JP3527250B2

JP3527250B2 - Ｇｄｐ―フコースピロホスホリラーゼをコードする核酸

Info

Publication number: JP3527250B2
Application number: JP53650197A
Authority: JP
Inventors: エム．ケチャン，キャサリン
Original assignee: ニオズテクノロジーズインコーポレイティド
Priority date: 1996-04-10
Filing date: 1997-04-10
Publication date: 2004-05-17
Anticipated expiration: 2017-04-10
Also published as: JP2002503082A; EP0904101A1; EP0904101A4; EP0904101B1; WO1997037683A1; CA2251465A1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、単離されたGDP−フコースピロホスホリラ
ーゼ酵素類及びそれらをコードする核酸に関する。前記
酵素は特に、オリゴ糖類の合成において有用である。

発明の背景細胞の表面上での認識要素としての炭水化物の役割の
理解の増加は、定義された構造の炭水化物分子の生成に
関する関心を高めている。たとえば、シアリルルイス
（sialyl Lewis）リガンド、シアリルルイス（sialyl
Lewis^x）及びシアリルルイス（sialyl Lewis^a）を含
んで成る化合物は、受容体、たとえばELAM−１及びGMP1
40受容体に結合する白血球及び非白血球細胞系に存在す
る。Polleyなど.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:6224（1
991）及び、Phillipsなど.,Science,250:1130（199
0）、並びにまた、U.S.S.N.08/063,181を参照のこと。

所望の炭水化物構造の製造への興味のため、グリコシ
ルトランスフェラーゼ類、及び炭水化物の酵素−触媒さ
れた合成におけるそれらの役割が現在、広範に研究され
ている。それらの酵素は、高い特異性を示し、そして定
義された配列の炭水化物構造の形成において有用であ
る。従って、グリコシルトランスフェラーゼは、治療及
び他の目的のために使用される多くの炭水化物類の合成
において酵素触媒としてますます使用されている（Ito
など.,Pure Appl.Chem.,65:753（1993）；アメリカ特許
第5,352,670号及び第5,374,541号）。

所望の炭水化物化合物の合成は、グリコシルトランス
フェラーゼ、たとえばβ−1,4−ガラクトシルトランス
フェラーゼ及びα−2,3−シアリルトランスフェラーゼ
を用いる酵素サイクルを用いて予備的規模で達成されて
来た（たとえば、アメリカ特許第5,374,541号;WO942561
5;及びIchikawa,など.,J.Am.Chem.Soc.,114:9283−9298
（1992）を参照のこと）。

フコシルトランスフェラーゼはクローン化され、そし
て発現されて来たが、グアノシン５−ジホスホ−β−Ｌ
−フコース（GDP−フコース）、すなわちフコシルトラ
ンスフェラーゼのためのドナー基質の生成のための酵素
は容易に入手できない。フコシルトランスフェラーゼサ
イクルの使用は、GDP−フコースが酵素的に容易に再生
され得る場合、非常に促進されるであろう。

発明の要約本発明は、単離されたGDP−フコースピロホルホリラ
ーゼ（GDPFPP）酵素類、及びそれらをコードする核酸類
を含んで成る組成物を供給する。

本発明のタンパク質は、種々の由来に起因し、そして
配列番号２に示されるような配列を有するタンパク質に
対して生成される抗体に特異的に結合する。本発明のタ
ンパク質の特定の例、すなわち本明細書に定義されるよ
うなGDP−フコースピロホスホリラーゼ活性、約66KDの
分子量、及び配列番号２示されるような配列を有するタ
ンパク質が提供される。

本発明の核酸は、種々の由来に起因し、そして典型的
には、配列番号１に示されるような配列を有する核酸に
対して緊縮（strrngent）条件下でハイブリダイズす
る。核酸は、その核酸に作用可能に連結されたプロモー
ターを含んで成る適切な組換えDNA構造体中に組み込ま
れ得る。前記プロモーターは、いづれか所望の細胞、た
とえば哺乳類細胞、昆虫細胞、菌類細胞及び同様のもの
の発現を指示するために選択され得る。

本発明はさらに、緊縮条件下で配列番号１に対して特
異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、配列番
号２に対して特異的に結合する抗体又は抗血清、及び配
列番号２と特異的に交差反応し、そしてGDPFPP活性を有
するタンパク質を含む（単独で、又は組合して）組成物
及びキットを含んで成る。

定義：本明細書において使用される場合、“GDP−フコース
ピロホスホリラーゼ”は、次の反応:GTP＋フコースＩ−
Ｐ→GDP−フコース＋PPiを触媒することができる単離さ
れたポリペプチド又はタンパク質調製物である。前記用
語はさらに、配列番号２に対する特異的抗血清と特異的
に交差反応するタンパク質を意味し、そして明確には包
含する。

“保存性置換”とは、タンパク質を記載する場合、タ
ンパク質の活性を実質的に変更しないタンパク質中のア
ミノ酸組成の変化を意味する。従って、特定のアミノ酸
配列の“保存的に修飾された変更”とは、必須のアミノ
酸の置換が活性を実質的に変えないように、タンパク質
活性のために必須ではないアミノ酸のアミノ酸置換、又
は類似する性質（たとえば酸性、塩基性、正に又は負に
荷電された、極性又は非極性、等）を有する他のアミノ
酸によるアミノ酸の置換を意味する。機能的に類似する
アミノ酸を提供する保存性置換表は、当業界において良
く知られている。次の６種のグループは、お互いのため
の保存性置換性であるアミノ酸をそれぞれ含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン
（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン
（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプ
トファン（Ｗ）。

さらに、Creighton（1984）Proteins W.H.Freeman an
d Companyを参照のこと。さらに、コードされた配列に
おける単一のアミノ酸、又は数％のアミノ酸を置換し、
付加し、又は欠失する個々の置換、付加又は欠失はま
た、“保存的に修飾された変更”である。

用語“単離された”とは、その生来の状態において見
出されるような酵素に通常、付随する成分を実質的に有
さない物質を意味する。従って、本発明の酵素は、それ
らの所在環境に通常関連する物質を含まない。典型的に
は、本発明の単離されたタンパク質は、銀染色されたゲ
ル上でのバンド強さにより測定される場合、少なくとも
約80％の純度、通常少なくとも約90％の純度、そして好
ましくは少なくとも約95％の純度である。ポリペプチド
は、トランスジェニック細胞、又はそれらが天然に発現
される細胞から精製される。

本発明のGDP−フコースピロホスホリラーゼ酵素の例
は、約66KDの分子量及びGDPFPP活性を有するタンパク質
である。GDPFPP酵素活性は、多くの手段でアッセイされ
得る。３つの好ましいアッセイは下記に詳細に示され
る。単離される場合、本発明の精製されたGDPFPPは、ア
ッセイ＃２に記載される条件下でGTP及びフコース１−
リン酸からのGDP−フコースの生成を一般的に触媒する
であろう。

２種のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、それら
の２種の配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸残基の
配列が、最大の対応で整列される場合に同じである場
合、“同一”であると言われる。比較のための配列の最
適な整列は、Smith and Waterman Adv.Appl.Math.2:482
（1981）の局部相同アルゴリズムにより、Needleman an
d Wunsch J.Mol.Biol.48:443（1970）の相同整列アルゴ
リズムにより、Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad.Sc
i.（USA）85:2444（1988）の類似性法についての調査に
より、それらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Sof
tware Package,Genetics Computer Group,575 Science
Dr.,Madison,WIにおけるGAP,BESTFIT,RASTA及びTFAST
A）のコンピューター処理された実施により、又は検査
により実施され得る。

用語“実質的な同一性”とは、ポリペプチドが、約20
個〜約600個の残基、典型的には約50〜約500個の残基、
通常、約250〜300個の残基の比較領域にわたって対照の
配列と比較される場合、少なくとも80％の配列同一性、
好ましくは90％、より好ましくは95％又はそれ以上の同
一性を有する配列を含んで成ることを意味する。％同一
性の値は、上記プログラムを用いて決定される。

ポリペプチド配列が実質的に同一であるもう１つの表
示は、１つのタンパク質が、他のタンパク質に対して生
じさせた抗体と免疫反応する場合である。従って、本発
明のGDPFPP酵素は、配列番号２に示されるような配列を
有するタンパク質に対して生じさせた抗体と免疫学的に
反応するポリペプチドを包含する。タンパク質又はペプ
チドに対して言及する場合、句“抗体に対して特異的に
結合する”、又は“〜と特異的に免疫反応する”とは、
タンパク質及び他の生物学的物質の異種集団の存在下で
タンパク質の存在の決定因子である結合反応を言及す
る。従って、企画されたイムノアッセイ条件下で、特定
の抗体は特定のタンパク質に結合し、そしてサンプルに
存在する他のタンパク質に有意な量で結合しない。その
ような条件下での抗体に対する特異的結合は、特定のタ
ンパク質に対するその特異性のために選択される抗体を
必要とする。種々のイムノアッセイ型が、特定の抗体と
特異的に免疫反応する抗体を選択するために使用され得
る。たとえば、固相ELISAイムノアッセイは、タンパク
質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択す
るために通常使用される。特異的免疫反応性を決定する
ために使用され得るイムノアッセイ型及び条件の記載の
ためには、Harlow and Lane（1988）Antibodies,Labora
tory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New Yo
rkを参照のこと。

ヌクレオチド配列が実質的に同一であるもう１つの表
示は、２種の分子が緊縮条件下でお互いに対してハイブ
リダイズする場合である。緊縮条件は、配列−依存性で
あり、そして異なった環境下で異なるであろう。一般的
に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びpHで特定の
配列についての熱溶融点（Tm）よりも約５℃〜約20℃、
通常、約10℃〜約15℃低く選択される。Tmは、標的配列
の50％が完全に適合したプローブにハイブリダイズする
温度（定義されたイオン強度及びpH下で）である。典型
的には、緊縮条件は、塩濃度がpH7で約0.02モル濃度で
あり、そして温度が少なくとも約60℃である条件であろ
う。たとえば、標準のサザンハイブリダイゼーション方
法においては、緊縮条件は、42℃での６×SSCでの初期
洗浄、続いて、少なくとも約55℃、典型的には約60℃及
びしばしば約65℃の温度での0.2×SSCにおける１又は複
数回の追加の洗浄を包含するであろう。

ヌクレオチド配列はまた、それらがコードするポリペ
プチドが実質的に同一である場合、この本発明のために
は実質的に同一である。従って、１つの核酸配列が第２
の核酸配列と実質的に同じポリペプチドをコードする場
合、それらの２つの核酸配列は、たとえそれらが遺伝子
コードにより可能にされるサイレント置換のために緊縮
条件下でハイブリダイズしない場合でさえ、実質的に同
一である（コドン縮重及び遺伝子コードの説明のために
は、Darnellなど．（1990）Molecular Cell Biology,Se
cond Edition Scientific American Books W.H.Freeman
and Company New Yorkを参照のこと）。

タンパク質の純度又は相同性は、当業界においてよく
知られている多くの手段、たとえばタンパク質サンプル
のポリアクリルアミドゲル電気泳動、続く染色に基づく
可視化により示され得る。ある目的のためには、高い分
離能が必要とされ、そしてHPLC又は精製のための類似す
る手段が利用されるであろう。

用語“残基”とは、アミド結合又はアミド結合擬似物
によりオリゴペプチドに組込まれるアミノ酸（Ｄ又は
Ｌ）又はアミノ酸擬似物を意味する。本発明のアミド結
合擬似物は、当業界においてよく知られているペプチド
の鎖修飾を包含する。

発明の特定の記載本発明は、単離されたGDP−フコースピロホスホリラ
ーゼ（GDPFPP）及びその酵素をコードする核酸を供給す
る。この核酸は、種々の用途に使用され得る酵素を組換
え発現するために使用される。特に有用な用途は、炭水
化物の合成におけるフコシルトランスフェラーゼサイク
ルでのGDP−フコースの再生のためである。

GDP−フコースの代謝に包含される酵素についてはほ
とんど知られていない。ほとんどの生物において、GDP
−フコースは、次の３種の別個の酵素活性の連続的作用
によりGDP−マンノースから形成される:GDP−Ｄ−マン
ノース−4,6−デヒドラターゼ、エピマー化及び還元を
なし遂げる単一のタンパク質、及びGDP−４−ケト−６
−デオキシ−Ｄ−マンノース−3,5−エピメラーゼ−４
−レダクターゼ（Ginsburg,など.,J.Biol.Chem.,236,23
89−2393（1961）及びChang,など.,J.Biol.Chem.,263,1
693−1697（1988））。マイナーな又は“掃去する”経
路がまた存在し、ここで遊離フコースがフコシナーゼに
よりリン酸化されてフコース１−リン酸が生じ、このも
のはグアノシン−５′−三リン酸と共にGDP−フコース
ピロホスホリラーゼにより使用されてGDP−フコースを
生成する（Ginsburg,など.,J.Biol.Chem.,236,2389−23
93（1961）及びReitman,J.Biol.Chem.,255,9900−9906
（1980））。

本発明の酵素は、少なくとも１つのグリコシルトラン
スフェラーゼ（たとえば、フコシルトランスフェラー
ゼ）、GDPFPPの使用により反応の間に通常形成されるド
ナー基質（たとえば、GDP−フコース）、受容体糖、及
び二価金属カチオンを含んで成る反応媒体において生じ
るグリコシド結合の形成のための方法において特に有用
である。前記方法は、基質サッカライドへのサッカライ
ドの付加を触媒するためにグリコシルトランスフェラー
ゼの使用に頼る。前記付加は、生物分子上のオリゴ糖又
は炭水化物成分の非還元端で生じる。本明細書において
定義されるような生物分子は、生物学的に有意な分子、
たとえばタンパク質（たとえば、糖タンパク質）、及び
脂質（たとえば、糖脂質、リン酸質、スフィンゴ脂質及
びガングリオシド）を包含するが、但しそれらだけには
限定されない。それらの方法において、典型的には、反
応媒体における金属カチオンの濃度を約2mM〜約75mMの
間に満たすために、グリコシド結合の形成の間、二価の
金属イオン濃度が補充される。

次の略語が本明細書において使用される： Ara ＝アラビノシル； Fru ＝フラクトシル； Fuc ＝フコシル； Gal ＝ガラクトシル； GalNAc ＝Ｎ−アセチルガラクト； Glc ＝グルコシル； ClcNAc ＝Ｎ−アセチルグルコ； Man ＝マンノシル；及び NeuAc ＝シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）。

オリゴ糖は、還元端でのサッカリドが実際に還元糖で
あろうとなかろうと、還元端及び非還元端を有すると思
われる。許容された命名法によれば、オリゴ糖は、本明
細書においては、左側に非還元端及び右側に還元端を有
するように示される。

本明細書に記載されるすべてのオリゴ糖は、非還元糖
についての名称又は略語（たとえば、Gal）により、続
いてグリコシド結合（α又はβ）の配置、環結合、その
結合に包含される還元糖の環位置、及び次に、還元糖の
名称又は略語（たとえば、GlcNAc）により記載される。
２種の糖間の結合は、たとえば2,3、２→３、又は（2,
3）として表わされ得る。個々の糖は、ピラノースであ
る。

A.一般方法本発明において必要とされる命名法及び一般的実験方
法の多くは、Sambrookなど.,Molecular Cloning A Labo
ratory Manual（2nd Ed.）,vol.1−3,Cold Spring Harb
or Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989に見
出され得る。そのマニュアルは、この後、“Sambrook,
など."として言及される。

本発明の実施は、組換え核酸の構成、及びトランスフ
ェクトされた細胞における遺伝子の発現を包含する。そ
れらの目的を達成するための分子クローニング技法は、
当業界において知られている。組換え核酸の構成のため
に適切な広範囲の種類のクローニング及びインビトロ増
幅方法は、当業者によく知られている。多くのクローニ
ング実験を通して当業者を指示するのに十分なそれらの
技法及び教授は、Berger and Kimmel,GUIDE TO MOLECUL
AR CLONING TECHNIQUES,Methods in Enzymology volume
152 Academic Press,Inc.,San Diego,CA（Berger）；
及びCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,F.M.Aus
ubelなど.,eds.,Current Protocols,Greene Publishing
Associates,Inc.及びJohn Wiley ＆ Sons,Inc.,間のジ
ョイントベンチャー（1994 Supplement）（Ausubel）に
見出される。

インビトロ増幅方法、たとえばポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、Ｑβ−レプリカー
ゼ増幅及び他のRNAポリメラーゼ介在技法を通して当業
者を指図するのに十分な技法の例は、Berger,Sambrook,
and Ausubel,as well as Millisなど.,（1987）アメリ
カ特許第4,683,202号;PCR Protocols A Guide to Metho
ds and Applications（Innisなど.eds）Academic Press
Inc.San Diego,CA（1990）（Innis）;Amheim ＆ Levin
son（October 1,1990）C ＆ EN 36−47;The Journal Of
NIH Research（1991）3,81−94;（Kwohなど．（1989）
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1173;Guatelliなど．（199
0）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,1874;Lomellなど．（19
89）J.Clin.Chem 35,1826;Landegrenなど.,（1988）Sci
ence 241,1077−1080;Van Brunt（1990）Biotechnology
8,291−294;Wu and Wallace,（1989）Gene 4,560;及び
Barringerなど．（1990）Gene 89,107に見出される。イ
ンビトロ増幅された核酸をクローニングする改良された
方法は、Wallaceなど.,アメリカ特許第5,426,039号に記
載される。

本発明に使用される細胞の培養物、たとえば組織又は
血液サンプルからの細胞系及び培養された細胞は、当業
界において良く知られている。Freshney（Culture of A
nimal Cells,A Mannal of Basic Technique,Third Edit
ion,Wiley−Liss,New York（1994））及びそこに引用さ
れる文献は、細胞の培養に対する一般的な案内を提供す
る。

B.GDPFPPをコードするDNAを単離するための方法本発明の核酸組成物は、RNA,cDNA、ゲル、DNA又は種
々の組合せでのハイブリッドであろうと、天然源から単
離され得、又はインビトロ合成され得る。請求される核
酸は、形質転換された又はトランスフェクトされた完全
な細胞中に、形質転換された又はトランスフェクトされ
た細胞溶解物中に、あるいは部分的に精製された又は実
質的に純粋な形で存在することができる。

本発明の酵素をコードする核酸の操作のための、たと
えばポリペプチドをコードする核酸配列を発現ベクター
中にサブクローン化する、プローブをラベリングする、
DNAハイブリダイゼーションのための、及び同様のもの
のための技法は、一般的にSambrookなど．に記載され
る。

組換えDNA技法が、GDPFPPを生成するために使用され
得る。一般的に、前記酵素をコードするDNAはまず、発
現ベクター中への連結のために適切な形でクローン化さ
れ、又は単離される。連結の後、DNAフラグメント又は
挿入体を含むベクターが、組換え酵素の発現のための適
切な宿主細胞中に導入される。次に、酵素が宿主細胞か
ら単離される。

GDPFPPをコードするDNA配列を単離する種々の方法が
存在する。典型的には、DNAは、そのDNAにおける配列に
対して特異的なラベルされたオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いてゲノム又はcDNAライブラリーから単離され
る。DNAライブラリーは、酵素を生成するいづれの生物
又は細胞型から調製され得る。たとえば、原核生物及び
真核生物が用いられ得る。典型的には、核酸は哺乳類細
胞又は組織から調製される。核酸が単離される特定の種
は、十分な活性の酵素がコードされている限り、臨界的
ではない。適切な分離源は、ヒト、ラットマウス、ウサ
ギ、ブタ、及び他の哺乳類を包含する。使用され得る他
の生物は、カエノルハビジチス・エレガンス（Caenorha
bditis elegans）、殺菌ジクチオステリウム・ジスコイ
デウム（Dictyostelium discoideum）、植物、たとえば
ゼア・メイス（Zea mays）、アラヒドプシス・タリアナ
（Arabidopsis thaliana）、ビグナ・ラジアタ（Vigna
radiata）（ヤエナリ）、藻類、たとえばフカス・ガル
ドニエリ（Fucus gardnieri）、細菌、たとえばマイコ
バクテリウム・カンサシ（Mycobacterium kansasii）、
マイコバクテリウム・スズルガイ（Mycobacterium szul
gai）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium
avium）及びマイコバクテリウム・ツベルキュロシス
（Mycobacterium tuberculosis）、ネイセリア・ゴノル
ホエアエ（Nisseria gonorrhoeae）、ネイセリア・メニ
ンギチジス（Neisseria Meningitidis）、及びネセリア
・ラクタミカ（Nesseria lactamica）、ヘリコバクター
・ピロリ（Helicobacter pylori）、ストレプトコーカ
ス・ピヲゲネス（Streptococcus pyogenes）（但し、そ
れらだけに限定されない）、真菌類、たとえばカンジダ
・アルビカンス（Candida albicans）、シゾサッカロミ
セス・ポンベ（Schizosaccaromyces pombe）、アスペル
ギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギル
ス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、ショウジ
ョウバエドロソピラ・メラノガステル（Drosophila m
elanogaster）、両性類、たとえばゼノパス・ラエビス
（Xenopus laevis）、等を包含する。核酸を単離するた
めに使用されるプローブの配列は、本明細書に開示され
る核酸配列に基づく。cDNAライブラリーが使用される場
合、腎臓又は甲状腺組織からのmRNAが典型的には、cDNA
を調製するために使用される（しかしながら、GDPFPP m
RNAは、ヒトcDNAプローブを用いてノザンブロットによ
りアッセイされるすべての組織に偏在して発現され、そ
してmRNAを発現するいづれかの組織が使用され得る）。

ポリメラーゼ連鎖反応はまた、DNAを調製するために
も使用され得る。ポリメラーゼ連鎖反応技法（PCR）
は、mRNAから、cDNAから、及びゲノムライブラリー又は
cDNAライブラリーからGDPFPP核酸配列を直接的に増幅す
るために使用される。

GDPFPP DNAを増幅するための適切なプライマー及びプ
ローブは、DNA配列の分析から生成される。手短に言え
ば、増幅されるべき領域の両側に位置するDNA配列に対
して相補的であるオリゴヌクレオチドプライマーが合成
される。次に、ポリメラーゼ鎖反応が、２種のプライマ
ーを用いて実施される。PCR Protocols:A Guide to Met
hods and Applications（Innis,M.Gelfand,D.,Sninsky,
J.and White,T.,eds.）,Academic Press,San Diego（19
90）を参照のこと。プライマーは、所望される場合、完
全な遺伝子を増幅するために、又はより小さなセグメン
トを増幅するために選択され得る。この目的のための好
ましいプローブは、それぞれ５′−TCA−GAT−ATC−GGG
−GCT−ATG−GCA−GCT−GCT−AG−３′及び５′−ATA−
GAT−ATC−TCT−GGA−ATG−TTA−CTC−AAA−AAG−GCA−
Ａ−３′である。

プローブ及びプライマーとして使用するためのオリゴ
ヌクレオチドは、Needham−VanDevanter,D.R.,など.198
4,Nucleic Acids Res.,12:6159−6168に記載されるよう
に、自動化された合成機を用いて、Beaucage,S.L.and C
aruthers,M.H.,（1981）Terrahedron Letts.,22（20）:
1859−1862により最初に記載された固相ホスホラミジッ
トトリエステル方法に従って化学的に合成される。オリ
ゴヌクレオチドの精製は、常用のアクリルアミドゲル電
気泳動、又はPearson,J.D.and Regnier,F.E.（1983）J.
Chrom.,255:137−149に記載されるようなアニオン−交
換HPLCのいづれかによる。

合成オリゴヌクレオチドの配列は、Maxam,A.M.and Gi
lbert,1980,W.Grossman,L.and Moldave,D.,eds.Academi
c Press,New York,Methods in Enzymology,65:499−560
の化学分解法を用いて確認され得る。

当業者に知られている他の方法もまた、GDPFPP酵素の
すべて又は一部をコードするDNAを単離するために使用
さ得る。Sambrook,などを参照のこと。

C.GDPFPPの発現所望のDNAが単離され、そしてクローン化されると、
組換え的に構築された細胞、たとえば細菌、真菌類（た
とえば、酵母）、昆虫（特に、バキュロウィルスベク
ターを用いる）、及び哺乳類細胞において所望のポリペ
プチドを発現することができる。当業者は、酵素をコー
ドするDNAの発現のために利用できる多くの発現系に見
識があることが予測される。原核生物又は真核生物にお
けるタンパク質の発現のために知られている種々の方法
を詳細に記載する試みは、行なわれないであろう。

手短に要約すると、GDPFPPをコードする天然又は合成
核酸の発現は典型的には、プロモーター（構成的又は誘
導的のいづれかである）にDNA又はcDNAを作用可能に連
結し、続いて発現ベクター中に組込むことによって達成
されるであろう。ベクターは、原核生物又は真核生物の
いづれかにおける複製及び組込みのために適切であり得
る。典型的な発現ベクターは、転写及び翻訳ターミネー
ター、開始配列、及び酵素をコードするDNAの発現の調
節のために有用なプロモーターを含む。クローン化され
た遺伝子の高レベルの発現を得るためには、少なくと
も、転写を指図するための強いプロモーター、翻訳開始
のためのリポソーム結合部位、及び転写／翻訳ターミネ
ーターを含む発現プラスミドを構成することが所望され
る。

1.原核生物における発現 E.コリにおけるこの目的のために適切な調節領域の例
は、Yanofsky,C.,1984,J.Bacteriol.,158:1018−1024に
より記載されるようなE.コリトリプトファン生合成路
のプロモーター及びオペレーター領域、及びHerskowit
z,I.and Hagen,D.,1980,Ann.Rev.Genet.,14:399−445に
より記載されるようなファージλの左方向プロモーター
（P_L）である。E.コリにおいて形質転換されたDNAベク
ターにおける選択マーカーの包含もまた有用である。そ
のようなマーカーの例は、アンピシリン、テトラサイク
リン、又はクロラムフェニコールに対する耐性を示す遺
伝子を包含する。E.コリに使用するための選択マーカー
に関する詳細のためには、Sambrookなどを参照のこと。

ベクターは、適切な宿主細胞中への導入を可能にする
よう選択される。細菌ベクターは典型的には、プラスミ
ド又はファージ起源のものである。適切な細菌細胞は、
ファージベクター粒子により感染され、又は裸のファー
ジベクターDNAによりトランスフェクトされる。プラス
ミドベクターが使用される場合、細菌細胞はプラスミド
ベクターDNAによりトランスフェクトされる。

酵素を発現するための発現系は、E.コリ、バシラスs
p.（Bacillus sp.）（Palva,I.など.,1983,Gene 22:229
−235;Mosbach,K.など.,Nature 302:543−545）、及び
サルモネラ（Salmonella）を用いて入手できる。E.コリ
系が好ましい。

原核細胞により生成されるポリペプチドは、必ずしも
正しく折りたたまれているわけではない。E.コリからの
精製の間、発現されたポリペプチドは、まず、変性さ
れ、そして次に再生され得る。これは、カオトロピック
剤、たとえばグアニジンHClに細菌から生成されたタン
パク質を溶解し、そして還元剤、たとえばβ−メルカプ
トエタノールによりすべてのシステイン残基を還元する
ことによって達成され得る。次に、ポリペプチドが、緩
慢な透析又はゲル濾過のいづれかにより再生される。ア
メリカ特許第4,511,503。

発現された酵素の検出は、ラジオイムノアッセイ、ウ
ェスターンブロット技法、免疫沈殿、又は活性アッセイ
のような当業界において知られている方法により達成さ
れる。E.コリからの精製は、アメリカ特許第4,511,503
号に記載される方法に従って達成され得る。

2.真核生物における発現種々の真核発現系、たとえば真菌類細胞（特に、酵
母）、昆虫細胞系及び哺乳類細胞は、当業者に知られて
いる。下記に手短に説明されるように、酵素はまた、そ
れらの真核系においても発現され得る。

a.真菌類細胞、たとえば酵母における発現組換え発現系への使用の他に、単離されたGDPFPP DNA
配列はまた、菌類細胞においても発現され得る。

真菌類を形質転換するための技法は、文献においてよ
く知られており、そしてたとえば、Beggs,Hinnenなど．
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929−1933（1978））,Y
eltonなど．（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1740−1747
（1984））、及びRussell（Nature 301:167−169（198
3））により記載されている。典型的には、糸状菌、た
とえば菌類アスペルギルス（Aspergillus）の菌株（Mck
nightなど.,アメリカ特許第4,935,349号）が使用され
る。有用なプロモーターの例は、アスペルギラス・ニジ
ュランス（Aspergillus nidulans）解糖系遺伝子に由来
するもの、たとえばADH3プロモーター（Mcknightなど.,
EMBO J.4:2093−2099（1985））及びtpiAプロモーター
を包含する。適切なターミネーターの例は、ADH3ターミ
ネーター（Mcknightなど．）である。そのような成分を
利用する発現単位は、アスペルギルスの染色体DNA中に
挿入できるベクター中にクローン化される。

酵母における異種タンパク質の合成はよく知られてお
り、そして文献に記載されている。Methods in Yeast G
enetics,Sherman F.,など.,Cold Spring Harbor Labora
tory,（1982）は、酵母において酵素を生成するために
利用できる種々の方法を記載する十分に理解された研究
である。

酵母への使用のためのプロモーターの例は、GAL1,10
（Johnson,M.and Davies,R.W.,1984,Mol.and Cell.Bio
l.,4:1440−1448）,ADH2（Russell,D.,など.1983,J.Bio
l.Chem.,258:2674−2682）,PHO5（EMBO J.6:675−680,1
982）、及びMFα１（Herskowitz,I.and Oshima,Y.,198
2,in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomy
ces,eds.Strathern,J.N.Jones,E.W.,and Broach,J.R.,C
old Spring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,N.Y.,pp.
181−209）に記載されているものを包含する。選択マー
カー、たとえばLeu−2,URA−3,Trp−１及びHis−３を有
する複数コピープラスミドがまた所望される。

YEp6,YEp13,YEp4のような多くの酵母発現プラスミド
が、ベクターとして使用され得る。注目の遺伝子は、種
々の酵母ベクターにおけるプロモーターのいづれかに融
合され得る。上記プラスミドは、文献（Botstein,な
ど.,1979,Gene,8:17−24;Broach,など.,1979,Gene,8:12
1−133）に十分に記載されている。

２種の方法が、酵母細胞を形質転換することに使用さ
れる。１つの場合、酵母細胞がまず、ジモリアーゼ；リ
チカーゼ又はグルスラーゼを用いてプロトプラストに転
換され、続いてDNA及びポリエチレングリコール（PEG）
が添加される。PEG−処理されたプロトプラストが次
に、選択条件下で３％寒天培地において再生される。こ
の方法の詳細は、J.D.Beggs,1978,Nature（London）,27
5:104−109;及びHinnen,A.,など.,1978,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,75:1929−1933による文献に記載されてい
る。第２の方法は、細胞壁の除去を包含しない。代わり
に、細胞は塩化リチウム又は酢酸リチウム及びPEGによ
り処理され、そして選択プレート上に置かれる（Ito,
H.,など.,1983,J.Bact.,153:163−168）。

酵素は、細胞を溶解し、そしてその溶解物に標準のタ
ンパク質単離技法を適用することによって酵母から単離
され得る。精製工程のモニターリングは、ウェスターン
ブロット技法、又は他の標準イムノアッセイ技法のラジ
オイムノアッセイを用いることによって達成され得る。

b.哺乳類及び昆虫細胞培養物における発現 GDPFPPの生成のために有用な例示的な細胞培養物は、
昆虫又は哺乳類起源の細胞である。哺乳類細胞系はしば
しば、細胞の単層形で存在し、そして哺乳類細胞懸濁液
もまた使用され得る。哺乳類細胞系の例示的な例は、VE
RO及びHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）
細胞系、W138,BHK,Cos−７又はMDCK細胞系を包含する。

上記に示されるように、ベクター、たとえば宿主細胞
を形質転換するために使用されるプラスミドは好ましく
は、転写を開始するためのDNA配列、及び遺伝子配列の
翻訳を制御するための配列を含む。それらの配列は、発
現制御配列として言及される。宿主細胞が昆虫又は哺乳
類起源のものである場合、例示的な発現制御配列は、SV
−40プロモーター（Science,222:524−527,1983）,CMV
I.E.プロモーター（Proc.Natl.Acad.Sci.81:659−663,1
984）、又はメタロチオネインプロモーター（Nature 29
6:39−42,1982）から得られる。発現制御配列を含むク
ローニングベクターは、制限酵素を用いて切断され、そ
して必要なように又は所望のように、サイズ調節され、
そして当業界においてよく知られている手段により、所
望のポリペプチドをコードするDNAにより連結される。

酵母におけると同様に、高等動物宿主細胞が使用され
る場合、既知の哺乳類遺伝子からのポリアデニル化又は
転写ターミネーター配列が、ベクター中に組込まれる必
要がある。ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモ
ン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写物の正
確なスプライシングのための配列もまた包含され得る。
スプライシング配列の例は、SV40からのVP1イントロン
である（Spragne,J.など.,1983,J.Virol.45:773−78
1）。

さらに、宿主細胞における複製を制御するための遺伝
子配列は、ベクター、たとえばウシ乳頭腫ウイルス型−
ベクターに見出されるベクター中に組込まれ得る。Save
ria−Campo,M.,1985,“Bovine Papilloma Virus DNAのE
ukaryotic Cloning Vector",in DNA Cloning Vol.II,A
Practical Approach Ed.D.M.Glover,IRL Press,Arlingt
on,Virginia pp.213−238を参照のこと。

宿主細胞は、種々の手段による形質転換のためにコン
ピテントであり、又はコンピテントにされる。動物細胞
中にDNAを導入するいくつかのよく知られた方法が存在
する。それらは、リン酸カルシウム沈殿、DNAを含む細
菌プロトプラストとの受容体細胞の融合、DNAを含むリ
ポソームによる受容体細胞の処理、DEAEデキストラン、
エレクトロポレーション、及び細胞中へのDNAの直接的
なマイクロインジェクションを包含する。

形質転換された細胞は、当業界においてよく知られて
いる手段により培養される。Biochemical Methods in C
ell Calture and Virology,Kuchler,R.J.,Dowden,Hutch
inson and Ross,Inc.,（1977）を参照のこと。発現され
た酵素は、懸濁液又は単層として増殖された細胞から単
離される。後者は、よく知られている機械的、化学的又
は酵素的手段により回収される。

D.GDPFPPに対する抗体の調製ポリクローナル及びモノクローナル抗体を生成するた
めの方法は、当業者に知られている。たとえば、Coliga
n（1991）,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,Wiley/Gr
eene,NY;及びHarlow and Lane（1989）,ANTIBODIES:A L
ABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Press,NY;Stite
sなど（eds.）BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY（4th e
d.）Lange Medical Publications,Los Altos,CA,及びそ
して引用される文献;Goding（1986）,MONOCLONAL ANTIB
ODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE（2d ed.）Academic Pr
ess,New York,NY;及びKohler and Milstein（1975）.Na
ture,256:495−497を参照のこと。そのような技法は、
ファージ又は類似するベクター中の組換え抗体のライブ
ラリーからの抗体の選択による抗体調製を包含する。Hu
seなど．（1989）,Science,246:1275−1281;及びWardな
ど．（1989）Nature,341:544−546を参照のこと。抗体
はまた、GDPFPPに対してスクリーンされたファージ表示
ライブラリーからも選択され得る（たとえば、Vaughan
など．（1966）Nature Biotechnology,14:309−314及び
そこに引用される文献を参照のこと）。抗体又は抗血清
は、種々の方法、たとえばウェスターンブロット、イム
ノアフィニティクロマトグラフィー、ELISA、免疫螢
光顕微鏡、等のいづれかにより、配列番号２のタンパク
質と交差反応するタンパク質を特異的に特徴づけ、検出
し、又は単離するために使用され得る。

たとえば、イムノアッセイへの使用のための抗血清を
生成するためには、配列番号１のポリペプチド又はその
フラグメントが、本明細書に記載されるようにして単離
される。たとえば、組換えタンパク質は、形質転換され
た細胞系において生成される。マウス又はウサギの近交
系は、標準的アジュバント、たとえばフロイントアジュ
バント、及び標準的免疫化プロトコールを用いて、配列
番号２のタンパク質又はそのペプチドにより免疫化され
る。他方では、本明細書に開示される配列に由来し、そ
してキャリヤータンパク質に接合される合成ペプチド
は、免疫原として使用され得る。ポリクローナル血清が
集められ、そしてイムノアッセイ、たとえば固体支持体
上に固定された免疫原を有する固相イムノアッセイにお
いて免疫原タンパク質に対して力価される。10⁴又はそ
れ以上の力価を有するポリクローナル抗血清が選択さ
れ、そして競争結合イムノアッセイを用いて、非GDPFP
P、又は他の細胞型又は種からのGDPFPP、又はそのペプ
チドフラグメントに対するそれらの交差反応性について
試験される。特異的モノクローナル抗体及びポリクロー
ナル抗体並びに抗血清は通常、少なくとも約0.1mM、よ
り通常には少なくとも約１μＭ、好ましくは少なくとも
約0.1μＭ又はそれよりも良好な、及び最も好ましくは
0.01μＭ又はそれよりも良好なKDを伴って結合するであ
ろう。

そのような条件下での抗体に対する特異的結合は、特
定のタンパク質に対するその特異性について選択される
抗体を必要とする。例えば、配列番号２に記載されるア
ミノ酸配列を有するGDPFPPに対して生起させた抗血清を
選択して、他のタンパク質にではなく、GDPFPPに特異的
に免疫反応性の抗体を得る。

様々なイムノアッセイ方式が、特定のタンパク質に特
異的に免疫反応性の抗体を選択するために使用されう
る。たとえば、固相ELISAイムノアッセイは通常、タン
パク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選
択するために使用される。特異的免疫反応性を決定する
ために使用され得るイムノアッセイ型及び条件の記載に
ついては、Harlow and Lane（1988）Antibodies,A Labo
ratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New
Yorkを参照のこと。

競争結合型におけるイムノアッセイは、交差反応性決
定のために使用され得る。たとえば、配列番号２のタン
パク質は、固体支持体に固定され得る。アッセイに添加
されるタンパク質は、固定された抗原に対する抗血清の
結合と競争する。固定されたタンパク質に対する抗血清
の結合と競争する上記タンパク質の能力が、配列番号２
のタンパク質に比較される。上記タンパク質についての
％交差反応性は、標準の計算法を用いて計算される。上
記に列挙されるタンパク質の個々との10％以下の交差反
応性を有するそれらの抗血清が選択され、そしてプール
される。次に、交差反応する抗体が、上記に列挙される
タンパク質による免疫吸収により前記プールされた抗血
清から除去される。

次に、免疫吸収され、そしてプールされた抗血清は、
免疫原タンパク質（すなわち、配列番号２のタンパク
質）と第２タンパク質とを比較するために、上記のよう
な競争結合イムノアッセイに使用される。この比較を行
なうためには、前記２種のタンパク質が、広範囲の濃度
でそれぞれアッセイされ、そして固定されたタンパク質
に対する抗血清の結合を50％阻害するために必要とされ
る個々のタンパク質の量が決定される。必要とされる第
２タンパク質の量が、必要とされる配列番号２のタンパ
ク質の量の10倍以下である場合、その第２タンパク質
は、配列番号２のタンパク質から成る免疫原に対して生
成された抗体に対して特異的に結合すると言われる。

本発明はまた、前記タンパク質に対して選択的に免疫
反応する抗体及び試験を実施するための教授材料を含む
容器を含んで成る、組織又は血液サンプルにおける＠の
存在を検出するためのキットを包含する。キットはま
た、他の成分、たとえば＠、対照、緩衝溶液、及び第２
抗体も含むことができる。＠に対する抗体を検出するた
めのキットは、＠教授材料を含む容器を含んで成り、そ
して他の材料、たとえば本明細書に記載されるような第
２抗体及びラベルを含んで成る。

E.GDPFPPを単離し、そして精製するための方法本発明の酵素は、酵素が天然において発現される細胞
又は組織から、あるいはそれらが発現され遺伝子的に構
築された細胞から直接的に調製され得る。

本発明の核酸の単離のために適切な生物のいづれか
が、酵素のための材料源として使用され得る。哺乳類の
場合、酵素の単離のためのプロトコールは一般的に次の
通りである： 1.GDPFPP−発現組織を得る。

2.組織1g当たり約１〜10mの均質化溶液（好ましく
は、約４℃でプロテアーゼインヒビターを含む）におい
て均質化する（たとえば、音波処理により、又は反発ホ
モジナイザーにおいて、又はブレンダーにおいて）。

3.不溶性及び粒状物質を、濾過及び／又は遠心分離によ
り除去する。

4.本発明のポリペプチドは、当業界においてよく知られ
ている標準的技法、たとえばGDPFPPが比較的不溶性であ
る溶液（たとえば硫酸アンモニウム、PEG）における選
択沈殿法；既知のGDPFPP、たとえば配列番号２に対する
抗体を用いてのイムノアフィニティクロマトグラフィ
ー；市販の又は既知のイオン交換マトリックス（たとえ
ば、DEAE DE−52）上でのイオン交換クロマトグラフィ
ー；市販の又は既知のマトリックス（たとえば、フェニ
ルセファロース）上での疎水性クロマトグラフィー；市
販の又は既知の篩いマトリックス（たとえば、Ｓ−30
0）上でのゲル濾過；色素−リガンドクロマトグラフ
ィー（たとえば、黄色セファロース及び赤色セファロー
スを用いる）；クロマトフォーカシング（たとえば、PB
E 94を用いる）により、実質的な純度に精製され得る。
たとえば、R.Scopes,Protein Purification:Principles
and Practice,Springer−Verlag:New York（1982）を
参照のこと。

一定の精製段階に続いて、一定のサンプル中のGDPFPP
の存在、量及び比活性が、本明細書に記載されるよう
に、サンプルからのアリコート（たとえば１〜1,000μ
）のGDPFPPアッセイ及びタンパク質アッセイを実施す
ることによってモニターされる。それはまた、ドデシル
硫酸ナトリウムポリアクリルアミドクロマトグラフ
ィー（SDS−PAGE）によってもモニターされる。精製段
階の最適な組合せ及び順序は、組織ごとに、及び組織ド
ナー種ごとに変化することができる。精製及び分析スケ
ムのための基本的骨格として次の例に用いる場合、当業
者は、一定の組織及び組織ドナー種のための精製段階の
良好な組合せ及び順序を決定することができる。

組換えDNA技法により生成されたGDPFPPはまた、当業
者によく知られている標準技法により単離され、そして
精製され得る。組換え的に生成されたポリペプチドは、
直接的に発現され得、又は融合タンパク質として発現さ
れ得る。次に、タンパク質が細胞溶解（たとえば、音波
処理）及びアフィニティクロマトグラフィーの組合せ
により精製される。融合生成物のためには、適切なタン
パク質分解性酵素による融合タンパク質の続く消化が、
上記のようにして精製され得る所望する酵素を放す。

実施例実施例1.ブタ腎臓からのGDPFPPの精製 1.酵素の精製すべての精製段階は、４℃で行なわれた。すべての濃
縮段階は、10,000分子量（MW）カットオフのDiaflo膜を
有するAmicon濃縮装置により実施された。典型的な単離
プロトコールは、下記に詳細に説明される。

均質化及び遠心分離:1つの新鮮なブタ腎臓（130g）を、
切り刻み、そして計量した。緩衝液Ａ（10mMのトリス−
HCl,pH7.8,1mMのエチレンジアミン−四酢酸〔EDTA〕,1m
Mのβ−メルカプトエタノール〔βME〕,50mMのスクロー
ス）を、組織1g当たり2.5mで添加し、そして組織をブ
レンダーにおいて１分間、均質化した。サンプルを、Be
ckman J−21遠心分離機により12,000×ｇで40分間、遠
心分離した。上清液画分を、チーズクロスを通して濾過
し、そして100,000×ｇで45分間、超遠心分離した。

硫酸アンモニウム沈殿:0〜30％硫酸アンモニウム切断
を、上記上清液画分に対して行ない、そしてそのサンプ
ルを、Beckman J−21遠心分離機において12,000×ｇで4
0分間、遠心分離した。次に、30〜60％硫酸アンモニウ
ム切断を行ない、そして前記のような遠心分離の後、ペ
レットを集めた。それを、緩衝液Ａに再懸濁し、そして
その緩衝液Ａに対して透析した。

PEG沈殿：それぞれ100mの透析され、再懸濁された硫
酸アンモニウムペレットに、25gのPEG 8000を添加し
た。そのサンプルを、上記のようにして12,000×ｇで遠
心分離し、上清液画分を捨て、そしてペレットを緩衝液
Ａに再懸濁した。

DEAE DE−52上でのイオン交換クロマトグラフィー:3cm
×30cmのDE−52カラムを、緩衝液Ａにより平衡化した。
サンプルを負荷した後、カラムを同じ緩衝液により洗浄
した。酵素を、緩衝液Ａ中、０〜200mMのNaClグラジエ
ントにより溶離した。活性画分をプールした。

フェニルセファロース上での疎水性クロマトグラフィ
ー：フェニルセファロース（約100m）を、1Mの硫酸ア
ンモニウムを含む緩衝液Ａにより平衡化した。硫酸アン
モニウムをまた、酵素サンプルに添加し、1Mにした。サ
ンプルの負荷の後、カラムを平衡化緩衝液により洗浄し
た。酵素を、1.0〜0Mの硫酸アンモニウムグラジエント
によりカラムから溶離した。活性画分をプールした。

Ｓ−300上でのゲル濾過:1.6×120cmのＳ−300カラム
を、緩衝液Ａにより平衡化した。酵素サンプルを、負荷
の前、1mに濃縮した。溶離を緩衝液Ａにより行なっ
た。活性画分をプールした。

黄色セファロース及び赤色セファロース上での色素−ク
ガンドクロマトグラフィー:Sigma Reactive Yellow 86
Sepharose（約20m）を、緩衝液Ａにより平衡化した。
前記段階からのプールされた酵素を、カラムに適用し
た。カラムを緩衝液Ａにより洗浄し、そして酵素を含む
洗浄画分をプールし、そして濃縮した。（結合された汚
染物を、2MのNaClにより樹脂から溶離し、そして捨て
た）Sigma Reactive Red 120 Agarose（約100m）をま
た、緩衝液Ａにより平衡化した。黄色セファロースを通
して実施した、プールされた酵素を負荷し、そしてカラ
ムを緩衝液Ａにより洗浄した。いくつかの不純物を、緩
衝液Ａ中、5mMのATPにより溶離した。次に、酵素を、緩
衝液Ａ中、3mMのピロリン酸により溶離した。

セファクリルＳ−300上でのゲル濾過:1.6×120cmのＳ−
300カラムを緩衝液Ａにより平衡化した。酵素サンプル
を、負荷の前、1mに濃縮した。溶離を緩衝液Ａにより
実施した。

PBE−94上でのクロマトフォーカシング:PBE−94カラム
（約20m）を、25mMのイミダゾール−HCl,pH7.4,50mM
のスクロース、1mMのEDTA,1mMのβMEの溶液により平衡
化した。酵素を含むサンプルを1mに濃縮し、そして負
荷した。カラムを平衡化緩衝液により洗浄した。カラム
を、Polybuffer 74−HCl（1:8に希釈されている;pH4.
2）を用いて、自己形成pHグラジエントにより溶出し
た。

2.GDPFPP活性についてのアッセイ GDP−フコースピロホスホリラーゼについての３種の
アッセイを、それらの研究に用いた。反応は容易に可逆
的であるので、GDP−フコースの合成又は加水分解につ
いてのアッセイは可能である。アッセイ＃１は、放射性
ラベルされたGDP−フコースのピロリン酸（PPi）−依存
性加水分解を測定する。これは２種のアッセイの中です
ばやく且つ容易なものであり、そして精製をモニターす
るために使用された。アッセイ＃２は、放射性ラベルさ
れたGTP及びフコース１−Ｐからの放射性ラベルされたG
DP−フコースの合成を測定する。このアッセイは、時間
がかかるが、しかしより特異的であり、そして個々の完
結された調製がGDP−フコースの合成のために実際的に
使用され得たかを確かめるために使用された。アッセイ
＃２のみが、クローン化された酵素を発現する細胞をス
クリーンするために使用された。

アッセイ＃1. 〔¹⁴C〕GDP−フコース＋PPi→〔¹⁴C〕フコース１−Ｐ＋
GTP 次の試薬を一緒に混合する：最終濃度： 100mMのトリス−HCl,pH7.5, 5mMのピロリン酸ナトリウム、 4mMのMgCl₂, 5000cpmの〔¹⁴C〕GDP−フコース、 200mMのトリス−HClに希釈される、 pH7.5。

反応体積50μ中、10μの酵素（又は、200mMのト
リス−HCl（pH7.5）10μに希釈された酵素）。

37℃で５〜10分間インキュベートする。

５％（w/v）トリクロロ酢酸500μを添加する。かき
まぜる。

水中、150mg/mのDarco G−50（木炭）300μを添
加する。30秒間かきまぜる。

1500rpmで５分間、木炭を遠心分離する。

上清液及び3mのシンチレーション流体を液体シンチ
レーションカウンターにより計数する。

アッセイ＃2. 〔³H〕GTP＋フコース１−Ｐ→〔³H〕GDP−フコース＋PP
i 次の試薬を一緒に混合する：最終濃度：２×10⁶〜１×10⁷cpm〔³H〕GTP、 Speed Vacにおいて乾燥せしめる、 0.1mMのGTP、 10mMのMgCl₂、 50mUの無機ピロホスファターゼ、 10mMのフコース１−リン酸、 50mMのMOPS又はトリス−HCl、pH7.5、 1mMのGTP、 12.5mMのKF、（ホスファターゼインヒビター、任意）、酵素、又は酵素及び体積の平衡のための緩衝液、合計
反応体積20μ。

37℃で５分間、インキュベートする。

1Mの硫酸アンモニウム10μを添加する。混合する。

氷冷却されたメタノール200μを添加する。混合す
る。

２分間、マイクロ遠心分離する。

100μの上清液（又は、所望により、それよりも少
量の上清液）及び3mのシンチレーション流体を液体シ
ンチレーションカウンターにより計数する。

残る上清液を新しい管に入れる。Speed Vacにより乾
燥せしめる。

５μのエタノールに再懸濁する。アルミニウム−裏
打ちされたシリカTLCプレート上に２μをスポットす
る。対照として1/10の希釈度のNEN〔¹⁴C〕−GDP−フコ
ースを使用する。低い熱により乾燥せしめる。7:3のエ
タノール/1Mの酢酸アンモニウム、pH7.4において、２〜
３時間、又は溶媒前方がプレートの少なくとも中間点に
達するまで実施する。空気乾燥せしめる。En³ Hanceに
より噴霧する。フードにおいて10分間、乾燥せしめる。
フィルム（たとえば、Kodak XARフィルム）及び増強ス
クリーンを有するカセットに配置し、−70℃で２時間、
又は必要なら一晩、貯蔵する。

アッセイのためのサンプルの調製：トランスフェクトさ
れた細胞をアッセイする場合、アッセイ＃２のみを使用
した。細胞（２つの６ウェルプレートからの）をウェル
当たり2mのカルシウム−マグネシウム−フリーのPBS
により２度、洗浄し、そして次に、同じ緩衝液（2m／
ウェル）にプレートから細胞スクレーパーにより除去し
た。細胞を、Beckman GPKR遠心分離機により、1500rpm
で15分間、遠心分離した。ペレットをPBS 2mにより洗
浄し、そして前記のようにして遠心分離した。個々のサ
ンプルを、100μの溶解緩衝液（50mMのトリス−HCl、
pH7.5;1％（v/v）のTriton×100;10mMのKF;0.5mMのAEBS
F;及び２μg/mの個々のアンチパイン、アプロチニ
ン、キモスタチン、ロイペクチン及びペプスタチン）に
再懸濁した。サンプルをmini−dounceにより改質化し
た。

アッセイ＃3.GDP−フコースピロポスホリセーゼ（GDPFP
P）のHPLCアッセイ：完全な細胞溶解物からのGDPFPPについての定量逆相イ
オン対HPLCアッセイを開発し、それはGDP−マンノース
からGDP−フロースを、並びにGTP,GDP,GMP及びグアノシ
ンを分解する。最良の分解能を提供する溶離緩衝液は、
１％から20％までの緩衝液Ｂの線状グラジエントを20分
間、用いる場合、20mMのリン酸カリウム（非塩基性）、
10mMのリン酸４プロピルアンモニウム、pH5.0及びH₃PO₄
の溶液（緩衝液Ａ）及びメタノール（緩衝液Ｂ）であっ
た。組換えGDPFPPを発現する細胞を非イオン性界面活性
剤により溶解し、そして50mMのトリス、pH7.5;10mMの塩
化マグネシウム;10mMの〔³H〕GTP;10mMのフコース−１
−リン酸及び10m単位のピロホスファターゼの存在下
で、37℃で５分間アッセイした。アッセイをメタノール
と共に急冷し、ペレット化し、上清液を真空下で乾燥せ
しめ、そして逆相イオン対HPLCによる分析のために水に
再懸濁した。GDP−フコースの形成に続いて、吸光度を
取り、そして画分をシンチレーション計数のために集め
た。個々のアッセイにおける〔³H〕GTPの比活性は知ら
れているので、HPLCカラムを溶出するGDP−フコースに
対応するCPMを定量化することができる。このアッセイ
を用いる場合、1mの組換えバキュロウィルスGDPFPPは
35m単位を生成し、ここで１単位は１分当たりに形成さ
れる１μモルのGDP−フコースとして定義される。この
アッセイの線状性はまだ確立されるべきであるが、使用
される条件下で、細胞溶解物に供給されるGTPの10％以
下が消費され、これは、アッセイが線状範囲にあること
を示唆する。

3.光ラベリング N₃−〔³²P〕−GDP−フコースを、Szumilo、など.,J.B
iol.Chem.,268,17943−17950（1993）においてN₃−〔³²
P〕−GDP−マンノースについて記載されるようにして合
成したが、但し、部分的に精製されたGDPFPP及びフコー
ス−１−Ｐを使用した。光ラベリング実験を、Szumil
o、など.,J.Biol.Chem.,268,17943−17950（1993）及び
Potter,など.,Meth.Enzymol.,91,613−633（1983）に実
質的に記載のようにして実施した。

高く精製された酵素（10μ）を約100μＭのN₃−〔
³²P〕−GDP−フコースと共に室温でインキュベートし、
そして1.5cmの距離で１分間、手に保持されたUVランプ
を通して短波UV線に暴露した。１％のBMEを含むNovex S
DS−PAGEサンプル緩衝液を前記サンプルに添加し、そし
てそれらを、８％又は８〜16％のグラジエントゲル上で
の電気泳動にゆだねた。オートラジオグラフィーを乾燥
されたゲル上で実施した。

上記技法を用いて、GDPFPP活性と相互関係し、そして
N₃−〔³²P〕−GDP−フコースにより光ラベルされた66,0
00MWのタンパク質を同定した。

4.ブロット、タンパク質分解及び配列決定配列決定のための酵素の調製：クロマトフォーカシング
処理の後、プールされた酵素サンプル（画分18〜22、18
m）を、Diaflo膜を有するAmicon濃縮機により350μ
に濃縮した。その材料200μアリコートを凍結乾燥に
より乾燥し、そして50μのDI水に再懸濁した。

ブロット：凍結乾燥され、再懸濁されたサンプル40μ
に、Novex SDS−PAGEサンプル緩衝液40μを、10mMの
個々のDTT及びメルカプト酢酸と共に添加した。その混
合物を100℃で５分間、加熱した。サンプルを、ゲルボ
ックスの上部チャンバーに10mMのメルカプト酢酸を有す
るNovex8％ゲルにおいての電気泳動にゆだねた。電気泳
動の後、ゲルを10mMのCAPS、pH11.0及び10％メタノール
により15分間、平衡化した。タンパク質を、ABI PVDF
（ProBlott）上に20Vで1.5時間ブロットした。ブロット
を水により洗浄し、１％酢酸において脱色された、１％
酢酸中、0.2％Ponceau Sにより染色し、そして水により
洗浄した。適切なタンパク質をブロットから切り出し、
1.5mの遠心分離管に入れ、水により洗浄し、そして湿
気を維持した。サンプルを輸送するまで−20℃で保存し
た。

タンパク質分解及び配列決定：単離されたタンパク質
を、トリプシンによる現場タンパク質分解にゆだねた。
プールし、そしてタンパク質分解の前、10％の個々のサ
ンプルをアミノ酸分析にゆだねた。ペプチドをVydac C
−18カラム上で分離した。強く対称的なピークを、配列
分析のために選択した。

実施例2.酵素をコードするcDNAのPCR増幅、単離及びク
ローニングブタタンパク質の一部のアミノ酸配列を用いて、それ
らの部分アミノ酸配列をコードする配列を含んで成るヒ
ト核酸配列を、発現された配列標識（ESTs）を含んで成
るコンピューターデータベースにより同定した。次に、
十分な長さのcDNAを、次のプライマー及び増幅条件を用
いてポリメラーゼ鎖反応により得た。

ブタGDPFPPペプチド配列と適合した最初のヒトEST
は、Gen Bank受託番号T75166（NCBI gi:691928）であっ
た。このESTは、Merck−Washington University配列決
定プロジェクトからであり、そして465個の塩基対の長
さであり、その335bpは高い品質の配列であると思われ
た。より短い同一のEST配列をまた、その研究において
同定し、それはGenethor's cDNA配列決定プロジェクト
からの受託番号F12805であった。他の２種のEST（示さ
れていない）を、遺伝子の大きな配列が単離され、そし
て配列決定された後に発現した。

十分な長さのcDNAを適切なベクター中にクローン化
し、そして次の通りにCOS細胞において発現した。

1.PCR増幅のためのDNA鋳型の源 cDNAライブラリーを、Gene Tranfer and Expression:
A Laboratory Manual,M.Kriegler,W.H.Freeman and Com
pany（1990）に見出される、RNA単離、mRNA精製及びcDN
Aライブラリー構成のためのプロトコールに従って、プ
ラスミドDNAベクターpBS II SK（＋）（Stratagene）中
に、Epstein−Barr−ウィルス−形質転換されたＢリン
パ芽球株細胞系JY（Terhost,Co.,など.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 73:910）から製造した。ライブラリーグリセ
ロールストックの0.1mアリコートを、50μg/mでの
アンピシリンにより補充されたLB増殖培地500m中に接
種し、そして37℃16時間、撹拌しながら、増殖した。ラ
イブラリーDNAを、業者により提供される条件下でGiage
n Plasmid Isolotion Kitを用いて単離した。

2.PCR増殖ヒトGDPFPP cDNAを、緩衝液＃１及び製造業者により
供給される条件下で、生来のPfuポリメラーゼ（Stratag
ene）及びポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いてJY−cDNA
ライブラリーから増幅した。プライマーは、５′及び
３′末端でEco R V制限部位を生成する。それらの５′
及び３′プライマーは、それぞれ、５′−TCA−GAT−AT
C−GGG−GCT−ATG−GCA−GCT−GCT−AG−３′及び５′
−ATA−GAT−ATC−TCT−GGA−ATG−TTA−CTC−AAA−AAG
−GCA−Ａ−３′であった。そのPCR工程は、1.8kbのフ
ラグメントを増幅した。

3.発現ベクター中へのGDPFPP cDNAのクローニング増幅されたGDPFPP遺伝子を、製造業者により供給され
る条件下で酵素Eco R V（New England Biolabs）により
消化した。ブラント末端の1.8kbフラグメントを、アガ
ロースゲル上で分別し、そして標準技法を用いて単離し
た。その1.8kbフラグメントを、標準の技法に従って、p
cDNA3（Invitrogen）のEco R V部位、pEE12（Celltec
h）のSma I部位、及びpVL−1392（Invitrogen）のSma I
部位中にクローン化し、それぞれpcDNA−GFP6,pEE12−G
FP7及びpVL1392−GFP6を生成した。

4.COS細胞におけるGDPFPPの過渡的発現 COS細胞を、Gene Transfer and Expression:A Labora
tory Manual,M.Krieglerにおけるプロトコールに従っ
て、プラスミドpcDNA3又はプラスミドpcDNA−GFP6のい
づれかによりDEAE−デキストランを通してトランスフェ
クトした。72時間のインキュベーションの後、細胞溶解
物を、TLC−GDPFPPアッセイによりGDPFPP活性について
アッセイした。pcDNA−GFP6によりトランスフェクトさ
れた細胞は、フコース−１−リン酸及びGTPからGDP−フ
コースを生成した。

5.NSO細胞におけるGDPFPPの安定した発現 NSO細胞を、プラスミドpEE12−GFP7によるエレクトロ
ポレーションによりトランスフェクトし、そしてグルタ
ミンシンセターゼ陽性クローンを、〔PATENT:NSO−GT〕
における方法に従って単離した。クローンを、TLC−GDP
FPPアッセイによりGDPFPP活性についてスクリーンし
た。クローンGFP−５をHPLC−GDPFPPを通してアッセイ
し、1.9ナノ単位のGDPFPPを細胞当たり生成した。

6.GDPFPP−組換えバキュロウィルスの構成及びGDPFPP発
現スポドプテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperd
a）昆虫細胞（Sf9 II;Gibco/BRL）のストック培養物
を、pVL1392−GFP6及び線状化されたBaculo Goldウィル
スDNA（PharMingen）により、Invitrogen Incのトラン
スフェクションプロトコールを用いて同時トランスフ
ェクトした。組換えGDPFPP−バキュロウィルスを単離
し、そして高い力価のストックを、標準技法により生成
した。Sf9 II細胞を、３の感染の多生度で感染せしめ
た。27℃で72時間のインキュベーションに続いて、細胞
を収穫し、そしてGDPFPPを精製した。GDPFPPをHPLC−GD
PFPPを通してアッセイし、細胞当たり5.8ナノ単位のGDP
FPPを生成した。

実施例3.トランスフェクトされた細胞のアッセイベクターのみ又は十分な長さのcDNAクローンを含むベ
クターにより過渡的にトランスフェクトされたCOS細胞
の溶解物を、例１に記載されたアッセイ＃２を用いて、
GDPFPP活性についてアッセイした。個々のサンプルを、
フコース１−リン酸又は不適切な糖リン酸、すなわちグ
ルコース１−リン酸のいづれかによりアッセイした。GD
PFPP比活性を、cDNAを発現するCOS細胞において観察し
た。特に、GDP−フコースが、GDPFPPクローンによりト
ランスフェクトされた細胞からの溶解物のアッセイ生成
物において検出されたが、しかしベクターのみの条件下
では検出されなかった。さらに、有意な量のヌクレオチ
ド糖は、グルコース１−リン酸が基質として提供される
場合、合成されなかった。

実施例4.バキュロウィルス−感染されたSf9細胞からの
組換えGDPFPPは、Cylexin^TMの生成のためにフコシルト
ランスフェラーゼサイクルに使用され得る Cylexin^TMは、NenAcα２→3Galβ１→４（Facα１→
３）GlcNAc（Sle^x）を発現する細胞のセレクチン受容
体、たとえばELAM−１への付着を阻害する五糖について
の商品名である。バキュロウィルス感染されたSf9細胞
からの組換えGDPFPPは、Cylexin^TMの生成のためにフコ
シルトランスフェラーゼサイクルに使用され得る。

1.バキュロウィルス培養物におけるGFPの合成 Sf−９細胞を、培地製造業者により推薦される条件下
で、50mの振盪フラスコ培養物においてSf−900 II培
地（GIBCO−BRL）において継代培養した。前記細胞を13
0rpmでの連続振盪を伴って、27℃で暗室において増殖し
た。組換えウィルスを創造するために、標準のプロトコ
ールがいくらかの変性を伴って使用された（O' Reilly
DR,Miller LK,and Luckow V（1992）,Baculovirus Expr
ession Vectors:A Laboratory Manual,New York;W.H.Fr
eeman Co.を参照のこと）。細胞を、Baculogoldバキュ
ロウィルスDNA〔Pharmingen,San Diego,CA〕及び精製さ
れたトランスファーベクターにより、Baculogold製造業
者の説明書に従って、同時トランスフェクトした。トラ
ンスフェクトされた細胞を、上清液が集められる場合、
トランスフェクションの後、５日間、Sf−900 II培地に
おいてインキュベートした。組換えウィルスを、60−ウ
ェル組織培養皿〔Robbins Scientific〕において、新鮮
なSf−９細胞に対する制限希釈により単離した。

７日後、ウィルスを、20％以下に感染されたウェルを
生成する希釈度での感染された細胞を含むウェルから集
めた。12の組換えウィルスを、24−ウェル組織培養皿に
おける新鮮な細胞の感染により体積的に拡張した。７日
後、個々のウィルス単離物を、GFPを合成する能力につ
いてスクリーンし、そして個々の単離物は陽性であるこ
とが見出された。１つの単離物（Ｅ−９と称する）を、
225cm²のフラスコにおける新鮮なSf−９細胞の感染によ
る追加の拡張のために選択した。感染の７日後に生成さ
れるウィルスストックを集め、そしてrBacy GFP p3と称
するウィルスマスターストックとして貯蔵した。

Sf−９細胞を、その培養物が1mの培養物当たり８×
10⁶個の細胞の密度に達するまで、27℃及び130rpmで、2
800mのFernbachフラスコにおける1000mの振盪フラ
スコ培養物において増殖せしめた。マスターストックの
ウィルス力価は３×10⁸pfu/mであると仮定され、そし
てSf−９細胞を、次の態様で約0.2pfu/細胞の感染の多
重度で感染せしめた:5mのウィルスストックを、Fernb
achフラスコにおける細胞に添加した。フラスコを４〜
５回、手によりかきまぜ、ウィルスを分配した。新鮮な
培地500mを添加し、そしてフラスコを振盪フラスコに
48時間、戻した。インキュベーションの後、ウィルスを
その上清液から無菌状態で集めた。培養物を、殺菌され
た１のボトルに移し、そして細胞を上清液（ウィルス
作業ストック）から遠心分離除去し（3,000×ｇ、15
分）、それを集め、そして貯蔵した。ウィルス作業スト
ックの力価を、O' Reillyなど.,に記載されているよう
にして、制限希釈感染の結果からの計算により決定し、
そして2.4×10⁹pfu/mであることが決定された。

GFPを生成するために、Sf−９細胞を、その培養物が1
mの培養物当たり約８×10⁶個の細胞の密度に達するま
で、27℃及び130rpmで、2800mのFernbachフラスコに
おける1000mの振盪フラスコ培養物において増殖せし
めた。細胞を、上記方法を用いて約3pfu/細胞の感染の
多重度で感染せしめ、そしてここで前記方法は、所望す
る多重度を達成するために個々のフラスコに10mのウ
ィルス作業ストックの添加の変法を伴った。ウィルスの
添加の後、500mの新鮮な培地を個々のフラスコに添加
し、そしてその培養物を振盪インキュベーターに65時
間、戻した。1mの分析サンプルを集め、そして遠心分
離し（5000×ｇ、２分）、そして細胞及び上清液をGFP
含有率について分析した。残る細胞を遠心分離により１
のボトルに収穫し（3,000×ｇ、25分）、少量の新鮮
な培地に再懸濁し、組合し、そして再び遠心分離した。
上清液を捨てた。

2.バキュロウィルス感染されたSf9細胞からのGDPFPPの
部分的精製 75×ｇ細胞ペレットを、GDPFPPのためのcDNAを有する
バキュロウィルスにより感染されたSf9細胞の４培養
物の遠心分離から得た。ペレットを、50mMのトリス−HC
l、pH7.8、２μg/mの個々のアンチパイン、アプロチ
ニン、キモスタチン、ロイペクチン及びペプスタチン溶
液に再懸濁した。サンプルを、Tekmar Sonic Disruptor
により60％の力で、６〜15秒間、音波処理した。サンプ
ルを、GSAローターを有するSorvall RC−5B遠心分離機
により8000rpmで30分間、４℃で遠心分離した。ペレッ
トを捨てた。上清液画分を急速に撹拌しながら、ポリエ
チレン（イミン）の10％（v/v）溶液3.5mを添加し
た。その混合物を、GSAローターを有するSorvall RC−5
B遠心分離機により8000rpmで15分間、４℃で遠心分離し
た。ペレットを捨てた。固体硫酸アンモニウムを添加
し、60％の飽和度にし、そしてそのサンプルを４℃で１
時間、撹拌した。その混合物を、GSAローターを有するS
orvall RC−5B遠心分離機により8000rpmで15分間、４℃
で遠心分離した。上清液画分を捨てた。ペレットを、50
mMのトリス−HCl（pH7.8）20mに再懸濁した。

3.フコシルトランスフェラーゼサイクルフコシルトランスフェラーゼサイクルを、次の試薬に
より100μの体積で実施した:50mMのシアリル−Ｎ−ア
セチルラクトサミン;50mMのHEPES、pH7.5;pH7.5に調節
された100mMのホスホ（エノール）ピルベート;2mMのグ
アノシン５′−二リン酸;0.7Uのピルビン酸キナーゼ;50
mMのフコース１−リン酸;5mMのMgCl₂;0.5mg/m（w/v）
のウシ血清アルブミン;0.2％（w/v）のNaN₃;上記のよう
にして精製された15％（v/v）のGDPFPP;及び15％（v/
v）のフコシルトランスフェラーゼＶ（SP−セファロー
ス上で部分的に精製された2.16U/mのα−1,3フコシル
トランスフェラーゼ）。そのサイクルを、37℃で一晩イ
ンキュベートした。10mMの溶液の0.3μアリコート
は、フコシルトランスフェラーゼサイクルのサンプルを
含むレーンにおいて明白であった。Cylexin^TM標準の3.3
mMの溶液0.3μによりスパイクされたサイクル0.3μ
サンプルを同じプレート上で実施し、Cylexin^TMとして
のサイクル生成物の同一性を確かめた。

上記例は、例示的であって、本発明を制限するもので
はない。本発明の他の変法は、当業者に容易に明らかに
なるであろう。本明細書に引用されるすべての出版物、
特許及び特許出願は、すべての目的のために引用により
本明細書に組込まれる。

配列番号１配列の範囲:1〜2318 配列番号２

フロントページの続き (56)参考文献特表平７−500248（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，1968年, Ｖｏｌ．243，ｐ．1110−1115 Ｌｉｅｂｅｇｓ．Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．，1992年，Ｖｏｌ．５，ｐ．467− 471 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12N 9/12 ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】GDP−フコースピロホスホリラーゼ活性を
有する配列番号:2に示すアミノ酸配列をコードする核
酸。
【請求項２】配列番号:1に記載の塩基配列の核酸に高緊
縮条件下でハイブリダイズし、且つGDP−フコースピロ
ホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核
酸。
【請求項３】配列番号:2に記載のアミノ酸配列に対して
１〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により
修飾されたアミノ酸配列からなり、且つGDP−フコース
ピロホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードす
る核酸。
【請求項４】配列番号:1に記載の塩基配列を有し、GDP
−フコースピロホスホリラーゼ活性を有するタンパク質
をコードする核酸。
【請求項５】配列番号:2に記載のアミノ酸配列に対して
90％以上の配列同一性を有し、且つGDP−フコースピロ
ホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核
酸。
【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸
がプロモーターに作用可能に連結されているDNA構造
体。
【請求項７】前記プロモーターが、哺乳動物細胞におけ
る前記核酸の発現を指令する、請求項６に記載のDNA構
造体。
【請求項８】前記プロモーターが、昆虫細胞における前
記核酸の発現を指令する、請求項６に記載のDNA構造
体。
【請求項９】前記プロモーターが、真菌類細胞における
前記核酸の発現を指令する、請求項６に記載のDNA構造
体。
【請求項１０】配列番号:2に記載のアミノ酸配列を有す
る単離されたGDP−フコースピロホスホリラーゼ酵素。
【請求項１１】請求項１〜５のいずれか１項に記載の核
酸によりコードされたGDP−フコースピロホスホリラー
ゼ活性を有する単離されたタンパク質。
【請求項１２】請求項１〜５のいずれか１項に記載の核
酸が導入された、遺伝子操作により形成された細胞。