PL165149B1 - Sposób wytwarzania stabilnej termicznie dezaminazy c ytozynowej PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania stabilnej termicznie dezaminazy cytozynowej droga rekombinacji, zna- mienny tym, ze eukariotyczne lub prokariotyczne komórki-gospodarcze transformuje sie rekombinan- towym wektorem ekspresyjnym powodujacym skute- czna ekspresje sekwencji nukleotydowej zasadniczo przedstawionej na fig. 10, po czym stransformowane komórki-gospodarze hoduje sie w warunkach umozli- wiajacych ekspresje tej nukleotydowej sekwencji i ze stransformowanych wyhodowanych komórek-gospo- darzy wyodrebnia sie stabilna termicznie dezaminaze cytozynowa. FIG. 10 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania stabilnej termicznie ^za^nazy cytozynowej wyodrębnionej z drożdży. Bardziej szczegółowo, wynalazek niniejszy dotyczy wytwarzania techniką rekombinantową termicznie stabilnej dezaminazy cytozynowej pochodzącej z Saccha^myces cerevieiee.

Dezaminaza cytozynowa /CDaza, EC, 3.5.4.1/ katalizuje hydrolizę cytozyny do uracylu na drodze reakcji przedstawionej schematem. Enzym ten, który gra ważną rolę w metabolizmie pirymidyny w drobnoustrojach /O^Donowan i Neuhard, 1970/, został wyodrębniony z kilku różnych drobnoustrojów, lecz okazało się, że nie był obecny w komórkach ssaków /Niehmoata i in.,

1985/.

Wykazano, że właściwości fizyczne CDazy z różnych organizmów różnię się znacznie jeśli chodzi o masę cząsteczkową, stabilność i skład podjednostek. I tak np., CDaze z Salmonella typhiturlum oczyszczono do jednorodności /za pomocą elektroforezy w żelu poliakkyloamirowyt z siarczanem ^decylo-sodowym - SDS-PAGE/ i okazało się, że jest ona złożona z czterech podjednostek o 54 kilodaltonach każda /West i in., 1982/, podczas gdy enzym z E. coli ma masę cząsteczkową 200 kilodaltonów i jest złożony z podjednostek o 35 do 46 kilodaltonów /Kateuragi i in., 1986/. Obydwa te enzymy są w wysokim stopniu termicznie stabilne i utrzymują wysoką aktywność w temperaturze 55°C.

Jako źródła CDazy użyto także drożdży piekarniczych /Saccharomyces cere^/l^ae/. CDaza otrzymana z nich uprzednio ma masę cząsteczkową 34 kilodaltony jak oznaczono za pomocą filtracji żelowej /Ipata i in., 1971, 1978/ i 32 - 33 kilodaltony jak oznaczono za pomocą SDS-PAGE i analizy aminokwasów /Yergatian i in., 1977/. Enzym CDaza, który został uprzednio wyodrębniony z drożdży piekarniczych jest więc, jak się okazuje, białkiem monomerycznym.

Roztwory CDazy uprzednio wyodrębnionej z drożdży piekarniczych utrzymuję aktywność w ciągu co najmniej 48 godzin, gdy przechowywane są w temperaturze 4°C w pH 5 - 9./Ipata i in., 1971, 1978/. Jednakże, w temperaturze 37° surowy preparat CDazy z drożdży piekarniczych traci, jak wykazano, połowę aktywności w ciągu godziny /Kream and Chargaff, 1952/, a w postaci oczyszczonej na półokres trwania 30 minut. /^seregi, 1988/. Półokres trwania w temperaturze 37°C można zwiększyć do 28 dni za pomocą unieruchomienia enzymu na kuleczkach epoksyakrylowych /Keteukegm i in., 1987/. Tak więc, termiczna niestabilność CDazy z drożdży piekarniczych, wraz z niską masą cząsteczkową, odróżnia ją od enzymów bakteryjnych wcześniej opisanych.

165 149

CDazy użyto terapeutycznie do konwersji proleku 5-fluorocytozyny /5-FC/ do przeciwrakowego leku 5-fluorouracylu /5-FU/ /Katsuragi i in., 1987/j Nishyama i in., 1985| Sakai i in., 1985,/t Senter i in., 1987/. Jednakże, bakteryjne źródła CDazy sę niepraktyczne w.tym zastosowaniu wymagając hodowli na wielką skalę w celu otrzymania odpowiedniej aktywności /Sakai i in., 1985/. Dodatkowo, ekstrakty bakteryjne mogą spowodować niepożądane działania uboczna u biorców.

W celu ominięcia tych problemów można użyć drożdży jako źródła CDazy. Jednak niestabilność termiczna uprzednio otrzymanego produktu z drożdży, wymaga, aby enzym ten został przed użyciem unieruchomiony /Katsuragi i in., 1987/. To też, wyodrębnienie i oczyszczenie termicznie stabilnej drożdżowej CDazy dostarcza ważnego enzymu do użycia w terapii przeciwrakowej. Podobnie, klonowanie genu termicznie stabilnej CDazy z drożdży pozwala na wprowadzenia określonych zmian lub uzupełnień do samego genu, sekwencji kontrolujących jego ekspresję i sprzężeń genowych utworzonych między genem z innymi cząsteczkami. Te nowe konstrukcje zwiększają skuteczność lub użyteczność enzymu w terapii przeciwrakowej.

Wynalazek niniejszy jest oparty na nieoczekiwanym odkrycniu termicznie stabilnej CDazy z drożdży piekarniczych. Analiza sekwencji aminokwasów tego enzymu nie ujawnia znacznej homologii ze znanymi sekwencjami innych białek.

Sposób wytwarzania stabilnej termicznie dezaminazy cytozynowej drogą rekombinacji polega według wynalazku na tym, że eukariotyczne lub prokariotyczna komórki-gospodarza transformuje aię rekombinantowym wektorem ekspresyjnym powodującym skuteczną ekspresję sekwencji nukleotydowej zasadniczo przedstawionej na fig, 10, po czym stransformowane komórki-gospodarza hodu je się w warunkach umożliwiających ekspresję tej nukleotydowej sekwencji i ze etrensformowanych wyhodowanych komórek-gospodarzy wyodrębnia się stabilną termicznie dezaminazę cytozynową

W sposobie według wynalazku jako komórki-gospodarze stosuje się komórki ssaków. W szczególnie korzystnym sposobie realizacji wynalazku stabilną termicznie dezaminazę cytozynowę wyodrębnia się z Saccharomyces cereyisiee.

Dodatkowe aspekty, korzyści i sposoby realizacji łatwo stanę się oczywiste dla zwykłych fachowców w tej dziedzinie techniki w świetle ujawnienie w niniejszym opisie.

W rysunkach stanowiących część niniejszego ujawnienia:

Figura 1 przedstawia analizę CDazy za pomocą SDS-PAGE /14% poliakryloamid w ' warunkach nieredukujących/. Substancje przedstawione na każdej ścieżce są jak następuje. Ścieżka 1 1 9 - białka markerowe j ścieżka 2 - supernatant autolityczny z etapu 1 w przykładzie Ij ścieżka 3 - produkt po wytrąceniu /NH4/2SO4 /70%/ w etapie 2 z przykładu I( ścieżka 4 produkt po wytrąceniu /NH4/2SO4 /50 - 73%/ w etapie 2 z przykładu I; ścieżka 5 - produkt otrzymany po chromatografii na Q-Sepharose w etapie 3 z przykładu I, ścieżka 6 - produkt po przeprowadzeniu przez kolumnę G-75 w etapie 4 z przykładu 1( ścieżka 7 - produkt po oczyszczeniu przy użyciu octyl-Sepharose w etapie 5 z przykładu I| ścieżka 8 - produkt finalny otrzymany po przeprowadzeniu przez drugą kolumnę G-75 w etapie 6 z przykładu I.

Figura 2 przedstawia profil elucjl CDazy z 1,5 x 100 cm kolumny Sephadex G-50.

/A/ 27 jednostek oczyszczonej CDazy zmieszano z 2 mg rybonukleazy A, 2 mg albuminy jaja kurzego, 1 mg chymotrypsynogenu A i eluowano PBS. Frakcje rejestrowano przy 280 na w celu oznaczenia zawartości białka całkowitego i przy 290 nm, przy zastosowaniu 5FC jako substratu, w celu oznaczenia aktywności CDazy. /B/ Eluacja CDazy z powyższej kolumny bez standardów do kalibracji.

Figura 3 przedstawia stabilność CDazy w temperaturze 37°C. CDazę /72 jednostki/mg/ w PBS /który zawierał, w stężeniu 1 mg/ml, bydlącą albuminę surowiczą bez zanieczyszczeń proteazami/ inkubowano w temperaturze 37°C w probówce polipropylenowej. Aktywność CDazy oznaczano w różnych odstępach czasu używając 10 /ul roztworu enzymu.

Figura 4 przedstawia profil CDazy oczyszczonej za pomocą chromatografii cieczowej wysokosprawnej /HPLC/. Odcinki poziome wskazują frakcje, które połączono do analizy sekwencji aminokwasów.

Figura 5 przedstawia analizę CDazy za pomocą SOS-PAGE po oczyszczeniu za pomocą HPLC /15% poliakryloamid w warunkach nieredukujących/. Ścieżka 1 - pula A, ścieżka 2 - pula B.

165 149

Figura 6 przedstawia częściową sekwencję aminokwasów CDazy. Wskazano peptydy otrzymane przez rozszczepienie CNBr /seria M/, endoproteinazę Glu-C /seria E/, endoproteinazę Lys-C /seria K/ i endoproteinazę Asp-N /seria D/.

Figura 7 przedstawia sekwencję nukleotydów starterów CDA4R1 i CDA5AS, odpowiednie sekwencje aminokwasów i względne pozycje tych starterów w sekwencji aminokwasów CDazy. CDA4R1 jest zorientowany w kierunku od 5' do 3' w nici sensownej, podczas gdy CDA5AS jest zorientowany w kierunku od 5' do 3' w nici antysensownej.

Figura 8 przedstawia sekwencję nukleotydów DNA z klonów genowych kodujących CDazę.

Figura 9 przedstawia otwarte ramki odczytu /ORF/ stwierdzone w genomowej sekwencji CDazy.

Figura 10 przedstawia sekwencję nukleotydów i odpowiednią sekwencję aminokwasów ORF 2. Dodatkowe aminokwasy, przewidywane na podstawie sekwencji nukleotydów , ale nie wykryte w sekwencjonowaniu peptydu są uwydatnione tłustą czcionką, a kodony START i STOP są ujęte w ramki.

Figura 11 przedstawia plazmidowy wektor ekspresyjny sprzęgacz” zawierający gen CDazy.

Figura 12 przedstawia mapę wektora pH3M.

W praktycznym zastosowaniu wynalazku stosuje się jeśli tego inaczej nie wskazano, zwyczajne techniki chemii białek, biologii molekularnej, mikrobiologii i technologii rekombinantowego DNA w zakresie znanym fachowcom. Techniki te są w pełni wyjaśnione w piśmiennictwie. Patrz np. R.K. Scopes, Protein Purlfication Principles and Practice, wyd. II /Springer-Verlag 1987/) Mathods in Enzymology /wyd. S. Colowick i N. Kaplan, Academic Press, Inc.,/i Maniatis, Fritsch i Sambrock, Molecular Cloning, - A. Laboratory Manual, wyd. II /1989/, Oligonuclectide Synthesis /wyd. M.J.Gait 1984/.

Przy opisywaniu wynalazku używa się następujących terminów. Dla stosowania ich tu definiuje się je jak wskazano poniżej.

Termicznie stabilna dezaminaza cytozynowa” odnosi się do COazy, która zachowuje co najmniej 50% aktywności w stanie wolnym, bez unieruchomienia, w ciągu ponad 12 godzin w temperaturze 37°C, korzystnie w okresie dłuższym niż 1 dzień w temperaturze 37°C i najkorzystniej przed ponad 3 dni w temperaturze 37°C, co ustala się za pomocą oznaczenia konwersji 5FC do 5FU w obecności wyodrębnionego enzymu w badaniu objaśnionym pełniej poniżej

Sekwencja aminokwasów lub białko jest zasadniczo jednorodne wobec innej sekwencji aminokwasów lub białka, gdy co najmniej około 50%, korzystnie około co najmniej 85% i najkorzystniej co najmniej około 90 - 95% aminokwasów odpowiada określonej długości częsteczki. Dodatkowo, zmiany dotyczące aminokwasów mogą obejmować podstawienia, delecje lub dodania

Termin funkcjonalny odpowiednik znaczy, że sekwencja aminokwasów lub białko określa łańcuch, który utworzy termicznie stabilny enzym, jak opisano powyżej, zdolny do konwersji 5-FC do 5-FU jak opisano w przykładach, białko, które jest funkcjonalnym odpowiednikiem termicznie stabilnej CDazy nie musi mieć dokładnie takiej /lub całkowitej/ sekwencji jak przedstawiona w figurach w niniejszym opisie. Białko, raczej. może istnieć jako biologicznie aktywny fragment tej sekwencji, o aktywności zdefiniowanej jak powyżej. Dodatkowo, białko może obejmować dodania, delecje lub podstawienia w powyższej sekwencji, w takim zakresie, w jakim białko to pozostaje biologicznie aktywne.

Oczyszczone białko zasadniczo nie zawiera innych materiałów. I tak np., białko A zasad' niczo nie zawiera B, gdzie 9 oznacza mieszaninę innych składników komórkowych 1 białek, gdy co najmniej 50% wag całości A + B, korzystniej co najmniej 75%, a najkorzystniej 90 - 95% i nawet 99% wag stanowi A. Oczyszczone nie odnosi się. jednak do metody, jaką białko otrzymano. Tak więc, oczyszczonym białkiem może być białko wytworzone technikami rekombinantowymi, wytworzone syntetycznie, albo wyodrębnione bezpośrednio z organizmu, w którym jest znajdowane w naturze.

Terminy polipeptyd i białko używane są w swoim rozszerzonym sensie, to jest oznaczają jakikolwiek polimer utworzony z aminokwasów /dipeptyd lub wyższy/ połączonych wiązaniami peptydowymi. Tak więc, terminy te obejmują oligopeptydy, fragmenty białka, analogi.

165 149 muteiny, białka sprzężone itp· Terminy obejmuję białka natywne i rekombinantowe·

Rekombinantowe białka lub polipeptydy odnoszę się do białek powstałych w wyniku ekspre sji rekombinantowej sekwencji nukleotydów, to jest wytworzonych przez komórki transformowane egzogenną konstrukcję ONA kodującą pożądany polipeptyd·

Termin rekombinantowy używany w niniejszym opisie charakteryzuje sekwencję nukleotydów kodującą CDazę i opisuje kwas nukleinowy pochodzenia genomowego, cDNA, półsyntetycznego lub syntetycznego, który z uwagi na swoje pochodzenie lub manipulację jest albo sekwencję nukleotydów nie występującą w naturze, albo sekwencję nukleotydów związaną z kwasami nukleinowymi innymi, niż kwasy z którymi jest związana w naturze·

Replikon jest to jakikolwiek element genetyczny, np. plazmid, chromosom, wirus,'który zachowuje się jako autonomiczna jednostka w replikacji polinukleotydów w komórce, tak więc jest on zdolny do replikacji pod swoją własną kontrolą·

Wektor jest replikonem, w którym przyłączony jest inny segment polinukleotydowy tak, aby doprowadzić do replikacji i/lub ekspresji przyłączonego segmentu· Wektor ekspresyjny odnosi się do wektora zdolnego do autonomicznej replikacji lub integracji, zawiera sekwencje kontrolne kierujące transkrypcją i translacją pożądanej sekwencji nukleotydów w organizmie odpowiedniego gospodarza·

Sekwencja kodująca jest sekwencję nukleotydów, która ulega transkrypcji i/lub translacji do polipeptydu·

Sekwencja promotorowa jest regionem regulatorowym zdolnym do przyłączania polimerazy RNA i inicjowania transkrypcji w dół, to jest w kierunku 3', sekwencji kodującej·

Sekwencja kodująca znajduje się pod kontrolą sekwencji promotorowej w komórce, gdy z przyłączenia polimerazy RNA do sekwencji promotorowej wynika translacja sekwencji kodującej· Następnie translacja powstałego mRNA daje w wyniku polipeptyd zakodowany w sekwencji kodującej·

Operatywnie połączony odnosi się do zestawienia, w którym komponenty są tak ułożone względem siebie, że pozwala to na ich zwykłe działanie· Tak więc, sekwencje kontrolne operatywnie połączone z sekwencję kodującą są zdolne do wywoływania ekspresji sekwencji kodującej·

Sekwencja kontrolne odnoszę się do tych sekwencji, które kontroluję transkrypcję i/lub translację sekwencji kodującej /sekwencji kodujących/· Mogę one obejmować, nie będąc do nich ograniczone, sekwencje promotorowe, transkrypcyjne sekwencje inicjacyjne i terminacyjne, oraz translacyjne sekwencje inicjacyjne i terminacyjne· Oprócz tego, sekwencje kontrolne odnoszą się do sekwencji kontrolujących przetwarzanie polipeptydu zakodowanego w sekwencji kodującej· Mogą one obejmować, nie będąc do nich ograniczone, sekwencje kontrolujące wydzielanie, rozszczepienie proteazaml i glikozylację polipeptydu·

Sekwencja sygnałowa może być włączona przed sekwencję kodującą· Ta sekwencja koduje peptyd sygnałowy, N-końcowy względem polipeptydu, który nadaje komórce-gospodarzowl tendencję do skierowania polipeptydu na powierzchnię komórek lub wydzielenia polipeptydu do otoczenia· Peptyd sygnałowy zostaje przez komórkę-gospodarza odszczepiony przez opuszczeniem przez białko komórki· Sekwencje sygnałowe można znaleźć w połączeniu z różnymi białkami natywnymi wobec prokariontów i eukariontów· I tak np· czynnikα, natywne białko drożdżowe, jest wydzielane z drożdży, a jego sekwencję sygnałową można przyłączyć do białek heterologicznych, które maję być wydzielone do podłoża/patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4546082/· Dalej, stwierdzono, że czynnik Ol i jego analogi biorą udział w wydzielaniu białek heterologicznych z rozmaitych drożdży, takich jak Saccharomycea i Kluyveromyces /patrz np· EPO Pub· nr 0 301 669, data opublikowania 1 lutego 1989/·

Transformacja jest to insercja egzogennego polinukleotydu do komórki-gospodarza· Egzogenny polinukleotyd może być utrzymywany jako plazmid, albo alternatywnie, może zostać zintegrowany z genomem gospodarza·

Rekomblnentowa komórka gospodarza, komórki-gospodarze, komórki i inne tego rodzaju terminy wskazujące drobnoustroje używane są wymiennie i odnoszą eię do komórek, które mogę być, lub powinny być użyte jako biorcy wektorów rekombinantowych i innego przenoszonego

165 149

ONA i obejmują potomstwo wyjściowej transfekowanej komórki. Rozumie się, że potomstwo pojedynczej komórki macierzystej niekoniecznie musi być całkowicie identyczne pod względem genomowego, lub całkowitego zespołu ONA z wyjściową komórką macierzystą z powodu przypadkowej lub zamierzonej mutacji. Tak więc, terminy te oznaczają potomstwo komórki macierzystej, które jest do niej wystarczająco podobne, aby zostać scharakteryzowane przez istotną właściwość, na przykład zastąpienie natywnego genu, kodującego zasadniczy enzym, genem klonowanym, połączonym z genem struktury kodującym pożądany produkt genu.

Terapeutycznie skuteczna ilość CDazy jest to taka ilość, która, gdy zostanie podana wraz z substratem, na który CDaza działa, jest wystarczająca do konwersji substratu w aktywny czynnik cytotoksyczny, który może z kolei hamować wzrost komórek nowotworowych.

Wynalazek jest ukierunkowany na sposób wytwarzania termicznie stabilnej dezaminazy cytozynowej wyodrębnianej z drożdży. Ta CDaza wykazuje właściwości, które odróżniają ją od pierwotnie wyodrębnionych z drożdży enzymów o charakterze CDazy. Masa cząstaczkowa ostatnio wyodrębnionej drożdżowej CDazy wynosi około 32 kilodaltonów, jak to oznaczono za pomocą chromatografii żelowej. SDS-PAGE wykazuje główne pasmo przy 17 kilodaltonach wskazując, że obecna CDaza stanowi dimer z każdą z podjednostek o masie cząsteczkowej około 17 kilodaltonów.

Oprócz tego, podczas gdy poprzednio wyodrębnione enzymy drożdżowe o charakterze CDazy były, jak wykazano, w wysokim stopniu termolabilne w temperaturze 37°C, oczyszczony enzym wytworzony sposobem według wynalazku jest stabilny w tej temperaturze. Dalej, sekwencja aminokwasów nowej CDazy nie wykazuje znacznej sekwencyjnej homologii z innymi znanymi, sekwencjonowanymi białkami. Klonowania i ekspresja genu kodującego tę unikalną CDazę dostarcza sekwencji kodującej o długości około 474 par zasad, wyznaczającej białko o 158 aminokwasach o przewidywanej masła cząsteczkowej wynoszącej około 17506 deltonów. Termicznie stabilną CDazę można wyodrębnić z drożdży, w tym należących do askosporotwórczych, bazydiosporotwórczych i drożdży niedoskonałych. Korzystnie, CDazę wyodrębnia się z organizmów należących do rodziny Saccharomycetoideas, przy czym korzystne są gatunki należące do Saccharomyces, a szczególnie korzystne są Saccharomyces cerevisiae /drożdże piekarnicze/. Stwierdzono, że drożdże prasowane Fleishmanna są doskonałym źródłem termicznie stabilnej CDazy i są łatwo handlowo dostępne w piekarniach i sklepach spożywczych.

Obecny sposób oczyszczania CDazy wytwarzanej sposobem według wynalazku różni się od sposobów, o których donoszono /patrz np. Katsuragi i in., 1987/t Katsuragi i in., 1986} Ipata i in., 1978; Ipata i in., 1971/, jak również od sposobu Katsuragi /1988/. Specyficznie, w sposobie tym występuję różne stepy oczyszczania, w tym dodatkowo żelowo-permeacyjne oczyszczanie na kolumnie, między etapami anlonitowej i hydrofobowej chromatografii /opisanymi poniżej/ jak również odmienne warunki oczyszczania, w tym różne bufory, wartości pH i składniki buforów, takie jak EDTA i DTT. Oprócz tego, poprzednie sposoby nie okazuję się pomocne w odniesieniu do termicznie stabilnego enzymu.

Pierwszy etap oczyszczania termicznie stabilnej CDazy z drożdży związany jest z rozbiciem komórek drożdży w celu otrzymania autolizatu zawierającego CDazę. Autolizę można uzyskać stosując jakąkolwiek z kilku metod znanych w tej dziedzinie techniki. I tak np. komórki drożdży można poddać plazmolizie z użyciem toluenu, metodę Kunitza /1947/. Szczególnie użyteczna jest ekspozycja drożdży na rozpuszczalnik organiczny, taki jak octan etylu, a następnie dodanie buforu dla utrzymania roztworu w pH około 7. Do odpowiednich buforów należy bufor z fosforanem potasu, roztwór soli buforowany fosforanami, bufor Tris, jak również kilka innych, dobrze znanych w tej dziedzinie techniki. Bufor korzystnie zawiera siarczan amonowy w stężeniu 1 - 25%, korzystnie 15%, jak również EDTA i ditiotreitol /DTT/ w celu stabilizacji CDazy. Alternatywnie, EDTA i DTT mogą zostać wyeliminowane z tego i następnych buforów. Stężenie EDTA, w razie jej obecności, mieści się w zakresie 0,1 - 10 mM, przy korzystnym stężeniu 5 mM, podczas gdy DTT może być obecny w stężeniu 0,01 - 10 mM, przy korzystnym stężeniu 0,1 mM. Tą mieszaninę miesza się w ciągu kilku dni, utrzymując pH około 7. Komórkowy debris można usunąć za pomocą odwirowania.

Po autolizie białko całkowite wytrąca się z autolizatu z użyciem siarczanu amonowego, który dodaje się do stężenia wystarczającego do uzyskania wyższego stosunku CDazy do białka.

165 149

I tak np., siarczan amonowy można najpierw dodać do osiągnięcia 60 - 80% nasycania, korzystnie 70% nasycenia. EDTA korzystnie włącza się do mieszaniny reakcyjnej w stężeniu 1 - 3 g/ litr, korzystnie 1,5 - 2,0 g/lltr, dopuszcza się, aby reakcja zachodziła w ciągu kilku godzin i zbiera się osad po odwirowaniu. Osad rozpuszcza się w odpowiednim buforze, takim jak PBS przy pH około 7, przy czym bufor korzystnie zawiera EDTA i DTT, jak powyżej. Roztwór dializuje się wobec tego samego buforu. Na dializat można podziałać drugi raz siarczanem amonowym, w celu osiągnięcia stężenia około 50%, w obecności EDTA jak powyżej. Osad ponownie zbiera się za pomocą odwirowania i do supernatantu dodaje siarczan amonowy do osiągnięcia około 73% nasycenia. Osad zbiera się i rozpuszcza w odpowiednim buforze o pH około 6,6 - 8,5, korzystnie w buforze Tris o pH 8,0, zawierającym DTT w stężeniu wyżej opisanym. Rekonstytuowany osad dializuje się następnie wobec tegoż buforu w ciągu kilku godzin. CDazę z dializatu można dalej oczyszczać za pomocą chromatografii na anionióie stosując np. sieciowaną agarozę lub celulozowy materiał do upakowania. Szczególnie użyteczne są anionity, takie jak Q-Sepharose i DEAE-Sepharose, dostępne z firmy Pharmacia. Do odpowiednich buforów równoważących należy np. bufor Tris lub bufor fosforanowy, z przeprowadzeniem elucji liniowym gradientem. Szczególnie stosowne jest użycie 20 mM Tris zawierającego 0,1 mM DTT przy pH 8,0 z liniowym gradientem O - 03 M KCl w tym buforze.

Po chromatografii na anionicie, frakcje wykazujące aktywność CDazy /oszacowaną jak opisano poniżej/ zbiera się i zatęża za pomocą ultrafiltracji, stosując np. filtr z odcięciem przy masie cząsteczkowej około 30000 daltonów, lub niższej.

Następnie, roztwór zawierający CDazę przenosi się na kolumnę żelowo-permsacyjną. Szczególnie użyteczny jest sieciowany dekstran, agaroza lub żele dekstran/bisakryloemid, przy czym korzystne są Sephadex G-75, G-100 lub Sephacryl S-300. Eluantem może być każdy zwykły bufor, dobrze znany w tej dziedzinie techniki, o pH około 7, przy czym korzystny jest PBS zawierający DTT jak uprzednio opisano. Frakcje wykazujące aktywność CDazy łączy się i dializuje wobec buforu takiego jak bufor z fosforanem potasowym. Korzystnie, bufor zawiera 1 - 2 M siarczan amonowy oraz EDTA i DTT jak opisano powyżej w odniesieniu do buforu do autolizy. Można przeprowadzić drugi rozdział na kolumnie żelowo-permeacyjnej, jeśli jest to pożądane, i zatężyć aktywne frakcje za pomocą ultrafiltracji, stosując filtr z odcięciem przy masie cząsteczkowej np, 5000 daltonów.

Następnie materiał zawierający CDazę można nanieść na kolumnę, która rozdziela substancje w oparciu o hydeofobowość i eluować np. odwróconym gradientem siarczanu amonowego w buforze z fosforanem potasowym. Frakcje wykazujące aktywność CDazy łączy się i zatęża za pomocą ultrafiltracji stosując filtr z odcięciem przy masie cząsteczkowej 5000 dalton. Koncentrat można przechowywać- zamrożony do dalszego użycia. Jednak jeżeli nie przeprowadzono rozdziału na drugiej kolumnie żelowo-permeacyjnej i aktywność właściwa CDazy jest niska, można przeprowadzić rozdział na innej kolumnie żelowo-permeacyjnej, jak opisano powyżej. Tak oczyszczona CDaza jest termicznie stabilna i może wobec tego być przechowywana, w etanie zamrożonym lub zliofilizowana, w wolnej postaci.

Aktywność CDazy można kontrolować podczas oczyszczania kilkoma metodami znanymi w tej dziedzinie techniki. I tak np,, konwersję cytozyny do uracylu, albo jego pochodnych w obecności CDazy można kontrolować w bezpośrednim badaniu spektrofotometrycznym ze spadku absorbancji przy 286 nm po konwersji. /Patrz np. Ipata i Carcignani, 1976/. Alternatywnie, aktywność można określić za pomocą kontrolowania konwersji 5FC do SFU spektrofotometrycznie jak opisali Nishyama i in./1985/, co włączono do niniejszego opisu Jako odnośnik.

Termicznie stabilną CDazę oczyszczoną w ten sposób sekweicjonowano jak opisano w części eksperymentalnej i częściowa sekwencja aminokwasów przedstawiona jest na fig. 6. Sekwencje nie wykazuje zasadniczej homologil z innymi sθkweicjonowβnymi białkami. Na podstawie tych informacji termicznie stabilną CDazę można wytwarzać technikami ^kombinatowymi. X tak np., sekwencje DNA kodujące CDazę można otrzymywać syntetycznie w oparciu o otrzymaną sekwencję aminokwasów, stosując odpowiednie kodony. Na ogół selekcjonuje się korzystne kodony ze względu na przewidywanego gospodarza używanego do ekspresji CDezy. Całkowitą sekwencję montuje się z zachodzących na siebie nukleotydów otrzymanych metodami standardowymi. Patrz np, Edge, Nature,

165 149

292, 756 /1981/( Nambair i in., Science, 223, 1299 /1984/t Jay i in., J. Biol. Cham.,

259, 6311 /1984/.

Alternatywnie, rekombinantową, termicznie stabilną CDazę można otrzymać jak następuje. Sondy oligonukleotydowe zawierające kodony dla części oznaczonej sekwencji aminokwasów można otrzymać i użyć do screeningu zbiorów genomowych lub cDNA pod względem genu kodującego CDazę, Zasadnicze strategie otrzymywania sond oligonukleotydowych i zbiorów DNA, jak również przeprowadzanie ich screeningu przez hybrydyzację kwasów nukelinowych, są dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie techniki. Patrz np. Oligonucleotide Synthesis, wyżej; T. Maniatis i in., wyżej i gdy klon z poddanego screningowi zbioru zidentyfikowano na podstawie pozytywnej hybrydyzacji, można przeprowadzić analizę enzymami restrykcyjnymi i screening DNA w celu potwierdzenia, że określony insert ze zbioru zawiera gen kodujący CDazę, Dodatkowo polimeryzowej reakcji łańcuchowej /PCK/ można użyć do amplifikacji i następnie wykrycia sekwencji nukleotydów kodującej CDazę. Metoda jest opisana przez Salki i in., /1986/ oraz w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 4683195 i 4683202, które to ujawnienia włączono do niniejszego opisu jako odnośnik. Analizę sekwencji nukleotydów PCR-amplifikowanych produktów można przeprowadzić za pomocą bezpośredniej analizy sekwencji jak opisali Saiki 1 in. /1988/. Alternatywnie, amplifikowaną docelową sekwencję /sekwencje/ można klonować przed analizę sekwencji. Metoda bezpośredniego klonowania i analizy sekwencji enzymatycznie amplifikowanych segmentów genomowych opisana została przez Scharfa i in. /1986/. W metodzie tej, startery użyte w technice PCR są zmodyfikowane blisko ich końca 5' w celu wytworzenia dogodnych miejsc restrykcyjnych do klonowania bezpośrednio do np. wektora sekwencjonującego M13. Po amplifikacji produkty PCR rozszczepia się odpowiednimi enzynami restrykcyjnymi. Fragmenty restrykcyjne liguje się do wektora M13 i transformuje nim np. gospodarza IM103, nanosi na płytki i powstałe łysinki poddaje screeningowi na drodze hybrydyzacji ze znakowaną sondę oligonukleotydową. Inne metody klonowania i analizy sekwencji są też znane w tej dziedzinie techniki.

W szczególnie korzystnym sposobie realizacji wynalazku zsyntetyzowano dwa startery oligonukleotydowe przy zastosowaniu częściowej sekwencji aminokwasów i modelu użycia kodonów przez S. cereyisiae /Guthrie i Abelson, 1982/ jako klucza do wyznaczania sekwencji guessner* sekwencji DNA. Tych starterów użyto do PCR, w której klonowany drożdżowy zbiór genomowego DNA był obecny jako matryca. Oligonukleotydy syntetyzowano z regionów CDazy, w których aminokwasy wykazują znaczniejszą tendencję w zużytkowaniu kodonów i/lub silej degeneracji. Pierwszy starter, CDA4R1, był to 42-mer zawierający 33 nukleotydy odpowiadające eminowemu końcowi sekwencji aminokwasów, podczas gdy drugi, CDA5AS, zawierał nukleotydy komplementarne z sekwencją znajdującą się blisko karboksy-końca białka. Sekwencja tych oligonukleotydów przedstawiona jest na fig. 7.

Jako matryca DNA w reakcjach PCR wykorzystano dwie genomowe biblioteki i stwierdzono, że obie dały pojedyńczy określony fragment, w przybliżeniu o długości 350 par zasad, wymiar przewidziany na podstawie dostępnej odpowiedniej sekwencji aminokwasów. Primery PCR obrobiono za pomocą EcoRI miejsc restrykcyjnych na ich 5' końcach aby ułatwić klonowanie fragmentów generowanych przez PCR.

Fragment pochodzący z PCR o 350 parach zasad oczyszczono za pomocą elektroforezy żelowej, po czym subklonowano go do właściwego wektora do ustalania sekwencji DNA. Fragment pochodzący z PCR wykorzystano również jako swoistą sondę CDazy dla skriningu bibliotek drożdży za pomocą technik hybrydyzacji kolonii na filtrze. Początkowa usiłowania wykorzystania oligonukleotydów o przypadkowej długości jako sond nie powiodły się z powodu niskiego stosunku sygnał izakłócenia po hybrydyzacji. Zebrano wszystkie potencjalne klony i dwukrotnie je reskriningowano w celu sprawdzenia sygnału pozytywnej hybrydyzacji.

Plazmidy oczyszczono z pojedynczych klonów i restrykcje odwzorowano przez trawienie za pomocą serii enzymów restrykcyjnych zarówno w pojedynczych jak i w różnych reakcjach wielokrotnego trawienia. Oba, klonowane fragmenty z PCR i genomowe klony kodujące CDazę poddano analizie sekwencji DNA. Zmiany warunków reakcji pozwoliły na analizę sekwencji bezpośrednio przylegających do primeru jak i tych oddalonych o kilka setek par zasad. Uzyskaną sekwencję

165 149

ONA przedstawiono na rysunku 8. Jak można zauważyć sekwencje są homologiczna w 93% posiadając 23 nukleotydy niezgodne i 330 nukleotydy zgodne. ORF-y znalezione w tej sekwencji pokazano na rysunku 9. Rysunek 10 przedstawia sekwencję nukleotydu i przewidzianą sekwencję aminokwasu z ORF 2, potwierdzającą uprzednio określoną sekwencję aminokwasu i przewidującą dodanie tylko kilku aminokwasów do któregokolwiek końca cząstkowej sekwencji uzyskanej za pomocą analizy oczyszczonego białka.

Dane sekwencji DNA wykorzystano następnie do projektowania nowych primerów PCR dla generowania wzmocnionych kasetek ONA kodujących CDazę. Takie kasetki można stosować w konstruktach genetycznych zaprojektowanych do produkcji wysokich poziomów ekspresji genów w którychkolwiek prokaryotycznych lub eukaryotycznych komórkach oraz do generowania fuzji genowych między CDazę a innymi cząsteczkami interesującymi z punktu widzenia biologii, lecz nieograniczonymi do cząsteczek immunoglobulin wycelowanych w antygeny raka. Sekwencją kodującą CDazę można klonować w jakikolwiek wektor lub replikon dobrze znany w tej dziedzinie wiedzy.

Przykłady wektorów będących produktami rekombinacji DNA służących do klonowania oraz komórek gospodarzy, które mogą one przekształcać, w nawiasach, obejmują bakteriofagi lambda /E. coli/, pBR322 /E. coli/, pACYCl77 /E. coli/, pKT230 /bakterie gram-ujemns/, pCVll06 /bakterie gram-ujemne/, /pLAFRl /bakterie gram-ujemne/, pME290 /nie- E.coli bakterie gramujemne/, pHVl4 /E.coli i Bacillus eubtilis/, pBD9 /Bacillue/, pIJ6l /Streptomyces/, pUC6 /Streptomyces/, YIp5 /Saccharomyces/, YCp19 /Saccharomyces/, oraz wirus brodawczaka wołowego /komórki ssaka/.

Sekwencję kodującą białko CDazy można umieścić pod kontrolą promotora, miejsca więżącego rybosom /dla ekspresji bakteryjnej/ i alternatywnie operatora /zbiorczo określonych tutaj Jako elementy kontrolne, tak aby sekwencja ONA kodująca białko była skopiowana w RNA w komórce gospodarza przekształconej przez wektor zawierający tę konstrukcję ekspresji. Sekwencja kodująca może lub nie może zawierać peptyd sygnalny lub sekwencję wiodącą. Sekwencje wiodące można usuwać za pomocą bakteryjnego gospodarza w obróbce potren^lt^^^jnej.

Patrz np, patent USA nr 4431739, 4425437, 4338397.

Dodatkowo, oprócz sekwencji kontrolnych, pożądane może być dodanie sekwencji regulacyjnych, które pozwalają na regulację sekwencji wyrażających CDazę zależnie od wzrostu komórki gospodarza. Sekwencje regulacyjne są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie wiedzy i przykłady zawierają te, które powoduję włączanie lub wyłączanie ekspresji genu w odpowiedzi na chemiczny lub fizyczny bodziec, w tym obecność związku regulacyjnego. Inne typy elementów regulacyjnych, na przykład sekwencje wzmacniające również mogę być obecne w wektorze. Wektor ekspresyjny jest tak skonstruowany aby sekwencja kodująca CDazę była umieszczona w wektorze z właściwymi sekwencjami regulacyjnymi, usytuowanie i orientacja sekwencji kodującej w odniesieniu do sekwencji kontrolnej są takie aby sekwencja kodująca była kopiowana pod kontrolą sekwencji kontrolnych /tzn. polimeraza RNA, które przyłącza się do cząsteczki DNA w sekwencjach kontrolnych kopiuje sekwencję kodującą/. Aby uzyskać ten koniec pożądana może być modyfikacja sekwencji kodujących CDazę. Na przykład, w niektórych przypadkach niezbędne może być modyfikowanie sekwencji tak aby mogła być ona przyczepiona z właściwą orientację do sekwencji kontrolnych to znaczy, aby zachować ramkę odczytu. Sekwencje kontrolne i inne sekwencje regulacyjne można podwiązać do sekwencji kodującej przed wprowadzeniem do wektora, tak jak wektory klonujące opisane wcześniej.

Alternatywnie sekwencję kodującą można klonować bezpośrednio w wektor ekspresji, który zawiera już sekwencje kontrolne i odpowiednie miejsca restrykcyjne.

W tej dziedzinie znana jest pewna liczba prokaryotycznych wektorów ekspresji. Patrz np. patenty USA nr 4440859, 4436815, 4431740, 4431739, 4428941, 4425437, 4418149, 4411994, 4366246, 4342832, zobacz również zgłoszenia patentowe Zjednoczonego Królestwa G3 2121054,

GB 2008123, GB 2007675, i Europejskie zgłoszenie patentowe 103395. Wektory ekspresyjne drożdży na również znane. Patrz np. patent USA nr 4446235, 4443539, 4430428, zobacz też Europejskie zgłoszenie patentowe 103409, 100861, 96491. Wektory ekspresyjne odnoszące się do ssaków są również znane.

165 149

W zależności od systemu ekspresji i wybranego gospodarza CDazę produkuje się hodując w warunkach ekspresji CDazy komórki gospodarzy przekształcone przez wektor ekspresyjny opisany powyżej. Później białko wyodrębnia eię z komórek gospodarzy i oczyszcza. Jeśli system ekspresji wydziela białko do środowiska hodowli, to może być one oczyszczane bezpośrednio z niego. Jeśli białko nie jest wydzielane, wyodrębnia się je z lizatów komórek. Dobór odpowiednich warunków hodowli oraz sposobów odzyskiwania są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.

Przykład jednego konstruktu do kontrolowanej indukcji sekwencji CDazy w drożdżach polega na wprowadzeniu kasetki CDazy do wektora drożdży zwanego fuzjonator. Wektor ten dostępny jest w Department of Cenetics, University of Washington, Seattle, Wachington, oraz w NIH. Taki konstrukt przedstawiony jest na rysunku 11. W konstrukcie tym CDazę wprowadza się do polilinkera, gdzie CDaza jest pod kontrolę silnego promotora z drożdży /Johnston, M. 1987/, który jest ściśle regulowany białkiem CALlO. Promotor CAL10 jest czuły na galaktozę, indukując pod jej kontrolę ekspresję genu o wysokim poziomie. Wektor ten można również wykorzystać do stworzenia fuzji CDeza-gen lac2 poprzez właściwe zmiany w sekwencji ONA. Białko generowane fuzję może ułatwić ilościowe określenie indukcji, oczyszczanie i biochemiczną analizę. Te konstrukty można transformować w dogodny szczep drożdży. Ten szczep drożdży zawiera pewną liczbę mutacji, które sprawiają, że jest on wskazany do stosowania z takim konstruktem jak opisano wyżej. Dokładniej, obecna jest mutacja gali powodująca deficyt dla enzymu, który katalizuje pierwszy etap utylizacji galaktozy zapobiegając w ten sposób wyczerpaniu w środowisku substancji indukującej /galaktozy/. Obecna jest również mutacja regi-501, która eliminuje represję glukozy ekspresji genowej galaktozy i pozwala na zakładanie kultur w warunkach optymalnych dla rozwoju i żywotności.

Indukcja może być łatwo osiągnięta przez-dodanie galaktozy do środowiska opartego na glukozie. Wreszcie w tym szczepie obecnych jest kilka mutacji z niedoborem proteazy, zwiększających stabilność jakichkolwiek białek heterologicznych lub ich fragmentów produkowanych w czasie wzrostu. Taki konstrukt ekspresji powinien ułatwiać wyodrębnianie i oczyszczanie CDazy z drożdży w ilościach wcześniej niemożliwych do osiągnięcia, stosując poziomy ekspresji uzyskane przy genie endogennym. Do stosowania w systemach kultur komórek ssaka można stworzyć inne konstrukty. W jednym korzystnym wcieleniu wynalazku kasetka kodująca CDazę przyczepiona jest przy użyciu technologii PCR do sygnalnego peptydu wydzielania onkostatyny M /Malik, 1989/ i może być później wprowadzona do wektora ekspresyjnego odnoszącego się do ssaka pH3MPy /Stamenkovic, /1990/, który zawiera właściwe wzmacniacze, promotory, zakończenia i sygnały obrabiające dla ekspresji ssaka. Konstrukt można transfektować w komórki COS /Aruffo i Seed, 1987/, zebrane środowisko kultury pozbawione surowicy i zanalizować pod względem aktywności CDazy w systemie pozbawionym czynności enzymu endogennego. Podobnie, konstrukty cDNA do fuzji genów między CDazą i innymi cząsteczkami będącymi przedmiotem zainteresowania można konstruować za pomocą standardowych technik, transfektować do komórek COS a ekstrakty komórek lub ciecze znad osadów można analizować pod względem białek i ich czynności.

Inne fuzje genów mogę również znaleźć zastosowania w rekombinacyjnej prpdukcji CDazy.

Na przykład sekwencja nukleotydowa kodująca CDazę lub funkcjonalny mutant albo jej fragment może być przyłączony do cząsteczek immunoglobulity kodujących cDNA wymierzonych w antygeny raka, aby stworzyć fuzyjne białko przeciwciało-enzym. Uzyskano monoklonalne przeciwciała, które rozpoznają determinanty korzystnie ulegające ekspresji w komórkach raka. /Hellatrom, 1984/. Zatem, można stworzyć białka fuzyjne, któro specyficznie celuję w wybrane komórki raka. Patrz np. patent USA nr 4906562 i Hallstrom 1985. Enzym może działać bezpośrednio na siedlisko komórki raka aby zmienić prolek 5FC w przeciwrakowy czynnik 5FU. Genomowe fuzje między genami kodującymi enzym, będący obiektem zainteresowania a przeciwciałem wymierzonym w komórki raka eliminuję konieczność chemicznego sprzężenia dwóch białek. Podobnie, konstrukty cDNA między dwiema cząsteczkami będącymi przedmiotem zainteresowania mogą zwiększyć giętkość takich konstruktów w systemach ekspresji hoterologicznaj.

165 149

W jednym systemie cDNA ciężkiego łańcucha, przeciwciała raka uzyskuje się z produkujących je linii komórek. Fragmenty PCR kodujące całość lub części tego cDNA można generować stosując dobrze znane w tej dziedzinie sposoby. Fuzję dwóch kasetek w ramce można uzyskać w kilku położeniach stosując standardowe techniki a powstałe fuzje zbadać pod względem produkcji białek o pożądanej czynności biologicznej. Kotransfekcja z drugim plazmidem niosącym cDNA kodujące lekki łańcuch będący częścią cząsteczki przeciwciała pozwala na wyodrębnienie fragmentu przeciwciała czynnego biologicznie poddanego fuzji z enzymem czynnej CDazy. Zatem będzie można osiągnąć wycelowanie enzymu w pożądane miejsce. Produkcja mutantów lub analogów stabilnej termicznie CDazy jest również pożądana, z tym, że muszą być one funkcjonalnie z nią równoważne. Można je wytworzyć wymazując część sekwencji kodującej CDazę, wprowadzając jakąś sekwencję, i/lub przez podstawienie jednego lub więcej nukleotydów w sekwencji. Specjaliści w tej dziedzinie dobrze znają techniki modyfikowania sekwencji nukleotydu, takie jak skierowana w określone miejsce mutageneza albo mutageneza nukleotydu PCR.

CDazę będącą przedmiotem niniejszego wynalazku syntetyzuje się chemicznie stosując takie syntezy jak synteza peptydów w fazie stałej i znane sekwencje aminokwasów, bądź też sekwencja aminokwasów pochodzących z sekwencji DNA genu będącego obiektem zainteresowania.

Takie sposoby znane są osobom wyszkolonym w tej dziedzinie. Termicznie stabilną CDazę można stosować jako środek chernotarapeutyczny. A dokładniej, enzym ten można użyć in vivo do przemiany proleku 5FC w środek przeciwrakowy 5 FU. CDazę można więc podawać wspólnie z 5FC poprzez chirurgiczne wprowadzenie CDazy przy lub blisko siedliska raka i doustne podawanie 5FC, jak to opisał Katsuragi 1987, w pracy której tytuł można znaleźć w odnośnikach. Alternatywnie, enzym można dostarczać do siedliska raka przez wycelowanie dostarczania kompleksu COaza/przecitjciało, na raka przy zastosowaniu przeciwciał specyficznych dla tych typów raka. Kompleks ten można wytworzyć sposobami chemicznymi, lub genetycznie konstruując fuzje genów między właściwym genem immunoglobulinowym i genem CDazy, jak to opisano wcześniej. Poniżej zamieszczono przykłady szczegółowych zastosowań niniejszego wynalazku. Mają one na celu jedynie zilustrowanie go a nie ograniczenie jego zakresu w jakikolwiek sposób.

Przykład I. Oczyszczanie enzymu, oznaczanie czynności i charakteryzacja CDazy.

CDazę oczyszczono za sprasowanych drożdży piekarskich Flelshmann^ stosując następujący sposób. Wszystkie etapy oczyszczania przeprowadzono w 4°C. Czynność enzymu oznaczono za pomocą 5' fluorocytozyny /5FC/ przy 3 mM w roztworze soli zbuforowanym fosforanem /PBS/ w 37°C /Nishiyama, 1985/. Po dodaniu roztworów enzymu przebieg reakcji śledzono spektrofotometrycznie na podwielokrotnych częściach próbek, w których przerwano reakcję stosując 0, 1 N roztwór HCl. Do zmierzenia ilości utworzonego 5-fluorouracylu /5FU/ wykorzystano stosunek absorbancjl 255/290. Jednostkę czynności enzymu zdefiniowano jako 1 mol utworzonego 5FU na minutę w 37°C. Stężenie białka zmierzono stosując analizę BCA dostępną w Pierce /Rockford, II/. Do monitorowania składu białka po każdym etapie oczyszczania wykorzystano SOS-PAGE.

Etap 1. Wytwarzanie autolizatu drożdży.

Drożdże piekarniane /2,25 kg/ dodano do octanu etylu /225 ml/, po czym mieszano 30 minut. Następnie przy pH 7,2 dodano 2,25 1 50 mM buforu foeforanu potasu zawierającego 15% siarczanu amonu oraz 5 mM EDTA i 0,1 mM ditiotreitolu /DTT/. Po 3 dniach mieszania i doprowadzania codziennie pH do wartości 7,2 za pomocą stałego trihydroksymetyloaminometanu /Trie/, usunięto resztki komórek przez trwające 15 ninut odwirowanie przy 10000 rpm.

Etap 2. Frakcjonowanie siarczanem amonu

Z cieczy sklarowanej osadem z etapu 1 wytrącono całe białko dodając EDTA /1,8 g/l/ i siarczanu amonu /371 g/l/, tak, aby stężenie siarczanu amonu było równe pod koniec 70% roztworu nasyconego. Roztwór trzymano 16 godzin w 4°C, po czyn osad zebrano po odwirowaniu. Grudkę rozpuszczono w 1,5 l 50 mM roztworu buforowego fosforanu potasu przy pH 7,2 zawierającego 5 mM EDTA i 0,1 mM DTT, a następnie przez około 12 do 16 godzin poddawano go dializie. Do dializatu dodano EDTA /1,8 g/l/ i siarczanu amonu w takiej ilości aby osiągnąć 50% nasycenia /314 g siarczanu amonu/litr dializatu/. Po 1 godzinie strącony osad odwirowano i do sklarowanej cieczy dodano dodetkowę porcję siarczanu amonu aby jego końcowa stężenie wynosiło 73% nasycenia. Strącony osad zebrano, rozpuszczono w 1 litrze 20 mM roztworu

165 149 buforowego Tris przy pH 8,0 zawierającego 0,1 mM DTT i przez około 12 do 16 godzin poddawano go dializie.

Etap 3. Chromatografia

Dializat z etapu 2 naniesiono na kolumnę 4,8 x 25 cm Q-Sepharosa /Pharmacia/, którą zrównoważono w 20 mM Tris zawierającym 0,1 mM DTT, przy pH 8,0. Po przemyciu kolumny wymywano enzym stosując powyższy bufor o linearnym gradiencie 0-0,3 M KCl. Frakcje zawierające CDazę zlano i zatężono przez ultrafiltrację /Amicon, PM 30-filtr/ do, w przybliżaniu 15 ml.

Etap 4. Chromatografia żelowa

Roztwór z etapu 3 zawierający CDazę naniesiono na kolumnę G-75 Sephadex /2,5x100 cm/ i eluowano stosując PBS zawierający 0,1 mM DTT. Frakcje z CDazę zlano i poddano dializie w 4 litrach 100 mM roztworu buforowego fosforanu potasu zawierającego 1,8 M siarczanu amonu, mM roztwór EDTA oraz 0,1 mM DTT, przy pH 7,0.

Etap 5, Chromatografia hydrofobowa

Materiał z etapu 4 naniesiono na kolumnę /2,5x15 cm/ oktyl-Sepharose /Pharmacia/, którą zrównoważono 100 mM fosforanu potasu zawierającego 1,8 M siarczanu amonu, 5 mM EDTA i 0,1 mM DTT, przy pH 7,0. Kolumnę przemyto tym buforem, a enzym eluowano stosując linearny gradient 1,8-0 M siarczanu amonu w powyższym buforze fosforanowym. Frakcje zawierające CDazę połączono i zatężono przez ultrafiltację /Amicon, filtr YM5/.

Etap 6. Chromatografia żelowa

Końcową filtrację żelową materiału z etapu 5 wykonano na kolumnie G-75 Sephadex stosując jako eluent PBS w sposób opisany w etapie 4. Oczyszczony enzym zatężono przez ultrafiltrację i przechowywano w -70°C.

Rezultaty oczyszczania w każdym etapie są zamieszczone w tabeli 1. Profile SDS-PAGE służące do kontrolowania składu białka po każdym stenie oczyszczania podano na rysunku 1. Końcowy preparat enzymu składał się z głównego pasma przy około 17 kDa oraz pasma mniejszego występującego przy około 19 kDa.

Tabela 1

Oczyszczanie CDezy otrzymanej z 2,25 kg drożdży piekarnianych

L........ ......... ! Etap	| Białko J sumaryczi nie ! /«g/1	1 1 1 1 1 1 1 1	Czynność sumaryczna /U/2	1 1 1 1 1
Czynność właściwa /U/mg/	J Stopień J J oczyszcze- J ! nia ! 1 | 1 | 1 |
i ekstrat pozbawiony	1 i 120000	1 1 1		T		— -y----------— 1 1	---1
{ komórek	1 1	1750		0,014	j 1
i /NH4/2so4	{ 36000 |	1 1 |	1274		0,035	2,5
i Q-Sepharosa	! 4200 1	1 1 1	685		0,16	i 11,4
J G-5 Sephadex	! 184 1	1 1 1	648	1 1	3,5	i 250 1
J Oktyl-Sepharose	' 20	1 1 1	495	1 1 1	25	J 1800
| G-75 Saphadex	S 6 .....o...........	1 .4.	394	1 1 ..u.	67	J 4800

^Stężenie białka oznaczono za pomocą BCA /Pierce/. o jednostkę czynności enzymu zdefiniowano jako 1 μ/mol 5 FU utworzonego w ciągu jednej minuty w 37°C.

Masę cząsteczkową CDazy wyznaczono nanosząc oczyszczony enzym na kolumnę G-60 Saphadex razem z rybonukleazą A /13,7 kDa/, chymotrypβynogana/ A /25 kDa/ i albuminę jaja kurzego /43 kDa/, Frakcje kontrolowano przy 280 nm aby zmierzyć białko sumaryczna i czynność CDazy przy zastosowaniu 5FC jako substratu. Czynność enzymu CDazy skoncentrowała się przy w przybliżeniu 32 kDa /Rysunek 2A/. Enzym eluowano dokładnie w takiej samej objętości w jakiej go naniesiono na kolumnę bez wzorców kalibracyjnych /rysunek 2B/.

165 149

Stabilność oczyszczonej CDazy w 37°C w roztworze soli zbuforowanej fosforanom przy pH 7,2 oznaczono za pomocą 5 FC jako substratu. Zaobserwowano niewielkie zmniejszenie czynności enzymu po przedłużonej inkubacji /rysunek 3/. W tych warunkach czynność enzymu obniżyła się o połowę po upływie 5,2 dnia. W pierwszych 4 godzinach inkubacji nie zachodziło widoczne zmniejszenie czynności enzymu /rysunek 3/.

Przykład II. Sekwencja aminokwasów w CDazie

Reagenty wykorzystane przy ustaleniu sekwencji CDezy uzyskano z Apolied Biosystems, Inc. Rozpuszczalniki stosowane w HPLC o odwróconych fazach pochodziły z firmy Budrick and Jackson. 4-winyloplrydyna pochodziła z Aldrich Chemical Co, CNBr z Kodak i wszystkie inne substancje chemiczne miały stopień czystości odczynników. Endoproteinazę Glu-C z Stephylococcus sureus uzyskano w Miles Lebαratαries. Enkoproteinazę Asp-N z Pseudwmwkap fragi i endoproteinazę Lys-C otrzymano w Boehringer Yannheim.

Automatyczną analizę sekwencji wykonano na aparacie /ABI/ model 475A stosując programy RUN470-L lub PRC470-L, Przed naniesieniem próbki użyto 1,5 mg BioBrena /ABI/ i poddano go dwum lub trzem precyklom degradacji Edman'a. Konwersja pochodnych tiazolinonu do fenylotiohydantoino aminokwasów została przeprowadzona za pomocą 25% TFA w 61°C. Fenylotrohydantoinowe pochodne aminokwasów rozdzielono za pomocą HPLC o odwróconych fazach na kolumnie PTH C1B /2,1x220 mm, ABI/ stosując jako bufor rozpoczynający roztwór buforowy octanu sodu zawierający 5% /objętość/ objętość/tetrahydrofuranu a jako bufor ograniczający acetonitryl zawierający 500 nM dlmetylofenylotiamacznika /ABI/. Wykorzystano analizator 9/ABI/ model 120A PTH. CDazę i fragmenty białka oczyszczono za pomocą HPLC o odwróconych fazach na urządzeniu do rozdzielania model 130A /Apolied Biosystems, Inc./. Rozdzielanie przeprowadzono w 40°C na kolumnie RP-300 /2,1x30 mm, ABI/. Do wymycia białek i fragmentów peptydowych stosowano liniowy gradient 0-60% acetonitrylu w 0,1% wodnym roztworze kwasu tr^^o^o^owego /TFA/ w czasie 2 godzin z prędkością 0,1 ml/minutę. Peptydy CNBr, endoproteinazę Lys-C, oraz peptydy endoproteinezy Clu-C i endoproteinazy Asp-N użyto w analizie sekwencji bez dalszego oczyszczania.

Reakcja CDazy z 4-winylopirydyną

CDaza z przykładu 1 etap 6 została zmodyfikowana przez dodanie 4-winylopirydyny w następujący sppoób. CDazę zredukowano za pomocą 20 mM ditiotreitolu w 0,1 ml 0*4 M buforu Tris-HCl, pH 8,5, zawlerajęcθga 6 M roztwór guanidyna-HCl, 0,1% NS2EDTA. Reakcję prowwadOo no 2 godziny w 50°C. Następnie dodano 100 mM 4-winylopirydyny i pozostawiono na całą noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną zakwaszono do pH 2,0 stosując 20% TFA, po czym ją odpolwno i oczyszczono za pomocą HPLC o odwróconych fazach jak to opisano wcześniej. Analiza HPLC powstałych produktów wykazała obecność dwóch wyraźnych pików /rysunek 4/, które rozdzielono i ponownie analizowano przy użyciu SDS-PAGE /rysunek 5/. Mniejszy pik odpowiadał pasmu 11 80a /ρ^β 8A 8 8rysukk 1, a pik większy odpowiadał pasau 17 kDa·

Końcową grupę arninoww ©sekwencji aminokwasów białek w polu A /rysunek 4/ uzyskano przez identyfikację pochodnych aminokwasów fβnylwtiwhydantwlkwwych aż do pozostałości 27. Stwierdzono, że sekwencja ta jest identyczna z sekwencją N-terminalną ^nadtlenku diamutazy z drożdży piekarn^nych /EC 1.15.1.1, Steinman, 1980/. To dowodzi identyczności pasma mniejszego obserwowanego w żelach oczyszczonej CDazy /rysunek 1,5/.

Z degradacji Edman'a dużego piku z rysunku 4 /pole B/ nie uzyskano żadnej sekwencji aminokwasów. To sugerowało, że zakończenie aminowe CDazy było zablokowane. Dlatego też częściową sekwencję aminokwasów CDazy uzyskano ustalając sekwencję wybranych fragmentów z enzymatycznej i bromo cyjanowej degradacji, w sposób opisany poniżej.

Enzymatyczne i chemiczne rozszczepienia CDazy.

Rozkładu CDazy zmodyfikowanej 4-wlkylopioydyką dokonano za pomocą skdwrootslkazy Lys-C i ekdwpowtsinszy Glu-C w 40 l 0,1 M roztworze Tris-kwas octowy /pH 8,0/. Reakcję prowadzono w 37°C przez 12 do około 16 godzin. Stosunek enzymu do substratu wynosił odpowiednio 1,10 /masa/masę/. Rozkładu ekdwproteikazą Asp-N dokonano w podobny sposób przy stosunku enzym/ substrat 1,100 w 37°C w ciągu około 12 do 16 godzin. Mieszaniny po trawieniu enzymatycznym zakwaszono 20% TFA do 2,0 pH i rozdzielono za pomocą HPLC o odwróconych fazach.

165 149

Do rozkładu CDazy w resztkach metionylowych ‘użyto bromocyjanu/CNBr/· CDazę /2,25 moli/, która była zmodyfikowana 4-winylopirydynę rozpuszczono w 40 l 70% roztworu kwasu mrówkowego, po czym dodano 200-krotny molarny nadmiar CNBr w 70% kwasie mrówkowym· Przez pierwsze 2 godzi ny mieszaninę reakcyjną utrzymywano w 35°C a przez następne około 12 do 16 godzin w temperaturze pokojowej· Po rozcieńczeniu wodą i suszeniu pod próżnią w celu usunięcia nadmiaru CNBr, przygotowano roztwór do analizy HPLC o odwróconych fazach stosując 1% TFA·

Rysunek 6 przedstawia częściową sekwencję aminokwasów CDazy uzyskaną w oparciu o fragmenty otrzymane z rozkładu za pomocą bromocyjanu i rozkładu proteolitycznego z zastosowaniem enzymów: andoproteinazy Glu-C, endoproteinazy Lys-C oraz endoproteinazy Asp-N· Zidentyfikowano 154 aminokwasy, które składają się na masę białka· Numeracja resztek aminokwasów nie obejmuje tych aminokwasów blisko zakończeń aminowych, które nie były dotychczas zidentyfikowane.

Porównanie częściowej sekwencji CDazy z jakimikolwiek innymi znanymi sekwencjami, w tym adenozynodearninazę myszy /Young, 1985/ i deaminazę drożdży piekarnianych dCMP /McIntosh and Haynes, 1986/ nie ujawniły istotnej homologii,

Przyk ład III· Klonowanie i ekspresja genu CDazy

Gen kodujący CDazę wyodrębniono ze szczepów laboratoryjnych S·ceravksiae /drożdże piekarniane/ i ekspresjonowano w komórki ssaka postępując w następujący sposób:

Etap 1: Generowanie specyficznej sondy CDazy za pomocą PCR

Dwa primery nukleotydowe zsyntetyzowano na zautomatyzowanym syntetyzerze DNA stosując częściowe sekwencję aminokwasów oraz wzory kodonów z S·cerevksiae /Guthris and Abelson, 1982/ jako przewodnik w projektowaniu przypadkowych segmentów sekwencji DNA· Te oligonukleotydy wykorzystano później jako primery w PCR z genomową bibliotekę DNA klonowanych drożdży obecną jako matryca· Primery nazwane CDA4R1 i CDA5AS, oba były 42-merami zawierając 33 nukleotydy o sekwencji odpowiadającej niciom CDazy odpowiednio sensownej i antysensownej· Pozostałość każdego nukleotydu kodowała miejsce enzymu restrykcyjnego dla EcoRI· Sekwencja dwóch primerów przedstawiona jest na rysunku 7·

Oba primery obecne są w reakcji w ilości albo 50 albo 100 pmoli· Dwie genomowe biblioteki użyte jako matryce DNA w reakcjach PCR skonstruowano z genomowych DNA drożdży stosując Sau3A częściowe trawienie restrykcyjne, a następnie podłączanie do miejsc BamHI wektora bakteryjno-drożdżowego typu CV13 lub YCp50· Te dwa wektory oraz biblioteki genomowe są ogólnie dostępne i uzyskano je z Departament of Genetics, Um^eraity of Washington· Obie biblioteki były już przetransformowane do gospodarzy bakteryjnych· Bibliotekę DNA wyodrębniono przez zasadową lizę preparatów plazmidowych, które oczyszczono następnie przez odwirowanie stosując gradienty gęstości chlorek cezu-bromek etydyny· Nastawiono reakcje PCR używając 1 g CV13 oczyszczonego za pomocą CaCl lub YCp50 genomowych bibliotek DNA z drożdży, lub 100 pmoli każdego primeru, 1/10 objętości 10x bufor reakcji PCR /Stratagene/, 16/100 objętości 1,25 mM dNTP'e /A, G, T, C/, destylowanej wody klasy PCR oraz 0,5 μΐ Taq DNA polimerazy /5U/ /Ll, Stratagene/ do końcowej objętości 100 μ!· Reakcje przeprowadzono w sterylnych mikroprobówkach do wirówki pod 75 l warstwą oczyszczonego oleju mineralnego aby zapobiec odparowaniu· Reakcje PCR prowadzono w Perkin-Elmer Cetus Thermal Cycler stosując program 30 cyklowy z następującymi zmianami temperatury: etap cyklu 94°C przez 30 sekund aby zdenaturować, 55°C przez 45 sekund aby wystudzić, 72°C przez 1,5 minuty aby /90 sekund/ aby przedłużyć· Podwielokrotności próbek z reakcji PCR analizowano na żelach agarozowych aby uzyskać dowód na istnienie przewidzianego fragmentu o 350 parach zasad kodującego większą część CDazy· Następnie fragmenty o 350 parach zasad oczyszczono za pomocą preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym, po czym eluowano je wykorzystując sposób postępowania i odczynniki dostarczone w zestawie GeneClean /BIOlOl/· W ten sposób usunięto primery i fragmenty heterologiczne z preparatu·

Etap 2: Subklonowanie fragmentów PCR do ustalania sekwencji

Primery PCR z etapu 1 obrobiono w EcoRI miejscach restrykcji na ich 5' końcach aby ułatwić klonowanie jakichkolwiek wygenerowanych fragmentów· Podwielokrotność próbki oczyszczonego fragmentu o 350 parach zasad pochodzącego z PCR trawiono enzymem restrykcyjnym EcoRI i podłączono do cięcia EcoRI wektor kosmidowy pBSII-SK+ /Stratagene/· Enzymy restryk165 149 cyjne uzyskano z Boehringer Mainnheim Biochemical /BMB/. Po dwugodzinnym inkubowaniu w 37°C przeprowadzono ekstrakcję stosując równe objętości fenolu i chloroform i alkohol i^a^^wy, a następnie zastosowano wytrącanie etanolem. Fragmenty ponownie zawieszono w TE /10 mM Tris-HCl pH 8,0) 1 mM EDTA pH 8,0/, po czym złączono razem wykorzystując T4 DNA Ligase /BMB/. Kompetentne bakterie JM109 /kzetkenefJk/JwenJ za pomocą reakcji podwiązania i w odpowiednich rozcieńczeniach położono na płytki z IB+ampicylina /100 ^g/ml/ uzupełnione XGal /5O μ/l 2% zapas w dimetyloformamidzie/ oraz IPTC /10 100 mM zapasu/. Zabrano białe kolonie i wykonano preparaty plazmidów w małej skali według przepisu podanego przez Sambrook^ /1989/. Plazmidy skriningowano pod względem wstawek 350 par zasad poprzez trawienie EcoRI. Wybrano kilka różnych izolatów, wyodrębniono plazmidy ONA, oczyszczono je i poddano analizie sekwencji DNA.

Etap 3: Wykorzystanie fragmentu PCR jako specyficznej sondy CDazy do skriningowania genomowych bibliotek drożdży

Fragment PCR uzyskany w etapie 1 wykorzystano również jako sondę do detekcji sekwencji kodującej CDazę w skriningowaniu bibliotek genomowych pod względem klonów zawierających ten gen. Oczyszczony fragment oznakowano za pomocą O.-³2-dCTP i zestawu do oznakowania ONA przypadkowego primeru z firmy Boehringer Mannheim Biochemicals. Biblioteki drożdży hodowano w ciągu nocy w LB+amp i w postaci rozcieńczonej umieszczono je na płytkach z LB+amp., tak aby na płytce znajdowało się 250-2000 kolonii. Kolonie przenoszono za pomocą krążków z nitrocelulozy 0,45 μm lub kwadracików produkowanych przez Schliecher and Schuell.

Sączki przerobiono w ten sposób, że położono je koloniami na papier 3MM Whatman nasycony przez 5 minut 10% SOS aby związać, 0,5M NaOH, 1,5M NaCl przez 5 minut aby zdenatueować,

1,5 M NaCl, O,SM Tris-HCl pH 7,4 przez 5 minut aby zneutralizować i 2 X SSC przez 5 minut przed poprzecznym usieciowaniem UV za pomocą Statalinker /Stratagene/, stosownie do instrukcji producenta. Sączki następnie zanużono w 2 X SSC przez 5 minut i przemyto 5 X SSC, 0,5% SDS, 1 mM EDTA w temperaturze 50°C.

Pkehobrydozecję wykonano w zgrzanych torebkach plastykowych zawierających 20 ml roztworu na torebkę z 12 sączkami. Roztwór pkehybkodozecyjny zawierał 50% formamidu, 6 X SSC, 0,01M NaP pH 6,8, 1 mM DTTA /pH 8,0/ % 0,5% DOS % 100 gg/m 0 DNA ddneatkJOwaeż % ser^a JeJeii.a, oraz 5X DenKa^^s Solution. Plastikowe torebki zanurzono w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C i inkubowano przez około 12 do 16 godzin. Oznakowaną sondę oczyszczono z nie wprowadzonych nukleo^^w poprzez elucję z Pueh-Colu/ns /Otkatagene/. Sondę dodano w przybliżonym stężeniu 10* cpm/ml cieczy i inkubowano przez około 12 do 16 godzin w 42°C aby nastąpiła hybrydyzacja. Sączki przemyto kilkakrotnie w 2 X SSC, 0,1% SDS w temperaturze pokojowej, a następnie pozostawiono w kąpieli 1 X SSC, 0,1% SDS w 55°C przez 1 godzinę. Sączki wysuszono na powietrzu, opakowano w folię sa^n. Błonę rentgenowską z ekranami wzmacniającymi wystawiono na działanie sączków w - 7O°C. Tutoradiogkafy ustawiono w szeregu z sączkami i macierzystymi płytkami w celu wybrania klonów dających sygnał pozytywnej hybrydyzacji.

Przed wyodrębnieniem plazmidu pozytywne klony dwukrotnie reskriningowano w podany wcześniej sposób. Plazmidy DNA wyodrębniono przez hodowlę kultur na 500 ml roztworu LB+am/icilyna, wzmocnionego chloramfenikolem a następnie przez ich oczyszczenie za pomocą zasadowej lizy, w sposób opisany przez Oembrook*e /1989/. Niektóre /laz/mry oczyszczono stosując odwirowania równowagowe z chlorkiem cezu0bko/kmem etodyny, natomiast inne eluowano z kolumn PZ253 /5' —> 3’/ a następnie wytrącono glikolem polietylenowym, ekstrahowano mieszeninę fenol: chloroform po czym wytrącono etanolem.

Etap 4: Ustalenia sekwencji klonów pochodzących z PCR oraz klonów genomowych kodujących CDazę

W celu ustalenia sekwencji DNA z klonów PCR i genomowych klonów CDazy zsyntetyzowano lub zamówiono kilka l8-mekowoch oligonukleotydów. Niektóre /ki/eky generowały sekwencję z nici kodującej, a inne dawały sekwencję z nici komple/enterneż. Reakcje ustalające sekwencje prowadzono według przepisów i na odczynnikach dostarczonych z wyposażeniem Seguenase yersion 2,0 Kit/ United States Bmoche/icel0. Przed reakcjami ustalającymi sekwencję zdena^^wano DNA w roztworze zasadowym, stosując 0,2 N NaOH. Rozcieńczenie mieszanin reakcji

165 149 znakującej oraz czasy trwania reakcji zmieniano zależnie od obszaru, w którym miała być ustalana sekwencja· W większości reakcji użyto po 1-1,5 pmoli matrycy DNA i primerów z 10-15 μ/Ci oL-35S-dATP. Próbki naniesiono na żele do ustalania sekwencji, składająca się z 8% poliakryloamid-mocznlk i rozwijano je przez 1-7 godzin zależnie od sekwencji, która miała być odczytana. Żele utrwalono w 105% metanolu, 10% kwasie octowym przez 30 minut i suszono 45 minut w 60°C za pomocą suszarki Slab-Gel połączonej z pompą próżniową. Następnie błonę Kodak XAR-5 wystawiono na działanie wysuszonych żeli w temperaturze pokojowej przez 16-72 godzin. Sekwencje odczytano manualnie. Orientację i analizę danych sekwencji wykonano za pomocą komputera Gene Pro Software /Riverside Scientific, Seattle, Washington/. Rysunek 8 przedstawia sekwencję nukleotydów genomowych klonów kodujących CDazę. Rysunek 10 obrazuje przewidywaną sekwencję aminokwasów. Jak można zauważyć na rysunkach sekwencja kodująca składa się w przybliżeniu z 474 par zasad i określa białko o 158 aminokwasach. Przewidywana masa cząsteczkowa uzyskanej w ten sposób CDazy wynosi około 17506 daltonów.

Etap 5t Konstruowanie kasetek kodujących CDazę do ekspresji w drożdżach i systemach ssaków.

Sekwencję DNA uzyskaną w etapie 4 wykorzystano przy projektowaniu primerów oligonukleotydowych do generowanych za pomocą PCR kasetek kodujących CDazę. Niektóre z tych oligonukleotydów zawierały w sobie dodatkowe sekwencje takie jak peptydy sygnalne wydzielania, oraz miejsca restrykcyjne, które mogą być wykorzystane przy klonowaniu lub ekspresji. Oligonukleotydowe primary stosowano w parach do generowania fragmentów PCR z właściwymi sekwencjami dodanymi na końcach.

Dokładniej kasetę kodującą CDazę skonstruowano za pomocą PCR stosując dwa primery zawierająca zarówno specyficzną sekwencję CDazy jak i dodatkową sekwencję kodującą miejsca restrykcyjne do klonowania. Primer 5' był 65-merowy i zawierał 45 zasad o sekwencji homologicznej, lecz niecałkowicie identycznej z końcem 5' genomowej kopii CDazy przylegającej do ogonka 5' zawierającego miejsca restrykcyjne HindlU, Sali i NcoI. 39-merowy primer 3' był identyczny z aityseisowną nicią C-zakończenia CDazy, z ogonkiem XbaI przyłączonym do jego końca 5! Jako matrycę stosowano genomowy klon CDazy w ilości, w przybliżeniu 1 ng na reakcję. Każdy primer obecny był w stężeniu 75 pmol. Reakcje PCR prowadzono w sposób opisany w etapie 1. Produkty reakcji PCR oczyszczono ekstrahując chloroformem a następnie wytrącając etanolem. DNA trawiono enzymami restrykcyjnymi Hindlll, i XbaI, poddano elektroforezie żelowej i oczyszczono przez elucję ze pomocą GeneClean /B10101/ stosownie do instrukcji producenta.

Etap 6: Ekspresja CDazy w systemie ssaka

Oczyszczony fragment z etapu 5 podwiązano do wektora plazmidowego CDM8 lub pH3M, który był trawiony HindIII-XbaI i przetransferowano go do gospodarza bakteryjnego MC1061 /Aruffo and Seed, 1987/. Mapa wektora pH3M przedstawiona jest na rysunku 12. Zebrano 20 transformatów, przeprowadzono na małą skalę zasadową lizę preparatów plazmidowych a podwielokrotności próbki trawiono Hindlll i XBaI, aby sprawdzić ich budowę. Pozostały z 3 preparatów plazmid użyto do transfekcji komórek COS metodą DEAE-Dextran /Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology/. Opisując w skrócie komórki COS w ilości 3,5x10* włożono do 6 cm naczyń z DMEM/ 10% surowicy z płodu wołu /FBS/ i inkubowano przez noc w 6% CO2 w 37°C. DNA z mini-preparatów wymieszano z PBS i 50 mg/ml DEAE-Dextran do końcowej objętości 100 l w 1lościach wyszczególnionych poniżej.

i Próbka	—T f 1 0	t DNA * 1	FBS	1 DAEDEAE-Dextran 1 J /SD mg/rnl/ {
	1		2	1	3		i	4	1 1
i---	Próbki kontrolne	β 1		1 1			i 1		1 1
	Rzekome	1 1	0 gl	1 1 l	80		1 1	20 μ	1 1
	BB1	!	4 μ i	1 1	76	Al	1 l	20 fjJ	1 1
				__			___L-	——»-r

165 149 __________1___,

Transfektanty

CDazy ►· ι

1-1	! 13 I	μ	1 1	67	μ· :	20	μ·
1-4	! 13	μ	1 1	67	μ· ϊ	20	μ
2-6	J 13 1	ί*	1 1 1	67	μ s	20	μ

j,

Każda transfekcja została zdublowana. środowiska kultur hodowanych 1 dzień wyssano z naczyń a komórki myto trzy razy w 2 ml PBS. Medium do transfekcji DMEM - chlorokin naniesiono w ilości 1,7 ml na płytkę, po czyn wkroplono do niego koktajl DNA. Transfekcje inkubowano 3 godziny, środowisko usunięto, komórki na 2 minuty poddano działaniu mieszaniny FBS /10% DMSO, wypłukano trzykrotnie w medium pozbawionym surowicy i inkubowano 3 dni w mieszaninie 3,5 ml DMEM/ 105% PBS.

Etap 7i Charakterystyka produktów rekombinacyjnych ekspresji

1. Reakcja strącania przy użyciu radioaktywnie znakowanych przeciwciał

Płytki z etapu 6, które miały być użyte do wytrącania radioimmunologicznego /RIPS/ inkubowano około 12 do 16 godzin w świeżym DMEM /10% FBS zawierającym 200 μ Ci/ml S-metloniny,

RIPS wykonano zasysając oczyszczone środowiska po okresie około 12 do 16 godzinnej inkubacji w 37°C, dodając 1 ml 1% 0G-P04RIPAE / 50 mM Na₂HPO4, 1% Nadeoxycholate, 1% trytonu Χ-100,

0,1% SDS, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 2 mM PMSF i 1 μg/ml aprotinin=P04-RIPAE z oktoglukozydem dodanym do 1% /buforu do każdego naczynia z kulturę, i inkubując 10 minut na lodzie. Lizaty przeniesiono do 10 ml probówek do- wirówek Oak Ridge i odwirowywano przy 40000 rpm w 4°C przez 40 minut. Ciecze sklarowane osadem przeniesiono do dwóch probówek do mikrowirówek na lodzie /0,4 ml na probówkę/. Transfektanty BB1 inkubowano za pomocą 2 g przeciwciała, natomiast do innych dodano 17,5 lub 31,5 g króliczej surowicy przeciwko poliklonalnym przeciwciałom CDazy. RIPS inkubowano na lodzie przez 1 godzinę. Do probówki BB1 jako drugorzędnego przeciwciała dodano koziej surowicy przeciwko myszy i inkubowano 20 minut na lodzie. Staphylococcus aureus /Calbiochem/ wypłukano w 700 buforu, 0,5% NP-40 /TES, potem w buforze 0,05% NP-40 /TES i zawieszono w buforze P04-RIPAE z 1 mg/ml białka jaja kurzego /TES 50 mM Tis-HCl, pH7,4, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl/. Próbki 50 mikrolitrowe bakterii przemytych StephA dodano do materiału RIP i inkubowano 10 minut na lodzie. RIPS zgranulowano w mikrowirówce i trzykrotnie przemyto 0,5 ml TWEN /20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40/. Grudki z wyjściowych 400 1 podwójnych próbek zawieszono albo w 35 1 redukującego lub w 35 l nieredukującego buforu roboczego SDS-PAGE. Próbki naniesiono na żel z gradientem 10-205% SDS-PAGE wraz z markerami białka o niskiej masie cząsteczkowej z Bio-Rad i poddawano elektroforezie przy 300 V przez, w przybliżeniu 2 godziny. 2ele barwiono w Coomassie Blue przez 1 godzinę, odbarwiono w 10% metanolu, 5% kwasie octowym przez około 12 do 16 godzin, wystawiono do wzmocnienia przez 30 minut, później płukano 3 razy w wodzie i suszono 1 godzinę w 60°C. Wystawienie błony rentgenowskiej przez 4 godziny na działanie żelu wykazało nieobecność w próbkach rzekomych pasma przy 17000 daltonów, brak pasma 17000 daltonów w próbkach BB1, w których natomiast obecne było specyficzne pasmo około 45000 daltonów, podczas gdy wszystkie 3 transfektanty wykazywały specyficzne pasmo przy około 17000 daltonów.

2. Analiza Western»

Identyczne płytki do transfekcji z etapu 6 pozostawiono nieoztakowane i zebrano je po trzydniowym okresie inkubacji. środowiska wyssano, komórki przepłukano w PBS, i zawieszono w 0,5 ml 10 mM Tris-HCl /pH 8,0/ zawierającego 1 μg/ml aprotyniny i 30 μ-g/ml PMSF. Komórki przeniesiono z naczyń do hodowli za pomocą sterylnych skrobaczek do sterylnych probówek do mikrowirówek na łodzie. Każdą zawiesinę poddawano działaniu dźwięków w 2-15 sekundowych uderzeniach z całą mocą. Lizaty odwirowywano 20 minut w chłodzonej mikrowirówce, aby usunąć szczątki komórek, a ciecze sklarowane osadem przeniesiono do świeżych probówek. Następnie przeprowadzono

165 149 oznaczanie enzymów w sposób opisany poniżej. Próbki tych lizatów również stosowano do wykonania Western blot-ów używając króliczej poliklonalnej przeciwsurowicy wyhodowanej przeciwko oczyszczonej CDazie. Dwudznaetopięciomnkrolntrowa próbki z nierozcieńczonych transfektowanych lizatów poddano elektroforezie SDS-PAGE, tak jak to opisano dla RIPS, z takim wyjątkiem, że jako standardy stężenia na kolumnę naniesiono serię roztworów oczyszczonej CDazy. Stężoną CDazę przy 500 ng/tor rozcieńczono w 5-krotnych przyrostach do 100 ng, 20 ng, 4 ng i 0,8 ng na tor. Następnie żel został przeniesiony na filtr z bibuły za pomocą prądu elektrycznego zgodnie z przepisami stosowanymi w ręcznym klonowaniu CSH /Sambrock, 1989/. Bloty zablokowano w Blotto przez 1 godzinę /Blotto-PBS* 1% mleko bez tłuszczu + 0,5% NP-40/. Świeże Blotto zawierające 2,5 g/ml poliklonalnej króliczej surowicy z przeciwciałami CDazy dodano do filtra i inkubowano 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Filtr wypłukano trzy razy po 5 minut w Blotto i inkubowano w roztworze przeciwciał sprzężonych z alkaliczną fosfatazą /Boehringer Mannheim Biochemicals/ rozcieńczonym w stosunku 1:1000 w Blotto. Nadmiar sprzężonych przeciwciał usunięto za pomocą trzech kąpieli w Blotto i końcowe przepłukanie w buforze o podłożu z zasadowej fosfatazy /100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NeCl, 5 mM MgCl₂/.

Sączek inkubowano 15 minut w 40 ml buforu do którego dodano 12 mg fosforanu bromochorindolilu i 7 mg błękitu nitrotetrazoliowego aby wywołać kolor. Reakcje zatrzymano przemywając sączek destylowaną wodą. Po wywołaniu barwy wszystkie 3 transfektanty ukazały pasma migrujące przy 17000 daltonów o intensywności większej od 0,8 ng i mniejszej od 4 ng standardowego stężenia oczyszczonej CDazy.

3. Pomiary czynności rekombinacyjnie ekspresjonowanej CDazy

W ekstraktach z transformowanych wcześniej komórek COS zmierzono konwersję 5-fluorocytozyny /5-FC/ w 5-fluoro uracyl /5-FU/. Transfektanty /3x10 komórek każdy/ zawierające CDazę /1-1, 1-4, 2-6/, trenefekcję rzekomą lub transfekcję plazmidów kontrolnych /BB1/ poddano działaniu dźwięków w buforze 0,5 ml 10 mM TRIS a następnie odwirowano, Do 100 każdej cieczy i 1 gl/ml roztworu CDazy dodano 170 gl roztworu soli zbuforowanego fosforanem /PBS/ i 30 gł. 30 mM roztworu 5-FC. W wyniku tego otrzymano 300 gl mieszaniny reakcyjnej z 3 mM 5-FC. Wykonano też reakcję kontrolną bez enzymu. Probówki te inkubowano 24 godziny w 37°C, po czym pobrano z nich 50 gl każdego roztworu i reakcję przerwano w 1 ml 0,1 N roztworu HCl. Próbki te mierzono na spektrofotometrze UV ptzy 255 i 290 nm. Wykorzystując równania:

/0,1191 X OO_2go - 0,02485 X 0D_25g / X 20 = mM 5-FC i /0,1849 X 0D₂5₅ - 0,04907 X OD^/ X 20 = mM 5-FU zmierzono ilość konwersji 5-FC w 5-FU. Następnie obliczono liczbę jednostek czynności w ekstrakcie komórki pierwotnej /1 Jednostka = 1 gmol/minutę przemiany 5-FC w 5-FU. /Transfekcje rzekome i BB1 oraz reakcja bez enzymów nie wykazały się czynnością, natomiast wszystkie trzy transfektanty CDazy były czynne. Transfektant 1-1 miał 0,41 X 10~3 jednostek, 1-4 • 3 «3 miał 0,54 x 10 jednostek a 2-6 miał 0,25 X 10 jednostek. Kontrolne oznaczanie za pomocą 1 μg/ml CDazy przemieniło 5-FC w 5-FU w całości. Zakładając, że czysta CDazę odznacza się czynnością 40 U/mg, czynną CDazę otrzymano w ilości 10 ng /1-1/, 13,5 ng /1-4/,

7,3 ng /2-6/.

Te same próbki zbadano również, stosując oznaczanie niezależne. Każda badana probówka zawierała 50 g c clzyzy lkrewawen ej asemel beb 1 g/rn 1 CDyz y, 030 g 1 SBS, 20 gl. 30 mM 5-FC oraz 1 gCl / ³H / 5-FC. Mieszaniny reakcyjne inkubowanj 24 godziny, odparowano, a pozostałość rozpuszczono w 20 gl metanolu, po czym nasieynoso je na płytki do chromatografii cienkowarstwowej sc żełu krzemionkowym /TCL/. Płytki rozwinięto stosując mieszaninę 96:4 aceton/woda, w której współczynniki Rf dla 5-FC i 5-FU wynosiły odpowiednio 0,2 i 0,8.

Z płytek TLC wycięto odpowiednie porcje, które włożono do cieczy scyntylacyjnej. Próbki zliczono w liczniku scyntylacyjnym i dla każdej z nich wyznaczono relatywna ilości 5-FC i 5-FU. Oznaczenie próbek rzekomych i BB1 nie wykazało obecności 5-FU, natomiast wszystkie

165 149 transfektanty zmieniły 14% 5-FC w 5-FU. To odpowiada 0,6 X 10 jednostkom w każdej próbce, potwierdzając ilości wyliczone w doświadczaniu z UV. Reakcje kontrolne z 1 g/ml CDazy p^eksz tałciły 5-FC w całości w 5-FU,

Doświadczenia wykazują, że toanapfsktakty CDazy rzeczywiście produkują czynny enzym. Ten fakt w połączeniu z analizą Western blot wskazuje na to, że specyficzna czynność enzymów rekombinacyjnych podobna jest do wykazywanej przez enzymy wyodrębnione z drożdży

Ujawniono zatem termicznie stabilną CDazę oraz sposoby oczyszczania jej jak i rekombikacyjksgα wytwarzania. Chociaż korzystne aspekty wynalazku zostały szczegółowo opisane należy uważać je za przykładowe i nie ograniczają one zakresu wynalazku zdefiniowanego w dołączonych zastrzeżeniach.

NH_}

N^ ''CH d e z amina za cytozynową

O⁵*',

-CH

O

II ^,(-x

N'

H

CH

L cytozyna (2-hydroksy-4-amlnoplrymidyna) uracyl (2-,4 -dwuh ydroks y pirymidyna)

Schemat

165 149

FIG. 12

SV40 ΟΓΪ rr\jX ori

CMV/HIV

4:

165 149

FIG. 9

1 1 II 1		1 '—•III	1 III 1 II 1	—j-c
1 1 |ULJ-_		.1......14.-..			L---, |
„ L|		1 i—, l—«	“Ή L---	Ί 1	ι Η ι i i
ii iii 11 rJi i		(>r—»JJI	l“J 1
U---J ,		i1 1 1		II	1 1 III
. -i —i			u	-J—	u
J , 1	1 1	±J n

FIG. 10

START

lATGl GTG

ACA T

GGG G

GGA ATG GCA AGC

AAG TGG

GAT CAG AAG GGT ATG

211

M

V

G

M

A

S

X

W

D

Q

X

G

M

GAC

ATT

GCC

TAT

GAG

GAG

GCG

GCC

TTA

GGT

TAC

AAA

GAG

GGT

GGT

256

D

I

A

Y

E

E

A

A

L

G

Y

X

E

G

G

GTT

CCT

ATT

GGC

GGA

TGT

CTT

ATC

AAT

AAC

AAA

GAC

GGA

AGT

GTT

301

V

P

I

G

G

C

L

I

H

N

X

D

G

S

V

CTC

GGT

CGT

GGT

CAC

AAC

ATG

AGA

TTT

CAA

AAG

GGT

TCC

GCC

ACA

346

L

G

R

G

H

N

K

R

P

Q

X

G

s

A

T

CTA

CAT

GGT

GAG

ATC

TCC

ACT

TTG

GAA

AAC

TGT

GGG

AGA

TTA

GAG

391

L

H

G

E

I

s

T

L

E

N

C

G

R

L

E

GGC

AAA

GTG

TAC

AAA

GAT

ACC

ACT

TTG

TAT

ACG

ACG

CTG

TCT

CCA

436

G

K

V

Y

X

D

T

T

L

Y

T

T

L

S

P

TGC

GAC

ATG

TGT

ACA

GGT

GCC

ATC

ATC

ATG

TAT

GGT

ATT

CCA

CGC

481

C

D

H

C

T

G

A

I

I

H

Y

G

I

P

R

TGT

GTT

GTC

GGT

GAG

AAC

GTT

AAT

TTC

AAA

AGT

AAG

GGC

GAG

AAA

526

C

V

V

G

E

N

V

H

F

K

S

X

G

E

K

TAT

TTA

CAA

ACT

AGA

GGT

CAC

GAG

GTT

GTT

GTT

GTT

GAC

GAT

GAG

571

Y

L

Q

T

R

G

H

E

V

V

V

V

D

D

E

AGG

TGT

AAA

AAG

ATC

ATG

AAA

CAA

TTT

ATC

GAT

GAA

AGA

CCT

CAG

616

R

C

K

K

I

M

X

Q

F

I

D

E

R

P

Q

GAT TGG TTT GAA GAT ATT GGT GAG ItaSI DWFEDIGE £jgp

641

165 149

M

V

T G

G

M

A S

K

W

D

Q

K

G

M

D

I

A Y

E

E

A A

L

G

Y

K

E

G

G

V

P

I G

G

C

L I

N

N

K

D

G

S

V

STARTER CDA4/RI: GGT AGA GGT L G R G 47

CAC H

(5'GGGGAATTC--) AAC ATG CGT TTC N M R F

CAA Q

AAG K

GGT G

3' S

—-s A

» T

L

H

G E

I

S

T Ł

B

N

C

G

R

L

E

G

K

V Y

K

0

T T

L

Y

T

T

L

S

P

C

0

M C

T

G

A I

Z

M

Y

G

Z

P

R

C

V

V G

E

N

V N

F

K

s

K

G

E

K

Y

L

Q T

R

G

Η E

V

V

V

V

D

D

E

R

C

K K

I

M

K Q

F

I <

D ---3

147 E 'CTT

R TCT

P GGT

Q GTT

D CTA G

W ACC

F E AAG CTT

D CTG A

I TAG A

157 158 G E CCA (

CTTAAGGGG 5'

) STARTER

CDA

AS 5

FIG. 7

FIG. 8

TTCTCCTCAT	ATCACGTGTC	ATTCTGCAGG	GCGGTAGTAC	CGAGACCCTG	ACTTTCTTTT	60
TTTTTTGCGA	AATTAAAAAG	TTCATTTTCA	ATTCGACAAT	GAGATCTACA	AGCCATTGTT	120
TTATGTTGAT	GAGAGCCAGC	TTAAAGAGTT	AAAAATTTCA	TAGCTAATGG	TGACAGGGGG	180
AATGGCAAGC	AAGTGGGATC	AGAAGGGTAT	GGACATTGCC	TATGAGGAGG	CGGCCTTAGG	240
TTACAAAGAG	GGTGGTGTTC	CTATTGGCGG	ATGTCTTATC	AATAACAAAG	ACGGAAGTGT	300
TCTCGGTCGT	GGTCACAACA	TGAGATTTCA	AAAGGGTTCC	GCCACACTAC	ATGGTGAGAT	360
CTCCACTTTG	GAAAACTGTG	GGAGATTAGA	GGGCAAAGTG	TACAAAGATA	CCACTTTGTA	420
TACGACGCTG	TCTCCATGCG	ACATGTGTAC	AGGTGCCATC	ATCATGTATG	GTATTCCACG	480
CTGTGTTGTC	GGTGAGAACG	TTAATTTCAA	AAGTAAGGGC	GAGAAATATT	TACAAACTAG	540
AGGTCACGAG	GTTGTTGTTG	TTGACGATGA	GAGGTGTAAA	AAGATCATGA	AACAATTTAT	600
CGATGAAAGA	CCTCAGGATT	GGTTTGAAGA	TATTGGTGAG	TAGAGCACGC	AGCACGCTGT	660
ATTTACGTAT	TTAATTTTAT	ATATTTGTGC	ATACACTACT	AGGGAAGACT	TGAAAAAAAC	720
CTAGGAAATG	AAAAAACGAC	ACAGGAAGTC	CCGTATTTAC	TATTTTTTCC	TTCCTTTTGA	780
TGGGGCAGGG	CGGAAATAGA	GGATAGGATA	AGCCATCTGC	TTAGCTGTTT	CCGTCTCATC	840

TTCGGTAGTT GTCTCATGTC GTTCAGTATA CTTAGAGCGC AT

882

165 149

10 20 30

C C M A S K W 0 Q K C Μ 0 1 A Y E E A A L C Y K E C C V P I

SO 60

CGCLINNKDCSVLCRCHNMRFQKGSATl.HC

-M6— -M9-E7-KJ--K2--K670 80 90 El STLEHCCRLECKYYKDTTLYTTLSPCDH -M9K6·

-K13-010100 110 120 CTCA11NYGIPRCVVCEHVNFKSKGEKYLQ

-H4-Ela—

-K13-016130 140 ISO

TRCHEVVVVODERCKK1MKQFXDERPQOUF

-H7-Elb- -E9-K3- -Kiledic FIG. θ —-K7— —Kil—

165 149

Stabilność dezaminazy cytazynowej w temp. 37°C

Aktywność właściwa (jednostki /mg)

165 149

σ c

fs/

Wyeluowona objętość (ml)

C

Wyeluowana objętość (ml) a

»

I

A

O

OT

OJ <

<1

180

165 149

FIG. | 123456789

FIG. 5

	94-
rp	67-
o	43-
X	30-
	20.1-
	14.4-

ł

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (3)

1. Zastrzeżenie patentowa

   1. Sposób wytwarzania stabilnej termicznie dezaminazy cytozynowej drogę rekombinacji, znamienny tym, że eukariotyczne lub prokariotyczne komórki-gospodarza transformuje się rekombinantowym wektorem ekspresyjnym powodującym skuteczny ekspresję sekwencjl nukleotydowej zasadniczo przedstawionej na fig. 10, po czym etrensformowane komórki-gospodarze hoduje się w warunkach umożliwiających ekspresję tej nukleotydowej sekwencji i ze etrensformowenych wyhodowanych komórek-gospodarzy wyodrębnia się stabilną termicznie dezaminazę cytozynową.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny ty m, ża Jrko óomórklepoθaoZarze stosuje się komórki ssaków.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny my m, ja orko komórkJepo8aoZerze stosuje się kom komarro dżożdży.

   * * *