PL164726B1 - Sposób wytwarzania czynnika neurotroflcznego CNTF metoda rekombinowanego DNA PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania czynnika neurotrofl- cznego CNTF metoda rekombinowanego D N A , znamienny tym, ze (a) przygotowuje sie sekwencje D N A obejmujaca kwasy nukleinowe ludzkie lub zwierzece o wzorze podanym na fig. 11 i 12, zdolne do ukierunkowania komórki gospodarza na wyt-- warzanie bialka wykazujacego aktywnosc CNTF, (b) klonuje sie te sekwencje D N A w nosniku zdol- nym do przenoszenia go do komórki gospodarza i replikacji w komórce gospodarza, przy czym nos- nik taki zawiera elementy operacyjne potrzebne do ekspresji tej sekwencji D N A , (c) przenosi sie nos- nik, zawierajacy syntetyczna sekwencje D N A i ele- menty operacyjne do komórki gospodarza, zdolnej do ekspresji D N A kodujacego CNTF, (d) prowadzi sie hodowle komórek gospodarza w warunkach odpowiednich do wzmocnienia nosnika i ekspresji CNTF (e) zbiera sie wytworzony CNTF i (f) poz- wala sie CNTF na przyjecie aktywnej struktury trzeciorzedowej, dzieki czemu wykazuje on aktyw- nosc CNTF. F i g 1 1 FIG. 1 2 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania czynnika neurotroficznego CNTF metodą rekombinowanego DNA.

Szereg zaburzeń umysłowych i fizycznych jet powodowanych obumieraniem komórek nerwowych lub glejowych w układzie nerwowym. Obumieranie to może być powodowane przez choroby powodujące degenerację nerwów, takie jak choroby Alzheimera i Parkinsona oraz

164 726 3 stwardnienie rozsiane, przez niedokrwienie będące wynikiem zawału, przez rany urazowe lub przez proces naturalnego starzenia się.

Czynniki neurotroficzne są klasą cząsteczek promujących utrzymującą przy życiu lub funkcjonalną aktywność komórek nerwowych lub glejowych. Istnieją dowody sugerujące, że czynniki neurotroficzne są przydatne do leczenia lub zapobiegania obumieraniu komórek nerwowych lub glejowych lub ich nieprawidłowej czynności, wynikającej z wymienionych wyżej stanów chorobowych (Appeal 1981, Ann. Neurology 10:499).

Najlepiej scharakteryzowanym spośród takich czynników neurotroficznych jest czynnik wzrostowy nerwu (NGF). Wykazano, że NGF jest czynnikiem neurotroficznym dla cholinergicznych komórek nerwowych przedmózgowia, obumierających podczas choroby Alzheimera oraz z wiekiem. Uważa się na ogół, że zanik tych komórek nerwowych jest odpowiedzialny za wiele zaburzeń świadomości związanych z chorobą Alzheimera i z zaawansowanym wiekiem.

Próby na zwierzętach wykazały, że NGF zapobiega obumieraniu cholinergicznych komórek nerwowych przedmózgowia po zranieniu urazowym i że NGF może odwrócić utratę świadomości, występującą z wiekiem (patrz Heffi and Weiner, 1986, Ann. Neurology 20:275; Fisher et al., 1987, Nature, 329:65). Wyniki te sugerują potencjalną przydatność kliniczną tego czynnika neutroficznego w leczeniu u ludzi utraty świadomości powodowanej obumieraniem cholinergicznych komórek nerwowych przedmózgowia, wywołanego chorobą, zranieniem lub wiekiem.

Komplikację w stosowaniu czynników neurotroficznych stanowi ich specyficzoność wobec tylko tych podpopulacji komórek nerwowych, które posiadają właściwe receptory błonowe. Większość komórek nerwowych ciała nie ma receptorów NGF i jest oczywiście niewrażliwa na ten czynnik neurotroficzny. Dlatego niezmiernie ważne byłoby odkrycie nowych czyników neurotroficznych, mogących podtrzymywać przeżycie innych rodzajów komórek nerwowych lub glejowych niż NGF.

Poszukiwano nowych czynników neurotroficznych ze względu na ich zdolność do podtrzymywania przeżycia w hodowli komórek nerwowych niewrażliwych na NGF. Szeroko stosowano próby skriningowe w celu odkrycia czynników promujących przeżycie rzęskowych zwojowych neuronów motorycznych unerwiających mięśnie szkieletowe i gładkie. Te rzęskowe zwojowe komórki nerwowe należą do parasympatycznego układu nerwowego a ich przeżycie nie jest podtrzymywane przez NGF.

Donoszono o obecności w różnych tkankach u różnych gatunków czynników promujących przeżycie rzęskowych zwojowych komórek nerwowych. Wiele z tych rzęskowych zwojowych czynników neurotroficznych wykazuje następujące podobne właściwości chemiczne i biologiczne: (1) wykazują wysoką aktywność w nerwach kulszowych, (2) zachowują aktywność neurotroficzną po ekspozycji na jonowy detergent, dodecylosiarczan sodowy (SDS) i środki redukujące, βmerkaptoetanol (BME) lub dwutiotreitol (DTT) podczas elektroforezy na poliakryloamidowych żelach redukujących SDS i (3) na żelach takich aktywność migruje wraz z pozornym ciężarem cząsteczkowym pomiędzy 24 - 28 kd (Collins, 1985, Developmental Biology, 109:255 -258, Manthorpe et al., 1986, Brain Research, 367:282 -286).

W oparciu o te podobne właściwości zaproponowano, że te same lub ściśle pokrewne cząsteczki, określane zwykle jako „rzęskowy czynnik neurotroficzny¹¹ lub „CNTF“ są odpowiedzialne za rzęskową zwojową czynność neurotroficzną. I tak, określenie CNTF jest operacyjną definicją odnoszącą się do środków o powyższych właściwościach, promujących przeżycie w hodowli rzęskowych zwojowych komórek nerwowych. Bez dostatecznych dowodów do ustalenia, że białka odpowiedzialne za to działanie są identyczne, CNTF rozróżniano na podstawie tkanki i gatunku, z którego pochodzą. I tak, jeśli gatunkiem z którego pochodzi białko jest królik, nazywa się je CNTF nerwu kulszowego królika (SN-CNTF).

CNTF nerwu kulszowego królika znajdowano oczywiście w najwyższym stężeniu w nerwach obwodowych, takich jak nerw kulszowy. Uwalniany jest on z komórek w nerwie po zranieniu. SN-CNTF podtrzymuje przeżycie i wzrost wszystkich badanych komórek nerwowych obwodowego układu nerwowego, włącznie z komórkami nerwowymi nerwów czuciowych, nerwów współczulnych i przywspółczulnych. I tak, SN-CNTF odznacza się szerszym zakresem wrażliwości komórek nerwowych niż NGF. Szczurzy SN-CNTF, jak wykazano ostatnio, reguluje w ośrodko4 164 726 wym układzie nerwowym powstawanie komórek glejowych specjalnego rodzaju (Hughes et al., 1988, Naturę 335:70).

Najrozsądniejszą hipotezą, opartą na tych dowodach jest to, że CNTF nerwu kulszowego stanowi składnik reakcji układu nerwowego na zranienie. Możnaby oczekiwać, że SN-CNTF uwalniany z komórek w uszkodzonym nerwie będzie promować przeżycie i ponowny wzrost zranionych komórek nerwowych i regulować czynność funkcjonalną komórek glejowych, konieczną do regeneracji. Rozważania te wskazują, że SN-CNTF mogłyby mieć wartość leczniczą w regulowaniu uszkodzeń układu nerwowego, powodowanych chorobą lub zranieniem.

Pomimo szerokiego zainteresowania naukowców SN-CNTF, trudności w oczyszczaniu znacznych jego ' ilości ze źródeł naturalnych i niedostępność ludzkiego SN-CNTF hamowały usiłowania aby wykazać jego wartość w podtrzymywaniu żywotności komórek nerwowych podczas choroby lub po zranieniu. Wcześniejsze usiłowania wyizolowania szczurzego SN-CNTF spowodowały 800-krotny wzrost aktywności właściwej w porównaniu z aktywnością ekstraktu z surowego nerwu (Manthorpe et al., 1986, Brain Research 367:282 - 286).

Wzrost 800-krotny aktywności właściwej był jednak niewystarczający do otrzymania pojedynczego rodzaju białka. Dlatego, produkt wykazujący zwiększoną aktywność, uzyskany metodą Manthorpa et al., jest niezadowalający, gdyż zawiera wiele rodzajów białek. Byłoby pożądane uzyskać taki stopień oczyszczania SN-CNTF, aby uzyskać jeden tylko rodzaj białka o odpowiedniej ' aktywności biologicznej. Gdy już raz uzyska się pojedynczy rodzaj białka, dane dotyczące sekwencji aminokwasów byłyby dokładniejsze. Pod określeniem „pojedynczy rodzaj białka“ rozumie się polipeptyd lub szereg polipeptydów o takiej samej sekwencji aminokwasów w ich aktywnych miejscach. Inaczej mówiąc, jeśli dwa lub większa liczba polipeptydów ma część operacyjną o takiej samej sekwencji aminokwasów, stanowią one “pojedynczy rodzaj białka“ zgodnie z powyższą definicją, nawet jeśli wykazują one pewną niejednorodność jeśli chodzi o długość lub ładunek.

Sposób według wynalazku wytwarzania czynnika neurotroficznego CNTF metodą rekombinowanego DNA polega na tym, że (a) przygotowuje się sekwencję DNA obejmującą kwasy nukleinowe ludzkie lub zwierzące o wzorze podanym na fig. 11 i 12 zdolną do ukierunkowania komórki gospodarza na wytwarzanie białka wykazującego aktywność CNTF, (b) klonuje się tę sekwencję DNA w nośniku zdolnym do przenoszenia go do komórki gospodarza i replikacji w komórce gospodarza, przy czym nośnik taki zawiera elementy operacyjne potrzebne do ekspresji tej sekwencji DNA, (c) przenosi się nośnik, zawierający syntetyczną sekwencję DNA i elementy operacyjne do komórki gospodarza, zdolnej do ekspresji DNA kodującego CNTF, (d) prowadzi się hodowlę komórek gospodarza w warunkach odpowiednich do wzmocnienia nośnika i ekspresji CNTF, (e) zbiera się wytworzony CNTF i (f pozwala się CNTF na przyjęcie aktywnej struktury trzeciorzędowej, dzięki czemu wykazuje on aktywność CNTF.

Rekombinowany układ ekspresji umożliwia stosowanie kwasu nukleinowego o sekwencji kodującej ludzki lub zwierzęcy CNTF do wytwarzania ludzkiego lub zwierzącego białka CNTF.

Znaleziono sondy SN-CNTF do skriningu cDNA i genomowy zapis SN-CNTF, jak również CNTF o króliczej i ludzkiej sekwencji aminokwasów i kwas nukleinowy CNTF. Tą drogą otrzymuje się aktywny biologicznie zwierzęcy lub ludzki CNTF.

Ani powyższy ogólny opis, ani dalszy szczegółowy opis wynalazku nie stanowi jego ograniczenia. Wynalazek jest bliżej wyjaśniony na rysunkach, na których fig. 1 przedstawia przykładowe wyniki chromatografii na kolumnie Mono P, fig. 2 - przykładowy rozkład aktywności neurotroficznej w eluacie z każdego z 7 pasków uzyskanych w układzie SDS-żel Page po elektroforezie, fig. 3 przykładowe wyniki chromatografii z odwróconymi fazami, fig. 4 - przykładowe wyniki barwionych srebrem redukujących przebiegów w układzie SDS-żel Page dla frakcji równoważnych frakcjom sąsiadującym z frakcjami o szczytowej aktywności neurotroficznej przedstawionej na fig. 3, fig. 5 - profil eluowanych peptydów po trawieniu endoproteazą Asp-N a fig. 6 - po trawieniu endoproteazą Lys-C, fig. 7 - przykładowe wyniki chromatografii frakcji siarczanu amonowego na kolumnie phenyl Sepharose HIC, fig. 8 - przykładowe wyniki dla Mono-P frakcji chromatoogniskowanej na kolumnie alkyl-Superose FPLC-HIC, fig. 9 - przykładowe wyniki chromatografii preparatywnej frakcji SDS-PAGE na kolumnie C8 HPLC z odwróconymi fazami (tabela A ilustruje wyniki oryginalnego postępowania oczyszczającego, a tabela B - bieżącego sposobu oczy164 726 szczania po dodaniu dwóch etapów chromatografii HIC), fig. 10 - przykładowe wyniki analizy za pomocą chromatografii i z odwróconymi fazami, przy czym linia 1 w każdej z dwóch tabel obejmuje białka o standardowym ciężarze cząsteczkowym (SIGMA SDS-7) a linia 2 - oczyszczony SN-CNTF; tabela (A) ilustruje wyniki barwienia srebrem a (B) wyniki analizy na bibule Western z oczyszczonym z powinowactwa przeciwciałem anty-peptydu-A; fig. 11 - sekwencję kwasu nukleinowego kodującą króliczy SN-CNTF, translacja tej sekwencji kwasu nukleinowego daje odpowiednią sekwencją aminokwasową wskazaną niżej w pojedynczym kodzie literowym, przy czym podkreślone sekwencje zostały potwierdzone przez sekwencję aminokwasów uzyskaną z białka SN-CNTF, fig. 12 - kwas nukleinowy i odpowiadającą mu sekwencję aminokwasową (w kodzie trzyliterowym), stanowiącą sekwencję ludzkiego CNTF. Sekwencje ludzkie są pomiędzy wierszami. Gdy króliczy kws nukleinowy lub sekwencja aminokwasów różnią się od ludzkich, wypisano je odpowiednio powyżej i poniżej wierszy, fig. 13 - konstrukcję nośnika ekspresji pCMVXVPL2, fig. 14 -sposób konstruowania CNTF-Syn 2/2 do ekspresji CNTF. Rysunki nie są wykonane w skali. Dane doświadczalne podano w przykładzie VII, fig. 15 - sposób konstruowania CNTF-Syn 2/3 do ekspresji CNTF. Rysunki nie są wykonane w skali. Dane doświadczalne podano w przykładzie VII, fig: 16 - syntetyczne oligonukleotydy 1 do 4, używane do konstruowania CNTF-SN 1/3 i CNTF-Syn 2/3, fig. 17 - syntetyczne oligonukleotydy 5 do 10, używane do konstruowania CNTF-Syn 2/3, fig. 18 - pewne cechy bakteryjnego nośnika ekspresji pT5T, zawierającego insert DNA odpowieni do ekspresji CNTF. Rysunki są przykładowe i nie wykonane w skali, a dane doświadczalne podano w przykładzie VII, fig. 19 - pewne cechy bakteryjnego nośnika ekspresji pT3XI-2 zawierającego insert DNA odpowiedni do ekspresji CNTF. Rysunki są przykładowe i nie wykonane w skali, a dane doświadczalne podano w przykładzie VII, fig. 20 - żel poliakryloamidowy redukujący SDS, w którym ekstrakty komórek transformowanych różnymi skonstruowanymi nośnikami poddano elektroforezie i barwiono barwnikiem Coomassie Brillant Biur, fig. 21 -żel poliakryloamidowy redukujący SDS, w którym ekstrakty komórek transformowanych różnymi skonstruowanymi nośnikami ekspresji poddano elektroforezie i immunoblotowaniu oczyszczonym z powinowactwa przeciwciałem anty- CNTF peptydu A, fig. 22 - próby biologiczne serii rozcieńczeń supernatantów z komórek bakteryjnych powodujących ekspresję pT5T:CNTF-Syn 1/3 lub pT3XI-2:CNTF-Syn 2/3 Wstawka przedstawia próby biologiczne supernatanta pT5T:CNTF-Syn 1/3 ekstrahowanego z pasków żelu poliakryloamidowego redukującego SDS z regionu żelu bezpośrednio powyżej i poniżej 24 kd.

SN-CNTF oczyszczony co najmniej 25000-krotnie z surowego ekstraktu stanowi pojedynczy rodzaj sbiałka, w sensie podanej wyżej definicji. Jako pojedynczy rodzaj białka, ma on sekwencję aminokwasów możliwą do ustalenia za pomocą skonstruowanych sond DNA do otrzymywania klonów genomowych lub klonów cDNA do stosowania w rekombinantowym wytwarzaniu SN-CNTF.

Częściowo ustalono sekwencją pojedynczego rozdaju białka SN-CNTF i wygląda ona następująco:

I-R-S-D-L-T-A-L-T-E-SY-V-K-H-Q-G-L-N-K-N D-G-V-P-M-A-G K-L-W-G-L-K

Dodatkową sekwencję aminokwasów ustalono dla oczyszczonego króliczego SN-CNTF,'jak podano w przykładzie II. Ta dodatkowa sekwencja pozwala na częściowe umiejscowienie podanej wyżej sekwencji aminokwasowej w pojedynczym dużym peptydzie (przykład II). Tę sekwencję pojedynczego peptydu użyto do generowania trzech degenerowanych sond oligonukleotydowych (nr 1, 13 i 7 w przykładzie IV), bardzo przydatnych do zapoczątkowania reakcji łańcuchowej polimerazy, gdy znane jest ich wzajemne usytuowanie względem siebie.

Ustalono sekwencje kwsu nukleinowego (równoważnik mRNA) kodującego króliczy i ludzki CNTF i podano na fig. 11 i 12.

Opracowano układ rekombinantowy do przejściowej ekspresji biologicznie czynnego CNTF i opisano w przykładzie V.

164 726

Ulepszony sposób oczyszczania SN-CNTF odnosi się do SN-CNTF pochodzącgo z dowolnego źródła, choć opisano go w odniesieniu do SN-CNTF wyizolowanego z królików.

W korzystnej postaci sposobu, sproszkowuje się materiał stanowiący nerw kulszowy królika, po czym surowy ekstrakt odwirowuje się. Supernatant zakwasza się, a powstały osad usuwa się przez odwirowanie. Następnie supernatant miareczkuje się NaOH i powstały osad ponownie usuwa się przez odwirowanie.

Po strąceniu osadu w różnym pH, do supernatantu dodaje się nasycony roztwór siarczanu amonowego, a osad usuwa się przez odwirowanie. Przy dalszym dodawaniu siarczanu amonowego do supernatantu, powstaje osad frakcji białkowej, zawierającej większość aktywności SN-CNTF. Preparat ten załadowuje się na chromatoogniskującą kolumnę Mono P HPLC. Następnie zbiera się frakcje z kolumny i analizuje się pod kątem pH i aktywności CNTF. Frakcje wskazane na fig. 1 o szczytowej aktywności SN-CNTF poddaje się dalszej obróbce, dokładnie opisanej niżej.

Zogniskowane frakcje z wielu przebiegów na kolumnie Mono P poddaje się elektroforezie na płytce żelu poliakryloamidowego SDS. Obszar żelu odpowiadający ciężarowi cząsteczkowemu 22-27 kd tnie się w poprzek szerokości żelu na liczne paski. Poszczególne paski tnie się na mniejsze kawałki i elektroforetycznie eluuje się białka. Wyeluowane białka zbiera się i frakcje o najwyższej aktywności oczyszcza się dalej metodą chromatografii HPLC z odwróconymi fazami. Opisano to bardziej szczegółowo w przykładach.

Ponadto dodatkowe operacje można włączyć do podanego wyżej sposobu oczyszczania, aby dogodnie przerabiać więcej materiału wyjściowego. W korzystnej postaci tych dodatkowych operacji, pomiędzy frakcjonowaniem za pomocą siarczanu amonowego a chromatoogniskowaniem umieszcza się operację chromatografii z hydrofobowym wzajemnym oddziaływaniem na phenyl-Sepharose, natomiast chromatografię z hydrofobowym wzajemnym oddziaływaniem na kolumnie HPLC alkyl-Superose włącza się pomiędzy operację chromatoogniskowania a preparację na SDS-PAGE (przykład I).

SN-CNTF w postaci oczyszczonej ma ponad 25000-k rotnie zwiększoną · aktywność właściwą w porównaniu z surowym ekstraktem. Produkt ten stanowi pojedynczy rodzaj białka. Oznacza to ponad 30-krotne zwiększenie aktywności SN-CNTF w porównaniu z preparatami zawierającymi wiele rodzajów białka otrzymanymi przez Manthorpa i in, jak opisano wyżej. Ponieważ SN-CNTF ulega częściowej dezaktywacji podczas chromatografii HPLC z odwróconymi fazami, podany stopień oczyszczania 25000-krotny reprezentuje minimalne uzyskane oczyszczanie, które w rzeczywistości może być 100000-krotne lub większe. To zwiększenie czystości ułatwia ustalenie sekwencji aminokwasowej SN-CNTF dostatecznej do generowania sond oligonukleotydowych ułatwiające skrining cDNA i ustalenie sekwencji kodującej króliczy i ludzki CNTF w celu klonowania genów kodujących zwierzęcy i ludzki SN-CNTF.

Jak podano niżej, geny te umożliwiają z kolei wytwarzanie na dużą skalę (1) zwierzęcego SN-CNTF nadającego się do badań jego możliwości leczenia na modelach zwierzęcych uszkodzenia układu nerwowego, i (2) ludzkiego SN-CNTF nadającego się do sporządzania preparatów farmaceutycznych przydatnych do leczenia uszkodzeń układu nerwowego u ludzi.

Sposób według wynalazku zapewnia wytwarzania biologicznie aktywnego zwierzęcego CNTF w rekombinowanym układzie ekspresyjnym.

Mając te oczyszczone białka, można ustalić sekwencję aminokwasów głównych peptydów. Białka traktuje się najpierw endoproteazą Asp-N, endoproteazą Lys-C, endoproteazą Glu-C lub chymotrypsyną. Po trawieniu, można ustalić sekwencję aminokwasów głównych peptydów, stosując Applied Biosystems gas phase protein sequencer.

W celu uzyskania genu kodującego SN-CNTF można używać przeciwciał reagujących z oczyszczonym SN-CNTF do skriningu zapisów ekspresji. Można syntetyzować syntetyczne peptydy odpowiadające regionom sekwencji SN-CNTF, stosując syntetyzator Applied Biosystems automated protein synthesizer. Peptydy ftakie można stosować do wytwarzania precciwciał. Wytworzono przeciwciała syntetycznych peptydów i wykazano na podstawie analizy na bibule Western, że ulegają one reakcji z oczyszczonym CNTF.

Ostatecznym celem jest klonowanie i ekspresja genu ludzkiego SN-CNTF w celu wytworzenia materiału nadającego się do użycia w preparatach farmaceutycznych dla ludzi. Gdy raz zostanie

164 726 poznana sekwencja genomowa, można prowadzić ekspresję genów kodujących SN-CNTF w komórkach zwierzęcych lub bakteryjnych. Ustalono królicze i ludzkie sekwencje genów kodujących CNTF. Opracowano przejściowy układ ekspresji do wytwarzania biologicznie czynnego CNTF.

Obecnie opracowano metodę rekombinacji DNA do wytwarzania CNTF. W jednej z postaci wynalazku, miejsca aktywne działają w sposób biologicznie równoważny wrodzonemu CNTF wyizolowanemu od ludzi. Do kierowania bezpośrednim wytwarzaniem CNTF można stosować sekwencję naturalnego lub syntetycznego DNA. Sposób ten polega na tym, że (a) sporządza się sekwencję DNA zdolną do ukierunkowania komórki gospodarza na wytwarzanie białka wykazującego aktywność CNTF, (b) klonuje się tę sekwencję DNA w nośniku, który może być przenoszony do komórki gospodarza i replikowany w niej, przy czym nośnik taki zawiera elementy operacyjne potrzebne do ekspresji sekwencji tego DNA, (c) przenosi się nośnik,zawierający sekwencję syntetycznego DNA i elementy operacyjne do komórki gospodarza zdolnej do ekspresji DNA dokującego CNTF, (d) prowadzi się hodowlę komórek gospodarza w warunkach odpowiednich do wzmocnienia nośnika i ekspresji CNTF, (e) zbiera się CNTF i (f) pozwala się na przyjęcie aktywnej trzeciorzędowej struktury, posiadającej aktywność CNTF.

W jednej postaci, częściowo lub całkowicie syntetyczna sekwencja DNA, stosowana do wytwarzania rekombinowanego CNTF może zawierać inne nukleotydy niż wrodzona sekwencja DNA. W korzystnej postaci, sekwencja DNA z innymi nukleotydami ciągle jeszcze będzie kodować polipeptyd o takiej samej pierwotnej strukturze jak CNTF kodowanej przez zwierzęce lub ludzkie geny CNTF. W alternatywnej korzystnej postaci, sekwencja DNA z innymi nukleotydami będzie kodować polipeptyd o pierwotnej strukturze pokrewnej naturalnemu CNTF, i który będzie mieć co najmniej jedną z aktywności biologicznych CNTF.

Wrodzoną sekwencję DNA kodującą CNTF modyfikuje się w celu promowania ekspresji w organizmie lub komórce gospodarza. Modyfikacje takie mogą być następujące:

(a) Gdy sekwencja wrodzonego DNA jest sekwencją genomowego DNA, wówczas można stosować usuwanie wtrąconych, nie kodujących sekwencji (intronów), jeśli przewiduje się ekspresję w drobnoustroju.

(b) Zmienia się sekwencję kwasu nukleinowego, włączając sekwencje rozpoznawane przez różne enzymy restrykcyjne dla ułatwienia dalszych operacji wiązania, klonowania i mutagenezy.

(c) Zmienia się sekwencję kwasu nukleinowego w celu utworzenia kodonów preferowanych przez komórki lub organizm gospodarza w celu wytwarzania rekombinantowego białka.

(d) Wiąże się sekwencje kwasu nukleinowego z elementami operacyjnymi koniecznymi do utrzymania i ekspresji DNA w komórce lub organizmie gospodarza.

Sporządza się, jak opisano wyżej, sekwencję DNA mającą powstawać w wyniku ekspresji i umieszcza się ją w nośniku ekspresji zdolnym do przebywania w organizmie lub komórce gospodarza i kieruje się ekspresją CNTF. Nośniki takie mają pewne korzystne cechy; odpowiednie do ekspresji w szczególnej komórce lub organizmie gospodarza.

(a) Drobnoustroje, zwłaszcza E.coli.

Nośniki, przeznaczone do stosowania w wynalazku obejmują wszelkie nośniki, w których można umieścić sekwencję DNA omówioną wyżej, wraz z dowolnymi korzystnymi lub wymaganymi elementami operacyjnymi, który to nośnik można następnie przenosić do komórki gospodarza i replikować w takiej komórce. Korzystne są nośniki o dobrze udokumentowanych miejscach restrykcji i zawierające elementy operacyjne korzystne lub wymagane do transkrypcji sekwencji DNA. Przewidziano jednak pewne możliwości stosowania nieodkrytych nośników, które mogłyby zawierać jedną lub więcej opisanych tu sekwencji DNA. Szczególnie korzystne jest, aby wszystkie te nośniki miały wszystkie lub niektóre z następujących właściwości: (1) miały minimalną ilość sekwencji organizmu gospodarza, (2) były trwale utrzymywane i reprodukowane w pożądanym gospodarzu, (3) były zdolne do występowania w dużej liczbie kopii w pożądanym gospodarzu, (4) miały dający się regulować promotor umiejscowiony tak, aby promować transkrypcję genu będącego przedmiotem zainteresowania, (5) miały co najmniej jedne marker sekwencji DNA, kodujący dającą się wyselekcjonować cechę występującą na części plazmidu oddzielonej od tej jego części, w której będzie umieszczona sekwencja DNA, i (6) miały sekwencję DNA zdolną do zakończenia transkrypcji.

164 726

W różnych postaciach, te nośniki klonujące zawierające sekwencje DNA używane w sposobie według wynalazku lub zdolne do ich ekspresji, zawierają różne elementy operacyjne. Te, opisane tu „elementy operacyjne obejmują co najmniej jeden promotor, co najmniej jedną sekwencją ShineDalgarno i kodon inicjatora, oraz co najmniej jeden kodon terminatora. Korzystnie, te „elementy operacyjne mogą także zawierać jeden lub więcej następujących elementów: co najmniej jeden operator, co najmniej jedną sekwencję liderową białek usuwanych z przestrzeni wewnątrzkomórkowej, co najmniej jeden gen regulatora białka, i wszelkie inne sekwencje DNA konieczne lub korzystne do właściwej transkrypcji i następnie translacji nośnikowego DNA.

Niektóre z tych elementów mogą występować w każdym z korzystnych nośników. Uważa się, że do tych nośników można dodawać wszelkie dodatkowe elementy operacyjne, które mogą być potrzebne, stosując sposoby znane fachowcom.

W praktyce, każdy z tych nośników można skonstruować w sposób pozwalający na jego łatwe wyodrębnienie, łączenie i wzajemną wymianę. Ułatwia to zestawienie licznych genów funkcjonalnych z kombinacji tych elementów i regionu kodującego sekwencje DNA. Ponadto, wiele z tych elementów nadaje się do stosowania u więcej niż jednego gospodarza. Uważa się dodatkowo, że nośniki te, w pewnych korzystnych postaciach wynalazku, zawierają sekwencje DNA zdolne do funkcjonowania jako regulatory („operatory) i inne sekwencje DNA zdolne do kodowania białek regulatorów.

(i) Regulatory.

Regulatory te, w jednej z postaci wynalazku, służą do zapobiegania ekspresji sekwencji DNA w obecności pewnych warunków środowiskowych, a w obecności innych warunków środowiskowych, pozwalają na transkrypcję i następnie ekspresję białka kodowanego przez sekwencję DNA. Korzystne jest zwłaszcza, aby segmenty regulujące umieszczać w nośniku tak, że nie nastąpi ekspresja sekwencji DNA lub nastąpi ona w znacznie zmniejszonym stopniu, pod nieobecność np. izopropylotio-8-D-galaktozydu (IPTG). W tej sytuacji, transformowane drobnoustroje zawierające- sekwencje DNA, mogą wzrastać do pożądanej gęstości przed zapoczątkowaniem ekspresji CNTF. W tej postaci wynalazku . ekspresję pożądanego białka indukuje się przez dodanie do środowiska drobnoustroju substancji zdolnej do powodowania ekspresji sekwencji DNA po osiągnięciu pożądanej gęstości.

(ii) Promotory.

Nośniki ekspresji mogą zawierać promotory, które mogą być wykorzystywane przez organizm gospodarza do ekspresji jego własnych białek. Chociaż stosuje się zwykle laktozowy układ promocyjny, wyodrębniono i scharakteryzowano także inne drobnoustrojowe promotory, umożliwiające fachowcowi zastosowanie ich do ekspresji rekombinantowego CNTF.

(iii) Terminator transkrypcji.

Rozważane tu terminatory transkrypcji służą do stabilizacji nośnika. Sekwencje te są zwłaszcza opisane przez M. Rosenberga i D. Courta w Ann. Rev. Genet. 13, 319 - 353 (1979).

(iv) Sekwencja nie ulegająca translacji..

Zauważono, że w korzystnej postaci wynalazku może także być pożądane rekonstruowanie 3' lub 5' końców regionu kodującego, aby pozwolić na włączenie sekwencji 3' lub 5' nie ulegających translacji do transkryptu genu. Do tych sekwencji nie ulegających tsranskrypcji należą te, które stabilizują mRNA, takie jak zidentyfikowane przez V. Schmeissnera, K. McKenny, M. Rosenberga i D. Courta w J. mol. Biol. 176: 39 - 53 (1984).

(v) Miejsca wiązania rybozomów.

Drobnoustrojowa ekspresja obcych białek wymaga pewnych elementów operacyjnych, obejmujących, lecz nie ograniczających tylko do nich, miejsca wiązania rybozomów. Miejsce wiązania rybozomów stanowi sekwencję, która rozpoznaje i wiąże rybozomy w okresie inicjacji syntezy białka, jak podano w publikacjach L.Gold i inni, Ann. Rev. Microbio. 35: 557-580 lub D. M. Marquis i inni, Gene 42: 175-183 (1986). Korzystnym miejscem wiązania rybozomów jest sekwencja GAGGCGCAAAAA (ATG).

(vi) Sekwencja liderowa i sprzęgacz translacyjny.

Dodatkowo korzystne jest, aby przy końcu 5' sekwencji DNA obecny był DNA kodujący odpowiednią ukrytą liderową (sygnałową) sekwencję, jak podał M. E. Watson w Nucleic Acids Res.

164 726

12: 5145 - 5163, o ile białko ma być wydalone z cytoplazmy. DNA sekwencji liderowej musi być w pozycji pozwalającej na wytwarzanie sprzęganego białka, w którym sekwencja liderowa przylega do i jest kowalentnie związana z CNTF, to jest pomiędzy dwoma sekwencjami kodującymi DNA nie może być sygnałów zakończenia transkrypcji lub translacji. Obecność sekwencji liderowej jest pożądana dla co najmniej jednego z następujących powodów: Po pierwsze, obecność sekwencji liderowej może ułatwiać gospodarzowi przerób CNTF. Zwłaszcza, sekwencja liderowa może kierować odszczepieniem początkowego produktu translacji przez peptydazę lidera w celu usunięcia sekwencji -liderowej i pozostawienie polipeptydu z sekwencją aminokwasową o silnej aktywności białkowej. Po drugie, obecność sekwencji liderowej może ułatwić oczyszczanie CNTF przez kierowanie białka poza cytoplazmę komórki.

W niektórych szczepach drobnoustrojów-gospodarzy obencość odpowiedniej sekwencji liderowej pozwala na transportowanie gotowego białka do przestrzeni periplazmowej, jak to ma miejsce w przypadku pewnych E. coli. W przypadku pewnych E.coli Streptomyces -i szczepów Bacillus i Pseudomonas odpowiednia sekwencja liderowa pozwala na transportowanie białka poprzez błonę komórkową i do środowiska pozakomórkowego. W tej sytuacji, białko można oczyszczać z białka pozakomórkowego. Po trzecie, w przypadku niektórych białek wytwarzanych według wynalazku, obecność sekwencji liderowej może być konieczna do zlokalizowania ukształtowanego białka w środowisku, w którym może ono być obecne aby założyć jego aktywną strukturę, mającą odpowiednią aktywność białka.

W korzystnej postaci wynalazku, dodatkowa sekwencja DNA jest umiejscowiona bezpośrednio przed sekwencją DNA kodującą CNTF. Dodatkowa sekwencja DNA jet zdolna do działania jako sprzęgacz translacyjny, to jest stanowi sekwencję DNA kodującą RNA służący do umieszczania rybozomów w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca wiązania rybozomu RNA inhibitora, do którego przylega. W jednej postaci wynalazku sprzęgacz translacyjny można uzyskać stosując sekwencję DNA TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG i sposoby znane fachowcom w odniesieniu do sprzęgaczy translacyjnych.

(vii) Terminator translacji.

Rozważane tu terminatory translacji służą do zastopowania translacji mRNA. Mogą one być albo naturalne, jak opisano przez J. Kohli. Mol. Gen. Genet. 182: 430-439 lub syntetyzowane, jak opisano przez R.F. Pattersona, Gene 24: 15-27 (1983).

(viii). Dający się wyselekcjonować marker.

Dodatkowo korzystne jest, aby nośnik klonujący zawierał dający się wyselekcjonować marker, taki jak marker odporny na lek lub inny marker, powodujący ekspresję dającej się wyselekcjonować cechy przez drobnoustrój gospodarza. W jednej z postaci wynalazku, do nośnika włączono gen oporności na ampicylinę, podczas gdy do innych plazmidów włączono gen oporności na tetracyklinę lub gen oporności na chloramphenicol.

Taki marker oporności na leki lub inny dający się wyselekcjonować marker jest przewidziany częściowo po to, aby ułatwić selekcję transformantów. Ponadto, obecność takiego dającego się wyselekcjonować markera w nośniku klonującym może być wykorzystana do powstrzymania namnażania zanieczyszczających drobnoustrojów w pożywce hodowlanej. W tej postaci wynalazku można uzyskać czystą hodowlę transformowanych drobnoustrojów-gospodarzy, prowadząc hodowlę w warunkach wymagających do przeżycia indukowanego fenotypu.

Omówione tu elementy operacyjne są rutynowo dobierane przez fachowców na podstawie znanej literatury. Ogólne przykłady tych elementów operacyjnych podano w publikcji B. Lewisa, Genes, Wiley and Sons, New York (1983). Różne przykłady elementów operacyjnych można znaleźć w wyżej opisanych nośnikach i na podstawie przeglądu omówionych publikacji można określić podstawową charakterystykę tych nośników.

Do zsyntetyzowania i wyodrębniania wszystkich koniecznych i pożądanych części składowych omówionego wyżej nośnika, konstruuje się nośnik sposobami znanymi fachowcom. Skonstruowanie takich nośników uważa się za leżące w kompetencji fachowców, i jako takie, możliwe do przeprowadzenia bez zbędnych eksperymentów. Np. podobna sekwencja DNA łączy się w odpo10 164 726 wiednie nośniki klonowania, jak podano w publikcji Maniatisa i in., Molecular Cloning, Gold Spring Harbor Laboratories (1984).

Przy konstruowaniu nośników klonowania według wynalazku należy dodatkowo zauważyć, że w każdym nośniku można umieścić liczne kopie sekwencji DNA i odpowiednie dla niej elementy operacyjne. W takiej postaci wynalazku, organizm gospodarza wytwarzałby większą ilość pożądanego CNTF w przeliczeniu na jeden nośnik. Ilość wielokrotnych kopii sekwencji DNA, która może być umieszczona w nośniku, jest ograniczona tylko zdolnością powstałego nośnika, ze względu na rozmiary, do przenoszenia go i replikowania oraz transkrypcji w odpowiedniej komórce gospodarza.

(b) Inne drobnoustroje.

Nośniki nadające się do stosowania w innych niż E.coli drobnoustrojach również nadają się do stosowania w niniejszym wynalazku. Nośniki takie opisano w tabeli 1. Ponadto, pewne korzystne nośniki omówiono niżej.

Tabela I

Gospodarz	Regulowane promotory	Induktor	Terminator transkrypcji	Stabilizacja MRNA	Miejsce startu transkrypcji i peptyd liderowy	Marker	Miejsce wiązania ry bozonów
1	2	3	4	5	6	7	8
E.coli	Lac1, Tac2 Lambda pL Trpa	1PTG podwyższona temperatura Dodanie IAA lub pozbawienie tryptofanu	rmB® rmC7	orapA8 lambda int9 trp10	bla11 ompa12 phoS	ampicylina14 tetracyklina14” chloramphenical”
Bacillus	alfa-amylaza17 subtilizyna18 p-4319 spac-l”	IPTG	E.coli rm rm BT.r®	B.amy obojętna proteaza21 B.amy alfa-amylaza22 B.subt. subtilizyna23	Kan'24 Cam'2’	B.amy obojętna proteaza B.amy alfa-amylaza23	B.amy obojętna proteaza B.amy alfa-amylaza22
PseudomonasTrp27 /E.coli/ Lac /E.coli/ Tac /E.coli/	Dodatek IAA lub pozbawienie tryptofanu IPTG			fosfolipidaza C28 exotoksyna A29	Sulfonamid90 Streptomycyna90	Trp /E.coli/
Drożdże	Gal 1” IO” Adh i” II14 Pho5	Pozbawienie glukozy i galaktozy Pozbawienie glukozy Pozbawienie fosforanu	CycI Una Czynnik alfa Sac 2	Inwertaza” Fosfataza kwasowa' Czynnik alfa	Ura 3” ” Leu2” His 3 Tao 1

nie regulowany

1. Backman, K., Ptashne, M. i Gilbert, W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 4174-4178 (1976).

2. de Boar, H.A., Comstock, L. J., i Vasser, W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983).

3. Shimatake, H. i Rosenberg, M. Naturę 292, 128-132 (1981).

4. Derom, C., Gheysen, D. i Fiers, W. Gene 17,45-54 (1982).

5. Hallerell, R.A. i Emtage, S. Gene 9, 27-47 (1980).

6. Brosius, J., Duli, T. J., Slester, D.D. i Noller, H.F. J. Mol.Biol.148, 107-127 (1981).

7. Normanly, J., Ogden, R.C., Horvath, S.J. i Abelson, J. Naturę 321, 213-219 (1986).

8. Belasco, J.G., Nilsson, G., von Gabain, A. i Cohen, S.N. Celi 46, 245-251 (1986).

9. Schmeissner, U., McKenney, K., Rosenberg M. i Court, D. J. Mol. Biol. 176, 39-53 (1984).

10. Mott, J.E., Galloway, J.L. i Platt, T. EMBO J. 4, 1887-1891 (1985).

11. Koshland, D. i Botstein, D. Celi 20, 749-760 (1980).

12. Movva, N.R., Kakamura, K. i Inouye, M. J. Mol. Biol. 143, 317-328 (1980).

13. Surin, B. P., Jans, D.A., Firomel, A.L., Shaw, D.C., Cox, G.B. i Rosenberg, J. J. Bacteriol. 157, 772-778 (1984).

14. Sutcliffe, J.G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3737-3741 (1978).

15. Peden, K.W.C. Gene 22, 277-280 (1983).

16. Alton, N.K. i Vapnek, D. Naturę 282, 864-869 (1979).

17. ,Yang, M., Galissi, A., i Henner, D. Nuc. Acids Res. 11/2/, 237-248 (1983).

18. Wong, S.-L., Price, C.W., Goldfarb, D.S. i Doi, R.H. Proc. Natl. Acad. Sci USA 81, 1184-1188 (1984).

19. Wang, P.-Z., i Doi, R.H. J. Biol. Chem. 251, 8619-8625 (1984).

20. Lin, C.-K.., Quinn, L.A. Rodriquez, R.L. J. Celi Biochem. Suppl. /9B/, p. 198 (1985).

21. Vasantha, N., Thompson, L.D., Rhodes, C., Banner, C., Nagle, J., i Filpula, D. J. Bact. 159/3/, 811-819 (1984).

22. Palva, I., Sarvas, M., Lethovaara, P., Sibaskov, Μ., I Kaariainen, L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5582-5586 (1982).

23. Wong. S.-L., Pricee, C.W., Goldfarb, D.S., i Dou, R.H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,1184-1188 (1984).

24. Sullivan, M.A. Yasbin, R.E., Young, F.E. Gene 29, 21-46 (1984).

25. Vasantha, N.,.Thompson, L.D., Rhodes, C., Banner, C.Nagle, J., i Filula, D. J. Bact. 159/3/, 811-819 (1984).

26. Yansura, D.G. i Henner, D.J. PNAS 81, 439-443 (1984).

164 726

27. Gray, G.L:, McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seeburg, P.H. i Heyneker, H.L. Biotechnology, 161-165 (1984).

28. Lory, S., i Tai, P.C. Gene 22, 95-101 (1983).

29. Liu, P.V. J. Infect. Dis. 130 /suppl/, 594-599 (1974).

30. Wood, D.G., Hollinger, M.P., i Tindol, M.B. J. Bact. 145, 1448-1451 (1981).

31. St. John, T.P. i Davis, R.W. J. Mol. Biol. 152, 285-315 (1981).

32. Hopper, J.E. i Rowe, L.B. J. Biol. Chem. 253, 7566-7569 (1978).

33. Denis, C.L., Ferguson, J. i Young, E.T., J. Biol. Chem. 258, 1165-1171 (1983).

34. Lutsdorf, L. i Megnet, R., Archa. Biochem. Biophys. 136, 933-944 (1968).

35. Meyhack, B., Sajwa, F., Rudolph, H. i Hinnen, A. EMBO. J. 6, 675-680 (1982).

36. Watson, M.E. Nucleic Acid Research 12, 5145-5164 (1984).

37. Gerband, C. i Cuerineau, M. Curr. Genet. 1, 219-228 (1980).

38. Jabber, M.A., Sivasubramaninan, W. i Nayak, D.P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2019-2023 (1985).

/i/ Nośniki stosowane w Pseudomonas.

Korzystne do stosowania jako nośniki klonujące w gospodarzach z rodzaju Pseudomonas jest szereg nośników plazmidowych- samodzielnie ulegających replikacji w szerokiej gamie bakterii Gram-ujemnych. Niektóre z nich opisano w publikacjach R.G. Tait, T.J. Close, R.C. Lundquits, M. Hagiya, R.L. Rodriquez i C.I. Kando Biotechnology, maj 1983, str. 269-275; N.J. Paneponlos, Genetic Engineering in the Plant Sciences, Prager Publishers, New York, str. 163-185 (1981); i K. Sakagucki, Current Topic in Microbiology and Immunology 96: 31-45 (1982).

Szczególnie korzystnie stosuje się plazmid RSF1010 i jego pochodne, opisane w publikacji M. Bagdasarian, M.M. Bagdasarian, S.Coleman i K.M.Timmis, Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, K.N. Timmis i A. Puhler, wyd. Elsevier/ North Holland Biomedical Press (1979). Zaletą RSF1010 jest to, że jest on stosunkowo małym plazmidem o dużej ilości kopii, który jest łatwo transformować do zarówno E.coli jak i Pseudomonas, i trwale w nich utrzymywać. W tym układzie korzystnie byłoby stosować układ ekspresji Tac, opisany dla Escherichia, gdyż wydaje się, że promotor trp E.coli jest łatwo rozpoznawany przez polimerazę RNA Pseudomonas, jak podano we wspomnianej publikacji Sakagucki i w publikacji G.L.Grey, K.A. Keown, A.J.S. Jones, P.H. Seeburg i H.L.Heyneker, Biotechnology, luty 1984, stsr. 161-165. Atywność transkrypcyjną można dalej zmaksymalizować, żądając wymiany promotora np. z promotorem trp E.coli lub Pseudomonas. Ponadto hen lacl E.coli również możnaby włączyć do plazmidu, aby przeprowadzić regulację.

Translacja może być sprzężona z inicjacją translacji jakiegokolwiek białka Pseudomonas, jak również z miejscem inicjacji któregokolwiek białka wybranego rodzaju ulegającego w dużym stopniu ekspresji, aby powodować wewnątrz-komórkową ekspresję inhibitora.

W tych przypadkach, gdy nie są dostępne szczepy gospodarza gatunku Pseudomonas ulegające ujemnej restrykcji, skuteczność transformacji skonstruowanymi plazmidami wyodrębnionymi z E.coli jest zła. Dlatego pożądane jest przejście nośnika klonującego Pseudomonas przez szczep r-m+ innego rodzaju przed transformowaniem pożądanego gospodarza, jak to podano w publikacji M. Bagdasarian i in., Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, str. 411-422, Timmis and Puhler editors, Elsevier/ North Holland Biomedical Press (1979).

/ii/ Nośniki stosowane w Bacillus.

Korzystny układ ekspresyjny w gospodarzach z rodzaju Bacillus wymaga stosowania jako nośnika klonującego plazmidu pUB11O. Jak i w innym układzie nośnika gospodarza, w Bacillus można powodować ekspresję CNTF według wynalazku zarówno jako białka wewnątrzkomórkowego jak i wydzielanego. Wynalazek obejmuje obydwa układy. Dostępne są różne nośniki wahadłowe ulegające replikacji zarówno w Bacillus jak i w E.coli do konstruowania i badania różnych genów, jak opisano w publikacji D.Dubnan, T.Gryczan, S. Contensts i A. G. Shivakumar, Genetic Engineering, Vol. 2, wyd. Setlow and Hollander, Plenum Press, New York, str. 115-131 (1980). Dla ekspresji i wydzielania CNTF z B.subtilis, sekwencję sygnałową alfa-amylazy korzystnie sprzęga się z regionem kodującym białko. W celu syntezy wewnątrzkomórkowego CNTF przenośną sekwencję DNA sprzęga się translacyjnie z miejscem wiązania rybozomów liderowej sekwencji alfa-amylazy.

Transkrypcja każdego z tak skonstruowanych nośników jest kierowana przez promotor alfa-amylazowy lub jego pochodną. T e pochodne zawierają sekwencję rozpoznającą RNA polimerazy rodzinnego promotora alfa-amylązowego a także włączony region operatora lac. Wykazano, że podobne hybrydowe promotory; skonstruowane z promotora genu penicylinazy i operatora lac działają w gospodarzach Bacillus w sposób dający się regulować (patrz D.G. Yansura i Henner,

164 726

Genetics and Biotechnology of Bacilli, A.T. Genesan i J.A.Hoch, Academic Press, str. 249-263 (1984). Gen lacI E.coli również możnaby włączyć do plazmidu dla zapewnienia regulacji.

/iii/ Nośniki stosowane w Clostridium.

Korzystna konstrukcja do ekspresjii w Clostridium jest w plazmidzie pJU12, opisanym w publikacji C.H. Squires i inni, J. Bacteriol. 159:465-471 (1984), transformowanym do C. perfringes metodą D.L.Heefnera i in., opisaną w J. Bacteriol. 159: 460-464 (1984). Transkrypcja jest kierowana przez promotor genu oporności na tetracyklinę. Translacja jest sprzężona z sekwencjami Shino-Dalgarno tego samego genu tet', w sposób dokładnie analogiczny do postępowania podanego wyżej dla nośników nadających się do stosowania w innych gospodarzach.

/iv/ Nośniki stosowane w drożdżach.

Utrzymanie obcego DNA wprowadzonego do drożdży można przeprowadzić na wiele sposobów, jak opisano w publikacji D. Botstein i R.W. Davis, The Molecular Biology of the Yeast Saccharamyces, Cold Spring Harbor Laboratory, wyd. Strathern, Jones and Broach, stsr. 607-636 (1982). Korzystny układ ekspresyjny do stosowania w organizmach gospodarzy z rodzaju Saccharomyces obejmuje gen CNTF na 2-mikronowym plazmidzie. Zaletami 2-mikronowego plazmidu w postaci koła jest stosunkowo duża liczba kopii i stabilność po wprowadzeniu do szczepów cir. Nośniki te korzystnie zawierają miejsce początku replikacji i co najmniej jeden marker oporny na antybiotyk z pBR322 pozwalający na replikację i selekcję w E.coli. Ponadto, plazmid korzystnie zawiera 2-mikronową sekwencję i gen LEU2 drożdży, służący temu samemu celowi w pozbawionych LEU2 mutantach drożdży.

Jeśli uważać, że rekombinowany CNTF będzie ostatecznie ulegać ekspresji w drożdżach, korzystnie jest aby nośnik klonowania przenieść najpierw do Escherichia coli, gdzie byłby replikowany i stąd byłby otrzymywany i oczyszczany po wzmocnieniu. Następnie nośnik można przenieść do drożdży w celu ostatecznej ekspresji CNTF.

/e/ Komórki ssaków.

cDNA genomowy DNA kodujący CNTF służący jako geny do ekspresji CNTF w komórkach ssaków, powinny mieć sekwencję skutecznie wiążącą rybozomy taką, jak opisana w publikacji Kozaka, Nucleic Aćids Research 15: 8125-8132 (1987). Fragment restrykcyjny DNA noszący sekwencję' DNA kodującą CNTF można umieszczać w nośniku ekspresji mającym promotor transkrypcyjny i wzmacniacz, jak opisano w publikacjach L. Guarenta, Celi 52:’ 303-305 (1988) i J.T. Kadonaga i 'in., Celi, 51: 1079-1090 (1987). Promotor może dawać się regulować, jak w przypadku plazmidu pMSG (Pharmacia Cat.N. 27450601), jeśli konstytucyjna ekspresja inhibitora jest szkodliwa dla wzrostu komórki. Nośnik powinien mieć kompletny sygnał poliadenylacyjny, jak opisano w publikacji F.M. Ausubel i inni, Current Protocola in Molecular Biology, Wiley (1987) tak, aby mRNA transkrybowany z tego nośnika być właściwie przetwarzany. Wreszcie, nośnik powinien zawierać początek replikacji i co najmniej jeden marker oporności antybiotycznej z pBR322, aby pozwolić na replikację i selekcję w E.coli.

W celu wyselekcjonowania stabilnej linii komórkowej produkującej CNTF, nośnik ekspresji może zawierać gen dającego się wyselekcjonować markera, takiego jak marker oporności na lek, lub też zawierać gen komplementarny z pozbawioną go linią komórkową, taki jak gen reduktozy dihydrofoliowej (dhfr) dla transformowania linii komórkowej dhfr, jak opisano w podanej wyżej publikacji Ausubel i wsp. Alternatywnie, wraz z nośnikiem ekspresji można współtransformować osobny plazmid zawierający dający się wyselekcjonować marker.

Komórki gospodarza/transformacja.

Tak otrzymany nośnik przenosi się do odpowiedniej komórki gospodarza. Komórki te mogą być drobnoustrojami lub komórkami ssaków.

/a/ Drobnoustroje.

Uważa się, że można wybrać dowolny drobnoustrój, zdolny do przyjmowania egzogenicznego DNA i ekspresji tych genów oraz towarzyszących im elementów operacyjnych. Po pobraniu organizmu gospodarza, nośnik przenosi się do niego stosując metody ogólnie znane fachowcom. Przykłady takich metod opisano w publikcji R.W.Davis i in., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980). W jednej z postaci wynalazku

164 726 korzystne jest, aby transformacja następowała w niskiej temperaturze, gdyż regulacja temperatury jest przewidziana jako środek regulujący ekspresję genu poprzez użycie elementów operacyjnych opisanych poprzednio. W innej postaci wynalazku, jeśli w nośnik wbudowane zostaną regulatory osmolarne, dla zapewnienia odpowiedniego zwalczania obcych genów wymagana jest regulacja stężenia soli podczas transformacji.

Korzystnie drobnoustrój gospodarza jest albo beztlenowcem albo tlenowcem. Poszczególni gospodarze, korzystni do stosowania w tym sposobie, obejmują drożdże i bakterie. Konkretnymi korzystnymi drożdżami są drożdże z rodzaju Saccharomyces, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae. Konkretnymi korzystnymi bakteriami są bakterie z rodzaju Bacillus, Escherichia i Pseudomonas, zwłaszcza Bacillus subtilis i Escherichia coli. Dodatkowe komórki gospodarzy podano wyżej, w tabeli 1.

Zb/ Komórki ssaków.

Nośnik można wprowadzać do komórek ssaków w hodowli różnymi metodami, takimi jak współstrącanie fosforanu wapniowgo z DNA, elektroporacja lub fuzja protoplastów. Korzystnym sposobem jest współstrącanie z fosforanem wapniowym, opisane we wspomnianej poprzednio publikacji Ausubela i wsp.

Istnieje wiele typów stabilnych komórek dających się transformować i zdolnych do transkrypcji i translacji sekwencji DNA, i wytwarzających białko CNTF. Typy komórek mogą być jednak zmienne jeśli chodzi o glikozylację białek i postUanslacyjną modyfikację reszt aminokwasów, o ile występuje. Tak więc, idealnymi typami komórek są te, które produkują rekombinantowy CNTF identyczny z cząsteczką naturalną.

Komórki gospodarza hoduje się w warunkach odpowiednich do ekspresji CNTF. Są to zwykle warunki konkretne dla danych komórek gospodarzy, łatwe do określenia przez fachowców na podstawie znanej literatury, biorąc pod uwagę warunki wzrostu takich komórek. Np. publikacja Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, wyd. 8, Williams and Wilkins Company, Baltimore, Maryland, zawiera informacje o warunkach do hodowania bakterii. Podobne informacje dotyczące hodowania drożdży i komórek ssaków można uzyskać z publikacji R. Pollack, Mammalian Celi Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (1975).

Na etapach transformacji i hodowli do regulowania ekspresji sekwencji DNA, zależnej od wszelkich elementów operacyjnych wbudowanych w nośnik lub obecnychw nośniku skuteczne są wszelkie konieczne warunki. W jednej z postaci wynalazku, komórki wzrastają do dużej gęstości w obecności odpowiednich warunków regulujących, inhibitujących ekspresję sekwencji DNA. Gdy osiągnięta zostanie optymalna gęstość komórek zmienia się · warunki środowiskowe na właściwe do ekspresji sekwencji DNA. Tak więc przewidziano, że wytwarzanie CNTF będzie następować w okresie czasu następującym po wzroście komórek gospodarza do niemal optymalnej gęstości, i że powstały produkt będzie zbierany w pewien czas po indukowaniu warunków regulacyjnych, koniecznych dla jego ekspresji.

Rekombinowany CNTF oczyszcza się po ekspresji w komórce lub organizmie gospodarza. W korzystnej postaci, rekombinowany CNTF oczyszcza się po ekspresji w drobnoustrojach, zwłaszcza E.coli. W korzystnej postaci wynalazku, CNTF po odzyskaniu z hodowli bakteryjnych występuje w swojej postaci biologicznie aktywnej. W alternatywnym przypadku można pozwolić by CNTF uległ ponownemu złożeniu, tak by przyjmował swą aktywną strukturę w określonym etapie procesu oczyszczania.

Do oczyszczania rekombinowanego białka, korzystnie stosuje się pewne kombinacje następujących operacji: chromatografii anionowymiennej /Mono-O, Mono-S i/lub DEAE-Sepharose/, chromatografii żelowej /Superose/, chromatoogniskowania /Mono-P/ i chromatografii z wzajemnym oddziaływaniem hydrofobowym /octyl- i/lub phenyl-Sepharose/.

Zrozumiałe jest, że stosowanie wynalazku do konkretnego problemu lub środowiska będzie w granicach zdolności przeciętnego fachowca.

Poniższe przykłady ilustrują pewne korzystne postacie wynalazku.

Przykład I. Wytworzenie białka.

Materiały.

Nerwy kulszowe dorosłych królików uzyskano z Pol-Freez Biologicals, Rogers, Arkansas. Siarczan amonowy ultraczysty (nabyto z Schwartz/Mann Biotech., Cleveland, Chio. Fluorek

164 726 fenylometylosulfonylu (PMSF), kwas epsilon-aminokapronowy, bezamidynę, pepstatynę, dwutiothreitol (DTT), poli-L-ornithine (P3655) i bromek 3-/4,5-dwumetylotiazolilo-2-/-2,5-dwufenylotetrazolilowy (MTT) uzyskano z Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. Kolumny Mono P do chromatoogniskującej chromatografii FPLC uzyskano z Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey. Kolumny do chromatografii HPLC C8 z odwróconymi fazami zakupiono w J.T. Baker Chemical Co., Phillipsbury, New Jersey. Kwas trójfluorooctowy uzyskano z Pierce Chemicals, Rockford, Illinois. Endoproteazy Asp-N i Lys-C uzyskano z Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana. Cielęcą surowicę płodową nabyto z Hyclone Laboratories, Logan, Utah. Pożywki hodowlane i roztwory soli uzyskano z Irvine Scientific, Santa Ana, California. Szalki do hodowli uzyskano z Costar, Cambridge, Massachussets. Użytkowe wolne od patogenu, zawierające płodny embrion drobiowy jaja uzyskano ze Spafas, Roanoke, Illinois.

B. Próby z SN-CNTF.

Przygotowano hodowle rzęskowych zwojów nerwowych pierwotnego embrionu drobiowego, jak opisano w publikacji Collinsa, 1978, Develop. Biol. 65:50; i Manthorpe i in., 1986, Develop. Brain. Res. 25:191. W skrócie, usunięto rzęskowe zwoje nerwowe z zapłodnionych, wolnych od patogenu jaj kurzych, inkubowanych w ciągu 9-10 dni w wilgotnej atmosferze w temperaturze 38°C. Zwoje nerwowe rozszczepiono chemicznie, poddając najpierw w ciągu 10 minut w temperaturze 37°C działaniu roztworu Hanks'Balanced Salt Solution bez kationów dwuwartościowych, zawierającego 10 mmoli buforu HEPES, pH 7,2, a następnie w ciągu 12 minut w temperaturze 37°C działaniu roztworu 0,125% baktotrypsyny 1:250 (Difco, Betroit, Michigan) w roztworze Hanks'Balanced Salt Solution modyfikowanym jak opisano wyżej. Trypsynizację zastopowano przez dodanie cielęcej surowicy płodowej do końcowego stężenia 10%.

Po tej obróbce zwoje nerwowe przeniesiono do roztworu, składającego się z pożywki Dulbiccos high glukose Modified Eagle Medium bez wodorowęglanu, zawierającego 10% cielącej surowicy płodowej i 10 mmoli HEPES, pH 7,2, i rozszczepiano mechanicznie przez rozcieranie w wyniku 10-krotnego przepuszczenia przez szklaną pipetę Pasteura z wypolerowanym ogniowo otworem, zawężonym do takiej średnicy, że napełnienie pipety zajmowało 2 minuty.

Rozszczepione zwoje nerwowe umieszczano na płytkach w pożywce hodowlanej (Dulbacco's Modified Eagle Medium uzupełnionej 10% cielęcą surowicą płodową, 4 mM glutaminą, 60 mg/1 penicyliny G, 25 mM HEPES, pH 7,2) w naczynkach do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm/40 rozszczepionych zwojów nerwowych na naczynko) na okres trzech godzin. Tego wstępnego rozlewania na płytki dokonano w celu oddzielenia komórek nerwowych, które przywierają do naczynek, od komórek nerwowych, które nie przywierają. Po trzech godzinach zebrano nieprzywierające komórki nerwowe przez odwirowanie, ponownie zawieszono je w pożywce hodowlanej i rozlano na płytki w ilości 50 pl na otwór na połowie obszaru 96 otworów na płytkach do hodowli tkankowej z mikromiareczkowaniem, przy gęstości 1500 komórek nerwowych na otwór. Otwory do mikromiareczkowania wystawiono poprzednio w ciągu nocy w temperaturze 4°C na działanie roztworu 1 mg/ml poli-L-ornityny w 10 molowym roztworze boranu sodu, pH 8,4, spłukano destylowaną wodą i wysuszono na powietrzu.

Do każdego otworu dodano 10 pi seryjnie rozcieńczonej próbki badanej pod kątem aktywności neurotroficznej, i płytki inkubowano w ciągu 20 godzin w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 7,5% CO2. Po 18 godzinach dodano 15 pl 1,5 mg/ml roztworu tetrazolilowego barwnika MTT w pożywce Dulbecco's high glucose Modified Eagle Medium bez wodorowęglanu, zawierającej 10 mM HEPES, pH 7,2 na otwór, i hodowle umieszczono ponownie na 4 godziny w inkubatorze w temperaturze 37°C. Następnie dodano 75 pl roztworu 6,7 ml 12m HC1 na litr izopropanolu i zawartość każdego otworu rozcierano 30 razy aby rozerwać komórki i osadzić barwnik. Dla każdego otworu określano absorbancję przy 570 nm w stosunku do 690 nm odniesienia, stosując automatyczne urządzenie odczytujące z płytek (Dynatech, Chantilly, Virginia). Absorbancję otworów, które nie otrzymały żadnego środka neurotroficznego (kontrola ujemna) odejmowano od absorbancji otworów zawierających próbkę. Uzyskana absorbancja jest proporcjonalna do liczby żywych komórek w każdym otworze, definiowanych jako komórki nerwowe zdolne do redukcji barwnika. Ilość jednostek troficznych aktywności neurotroficznej definiowano jako odwrotność rozcieńczenia, dającego 50% maksymalnego przeżycia komórek nerwowych.

164 726

Stężenie aktywności troficznej w jednostkach troficznych na ml uzyskano, dzieląc całkowitą ilość jednostek troficznych przez objętość próbki (60 μΐ). Aktywność właściwą określono, dzieląc liczbę jednostek troficznych przez ilość białka, obecną w próbce.

C. Oczyszczanie SN-CNTF.

Po zakończeniu każdej z poniższych operacji preparat niezwłocznie przetwarzano dalej, przechowywano go w temperaturze -70°C w ciągu 1 tygodnia przed użyciem.

Operacja 1. Sporządzanie surowego ekstraktu.

100 g (ciężar substancji wilgotnej) nerwu kulszowego królika (około 300. nerwów) rozmrożono i sproszkowano, używając obrotowego homogenizatora Polytron (Kinematica, Szwajcaria), w ciągu 1 minuty w 10 objętościach (wagowo/objętościowych) wody zawierającej 10 mM EDTA, 1 mM kwasu epsilon-aminokapronowego, 1 mMbenzamidynęi0,1 mMPMSF, i odwirowano przy 140000 g w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C. Supernatant przesączono przez wełnę szklaną, aby usunąć pływający tłuszcz.

Operacja 2. Traktowanie kwasem i frakcjonowanie siarczanem amonowym.

Opisane niżej odwirowanie prowadzono w ciągu 20 minut przy 17000g, a o ile nie podano inaczej, wszystkie czynności prowadzono w temperaturze 4°C. Surowy ekstrakt odwirowano. Supernatant zakwaszono do pH 3,6 5N HCl i usunięto powstały osad przez odwirowanie. Supernatant miareczkowano do pH 6,3 1N NaOH i ponownie odwirowano powstały osad. Do supernatantu dodano nasycony roztwór siarczanu amonowego do osiągnięcia 30% nasycenia i odwirowano osad. Dodawano dalej siarczan amonowy do supernatantu aby osiągnąć 60% nasycenia, co powodowało wytrącenie frakcji białkowej zawierającej największą aktywność SN CNTF. Osad rozpuszczono w 30 mmolarnym buforze fosforanu sodowego, pH 6,7, zawierającym 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF i 0,1 μmolarną pepstatynę, uzyskując stężenie białka 8-13 mg/ml.

Operacja 3. Chromatoogniskowanie.

Preparat otrzymany jak opisano wyżej dializowano w ciągu nocy 500-krotną objętością 10 mmolarnego roztworu fosforanu sodowego, pH 6,7 z jedną zmianą buforu, i odwirowano w ciągu 30 minut przy 140000 g. Supernatant przepuszczono przez filtr nylonowy o średnicy porów 0,22μιη i załadowano za pomocą 3 wstrzyknięć po 2 ml każde na kolumnę Mono P do chromatoogniskowania za pomocą FPLC (objętość złoża 4 ml), zrównoważonej w 25 mmolarnym buforze bis-Tris-HCl, pH 5,8. Kolumnę przemywano tym samym buforem dopóki absorbancja odcieku przy 280 nm nie powróciła do wartości podstawowej. Próbkę poddawano następnie chromatografii z polibuforem o pH 4,0 (1-10 rozcieńczenie PB 74 z Pharmacia).

Zbierano frakcje z kolumny i analizowano ich pH i aktywność CNTF. Na fig. 1 przedstawiono wyniki chromatografii na Mono P. Profil eluowanych białek wykreślono jako gęstość optyczną (O.D.) przy 280 nm. Nałożono wykresy pH i aktywność SN CNTF zmierzone w każdej frakcji. Frakcje wskazane kreską, o szczytowej aktywności SN-CNTF (około pH 5) zebrano i traktowano stałym siarczanem amonowym do osiągnięcia 95% nasycenia i utworzono tabletkę przez odwirowanie, ponownie przeprowadzono ją- w zawiesinę w nasyconym roztworze siarczanu . amonowego i ponownie odwirowano, aby usunąć polibufor. Osad rozpuszczono w wystarczającej ilości 10 mmolarnego roztworu buforowego z fosforanu sodowego o pH 6,7, aby uzyskać ostateczne stężenie białka 3-5 mg/ml (preparat ten określono jako frakcję „zogniskowaną**). Zwykle 1 litr wyjściowgo surowego ekstraktu przerabiano w 8 oddzielnych przebiegach na kolumnie Mono P.

Operacja 4. Preparatywna elektroforeza żelu dodecylosiarczanu sodowego (SDS).

Frakcje zogniskowane z licznych przebiegów na kolumnie Mono P połączono i dializowano 100-krotnie większą objętością 10 mmolarnego buforu fosforanowego, pH 6,7, w ciągu 8 godzin z jedną zmianą buforu, a następnie nanoszono na płytkę z 15% redukującego żelu poliaktyloamidowego SDS metodą Laemmli, 1970. Kada płytka żelu rozdzielającego miała grubość 0,3 cm, wysokość 14 cm i szerokość 11,5 cm. Na każdy żel załadowano 5,5 mg białka. Elektroforezę prowadzono w temperaturze 15°C przy 40mA/żel do czasu, aż zabarwiony wcześniej standard o ciężarze cząsteczkowym 20 kd osiągnął dno żelu rozdzielającego.

Aby ujawnić zakrzywienie poszczególnych pasm białka poprzez szerokość płytki żelu, na żel nałożono arkusz nitrocelulozy (0,45 μιη rozmiar porów, w postaci rolki, uzyskana z Millipora Corporation, Nedford, Massachussets), zwilżonej wcześniej wodą, 2 arkusze zwilżonej wcześniej- i 2

164 726 akrusze suchej bibuły chromatograficznej (3 MM Chr uzyskanej z Whatman, Hillsboro, Oregon), płytkę szklaną, i butelkę szklaną o pojemności 500 ml dla obciążenia. Po 30-45 minutach nierozpuszczalnym w wodzie znacznikiem zaznaczono zarys żelu na bibule nitrocelulozowej. Bibułę przemyto trzykrotnie 10 mmolarnym roztworem buforowym Tris-HCl o pH 8,0, zawierającym 0,15 molarny NaCl i 0,3% detergentu NP-40, po czym barwiono w ciągu 15-30 minut rozcieńczonym w tym buforze w stosunku 1:1000 tuszem Kohinuor Ropidograph Ink (dostępnym w sklepach papierniczych).

Oryginalny żel umieszczono na płytce szklanej i ustawiono w linii z jego zarysem na zabarwionej bibule nitrocelulozowej zmieszczonej pod szkłem. Obszar żelu odpowiadający ciężarowi cząsteczkowemu 22-27 kd, zlokalizowany w odniesieniu do wcześniej zabarwionych standardów ciężaru cząsteczkowego (BRL, Bethesda, MD) zaznaczono cienkimi liniami na obu końcach żelu. Obszar ten pocięto w poprzek szerokości żelu na siedem równoległych 2,5 mm pasków, posługując się zakrzywieniem pasm ujawnionym przez zabarwioną bibułę nitrocelulozową. Każdy pasek żelu cięto na mniejsze kawałki (2,5 X 2 mm) i elektroforetycznie eluowano białka w ciągu 6 godzin rozcieńczonym 1:1 buforem rozwijającym Laemmli, stosując elektroforetyczny zatężacz (ISCO, Lincoln, Nebraska). Eluowane białka zbierano we frakcjach o objętości 0,2 ml. Na fig. 2 przedstawiono wykres rozkładu aktywności neurotroficznej w eluacie dla każdego z 7 pasków (oznaczonych a-g w kolejności zmniejszającego się ciężaru cząsteczkowego). Frakcje o najwyższej aktywności (pasek d) oczyszczano dalej metodą chromatografii HPLC z odwróconymi fazami.

Operacja 5. Wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami.

Do eluatu żelu dodano dwutiotritol (DTT) i 10% kwas trójfluorooctowy, aby uzyskać ich końcowe stężenie, odpowiednio, 2% i 0,3%. Próbkę przesączono przez filtr nylonowy 0,22 μτη, . załadowano na kolumnę C8 do chromatografii HPLC z odwróconymi fazami i eluowano gradientem H2O/0,1% TFA: acetonitryl/0,1% TFA. Frakcje zbierano do silikonowanych probówek, zawierających 5 μΐ 0,4% detergentu Tween 20. Próbki pobierane z takich frakcji badano pod kątem aktywności neurotroficznej. Na fig. 3 przedstawiono wyniki chromatografii z odwróconymi fazami. Na wskazywane przez absorbancję przy 215 nm stężenie białka naniesiono rozkład aktywności neurotroficznej. Frakcje o szczytowej aktywności SN-CNTF (frakcje 37-40, fig. 3) zebrano do sekwencjonowania, opisanego w przykładzie II. W oddzielnym preparacie analizowano także na zabarwionym srebrem redukującym' SDS-PAGE (fig. 4) frakcje sąsiadujące i zawierające .szczytową aktywność CNTF, równoważne frakcjom 36-44 na fig. 3.

Przeprowadzono dwie dalsze operacje chromatografii. Potwierdziły one czystość CNTF otrzymanego jak opisano wyżej.

W dwóch dodatkowych operacjach chromatograficznych stosowano zasadę chromatografii z wzajemnym oddziaływaniem hydrofobowym (HIC). Pierwszym etapem HIC było konwencjonalne postępowanie w chromatografii kolumnowej, wprowadzane po operacji 2, to jest nastawienie pH i frakcjonowanie siarczanem amonowym. Rozpuszczony materiał po strąceniu buforem amonowym rozcieńczono dalej 10 mmolarnym buforem z fosforanu sodowego o pH 6,7 (Bufor B) aż do osiągnięcia mocy jonowej (mierzonej miernikiem przewodnictwa) równiej mocy jonowej Buforu B zawierającego 0,3 mola siarczanu amonowego i 5% izopropanolu (Bufor A). Następnie do rozcieńczonej próbki dodano izopropanol do końcowego stężenia 5% i . mieszaninę naniesiono na kolumnę phenyl-Sepharose CL4B (Pharmacia, Inc. Piscatawan, New Jorsey) zrównoważoną Buforem A. Na ml objętości złoża kolumny nanoszono nie więcej niż 3 mg próbki białka. Zwykle z 1 litra surowego ekstraktu nerwu kulszowego otrzymywano 50 ml ponownie przeprowadzonej w zawiesinę tabletki z siarczanem amonowym, którą następnie rozcieńczono do objętości 70-100 ml jak wyżej i nanoszono na kolumnę phenyl-Sepharose o objętości 110 ml. 'Kolumnę eluowano stopniowo, poczynając od 3 objętości złoża Buforu A, następnie 3 objętościami złoża Buforu B, po czym 2 objętościami złoża bufoni B zawierającego 50% glikolu etylenowego (Bufor C), a następnie przemyto wodą w ilości 5 objętości złoża. Zbierano frakcje eluowanego materiału po 18 ml.

Na figurze 7 przedstawiono wyniki jednego takiego przebiegu chromatograficznego. Śledzono ciągle profil eluowanych białek za pomocą O.D. 280 (liczba ciągła). Nałożona na O.D. kopia stanowi profil eluowanej bioaktywności SN-CNTF w każdej frakcji (linia łącząca znaki X), mierzonej w próbie przeżycia rzęskowych zwojów nerwowych, opisanej w oryginalnym zgłoszeniu

164 726 patentowym. Aktywność SN-CNTF pojawiała się z kolumny podczas eluowania buforem C. Zbierano razem frakcje z kolumny, wykazujące większość bioaktywności (wskazano kreską na fig. 7) i zatężano przez dializę ciśnieniową przy użyciu membrany Amicon YM-10 (Amicon Division, W.R. Gruce and Co., Denvers, MA) do około 1/10 początkowej objętości , co zwykle dawało końcowe stężenie białka 2,5-3,0 mg/ml. Koncentrat dializowano łącznie w ciągu 6 godzin trzykrotnie zmieniając 55-krotną objętość Buforu B. Dializowany materiał przechodził przez filtr Aerodisc o średnicy porów 0,2-um (Gelman Sciences, Inc., Ann Arbor, MI) i załadowywano wieloma wstrzyknięciami, po 2 ml każde, na kolumnę chromatccgniskującą Mono-P.

Bez tej operacji na kolumnie HIC, 1 litr surowego ekstraktu nerwu kulszowego wymagał 8 oddzielnych przebiegów na kolumnie chromatoogniskującej Mono-P, ze względu na ograniczoną zdolność obciążenia kolumny białkiem. W przypadku dodania operacji prowadzonej na kolumnie HIC, 1 litr surowego ekstraktu można przerabiać w jednym przebiegu chromatoogniskującym.

Drugą operację HIC wprowadzono po początkowej operacji 3: chrcmatcogriiskowania na kolumnie Mono-P. Do każdego 1 ml chromatoogniskowanego materiału (przy 3-5 mg/ml białka) dodano 2 ml 50 mmolarnego buforu fosforanowego o pH 6,2, zawierającego 1,5 molarny siarczan amonowy (Bufor D). Następnie mieszaninę przepuszczano przez filtr Aerodiac o średnicy porów 0,2/um i załadowano, poprzez liczne wstrzyknięcia, każde o objętości 2 ml, na kolumnę do FPLC Alkyl-Superose HR 10/10 (Pharmacia), zrównoważonej Buforem D. Kolumnę przemywano Buforem D do czasu, aż absorbancja odcieku przy O.D. 280 powróciła do poziomu wyjściowgo. Następnie kolumnę eluowano 60 ml liniowego gradientu biegnącego od Buforu D do Buforu E (50 mmolowy bufor fosforanowy o pH 6,7) i zbierano frakcje o objętości 1 ml.

Figura 8 ilustruje wyniki uzyskane w przebiegu na takiej kolumnie do FPLC-HIC. Linia ciągła przedstawia profil eluowanego białka, mierzony przez O.D. 280. Nałożono na to wykres bioaktywności SN-CNTF w każdej frakcji gradientu. Frakcje zawierające bioaktywność (wskazane kreską na fig. 8) połączono i zatężono na zatężaczu Gentricon-10 (Amicon) do objętości 0,5 ml. Próbkę rozcieńczono, dodając do górnego zbiorniczka 2 ml Buforu B i ponownie zatężono przez odwirowanie do końcowej objętości 0,5 ml. Rozcieńczanie i ponowne zatężanie powtarzano jeszcze dwukrotnie, a ostatecznie zatężoną próbkę poddano rozdzielaniu na preparatywnej płytce 15% żelu polichryloamidowegc redukującej SDS, jak opisano poprzednio z tą różnicą, że wcześniejsza dializa nie była konieczna.

Na figurze 9 przedstawiono porównanie końcowej operacji oczyszczania metodą HPLC z odwróconymi fazami w początkowym postępowaniu oczyszczającym (górna tabela) i w procedurze oczyszczającej po dodaniu dwóch operacji HIC (niższa tabela). W każdej tabeli przedstawiono profil eluowanych białek (linia ciągła oznacza O.D. 280 z nałożoną bioaktywnością- - linia -łącząca znaki X). Z rysunku tego wynika, że w próbce oczyszczonej nowym sposobem obejmującym HPLC z odwróconymi fazami występuje znacznie mniej białek zanieczyszczających. Ważne jest zauważyć, że aktywność właściwa CNTF otrzymanego w wyniku tego nowego sposobu postępowania była w granicach błędu doświadczalnego, 'identyczna z aktywnością właściwą CNTF otrzymanej zgodnie z opisanym wcześniej sposobem postępowania (tabela 1) wskazuje, że CNTF otrzymany według początkowo opisanego sposobu był oczyszczony do stanu hcmcgeniczności. Zaletą tego nowego postępowania oczyszczającego jest to, że 8 litrów wyjściowego materiału można przerobić również dogodnie jak 1 litr w początkowo opisanym sposobie oczyszczania.

Przykład II. Sekwencjcncwanie oczyszczonego czynnika neurotroficznego.

Frakcje o szczytowej aktywności SN-CNTF (frakcje nr 37-40 na fig. 3) zebrano razem i zatężono do objętości 50 ul na wyparce próżniowej odwirowującej. Zatężona próbka zawierała 0,14% Tween 20. Rozcieńczono ją 1% wodorowęglanem amonowym do końcowej objętości 350 ul i traktowano w ciągu nocy w temperaturze 37°C endoproteazą Asp-N endoproteazą Lys-C. Mieszaninę zatężono do objętości 50-100ul na wyparce próżniowej odwirowującej i załadowano poprzez 1 ml uszko do próbek na wąski otwór kolumny C8 do chromatografii HPLC z odwróconymi fazami Angapore RF = 300 (Brown Lee Labs.), 2,1 X 220 mm, eluownej gradientem HzO/0,1% TFA: acetonitryl/0,1% TFA. Frakcje zawierające peptyd zbierano ręcznie do rurek Eppendorfa, bazując na absorbcji przy 215 nm. Na fig. 5 przedstawiono profil eluowanych peptydów po trawieniu endoproteazą LYS-C, z następną redukcją karboksymetylowaniem. Sekwencję - amino18 164 726 kwasową przeważających peptydów określano przy użyciu sekwencera Applied Biosystems gas phase protein seąuencer.

Dodatkową sekwencją aminokwasów uzyskano, stosując enzymy rozszczepiające chymotrypsynę i endoproteazę Glu-C (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, In). Ta dodatkowa sekwencja białka umożliwiła połączenie razem niektórych opisanych wyżej sekwencji aminokwasów w większych peptydach, dzięki nakładaniu się ciągu aminokwasów. Te nowe sekwencje aminokwasów i te połączone razem z wcześniejszymi sekwencjami podano niżej.

M-S-A-L-T-P-H-R-R-E

L-A-R-K-I-R-S-D-L-T-A-L-T-E-S-Y-V-K-H-Q-GL-N-K-N-I-N-L-S-D-S-V-D-G-V-P-M-A

D-Q-Q-V-H-F-T-P-A-E-G

D-G-L-F-E-K-K-L-W-G-L-K-V-L-Q-E-L-S-H-W-T-V

D-L-R-V-l

Przykład III. Wytwarzanie przeciwciał czynnika neurotroficznego.

Przeciwciała, reagujące z oczyszczonym króliczym SN-CNTF są przydatne do skriningu zapisów ekspresji w celu uzyskania genu kodującego króliczy SN-CNTF. Ponadto, przeciwciała które neutralizują jego aktywność biologiczną stosuje się u nieuszkodzonych zwierząt w celu określenia biologicznej roli tego czynnika neurotroficznego.

W celu wytworzenia takich przeciwciał, zsyntetyzowano syntetyczne peptydy odpowiadające regionom sekwencji SN-CNTF, stosując syntetyzator Applied Biosystems automated protein synthesizer. Takie syntetyczne peptydy są kowalentnie związane z białkiem nośnikowym tworzącym otwór pasujący do hemocyjaniny. Sprzężony peptyd wstrzyknięto świnkom! morskim w pełnym adjuwancie Freunda, ze wspomagającymi wstrzyknięciami stosowanymi w trzecim i szóstym tygodniu w niepełnym adjuwancie. Od każdej świnki morskiej pobrano próbki surowicy i stosowano w bibule Western wobec oczyszczonego SN-CNTF w celu określenia, czy przeciwciało w surowicy reaguje z oczyszczonym białkiem. Surowice pozytywne w próbie Western badano dalej pod kątem zgodności do neutralizowania aktywności neurotroficznej w próbkach biologicznych używnych do oczyszczania. Surowice pozytywne zarówno w próbie Western jak i w próbie neutralizacji będą dalej oczyszczane jak następuje:

/1/ surowice absorbuje się na nośniku białkowym z hemocyjaniną „Keyhole Limpet Hemocyanin w celu usunięcia przeciwciał skierowanych przeciw temu białku, po czym surowice te poddaje się testom opisanym powyżej.

/2/ przeciwciała IgG wydziela się z surowicy w znany sposób i poddaje opisanym powyżej testom. Po wykonaniu tych dwóch etapów uzyskuje się przeciwciała poliklonalne o czystości wystarczającej do ich użycia do skriningu banków ekspresyjnych potrzebnych do klonowania informacyjnego RNA i genu dla SN-CNTF.

U królików wytwarza się przeciwciała przeciw syntetycznemu peptydowi „A“ odpowiadającemu części sekwencji aminokwasowej SN-CNTF królika podanej w przykładzie 2 (E-S-Y-V-K-H-Q-G-L-N-K-N). Procedura podana jest poniżej. Oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa przeciwciała przeciw syntetycznemu peptydowi A ( przeciwciała przeciw peptydowi A) przygotowuje się przepuszczając antysurowicę immunizowanych królików przez kolumnę do chromatografii powinowactwa z kowalentnie związanym syntetycznym peptydem A i następnie eluując związane przeciwciała. Miano niefrakcjonowanej antysurowicy immunizowanych zwierząt oznaczone techniką ELISA z zastosowaniem wgłębień powleczonych peptydem A wynosi około 10⁵; surowicę tę stosuje się w rozcieńczeniu 1:50 do prób hybrydyzacji Western'a na bibule. Przeciwciała przeciw peptydowi A oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa, przygotowane w sposób opisany poniżej, stosuje się do analizy Westenia w końcowym stężeniu 80^g/ml.

Zarówno antysurowica przeciw peptydowi A jak i przeciwciała oczyszczone metodą powinowactwa reagują z oczyszczonym SN-CNTF królika, co wykazuje analiza Western'a na bibule, z użyciem CNTF oczyszczonego metodą redukującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosulfonianem sodowym (SDS-PAGE). Surowica pre-immunizowanego królika nie daje reakcji z SN-CNTF w tych samych warunkach. W dwóch oddzielnych pasmach prowadzi się redukującą elektroforezę (SLS-PAGE) próbek z frakcji pikowej CNTF z końcowego etapu oczy164 726 szczania metodą HPLC z fazami odwróconymi (frakcja nr 46, fig. 9, panel B). Z każdym pasmem oczyszczonego CNTF sąsiaduje pasmo zawierające białka markerowe wyznaczające ciężary cząsteczkowe. Żel przecina się na dwie panele, z których każda zawiera jedno pasmo oczyszczonego CNTF i sąsiadujące z nim pasmo białek markerowych. Jeden z kawałków barwi się srebrem dla zlokalizowania białek (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) a drugi poddaje się analizie metodą Western'a na bibule (Towbin i wsp., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,4350) dla wykrycia białek reagujących z przeciwciałami przeciw peptydowi A oczyszczonymi metodą powinowactwa.

Panel pasm na fig. 10 z lewej strony przedstawia frakcję pikową CNTF oczyszczonego metodą HPLC z fazami odwróconymi. Frakcja ta zawiera dwa bardzo blisko siebie położone pasma białka o wi^H^o^c^i około 25^-(^(^0 daltonów. Białka te w elektroforezie redukującej (SDS-PAGE) oddzielone są od siebie o około 500 daltonów. Ponieważ żele barwione srebrem są przeciążone oczyszczonym CNTF, często nie jest.możliwe rozdzielenie tych dwu pasm, jak na fig. 4.

Panel pasm z prawej strony na fig. 10 przedstawia, że obydwa te pasma są rozpoznawane przez oczyszczone metodą powinowactwa przeciwciała przeciw peptydowi A i podlegają barwieniu. Rozpoznawanie to jest specyficzne, gdyż niespokrewnione białka markerowe w lewej krawędzi pary prawostronnej nie są rozpoznawane przez przeciwciała przeciw peptydowi A, pomimo, iż są obecne w dużym stężeniu, jak to wykazują pasma barwione srebrem z lewej strony na fig. 10. Preimmunizowana surowica tego samego królika również nie reaguje (nie rozpoznaje) z tymi dwoma pasmami oczyszczonego CNTF. Wyniki te wskazują, że istnieją co najmniej dwie różne formy CNTF różniące się ciężarami cząsteczkowymi o około 500 daltonów według elektroforezy redukującej SDS-PAGE.

W celu przygotowania przeciwciał przeciw peptydowi A koniuguje się syntetyczny peptyd A z hemocyjaniną „Kęyhole Limpet Hemocyanin“ (KLH) dla zwiększenia antygeniczności. W celu koniugacji, ilość 1 mg peptydu A i 1 mg KLH (Calbiochem, La Jolla, CA) w 50% glicerolu rozpuszcza się w 0,5 ml PBS (20 mM bufor fosforanowy o pH = 7,4, zawierający 0,15 M NaCl), następnie dodaje się kroplami 10% aldehyd glutarowy, mieszając do końcowego stężenia 1%, mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej do następnego dnia, po czym rozcieńcza się ją do objętości 5 ml za pomocą PBS. Mieszaninę koniugacyjną emulguje się w stosunku 1:2 z kompletnym adiuwantem Freunda i podskórnie wstrzykuje się do wielu miejsc grzbietowych białym królikom Nowo-Zelandzkim w ilości około 100 pg peptydu A na jednego królika. Po trzech tygodniach każdy królik otrzymuje wzmagającą dawkę 50pg skoniugowanego peptydu A z niekompletnym adiuwantem Freunda. Następnie, w dwutygodniowych odstępach czasu podaje się podobne wzmagające iniekcje, do czasu aż miano antysurowicy osiągnie miano co najmniej 100.000 według próby ELISA (Tainer i wsp., 1984, Naturę, 312,127) z użyciem wzgłębień powleczonych peptydem A. Z krwi zebranej z żyły usznej po 5 tygodniach od początkowej iniekcji i następnych iniekcjach co 2 tygodnie, przygotowuje się surowice. Surowice te przechowuje się w temperaturze -70°C.

W celu przygotowania kolumny do chromatografii powinowactwa, peptyd A wiąże się kowalencyjnie z matrycą kolumny chromatograficznej następująco: Do 8 mg peptydu A rozpuszczonego w 0,4ml PBS zawierającego 4M chlorowodorku guanidyny dodaje się 4,5ml 0,1 M NaHCO3 (pH = 0,8) i 0,5 M NaCl. Ilość 1 g liofilizowanej, aktywowanej CH Sepharozy 4B (Pharmacia) przemywa się i poddaje spęcznieniu w 200 ml 1 mM HCl i natychmiast przenosi się do roztworu peptydu A. Mieszaninę wstrząsa się do następnego dnia w temperaturze 4°C. Żel poddaje się sedymentacji w wirówce klinicznej a supernatant przechowuje się w celu oznaczenia ilości peptydu A, któy został związany z maty/cą . Do pestki żelu dodaje się 15 mli 0,1 M buforu Tris (pH == 8,0) i inkubuje się w temperaturze pokojowej w czasie 2 godzin dla zablokowania nieprzereagowanych, wolnych grup funkcyjnych (wiążących) na matrycy żelu. Następnie żel umieszcza się w kolumnach (objętość złoża = 3 ml) i trzy razy przemywa kolejnymi buforami: (1) 0,1 M buforem octanowym (pH = 4,0) zawierającym 0,5 M NaCl w ilości 10 objętości złoża, (2)0,1 .M buforem Tris (pH = 8,0) zawierającym 0,5 M NaCl. W końcu, kolumnę równoważy się roztworem PBS zawierającym 0,02% azydku sodowego. Następnie, metodą z użyciem fluoreskaminy oznacza się różnicę w stężeniu

164 726 wolnych grup aminowych w oryginalnym roztworze peptydu A i w supernatancie po koniugacji (Chem. i wsp., Arch. Biochem. Biophys., 189,241,1978, Nowicki, Anal. Letters, 12,1019,1979). Analiza wykazuje, że 92-95% peptydu znika z roztworu i wiąże się z matrycą żelu Sepharozy.

Przed oczyszczaniem metodą powinowactwa przeciwciał przeciw peptydowi A, dializuje się 8 ml immunizowanej surowicy królika przez dobę, wobec 2 litrów PBS. Kolumnę: peptyd A -Sepharoza przemywa się kolejno ilościami równymi 10 objętościom złoża następujących roztworów: 0,1 M roztwór chlorowodorku glicyny (pH = 2,5); PBS; 0,1 M roztwór trietyloaminy (pH = 11,5) i PBS. Surowicę po dializie przepuszcza się trzy razy przez kolumnę dla zapewnienia całkowitego związania przeciwciał przeciw peptydowi A. Kolumnę przemywa się ilością równą 20 objętościom złoża PBS a następnie prowadzi się eluowanie następującymi roztworami w ilości po 4 objętości złoża: 0,1 M roztwór chlorowodorku glicyny (pH = 2,5); PBS; 0,1 M roztwór trietyloaminy (pH = 11,5); PBS. Zbiera się frakcje o objętości 1 ml. Wycieki z przemywania roztworem glicyny i tiretyloaminy natychmiast się zobojętnia 1 M roztowrem Tris do pH odpowiednio 9 i 7, i w próbkach oznacza się przeciwciała przeciw peptydowi A techniką ELISA z wgłębieniami pokrytymi peptydem A. Frakcje o najwyższym mianie (na ogół w zakresie 3 objętości złoża początku eluowania glicyną i trietyloaminą) łączy się i poddaje dializie wobec PBS. Po odwirowaniu cząstek stałych, supernatant przeciwciał przeciw peptydowi A oczyszczony metodą powinowctwa przechowuje się w temperaturze -70°C.

Przykład IV. Klonowanie genu dla SN-CNTF.

Ostatecznym celem pracy opisanej w przykładzie jest klonowanie i wywołanie ekspresji genu ludzkiego SN-CNTF dla uzyskania materiału nadającego się do stosowania w ludzkich preparatach farmaceutycznych. Jednak uzyskane sekwencje peptydowe są sekwencjami SN-CNTF królika a sekwencje królika i człowieka nie muszą być identyczne. Należy zatem postępować ostrożnie, najpierw uzyskując klony genu królika na drodze hybrydyzcji z oligonuklotydami syntetycznymi wytworzonymi w oparciu o sekwencję białka i zastosować następnie klony królika jako sondy hybrydyzacyjne do skriningu na gen ludzki.

Uzyskuje się sekwencje zarówno genomowego jak i informacyjnego RN A (mRNA) kodujące SN-CNTF królika i ludzi. Sekwencje mRNA są użyteczne do ekspresji białka a sekwencje genomowe mają znaczenie dla zrozumienia struktury i regulacji genu dla SN-CNTF. W celu uzyskania tych sekwencji poddaje się skriningowi banki genomowe królika i człowieka oraz banki cDNA królika i człowieka uzyskane z mRNA wyizolowanego z nerwów kulszowych. W procesie preparowania genu odpowiadającego sekwencji SN-CNTF królika lub człowieka jest również możliwy skrining na ściśle spokrewnione strukturalnie geny mogące być dodatkowymi reprezentantami rodziny czynników neurotroficznych.

A. Gen dla SN-CNTF.

W celu izolacji sekwencji genomowych królika kodujących SN-CNTF bank genomowy królika (Clontech) posiewa się na szczepie bakteryjnym E.coli nm 538 i prowadzi się skrining około 1.000.000 rekombinowanych klonów. Regiony sekwencji białkowych SN-CNTF królika, które mogą być reprezentowane przez najmniejszą ilość kodonów poddaje się odwrotnej translacji i syntetyzuje się odpowiadające im sondy degenerowanych oligonukleotydów. Oligonukleotydy królika znakuje się kinazą według standardowego przepisu Maniatis'a i wsp. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory). Kinaza DNA jest dostępna u Biochemical Corp. a znakowany gamma ATP uzyskuje się z firmy ICN. Oligonukleotydy znakuje się do aktywności właściwej co najmniej 1.000.000 cpm na pikomol.

Po posianiu banku genomowego, około 1 milion łysinek przenosi się na duplikaty filtrów nitrocelulozowych. Filtry te poddaje się obróbce w sposób podany parzez Mianiatis'a (Maniatis i wsp., 1982) i hybrydyzuje przez dobę ze znakowaną radioaktywnie sondą oligonukleotydową. Roztwór do hybrydyzacji zawiera 6 X SSCP, 2 X roztwór Denhardfa, 0,05% pirofosforan sodowy, 1 mM EDTA,0,l% SDS i lOOpgdrożdżowego tRNA (Sigma) o pH = 8,0. Hybrydyzację prowadzi się w temperaturze o kilka stopni niższej od temperatury topnienia oligonukleotydu. W celu identyfikacji klonów kodujących sekwencję białka SN-CNTF oczyszcza się klony hybrydyzujące z kilkoma sondami dla różnych regionów sekwencji białkowej metodą łysinek i oznacza się sekwencje regionów hybrydyzacji metodą zakończenia łańcucha „didezoksy stosując zestaw „Sequenase“ (US Biochemicals Corp) (Sanger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 1977, 74, 5463).

164 726

B. Sekwencje mRNA dla SN-CNTF.

Z nerwów kulszowych królika i człowieka otrzymuje się całkowity komórkowy RNA. Tkankę homogenizuje się w roztworze tiocyjanianu ąuanidyniowego z /J-merkaptoetanolem i RNA oczyszcza się przez sedymentację w gradiencie chlorku cezu (Glison i wsp., Biochemistry 13, 2633, 1974).Poliadenylowany RNA rozdziela się na oligo/dT/celulozie (Avid i Lider, Proc. Natl. Acad. Sci. 69, 408, 1972). Następnie z sondami oligonuklotydów „antysensownych prowadzi się ilościową analizę hybrydyzacji RNA na bibule dla oznaczenia występowania sekwencji SN-CNTF w każdym preparacie RNA a przez to oznaczenia ilości niezależnych klonów jakie są potrzebne do skriningu dla uzyskania co najmniej 99 procentowego prawdopodobieństwa uzyskania klonów CNTF. Metodą opisaną przez Gubler'a i Hoffman'a (Gene 25, 263, 1983) syntetyzuje się dwuniciowy komplementarny DNA i dokonuje się jego insercji do wektora faga lambda gem 2 (Promega Biotech) metodą Palazzolo i Meyerowitz'a (Gene, 52, 197, 1987).

Klony kodujące SN-CNTF indentyfikuje się przez hybrydyzację łysinek rekombinantowego faga w sposób opisany powyżej. Identyczność klonów weryfikuje się przez oznaczenie sekwencji nukleotydowych i sprawdzenie ich zgodności z całą znaną sekwencją białkową. Prowadzi się ponadto skrining banku cDNA ludzkiego nerwu kulszowego z losowo łączonymi z pirmerem sondami cDNA dla SN-CNTF królika (Feinerg i Vogelstein, Anal. Biochem. 132, 6,1983), co jest bardziej wiarygodną procedurą wykrywania hybrydyzacji krzyżowej między gatunkami niż użycie mniejszych oligonukleotydów stosowanych do skriningu banków cDNA królika.

Dla otrzymania większej ilości fragmentów DNA odpowiadających sekwencji aminokwasowej CNTF królika wykonuje się reakcję syntezy łańcucha z użyciem polimerazy (Polymerase Chain Reaction, PCR), opisaną przez Saiki i wsp., Science 239, 487, 1988). Takie framgnety DNA amplifikuje się na podstawie genomowego DNA człowieka i królika oraz cDNA z nerwu kulszowego i ze zwoju sympatycznego królika. Uzyskane fragmenty DNA poddaje się sub-klonowaniu i sekwencjoriuje znanymi technikami (Maniatis i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, 1982, Cold Spring Harbor, Nowy Jork).

Fragmenty DNA otrzymane metodą PCR stosuje się równieżjako sondy do skriningu banku cDNA nerwu kulszowego królika i banku genomowego DNA ludzkiego. Pozytywne klony cDNA królika i pozytywne klony genomowe ludzkie oczyszcza się i częściowo sekwencjonuje. Sekwencja otwartej fazy odczytu odpowiadająca sekwencji kodującej (równoważnej mRNA) CNTF królika bądź człowieka potwierdza sekwencję fragmentów DNA regionu kodującego uzyskanego metodą PCR. Uzyskane sekwencje kodujące CNTF królika i człowieka są podane odpowiednio na fig. 11 i 12.

Odwrotna translacja SN-CNTF królika (fragmentów sekwencji aminokwasowych) prowadzi się do uzyskania degenerowanych oligonukleotydów 1,13, 7 i 12 oraz ich sekwencji komplementarnych 3, 14, 8 i 17. Poniżej podane są: sekwencja aminokwasowa (na górze) oraz lokalizacja i numeracja odpowiadających jej sensownych i anty-sensownych oligonukleotydów (poniżej):

Y-V-K-H-Q-G-L-N-K-N-I-N-L-D-S-V-D-G-V-P-M-A |XXXXXX XXXXjjXXXXX XXXXXyXXXXX(j,^ ^/^ΧΧΧΧβΧΧΧΧΧΧ ΧΧΧΧ14ΧΧΧΧΧ XXXXX₈XXXXX_(y)

K-L-N-G-L-K-V-L-Q-E-L-S (5')^xxxx 12^XXXXX(3')

XXXXjyXXXXX (3') (50

Wersja sensowna sekwencji nukleotydowej każdego z degenerowanych oligonukleotydów jest przedstawiona poniżej (N oznacza dowolny nukloetyd):

^X1 5'-TA/T/C/GTN AA /A/G/ CA/T/C/ CA/A/G/ GG-3' ^x 13 5'-AA/T/C/ AA/A/G/ AA/T/C/ AT/A/T/C/ AA /T/C/ /C/T/T-3' ^x7 5'-GA/T/C/ GGN GTN CCN ATG GC-3' ^X12A 5'-AA/A/G/TT/A/G/TGG GGN TT/A/G/AA-3' ^X12B 5'-AA/A/G/ TT/A/G/ TGG GGN CTN AA-3' ^X12C 5'-AA/A/G/ CTN TGG GGN TT/A/G/ AA-3' ^X12D 5'-AA/A/G/ CTN TGG GGN CTN AA-3'

164 726

W celu amplifikacji odpowiednich regionów genów CNTF człowieka i królika prowadzi się oddzielne reakcje syntezy łańcucha z użyciem polimerazy (PCR) stosując jako matrycę genomowy DNA człowieka albo królika a jako primery-oligonukleotydy nr 1 i 8 albo nr 1 i 17. Analiza Southerna produktów reakcji (znakowanych radioaktywnym oligonukleotydem nr 13) ujawniła obecność znakowanych pasm o wielkości około 66 par zasad (nr 1i 8) i około 366 par zasad (nr 1i 17).

Takie same, opisane powyżej reakcje PCR prowadzi się stosując cDNA wypreparowany albo z nerwu kulszowego królika albo mRNA ze zwojów sympatycznych.’ RNA wyizolowany z nerwów kulszowych królika albo ze zwojów sympatycznych przepuszcza się przez kolumnę oligo/dT/ dla wyodrębnienia informacyjnego RNA (mRNA) w sposób opisany powyżej. Komplementarny DNA (cDNA) wytwarza się stosując odwrotną transkryptazę i mRNA jako matrycę oraz oligo-dT jako primer. Jeśli prowadzi się reakcje PCR stosując jako matrycę-cDNA, a jako primer-oligonukleotydy 1 i 8 albo 1 i 17, wówczas uzyskuje się fragmenty posiadające taką samą sekwencję jak te, które amplifikuje się z genomowego DNA królika (fig. 11). Wskazuje to na fakt, że pomiędzy oligonukleotydami 1 i 17 genu CNTF nie ma sekwencji niekodujących (intronów) w regionie kodującym białko tego genu.

Dla uzyskania dalszej części sekwencji (odpowiadającej mRNA) CNTF królika prowadzi się dodatkową strategię. Przygotowuje się dwuniciowy cDNA stosując mRNA z nerwu kulszowego królika jako matrycę i oligo/dT//nie I-linker jako primer. Następnie, do końca 5' dwuniciowego cDNA dodaje się sekwencję linkera EcoRI/Xmn/ (5'-AATTCGAACCCCTTCG-3') metodą · ligacji tępych końców (Maniatis i wsp., jak wyżej). Następnie prowadzi się reakcje PCR stosując ten cDNA jako matrycę, oligonukleotydy nr 8 oraz sekwencję linkera-adaptora EcoRI/XmnI jako primery. .Analiza Southerna na bibule produktów reakcji (znakowanych radioaktywnym oligonukleotydem nr 13) ujawnia obecność znakowanego pasma o wielkości około 200 par zasad.

W celu uzyskania klonów cDNA dla CNTF królika sporządza się bank cDNA z poliA+ -mRNA z nerwu kulszowego królika stosując opisany powyżej sposób, z tym, że zamiast faga lambda gem 2 stosuje się wektor lambda gt10 (Stratigene). Skrining około 4 X 10⁶ łysinek z tego banku prowadzi się wykorzystując jako sondę losowo znakowany podklon M13 z fragmentu PCR otrzymanego z zastosowaniem cDNA ze zwoju sympatycznego królika jako matrycy oraz oligonkleotydu nr 8 oraz linkera-adaptora EcoRI/XmnI jako primerów (jak wyżej). Pierwszą pozytywną jedną łysinką byłałysinka oczyszczona po trzecim skriningu. Po trawieniu enzymem EcoRI, DNA z tego klonu daje poza ramionami faga lambda trzy fragmenty o długości około 2,0,1,5 i 0,6 kilozasady. Analiza fragmentu o długości 1,5 kilozasady metodą Southerna wykazuje, że hybrydyzuje on z' innymi specyficznymi dla CNTF oligonukloetydami oraz z opisanymi powyżej fragmentami uzyskanymi techniką PCR. Ustalono, że sekwencja DNA tego frgmentu cDNA o długości 1,5 kilozasady zawiera całą sekwencję kodującą CNTF królika (fig. 11).

W celu uzyskania klonów genomowego DNA dla ludzkiego CNTF prowadzi się skrining około 3 X 10^e łysinek banku ludzkiego genomowego DNA w wektorze lambda EMBL3, stosując sondę wytworzoną przez losowe znakowanie podklonu M13 fragmentu PCR uzyskanego sposobem opisanym powyżej, z zastosowaniem ludzkiego genomowego DNA jako matrycy i oligonukleotydów nr 1 i nr 17 jako pirmerów. Sześć pierwotnych pozytywnych klonów są to łysinki oczyszczane przez następny skrining. Okazuje się, że hybrydyzują one z dodatkowymi oligonukleotydami specyficznymi dla CNTF i z fragmentami CPR. Fragment restrykcyjny BamHI o długości 0,6 'kilozasady z jednego z klonów hybrydyzujący z oligonukleotydem nr 13 podklonowano do M13mp19 trawionego BamHI i sekwencjonowano.

Sekwencje DNA z frgmentów uzyskanych w reakcjach CPR z materiału królika i z klonu cDNA królika łączy się w oparciu o regiony częściowo nakładających się sekwencji, uzyskując sekwencję klonującą (równoważną mRNA) dla SN-CNTF królika przedstawioną na fig. 11. Sekwencje DNA fragmentów uzyskanych w reakcjach PCR z ludzkiego genomowego DNA i z klonów genomowych ludzkich łączy się w oparciu o regiony częściowo nakładających się sekwencji uzyskując sekwencję kodującą dla ludzkiego SN-CNTF przedstawioną na fig. 12. Sekwencje kwasów nukleinowych dla CNTF królika i człowieka są identyczne w około 89 procentach (fig. 12), co wskazuje, że sekwencje królika i człowieka pochodzą z homologicznych genów kodujących

164 726

CNTF. Jak to przedstawia fig. 11, część sekwencji kwasów nukleinowych dla CNTF królika znalazła potwierdzenie przez analizę sekwencji aminokwasowych oczyszczonego SN-CNTF, co jest opisane we wcześniejszych przykładach.

Warunki prowadzenia reakcji syntezy łańcucha za pomocą polimerazy (reakcji PCR) z użyciem matryc i primerów podanych powyżej są następujące: cykl denaturacji - 1 minuta, temperatura 95°C, cykl „przyrzażania“ - 1,5 minuty, temperatura 40°C, cykl wydłużania łańcucha - 4 minuty, temperatura 72°C. Reakcje prowadzi się w 30 cyklach. Produkty reakcji poddaje się elektroforezie w 2 procentowych żelach agarozowych i przenosi się na filtry „Zeta-Bind (BioRad Richmond, CA) do analizy Southerna. W celu identyfikacji zamplifikowanych części sekwencji kodującej CNTF filtry Southerna znakuje się radioaktywnym oligonukleotydem-nr 13, o którym wiadomo na podstawie analizy sekwencji białkowej CNTF, że leży pomiędzy oligonukleotydami stosowanymi do zapoczątkowania reakcji. Znakowane pasma utworzone na filtrach hybrydyzacyjnych Southerna wycina się z pierwotnych żeli i przygotowuje do klonowania techniką reperacji końców fragmentem Klenowa polimerazy DNA (New England Biolabs, Beverly, MA) w obecności wszystkich czterech dezoksytrójfosforanów nukleotydowych (dNTP) z .następnym traktowaniem kinazą polinukleotydową T4 (US Biochemical Corp., Cleveland) oraz ATP. Odpowiednie kawałki DNA subklonuje się do trawionego SmaI wektora M13mp10 (defosforylowanego, -dostępnego w handlu z Amersham Corp., Atlington Heights, IL). Rekombinantowe fagi zawierające żądany fragment identyfikuje się metodą Benton'a i Davis'a (Science 196, 180 1979), stosując skrining z użyciem radioaktywnego cligcnukleotydu nr 13 jako sondy. Następnie prowadzi się wzrost rekombinantowy klonów dla uzyskania ilości jedno-niciowego DNA wystarczających do sekwen^nowania. Sekwencjonowanie prowadzi się metodą zakańczania łańcucha didezoksy (Sanger i wsp., jak wyżej).

Przy użyciu długich, znakowanych losowo sond DNA stosuje się następujące warunki hybrydyzacji: 5 X SSCP, 2 X roztwór Denhardt'a, 2mM EDTA, 0,05% pirofosforan sodowy, 0,1% siarczan dodecylo-sodowy (SDS), 250 ug/ml DNA ze spermy śledzia (konkurencja niespecyficzna) (pH = 8,0). Hybrydyzację prowadzi się w temperaturze 65°C, bibuły lub filtry przemywa się w temperaturze 65°C w 0,1 X SSCP i 0,1% SDS. Warunki hybrydyzacji dla krótszych sond oligonukleotydowych są następujące 6 X SSCP, . 2 X roztwór Denhardt'a, 2 mM EDTA, 0,05% pirofosforan sodowy, 0,1% SDS, 100 ug/ml tRNS z drożdży (konkurencja niespecyficzna), pH = 8,0. Temperaturę hybrydyzacji i warunki przemywania bibuł i filtrów dobiera się indywidualnie, w zależności od zawartości GC w każdym oligonukleotydzie (Maniatis i wsp., jak wyżej).

Przykład V. Ekspresja genów kodujących SN-CNTF w komórkach zwierzęcych.

Ekspresja SN-CNTF w komórkach zwierzęcych polega na wykonaniu następujących etapów:

a. Konstruowanie wektora ekspresyjnego;

b. Wybór linii komórek gospodarza;

c. - Wprowadzenia wektora ekspresyjnego do komórek gospodarza oraz

d. Manipulowanie rekombinantowymi komórkami gospodarza dla zwiększenia. poziomów ekspresji SN-CNTF.

W etapie-(a), wektory ekspresyjne SN-CNTF konstruowane z przeznaczeniem do użycia w komórkach zwierzęcych należą do kilku typów, takich jak silne konstytutywne konstrukty ekspresyjne indukowane konstrukty genowe, oraz wektory przeznaczone do ekspresji w określonych typach komórek. We wszystkich przypadkach, - w wektorach plazmidowych umieszcza się promotory i inne regiony regulacyjne, takie jak geny wzmacniające (indukowane lub nieindukowane) oraz sygnały poliadenylacji w odpowiedniej lokalizacji w stosunku do sekwencji cDNA. Dwoma przykładami takich sekwencji są: (1) konstrukt z użyciem regionu silnego promotora konstytutywnego, sporządzony z sygnałów kontrolnych genu wirusa Simiana 40 (SV40) w takim uszeregowaniu, jakie występuje w plazmidzie pSV2CAT opisanym przez Gorman'a i wsp. (Mol. Cel. Ciol., 2,1044-1051, 1982). Plazmidem tym manipuluje się w taki sposób, aby podstawić cDNA dla SN-CNTF w miejsce sekwencji kodujących acetylotransferazę chloramfenikolu (CAT), stosując standardowe techniki biologii molekularnej. (Maniatis i wsp., jak wyżej); (2) Indukowany konstrukt genowy przygotowuje się z plazmidu PMK zawierającego region promotora genu metalotioneiny mysiej MT-1

164 726 (Brinster i wsp., Celi, 27, 228-231, 1981). Plazmid ten stosuje się jako materiał wyjściowy i manipuluje się nim tak, aby uzyskać indukowany metalem konstrukt genowy.

W etapie (b) można stosować wiele linii komórkowych pochodzenia zwierzęcego do ekspresji SN-CNTF, stosując wektory opisne powyżej, do wytwarzania aktywnego białka. Dwiema potencjalnymi liniami komórkowymi, które zostały dobrze scharakteryzowane pod względem zdolności ekspresji obcego genu są linia komórek mysich Ltk” i linia komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) dhfr, jakkolwiek ekspresja SN-CNTF nie ogranicza się do tych dwu linii. Poza wymienionymi powyżej zwierzęcymi liniami komórkowymi można również stosować linię komórek nerki małpy COS-7, która jest użyteczna do ekspresji przejściowej oraz linię ludzkich embrionalnych komórek nerki 293.

W etapie (c), wektory DNA wprowadza się do tych linii komórkowych dowolną techniką przeniesienia genu. W sposobie według wynalazku stosuje się technikę precypitacji DNA fosforanem wapniowym opisaną przez S.L-Graham^ i A.S. van der Eb'a (Virology, 52,456-467,1973). W sposobie tym wykonuje się ko-precypitację wektora ekspresyjnego dla SN-CNTF z drugim wektorem ekspresyjnym kodującym marker umożliwiający selekcję. W przypadku transfekcji komórek Ltk^_ markerem selekcyjnym jest gen kinazy tymidynowej. Selekcję prowadzi się w sposób opisany przez Wiglefa i wsp. (Cell. 16, L777 - 785,1979), a w przypadku komórek CHO dhfr markerem selekcyjnym jest gen reduktazy dihydrofolanowej (DHFR). Selekcję tego genu opisał Ringold i wsp. (J. Mol. Appl. Genet., 1, 165-175, 1981).

W etapie (d), komórki, w których zachodzi ekspresja konstruktów genowych dla SN-CNTF hoduje się w warunkach zwiększających poziomy wytwarzanego SN-CNTF. Komórki zawierające konstrukty z promotorem genu metalotioneiny hoduje się w obecności metali ciężkich, takich jak kadm, co prowadzi do 5-krotnego zwiększenia utylizacji promotora MT-1 (Mayo i wsp., Cell, 29, 99-108) a w konsekwencji, do porównywalnego wzrostu poziomów białka SN-CNTF. Komórki zawierające wektory ekspresyjne SN-CNTF (skonstruowane z SV40 albo z MT-1) oraz wektor ekspresyjny DHFR namnaża się według protokółu amplifikacji genu opisanego przez Ringold'a i wsp. (J. Mol. Appl. Genet. 1, 165-175, 1981) wobec metotreksatu - kompetytywnego antagonisty DHFR. Prowadzi to do zwiększenia ilości kopii genów DHFR w komórkach i równocześnie do zwiększenia ilości kopii genów SN-CNTF, a to z kolei daje zwiększone wytwarzanie białka SN-CNTF przez te komórki.

Dodatkowy wektor ekspresyjny, pCMVXVPL2 zastosowano do ekspresji sekwencji kodującej CNTF królika, przejściowo, w komórkach COS-7. Ten wektor plazmidowy zawiera bezpośredni wczesny promotor i gen wzmacniający z cytomegalowirusa (CMV), co jest .opisane przez Boshart'a i wsp. (Cell 41, 521-530,1985). Ten plazmid konstruuje się w sposób przedstawiony na fig. 13. Sygnał poliadenylacji pochodzi z sekwencji wirusa Simiana 40 (SV40) (współrzędne mapy: 2589-2452, patrz Reddy i wsp., Science 200, 494-502, 1978). Do tego plazmidu włącza się źródło replikacji z SV40 dla ułatwienia jego użycia.w komórkach COS do prób ekspresji przejściowej.

Przejściową ekspresję SN-CNTF królika w komórkach COS-7 wywołuje się następująco: fragment restrykcyjny EcoRI o długości 1,5 kilozasady z klonu cDNA nerwu kulszowego królika zawierającego cały region kodujący SN-CNTF (przykład IV, subklonuje się do wektora ekspresyjnego pCMVXPL2 ciętego enzymem EcoRI. Selekcjonuje się pojedynczy klon, który po trawieniu Sac I i BamHI daje fragmenty restrykcyjne o wielkości przewidzianej do insercji fragmentu o długości 1,5 kilozasady do wektora, w orientacji prawidłowej dla ekspresji CNTF. Plazmidowy DNA z tego konstruktu preparuje się metodą alkalicznej lizy z następnym wirowaniem w gradiencie gęstości CsCl (Maniatis i wsp., jak wyżej). Ten DNA wprowadza się do komórek COS-7 przez transfekcję, metodą Sompayrac'a i Danna'ego (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 7575, 1981). W próbach kontrolnych dokonuje się transfekcji równoważnych hodowli komórek ĆOS przez DNA wektora plazmidowego bez insertu.

Po 48 godzinach od transfekcji zbiera się pożywkę i peletki komórek. Ekstrakcję peletek komórek prowadzi się przez krótkie działanie ultradźwiękami na lodzie w 20 mM roztworze fosforanu sodowego (pH = 6,7) zawierającym 1 mM EDTA. 0,1 mM PMSF i 0,1 μΜ pepstatyny. W seryjnych rozcieńczeniach zarówno ekstraktu komórkowego jak i płynu nad osadem z każdej hodowli oznacza się aktywność w próbie przeżycia zwoju rzęskowego.

164 726

Ekstrakty komórkowe z hodowi transfekowanych wektorem zawierającym fragment cDNA CNTF oznaczane w testach biologicznych wykazują miano równe około 15.000 jednostek TU/ml a oznaczane metodą hybrydyzacji Westerna na bibule wykazuje około 50 ng/ml CNTF. Ani ekstrakty komórkowe z hodowli transfekowanych samym wektorem ani płyn znad osadu z żadnej hodowli nie wykazuje żadnej wykrywalnej aktywności biologicznej ani białka CNTF w próbie Westerna. Taki wynik jest wyraźnym dowodem, że sklonowany cDNA dla CNTF koduje białko o aktywności biologicznej charakteiystycznej dla autentycznego SN-CNTF.

Przykład VI. Oczyszczanie SN-CNTF z rekombinantowych komórek zwierzęcych.

Ponieważ zakłada się, że SN-CNTF jest syntetyzowany w komórkach jak substancja naturalna, przypuszcza się, że opisane powyżej sposoby oczyszczania naturalnego białka pozwala na podobne oczyszczanie i charakteryzację białka rekombinantowego. Dla specjalistów jest zrozumiałe, że w sposobie i produkcie wytwarzanym według wynalazku można dokonywać szeregu modyfikacji i zmian. Wynalazek obejmuje zatem te modyfikacje i zmiany, o ile tylko wchodzą w zakres załączonych zastrzeżeń i ich równoważników. Ponadto, termin SN-CNTF, o ile nie jest użyty w tekście w odniesieniu do konkretnego gatunku, obejmuje wszytkie gatunki będące jego źródłem.

Przykład VII. Wytwarzanie rekombinowanego ludzkiego CNF.

W jednym rozwiązaniu praktycznym wynalazku przyjmuje się układ do wytwarzania ludzkiego rekombinowanego CNTF w bakterii Escherichia coli. Stosuje się dwa alternatywne sposoby konstruowania DNA do ekspresji w dwu różnych wektorach ekspresyjnych. Te wszystkie wariantowe układy ekspresyjne wytwarzają rozpuszczalne białko CNTF z dużą wydajnością. Aktywność biologiczna tego białka występuje w ekstraktach z komórek bakteryjnych. Sposoby wytwarzania takich układów wytwarzania są opisane poniżej. Pozycje, przy których zachodzą przemiany, podane w nawiasach [np. (233)] oznaczają kolejne numery zasady, przy której zaczyna się przemiana, w dół od A (1) w początkowym kodonie ATG w sekwencji kodującej ludzki CNTF (fig. 12).

1. Preparowanie DNA do CNTF.

Strategia nr 1 konstruowania końca 5' (fig. 14). Klon ludzkiego genomowego DNA dla CNTF w fagu lambda EMBL3 z przykładu IV trawi się enzymami restrykcyjnymi SalI i HindIII i fragment o długości 4,3 kilozasad, zawierający sekwencje kodujące CNTF w górę od miejsca dla HindIII (233) oczyszcza się w żelu. Ten fragment zawiera również pojedynczy intron o długości 1,3 kilozasady (114-115) w sekwencji kodującej. Dla umożliwienia ekspresji w komórkach bakteryjnych intron ten usuwa się na drodze kierowanej miejscem mutagenezy in vitro, stosując syntetyczny oligonukleotyd w sposób opisany przez J.A. CmClary'ego, F. Whitney'a, J. Geisselsodefa (Biotechnigues, 7, 282-289, 1989).

A. Delecja intronu na drodze kierowanej miejscem mutagenezy z zastosowaniem wektora fagemidowego i selekcji genetycznej.

Kierowaną miejscem mutagenezę prowadzi się w celu delecji intronu o wielkości 1,3 kilozasad w trawionym Sal I/Hind III fragmencie DNA o wielkości 4,3 kilozasad, klonowanego do wektora fagemidowego, Bluescript SK ML·^/^/ (Stratagene). Wektor ten został wybrany ponieważ nadaje się on do umieszczenia w nim dużego (około 4,3 kilozasad) insertu Sall/HindIII. Wektory fagemidowe są wektorami plazmidowymi zawierającymi intergenowy region bakteriofaga f1 pozwalający na odzysk w postaci jednoniciowego DNA. Wektory fagemidowe posiadają ponadto szereg zalet w stosunku do jednoniciowych wektorów opartych na bakteriofagu M13. Ponieważ fagemidy mają wielkość stanowiącą mniej niż połowę wielkości wektorów M13, które preferują inserty o wielkości poniżej 2,3 kilozasad, do fagemidów znacznie łatwiej wprowadza się większe inserty i zmniejsza się prawdopodobieństwo samorzutnej delecji. Inną zaletą fagemidów jest to, że inserty można sekwencjonować bezpośrednio z dwuniciowego, wtórnie zwiniętego DNA, co upraszcza ich charakteryzację.

Mutagenezę prowadzi się w zestwie do mutagenezy in vitro „Muta-Gene In Vitro Mutagenesis“ z firmy Bio Rad. Komórkami gospodarza do przygotowania matrycy do mutagenezy jest szczep E.coli CJ236 o genotypie: dut, ung, thi, rei, Al, pCJ105 [(cap^r)]. Szczep CJ236 jest nośnikiem czynnika F' podlegającego selekcji chloramfenikolem, co pozwala na odzysk jednoniciowego DNA fagemida przy użyciu odpowiedniego faga pomocniczego (helperowego) R408, stosowanego w niniejszej pracy. W wyniku mutacji dut (dUTPaza) i ung (N-glikozydaza uracylowa) w CJ236 odzyskany jednoniciowy fagemidowy DNA jest częściowo podstawiony uracylem.

164 726

Matrycowy DNA podstawiony uracylem i stosowany do mutagenezy ulega selektywnemu rozkładowi podczas transformacji do komórek gospodarza zawierających loci ung typu dzikiego, takie jak DH5α w tym przypadku, co umożliwia preferencyjną replikację nowo zsyntetyzowanego zmutowanego DNA.

W celu przeprowadzenia mutagenezy oczyszczony w żelu fragment Sall/HindIII o wielkości 4,3 kilozasad poddaje się ligacji z trawionym SalI/HindIII i oczyszczonym w żelu Bluescriptem SK M13/-/. Zligowany DNA wprowadza się do komórek CJ236 doprowadzonych do stanu kompetencji metodą Hanahan'a (J. Mol. Biol. 166,557,1983). Transformanty selekcjonuje się na płytkach zawierających 50 pg/ml ampicyliny (selekcja na fagemid) i 30 fg/ml chloramfenikolu (selekcja na zachowanie czynnika F'). W transformantach oznacza się obecność prawidłowego insertu metodą analizy enzymami restrykcyjnymi uzyskanych transformantów DNA. Transformant zawierający prawidłowy insert (pSHM-D19) stosuje się do dalszych prób mutagenezy.

Jednoniciową matrycę z pSHM-D19 odzyskuje się stosując fag R408 jako helperowy. Prowadzi się hodowlę komórek CJ236 zawierających pSHM-D19 na pożywce Lutria z dodatkiem ampicyliny (50pg/ml) i chloramfenikolu (30pg/ml) do gęstości optycznej A₆00 = 0,3.· Komórki zakaża się fagiem helperowym R408 wielokrotnością infekcji równą 20, następnie wytrząsa się je w temperaturze 37°C w czasie 8-14 godzin. Jednoniciową matrycę ekstrahuje się z odzyskanych fagemidów. Kierowaną miejscem mutagenezę z delecją intronu prowadzi się stosując 71-zasadowy oligonukleotyd (oligonukleotyd 1 na fig. 16). Oligonukleotyd posiada zasady 1-30 komplementarne do nici kodującej bezpośrednio w dół (3') i zasady 31-71 komplementarne do nici kodującej bezpośrednio w górę (5') intronu, który ma być usunięty z genomowego DNA CNTF. Przed użyciem w reakcjach' mutagenezy oligonukleotyd ten fosforyluje się kinazą polinukleotydową T4. Reakcje mutagenezy w zestawie „Muta-Gene“ firmy BioRad prowadzi się według instrukcji producenta z tym, że DNA z ' reakcji mutagenezy stosuje się do transformowania szczepu E.coli DH5 α. Mutanty delecyjne charakteryzuje się przez mapownie restrykcyjne uzyskanych DNA i przez sekwencjonowanie dwuniciowych DNA z mutantów o odpowiednich mapach restrykcyjnych. Mutantem z prawidłową delecją intronu w fagemidzie Bluescript jest mutant pMCN-2a.

B. Rekonstrukcja końca 5' genu CNTF do ekspresji.

Koniec 5' w sekwencji kodującej CNTF rekonstruuje się w celu wprowadzenia pewnych zmian, które nie zmieniają sekwencji aminokwasowej kodowanej przez tę sekwencję ale prawdopodobnie zwiększają wydajność ekspresji w bakteriach. Częściowo nakładające się, komplementarne oligonukleotydy 2 i 3 (fig. 16) syntetyzuje się, oczyszcza w żelu i łączy ze sobą przez „przyżarzenie. Oligonukleotyd 2 koduje sekwencję aminokwasową obecną w ludzkim CNTF w górę od miejsca Nhe . I (66). Sekwencja kodująca oligonukleotyd 2 zawiera kilka zasad różniących się od tych, które występują w genie ludzkim (porównanie figur 12 i 16). Zmiany te wprowadza się po to, aby zmienić użycie kodonu ludzkiego na takie, które jet preferencyjne w E.coli (według DeBoer'a i Kastelein'a: („From Gene to Protein: Steps Dictating the Maximal Level of Gene Expression“, 1986, wydawca: Davis i Reznikoff, str. 225-283, Butterworths, NY) albo aby wprowadzić miejsce BglII (fig. 16) dla ułatwienia następnych manipulacji genetycznych. Oligonukleotyd 2 zawiera również kody. dla łącznika translacji w kierunku 5' (fig. 16) dla zapewnienia skutecznej translacji. „Przeżarzone oligonukleotydy 2 i 3 posiadają wystające miejsca BamHI przy końcu 5' i wystające miejsce Nhel przy końcu 3' dla łatwości następnej ligacji i klonowania (fig. 14-16). Analiza sekwencji DNA genu ludzkiego CNTF enzymami restrykcyjnymi wykazuje unikalną sekwencję rozpoznawaną przez Nhel (66) (fig. 12). Tak więc, zostały skonstruowane oligonukleotydy 2 i 3 z wystającym miejscem Nhel pozwalającym na ich łączenie z pozostałym fragmetem 3' genu po trawieniu enzymem Nhel.

C. Łączenie oligonukleotydów 2 i 3 z sekwencjami kodującymi z delecją intronu.

Oligonukleotydy 2 i 3, posiadający zrekonstruowany koniec aminowy genu CNTF łączy się przez przyżarzanie i poddaje ligacji z pMCN-2a trawionym Nhel. Zligowany DNA trawi się następnie BamHI i Hind III uwalniając fragment DNA określany jako CNTF-Syni, zawierający sekwencje DNA nadające się do ekspresji w E.coli i kodujące ludzki CNTF w górę od miejsca Hindlll (233).

Strategia nr 2 konstruowania końca 5' (fig. 15): W strategii alternatywnej nie usuwa się intronu w procesie kierowanej miejscem mutagenezy lecz sporządza się całkowicie syntetyczną sekwencję

164 726

DNA kodującą CNTF w górę od miejsca HindIII (233) ale bez intronu. Dla utworzenia takiego syntetycznego konstruktu DAN syntetyzuje się oligonukleotydy 5-10 (fig. 17). Oligonukleotydy tworzące częściowo się pokrywające, dwuniciowe pary to: 5 i 6,7 i 8 oraz 9 i 10. Każda dwuniciowa para zawiera jednoniciowe nawisy wbudowane w celu umożliwienia ligacji tych oligonukleotydów w kolejności: 5 i 6, 7 i 8 oraz 9 i 10. Oligonukleotydy te oczyszcza się w żelu, „przyżarza“ i poddaje ligacji ze sobą. Uzyskuje się jeden dwuniciowy oligonukleotyd DNA o długości 261 par zasad oznaczony jako CNTF-Syn2. Ten syntetyczny DNA zawiera również: (1) kodony zmienione tak, aby pasowały do preferencyjnego użycia kodonu E.coli (porównanie fig. 12 i 17), (2) stosowany powyżej łącznik translacji 5' (fig. 16 i 17), oraz (3) wystający koniec 5' dla BamHI i wystający koniec 3' dla HindIII, ułatwiające ligację i klonowanie (fig. 17). Preparowanie końca 3' konstrukcji ekspresyjnej (fig. 14 lub 15): Klon ludzkiego genomowego DNA CNTF w fagu lambda EMBL3 z przykładu IV przecina się enzymem restrykcyjnym HindIII i w żelu oczyszcza się fragment o wielkości 2,1 kilozasad, zawierający sekwencje kodujące CNTF w dół od miejsca dla HindIII (233). Fragment ten klonuje się do trawionego HindIII plazmidu pEMBL8 (Dente i wsp., Nucleic Acids Res., 11, 1645, 1983). Do tego insertu DNA o wielkości 2,1 kilozasad wprowadza się miejsce dla SpeI (613) na drodze kierowanej oligonukleotydem mutagenezy 13 par zasad w dół od kodonu stopu kończącego sekwencję CNTF, stosując syntetyczny oligonukleotyd 4 (fig. 16). Zmutowany plazmid tnie się za pomocą HindIII i SpeI dla uwolnienia dolnego fragmentu kodującego, który następnie oczyszcza się w żelu. Fragment ten oznaczono jako CNTF-Syn3 (zawiera on sekwencje kodujące ludzki CNTF w dół od miejsca dla HindIII (233).

Preparowanie kompletnej konstrukcji ekspresyjnej. CNTF-Syn-1 poddaje się ligacji z CNTFSyn3 z utworzeniem CNTF-Syn1/3 (fig. 14) a CNTF-Syn2 poddaje się ligacji z CNTF-Syn3 z wytworzeniem CNTF-Syn2/3 (fig. 15) w celu skonstruowania dwu alternatywnych fragmentów DNA, z których każdy koduje ludzki CNTF i posiada odpowiednie modyfikacje w sekwencji DNA dla wzmożenia wydajnej ekspresji w E.coli. Wywołuje się ekspresję tych fragmentów w E.coli po podklonowaniu do: (A) bakteryjnego wektora ekspresyjnego pT5T, w oparciu o promotor fagowy T7 albo (B) bakteryjnego wektora ekspresyjnego pR3XI-2 w oparciu o hybrydowy promotor operonu laktozowego i tryptofanowego (Tac).

2. Ekspresja CNTF z zastosowaniem wektora ekspresyjnego opartego na układzie promotora T7 (na fig. 17 podane są cechy tego wektora):

A. Opis plazmidu pT5T. Oparty na promotorze T7 wektor ekspresyjny pT5T jest zasadniczo taki sam jak plazmid pJU1003 opisany przez Squires'a i wsp. (J. Biol. Chem. 263, 16297-16302, 1988) z tym, że występuje w nim krótki odcinek DNA między miejscem dla Bgl II w kierunku od 5' do promotora T7 a miejscem dla Cla I w genie oporności na tetracyklinę. Sekwencja tego DNA jest następująca:

ATCGATGATA AGCTGTCAAA CATGAGAATT GAGCTCCCCG GAGATCCTTA Cla I

GCGAAAGCTA AGGATTTTTT TTAGATCT Bgl II

B. Konstruowanie kompletnego wektora ekspresyjnego. Oczyszczony w żelu wektor linearyzuje się enzymami restrykcyjnymi BamHI i SpeI. Ze zlinearyzowanym wektorem miesza się CNTF-Syn 1/3 i poddaje ligacji. Powstaje konstrukcja ekspresyjna pT5T:CNTF-Synl/3. Na fig. 14 przedstawiony jest ogólny schemat konstruowania tego wektora.

C. Eskpresja rekombinantowego ludzkiego CNTF w E.coli. Szczep E.coli BL21/DE3/ transformuje się wektorem pT5T:CNTF-Synl/3 dla uzyskania ekspresji. Ten szczep, opisany przez Studier'a i Moffat'a (J. Mol. Biol. 189, 113-130, 1986) zawiera gen polimerazy RNA T7 pod kontrolą indukowanego przez IPTG promotora lac na nieusuwalnym, lizogenicznym bakteriofagu lambda. Z 10 transformantów poddanych skriningowi, dwa klony wykazują ekspresję indukowanego IPTG białka o zdolności migracji charakterystycznej dla ciężaru cząsteczkowego CNTF (około 24 kD). Te dwa klony oznaczono jako pT5T:Synl/3-5a i 5c. Sekwencjonowanie DNA z tych dwóch klonów potwierdziło prawidłowość sekwencji w tych rekombinantach.

Wysoki poziom ekspresji rekombinantowego CNTF osiąga się prowadząc hodowlę komórek na pożywce Luria z dodatkiem 15 ,ug/ml tetracykliny do czasu uzyskania gęstości komórek odpowia28

164 726 dającej gęstości optycznej A₆oo = 0,5-0,8. Komórki hoduje się w czasie 1,4-4 godziny, albo bez dodatku IPTG (nieindukowane) albo z dodatkiem IPTG w ilości odpowiadającej końcowemu stężeniu 1,0 mM (indukowane). IPTG (izopropylo-/3-D-tiogalaktropiranozyd) jest środkiem indukującym operon lac, który pośrednio aktywuje polimerazę T7 wektora ekspresyjnego i zwiększa poziom wytwarzanego CNTF.

D. Analiza wydzielanego białka metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym-SDS z następnym ,barwieniem barwnikiem Coomassie lub próbą immunologiczną na sączkach nitrocelulozowych.

Komórki zbiera się przez krótkie wirowanie i bezpośrednio po tym rozpuszcza w buforze do próbek analizowanych w żelu poliakryloamidowym-SDS (0,025% błękitu bromofenolowego, 10% glicerolu, 1% /J-merkaptoetanolu, 2% SDS i 0,0625 M Tris-HCl (pH = 6,8) i utrzymuje się we wrzeniu przez 2 minuty (fig. 20 i fig. 21). Komórki transformowane przez pT5T:CNTF-Synl/3-5a i indukowane za pomocą IPTG przez 2 godziny (pasmo 5 na fig. 20) dają pasmo ciemno zabarwione barwnikiem Coomassie migrujące do pozycji przewidzianej dla białka CNTF (około 24 kD). Jeśli komórki hoduje się bez dodatku IPTG, wówczas pasmo jest znacznie mniejsze (pasmo 4 na fig. 20) od pasma charakterystycznego dla białka, którego ekspresja, jest pod kontrolą operonu lac. Komórki transformowane wektorem pT5T bez insertu CNTF nie wykazują takiego pasma ani po indukcji (pasmo 3 na fig. 20) ani bez indukcji (pasmo 2 na fig. 20). Pasmo 1 przedstawia standardy ciężarów cząsteczkowych.

Identyczny żel poliakryloamidowy-SDS przenosi się na nitrocelulozę i poddaje testom immunologicznym z oczyszczonymi metodą powinowactwa przeciwciałami przeciw peptydowi A CNTF (E-S-Y-V-K-H-Q-G-L-N-K-N). W komórkach transfomowanych wektorem pT5T:CNTFSynl/35a i indukowanych przez 2 godziny przez IPTG (pasmo 5 na fig. 21) występuje intensywne psmo rozpoznawane przez oczyszczone metodą, powinowactwa przeciwciała przeciw peptydowi A CNTF migrujące do pozycji spodziewanej dla CNTF (około 24 kD). Jeśli komórki rosną bez dodatku IPTG (pasmo 4 na fig. 21) pasmo to jest znacznie mniejsze. Komórki transformowane wektorem pT5T bez insertu CNTF nie wykazują tego pasma ani w przypadku indukowania (pasmo 3 na fig. 20) ani bez indukowania (pasmo 2 na fig. 20). Pasmo 1 przedstawia standardy ciężarów cząsteczkowych.

Ponadto, komórki transformowane wektorem pT5T: CNTF-Synl/3-5a i indukowane IPTG przez 2 godziny rozrywa się przepuszczając je trzy razy przez celkę ciśnieniową. Pewną ilość surowego lizatu komórkowego rozdziela się na supernatant i frakcje peletki osadu wirując go z szybkością 20.000 obrotów/minutę w wirówce JA-20 (Beckman) przez 15 minut. Ilości surowego lizatu, supernatantu i frakcji osadu odpowiadające tej samej ilości wyjściowej zawiesiny komórkowej analizuje się w tym samym żelu poliakryloamidowym-SDS, przenosi na nitrocelulozę i prowadzi próby immunologiczne z oczyszczonymi metodą powinowactwa przeciwciałami przeciwpeptydowi A. Supernatant z lizatu (pasmo 8 na fig. 21) zawiera znacznie więcej reaktywnego immunologicznie białka CNTF niż peletka osadu z lizatu (pasmo 9 na fig. 21). Poziom CNTF w supematanciejestporównywalnyzpoziomemCNTFwniefrakcjonowanymlizacie(pasmo7nafig.21).

E. Aktywność biologiczna wytwarzanego CNTF. Komórki zbiera się przez krótkie wirowanie i zawiesza w 20 mM roztworze Tris-HCl (pH — 8,2) w objętości równej 1/35 początkowej objętości zawiesiny komórek. Następnie komórki rozrywa się przez trzykrotne przepuszczenie przez celkę ciśnieniową i surowy lizat komórkowy rozdziela się na supernatant i peletkę osadu przez wirowanie z szybkością 20 000 obrotów/minutę w wirówce JA-20 (Beckman) przez 15 minut. W seryjnych rozcieńczeniach supernatantu oznacza się zdolność utrzymywania przy życiu komórek nerwowych zwoju rzęskowego w sposób podany w przykładzie I. Supernatant wykazuje znaczną aktywność biologiczną aż do rozcieńczenia 1:1.000.000 (fig. 22). W oparciu o oznaczenie aktywności biologicznej i ilości białka CNTF występującego na sączkach nitrocelulozowych aktywność właściwą rekombinantowego ludzkiego CNTF szacuje się na około 275 jednostek TU/ng. Jest to aktywność dwukrotnie wyższa od aktywności właściwej oczyszczonego białka CNTF królika, co wskazuje, że

164 726 w ekstrakcie komórek bakteryjnych biologicznie aktywny jest rekombinantowy CNTF. Lizaty komórek transformowanych pT5T bez insertu CNTF nie wykazywały żadnej wykrywalnej aktywności biologicznej.

Supernatant poddaje się również elektroforezie w 15% żelu pcliakryloamidowym-SDS i tnie się na warstewki o szerokości 1 mm, które ekstrahuje się przez dobę w pożywce hodowli komórkowych, w temperaturze 4°C, na wstrząsarce wahadłowej i oznacza biologicznie w sposób opisany w przykładzie I. Rysunek w rogu fig. 22 przedstawia, że frakcje o ciężarze cząsteczkowym odpowiadającym 24 kD przewidzianym dla CNTF wykazują pik aktywności biologicznej.

F. Sekwencja aminokwasowa wytwarzanego CNTF. Region odpowiadający 24 kD wycina się z żelu pcΠakrylcamidowego-SDS uzyskanego w sposób podobny jak na fig. 20 ale bez barwienia barwnikiem Coomassie. Materiał ten sekwencjonuje się w aparaturze do sekwencjonowania białek „ Applied Biosystems Protein Sequencer“ metodą degradacji Edman'a, w sposób opisany w przykładzie II. Uzyskano następującą sekwencję aminokwasową: AFTEHSPLTPHRRDL/7/S......

Znak zapytania odpowiada aminokwasowi C w sekwencji ludzkiej. Aminokwas ten nie może być oznaczony tym sposobem. Sekwencja ta odpowiada sekwencji przewidywanej dla ludzkiego CNTF (fig. 12) i jest dodatkowym dowodem na to, że ekspresja CNTF zachodzi prawidłowo. Z oznaczenia wynika również, że podczas ekspresji z końca aminowego jest usuwana metionina i 'w Wytworzonym białku jako końcowy aminokwas końca aminowego pozostaje alanina.

Powyższe wyniki dowodzą ekspresji CNTF reaktywnego w reakcjach krzyżowych immunologicznych. Ekspresja ta przebiega na wysokich poziomach a produkt występuje w formie aktywnej biologicznie, w większości w postaci rozpuszczonej po lizie komórek bakteryjnych.

3. Ekspresja CNTF z zastosowaniem wektora ekspresyjnego opartego na układzie promotora hybrydowego operonu laktozowo-tryptofanowego (Tac) (cechy tego wektora są przedstawione na fig. 19).

(A) Opis plazmidu pT3XL-2 (modyfikacja pKK223-3).

Plazmidem wyjściowym jest plazmid pKK223-3 dostarczony przez firmę Pharmacia. Plazmid ten posiada częściowy gen oporności na tetracyklinę. Ten niefunkcjonalny gen zastępuje się całkowitym genem oporności na tetracyklinę występującym w plazmidzie pBR322. Plazmid pKK223-3 trawi się całkowicie enzymem SpH I i częściowo BamHI. Framgent o długości 4,4 kilopar zasad oczyszcza się w żelu i łączy z syntetyczną sekwencją adaptorową:

5' GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT 3'

3' ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 5' i z fragmentem DNA o długości 539 par zasad pochodzącym z trawienia Cla I i Sph I genu oporności na tetracyklinę zpBR322 (PL Biochemicals, 27-4891-01). Wytworzony plazmid oznacza się jako pCJ1.

Następnie, w miejscu Pvu II plazmidu pC J1 dokonuje się insercji linkera Xho I dostarczonego przez New England Biolabs. Powstaje plazmid pCJX-1. Ta insercja rozrywa gen rop kontrolujący ilość kopii plazmidu. Z plazmidu pMC9 (Calos i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80,3015-3019, 1983) oocyszzca s żę fragment Eco Ri zawierający gen 1 ac 11 dokonujei ego onsercji w mieiscu Xho I, stosując sekwencje adapterowe Xho I do Eco RI:

5' TCGAGTCTAGA 3'

3' CAGATCTTTAA 5'

Następnie sekwencję polilinkeca pomiędzy miejscami Eco RI i Pst I w plazmidzie pKK223-3 zamienia się na sekwencję polilinkeca przedstawioną poniżej:

5' AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA 3'

3' GGGCCC ATGGTCTAGA CTGGAGTGAT CAG 5'

Uzyskany wektor plazmidowy oznacza się jako pCJXI-1.

W końcu, gen oporności na tetracyklinę zastępuje się podobnym genem, u którego na drodze mutagrsezy zniszczono miejzoa rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Hind III, Bam HI i Sal I. W celu dokonania mutacji genu oporności na tetracyklinę w pBR322 prowadzi się następujące prace: Plazmid pBR322 przecina się enzymem Hind III i poddaje mutagenezie kwaśnym siarczynem sodowym w sposób opisany przez S0crtle'eoo i Na^ans^ (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 5, 2170-2174, 1978). Zmutowany DNA poddaje się lil^gaji z utworzeniem formy kolistej, następnie trawi się Hind III w celu linearsagcji każdego plazmidu, który nie uteg- mujaeii. Plaemidem tmin

164 726 transformuje się E.coli JM109 (Yanisch-Perron i wsp., Gene 33, 103-119, 1985) i posiewa się na pożywkach selekcyjnych. Z kolinii opornych na tetracyklinę izoluje się plazmidy i w genie oporności na tetracyklinę sprawdza utratę miejsca dla Hind III. Prawidłowo zmutowany plazmid oznaczono symbolami pT 1. Podobną procedurę stosuje się dla mutagenezy miejsca Barn HI w pT 1, uzyskując plazmid pT2. Plazmid pT2 z kolei mutagenizuje się w celu usunięcia miejsca Sal I, tworząc plazmid pT3. Fragment Clal/Bam I z pT3, zawierający zmutowany gen oporności na tetracyklinę izoluje się i stosuje do zamiany homologicznego fragmentu pCJXI-l z utworzeniem pT3XI-2. Zmutowany gen oporności na tetracyklinę w dalszym ciągu koduje funkcjonalne białko.

B. Tworzenie pT3XI-2-10TC3FGFsyn (preparowanie wektora promotora tac dla CNTF). Początkowo syntetyzuje się „gen“ dla zasadowego Czynnika Wzrostu Fibroblastów (bFGF).

Ten „gen“ koduje taką samą sekwencję jaką opisał Sommer i wsp. (Biochem. Biphys. Res. Commun. 141, 67, 1987) dla FGF ale zastosowane są w nim kodony, o których wiadomo, że są korzystne w genach wykazujących wysoką ekspresję w E.coli. Struktura tego genu we fragmencie poprzedzającym część kodującą zapewnia skuteczną inicjację translacji (Sąuires i wsp., 1988 jak wyżej).

Syntetyczny gen FGF wprowadza się do M13mpl8 między miejscami Eco RI i Hind III i poddaje sekwencjonowaniu. Struktura tego genu jest następująca:

AATTCAGGA TCCGATCGTG GAGGATGATT AAAIGGGTAC CATGGCTGCT GTCCT AGGCTAGCAC CTCCTAOTAA TTTACCCATG GTACCGACGA

EcoRI BamHI_RBS_ PGFstart

GGCTCCATCA CTACCCTGCC GGCACTGCCG GAAGACGGTG GCTCCGGTGC

CCGAGGTAGT GATGGGACGG CCGTGACGGC CTTCTGCCAC CGAGGCCACG

TTTCCCGCCG GGCCACTTCA AAGACCCGAA ACGTCTGTAC TGTAAAAACG

AAAGGGCGGC CCGGTGAAGT TTCTGGGCTT TGCAGACATG ACATTTTTGC

GTGGCTTCTT CCTGCGTATC CACCCGGATG GTCGTGTCGA CGGCGTACGT

CACCGAAGAA GGACGCATAG GTGGGCCTAC CAGCACAGCT TGCCGCAIGC

GAAAAAAGCG ACCCGCACA TCAAACTGCA GCTGCAGGCTG AAGAACGTG ACTTTTTTCC TGGGCGTGT AGTTTGACGT CGACGTCCGAC TTCTTGCAC

GTGTTGTATC TATCAAAGGC GTTTGCGCAA ACCGTTACCT GGCTATGAAAG

CACAACATAG ATAGTTTCCG CAAACGCGTT TGGCAAIGGA CCGATACTTTC

AAGACGGTC GTCTGCTGGC TAGCAAATGT GTAACTGACG AATGTTTCTT TTCTGCCAG CAGACGACCG ATCGTTTACA CAITGACTGC TTACAAAGAA

CTTCGAACGTC TGGAAAGCA ACAACTACAA CACCTACCGT TCTCGTAAAT

GAAGCTTGCAG ACCTTTCGT TGTTGATGTT GTGGATGGCA AGAGCATTTA

ACACTTCTTG GTACGTTGCTC TGAAACGTA CCGGCCAGTA CAAACTGGGT TGTGAAGAAC CATGCAACGAG ACTTTGCAT GGCCGGTCAT GTTTGACCCA

TCCAAAACTG GCCCGGGTCA GAAAGCAATCC TGTTCCTGC CGATGAGCGC AGGTTTTGAC CGGGCCCAGT CTTTCGTTAGG ACAAGGACG GCTACTCGCG

TAAATCTTAA ACTAGTA ATTTAGAATT TGATCATTCGA

FGFstop Hindlll

164 726

Interesujące cechy tego genu są uwypuklone. Gen ten izoluje się przez trawienie Bam HI i Hind III i wprowadza do plazmidu pJU1003 (Squires i wsp. 1988, jak wyżej) ciętego Bam HI i Hind III, uzyskując pJU1003-synFGF. Ten plazmid przecina się za pomocą Xba I i Hind III i izoluje się fragment Xba I/Hind III posiadający gen FGF. Ten fragment łączy się przez ligację z pT3XI-2 uprzednio ciętym za pomocą Eco RI i Hind III, stosując linker Eco RI-XBA I:

5' pAAT TCC ACA ACG GTT TCC CT 3'

3' GG TGT TGC CAA AGG GAG ATCp 5'

Ten nowy plazmid oznaczono symbolami pT3XI-2-10TC3FGFsyn.

C. Insercja konstrukcji ekspresyjnych CNTF do . wektora promotora Tac. pT3XI-2-10TC3FGFsyn tnie się enzymami Bam HI i Spe I w wyniku czego następuje linearyzacja wektora ekspresyjnego o wielkości 7,4 kilozasad i uwolnienie fragmentu DNA FGF o wielkości 0,5 kilozasady. W oddzielnych reakcjach liguje się CNTF-Syn 1/3 i CNTF-Syn2/3 z oczyszczonym w żelu fragmentem DNA wektora uzyskanym po cięciu Bam HI i Spe I. Uzyskuje się plazmidy pT3XI-2:CNTF-Syn 1/3 i pT3XI-2:CNTF-Syn2/3.

D. Ekspresja w E.coli. Oporny na fai szczep E.coli K-JM107 transformuje się plazmidem pT3XI-2:CNTF-Syn1/3. Prowadzi się hodowlę 14 transformantów, po czym analizuje się je na ekspresję CNTF metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym-SDS i barwienie błękitem brylantowym Coomassie. Cztery transformanty wykazują ciemno-zabarwione pasmo w pozycji odpowiadającej CNTF. Wysoki poziom eskpresji rekombinantowego CNTF osiąga się hodując komórki na pożywce Luria z dodatkiem 15μg/ml tetracykliny aż do uzyskania gęstości komórek odpowiadającej gęstości optycznej Λβ00 — 0,8. IPTG dodaje się w ilości odpowiadającej końcowemu stężeniu 1,0 mM, po czym prowadzi się hodowlę komórek w - czasie 2 godzin. Te wszystkie 4 transformanty wykazują mniej - więcej takie samo stężenie CNTF zarówno w próbkach barwionych błękitem Coomassie jak i w testach immunologicznych. Widoczny poziom ekspresji CNTF w tych transformantach obserwowany w tych żelach stanowi około 1/4 tego jaki występuje w pT5T:CNTF-Synl/3-5a hodowanym w sposób opisany poprzednio. Mapowanie restrykcyjne DNA z tych 4 transformantów wykazało, że wszystkie one posiadają gen ludzkiego CNTF.

Szczep E.coli TG1 transformuje się pT3XI-2:CNTF-Syn2/3 i poddaje ekspresji. Transformanty selekcjonuje się posiewając je na agarze LB z dodatkiem 15 μg/ml tetracykliny. Wyselekcjonowano 4 transformanty pT3XI-2:CNTF-Syn2/3,A, -B, -C, -D, prowadzono ich hodowlę i wykonano mapy restrykcyjne. Do dalszych badań wyselekcjonowano jeden transformant, pT3XI-2:CNTF-Syn2/3-A. Hodowlę tego transformantu prowadzi się przez dobę w 500 ml pożywki 2XYT z dodatkiem 10μg/ml tetracykliny i 1 mM IPTG. Komórki zbiera się przez wirowanie tak jak w poprzednich przykładach i poddaje ekstrakcji w 10 mM buforze fosforanowym o pH = 6,7 zawierającym 1 mM EDTA, 0,1 M PMSF i 0,1 mcM pepstatyny, działając ultradźwiękami, na lodzie przez 15 sekund stosując mikrokońcówkę przy ustawieniu prądu nr 3. Po 15 minutowym wirowaniu w mikrowirówce zbiera się supernatant i oczyszcza w nim aktywność biologiczną w próbie przeżywania nerwów węzła rzęskowego (przykład I). W supernatancie, zawierającym 1,5 mg białka w ml występuje znaczna aktywność biologiczna.

Przedstawione w przykładach wyniki wskazują, że dwa różne konstrukty DNA w dwóch różnych wektorach ekspresyjnych pozwalają na ekspresję aktywnego biologicznie białka CNTF, które właściwie migruje w żelach poliakryloamidowych-SDS, jest rozpoznawane przez oczyszczanie metodą powinowactwa przeciwciała przeciw CNTF i posiada odpowiednią sekwencją aminokwasową.

4. Oczyszczanie rekombinantowego CNTF. Małą ilość inoculum pT5T:CNTF-Synl/3-5a hoduje się w temperaturze 37°C, wstrząsając na pożywce Luria z dodatkiem 10 μg/ml tetracykliny. Ilość 7 ml tej zawiesiny komórkowej dodaje się do 50 ml pożywki Luria w dużych kolbach i hoduje się w temperaturze 37°C, wstrząsając aż do osiągnięcia gęstości optycznej A600 = 0,5. Następnie dodaje się IPTC do końcowego stężenia 0,5 mM dla indukowania ekspresji CNTF i kontynuuje się hodowlę do gęstości optycznej A600 = 1,2, co na ogół trwa 4-6 godzin. Komórki zbiera się przez wirowanie w wirówce JA-20 z szybkością 7.000 obrotów na minutę przez 5 minut w temperaturze 4°C i przemywa jeszcze raz przez wirowanie w 50 mmolarnym buforze fosforanowym (pH = 8,0)

164 726 (bufor A) w temperaturze 4°C. Supernatant usuwa się, a peletkę komórek zamraża się i przechowuje w temperaturze -20°C w postaci pasty.

Pastę komórek zawiesza się w buforze B (bufor A) zawierający 1 mM EDTA czyli eter glikolu etylenowego z kwasem bis/aminoetylo/-N,N,N,N-cztęrooctowym i 1 mM EDTA czyli kwas etylenodiaminoczterooctowy w ilości 0,5 g pasty w ml buforu w temperaturze 4°C i przepuszcza 3 razy przez celkę ciśnieniową dla rozerwania błon komórek bakteryjnych. Następnie dodaje się polietylenoiminę (PEI) w ilości odpowiadającej końcowemu stężeniu 0,25% i wstrząsa przez 30 minut w temperaturze 4°C. Osad usuwa się przez wirowanie przez 15 minut z najwyższą szybkością w mikrowirówce. W tym etapie obniża się na ogół zawartość kwasów nukleinowych od około 25% do poniżej 5%, co wynika z pomiarów stosunku A260/A280.

Próbkę wprowadza się na kolumnę Q-Sepharose (Pharmacia) zrównoważoną buforem B. CNTF jest na tyle przeważającym składnikiem lizatu komórkowego otrzymanego z celki ciśnieniowej, że może być oznaczany podczas trwania chromatografii bezpośrednio z wycieku z kolumny w barwionych błękitem brylantowym Coomassie żelach poliakryloamidowych-SDS. CNTF stanowi główne pasmo w barwionych żelach w położeniu odpowiadającym około 24 kD. Stosując tę próbę, CNTF wymywa się z kolumny Q-Sepharose buforem B. Wyciek z kolumny zawierający białko CNTF zebrany w wielu frakcjach łączy się, dializuje wobec buforu C (5 mM bufor fosforanowy o pH = 8,9, zawierający 1 mM EDTA i 1 mM EDTA) i wprowadza na kolumnę Q-Sepharose zrównoważoną buforem C. Kolumnę przemywa się buforem C aż A280 powróci do wartości podstawowej, co wskazuje, że z kolumny nie wymywają się już żadne niewiążące się z nią białka. W buforze C CNTF więżę się kolumnę Sepharose i jest z niej eluowany gradientem 0-0,1 M NaCl w buforze C. CNTF pojawia się w wycieku z kolumny przy około 40 mM NaCl i ma czystość powyżej 90% jak wynika z frakcji pików CNTF w żelach poliakryloamidowych-SDS barwionych błękitem Coomassie.

164 726

TU-IO-3

F/G. 20

164 726

FIG. 1

164 726

FG 17

Bom HI

0LIG0-5 5-

GATC

CGA

TCT

TGG

AGG

ATG

ATT

AAA

TGG

CTT

TCA

CCG AAC ACT CCC CGC

TGA

OLIGO

-6 3'-

GCT

AGA

ACC

TCC

TAC

TAA

TTT

ACC

GAA

AGT

GGC TTG TGA GGG GCG

ACT

CCC CGC

ACC

GTC

GTG

ACC

TGT

GCT

ccc

GTT

CCA

TCT

GGC TGG CT-3OLIG0-5

GGG GCG

TGG

CAG

CAC

TGG

ACA

CGA

GGG

C.AA

-5'OLIGO-B

OLIGO-7 5

- C

GTA

AAA

TCC

GTT

CCG

ACC

TGA CCG CTC TGA CCG

AAT

OLIGO-8 3'

- GGT

AGA

CCG

AC.C

GAG

CAT

TTT

AGG

CAA

GGC

TGG

ACT GGC GAG ACT GGC

TTA

CCT ACG

TTA.

. A.AC

ACC

AGG

GTC

TGA

ACA

AAA

ACA

TCA

ACC TGG ACT CC-3OLIG0-7

GGA TGC

AAT

TTG

TGG

TCC

CAG

ACT

TGT

TTT

TGT

AGT

T -5OLIG0-8

0LIG0-9 5'- G CTG ACG GTA TGC CGG TTG CTT CCA CCG ACC AGT GGT CCG OLI GO-10 3'- GG ACC TGA GGC GAC TGC CAT ACG GCC AAC GAA GGT GGC TGG TCA CCA GGC

AAC TGA CCG AAG CTG AAC GTC TGC AGG AAA ACC TGC A TTG ACT GGC TTC GAC TTG CAG ACG TCC TTT TGG ACG

TTCGA Hi.id ΙΣΙ

3' OLIGO-9

5'OLIGO-IO

164 726

F/G. /6 igonukleocujd 1

OLlGO-i 5'-gat gtt ctt ctt cag gcc ctg atg ctt cac

ATA GGA TTC CGT AAG AGC AGT CAG GTC TGA ACG AAT CTT CC - J

Oligonukleotydy 2 i 3

OLIGO-2 5'·

BamHI

GATC

CGATCTTGGAGGATGATTAA

0LIG0-3 3'-cctagaacctcctactaatt

ATG GCT TTC TAC CGA AAG met ala phe

ACT GAA CAC TCT CCG CTG ACC CCG CAC CGT C

TGA CTT GTG AGA GGC GAC TGG GGC GTG GCA G chr glu his ser pro leu chr pro his arg arg asp leu

TGC AGC CGC ACG TCG GCG cys ser arg ser

TCT ATC AGA TAG ile

TC

AC

Nhe I G

C GATC crp leu

Oligonukleotyd 4

CCT TCT

0LIG0-4 5'- ATG TAG CAG TT A GTC mec STOP

ACT AGT Spe 1

CTC TTC CTT GCT-l

FIG. 15

Soli f—CNTF —, Hindin

1^INTRON^^W%^%1 '

1.3-kb INTRON (114) tlind ± (233)

LAMBDAEMBL3

164 726

FIG. 14

SaLl

Ι-CNTF , —, Hindm t^NTRONt^/WW^ ' ‘

1.3-kb INTR0NO14) Hind ΠΗ233)

Spel

16-4726

i

164 726

TG

G A

FIG

c

G

TAA GGG

ATG

GCT

KC ACA

GAG

met

ala

phe thr

g 1 u

T

met A C

CAT TCA CCG 1

CTG ,

ACC

CCT CAC 1

CGT 1

CGG

GAC

CTC TGT ,

AGC

CGC

TCT ATC

TGG

his

ser pro

1 e u

1 h r

pro

h i s

arg

arg

asp

leu c ys

ser

arg

ser ile

trp

a 1 a

glu

thr

G

C

T C

CTA i

GCA AGG

AAG

ATT

CGT '

ica i

SAC i

CTG

ACT

GCT CK

ACG

GAA

TCC TATI GTG

leu

ala aro

lys

i le

arg

ser asp

1 e u

thr

ala leu

thr

glu

ser tyr i val

T

AGA

AAG

CAT CAG

GGC

CTG

AAC

AAG

AAC

ATC

AAC

CTG GAC

TCT

GCG

GAT GGG

ATG

lys

his gin

gly

leu

asn

lyn

asn

ila

asn

leu asp

ser

ala

asp gl y

mel

val

val

A

T

CCA

GTG GCA

AGC

ACT

GAT

CAG

TGG

AGT

GAG CTG ACC GAG

GCA

GAG CBA

CTC

pro

val ala

ser

thr

asp

gin

Irp

ser

glu

leu l h r

glu

ala

glu arg

leu

mel

fi

fi

A

A

I

CAA

GAG AAC

CTT

CAA

GCT

TAT

CGT

ACC

TTC

CAT GTT

KG

KG

GCC AGG CTC

gin

glu asn

1 e u

gin

ala

tyr

arg

thr

phe his val

leu

leu

ala arg

leu

1 le

me t

G T

KA

GAA GAC

CAG

CAG

GTG

CAT

TTT

ACC

CCA

ACC GAA

GGT

GAC

KC CAT

CAA

leu

glu asp

gin

gin

va 1

his

p he

l h r

p r o

th r glu

giy

asp

phe his

gin

al a

T A

T

C

T

GCT

ATA CAT

ACC

CTT

CTT

CTC

CAA

GTC

GCT

GCC TTT

GCA

TAC

CAG ATA

GAG

al a

ile his

thr

leu

1 e u

1 e u

g 1 n

v a 1

ala

ala phe

ala

tyr

gin ile

glu

G G

fi

T

GT

T

T CC

A

T

GAG

TTA ATG

ATA

CTC

CTG

GAA

TAC

AAG

ATC

CCC CGC

AAT

GAG

GCT GAT GGG

giu

leu met

ile

leu

leu

glu

tyr

!ys

ile

pro arg

asn

glu

ala asp gly

val

cys

asn

pro

lys

asp

CA

G C

GT

A

ATG

CCT ATT

AAT

GTT

GGA

GAT

GGT

GGT

CTC

ΠΤ GAG

AAG

AAG

CTG TGG

GGC

mel

pro ile

asn

val

gly

asp

qly

qly

leu

phe glu

lys

lys

leu trp

9'y

val

ile

gly

asp

G

A

A

C

G

A

T

CTA

AAG GTG

CTG

CAG

GAG

ck

TCA

CAG

TGG

ACA GTA

AGG

TCC

ATC CAT

GAC

1 e u

lys val

leu

g 1 n

glu

le u

ser gin

trp

thr val

arg

s e r

ile his

asp

G

fi

A

h i s

/

A

CK

CGT KC

ATT

TCT

TCT

CAT CAG

ACT

GGG ATC CCA

GCA

, CGT GGG ABC CAT

leu

a r g p he

ile

s e r

ser

his

i gin

thr

gly

ile pro

ala

arg gly ser

his

val

cys

h i s

G

G

TAT	AK	GCT	AAC	AAC	AAG	AAA	ATG TAG
tyr	ile	ala	asn	asn	lys	lys	m e 1
				asp		glu

164 726

FIG. IOA FIG. IGB

12

45— “ ~ —

— 24 — —

—

FIG. II

G CAA ACT CAG CTG ACT TGT TTC CTG GGA CAG TTG AGT TAG GGG ATG GCT M A

TTC .

ATG

GAG

CAT

TCA

GCA

CTG

ACC

CCT

CAC

CGC

CGG

GAG

CTC

TGT

AGC

F

M

E

H

S

A

L

T

P

H

R

R

E

L

C

S

CGT

ACC

ATC

TGG

CTA

GCG

AGG

AAG

ATT

CGT

TCA

GAC

CTG

ACC

GCT

CTT

R

T

I

W

L

A

R

K

I

R

S

D

L

T

A

L

ACG

GAA

TCT

TAC

GTG

AAG

CAT

CAG

GGC

CTG

AAC

AAG

AAC

ATC

AAC

CTG

T

E

S

Y

V

K

H

0

S

L

N

K

N

I

N

L

GAC

TCT

GTG

GAT

GGA

GTA

CCA

ATG

GCA

AGC

ACT

GAT

CAG

TGG

AGT

GAG

D

S

V

0

G

V

P

M

A

S

T

D

Q

W

S

E

CTG

ACT

GAG

GCA

GAG

CGA

CTC

CAA

GAG

AAC

CTC

CAA

GCT

TAT

CGG

ACC

L

T

E

A

E

R

L

Q

E

N

L

0

A

Y

R

T

TTC

CAT

ATT

ATG

TTG

GCC

AGG

CTT

TTA

GAA

GAC

CAG

CAG

GTG

CAT

TTT

F

H

I

M

L

A

R

L

L

E

D

Q

Q

V

H

F

ACC

CCA

GCT

GAA

GGT

GAC

TTC

CAT

CAA

GCT

ATA

CAT

ACC

CTT

TTA

CTC

T

P

A

E

G

D

F

H

Q

A

I

H

T

L

L

L

CAA

GTT

GCT

GCC

TTC

GCT

TAC

CAG

ATA

GAG

GAG

TTA

ATG

GTG

CTG

KG

Q

V

A

A

F

A

Y

Q

I

E

E

L

M

V

L

L

GAA

TGT

AAT

ATC

CCT

CCC

AAA

GAT

GCT

GAT

GGG

i ACA

CCT

GTC

ATT

GGA

E

C

N

l

P

P

K

D

A

D

S

T

P

V

I

S

GGT

GAT

GGT

CTC

TTT

GAG

AAG

AAG

CTG

TGG

GGC

; ctg

AAG

GTG

CTA

CAA

B

D

S

L

F

E

K

K

L

W

S

L

K

V

L

Q

GAG

CTT

TCA

CAC

TGG

ACA

GTG

.AGA

TCC

ATT

CAT

GAC

CTT

CGT

GTC

ATT

E

l,

S

H

W

T

V

R

S

I

H

D

L

R

V

I

TCT

TGT

CAT

CAA

ACT

GGA

ATC

CCA

GCA

CAT

GGG AGC

CAT

TAT

ATT

GCT

S

C

H

Q

T

G

I

P

A

H

G

S

H

Y

I

A

AAC GAC AAG GAA ATG TAG N D Κ E M

ł

TU*!0-3(«

FIG. GB

164 726

Α28θ(—

TUxlO-4(•—‘ CNTF

OD 280

164 726

FłG. 4

C\J O Od CO OO

I + + + +

I - 29K - 20K

- I4K

TU»IO-3(.

PH

CNTF

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania czynnika neurotroficznego CNTF metodą rekombinowanego DNA, znamienny tym, że (a) przygotowuje się sekwencję DNA obejmującą kwasy nukleinowe ludzkie lub zwierzęce o wzorze podanym na fig. 11 i 12, zdolne do ukierunkowania komórki gospodarza na wytwarzanie białka wykazującego aktywność CNTF, (b) klonuje się tę sekwencję DNA w nośniku zdolnym do przenoszenia go do komórki gospodarza i replikacji w komórce gospodarza, przy czym nośnik taki zawiera elementy operacyjne potrzebne do ekspresji tej sekwencji DNA, (c) przenosi się nośnik, zawierający syntetyczną sekwencję DNA i elementy operacyjne do komórki gospodarza, zdolnej do ekspresji DNA kodującego CNTF, (d) prowadzi się hodowlę komórek gospodarza w warunkach odpowiednich do wzmocnienia nośnika i ekspresji CNTF (e) zbiera się wytworzony CNTF i (f) pozwala się CNTF na przyjęcie aktywnej struktury trzeciorzędowej, dzięki czemu wykazuje on aktywność CNTF.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujący sekwencję aminokwasów ludzkiego CNTF.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się sekwencję DNA obejmującą kwasy nukleinowe obecne w CNTF-Syn 1/3.
4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się sekwencję DNA obejmującą kwasy nukleinowe obecne w CNTF-Syn 2/3.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję DNA kodującą fizjologicznie czynny CNTF zawierający sekwencję kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasów dostatecznie podobnej do CNTF, pozwalającej na posiadanie co najmniej jednej właściwości biologicznej CNTF.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się drobnoustrój.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako drobnoustrój stosuje się E.coli.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórki-gospodarze stosuje się komórki ssaków.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako komórki-gospodarze stosuje się komórki Chinese Hampster Ovary.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję kwasu nukleinowego kodującą króliczy SN-CNTF o wzorze podanym na fig. 11.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki CNTF o wzorze podanym na fig. 12.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się rekombinantowy układ ekspresyjny komórki zwierzęcej wytwarzający biologicznie czynny CNTF.
13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się układ ekspresyjny komórki bakteryjnej wytwarzający biologicznie czynny CNTF.