JPH09268200A - ラットトロンボモジュリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 配列番号３の１−５５９のアミノ酸配列の部
分配列からなり、トロンビンに結合しトロンビンによる
プロテインＣの活性化を促進する活性を有する可溶性の
ラットトロンボモジュリンの誘導体ペプチド、及び該ペ
プチドやラットトロンボモジュリンをコードするＤＮ
Ａ、組換え体ＤＮＡ、形質転換体、及びこれらのペプチ
ドの製造法、またさらに、ラットトロンボモジュリンを
コードする遺伝子を変異せしめたトランスジェニックラ
ットの作製方法およびそのトランスジェニックラット。 【効果】 ラットＴＭまたはその誘導体ペプチドの大量
調製が可能となり、ラット実験モデルとして使用できる
トランスジェニックラットを提供でき、ＴＭ薬効の正確
な評価が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、ラットトロンボモ
ジュリンの誘導体ペプチド、及び該ペプチドやラットト
ロンボモジュリンをコードするＤＮＡ、組換え体ＤＮ
Ａ、形質転換体、及びこれらのペプチドの製造法に関す
る。またさらに、ラットトロンボモジュリンをコードす
る遺伝子を変異せしめたトランスジェニックラットの作
製方法およびそのトランスジェニックラットに関する。

【０００２】

【従来の技術】トロンボモジュリン（以下ＴＭと略すこ
とがある）は、血管内皮細胞膜上に存在する糖蛋白のひ
とつであり、トロンビンに結合し、トロンビンによるプ
ロテインＣ活性化の補酵素として、主に血液凝固系の調
節因子として機能している。特に、ヒトＴＭまたはその
誘導体ペプチドは、医薬品として有望視されており、開
発研究が検討されつつある。

【０００３】従来、ヒトＴＭについては、Ｈ．Ｈ．Ｓａ
ｌｅｍら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１２２
４６−１２２５１，（１９８４）］において臓器から抽
出する方法が知られている。また、Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉら
［ＥＭＢＯ Ｊ，６，１８９１−１８９７，（１９８
７）］により、ヒトＴＭのＮ末端アミノ酸配列及び、ヒ
トＴＭｃＤＮＡの全配列が報告されている。また、Ｔ．
Ｓｈｉｒａｉら［Ｊ．Ｂｉｏｌｃｈｅｍ．，１０３，２
８１−２８５，（１９８８）］が、ヒトＴＭ遺伝子につ
いて報告している。また、ヒトＴＭ改変体についても知
られている〔特開昭６４−６２１９号公報〕。

【０００４】また、ウサギＴＭについては、Ｃ．Ｔ．Ｅ
ｓｍｏｎら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，８５
９−８６４，（１９８２）］において、臓器から抽出す
る方法で、そのペプチドが取得されており、Ｄ．Ｊ．Ｓ
ｔｅｒｎｓら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，３
３５２−３３５６，（１９８９）］により、極めて限定
された部分的なアミノ酸配列のみが明らかになってい
る。また、ウシＴＭについては、Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉら
［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
Ａｃｔａ，８８２，３４３−３５，（１９８６）］に
おいて、臓器から抽出する方法で、そのペプチドが取得
されており、Ｒ．Ｗ．Ｊａｃｋｍａｎら［Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３，８８
３４−８８３８（１９８６）］により、ウシＴＭｃＤＮ
Ａの部分配列が報告されている。

【０００５】マウスＴＭについては、Ｗ．Ａ．Ｄｉｔｔ
ａｍａｎら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１５
８１５−１５８２２（１９８８）］により、マウスＴＭ
ｃＤＮＡの部分配列について報告している。またＰ．Ｎ
ｉｆｏｒａｓら［Ｂｉｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐ
ｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１７３，１７９−１８８
（１９９３）］が、マウスＴＭ遺伝子について報告して
いる。

【０００６】また、ラットＴＭについては、Ｃ．Ｔ．Ｅ
ｓｍｏｎら［Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ
Ｅｎｄｏｔｈｅｒｌａｌ Ｃｅｌｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ １２１−１３６（１９８２）］及びＴ．
Ｋｕｍａｄａら［Ｂｌｏｏｄ，７１，３，７２８−７３
３（１９８７）］において、臓器から抽出する方法で、
そのペプチドが取得されている。

【０００７】ところで、ヒトＴＭまたはその誘導体ペプ
チドを、医薬品として開発するには、各種の基礎検討及
び前臨床試験が必要とされ、これらの段階で、有効性や
安全性に関する各種の試験管内試験や動物試験あるいは
スクリーニング実験等が必要である。これらの試験は実
際にヒトでの臨床試験における有効性や安全性を予測す
るために行うものであり、それらの試験を行うために
は、少なくとも数１０ｇの蛋白サンプルが必要であると
されている。生体内に通常微量にしか存在しない生理活
性蛋白の場合は、それがいかに微量で効くとしても、医
薬品とする前提として極めて多量のサンプル量の確保が
必要とされるのである。

【０００８】ところが、一般的に生理活性を持つ蛋白
は、その効果に種差を有し、種の等しい動物には高い有
効性を有するが、種の異なる動物には有効性が劣る場合
が多く、その蛋白質の生理活性を十分に評価することが
できず問題となる場合が多い。例えば、γ−ＩＦＮに関
して、 Ｃ．Ｈ．Ｓｃｈｅｉｎら［Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．，３０７，１，１２３−１２７（１９９５）］は、
ヒトとウシのγ−ＩＦＮは、ＲＮＡに強く結合してウシ
の精子から単離したＲＮａｓｅＡダイマーの活性を阻害
するがマウスγ−ＩＦＮにはその阻害能がないと報告し
ている。さらにまた、Ｍ．Ｏｎｏら［Ｔｈｒｏｍｂｏｓ
ｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，７１，１，５
４−６１，（１９９４）］は、組換えラットプロテイン
Ｃとラット血漿由来プロテインＣはラット血漿を用いた
活性化部分トロンボプラスチン時間を用量依存的に延長
するが、ヒト血漿由来プロテインＣは延長作用が弱いと
報告している。

【０００９】さらにＴＭについて種差が存在する可能性
を指摘したものとして、以下の文献が存在する。即ち、
Ｋ．Ｈｉｒａｈａｒａら［Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，５７，１１７−１２６，（１９９０）］
は、ウサギＴＭは、アンチトロンビンIIIによるトロン
ビン阻害を促進するが、ヒトＴＭにはその作用はなくヒ
トＴＭとウサギＴＭには種差が存在すると報告してい
る。

【００１０】したがって、ＴＭについて、より正確に研
究が可能となる動物モデルの確立が待たれるところであ
る。ところで、前臨床試験等の実験に用いる動物として
は、上記のマウスやウサギの他に、ラットが知られてい
る。ラットは、栄養代謝がヒトと似ていることの他、マ
ウスの８〜１０倍の大きさがあり、解析に十分な組織試
料が確保できること、血管を通した血液の採取が反復し
て可能であること、再現性が高く確立された実験動物と
して最も多用されていること等の、種々の利点を有す
る。

【００１１】したがって、ＴＭについてのラットを用い
た動物モデルの確立は極めて有用であるが、従来、ラッ
トを用いた動物モデルを確立するには至っていない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】ＴＭの開発研究、実験
等に必要な、ラットＴＭの十分な提供が求められている
が、従来の、臓器から抽出する方法による該ペプチドに
おいては、実験に用いるのに十分な量が得られず、質的
にも常に均一な物が得られる保証がなく、量、質的に満
足のいく物ではなかった。また、前述の通り、従来、ラ
ットを用いた動物モデルを確立するには至っていない。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み、本発明
者らは、種々検討をした。上記の通り、種差が存在する
ことが明らかなことから、必ずしも、他の種のＴＭの情
報が通用しないことは明らかであって、この様な状況に
おいては、ラットＴＭ遺伝子や遺伝子工学、さらにその
誘導体ペプチドの確立など全く不可能であったが、以下
の方法で本発明を完成した。

【００１４】即ち、本発明は、配列番号３の１−５５９
のアミノ酸配列の部分配列からなり、トロンビンに結合
しトロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する活
性を有するペプチドである。本発明のペプチドがトロン
ビンに結合することは、例えば、本願明細書実施例に記
載されているように、ＤＩＰ−トロンビン〔ジイソプロ
ピルホスフォロトロンビン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐ
ｈｏｓｐｈｏｒｏ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、またはＤＩＰ
−トロンビン−アガロースに結合することにより確認さ
れる。また、トロンビンによるプロテインＣの活性化を
促進する活性を有することも、本願明細書実施例に記載
されている通りである。

【００１５】上記トロンビンに結合しトロンビンによる
プロテインＣの活性化を促進する活性を示す、最も典型
的な例としては、該部分配列中に、少なくとも配列番号
１の１−１１４のアミノ酸配列が包含されていることで
ある。勿論、配列番号１の１−１１４のアミノ酸配列
は、好ましい例であって、程度の差はあっても、トロン
ビンに結合しトロンビンによるプロテインＣの活性化を
促進する活性を示せればよいのであって、その配列のさ
らに小さな部分配列であってもよい。

【００１６】上記で定義される本発明のペプチドは、界
面活性剤の非存在下で水溶液となる可溶性であることが
好ましく、特に、蒸留水ｍｌ当たり少なくとも２ｍｇ溶
解する可溶性ペプチドであることが好ましい。上記蒸留
水としては、勿論、ｐＨ７程度の中性条件において特に
溶解性を減ずるような溶解成分を含まないような条件と
理解すべきである。

【００１７】また、配列番号２の１−５００のアミノ酸
配列の全配列又は部分配列からなり、トロンビンに結合
しトロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する活
性を有するペプチドも好ましい例示として挙げられる。
通常、このペプチドも上記の通り、蒸留水ｍｌ当たり少
なくとも２ｍｇ溶解する可溶性ペプチドである。即ち、
配列番号３の５０１−５５９のアミノ酸配列は、溶解性
に関与する部分であると認識できる。したがって、配列
番号３の５０１−５５９のアミノ酸配列を少なくとも包
含しないアミノ酸配列からなるペプチドは、好ましい例
として挙げられる。

【００１８】具体的に、好ましくは、配列番号１の１−
１１４のアミノ酸配列〔式（Ｉ）ということがある〕、
および配列番号２の１−５００のアミノ酸配列のいずれ
かのアミノ酸配列からなるペプチドが例示される。本発
明のプチペドはまた、Ｎ末端アミノ酸配列として、例え
ば次式： Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ で表されるアミノ酸配列を有するシグナル配列（リーダ
ー配列）の一部または全部を含有していてもよい。

【００１９】自然の変異によりまたは人工の変異によ
り、ペプチドの活性に重大な変化を与えることなく、ペ
プチドの構造の一部を変化させることが可能である。本
発明のペプチドは、前記アミノ酸配列を有するペプチド
の相同変異体（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｖａｒｉａｎ
ｔ）に相当する構造を有するペプチドも包含する。本発
明のペプチドは少なくとも１個の糖残基を含有していて
もよいし、含有していなくてもよい。また、本発明の複
数のＴＭペプチドの混合物であってもよい。

【００２０】配列番号２の１−５００のアミノ酸配列の
Ｎ末端に、上記のリーダー配列が結合してなる配列であ
る配列番号１７の１−５１８のアミノ酸配列からなるペ
プチドも本発明で提供し得る。本発明のプチペドはＮ末
端アミノ酸残基としてアミノ酸メチオニンを含有してい
てもよい。

【００２１】また、本発明は、上記で示される本発明の
ペプチドをコードするＤＮＡである。上記の配列番号２
の１−５００のアミノ酸配列をコードする塩基配列とし
てより具体的には、例えば、配列番号５の１−１５００
の塩基配列が挙げられ、また配列番号１の１−１１４の
アミノ酸配列をコードする塩基配列としてより具体的に
は、例えば、配列番号４の１−３４２の塩基配列が挙げ
られ、本発明のＤＮＡは、これらの塩基配列の全部また
は部分配列を実質的に包含するＤＮＡである。

【００２２】また、本発明は、ラットトロンボモジュリ
ンをコードする下記の制限酵素地図

【００２３】

【化３】

【００２４】に示す制限酵素サイトにより特徴付けられ
るＤＮＡ、又はそのペプチドコード領域の塩基配列を含
有するＤＮＡである。この制限酵素地図は、図１の要部
と一致するが、図中の斜線部分は、配列番号１８の１−
１８に示されるリーダー配列の１８アミノ酸をコードす
る塩基配列部分である。また、斜交線部分は配列番号３
の１−５５９のアミノ酸配列をコードする塩基配列部分
である。したがって、上記のペプチドコード領域の塩基
配列とは、通常は、配列番号３の１−５５９のアミノ酸
配列をコードする塩基配列部分を示し、リーダー配列の
１８アミノ酸配列を付加する目的においては、このリー
ダー配列をコードする塩基配列部分を含む塩基配列を示
す。

【００２５】また、上記の制限酵素サイトにより特徴付
けられるＤＮＡ、又はそのペプチドコード領域の塩基配
列を含有するＤＮＡとしては、ＲＴＭＥ２又ＲＴＭＸ２
のラット由来のＤＮＡや、配列番号７の１−５２８３の
塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。上記の配列番号
３の１−５５９のアミノ酸配列をコードする塩基配列と
してより具体的には、例えば、配列番号６の１−１６７
７の塩基配列が挙げられる。

【００２６】遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくその
遺伝子の塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の
塩基に置換することができる。従って、本発明のＤＮＡ
はまた、遺伝略号の縮重に基づく置換によって変化され
た塩基配列を含有することも可能である。また、本発明
は、上記で示される本発明のＤＮＡに対する相補的なＤ
ＮＡである。

【００２７】上記の本発明のＤＮＡは前述のペプチドを
組換えＤＮＡ技術を用いて製造するのに用いることがで
きる。本発明のＤＮＡ及び、ペプチドは、概略以下の
（１）〜（８）ようにして得ることができる。 （１）例えば、配列番号８の１−２３及び配列番号９の
１−２３の塩基配列からなるプライマーにより、ラット
の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い部分ＤＮＡ断
片を取得する。 （２）かくして得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定
し、該ＤＮＡ断片がＴＭ遺伝子の部分ＤＮＡ断片である
可能性を検討する。 （３）（２）で得たＤＮＡをラベルし、ラット染色体Ｄ
ＮＡライブラリーとハイブリダイゼーションを行なわ
せ、該プローブと相同性を示すクローンを選択分離す
る。 （４）（３）で選択したクローンよりＤＮＡを抽出し、
同上のプローブを用いてサザンハイブリダイゼーション
を行い、適当なサイズの制限酵素断片上に目的の遺伝子
を位置づけ、それをプラスミドベクターにサブクローニ
ングする。 （５）かくして得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定
し、そのコード領域の位置づけを行う。 （６）ラットＴＭの全コード領域あるいはその一部を含
むＤＮＡ断片を発現用ベクターに組み込んで組換え体Ｄ
ＮＡ構築する。 （７）構築した組換え体ＤＮＡにより、宿主細胞を形質
転換する。 （８）得られた細胞を培養し、組換えラットＴＭまた
は、その類縁体を発現させ活性を確認後、カラムクロマ
トグラフィーにより精製する。

【００２８】上記の工程中でＤＮＡ、組換え体宿主とし
ての大腸菌等の取扱いに必要な一般的な操作は、当業者
間で通常行われているものであり、例えば Ｔ．Ｍａｎ
ｉａｔｉｓらの実験操作書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ １９８２，１９８９）に従えば容易に実
施できる。使用する酵素、試薬類もすべて市販の製品を
用いることができ、特に断わらない限り、製品で指定さ
れている使用条件に従えば、完全にそれらの目的を達成
することができる。以下に、上記（１）〜（８）の工程
について更に詳しく説明する。

【００２９】上記（３）における染色体ＤＮＡライブラ
リーとしては、例えば、市販されている（ＣＬＯＮＴＥ
ＣＨ社、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社等）ライブラリーを使
用することができる。また、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４
（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）等のラムダファージベクタ
ーもしくは、ｐＨＣ７９（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）社）等
のコスミドベクターを用いて作製したライブラリーを使
用することもできる。また、プローブのラベル化は、従
来から汎用されている放射性同位元素あるいはジゴキシ
ゲニン、ビオチン等の非放射性化合物のいづれも使用可
能である。 また上記（１）、（２）を行うかわりに、
例えばヒトのＴＭ遺伝子を単離し、該ＤＮＡをプローブ
として上記（３）の染色体ＤＮＡライブラリーとハイブ
リダイゼーションを行わせることにより、ラットＴＭ遺
伝子を単離することもできる。ヒトＴＭ遺伝子は、例え
ば既に明かとなっている塩基配列に相当するＤＮＡオリ
ゴマーを合成し、該オリゴマーをプローブとしてヒトの
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって
容易に取得することができる。また、遺伝子の両端に相
当する２種のプライマーを利用したＰＣＲによりヒトの
染色体ＤＮＡから直接クローン化することも可能であ
る。上記のようにして得られるラットＴＭ遺伝子は、ラ
ットＴＭのオープンリーディングフレームをコードする
ＤＮＡに相当するＤＮＡ断片を含んでいればよく、更に
好ましくは配列番号（１７）に示したオープンリーディ
ングフレームをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片で
ある。

【００３０】また、上記ラットＴＭ遺伝子ＤＮＡ断片を
プローブとして用いれば、ラット由来ｃＤＮＡライブラ
リーから、ラットＴＭの全コード域を含有するｃＤＮＡ
を単離することができる。これらｃＤＮＡもラットＴＭ
遺伝子ＤＮＡ断片と同様に利用することができる。本発
明は、前述のラットトロンボモジュリンをコードする制
限酵素地図に示す制限酵素サイトにより特徴付けられる
ＤＮＡ、又はそのペプチドコード領域の塩基配列を含有
するＤＮＡ、又はその活性発現部位の塩基配列を含有す
るＤＮＡを調製し、このＤＮＡを、または発現ベクター
に組み込んで調製された組み換えＤＮＡを、ラットに導
入し、ラットＴＭの過発現を引き起こすことを特徴とす
るトランスジェニックラットの作製方法である。

【００３１】ここで、上記で組換えＤＮＡとなすに際
し、前述のラットトロンボモジュリンをコードする制限
酵素地図に示す制限酵素サイトにより特徴付けられるＤ
ＮＡ、又はそのペプチドコード領域の塩基配列を含有す
るＤＮＡ、又はその活性発現部位の塩基配列を含有する
ＤＮＡ（以下、ラットＴＭ遺伝子ともいう）を調製し、
このＤＮＡを、発現ベクターに組み込んで調製すればよ
い。この組み換えＤＮＡにより、ラットＴＭを過発現す
るトランスジェニックラットを作製することができる。
この際用いられる発現ベクターとは、プロモーター、ス
プライシングシグナル、ターミネーター等、ラットＴＭ
をラット生体内で発現させるために必要な各機能部位を
含むものであって、個々のプロモーター、スプライシン
グシグナル、ターミネーター等はラット本来の物であっ
てもよいし、ラット生体内で機能する物であれば、例え
ば、他の種の動物やウィルス由来の物であってもよい。
このトランスジェニックラットの作製に際して、例え
ば、Ｊ．Ｊ．Ｍｕｌｌｉｎｓら［Ｎａｔｕｒｅ，３４
４，５４１−５５５（１９９０）］を参考にすればよ
く、この引例においては、マウスレニン遺伝子のコード
領域及び、その上流約５ｋｂ、下流約９ｋｂの領域を含
む直鎖状のＤＮＡ断片をラット卵細胞に顕微注入操作を
行うことにより、高血圧症モデルラットを作製できるこ
とが確認されているため、本発明の十分な指針となる。

【００３２】また本発明は、ラットＴＭ遺伝子の上流及
び下流のＤＮＡ配列、または、ラットＴＭ遺伝子の活性
発現部分の上流及び下流のＤＮＡ配列と相同性を有する
塩基配列であり、ラットＴＭ遺伝子とハイブリダイズし
得る第１の部位および第２の部位と、ラットＴＭに関す
る任意の変異を起こせしめる第３の配列部位とを含み、
該第３の配列部位は該第１の部位と該第２の部位との間
に存在せしめたＤＮＡ断片を調製し、このＤＮＡ断片に
よりラットＴＭに関する任意の変異を有する組換えＤＮ
Ａとなすことを特徴とするトランスジェニックラットの
作製方法である。

【００３３】上記のトランスジェニックラットの作製方
法においては、例えば、Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉら［Ｍｅｃ
ｈ．Ｄｅｖ．，５１，２６５−２７３（１９９５）］の
方法が参考にできる。上記で、ラットＴＭに関する任意
の変異としては、例えば、過発現、破壊、部分的な欠
失、挿入、置換等が挙げられる。このトランスジェニッ
クラットによれば、ＴＭ遺伝子の遺伝子発現の調節機構
の検討、遺伝子産物の生体への影響、遺伝子産物の過剰
発現や異所性の発現、疾患モデル動物の樹立や動物工場
等に利用することができる。

【００３４】上記（６）において発現ベクターに組み込
むラットＴＭをコードする断片は、ラットＴＭの全長を
コードする断片でもよいし、その一部分を発現するよう
に構築されたＤＮＡ断片でもよい。即ち、本発明は、上
記のＤＮＡをベクターに組み込んだ複製可能な組換え体
ＤＮＡである。

【００３５】また、用いる発現ベクターとしては複製可
能であれば、大腸菌をはじめとする原核生物由来、真菌
由来、酵母由来、昆虫ウィルス由来、脊椎動物ウィルス
由来いずれのベクターでも良いが、宿主として使用する
微生物または細胞に適したものを選択する必要がある。
また、発現物に応じて、宿主細胞−発現ベクター系は適
切な組み合わせが選択される。

【００３６】微生物を宿主として使用する場合、これら
微生物に適したプラスミドベクターが組換え体ＤＮＡの
複製可能な発現ベクターとして一般に用いられる。例え
ば大腸菌を形質転換するためのプラスミドベクターとし
てはプラスミドｐＢＲ３２２やｐＢＲ３２７などを用い
ることができる。プラスミドベクターは通常複製起源、
プロモーター、および組換え体ＤＮＡで形質転換した細
胞を選別するのに有用な表現型を組換え体ＤＮＡに与え
るマーカー遺伝子等を含んでいる。プロモーターの例と
しては、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモータ
ー、トリプトファンプロモーター等が挙げられる。マー
カー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子やテ
トラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。適した発現ベ
クターの例としては、プラスミドｐＢＲ３２２及びｐＢ
Ｒ３２７の他に、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、等が挙げら
れる。

【００３７】酵母で本発明のＤＮＡを発現するためには
複製可能な発現ベクターとして例えばプラスミドＹＲｐ
７を用いることができる。プラスミドＹＲｐ７はｔｒｐ
ｌ遺伝子を含有しており、このｔｒｐｌ遺伝子をマーカ
ー遺伝子として利用することができる。酵母細胞用の発
現ベクターのプロモーターの例としては、３−ホスホグ
リセレートキナーゼまたはエノラーゼ、グリセルアルデ
ヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナ
ーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクト
キナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラー
ゼ、グルコキナーゼ、などの解糖系に関与する酵素類の
遺伝子のプロモーターやアルコールデヒドロゲナーゼ
２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代
謝に関与する酵素、マルトース及びラクトースの利用に
関与する酵素類の遺伝子のプロモーターが挙げられる。
これらのうち、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
トクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与す
る酵素類、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、及びマルトース及びラクトースの利用に
関与する酵素類の遺伝子のプロモーターは、これらのプ
ロモーターによる転写を宿主の培養条件を変えることに
よって制御することができるので有利である。酵母細胞
中における転写や翻訳を制御するための複製起源や終止
コドンおよびその他のＤＮＡ配列としては、酵母細胞に
適している通常の公知のＤＮＡ配列を用いることができ
る。適した発現ベクターの例としては、ＹＥｐ２４（Ａ
ＴＣＣ３７０５１）等が挙げられる。

【００３８】真菌で本発明のＤＮＡを発現するための複
製可能な発現ベクターに用いられるプロモーター及びタ
ーミネーターの例としては、ホスホグリセレートキナー
ゼ（ＰＧＫ）またはグリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、アクチン等の遺伝
子プロモーター及びターミネーターが挙げられる。適し
た発現ベクターの例としては、プラスミドｐＰＧＡＣＹ
２、ｐＢＳＦＡＨＹ８３等が挙げられる。

【００３９】動物細胞で本発明のＤＮＡを発現させるた
めの組換え体ＤＮＡは、一般に遺伝子発現を制御するた
めの機能配列、例えば、複製起源、本発明のＤＮＡの上
流に位置すべきプロモーター、リボゾーム結合部位、ポ
リアデニル化部位や転写終止配列を含有している。本発
明のＤＮＡを真核細胞内で発現させるのに用いることの
できるそのような機能配列はウィルスやウィルス性物質
から得ることができる。例えば、本発明で用いることの
できるプロモーターは、アデノウィルス２、ポリオーマ
ウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、などか
ら得ることができる。特に、アデノウィルス２の主後期
プロモーターやＳＶ４０の初期および後期プロモーター
が好ましい。また、トロンビンのプロテインＣ活性化を
促進する作用を有するヒト肺由来のペプチドをコードす
る遺伝子の上流の位置に本来存在するプロモーターも、
上述の宿主−ベクター系で使用するのに適しているなら
ば使用することができる。複製起源については、外来性
の起源、例えば、アデノウィルス、ポリオーマ、ＳＶ４
０、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）、ウシ乳頭腫ウィ
ルス（ＢＰＶ）等のウィルス由来の複製起源を用いるこ
とができる。また、発現ベクターとして宿主染色体に組
み込まれるような性質を有するベクターを用いる場合、
宿主染色体の複製起源を利用することができる。適した
発現ベクターの例としては、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈ
ｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＢＰＶ−１（９−
１）（ＡＴＣＣ ３７１１１）、ｐＢＰ６９Ｔ（６９−
６）、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６、ＣＤＭ８等が挙げられ
る。

【００４０】また、本発明は、上記の組換え体ＤＮＡに
より形質転換体である。本発明の複製可能な組換え体Ｄ
ＮＡで形質転換された微生物または細胞は、前述のとお
り、組換え体ＤＮＡに与えられた少なくとも１種の表現
型によって形質転換されずに残った親細胞から選別され
る。表現型は少なくとも１種のマーカー遺伝子を組換え
体ＤＮＡに挿入することによって与えることができる。
また複製可能な発現ベクターが本来有しているマーカー
遺伝子を利用することもできる。マーカー遺伝子の例と
しては、例えば、ネオマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝
子やジヒドロ葉酸レダクターゼ（以下“ＤＨＦＲ”と称
する）をコードする遺伝子などが挙げられる。これに関
し、ＤＨＦＲ遺伝子をマーカー遺伝子として用いる場
合、ＤＨＦＲには様々のタイプがあるため、その使用す
るマーカー遺伝子のコードしているＤＨＦＲのタイプに
よって用いるべき宿主を選択しなければならない。例え
ば、マーカー遺伝子として野生型ＤＨＦＲをコードする
遺伝子を用いる場合、宿主としてはＤＨＦＲ欠損株を用
いるのが好ましい。ＤＨＦＲ欠損株はヒポキサンチン、
グリシン及びチミジンを要求するので、ヒポキサンチ
ン、グリシン及びチミジンを含まない培地中では成育で
きない。しかしながら、ＤＨＦＲ欠損株をＤＨＦＲ遺伝
子を含有する組換え体ＤＮＡで形質転換すると、その株
はもはやヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを要求
しなくなり、ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを
含まない培地中でも成育することができる。従って、形
質転換細胞は、ヒポキサンチン、グリシン及びチミジン
についての栄養要求性を判断基準にして形質転換されな
いで残った細胞から容易に選択することができる。

【００４１】一方、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対す
る親和性の低い変異体ＤＨＦＲをコードする遺伝子（以
下“ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子”と称する）をマーカー
遺伝子として用いる場合には、宿主細胞は正常なＤＨＦ
Ｒをコードする遺伝子を有していればよくＤＨＦＲを欠
損している必要はない。その理由は以下のとおりであ
る。正常ＤＨＦＲはＭＴＸによって阻害されるため、正
常ＤＨＦＲをコードする遺伝子を含有する宿主細胞はＭ
ＴＸの存在下ではヒポキサンチン、グリシン及びチミジ
ンを要求する。しかしながら、その宿主細胞がＭＴＸ耐
性ＤＨＦＲ遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡで形質転換
すると形質転換細胞はＭＴＸ存在下においてももはやヒ
ポキサンチン、グリシン及びチミジンを要求しない。従
って、形質転換細胞は、ＭＴＸ存在下におけるヒポキサ
ンチン、グリシン及びチミジンについての栄養要求性を
判断基準として用いて形質転換されていない細胞から選
択することができる。これに関し、真核細胞の大多数が
ＭＴＸ感受性であるのでＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子はマ
ーカー遺伝子として用いるのに好都合である。

【００４２】上記（７）において用いる宿主としては、
大腸菌をはじめとする原核生物、真菌、等の微生物、及
び酵母、昆虫や動物等の細胞いずれでも良いが、用いる
発現ベクターに適したものを選択する必要がある。微生
物の例としては、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、例えばＥ．ｃｏｌｉＫ１
２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３
７）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００、Ｅ．ｃｏｌｉＣ６００
ｈｆｌ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（Ｆ− 、λ− 、
プロトトロフィック、ＡＴＣＣ２７３７５）、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０５並びにＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９；バチ
ラス サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）の如きＢａｃｉｌｌｕｓ属の菌株；サルモネラ チ
フィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ）またはセラチア マーセサンス（Ｓｅｒｒａ
ｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の腸内
菌；シュードモーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の
種々の菌株；およびサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；アス
ペルギルス ニドランス（Ａｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アクレモニウム クリソゲナム
（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）
（ＡＴＣＣ１１５５０）等の真菌類等が挙げられる。細
胞の例としては、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｃ
Ｖ−１細胞、ＶＥＲＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８
１）、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター（ＣＨ
Ｏ）細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ハムスターＡＶ
−１２−６６４細胞、ヒト２９３細胞などが挙げられる
が、好ましくは、ＣＯＳ−１細胞である。

【００４３】また、細胞を宿主とする場合、用いられる
発現ベクターと宿主細胞の組み合わせは実験の目的によ
り異なるが、その組み合わせにより、一過的発現、構成
的発現の２種類の発現方式が考えられる。一過的な発現
の場合、その組み合わせは、発現用ベクターが、ＳＶ４
０の複製開始点を含むものであり、好ましくはｐＳＶ２
−Ｘ、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６であり、宿主細胞は、Ｓ
Ｖ４０のＴ抗原産生能を持つ細胞株であり、好ましく
は、ＣＯＳ−１細胞またはＣＯＳ−７細胞である。構成
的な発現の場合、染色体外で安定に維持される宿主ベク
ター系を用いるか、発現ベクターが宿主染色体内に安定
に機能する形で挿入される宿主−ベクター系が使用され
る。宿主染色体内へ挿入する場合には、生産性を上げる
ために、薬剤により遺伝子増幅を起こすマーカー遺伝子
を発現ベクターに組み込み同時に導入する方法も用いる
事ができる。用いられる遺伝子増幅能を持つマーカー遺
伝子−薬剤の組み合わわせは、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄ
ｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＤ）−Ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙ
ｃｉｎ（ｄＣＦ）、Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅ
ｄｕｃｔａｓｅ（ＤＨＦＲ）−Ｍｅｔｈｔｏｒｅｘａｔ
ｅ（ＭＴＸ）、Ｇｕｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔ
ａｓｅ（ＧＳ）−Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｐｈｏ
ｘｉｍｉｎｅ（ＭＳＸ）が挙げられるが、好ましくは、
ＤＨＦＲ−ＭＴＸの組み合わせである。

【００４４】また、上記（７）における微生物及び細胞
の形質転換とは、ＤＮＡを強制的方法や細胞の貪食能に
より微生物や細胞に取りこませ、プラスミド状態あるい
は、染色体に組み込まれた状態でＤＮＡの形質を一過的
にあるいは構成的に発現させることである。動物細胞の
場合、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム
法、電気窄孔法などのいずれの方法でも導入することで
きが、特に好ましくは、［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｐ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，
Ｉｎｃ．，９．２．１−６（１９９３）］記載のＤＥＡ
Ｅ−デキストラン法であり、ＤＥＡＥ−デキストランと
ＤＮＡの複合体を形成後、細胞に導入する方法である。
この際のＤＮＡの形状は前述の通り、環状ＤＮＡであっ
てもよいし、線状ＤＮＡであってもよい。

【００４５】上記（７）で得られた形質転換体を培養
し、本発明のペプチドを発現させる場合で、一過的な発
現で細胞表面上に発現させる場合は、形質転換後数日で
細胞を回収する。その培養期間は、通常、２〜４日、好
ましくは２日である。また、一過的な発現で培養上清中
に分泌させる場合は、２〜３日毎に培地交換を繰り返し
ながら培養する。培養期間は通常数週間、好ましくは２
週間である。構成的に発現させる場合で、ＤＨＦＲ−Ｍ
ＴＸ系による遺伝子増幅を行う場合は、ＭＴＸ濃度の漸
増する濃度条件下で選択される。ＭＴＸの漸増を行うに
際しては、連続的にまたは、段階的に行なえばよいが、
通常は、段階的が好ましい。ＭＴＸの濃度の範囲は、通
常２０ｎＭ〜１００ｍＭ、好ましくは、２０ｎＭ〜１０
ｍＭである。高生産細胞を得るためには、ＭＴＸの濃度
は、初期濃度の３〜１０倍づつ増加させ、段階はできる
だけ多く行なうのが好ましいが、少なくとも、５段階以
上行うことが好ましい。さらに、各段階でラットＴＭの
生産性を調べながら行なうのが好ましい。また、ＭＴＸ
選択後の生産細胞について、ＭＴＸ有無による長期継代
を行い、生産性の低下しない安定生産株を選択すること
が好ましい。この長期継代の期間は通常１〜６カ月で、
好ましくは１〜２カ月が例示される。

【００４６】本発明の製造方法でラットＴＭを製造する
に際しては、上述の方法で得られたラットＴＭ生産細胞
を、各種の動物細胞培養法、例えば、シャーレ培養、マ
ルチトレー式培養、モジュール培養などの付着培養、ま
たは、細胞培養用担体（マイクロキャリアー）に付着さ
せるか生産細胞自体を浮遊化させ浮遊培養等の公知の方
法により培養を行なえばよい。培地は、通常良く用いら
れる動物細胞用培地、例えばＤ−ＭＥＭやＲＰＭＩ１６
４０等を用いればよい。また、必要に応じて血清を添加
してもよいし、さらに、生産性の向上を図るために、ア
ミノ酸、ビタミン、核酸、脂質等を添加してもよい。培
養温度は使用する細胞により異なるが、一般的に３７℃
が好ましい。培養液の回収法は、付着培養か浮遊培養か
で異なるが、バッチ式の回収法でもよいし、培養液を潅
流して連続的に回収することもできる。培養後、通常の
公知の方法、例えばイオン交換、アッフィニティー、ゲ
ルろ過等の通常の公知のカラムクロマトグラフィー等を
単独または組み合わせて用いることにより精製ラットＴ
Ｍ及びその類縁体を単離することができる。

【００４７】このようにして得られた本発明のペプチド
としては、配列番号１、２または、３に示されるペプチ
ドが挙げられる。このようにして得られたペプチドは様
々な種類と長さの糖鎖を少なくとも１種含有していても
よい。得られたペプチドが糖鎖を含有しているか否かは
用いる宿主細胞の種類によって異なる。また、ペプチド
が糖鎖を含有している場合の糖鎖の種類や長さも用いる
宿主細胞の種類によって異なる。

【００４８】一般に翻訳開始シグナルのＡＴＧから翻訳
されたペプチドは宿主細胞から分泌されるときにプロセ
ッシングを受けて成熟蛋白になることが知られている。
本発明のペプチドの場合もそのようなプロセッシングを
受けることがある。ペプチドがプロセッシングを受ける
部位は、宿主により、または培養条件により変化する場
合がある。例えば、本発明で発現されるペプチドは、ヒ
トＴＭとの比較により推測される配列番号１８の１−１
８のアミノ酸配列 Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ からなるリーダー配列とを含むプロセッシングを受けて
いない未成熟形で形質転換細胞中で産生される場合、そ
の未成熟形ペプチドはプロセッシングを受けてリーダー
配列が削除されて成熟形となることがある。しかしなが
ら、前述のように未成熟形ペプチドのプロセッシングを
受ける位置は使用する宿主の種類や宿主の培養条件によ
り変化するので必ずしも上記のようなプロセッシングが
起きるとは限らない。よって最終的に得られたペプチド
は上記アミノ酸配列で表されるリーダー配列の一部また
は全部を含有していてもよい。また、本発明のペプチド
はＮ末端アミノ酸残基としてアミノ酸メチオニンを含有
していてもよい。

【００４９】自然の変異によりまたは人工の変異によ
り、ペプチドの活性に重大な変化を与えることなく、ペ
プチドの構造の一部を変化させることが可能である。本
発明のペプチドは、前記アミノ酸配列を有するペプチド
の相同変異体（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｖａｒｉａｎ
ｔ）に相当する構造を有するペプチドも包含する。ヒト
ＴＭに関しては、４５５番目のアミノ酸残基に関してＶ
ａｌとＡｌａの多型性が存在し、それは活性の変化とは
関係ない中立の変異である事が確認されている。本発明
はこの様なペプチドも包含する。

【００５０】本発明のペプチドは少なくとも１個の糖残
基を含有していてもよいし、含有していなくてもよい。
即ち、本発明では少なくともアミノ酸配列として、本明
細書に説明された配列であることを示すものであって、
特に糖残基により限定されるものではない。前述の通
り、ＴＭは血液凝固線溶機構において重要な機能を有し
ているばかりでなく、その他の多くの新たな機能を有す
ると考えられる。本発明のペプチドは、実験動物として
最も多く用いられるラットの各種実験モデルにおける薬
効評価において、ヒトＴＭの有する種差という問題を解
決し、ＴＭの持つ薬効の正確な評価と新たな薬効探索を
可能にせしめるものである。また、本発明のラットＴＭ
遺伝子、およびトランスジェニックラットは、ＴＭの新
たな機能を探索する事を可能にせしめるものである。従
って、本発明は生体におけるＴＭの機能研究に大きく寄
与するものである。

【００５１】以下に、実施例を挙げて本発明を詳しく説
明するが、本発明は、これらの例になんら限定されるも
のではない。また、以下の実施例において、特に断わら
ない限り、ＤＮＡ断片のアガロースゲルからの分離精製
はジーンクリーン（ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮTMフナコシ社
販）を用いてその添付プロトコールに従って行い、サブ
クローニング、プラスミド構築等における基本操作（Ｄ
ＮＡ断片間の連結反応、該反応により生ずるハイブリッ
ドプラスミドによる大腸菌の形質転換、得られた形質転
換体からのプラスミドの調製及びその解析等）はすべて
上記マニアティスの実験書（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２）に準じ
て行った。

【００５２】

【実施例】

【００５３】

【実施例１】 ラットＴＭ部分ＤＮＡの単離。 配列番号８と９に示された塩基配列からなるミックスプ
ライマー並びに鋳型ＤＮＡとして、ラット染色体ＤＮＡ
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社より購入：ＣＡＴ．Ｎｏ．６７５
０−１）を用いてＰＣＲを行う事により、ラットＴＭの
一部をコードするＤＮＡ断片を取得した。以下に実験の
詳細を記述する。

【００５４】ＰＣＲは、１０倍濃度の反応緩衝液（Ｔａ
ｋａｒａ Ｔａｑに添付のバッファー:宝酒造販）５μ
ｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰ混合液５μｌ、上記プライマー
ＴＭ１、ＴＭ２各々２．５μｌ（各々濃度は２μｇ／μ
ｌの溶液）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ
ｒＴａｑ：宝酒造）０．５μｌ、ラット染色体ＤＮＡ
（濃度０．１μｇ／μｌの溶液）１μｌ、ジメチルスル
ホキシド２．５μｌ、滅菌脱イオン水３１μｌからなる
反応系を調整し、９４℃で４０秒間、６０℃で１分間、
７２℃で４０秒間のインキュベーションをパーキン エ
ルマー シータス ＤＮＡ サーマル サイクラー（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＣｅｔｕｓＤＮＡ Ｔｈｅｒ
ｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）を使用して４０サイクル行っ
た。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動により解
析したところ約７００ｂｐのバンドが検出された。そこ
で該断片をゲルから抽出し、ＴＡクローニングシステム
（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）に
クローン化した後、その塩基配列をサンガーらの方法
［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７
４，５４６３（１９７７）］に基づき、アプライドバイ
オシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）社製の３７３ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用い
て決定した。配列を解析した結果、アミノ酸レベルでヒ
トのＴＭと６５％、マウスのＴＭと８１％、ウシのＴＭ
と６６％の相同性を有する単一の読み取り枠が見いださ
れた。そして、該部分ＤＮＡ断片（約５００ｎｇ）をジ
ゴキシゲニン標識デオキシウリジン３リン酸（ＤＩＧ−
ｄＵＴＰ）で標識し、ＲＴＭプローブと称し、以下のハ
イブリダイゼーションに供した。尚、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ
による標識は、ノンラジオシステムＤＮＡ標識システム
（ＤＮＡ ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ：Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ）を用い、それに付属するプロトコールに従って行
った。

【００５５】

【実施例２】 ラットＴＭ遺伝子の単離 ａ．ハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニングＣＬＯＮＴＥＣＨ社より購入し
たラット染色体ＤＮＡライブラリー（λＥＭＢＬ３ Ｓ
Ｐ６／Ｔ７：ＣＡＴ．：ＲＬ１０２２ｊ）の一部を大腸
菌ＬＥ３９２株に感染させ、Ｌ−ブロス寒天培地上（１
５０ｍｍプレート１２枚）に約４０万個のプラークを形
成させた。次いで該プラークをハイボンドＮ（アマーシ
ャム社）に、アマーシャム社の添付プロトコールに従っ
て転写し、アルカリ変性、中和処理を行い、ＵＶ−照射
でＤＮＡを固定した。かくして得たフィルターを上記実
施例１で得たＲＴＭブローブとハイブリダイゼーション
させた。ハイブリダブリダイゼーションは、５０％ホル
ムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ塩化ナトリウム／７
５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０.０２％ＳＤＳ、２％
ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎ：Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、０.１％Ｎ−ラウロイルザルコ
シン及び終濃度１０ｎｇ／ｍｌでＤＩＧ−ｄＵＴＰラベ
ル化ＲＴＭプローブ（１００℃で５分間の熱変性処理後
に添加した）を含有する溶液を用いて、４２℃で１６時
間行った。次いで、フィルターを０.１％のＳＤＳを含
む２×ＳＳＣ溶液中、室温で１０分間ずつ２回洗浄し、
更に０.１％のＳＤＳを含む０.１×ＳＳＣ溶液中６８℃
で１５分間ずつ２回洗浄した。次いで、アルカリフォス
ファターゼ標識された抗ジゴキシゲニン抗体及び発光基
質ＡＭＰＰＤを利用した検出キット（ＤＩＧ Ｌｕｍｉ
ｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ：Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ）を使用し、その添付プロトコールに従
って、ＲＴＭプローブとハイブリダイズしたクローンの
検出を行った。その結果４個の陽性スポットが見い出さ
れた。そこで、これら陽性スポットに相応する寒天領域
よりファージを抽出し、再度上記の工程に従ってプラー
クハイブリダイゼーションを行い、４個の純化ポジティ
ブファージクロ−ンを得た。 ｂ．ＴＭ遺伝子のサブクローニング及びその位置の限定 上記ａ．で得たファージクローン４種より、グロスバー
ガー（Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒ）記載の方法［文献：Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ１５，６
７３７（１９８７）］に従ってＤＮＡを抽出した。次い
でこのλＤＮＡをＥｃｏＲＩまたはＸｂａＩで消化し
て、アガロースゲル電気泳動を行った後、ＲＴＭプロー
ブを用いてサザンハイブリダイゼーション［方法につい
ては文献：サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３，（１９７５］を行っ
た。尚、ハイブリダイゼーション、フィルター（ハイボ
ンドＮ）の洗浄、シグナルの検出等の操作は、上記ａ．
に記載したものと同様に行った。その結果、上記４種の
λクローン中２種において共通に存在する約４.８ｋｂ
のＲｃｏＲＩ断片または約４．６ｋｂのＸｂａＩ断片が
該プローブとハイブリダイズする事が判明した。また、
ラット染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩまたはＸｂａＩで消化
し、同上のサザン解析を行ったところ、この場合もＥｃ
ｏＲＩ消化では約４．８ｋｂの断片、ＸｂａＩ消化では
約４．６ｋｂの断片にのみハイブリダイゼーションシグ
ナルが観察された。そこでこれら２種のλクローンの１
種よりＥｃｏＲＩ４．８ｋｂ、ＸｂａＩ４．６ｋｂの両
断片を分離精製し、ｐＵＣ１１８（宝酒造販）のＥｃｏ
ＲＩ部位またはＸｂａＩ部位にサブクローニングする事
によって、ｐＲＴＭＥ２またはｐＲＴＭＸ２を取得し
た。尚、ｐＲＴＭＥ２をＥｃｏＲＩで切断した後または
ｐＲＴＭＸ２をＸｂａＩで消化した後、再度同上のサザ
ン解析を行い、該プラスミドが所望のインサートを担っ
ているという事を確認した。なお、ｐＲＴＭＸ２のラッ
ト由来ＤＮＡ部分をＲＴＭＸ２、ｐＲＴＭＥ２のラット
由来ＤＮＡ部分をＲＴＭＥ２とした。次に、ｐＲＴＭＥ
２とｐＲＴＭＸ２を種々の制限酵素で切断し、アガロー
スゲル電気泳動により解析した結果、図１に示される
５．３ｋｂインサートの制限酵素地図が得られた。ま
た、得られたプラスミドｐＲＴＭＥ２を保持する微生物
は、Escherichia coli DH5/pRTME2 （ＦＥＲＭ Ｐ−１
５４９９）として工業技術引用例生命工学工業技術研究
所に寄託されている。 ｃ．ラットＴＭ遺伝子の塩基配列 上記５．３ｋｂ断片の全塩基配列をサンガーらの方法に
基づき決定した。本ＤＮＡ配列には、１３８６番目に始
まるＡＴＧから３１１９番で終わるＴＧＡまで、５７７
個のアミノ酸をコードしうるオープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦ）が存在していた。コンピュータ検索の結
果、本アミノ酸配列は、ヒトのＴＭと約６５％、マウス
のＴＭと約８５％の相同性を示した。なお決定した５２
８３ｂｐの配列を予想される翻訳産物とともに配列番号
１７に示した。

【００５６】

【実施例３】 ラットＴＭの発現 ａ．発現プラスミドの構築 （１）以下に説明する工程に従って、配列番号３に示す
５５９アミノ酸からなるペプチドをＣＯＳ−１細胞で発
現させるためのプラスミドｐＳＶ２ＲＴＭを構築した。

【００５７】発現ベクターｐＳＶ２のＨｉｎｄＩＩＩと
ＢｇｌＩＩ部位に上記遺伝子領域を挿入するために以下
に示す２種類のＰＣＲ反応を行い、２種類のＤＮＡ断片
を作製した。まず配列番号１０、１１に示す２種類の化
学合成ＤＮＡをプライマーを用い、ｐＲＴＭＥ２を鋳型
ＤＮＡとしてＰＣＲを行い、得られた約１．２ｋｂのＤ
ＮＡ分離し、ＴＡクローニングシステム（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ社）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）にクローン化した
後、その塩基配列を決定し配列に誤りの無いことを確認
した。そして該プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨ
Ｉで消化後、アガロースゲル電気泳動に供し約１．２ｋ
ｂの断片をゲルから回収、精製した（断片１）。次に、
配列表配列番号１２、１３に示す２種類の化学合成ＤＮ
Ａをプライマーを用い、ｐＲＴＭＥ２を鋳型ＤＮＡとし
てＰＣＲを行い、得られた約０．７ｋｂのＤＮＡ分離
し、ＴＡクローニングシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を
用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）にクローン化した後、その
塩基配列を決定し配列に誤りの無いことを確認した。そ
して該プラスミドをＢａｍＨＩで消化後、アガロースゲ
ル電気泳動に供し約０．７ｋｂの断片をゲルから回収、
精製した（断片２）。続いて発現ベクターｐＳＶ２−ｄ
ｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）をＨｉｎｄＩＩＩとＢ
ｇｌＩＩで消化してＳＶ４０の初期転写プロモーター及
びＳＶ４０の転写ターミネーターを有する断片を得、そ
の断片と、上記断片１、断片２の３者をＴ４−リガーゼ
で連結することによりｐＳＶ２ＲＴＭを得た。最後にｐ
ＳＶ２ＲＴＭの制限酵素解析を行い、正しく構築されて
いることを確認した。この構築の過程を図２に示した。
なおＰＣＲは、１０倍濃度の反応緩衝液（ＴａＫａＲａ
Ｅｘ Ｔａｑに添付のバッファー:宝酒造販）５μｌ、
２．５ｍＭｄＮＴＰ混合液５μｌ、上記プライマー各々
２μｌ（各々濃度は０．１μｇ／μｌの溶液）、ＴａＫ
ａＲａ Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造）０．５μ
ｌ、ｐＲＴＭＥ２（濃度０．１μｇ／μｌの溶液）１μ
ｌ、滅菌脱イオン水３４．５μｌからなる反応系を調整
し、９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒間、７２℃で１
分間のインキュベーションをパーキン エルマー シー
タス ＤＮＡ サーマル サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃ
ｙｃｌｅｒ）を使用して１５サイクル行った。 （２）以下に説明する工程に従って、配列番号２に示す
５００アミノ酸からなるペプチドをＣＯＳ−１細胞で発
現させるためのプラスミドｐＳＶ２ＲＴＭ１２３を構築
した。

【００５８】発現ベクターｐＳＶ２のＨｉｎｄＩＩＩと
ＢｇｌＩＩ部位に上記遺伝子領域を挿入するために以下
に示すＰＣＲ反応を行い、０．５ｋｂのＤＮＡ断片を作
製した。配列番号１２、１４に示す２種類の化学合成Ｄ
ＮＡをプライマーを用い、ｐＲＴＭＥ２を鋳型ＤＮＡと
してＰＣＲを行い、得られた約０．５ｋｂのＤＮＡ分離
し、ＴＡクローニングシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を
用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）にクローン化した後、その
塩基配列を決定し配列に誤りの無いことを確認した。そ
して該プラスミドをＢａｍＨＩで消化後、アガロースゲ
ル電気泳動に供し約０．５ｋｂの断片をゲルから回収、
精製した（断片３）。続いて発現ベクターｐＳＶ２−ｄ
ｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）をＨｉｎｄＩＩＩとＢ
ｇｌＩＩで消化してＳＶ４０の初期転写プロモーター及
びＳＶ４０の転写ターミネーターを有する断片を得、そ
の断片と、上記断片１、断片３の３者をＴ４−リガーゼ
で連結することによりｐＳＶ２ＲＴＭ１２３を得た。最
後にｐＳＶ２ＲＴＭ１２３の制限酵素解析を行い、正し
く構築されていることを確認した。この構築の過程を図
３に示した。なおＰＣＲは、１０倍濃度の反応緩衝液
（ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑに添付のバッファー:宝酒
造販）５μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰ混合液５μｌ、上記
プライマー各々２μｌ（各々濃度は０．１μｇ／μｌの
溶液）、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（宝
酒造）０．５μｌ、ｐＲＴＭＥ２（濃度０．１μｇ／μ
ｌの溶液）１μｌ、滅菌脱イオン水３４．５μｌからな
る反応系を調整し、９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒
間、７２℃で１分間のインキュベーションをパーキン
エルマー シータス ＤＮＡ サーマル サイクラー
（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ Ｔ
ｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）を使用して１５サイクル
行った。 （３）以下に説明する工程に従って、配列番号１に示す
１１４アミノ酸からなるペプチドをＣＯＳ−１細胞で発
現させるためのプラスミドｐＳＶ２ＲＴＭＥ４５６を構
築した。

【００５９】発現ベクターｐＳＶ２のＨｉｎｄＩＩＩと
ＢｇｌＩＩ部位に上記遺伝子領域を挿入するために以下
に示す部位特異的変異反応とＰＣＲ反応を行った。ま
ず、上記実施例３−ａ−（１）で構築した断片１、上記
実施例３−ａ−（２）で構築した断片３及び、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩとＢａｍＨＩで消化したＭ１３ｍｐ１９とＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結させＭ１３ｍｐ１９ＲＴＭ１２３を
構築し、制限酵素解析により正しく構築されているのを
確認した。更に、特願昭６３−２０２７に記載されてい
る公知の部位特異的変異法により配列番号１５に示す２
５塩基の合成ＤＮＡを用い配列番号２に示されるペプチ
ドの１９番目から３６５番目のアミノ酸をコードするＤ
ＮＡを欠失させたＤＮＡを得た。このプラスミドＤＮＡ
をＭ１３ｍｐ１９ＲＴＭ１２３Ｄと称した。次にその塩
基配列を決定し配列に誤りの無いことを確認した。更
に、配列番号１０、１６に示す２種類の化学合成ＤＮＡ
をプライマー、Ｍ１３ｍｐ１９ＲＴＭ１２３Ｄを鋳型Ｄ
ＮＡとしてＰＣＲを行い、得られた約０．４ｋｂのＤＮ
Ａ分離し、ＴＡクローニングシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ
社）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）にクローン化した
後、その塩基配列を決定し配列に誤りの無いことを確認
した。そして該プラスミドをＨｉｎｄＩＩ及びＢａｍＨ
Ｉで消化後、アガロースゲル電気泳動に供し約０．４ｋ
ｂの断片をゲルから回収、精製した（断片４）。続いて
発現ベクターｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４
６）をＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌＩＩで消化してＳＶ４０
の初期転写プロモーター及びＳＶ４０の転写ターミネー
ターを有する断片を得、その断片と、上記断片４の２者
をＴ４−リガーゼで連結することによりｐＳＶ２ＲＴＭ
Ｅ４５６を得た。最後にｐＳＶ２ＲＴＭＥ４５６の制限
酵素解析を行い、正しく構築されていることを確認し
た。この構築の過程を図４に示した。なおＰＣＲは、１
０倍濃度の反応緩衝液（ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑに
添付のバッファー:宝酒造販）５μｌ、２．５ｍＭｄＮ
ＴＰ混合液５μｌ、上記プライマー各々２μｌ（各々濃
度は０．１μｇ／μｌの溶液）、ＴａＫａＲａ Ｅｘ
Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造）０．５μｌ、ｐＲＴＭＥ
２（濃度０．１μｇ／μｌの溶液）１μｌ、滅菌脱イオ
ン水３４．５μｌからなる反応系を調整し、９４℃で３
０秒間、６４℃で３０秒間、７２℃で１分間のインキュ
ベーションをパーキン エルマー シータス ＤＮＡ
サーマル サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ
ｅｔｕｓ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）を
使用して１５サイクル行った。 ｂ．動物細胞におけるラットＴＭの発現 上記工程で得られた発現プラスミドｐＳＶ２ＲＴＭ、ｐ
ＳＶ２ＲＴＭ１２３及び、ｐＳＶ２ＲＴＭＥ４５６をそ
れぞれＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｄｙ Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ
ｏｎｓ．Ｉｎｃ．，９．２．１−６（１９９３）］によ
りＣＯＳ−１細胞へトランスフェクションした。導入の
２日前にＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）
２Ｘ１０6個を直径１０ｃｍディシュ（ファルコン ３
００３）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（以下ＦＣＳ
と略す）含有ダルベッコ変法イーグル培地（Ｆｌｏｗ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製、１０−３３１、以下ＤＭＥ
Ｍ培地と略す。）を使用して継代し、３７℃、５％炭酸
ガスの条件で炭酸ガスインキュベーター内で培養する。
導入当日、培地を除去し、１０ｍｌの滅菌ＰＢＳ溶液
（日水）で洗浄後、１０％（ｖ／ｖ）Ｎｕｓｅｒｕｍ
（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉ
ｎｃ．）を含むＤＭＥＭ培地４ｍｌを加える。次に、上
記ａで構築したプラスミドを濃度０．１７μｇ／μｌで
ＴＢＳに溶解したＤＮＡ溶液６０μｌを ３７℃に加温
した１０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）ＤＥＡＥ−デキストラン
（Ｓｉｇｍａ）を含むＴＢＳ溶液１２０μｌに添加撹は
んした溶液を作製し、細胞に均一に滴下する。炭酸ガス
インキュベーター内で３７℃で４時間培養後、ディシュ
内の溶液を除去し、１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ（Ｍｅ
ｒｋ）を含むＰＢＳ溶液５ｍｌを加え室温で１分間静置
する。ディシュ内の溶液を除去し、ＰＢＳ溶液５ｍｌで
１回洗浄する。１００μＭクロロキン（ｓｉｇｍａ）及
び２％ＦＣＳ含有のＤＭＥＭ培地を７ｍｌ添加し、炭酸
ガスインキュベーター内で３７℃で３時間培養後、ＰＢ
Ｓ溶液１０ｍｌで１回洗浄する。１０％（ｖ／ｖ）ＦＣ
Ｓ含有のＤＭＥＭ培地を１０ｍｌ加え、炭酸ガスインキ
ュベーター内で３７℃で２日間培養する。２日後、培地
を除去し、３７℃に暖めたＰＢＳ１０ｍｌで洗浄する。
次いで、３７℃に暖めたＤＭＥＭ培地１０ｍｌで洗浄す
る。次いで３７℃に暖めたＤＭＥＭ１０ｍｌを加え、炭
酸ガスインキュベーター内で３７℃で４日間培養する。
ｐＳＶ２ＲＴＭ場合は、４日後に細胞をスクレイパーで
かきとって回収した。ｐＳＶ２ＲＴＭ１２３とｐＳＶ２
ＲＴＭＥ４５６の場合は、４日後に発現したペプチドを
含む上清を回収する。以後４日毎に４回上清液を回収し
た。また、上記実験で使用したＴＢＳは以下の通り作製
した。：Ａ液（８０ｇ／ＬＮａＣｌ、３．８ｇ ＫＣ
ｌ、２ｇ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、３０ｇ／Ｌ Ｔｒｉｓｂ
ａｓｅを蒸留水に溶解した液）１０ｍｌを８９ｍｌの蒸
留水に加え、撹はんしながらＢ液（１５ｇ／Ｌ ＣａＣ
ｌ2、１０ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ2で蒸留水に溶解した液）１
ｍｌをゆっくり滴下しｐＨを７．５に調整後、フィルタ
ー濾過により滅菌した。 ｃ．トロンビンによるプロテインＣの活性化の促進活性
の確認 発現したラットＴＭのトロンビンによるプロテインＣの
活性化の促進活性の測定は、合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−
Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｂｏｃ及びＭＣＡは
それぞれｔ−ブトキシカルボニル基及び４−メチルクマ
リル−７−アミドの略称である）を用いる公知のプロテ
インＣ測定法〔Ｙ．Ｏｈｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
９０、１３８７（１９８１年）〕に従って行なった。

【００６０】すなわち、１０倍濃度アッセイ緩衝液（１
％ ＢＳＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＣａＣｌ2を
含むトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．５）５μｌ、７５ＮＩＨ
Ｕ／ｍｌのヒトトロンビン溶液３μｌ、蒸留水２９．５
μｌを混合した溶液にラットＴＭを含む培養上清５μｌ
及び３００ｎｇ／ｍｌのウシプロテインＣ溶液７．５μ
ｌを加え全量を５０μｌとする。得られた混合物を３７
℃で３０分間反応させてプロテインＣを活性化した後
に、０．３ Ａ280 ／ｍｌのアンチトロンビンＩＩＩ及
び、１００μｇ／ｍｌのヘパリン（和光純薬工業社
製）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を７．５μｌ加えて３７℃で
１５分間保温して反応を停止させた。得られた反応混合
物に、前述の合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ 研究所）１００μ
ｇ／ｍｌ、５０ｍＭ塩化セシウム、１００ｍＭＮａＣｌ
を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）５００
μｌを加え、３７℃で２０分間反応させた後、酢酸５０
μｌを加えて反応を停止させ、遊離してきたＡＭＣ（７
−アミノ−７−メチル−クマリン）の濃度を励起波長３
８０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍで蛍光光度計Ｆ−２００
０（日立）により測定した。１分間に１ｐｍｏｌのウシ
プロテインＣを活性化しＡＰＣとする量を１ｕｎｉｔと
した。

【００６１】ｐＳＶ２ＲＴＭを導入した細胞をそのまま
１００μｌのＰＢＳに懸濁し活性を測定したところ５０
ｕ／ｍｌのトロンビンによるプロテインＣの活性化の促
進活性が確認された。ｐＳＶ２ＲＴＭ１２３を導入後４
日目の培養上清に、１９５０ｕ／ｍｌのトロンビンによ
るプロテインＣの活性化の促進活性が確認された。ｐＳ
Ｖ２ＲＴＭＥ４５６を導入後４日目の培養上清に、２５
００ｕ／ｍｌのトロンビンによるプロテインＣの活性化
の促進活性が確認された。 ｄ．ラットＴＭの精製 上記実施例３−ｂと同様の操作により、ｐＳＶ２ＲＴＭ
１２３及びｐＳＶ２ＲＴＭＥ４５６を用いてＤＥＡＥ−
デキストラン法によるＣＯＳ−１細胞へトランスフェク
ションを 各々４０回繰り返し、各々２Ｌの培養上清液
を回収した。ｐＳＶ２ＲＴＭ１２３をトランスフェクト
した培養上清液については、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含
む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化し
たＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラ
ム（直径２６ｍｍ、高さ１０ｃｍ）に供した。５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）及び１．０Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し、各フラクションの
トロンビンによるプロテインＣの活性化の促進活性を測
定した。このふたつの活性画分を１００ｍＭ ＮａＣｌ
及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析した。Ｑ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅの５００ｍＭＮａＣｌ溶出画分の透析後の
液を、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシ
ウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で
平衡化したＤＩＰ−トロンビン−アガロース（ＰＡＥＳ
ＥＬＬＯＲＥＩ、０６−１４８−１０３５、直径９０ｍ
ｍ、高さ２２ｃｍ）に供した。２００ｍＭ ＮａＣｌ及
び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、１．０Ｍ ＮａＣｌ及
び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。この溶出画分の各フ
ラクションのトロンビンによるプロテインＣの活性化の
促進活性を測定したところ強い活性が確認された。この
画分をＲＴＭ−１とした。一方、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅの１．０Ｍ ＮａＣｌ溶出画分の透析後の液を、１０
０ｍＭＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロース（ＰＡＥＳＥＬ ＬＯＲ
ＥＩ、０６−１４８−１０３５、直径９０ｍｍ、高さ２
２ｃｍ）に供した。２００ｍＭＮａＣｌ及び０．５ｍＭ
塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で洗浄後、１．０Ｍ ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ
塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で溶出した。この溶出画分の各フラクションの
トロンビンによるプロテインＣの活性化の促進活性を測
定したところ強い活性が確認された。この画分をＲＴＭ
−２とした。ＢＳＡを標準としてＬｏｗｒｙ法で蛋白定
量を行った結果、ＲＴＭ−１画分として１．５ｍｇ、Ｒ
ＴＭ−２画分として２ｍｇの蛋白が回収された。このふ
たつの活性画分について還元、非還元の両条件でＳＤＳ
−ＰＡＧＥ電気泳動を行ない、銀染色により検出したと
ころＲＴＭ−１画分については還元で約９６ｋＤａ、非
還元で約８０ｋＤａの１本のバンドが検出された。ＲＴ
Ｍ−２画分については還元で約１０５ｋＤａ、非還元で
約９０ｋＤａの１本のバンドが検出された。結果を図５
に示す。

【００６２】ｐＳＶ２ＲＴＭＥ４５６をトランスフェク
トした培養上清液については、１５０ｍＭ ＮａＣｌを
含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化
したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カ
ラム（直径２６ｍｍ、高さ１０ｃｍ）に供した。１．０
Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で溶出し、フラクションのトロンビンによるプ
ロテインＣの活性化の促進活性を測定した。この活性画
分を１００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウ
ムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対
して透析し、透析後の液を、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び
０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＩＰ−トロンビン−
アガロース（ＰＡＥＳＥＬ ＬＯＲＥＩ、０６−１４８
−１０３５、直径９０ｍｍ、高さ２２ｃｍ）に供した。
２００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを
含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄
後、１．０Ｍ ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウム
を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出
した。この溶出画分の各フラクションのトロンビンによ
るプロテインＣの活性化の促進活性を測定したところ強
い活性が確認され、この画分をＲＴＭ−Ｅとした。ＢＳ
Ａを標準としてＬｏｗｒｙ法で蛋白定量を行った結果、
ＲＴＭ−Ｅ画分として２ｍｇの蛋白が回収された。ま
た、この活性画分について還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ
電気泳動を行ない、銀染色により検出したところ約３０
ｋＤａの１本のバンドが検出された。

【００６３】

【実施例４】 ラットＴＭの溶解性 上記実施例３−（３）−ｄで精製したＲＴＭ−１、ＲＴ
Ｍ−２、ＲＴＭ−Ｅ各々の溶液について、分子量３００
０カットの透析膜を用い、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有
する２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）に対して
十分に透析を行った後、ペンシル型モジュール及びセン
トリコン等を用いて濃縮を行い、０．２ｍｇ／ｍｌの濃
度の溶液を調製した。さらに、該溶液を５ｍｌずつガラ
スバイアルに分注し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥は、
−４０℃で１８時間予備凍結し、−４０〜＋２０℃、真
空度０．０５〜０．０１ｍｍＨｇで４０時間一次乾燥
し、ついで２０℃、真空度０．０５〜０．０１ｍｍＨｇ
で６時間二次乾燥した。

【００６４】凍結乾燥後、ＲＴＭ−１、ＲＴＭ−２、Ｒ
ＴＭ−Ｅ各々のバイアルについて注射用蒸留水０．５ｍ
ｌを加え、完全に溶解することを確認した。すなわち、
本発明のペプチドは、少なくとも２ｍｇ／ｍｌの溶解性
を有し、界面活性剤の非存在下においても極めて可溶性
であることが確認された。

【００６５】

【発明の効果】本発明によれば、ラットＴＭまたはその
誘導体ペプチドの大量調製が可能となり、ラット実験モ
デルでのＴＭ薬効の正確な評価が可能となる。また、本
発明のラットＴＭ遺伝子や、トランスジェニックラット
によりＴＭの新たな機能を探索する事が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のラットＴＭをコードするＤＮＡの制限
酵素マップ、および実施例２で得られたプラスミドＲＴ
ＭＥ２とＲＴＭＸ２の制限酵素マップを示す。図中の斜
線部分は、リーダー配列をコードする塩基配列部分であ
る。また、斜交線部分、または前記の斜線部分と斜交線
部分を合わせた部分は、ペプチドコード領域の塩基配列
を示す。

【図２】実施例３−ａ−（１）で作製したプラスミドｐ
ＳＶ２ＲＴＭの構築を示したフローチャートである。

【図３】実施例３−ａ−（２）で作製したプラスミドｐ
ＳＶ２ＲＴＭ１２３の構築を示したフローチャートであ
る。

【図４】実施例３−ａ−（３）で作製したプラスミドｐ
ＳＶ２ＲＴＭＥ４５６の構築を示したフローチャートで
ある。

【図５】実施例３−ｃで精製したラットトロンボモジュ
リンの還元条件下（レーン１〜３）、及び非還元条件下
（レーン４〜６）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を
示す図である。レーン１及び６は、分子量マーカーであ
る。レーン２及び５はＲＴＭ−１、レーン３及び４はＲ
ＴＭ−２である。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：114 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Pro Cys Phe Arg Ser Lys Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Val Asn 1 5 10 15 Ser Thr His Tyr Asn Cys Ile Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Lys Leu 20 25 30 Asp Asp Pro Asp Arg Cys Glu Met Phe Cys Asn Glu Thr Ser Cys Pro 35 40 45 Ala Asp Cys Asp Pro Asn Ser Pro Ser Phe Cys Gln Cys Pro Glu Gly 50 55 60 Phe Ile Leu Asp Glu Gly Ser Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Ser 65 70 75 80 Gln Gly Glu Cys Leu Thr Asn Glu Cys Arg Asn Leu Pro Gly Ser Tyr 85 90 95 Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Thr Ala Leu Ala Gly Gln Ile Ser Lys 100 105 110 Asp Cys 配列番号：2 配列の長さ：500 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Leu Ala Lys Leu Gln Pro Lys Gly Ser Gln Cys Val Gly Asn Glu 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Phe Gln Asp Pro Val Thr Phe Leu Asp Ala Ser Gln 20 25 30 Ala Cys Gln Arg Leu Gln Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Val Ser Asp Ser Ser Met Asp Ser 50 55 60 Arg Pro Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Gln Gly Cys Gly Asp Pro Val 65 70 75 80 His Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp Asn His 85 90 95 Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Pro Asn Asp Gln Ser Pro Pro Leu 100 105 110 Cys Gly Pro Leu Cys Val Thr Val Ser Thr Ala Thr Glu Ala Ala Pro 115 120 125 Gly Glu Pro Ala Trp Glu Glu Lys Pro Cys Glu Asn Glu Thr Lys Gly 130 135 140 Phe Leu Cys Glu Phe Tyr Phe Ala Ala Phe Cys Arg Pro Leu Arg Val 145 150 155 160 Asn Thr Arg Asp Pro Glu Gly Ala His Ile Ser Ser Thr Tyr Asn Thr 165 170 175 Pro Leu Gly Val Ser Gly Ala Asp Phe Gln Thr Leu Pro Ile Gly Ser 180 185 190 Ser Ala Thr Val Ala Pro Phe Gly Leu Glu Leu Val Cys Arg Ala Leu 195 200 205 Pro Gly Thr Ser Glu Gly His Trp Thr Arg Glu Val Thr Gly Ala Trp 210 215 220 Asn Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu Tyr Met Cys Asn Arg Ser 225 230 235 240 Ala Asn Gly Pro Arg Cys Val Cys Pro Ser Gly Gly Asp Leu Gln Ala 245 250 255 Asp Gly Arg Ser Cys Ala Lys Pro Val Ala Gln Leu Cys Asn Glu Leu 260 265 270 Cys Gln His Phe Cys Val Asn Asn Ser Asp Val Pro Gly Ser Tyr Ser 275 280 285 Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Gln Leu Ala Ala Asp Gly His Arg Cys 290 295 300 Glu Asp Val Asp Asp Cys Lys Gln Gly Pro Asn Pro Cys Pro Gln Leu 305 310 315 320 Cys Ser Asn Thr Glu Gly Gly Phe Glu Cys Arg Cys Tyr Asp Gly Tyr 325 330 335 Glu Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Gln Leu Asp Pro Cys Phe Arg 340 345 350 Ser Lys Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Val Asn Ser Thr His Tyr Asn 355 360 365 Cys Ile Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Lys Leu Asp Asp Pro Asp Arg 370 375 380 Cys Glu Met Phe Cys Asn Glu Thr Ser Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro 385 390 395 400 Asn Ser Pro Ser Phe Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ile Leu Asp Glu 405 410 415 Gly Ser Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Ser Gln Gly Glu Cys Leu 420 425 430 Thr Asn Glu Cys Arg Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Glu Cys Ile Cys Gly 435 440 445 Pro Asp Thr Ala Leu Ala Gly Gln Ile Ser Lys Asp Cys Asp Pro Ile 450 455 460 Pro Val Leu Glu Asp Ser Glu Asp Gly Gly Ser Gly Glu His Pro Ser 465 470 475 480 Ser Asn Pro Thr Val Val Ser Ser Thr Val Pro Pro Ser Ala Arg Pro 485 490 495 Met His Ser Gly 500 配列番号：3 配列の長さ：559 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Leu Ala Lys Leu Gln Pro Lys Gly Ser Gln Cys Val Gly Asn Glu 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Phe Gln Asp Pro Val Thr Phe Leu Asp Ala Ser Gln 20 25 30 Ala Cys Gln Arg Leu Gln Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Val Ser Asp Ser Ser Met Asp Ser 50 55 60 Arg Pro Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Gln Gly Cys Gly Asp Pro Val 65 70 75 80 His Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp Asn His 85 90 95 Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Pro Asn Asp Gln Ser Pro Pro Leu 100 105 110 Cys Gly Pro Leu Cys Val Thr Val Ser Thr Ala Thr Glu Ala Ala Pro 115 120 125 Gly Glu Pro Ala Trp Glu Glu Lys Pro Cys Glu Asn Glu Thr Lys Gly 130 135 140 Phe Leu Cys Glu Phe Tyr Phe Ala Ala Phe Cys Arg Pro Leu Arg Val 145 150 155 160 Asn Thr Arg Asp Pro Glu Gly Ala His Ile Ser Ser Thr Tyr Asn Thr 165 170 175 Pro Leu Gly Val Ser Gly Ala Asp Phe Gln Thr Leu Pro Ile Gly Ser 180 185 190 Ser Ala Thr Val Ala Pro Phe Gly Leu Glu 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ATTCAAGTGG GAAAGGGGGC 480 CCTGATCTCT GAACCCATAC AACACTTGCA CGACATTCTC AAGCAACTAG ATAGGGTCTG 540 GCCTTGGCGA TGCCTGCCCA AGATCAGGGG ATTGCTGTCC AGATGTCAGA ATGGAGAAGA 600 ATGGAGAAGG CTTTGAGGTT ATTAGACCAC TCCATCCTCT TGCTGCCCTA GTATAATTTC 660 CCGGCCTCTT CTAAGGTCAT TTGGGACCCA ACCCCTCTGC TAGTCACAGC AGCCAGGCTT 720 CCTGAGCTCC CATCAGGGAT CTAGCTAATC CTTCTCAGAG TCTTGCAAGT CTCAGACACA 780 CCCTCTACCA GACTCTTCCT TTTTTTCCCC CCTGCCCCAA CTACCAGGCC ATCCTCCAAA 840 CTCTGGTAGC ATCTATAGGG AAGTGTGTGT GTGTACGTGT GCGTTTGCTT GTGTACGTGT 900 GTAGAGGTTT AAAGACAGGC TACCCGTGGG CTATACCGGA GAGTCTGGGA CGGGAACTGT 960 CGACTTGCTG ACACAATTCA GTTCTGTGGT GGCGCCTGCA GGCCACGCCC TAGGGCCTCC 1020 CTACGCCCAG ACAGTGTTTT TAACTCTTCG CACAGAGGTG ATCCCAGGCT GGAGGGCGGG 1080 CACAAGGCGT CCGGAGAACC CAGTAATCCG AGAACGCAGC ATCAGCCCTT CCCACTAGGC 1140 ACTTCCTTCC TTTTCCCGAA CCTCCAGAGA GGGAGGGCCG CGCATTTATA AACTGGAGCC 1200 TCAGCTGAGT GGCATGTCAG AGGCTGCCTC GCAGGGACTA CGAACCTGGG CTAGAAAAGT 1260 CTAGGCTGAG ACAGAGGCTA ACTGCTGTCG CCGCAGACGT ACGAAACCCT CTGCCGGGAC 1320 TGGGTGCCTG CACCATCGCA GTGCTAGCGT TTTCTCGTAG CTTGCACGGT GTTCTCCTGA 1380 ACAGC ATG CTT GGG GTT TTC CTT CTG GGT GTG CTG GCT CCA GCT GGC CTG 1430 Met Leu Gly Val Phe Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Ala Gly Leu 1 5 10 15 GGG ATC TCT GCA CTA GCC AAG CTG CAG CCC AAA GGC AGT CAA TGC GTG 1478 Gly Ile Ser Ala Leu Ala Lys Leu Gln Pro Lys Gly Ser Gln Cys Val 20 25 30 GGG AAT GAG TGC TTC GCG CTT TTC CAG GAC CCC GTG ACC TTC CTC GAT 1526 Gly Asn Glu Cys Phe Ala Leu Phe Gln Asp Pro Val Thr Phe Leu Asp 35 40 45 GCC AGC CAG GCC TGC CAG CGC CTG CAG GGA CAT TTG ATG ACA GTG CGC 1574 Ala Ser Gln Ala Cys Gln Arg Leu Gln Gly His Leu Met Thr Val Arg 50 55 60 TCC TCG GTG GCT GCG GAT GTC ATC TCC CTT CTG GTG AGC GAC AGT AGT 1622 Ser Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Val Ser Asp Ser Ser 65 70 75 ATG GAC TCA CGG CCC TGG ATC GGT TTA CAG CTC CCT CAG GGC TGT GGT 1670 Met Asp Ser Arg Pro Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Gln Gly Cys Gly 80 85 90 95 GAC CCG GTG CAT CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACT GGG 1718 Asp Pro Val His Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly 100 105 110 GAT AAC CAC ACC AGT TAC AGC AGG TGG GCG CGG CCC AAC GAC CAG TCG 1766 Asp Asn His Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Pro Asn Asp Gln Ser 115 120 125 CCT CCA CTT TGC GGT CCG CTG TGC GTC ACG GTC TCA ACA GCA ACA GAA 1814 Pro Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Thr Val Ser Thr Ala Thr Glu 130 135 140 GCT GCA CCA GGC GAG CCG GCC TGG GAA GAG AAG CCG TGC GAG AAC GAG 1862 Ala Ala Pro Gly Glu Pro Ala Trp Glu Glu Lys Pro Cys Glu Asn Glu 145 150 155 ACC AAG GGT TTT CTC TGC GAG TTT TAC TTC GCA GCT TTC TGC AGG CCT 1910 Thr Lys Gly Phe Leu Cys Glu Phe Tyr Phe Ala Ala Phe Cys Arg Pro 160 165 170 175 TTA CGG GTG AAT ACC CGA GAT CCT GAG GGT GCC CAC ATC TCT AGC ACC 1958 Leu Arg Val Asn Thr Arg Asp Pro Glu Gly Ala His Ile Ser Ser Thr 180 185 190 TAC AAT ACC CCA TTG GGG GTC AGC GGC GCG GAT TTT CAG ACG CTG CCG 2006 Tyr Asn Thr Pro Leu Gly Val Ser Gly Ala Asp Phe Gln Thr Leu Pro 195 200 205 ATA GGC AGT TCT GCT ACC GTG GCG CCC TTT GGC TTG GAG CTG GTG TGC 2054 Ile Gly Ser Ser Ala Thr Val Ala Pro Phe Gly Leu Glu Leu Val Cys 210 215 220 AGG GCC CTG CCC GGA ACT TCA GAG GGA CAC TGG ACT CGG GAA GTG ACA 2102 Arg Ala Leu Pro Gly Thr Ser Glu Gly His Trp Thr Arg Glu Val Thr 225 230 235 GGA GCT TGG AAC TGC AGC GTG GAG AAT GGT GGC TGC GAG TAC ATG TGC 2150 Gly Ala Trp Asn Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu Tyr Met Cys 240 245 250 255 AAC AGG AGC GCT AAC GGA CCC AGA TGC GTC TGC CCC AGC GGC GGG GAC 2198 Asn Arg Ser Ala Asn Gly Pro Arg Cys Val Cys Pro Ser Gly Gly Asp 260 265 270 CTG CAG GCT GAT GGC CGT TCG TGC GCA AAA CCT GTG GCT CAA TTG TGC 2246 Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Ala Lys Pro Val Ala Gln Leu Cys 275 280 285 AAC GAA CTC TGC CAG CAT TTT TGC GTC AAC AAC TCT GAT GTG CCA GGC 2294 Asn Glu Leu Cys Gln His Phe Cys Val Asn Asn Ser Asp Val Pro Gly 290 295 300 TCT TAT TCC TGT ATG TGC GAA ACA GGC TAC CAG TTG GCG GCA GAC GGA 2342 Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Gln Leu Ala Ala Asp Gly 305 310 315 CAT CGG TGT GAG GAC GTG GAT GAC TGT AAG CAG GGG CCC AAT CCA TGC 2390 His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Lys Gln Gly Pro Asn Pro Cys 320 325 330 335 CCT CAG CTC TGT TCT AAC ACC GAG GGC GGC TTC GAA TGC CGC TGC TAT 2438 Pro Gln Leu Cys Ser Asn Thr Glu Gly Gly Phe Glu Cys Arg Cys Tyr 340 345 350 GAT GGC TAT GAG TTG GTG GAC GGA GAG TGC GTG GAG CAA CTG GAT CCG 2486 Asp Gly Tyr Glu Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Gln Leu Asp Pro 355 360 365 TGC TTC AGA TCT AAA TGC GAG TAT CAG TGC CAG CCA GTA AAC TCC ACG 2534 Cys Phe Arg Ser Lys Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Val Asn Ser Thr 370 375 380 CAC TAC AAT TGC ATC TGT GCT GAG GGC TTC GCA CCT AAG CTG GAT GAT 2582 His Tyr Asn Cys Ile Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Lys Leu Asp Asp 385 390 395 CCC GAC AGG TGC GAA ATG TTC TGC AAT GAA ACT TCG TGC CCA GCA GAC 2630 Pro Asp Arg Cys Glu Met Phe Cys Asn Glu Thr Ser Cys Pro Ala Asp 400 405 410 415 TGT GAC CCC AAC TCC CCA AGC TTT TGT CAA TGC CCT GAG GGC TTC ATC 2678 Cys Asp Pro Asn Ser Pro Ser Phe Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ile 420 425 430 CTG GAC GAG GGT TCC ATA TGC ACA GAC ATT GAT GAG TGC AGT CAA GGC 2726 Leu Asp Glu Gly Ser Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Ser Gln Gly 435 440 445 GAA TGC CTC ACC AAT GAA TGT CGA AAC CTT CCT GGC TCC TAT GAG TGC 2774 Glu Cys Leu Thr Asn Glu Cys Arg Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Glu Cys 450 455 460 ATC TGC GGA CCT GAC ACA GCC CTT GCT GGT CAG ATT AGC AAG GAC TGT 2822 Ile Cys Gly Pro Asp Thr Ala Leu Ala Gly Gln Ile Ser Lys Asp Cys 465 470 475 GAC CCC ATC CCT GTT CTG GAG GAC TCA GAG GAT GGT GGC TCT GGG GAG 2870 Asp Pro Ile Pro Val Leu Glu Asp Ser Glu Asp Gly Gly Ser Gly Glu 480 485 490 495 CAC CCA TCA AGC AAT CCG ACG GTA GTC TCT TCG ACA GTT CCC CCT TCT 2918 His Pro Ser Ser Asn Pro Thr Val Val Ser Ser Thr Val Pro Pro Ser 500 505 510 GCA AGA CCA ATG CAC TCT GGT GTG CTC ATT GGG ATC TCC ATT GCC AGC 2966 Ala Arg Pro Met His Ser Gly Val Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser 515 520 525 CTG TCC CTG GTG GTG GCG CTT TTG GCG CTT CTT TGT CAC CTG CGC AAG 3014 Leu Ser Leu Val Val Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys 530 535 540 AAG CAG GGC ACT GCT CGC GCG GAG CTG GAG TAC AAG TGT ACC TCT TCA 3062 Lys Gln Gly Thr Ala Arg Ala Glu Leu Glu Tyr Lys Cys Thr Ser Ser 545 550 555 GCC AAG GAG GTA GTA CTG CAG CAC GTG AGG ACT GAT CGG ACG CTG CAG 3110 Ala Lys Glu Val Val Leu Gln His Val Arg Thr Asp Arg Thr Leu Gln 560 565 570 575 AAG TTC TGAGGGATTT ACTCCAGAGA CCAAGGTGGC CTTTGTCTTT CCGGGCTCTG 3166 Lys Phe TACCTCTCCT TTCTCTCTCT TCAGCCTCCC AGCTGTGCTC TCTGGCAATG TAAAAGCATT 3226 CTGGCTGGTA TAATAACCAG AGAAGAGCTC ATCCTCTTAT GACAAGCGAG GGTAGGGAGG 3286 ACTTGAAGCC GGAGAGCCCA GTTTCTTCCA AGTAGAGACT GGACAACTGG GCGGAGGTGA 3346 CAAATACAGT GAAGATCCCA GAGTGTCCCA GTCCCTCACC TCGGGGTGCA GGATGTGTGG 3406 GTGCTGCTGA TCTGTAGGCT TGGAGGCAAA CCTTGACCCT ATGGACTGGA GATGACCCAG 3466 ATATTTATTT TTTTAAAAGT ATTTAGTATT TTCTTCCCTT CAGCTTTATT CTGCTTGTAA 3526 GTCTCCAGTC CCTCACCCTT TTCTGTGTCC CTCCATTCCT TTCCCTCCCC TCCCCCTCTC 3586 CATCATTCTC CTCCCCGAAC CTGATCATAG TTTGCCTTTA CCCTTGTCTC CAAACTCTTA 3646 TGTGAAACAG AAAAAAAAAA AACACTAAAC GCAGAAAAAT ATTTTTTTTC GCTAGCTTTG 3706 GCAATTTAAT CGGGGATTTC AGGTAACCAG AGCAAAAGAA TTTAAACAAA AGTTAAAATG 3766 TTTCAACTGA ACACTAACTA GTTAATAGTG CTGGAATATC ACAGAATTTA AACTCAAGGA 3826 AGTAGGGTTT TGATTTTTTT TAATCTTTGT TTTTGAAAGG GTGAGCCTGG GTTTTATGAT 3886 TGTTGCTGTT GTTTTTTTTT TTATTTAGAA TGACAAAAGA GGTAATAATT ATTAAACTTT 3946 TTATGCCGGC TTCTACAGTG TTATTAATTT TTGACAGTGT TTCAAATGTG CAGAGGATCC 4006 TTTGTCCAAC CCTTTGACAT TCCAATAGGA CATTGCCATC TTCAGACATA TTGGGCCACA 4066 TTCATAGCTA TCCAAGAATG TATGTGGTCC TTAGCCTGGA CATATCTGAG ACGGATGGAT 4126 GGAAGCATCT TCCAGTAAAG CTTGAGCTGT ATGCTTCGTG CCTGGCTGAC TCTCCACTGT 4186 GTTTGCCACT TGTAGTCCCA AAATAAAAGC AATGTGCTGC TTAGGGAGAT ATGGCAACTT 4246 GGGAAAGGAG TCTGGGGGGT GACTAGATGG GACTTTGCTT TAATGAAACT CTGGAACGAT 4306 ATCTTGTACT TCAGAGAGAT CTACTAGCCC TGGCCTATAC ACAAGAATTG GGACCTCCCT 4366 TGGGATCTGG CTAGAATTGC AAAATCCTAA CCCCCACCCT ACCCCACTCC CACCCCAGTG 4426 AGCCAGTTCA TAAGAAGCTG CATTTTGACA ACATCCACAG GGCATTGTCC AGTCATTTCA 4486 GGACAACTGG TCTAAAGAGT TTCCAACTTC TTGAGAACAT TTAAATGTCA CTTAATAATA 4546 AGTAGCAGGC CATATGCAGG CCATTTTTTA ATAAAGAAAC TGAGGAATTT TCTCTGCATA 4606 GCTTTGCTTT CTGGATAAAA TAAAAGGACC AGGTACATGC CTCTAGATAT TGGCATACAG 4666 AGTCCAGAAG GGTTTTGTTT TAAGTAAGCT AGGAATGAGT TCATATGTCA GTGTAAGGAA 4726 CAAATGTATC ATATGTGTAT CTTTTGTGAA GAAAAGGTTT TCTTTACTGT TTTGTAGGCT 4786 CAGCATATCT GTACATATTT ATTTATTGGA GTTTAGCTAG AACACAAGCA AAGCCTTTGC 4846 TTATGACGTC ACGTGTATAA AATAAATAGA TTACAATGTA CCGATGGGTG TCTCCTTCCT 4906 TTCTCTCCTC CAAGTCCCTT CATTTTTAAA TCTTATTTTA TACTCAGAAA CAATGCCAAC 4966 TGCAGGAGAT ACATTCCAGG CTGGACTGCA TCTTTACGGC CTACCTGCCG CCCAATCTCT 5026 GACGTTGCCT TCCAAGAGGA GGCTCTTTTC CATGTAACAG GAGTTTGTTA CCTTTGTATG 5086 CACAGATATT TTTTTTTATG TGTATGACCG TAGCAACCTT ATATTGGAGG CCTCGTGTCT 5146 GTGTTTTCAG ACACACTCTA GGATCTGAGG GAATCTTTAG CCTCCCAACT GAGGGTCATT 5206 CTGTGTGTGC GTCATTATTG CCTGTTATCT GGCATGTAAA ACTCAACTTT GTCATGAGAG 5266 GTCTACGGCT CGAATTC 5283 配列番号：18 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Leu Gly Val Phe Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Ile Ser

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＣＢ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＢ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号３の１−５５９のアミノ酸配列
   の部分配列からなり、トロンビンに結合しトロンビンに
   よるプロテインＣの活性化を促進する活性を有するペプ
   チド。
2. 【請求項２】 該ペプチドが、蒸留水ｍｌ当たり少なく
   とも２ｍｇ溶解する可溶性ペプチドであることを特徴と
   する請求項１に記載のペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号２の１−５００のアミノ酸配列
   の全配列又は部分配列からなり、トロンビンに結合しト
   ロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する活性を
   有するペプチド。
4. 【請求項４】 該部分配列中に、少なくとも配列番号１
   の１−１１４のアミノ酸配列が包含されていることを特
   徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
5. 【請求項５】 配列番号２の１−５００のアミノ酸配
   列、または配列番号１の１−１１４のアミノ酸配列のい
   ずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載のペプチ
   ドをコードするＤＮＡ。
7. 【請求項７】 配列番号５の１−１５００の塩基配列、
   または配列番号４の１−３４２の塩基配列のいずれかの
   塩基配列から実質的になるＤＮＡ。
8. 【請求項８】 ラットトロンボモジュリンをコードする
   下記の制限酵素地図 【化１】 に示す制限酵素サイトにより特徴付けられるＤＮＡ、又
   はそのペプチドコード領域の塩基配列を含有するＤＮ
   Ａ。
9. 【請求項９】 配列番号３の１−５５９のアミノ酸配列
   をコードするＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 配列番号６の１−１６７７の塩基配列
    のいずれかの塩基配列から実質的になる請求項９に記載
    のＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 請求項６〜１０のいずれかに記載のＤ
    ＮＡに対する相補的なＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 請求項６〜１１のいずれかに記載のＤ
    ＮＡをベクターに組み込んだ複製可能な組換え体ＤＮ
    Ａ。
13. 【請求項１３】 請求項１２のいずれかに記載の組換え
    体ＤＮＡにより形質転換体。
14. 【請求項１４】 請求項１３の形質転換体を培養して取
    得することを特徴とする請求項１〜５のペプチド、又は
    ラットトロンボモジュリンペプチドの製造法。
15. 【請求項１５】 ラットトロンボモジュリンをコードす
    る下記の制限酵素地図 【化２】 に示す制限酵素サイトにより特徴付けられるＤＮＡ、又
    はそのペプチドコード領域の塩基配列を含有するＤＮ
    Ａ、又はその活性発現部位の塩基配列を含有するＤＮＡ
    を調製し、このＤＮＡを、または発現ベクターに組み込
    んで調製された組み換えＤＮＡを、ラットに導入し、ラ
    ットＴＭの過発現を引き起こすことを特徴とするトラン
    スジェニックラットの作製方法。
16. 【請求項１６】 ラットＴＭ遺伝子の上流及び下流のＤ
    ＮＡ配列、または、ラットＴＭ遺伝子の活性発現部分の
    上流及び下流のＤＮＡ配列と相同性を有する塩基配列で
    あり、ラットＴＭ遺伝子とハイブリダイズし得る第１の
    部位および第２の部位と、ラットＴＭに関する任意の変
    異を起こせしめる第３の配列部位とを含み、該第３の配
    列部位は該第１の部位と該第２の部位との間に存在せし
    めたＤＮＡ断片を調製し、このＤＮＡ断片によりラット
    ＴＭに関する任意の変異を有する組換えＤＮＡとなすこ
    とを特徴とするトランスジェニックラットの作製方法。
17. 【請求項１７】 請求項１５または１６に記載の作製方
    法により作製されたトランスジェニックラット。