Hból származó, 8,3 kb hosszúságú BamHI-HindlII fragmenssel. így kaptuk a pALFA310 plazmidot.

A pGLDlp31-RcT plazmidból (EP-A 0235430) izoláltunk egy PGK terminátort tartalmazó 0,29 kb hosszúságú AhalII-SalI fragmenst. Ehhez a fragmenshez T4 DNS-ligázzal ligáltuk a pCCTCGAGG Xhol linkért, majd Xhol-gyel és Sall-gyel kezelve kaptunk egy PGK terminátort tartalmazó, 0,29 kb hosszúságú Xhol-Sall fragmenst. Ezt a 0,29 kb hosszúságú XholSall fragmenst egy Xhol helyre inszertáltuk, amely a fent ismertetett pALFA310 plazmidban az α-faktor pro régióját kódoló DNS után helyezkedik el. így kaptuk a pALFA310T plazmidot.

A 2. példa szerint előállított pHNT2 plazmidból izoláltunk egy (I) polipeptid cDNS-t tartalmazó, 1,1 kb hosszúságú EcoRI fragmenst. Ezt az 1,1 kb hosszúságú EcoRI fragmenst AhalII-mal hasítottuk, majd hozzáadtuk az Xhol linkért. A kapott fragmenst Scal-gyel hasítva kaptunk egy 0,36 kb hosszúságú Seal fragmenst. Ehhez a 0,36 kb hosszúságú Scal-Xhol fragmenshez ligáltuk az 5'AGCTTGGATAAAAGATACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGGGGAGT3' 'ACCTATTTTCTATGCGCCTCGTATTCTCAGTGGCTCCCCTCA5'

Hind III Sca I szintetikus DNS-t és a fent említett XhoI-HindlII adaptert, majd HindlII-mal kezeltük. így kaptuk az (I) polipeptidet kódoló, 0,4 kb hosszúságú Hindin fragmenst.

Az (I) polipeptidet kódoló 0,4 kb hosszúságú HindUI fragmenst a HindUI helyre inszertáltuk, amely a pALFA310T plazmidban az α-faktor prepro régióját kódoló DNS 3'-végén helyezkedik el. így kaptuk a pANT34lT (I) polipeptid expressziós vektort (9. ábra).

9. példa

Transzformáns izolálása és az (1) polipeptid cDNS expressziója

A 8. példa szerint előállított pANT341T (I) polipeptid expressziós vektort alkalmazva, lítiumos eljárással [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)] transzformáltuk az 1. referencia példa szerint előállított S. cerevisiae TB3911

HU 211 309 A9 p törzset (IFO 10467, FERM BP-2399). így kaptuk az

S. cerevisiae TB39p-/pANT341T transzformánst (IFO 10475, FERM BP-2530).

Az S. cerevisiae TB39p“/pANT341T transzformánst kémcsőben 5 ml módosított Burkholder tápközegbe (amely 89 g szacharózt, 11 g glükózt, 5,6 g aszparagint és 0,44 g KH₂PO₄-et tartalmaz literenként) [Amer. J. Bot. 30, 206 (1943)] oltottuk, és 30 'C-on 3 napon keresztül rázatva tenyésztettük. Az így kapott tenyészet 1 ml-jét átvittük egy 4 ml fenti tápközeget tartalmazó kémcsőbe, és 30 'C-on 1 napon keresztül rázatva tenyésztettük. Az így kapott tenyészet 2 ml-jét újból átvittük egy 18 ml fenti tápközeget tartalmazó 200 ml-es Erlenmeyer lombikba, és 30 'C-on 3 napon keresztül rázatás közben tenyésztettük.

Az így kapott tenyészetet centrifugáltuk, és felülúszójának 750 μΐ-jéhez triklór-ecetsavat adva kicsaptuk a proteineket. A csapadékot minta pufferben [Laemmli, Natúré, 227, 680 (1970)] oldottuk, és 100 ’Con 5 percen keresztül melegítettük, majd 0,5% SDS-t tartalmazó, 15%-os poli(akril-amid) gélen elektroforetizáltuk. A jelenlévő proteineket nitrocellulóz membránra vittük át Burnette [Analytical Biochemistry 772, 195 (1981)] módszere szerint.

A Western blotting analízist nyúl anti-egér NGF antitest (Collaborative Research Inc. U. S. A.) és egy affinitással tisztított HRP-kötött kecske anti-nyúl IgG (Bio RÁD, U. S. A.) alkalmazásával hajtottuk végre. Ennek eredményeként detektáltunk egy sávot, amely egy körülbelül 15 kDa molekulatömegű (I) polipeptidnek felel meg. Ezt a sávot az S. cerevisiae TB39p~/pALFA310T felülúszójában nem detektáltuk.

10. példa (1) polipeptid előállítása E. coli-val

Az Escherichia coli BL21(DE3) törzset [Gene 56, 125 (1987)] a 3. példa szerint előállított pENGFT102 (I) polipeptid expressziós vektor és a pLysS T7 lizozim expressziós vektor alkalmazásával transzformáltuk, így kaptuk az E. coli BL21(DE3)/pLysS, pENGFT102 transzformánst (IFO 14903, FERM BP-2529).

Az E. coli BL21(DE3)/pLysS, pENGFT102 transzformánst 50 pg/ml ampicillint, 10 μg/ml kloramfenikoll és 0,2% glükózt tartalmazó LB tápközegben [1% tripton (Difco), 0,5% élesztőkivonat, 0,5% NaCl] tenyésztettük 37 ’C-on 16 órán keresztül, rázatás közben. 12,5 ml tenyészetet átvittünk egy 250 ml azonos tápközeget tartalmazó 1 1-es Erlenmeyer lombikba, és 30 ’C-on 3 órán keresztül rázatva tenyésztettük. Ekkor a tenyészlé Klett-értéke elérte a 170-et. A tenyészethez 0,1 pmól/l végkoncentrációban izopropil-P-D(-)-tiogalakto-piranozidot adtunk, és a tenyésztést 30 ’C-on rázatás közben 3 órán keresztül folytattuk. Az így kapott tenyészet 30 μΐ-éből a sejteket összegyűjtöttük, és 30 μΐ minta pufferben [Laemmli, Natúré 227, 680 (1970)] szuszpendáltuk, majd 100 ’C-on 5 percen keresztül melegítettük, és 0,1% SDS-t tartalmazó 16%-os poli(akril-amid) gélen elektroforetizáltuk. A gélen lévő proteineket nitrocellulóz membránra vittük át Burnette [Analytical Biochemistry 772, 195 (1981)] módszere szerint, majd a Western blotting analízist nyúl anti-egér NGF antitest (Collaborative Research Inc. U. S. A.) és affinitással tisztított HRP-kötött kecske anti-nyúl IgG (Bio RÁD, U. S. A.) alkalmazásával elvégeztük. Ennek eredményeként egy 15 kDa molekulatömegű (I) polipeptidet detektáltunk.

Ha a fenti módon előállított és elektroforetizált géleket Coomassie Brilliant Blue-val megfestettük, egy, az (I) polipeptidnek megfelelő 15 kDa molekulatömegű proteint detektáltunk, amelynek mennyisége becslésünk szerint a proteinek összes mennyiségére vonatkoztatva körülbelül 10%.

77. példa (1) polipeptid izolálása

A 10. példa szerint előállított E. coli BL21(DE3)/pLysS, pENGFT102 transzformáns tenyészetének 3,75 literét centrifugálva 17 g (nedves tömeg) sejtet kaptunk. A sejteket 375 ml 50 mmól/1 Tris-HCl-ben (pH 8,0) szuszpendáltuk, és fagyasztottuk-felolvasztottuk, majd ultrahangos oszcillátorral (Kaijo Denki, 2A, 2 perc) kezeltünk háromszor. A szétroncsolt sejtek szuszpenzióját centrifugáltuk, és a kapott csapadékot 60 ml 5 mól/1 guanidin-hidroklorid/5 mmól/1 EDTA/1 mmól/1 PMSF/0,1 mmól/1 APMSF/20 mmól/1 ditiotreit (DTT)/50 mmól/1 nátrium-foszfát pufferben (pH 6,0) oldottuk. Az így kapott oldatot 2 mól/1 guanidin-hidroklorid/5 mmol EDTA/0,1 mmol APMSF/5 mmól/1 DTT/25 mmól/1 nátrium-foszfát pufferrel (pH 6,0) ekvilibrált Sephacryl

S-200 oszlopra vittük, és összegyűjtöttük azokat a frakciókat, amelyekben a fent említett Western blotting eljárással kimutattuk az (I) polipeptidet (térfogat = 300 ml). Ezt az oldatot YM5 membránnal (Amicon) felszerelt ultraszűrő alkalmazásával koncentráltuk, és a kapott koncentrált oldat 50 ml-ét a fentiek szerint Sephacryl S-200 oszlopra vittük. így 164 ml oldatot kaptunk, amely 328 mg tisztított (I) polipeptidet tartalmazott. A tisztaságot SDS/poli(akriI-amid) gél-elektroforézissel vizsgáltuk. Ennek eredményeként megállapítottuk, hogy a kapott tisztított (I) polipeptid lényegében homogén.

A fentiek szerint előállított, tisztított (I) polipeptidet tartalmazó oldatot Ultrapore RPSC oszlopra (0,46x7,5 cm, Altex) vittük, és nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC) kromatografáltuk, eluensként trifluor-ecetsav/acetonitril oldószerrendszert alkalmazva kaptuk a homogén (I) polipeptidet. Az így kapott (I) polipeptid N-terminális aminosav-szekvenciáját gázfázisú protein-szekvenátorban (Model 470A, Applied Biosystems) határoztuk meg. Megállapítottuk, hogy a tisztított (I) polipeptid N-terminális aminosav-szekvenciája megegyezik a cDNS nukleotid-szekvenciájából következtetett (I) polipeptid N-terminális aminosav-szekvenciájával, kivéve, hogy az N-terminálishoz egy metionin-maradék adódott (4. táblázat).

HU 211 309 A9

4. táblázat

N-terminális aminosav-szekvencia

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Tisztított mintából meghatározott szekvencia	Met	Tyr	Ala	Glu	His	Lys	Ser	His	Arg	Gly
cDNS-ből következtetett szekvencia	T\r	Ala	Glu	His	Lys	Ser	His	Arg	Gly	Glu

A fentiek szerint kapott tisztított minta aminosavösszetételét ninhidrines eljárással határoztuk meg. Ennek eredményeként megállapítható, hogy a mért értékek lényegében megegyeztek az elméleti értékekkel, amelyeket az N-terminálison metionin-maradékot is tartalmazó (I) polipepúdből számoltunk ki (5. táblázat).

5. táblázat A minosav-összetétel

	Talált érték1'	Számított érték21
Asp	10,3	11
Thr	8,3	9
Ser	10,0	12
Glu	11,0	11
Pro	1,8	2
Gly	7,9	8
Ala	5,1	5
Cys	5,9	6
Val	8,4	9
Met	1,0	1
lle	6,8	7
Leu	5,1	5
Tyr	5,2	5
Phe	1,1	1
Lys	9,6	10
His	3,6	4
Arg	9,3	10
Trp	3,6	4

I) A Glu-l 11 -nek véve számítottuk.

2) Az N-terminálison metionin-maradékoi is tartalmazó (I) polipeptiddel számolva.

A fenti tisztított (I) polipeptidet tartalmazó oldatot 45 (protein-koncentráció: 2 mg/ml) 2 mól/1 guanidin-hidroklorid/5 mmól/1 EDTA/0,1 mmól/1 APMSF/5 mmól/1 DDT/25 mmól/1 nátrium-foszfát pufferrel (pH 6,0) hígítottuk 10 μg/ml protein végkoncentrációra. A hígított oldatot 50-szeres mennyiségű 1 mmól/1 EDTA/50 mmól/1 50 NaHCO3/Na₂CO₃ pufferrel (pH 10,0) szemben dializáltuk 4 ’C-on 16 órán keresztül, azonos pufferrel szemben tovább dializáltűk 4 órán keresztül. A kapott dializált folyadék hatását PC12 sejteken vizsgáltuk [Brain Research,

133 350 (1979) és Experimental Cell Research 145,179 55 (1983)]. Ennek eredményeként azt találtuk, hogy a PC12 sejtek 6%-a rendelkezett neuritokkal a belső dializált folyadék hozzáadása után, és 2%-a rendelkezett olyan neuritokkal, amelyek hosszúsága legalább kétszerese volt a sejttest átmérőjének. Ezzel szemben kontrollként 60 mmól/1 EDTA/50 mmól/1 NaHCO3/Na₂CO₃ puffer (pH 10,0) alkalmazása esetén a sejteknek csak legfeljebb 0,5%-a rendelkezett neuritokkal. Azt tapasztaltuk, hogy a fentiek szerint előállított tisztított (I) polipeptid csirke embrió érző neuronok (dorsális gyökér ganglionok) túlélését elősegítő aktivitással rendelkezett (fent leírva).

12. példa (1) polipeptid cDNS expresszálása állati sejtekben

Majom COS-7 sejteket egysejtrétegben tenyésztettük 10% magzati borjúszérumot tartalmazó Dulbeccoféle módosított Eagle tápközegben (DMEM közeg) széndioxidos inkubátorban, majd a tápközeget azonos összetételű tápközegre cseréltük. A csere után 4 órával 10 pg pTB389-et (64-2572/1989 számon publikált japán szabadalmi leírás, amely az EP-251 244A-nak felel meg) vagy 10 pg pNTL145-öt (lásd 5. példa) tartalmazó kalcium-foszfát géleket állítottunk elő ismert módon [Graham és munkatársai, Virology 52, 456 (1973)] és a sejtekhez adtuk. Ezeket a sejteket 4 órán keresztül tenyésztettük, majd glicerinnel kezeltük (Gorman és munkatársai, Science 221, 551 (1983)], és a sejteket 10% magzati borjúszérumot tartalmazó DMEM tápközegben 16 órán keresztül tenyésztettük. A tápközeget 0,5% magzati borjúszérumot tartalmazó DMEM-re cseréltük, majd a sejteket 2 napon keresztül tovább tenyésztettük, és a kapott tenyészetet centrifugáltuk. A pTB389-el transzfektált COS-7 sejtek tenyészetének így kapott felülúszóját (1. minta), illetve a pNTL145-tel transzfektált COS-7 sejtek tenyészetének felülúszóját (2. minta) alkalmaztuk a további kísérletekben.

Az egyes minták 0,5 ml-jéhez triklór-ecetsavat adva kicsaptuk a proteineket. A kapott csapadékot minta pufferben [Laemli Natúré, 227, 680 (1970)] oldottuk, és 100 ’C-on 5 percen keresztül melegítettük, majd 0,5% SDS-t tartalmazó 17%-os poli(akril-amid) gélen elektroforetizáltuk. A gélen lévő proteineket nitrocellulóz membránra vittük át Bumette eljárása szerint [Analytical Biochemistry 112,195 (1981)]. A Western blotting analízist a 2. referencia példa szerint előállított anti-(I) polipeptid N-terminális peptid antitest és affinitással tisztított HRP-kötött kecske anti-nyúl IgG (Bio RÁD, U. S. A.) alkalmazásával hajtottuk végre. Ennek eredményeként a pNTL145-tel transzfektált COS-7 sejtek tenyészetének felülúszójában (2. minta) detektáltunk egy körülbelül 15 kDa molekulatömegű sávot, amely az (I) polipeptidnek felel meg. Azonban a pTB389-el transzfektált COS7 sejtek tenyészetének felülúszójában (1. minta) nem detektáltuk az (I) polipeptidnek megfelelő sávot. Abban az esetben, ha a fenti anti-(l) polipeptid N-terminális peptid antitest helyett anti-egér NGF antitestet (Collaborative Research, U. S. A.) alkalmaztunk, kimutatható volt az (1) polipeptidnek megfelelő sáv.

HU 211 309 A9

8-napos csirke embriókból izoláltuk az érző neuronokat (dorsális gyökér ganglionok) és 0,1% tripszinnel (sertés hasnyálmirigyből származó kristályosított tripszin, Wako Junyaku) kezeltük CMF (kalcium-magnézium-mentes) PBS-ben 37 °C-on 20 percen keresztül a sejtek diszpergálása céljából. A sejtek előtenyésztését 10% magzati borjúszérumot (FCS) tartalmazó DMEMben végeztük műanyag tenyésztőcsészében 2 órán keresztül, amikor is a nem-idegsejtek megtapadtak. Ezután a nem tapadó sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és poli-L-ornitinnel bevont 24 rezervoáros lemezre oltottuk ΙΟ⁴—10⁵ sejt/rezervoár sűrűségben. Ezután azonnal hozzáadtuk a DMEM-mel szemben dializált egyes mintákat, tenyészközegként 10% FCS-t, 1 pmól/l Ara-C-t és 50 pg/ml 1:1 arányú kanamicin/Ham-féle F12 elegyet tartalmazó DMEM-et alkalmaztunk. A tenyésztést 4 napon keresztül folytattuk, majd meghatároztuk az életben maradt idegsejtek számát, rezervoárokként 10 látómezőt véve figyelembe. Életképesnek azokat a sejteket tekintettük, amelyek sima felszínnel és egy legalább kétszer olyan hosszú neurittal rendelkeztek, mint a sejttest átmérője.

A tenyésztés megkezdése után 3 nappal összehasonlítottuk egymással az idegsejtek konfigurációját.

Ha 10⁵ sejtet helyeztünk az egyes rezervoárokba, és ezekhez az egyes mintákat 10 térfogat% mennyiségben adtuk a tenyészközegre vonatkoztatva, a 2. mintában számos életben maradt idegsejtet figyeltünk meg, és a neuritok eloszlása sűrű volt. Ezzel szemben az 1. mintában számos halott sejtet (úszó sejtek, bizonytalan körvonallal és neurit nélkül) figyeltünk meg, és az életben maradt sejtek száma kevesebb volt, mint a 2. mintában.

Abban az esetben, ha a sejteket 10⁴ sejt/rezervoár sűrűségben oltottuk le és tenyésztettük, minden mintában erős neurit-fejlődést figyelhettünk meg 5% és 10% koncentráció esetén. 2% minta koncentráció esetén azonban a 2. mintában erősen fejlett neuritokat tartalmazó idegsejteket figyeltünk meg, míg az 1. mintában a neuritok fejlődése gyenge volt, és a sejttestek kicsik voltak.

Ha a 10⁴ sejt/rezervoár sűrűségben leoltott sejteket tenyésztettük, a tenyésztés megindítása után 4 nappal meghatároztuk az életben maradt idegsejtek számát (10. ábra). A 10 ábrán az üres körök (Ojjelzik a pTB89-el transzfektált COS-7 sejtek tenyészetének felülúszóját (1. minta), és a fekete pontok (·) mutatják a pNTL145-tel transzfektált COS-7 sejtek tenyészetének felülúszóját (2. minta). A 2. minta megnövelte az érző idegsejtek életbenmaradását, és hatása a koncentrációtól függő volt, ellentétben az 1. mintával.

13. példa

Patkány (1) polipeptid gén klónozása

A 2. példa szerint előállított pHNT2 plazmidból izoláltunk egy polipeptid cDNS-t tartalmazó, 1,1 kb hosszúságú EcoRI DNS fragmenst, és oligojelző reakcióval (Nippon Gene) jelezve előállítottunk egy próbát.

5-hetes patkányok minden egyes szervéből preparáltuk az összes RNS-t guanidínium-CsCl eljárással, és oligo-dt cellulóz alkalmazásával előállítottuk a poli(A)-RNS-t. A fent említett próba alkalmazásával végrehajtottuk az egyes szövetekből kapott poli(A)-RNS Northern blotting analízisét. Ennek eredményeként az (I) polipeptid egy 1,4 kb hosszúságú messenger RNSét (mRNS) mutattuk ki a vesében, májban, szívben, agyban, lépben, csecsemőmirigyben, tüdőben és a szubmandibuláris mirigyben. A fenti eredményből arra következtettünk, hogy az (I) polipeptid gén patkányban is létezik, és számos szövetben expresszálódik.

Az 1. példa szerint előállított pUNK5 plazmidból izoláltunk egy, a humán (I) polipeptidet kódoló 0,45 kb hosszúságú EcoRI-AhalII fragmenst, és próbaként ezt a fragmenst alkalmazva elvégeztük a patkány genomiális DNS Southern hibridizációját. A fenti próba egy körülbelül 7,4 kb hosszúságú EcoRI fragmenssel, egy körülbelül 3,8 kb hosszúságú BglII fragmenssel és egy körülbelül 3,8 kb hosszúságú HindlII fragmenssel hibridizált, amiből arra következtettünk, hogy egy (I) polipeptid gén patkányban is létezik.

Ezután a 2. példa szerint előállított pHNT2 plazmidból izoláltuk az (I) polipeptid cDNS-t tartalmazó

1,1 kb hosszúságú EcoRI fragmenst, és próbaként ezt a fragmenst alkalmazva klónoztuk a patkány (I) polipeptid gént. A klónozásra patkány genomiális DNS könyvtárat alkalmaztunk, amelyet úgy állítottunk elő, hogy a nőstény patkány (Sprague-Dawley) májából származó DNS-t részlegesen emésztettük, és a kapott fragmenst egy Charon 4A fágba (gyártja a Clontech) vezettük be. E. coli LE362-t ezzel a fág-könyvtárral fertőzve lemezenként körülbelül 5 x 10⁵ plakkot kaptunk. 10 különálló lemezről származó fág DNS-eket nitrocellulóz membránra vittük ismert módon (T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual) és a fent említett próbával hibridizáltuk. Ennek eredményeként 7 pozitív kiónt kaptunk. Az egyik pozitív klón (XrNGF2-8) egy körülbelül 12 kb hosszúságú inszertált DNS-fragmenst tartalmazott. A Southern hibridizáció eredményeiből arra következtettünk, hogy az (I) polipeptidet kódoló régió jelen van a DNS-fragmens 0,95 kb hosszúságú BglII-HindlII fragmensében. Ezután a 0,95 kb hosszúságú BglII-HindlII fragmenst pUC118 plazmidba (Takara Shuzo) szubklónoztuk, így kaptuk a pRNT18 plazmidot. A pRNT18 plazmid alkalmazásával transzformálva az E. coli DH1 törzset kaptuk az E. coli DHl/pRNT18 transzformánst (IFO 14934, FERM BP-2618).

A fenti 0,95 kb hosszúságú BglII-HindlII fragmenst különféle restrikciós enzimekkel hasítottuk, és a kapott fragmenseket pUC118-ba, M13mpl8-ba és hasonlókba szubklónoztuk. Ezután nukleotid-szekvenciájukat Seaqunase (Toyobo) alkalmazásával meghatároztuk (11. ábra). Ennek eredményeként azt találtuk, hogy a 0,95 kb hosszúságú BglII-HindlII ffagmens tartalmazta a patkány (I) polipeptid szignál-peptid régióját, pro-régióját és érett proteinjét kódoló régiót és, intront nem tartalmazott.

A patkány (I) polipeptid nukleotid-szekvenciából következtetett aminosav-szekvenciáját a humán (I) polipeptidével összehasonlítva 11 aminosav-maradéknál találtunk eltérést a szignál-szekvenciában és a pro-régióban, de nem találtunk eltérését az érett proteinben

HU 211 309 A9 [(I) polipeptidben]. Ezzel bebizonyítottuk, hogy a patkány (I) polipeptid aminosav-szekvenciája teljesen azonos a humán (I) polipeptidével.

14. példa (1) polipeptid cDNS klónozása

Az (I) polipeptid cDNS-ből izoláltunk egy, a szignál-szekvenciát, pro-régiót és (I) polipeptidet kódoló, 0,83 kb hosszúságú DNS fragmenst. Az így kapott fragmenst próbaként alkalmazva 0,73 kb és 1,1 kb hosszúságú (1) polipeptid cDNS-eket klónoztunk egy humán placenta könyvtárból (Clontech Laboratories, Inc.) az 1. és 2. példában leírtakhoz hasonló módon. Az így kapott (I) polipeptid cDNS nukleotid-szekvenciája megegyezett az 1. és 2. példában kiónozott (I) polipeptid cDNS-ek nukleotid-szekvenciájával.

15. példa (1) polipeptidet termelő állati sejtvonal előállítása (1) polipeptid expressziós vektor bevezetésével

1) Expressziós vektor szerkesztése

A 2. példa szerint előállított pHNT2 plazmidból izoláltuk az (I) polipeptid cDNS egy 0,86 kb hosszúságú, szignál peptidet, propeptidet és (I) polipeptidet kódoló régióit tartalmazó EcoRI-AhalII fragmensét. Másrészről az interleukin (IL) cDNS expresszálására alkalmas pTB399 plazmidot [Cell Struct. Funct. 72, 205 (1987)] BglII-vel hasítottuk, majd DNS-polimeráz Klenow-fragmenssel kezeltük, végül EcoRI-gyel tovább hasítottuk. így egy körülbelül 3,8 kb hosszúságú fragmenst kaptunk, amelyből az IL-cDNS részt eltávolítottuk.

Ehhez a fragmenshez ligáltuk a fenti 0,86 kb hoszszúságú EcoRI-AhalII fragmenst T4 DNS-ligáz segítségével. így kaptuk a pTB 1091 plazmidot.

Ezután a pLG89 plazmidból (Gene 25, 179 (1983)] izoláltunk egy higromicin B-rezisztencia gént tartalmazó 1,0 kb hosszúságú BamHI fragmenst, és a pTB6 [Cell Struct. Funct. 72, 205 (1987)] neomicin-rezisztencia gént tartalmazó régiójával (1,0 kb BglII-Smal) helyettesítettük. így egy pTB681 higromicin-rezisztencia gén expressziós vektort szerkesztettünk, amely egy HSV TK gén promotert tartalmaz. A pTB681 plazmid PvuII-vel végzett hasításával kapott 1,8 kb hosszúságú fragmenshez egy HindlII linkért adtunk, majd a kapott fragmenst a fenti módon előállított pTB1091 (I) polipeptid expressziós vektor HindlII helyébe inszertáltuk. így kaptuk a higromicin-rezisztencia gént tartalmazó pTBl 139 (I) polipeptid expressziós vektort (12. ábra).

2) (/) polipeptidet termelő állati sejtvonal előállítása

Egér L sejteket (TK-deficiens törzs) 6 cm átmérőjű Falcon-csészébe oltottunk (7xl0⁵ sejt/csészé), és 10% FCS-t tartalmazó Eagle-féle MÉM tápközegben tenyésztettük. A következő napon a sejteket 10 gg pTB 1139 expressziós vektorral transzfektáltuk Graham és munkatársai módszere szerint [Virology 52, 456 (1973)], majd a tenyésztést a fenti közegben 2 napon keresztül folytattuk. Tripszines kezelés után a kapott sejteket egy új csészére oltottuk le, és a tenyésztést

500gg/ml higromicin B-t (Sigma) tartalmazó 10% FCS/MEM tápközegben folytattuk. 2-3 hét elteltével kaptuk a telepszerűen szaporodott higromicin-rezisztens sejteket. Az így kapott higromicin-rezisztens L sejteket ismert módon, például a korlátozott hígítási eljárással klónozva kaptuk az L-Hl-1, L-H6-1, LHll-1, L-H13-1, L-H14-1 (IFO 50223, FERM BP2754), L-H18-1, L-H19-1, L-H35-1, L-H36-1 és L-H-43-1 kiónokat. Az egyes kiónok sejtjeit 24 rezervoáros lemezre oltottuk és tenyésztettük. Amikor a sejttenyészet közelítőleg Összefüggővé vált, a közeget 0,1% FCS-t tartalmazó MÉM tápközegre cseréltük, rezervoáronként 0,5 ml térfogatban. A tenyésztést 2 napon keresztül folytattuk, majd a felülúszót SDS/poli(akril-amid) gél-elektroforézisnek vetettük alá, és az (I) polipeptidet Western blotting eljárással detektáltuk, a 2. referencia példa szerint előállított (I) polipeptid N-terminális peptid antitestet alkalmazva. Ennek eredményeként megállapítottuk, hogy körülbelül 1 mg (I) polipeptid termelődött a fent említett minden egyes klón tápközegében.

Claims (6)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. (I) polipeptid, amely egy (II) képletű aminosav szekvenciát

   TyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCys

   AspSerGlu SerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlalle

   AspIleArgGlyHisGln ValThrValLeuGlyGluIleLys

   ThrGlyAsnSerProValLysGlnTyrPheTPyrroGluThrArg

   CysLysGluAlaArgProValLysAsnGlyCysArgGlylle

   AspAspLysHisTrpAsnSerGlnCysLysThrSerGlnThr

   TyrValArgAlaLeuThrSerGluAsnAsnLysLeuValGly

   TrpArgTrpIleArglleAspThrSerCysValCysAlaLeu

   SerArgLysIleGlyArg X (II) tartalmaz, ahol X jelentése kémiai kötés vagy Thr.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti (I) polipeptid, amelyben az aminosav-szekvencia N-terminálisához egy metionin is kapcsolódik.
3. 3. DNS-szekvencia, amely egy (II) képletű aminosav-szekvenciát

   TyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCys

   AspSerGlu SerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlalle

   AspIleArgGlyHisGln ValThrValLeuGlyGluIleLys

   ThrGlyAsnSerProValLysGln'Irr

   PheTyrGluThrArg

   CysLysGluAlaArgProValLysAsnGlyCysArg Glylle

   HU 211 309 A9

   AspAspLysHisTrpAsnSerGlnCysLysThrSerGlnThr

   Tyr ValArgAlaLeuThrSerGluAsnAsnLysLeuValGly

   TrpArgTrpIle ArglleAspThrSerCysValCysAlaLeu

   SerArgLysIleGlyArg X (II)

   - amelyben X jelentése kémiai kötés vagy Thr - tartalmazó (I) polipeptidet kódol.
4. 4. A 3. igénypont szerinti DNS, ahol az aminosavszekvencia N-terminálisához egy metionin is kapcsolódik.
5. 5. Eljárás polipeptid - amely egy (II) képletű aminosav-szekvenciát

   TyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCys

   AspSer GluSerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlalle

   AspIleArgGlyHis GlnValThrValLeuGlyGluIleLys

   ThrGlyAsnSerProValLysGln TyrPheTyrGluThrArg

   CysLysGlnAlaArgProValLysAsnGlyCys

   ArgGlylle

   AspAspLysHisTrpAsnSerGlnCysLysThrSerGlnThr

   TyrValArgAlaLeuThrSerGluAsnAsnLysLeuValGly

   TrpArgTrp IleArglleAspThrSerCysValCysAlaLeu

   SerArgLysIleGlyArg X (II) (ahol X jelentése kémiai kötés vagy Thr) tartalmaz - előállítására, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet kódoló DNS-t tartalmazó vektorral transzformáit transzformánst tápközegben tenyésztjük, a polipeptidet felszaporítjuk, és a polipeptidet összegyűjtjük, és vektorként a pUC118, pUC119, pET-3c, pTB389, pTB505, pKSV-10, pGE125 vagy pTB399 plazmidot, és a transzformálásra gazdaként Escherichia colit, Saccharomyces cerevisiaet, majom COS-7 sejtet vagy egér L sejtet alkalmazunk.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol az aminosav-szekvencia N-terminálisához egy metionin is kapcsolódik.