JPH08508888A

JPH08508888A - グルタミルシステイン・シンセターゼ軽サブユニット

Info

Publication number: JPH08508888A
Application number: JP6523318A
Authority: JP
Inventors: マイスター，アルトン; ハン，チン−ショウ; アンダーソン，メリー・イー
Original assignee: コーネル・リサーチ・ファウンデーション，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-04-08
Filing date: 1994-04-07
Publication date: 1996-09-24
Also published as: EP0693122A4; EP0693122A1; WO1994024276A1

Abstract

(57)【要約】 γグルタミルシステインシンセターゼの軽サブユニットについてのヌクレオチドｃＤＮＡ配列、および、このサブユニットのアミノ酸配列が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】グルタミルシステイン・シンセターゼ軽サブユニット本発明は、１９９１年９月２５日に出願した米国特許出願第７６５,２１１号の一部継続出願である。本発明を成すための一部資金供給は、ユナイテッド・ステイツ・ナショナル・インスティチューツ・オブ・ヘルス（United States National Institutes of H ealth）によって認可番号４Ｒ３７ＤＫ１２０３４の下に提供された。したがって、合衆国政府は、３５ＵＳＣ２００et seq.の下に、請求の範囲に記載された発明の法定権利を有する。グルタチオンは、動物組織、植物および微生物中に存在するトリペプチドチオール（Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシン）である。それは、高い（０.１〜１０mＭ）ミリモル濃度で細胞内に見られ、かくして、哺乳動物において典型的に見られる最も有力な細胞チオールおよび最も豊富な低分子量ペプチドである。グルタチオンの２つの特徴的な構造特性−γ−グルタミル結合およびスルフィジル基−は、その細胞内安定性を促進し、その多重生化学的機能に密接に関係する。グルタチオンは、反応性酸素化合物の毒性効果から細胞を保護し、還元したピリジンヌクレオチドを使用して、例えば、システインの細胞内形成およびタンパクのチオール型を促進するその還元特性を有する細胞を提供する系の重要な成分である；グルタチオンは、触媒反応、代謝および輸送において機能する；それは、タンパクおよび核酸の合成を含む反応において、ならびに、遊離ラジカルおよび過酸化物を解毒する反応において関係する；それは、内因性および外因性起源の種々の化合物とのコンジュゲートを形成し、種々の酵素についての補因子である。グルタチオンの生化学の一般的な概要は、米国特許出願第７６５,２１１号におけるグルタチオンサイクル図において示されている（出典明示により本明細書の一部とする）。グルタチオンは、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、マレイルアセトアセテートイソメラーゼ、グリオキサラーゼ、プロスタグランジンエンドペルオキシダーゼイソメラーゼ、およびジクロロジフェニルトリクロロエタンデヒドロクロリナーゼならびに類似の酵素についての補酵素として機能する。グリオキサラーゼ反応において、メチルグリオキサルおよびグルタチオンの反応によって非酵素的に形成されたヘミメルカプタル（ＧＳＨ）は、グリオキサラーゼＩによってＳ− ラクチル−グルタチオンに転換され、これは、グリオキサラーゼIIによってＤ− ラクテートおよびグルタチオンに分解される。ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ反応において、Ｓ−ホルミルグルタチオンが形成され（グルタチオン＋ＨＣＨＯ＋ＮＡＤ⁺）、ホーメートおよびグルタチオンに加水分解される。細胞内で、ＧＳＨは、以下の反応に示すようなγ−グルタミルシステインシンセターゼおよびグルタチオンシンセターゼの作用によって合成される。γ−グルタミルシステインは、これらの反応のうち最初の反応を触媒し、グルタチオン合成における律速反応である。 L-グルタメート＋L-システイン＋ATP⇒L-γ-グルタミル-L-システイン＋ADP＋Pi L-γ-グルタミル-L-システイン＋グリシン＋ATP⇒グルタチオン＋ADP＝Pi グルタチオン合成のために必要とされる２つの酵素のいずれかを欠いているヒトは、精神遅延、溶血性貧血および麻痺を含む多くの重篤な全身症状を経験する。ホロ酵素の活性は、ＧＳＨによってフィードバック阻害される［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）２５０：１４２２（１９７５）を参照］。種々の組織におけるＧＳＨレベルを調節するメカニズムを提供するかかる阻害は、酵素の還元によって、および、グルタメートに関するＧＳＨによる競合阻害によって行われる［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）（１９９３）を参照］。 γ−グルタミルシステインシンセターゼの非常によく精製された調製物は、ラット赤血球、細菌、およびラット腎臓を含むいくつかの供給源から単離された。ラット腎臓から精製された酵素（Ｍ_r約１０４,０００）は、ゲル電気泳動において均一であり、変性条件下で分離して、２つの異なったサブユニット−Ｍ_r〜７３, ０００の重サブユニットおよびＭ_r〜２７,７００の軽サブユニット−を生じる。ホロ酵素は、非変性条件下で２つのサブユニットに分離することもできる。単離された重サブユニットは、触媒的に活性であり、それは、ＧＳＨによってフィードバック阻害される。これらの結果により、米国特許出願第７６５,２１１号に開示されている重サブユニットをコードするcＤＮＡのクローニングおよび配列決定が行われる。重サブユニットのこのオープンフレームオリゴヌクレオチド配列は、以下のとおりである：このオープンリーディングフレームは、以下のペプチドに翻訳される：イー・コリ（E.coli）におけるcＤＮＡの発現によって得られた組換え重サブユニット（ならびに、単離されたホロ酵素から単離された重サブユニット）は、ホロ酵素よりも、グルタメートについて非常に高いＫ_m値、および、ＧＳＨによるフィードバック阻害に対する高い感度を示す。これらの結果から、軽サブユニットは、それ自体では酵素的に活性ではないが、グルタメートに対する高い親和性およびＧＳＨによるフィードバック阻害に対する適切な感度を維持するために酵素について必須であることが判明した。本発明は、γ−グルタミルシステインシンセターゼの軽サブユニットをコードするcＤＮＡの単離および配列決定を提供するものである。本発明は、また、γ−グルタミルシステインシンセターゼの軽サブユニットのアミノ酸配列を提供するものである。本発明は、また、γ−グルタミルシステインシンセターゼの軽サブユニットの発現のためのcＤＮＡヌクレオチド配列を提供するものである。本発明のγ−グルタミルシステインシンセターゼの軽サブユニットをイー・コリ（E.coli）において発現させ、軽サブユニットおよび重サブユニットの共発現によって、および、別々に発現されたサブユニットを混合することによって得られた再構築組換えホロ酵素の触媒特性を試験した。 γ−グルタミルシステインシンセターゼの軽サブユニットのヌクレオチドおよびアミノ酸配列の解明を含む本発明のこれらおよび他の態様および結果は、以下の実施例、図面および詳細な説明への言及によってより完全に理解されるであろう。図面において、第１図は、本発明の軽サブユニット発現プラスミドpＲＧＣＳＬを表し；第２図は、本発明の共発現プラスミドpＲＧＣＳＨＬを表し；第３図は、本発明のクローン７１および６２についての配列決定ストラテジーを表し；第４図は、本発明の分離された軽サブユニットおよび重サブユニットの２つのピークを示すトレーシングを示す。実施例Ｉラット腎臓γ−ＧＣＳ軽サブユニットに対する抗体の単離を以下のとおり行った：ラットのホロ酵素に対するウサギ抗血清［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）２６５：１５８８（１９９０）］（５ml）を、セファロース（１ml）に結合した組換え重サブユニットを含有するセファロース（Sepharose）４Ｂ［ファーマシア（Pharmacia）］カラムに流速１５ml／時で適用した；溶離液は、２時間、カラムを通して再循環させた。ＰＢＳ（１０ml）で洗浄後、０.１Ｍグリシン（pＨ２.５）で軽サブユニット抗体をカラムから溶出させた。１Ｍリン酸ナトリウム（pＨ８.０）０.１mlを含有する管にフラクション（２ml）を回収した。精製した抗体の特異性をウエスタンブロット分析法によって試験した。この試験によると、分子量約３０,０００の、抗体と反応するバンドを示した。さらに、この産生された抗体を本発明で使用して、cＤＮＡライブラリーをスクリーンした。実施例II 本発明のラット腎臓γＧＣＳ軽サブユニットの単離を以下のとおり行った：精製したラット腎臓γ−グルタミルシステインシンセターゼ（１mg、１０nmol ）［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）１１３：３７９（１９８５）を参照］を、６Ｍグアニジニウム−ＨＣｌおよび２mＭＥＤＴＡを含有するトリス−ＨＣｌ緩衝液（０.５ml；pＨ８.５）０.５mlに溶解させた。空気による酸化を回避するために該タンパク溶液に窒素ガスを通気した後、ジチオトレイトール（１.２mg、８μmol）を添加し、反応混合物を５５℃で４時間インキュベートした。次いで、該溶液を室温に冷却し、ヨード酢酸（３mg、１６ μmol）と３０分間反応させた。還元し、カルボキシメチル化したタンパクを７０％溶媒Ａ（０.１％トリフルオロ酢酸（水溶液））および３０％溶媒Ｂ（９５％アセトニトリル、０.１％トリチルオロ酢酸（水溶液））で平衡化させたＣ− ４逆相ＨＰＬＣカラム（４.２×２５０mm）に適用した。３０〜７０％溶媒Ｂの直線勾配液によって、流速１ml／分で４０分間かけて分離し、２１５nmで分光測定によってモニターした。前記のとおり、還元し、カルボキシメチル化したホロ酵素をＨＰＬＣＣ−４逆相カラムに適用し、該カラムから溶出した２つの分離したタンパクピークを生じた（第４図）。ピーク１および２をＳＤＳゲル電気泳動によってそれぞれ軽サブユニットおよび重サブユニットと同定した。精製した軽サブユニットを、以下の実施例に記載するとおり、トリプシンで切断した。実施例III ラット腎臓γＧＣＳ軽サブユニットのペプチド配列分析を以下のとおり行った：精製した軽サブユニット（０.２mg）をトリス−ＨＣｌ緩衝液（５０mＭ；pＨ８.０）０.１mlに溶解させ、３７℃で１６時間、トリプシン（６mg）と反応させた。形成されたペプチドを、Ｃ−１８逆相カラム（４.２×２５０mm）を使用してＨＰＬＣによって分離した；流速１ml／分で、０％〜７０％直線勾配液を、０ .１％トリフルオロ酢酸と９５％アセトニトリルを含有する０.１％トリフルオロ酢酸との間で７０分間かけて使用した。オンライン・フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸分析器を装着した気相シークエンサー［アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）］を用いて自動エドマン（Edman）分解を行った。前記とおり、ＨＰＬＣＣ−１８逆相カラムによって、本発明のペプチドを分離し、自動エドマン分解法によって２つの明らかに均一なペプチドの配列を得た。 γ−グルタミルシステインシンセターゼの軽サブユニットから得たペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである：ペプチドＩ：ペプチドII：ペプチドＩから推定される配列に対応してオリゴヌクレオチドプローブを設計し合成した。プローブは、上記ペプチドＩから誘導されるすべてのコドンの組み合わせに対応する３２種の異なる２０量体オリゴヌクレオチドの混合物である。下記配列中の文字Ｉは、デオキシイノシンを表し、２個のコドンにおけるゆらぎ位置において置換されている。実施例IV ラット・腎臓γＧＣＳの軽サブユニットのcＤＮＡクローンの単離を以下のように行った：サムブルック（Sambrook）により記載されたごとく［ジェイ・サムブルック（ J.Sambrook）、エー・エフ・フリッチュ（E.F.Fritsch）およびティー・マニアティス（T.Maniatis），「モレキュラー・クロ−ニング，ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,a Laboratory Manual）」コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Sprong Harbor Press）（１９８９年）参照］、ベクターλgtII中、平均挿入断片サイズ１.１kb（０.６ないし３.８kbの範囲）の１. ２ｘ１０⁶個の別々のクローンを有するラット・腎臓cＤＮＡライブラリー［クローンテック（Clontech）社製］を、実施例Ｉにより調製された軽サブユニットに対する抗体を用いて免疫スクリーニングした。０.２％マルトースおよび１０mＭＭgＳＯ₄を含有するＬＢ培地中で増殖したイー・コリＹ１０９０ｒ−［クローンテック社製］の一晩培養物を０.１mlずつ１０個に分けた。０.１mlを入れた各試験管を、５ｘ１０⁴プラーク形成単位（pfu）のバクテリオファージλgtII発現ライブラリー［クローンテック社製］で、３７℃において１５分間感染させた。７mlのトップ・アガロース（０.７５％アガロースを含有するＬＢ培地）と混合し、感染した細菌を、アンピシリン（１００μg／ml）を含有する１０個のＬＢ寒天プレート（１５０ｘ３５mm）に注ぎ、４２℃で３.５時間インキュベーションした。次いで、プレートを、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（１０mＭ）で処理したニトロセルロースフィルターで覆い、３７ ℃で４時間インキュベーションした。フィルターを注意深くプレートからはがし、ＴＮＴ緩衝液（１０mＭＴris−ＨＣｌ（pＨ８.０）、１５０mＭＮaＣｌおよび０.０５％ツイン２０）で濯いだ。次いで、次のセットのニトロセルロースフィルターで覆い、３７℃でさらに６時間インキュベーションした。２セットのニトロセルロースフィルターをブロッキング緩衝液（５％脱脂乳を含有するＴＮＴ）で１時間処理し、次いで、希釈された（１：５００）軽サブユニットに対する抗体を含有する同じ緩衝液でさらに４時間処理した。ＴＮＴ緩衝液で３回洗浄後、希釈された（１：５０００）ペルオキシダーゼ結合ヤギ・抗ウサギＩｇＧ抗体でフィルターを１時間処理した。洗浄（５回）後、０.０１８％Ｈ₂Ｏ₂および０.０６％３,３'−ジアミノベンジジンを含有するＴris−ＨＣｌ緩衝液（１０mＭ；pＨ７.５）とともにフィルターを５分間インキュベーションすることにより、抗原−抗体複合体を検出した。両セットのニトロセルロースフィルターに出現した陽性プラークを拾い、増殖させ、同じ抗体で再スクリーニングした。説明したように、ファージのＥcoＲＩ部位にcＤＮＡを含んでいるラット・腎臓cＤＮＡλgtII発現ライブラリーを、軽サブユニットに対する抗体でスクリーニングした。約５ｘ１０⁵個のファージから、３８個の陽性クローンを得た。それらのクローンのうち２１個から発現された融合蛋白は、ウェスタンブロット分析により試験した場合、抗体と反応した。それらのクローン由来のファージＤＮＡを単離し、最大の挿入断片を有する２個のクローン（６２番および７１番）をさらなる分析のために選択した。ＥcoＲＩで消化し、次いで、アガロースゲル電気泳動を行ったところ、挿入cＤＮＡを示す２本のＤＮＡバンドが２個のクローンそれぞれから得られた。かくして、クローン６２は１kbおよび０.４kbのバンドを有し、一方、０.７および０.４kbのバンドがクローン７１に含まれていた。これらの結果は、これら２個のクローンが同様のＤＮＡ配列を含んでいる可能性が最も高いことを示す。サザンブロット分析は、上記オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする、クローン６２からの１kbのバンドおよびクローン７１からの０.７kbのバンドを示した。配列決定用ファージミドpＢluescript ＫＳ− （＋）のＥcoＲＩ部位中にサブクローニングされたのは、１.０、０.７および０ .４kbのＤＮＡであった。実施例Ｖ組み換えバクテリオファージλＤＮＡの精製を以下のように行った：陽性クローンから得られた組み換えλファージ粒子（１ｘ１０⁶pfu）を、別々に、イー・コリＹ１０９０ｒ−（１ｘ１０⁸個）とともに３７℃で２０分間インキュベーションした。感染細胞を、あらかじめ暖めておいたＬＢ培地５０mlに接種し、細胞を溶解させた（約６〜８時間）。遠心分離（３０００ｘｇ、５分間）により細胞残渣を除去した後、ＮaＣｌ（２.９g）およびポリエチレングリコール（分子量８０００；５ｇ）を培地に添加することによりλファージを沈殿させた。氷中に２時間置いた後、沈殿したλファージ粒子を遠心分離（５０００ｘｇ、１０分間）により回収した。ペレットを４mlのＴＭ緩衝液（５０mＭＴris− ＨＣｌ（pＨ７.５）および１０mＭＭgＳＯ₄）に再懸濁し、溶液を４mlのクロロホルムで抽出することにより過剰のＰＥＧ８０００を除去した。水層を、あらかじめＴＭ緩衝液で平衡化しておいたＤＥ５２カラム（４ml）に通した。カラムを３mlのＴＭで洗浄し、溶出液（７ml）を集めた。イソプロパノール（７ml）およびＮaＣｌ（４００＃１；４Ｍ）を溶出液に添加し、溶液を氷上に１時間置いた。遠心分離（８０００ｘｇ、１０分）によりファージを沈殿させ、５００μl のＴＥ緩衝液（１０mＭＴris−ＨＣｌ；pＨ８.０および１mＭＥＤＴＡ）に再懸濁した。ファージ溶液を５００μlのフェノール（Ｔris−ＨＣｌ緩衝液,pＨ８.０で飽和）で抽出し、次いで、同体積のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出した。抽出液界面に沈殿が見られなくなるまでフェノールおよびフェノール／クロロホルムによる抽出を数回繰り返した。次いで、溶液をクロロホルムで抽出し、４０μlの０.３Ｍ酢酸ナトリウムおよび１mlのエタノールでＤＮＡを沈殿させた。実施例VI 組み換えＤＮＡのサザンブロット分析を以下のようにして行った：実施例５からの組み換えλgtII ＤＮＡ（３ｇ）をＥcoＲＩで消化し、得られたフラグメントをアガロース（０.８％）ゲル電気泳動により分離した。消化したＤＮＡを、１０ｘＳＳＰＥ緩衝液（２０ｘＳＳＰＥ：３ＭＮａＣｌ、０.２ＭＮaＨ₂ＰＯ₄および２０mＭＥＤＴＡ）中のニトランメンブランフィルター（ Nitran membrane filter）に毛細管現象により移行させた。プレハイブリダイゼーション緩衝液［６ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハーツ溶液（０.１％フィコール４００、０.１％ポリビニルピロリドン、０.１％ウシ・血清アルブミン、０.５％ＳＤＳおよび１００μg／ml変性分画サケ精子ＤＮＡ）］中でフィルターを４５℃ で３時間インキュベーションし、次いで、³²Ｐで標識したオリゴヌクレオチドプローブ（２ｘ１０⁵cpm；１０⁹cpm／μg）を含有する同じ緩衝液中、４５℃で一晩インキュベーションした。軽サブユニットのトリプシン消化により得られたペプチド配列から推定される配列にしたがってプローブを合成した。０.５％ＳＤＳを含有する２ｘＳＳＰＥでフィルターを室温にて洗浄し、次いで、４５℃において１ｘＳＳＰＥで３０分間洗浄した。オーラジオグラフィーを室温で一晩行った。実施例VII 本発明ＤＮＡのＤＮＡ配列分析を以下のように行った：組み換えλgtIIファージＤＮＡの挿入断片を、ＥcoＲＩ処理により切り出し、アガロースゲルから単離し、製造者の説明書にしたがってジェネクリーン（Gene clean）（登録商標）キットを用いて精製した。cＤＮＡをファージミドpＢluesc ript ＫＳ−（＋）（ストラタジーン（Stratagene）社製）のＥcoＲＩ部位中にサブクローニングした。製造者の説明書にしたがってセクエナーゼ（ユー・エス・バイオケミカルズ（U.S.Biochemicals）社製）を用いるジデオキシヌクレオチド鎖ターミネーション法［プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Sci.USA）第７４巻：５４６３頁（１９７７年）参照］により、pＢluescriptの１本鎖または２本鎖ＤＮＡのいずれかに基づいてヌクレオチド配列を決定した。Ｔ７、ＳＫプライマーならびに内部軽サブユニット配列に対応するプライマーを用いた。ＰＣ／Ｇeneソフトウェアを用いて配列分析を行った。軽サブユニットのcＤＮＡ配列を、上記のごとく、組み換えクローン６２および７１のcＤＮＡ挿入断片から誘導した。陽性鎖の全体について、内部プライマーを用いて異なる重複セットから少なくとも３回配列決定を行った。相補鎖を２回配列決定することにより、配列を確認した。 γ−グルタミルシステインシンターゼのmＲＮＡの軽鎖に対応するcＤＮＡ配列を以下に示す：本発明配列は１３８２個のヌクレオチドを有し、２７４個のアミノ酸残基をコードしている８２２個のヌクレオチドのトリプレットコドンにより示された読み取り枠を有している。さらに該cＤＮＡは６０個のヌクレオチドの５'−非翻訳約領域および５００個のヌクレオチドの３'−非翻訳領域からなる。最初のＡＴＧ（６１の位置）は開始コドンと推定される。なぜなら、（ａ）このコドン（... ＧＣＣＡＴＧＧ...）はコザク（Kozak）により記載された真核細胞の開始部位についての一致した配列［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid Res earch）第１２巻：８５７頁（１９８４年）］と一致し、（ｂ）このＡＴＧを開始コドンとして用いるcＤＮＡの発現により、単離されたホロ酵素の軽サブユニットと同時に泳動する蛋白が得られるからである。読み取り枠配列は、１０個の他の終止コドンが後に続く８８３の位置の終止コドン（ＴＡＡ）において終わっている。ジーンバンク（Genebank）＃データベースにおいて得られる蛋白配列と比較した場合、別々に決定された２個のペプチド配列（全部で４１残基；１３９〜１５６および２１９〜２４１）を含む予想蛋白配列は独特のものであることがわかった。発現された本発明γ−グルタミルシステインシンセターゼの軽鎖の読み取り枠は、下線を付した上記の別々に決定された２個のペプチド配列を有する以下のペプチドを提供する：ラット・腎臓γ−グルタミルシステインシンセターゼの軽サブユニットのアミノ酸組成は、以下のとおりである：実施例VIII 軽サブユニット発現プラスミドの構築を以下のように行った：プラスミドpＢluescript ＫＳ中の軽サブユニットcＤＮＡをＮcoＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて４種のdＮＴＰでＤＮＡをフィル−イン（fil l-in）し、次いで、ＢamＨＩで処理した［サムブルック，上記文献参照］。得られたＤＮＡフラグメント（１kb）を、あらかじめＮdeＩ（フィル−イン）およびＢamＨＩで消化しておいた発現ベクタ−pＴ７−７中に連結した［サムブルック，上記文献参照］。得られたプラスミド（pＲＧＣＳＬ）（図１参照）はＴ７プロモーターのすぐ下流に軽サブユニットcＤＮＡを含んでいる。このプラスミドは、ニューヨーク州ニューヨーク、ヨーク・アベニュー１３００番のコーネル大学メディカル・カレッジに寄託されており、ブダペスト条約にしたがって、プラスミドをその発明者から要求するいかなる者にも利用可能となるであろう。実施例IX 本発明同時発現プラスミドを以下のように構築した：重サブュニット用発現プラスミドpＲＧＣＳＨ［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）（１９９３年）参照］をＢstＢＩで消化した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡをフィルーインし［サムブルック，上記文献参照］、次いで、ＨindIIIで消化した。Ｔ７プロモーターおよび重サブユニットcＤＮＡを含んでいる、得られた２kbのＤＮＡフラグメントを、あらかじめＣlaＩ（フィル−イン）およびＨindIIIで消化しておいたプラスミドpＲＧＣＳＬ（図１参照）に連結した。得られたプラスミド（pＲＧＣＳＨＬ）（図２参照）は、重および軽サブユニットがすぐ後にある、逆方向の２個のＴ７プロモーターを有している。実施例X 組み換えホロ酵素の精製を以下のように行った：同時発現プラスミドpＲＧＣＳＨＬ（１ng）をイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換した。この生物は、ニューヨーク州ニューヨーク、ヨーク・アベニュー１３００番のコーネル大学メディカル・カレッジに寄託されており、ブダペスト条約にしたがって、プラスミドをその発明者から要求するいかなる者にも利用可能となるであろう。組み換えホロ酵素を、文献記載の既知方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（１９９３年）参照］にしたがって発現させた。認められている方法［サムブルック，上記文献参照］を用いる組み換え重サブユニットの精製に用いられるのと同様の方法で、酵素を精製した。ＡＴＰ −アガロースカラムから単離された酵素を、１ｍＭＥＤＴＡを含有するイミダゾール緩衝液（１０mＭ；pＨ７.４）であらかじめ平衡化しておいたプロテインパック（登録商標）３００（ProteinPak３００）（ウォーターズ（Waters）社製）によりさらに精製した。精製された組み換えホロ酵素は、下表に示す１０mＭグルタミン酸を含有するアッセイ溶液中でアッセイした場合、比活性値１２５０を示した。この比活性はラット・腎臓から単離されたホロ酵素の比活性と同様であったが、ずっと高かった。組み換えγ−グルタミルシステインシンセターゼホロ酵素の単離下表は、ＧＳＨ酵素のホロ酵素および重サブユニットに対するＫm値を示す。この表において、Ｋｍ値は酵素に対する基質の親和性の反映であり、高い値は低い親和性を、低い値は高い親和性を示す。 γ−グルタミルシステインシンセターゼに対する見かけのＫm値（mＭ）かくして、この表は２つのタイプの組み換え酵素（１つは軽および重サブユニットに対する同時発現cＤＮＡにより得られ、もう１つは別々に発現されたサブユニットを単に混合しただけ）は、グルタミン酸、システイン（およびα−アミノ酪酸）に対して単離されたホロ酵素と同程度の親和性を有することを示す。しかしながら、組み換え重サブユニット酵素はグルタミンに対して１８.２mＭの値を有しており、この酵素がグルタミン酸に対して約１０倍低い親和性を有することが示される。実際、このことは本発明のキーポイントである：重サブユニットのみでは（軽サブユニットなしでは）基質の１つ（グルタミン酸）に対する親和性が低すぎて生理学的に有用でない。別々に発現された軽および重サブユニットを単に混合することにより得られた組み換えホロ酵素に対するグルタミン酸の値は２.８mＭであり、サブユニットの混合はサブユニットを同時発現させるほどには効果的でないことが示される。現在のテクノロジーを用いれば、自動化された方法を用いて本発明ヌクレオチドまたはペプチド配列のいずれを合成することも可能である。例えば、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社の３８０Ａ型のごとき自動ＤＮＡ合成装置を用いてヌクレオチド配列を直接合成してもよい。合成の際、通常のホスホラミダイト化学薬品の代わりに適当な試薬を用いることにより、大量の塩基、リボースおよびリン酸での修飾を合体させることができる。小型のオリゴヌクレオチドは、ある種の細胞により周囲の培地から自発的に摂取されるので、この方法を用いて本発明オリゴヌクレオチドを適当な細胞に導入し、動物組織におけるＧＳＨレベルを増大させてもよい。さらに、本発明オリゴヌクレオチドに対するアンチセンス配列を開発し、かかるアンチセンス配列を適当な細胞中に導入して動物組織中のＧＳＨレベルを抑制することも、現在の当業者の範囲内のことである。疎水性基での誘導体化、メチルホスホナート、ホスホロチオアートまたはジチオアートでの通常存在するリン酸の置換のごとき核酸の修飾により、センスおよびアンチセンス両方のオリゴヌクレオチドのかかる摂取を容易にすることもできる。リポソーム融合は、核酸を骨格とする試薬の細胞への送達のための別の様式を提供する。オリゴヌクレオチドおよびペプチドの製造および送達のためのかかる方法は当該分野においてよく知られている。かくして、本発明の詳細な説明およびそこに包含される実施例によれば、本発明の２７４個のアミノ酸の配列は分子量３０,５４８となり、この値はＳＤＳゲル電気泳動によりあらかじめ見積もられた値２７,７００よりも大きく、さらに算出されたアミノ酸組成は単離された軽サブユニットのアミノ酸分析により決定されたアミノ酸組成とかなり一致していると考えられる。本発明の有用でありうる適用は、遺伝子転移による動物体内に存在する酵素量の増大（いわゆる遺伝子治療）の可能性を包含する。このタイプの遺伝子転移およびそれが有用でありうることに関するモデルは、組み換えＤＮＡ法によってグルタチオン合成に必要な酵素含量を増大させることにより放射線耐性が向上したイー・コリ株についての研究に関連して見いだされる［プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８６巻：１４６１頁（１９８９年）参照］。本発明遺伝子の遺伝子転移も同様の結果を与えると期待され、動物宿主中への本発明遺伝子のかかる遺伝子転移によりグルタチオンに関連した生化学的反応が促進されることも期待される。もちろん、たいていの場合において、この遺伝子は、プロモーター、インデューサー等とともに動物宿主中に転移されて（そのことは遺伝子工学の分野において知られ、認められている方法である）、細胞は該遺伝子産物である蛋白の産生を開始および継続することができよう。しかしながら、日常的にヒトをはじめとする動物を治療してその体内のグルタチオン産生を増加させるには臨床試験および合衆国政府の認可が必要であるため、かかる可能性のある適用の商業化は容易でない。上記した本願の範囲内のもう１つの可能性のある適用は、細胞によるＧＳＨ産生を抑制する手段として、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を細胞に導入することである。本発明の近い将来の商業的使用として、動物から得られた臨床標本における酵素のｍＲＮＡ濃度のアッセイおよび測定のために上記プローブが使用できよう。当該テクノロジーは、本発明に関連したかかる試験を開発するために適切である。全てのヌクレオチドおよびペプチド配列の配列表を以下に示す：配列表（１）一般的情報：（ｉ）出願人：アルトン・メイスター、チン−ショウ・ファン、およびメアリー・イー・アンダーソン（ii）発明の名称：グルタミルシステイン・シンセターゼ軽サブユニット（iii）配列の数：１０（２）配列番号１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２３アミノ酸（Ｂ）配列の型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号１：（２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１８アミノ酸（Ｂ）配列の型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（ix）特徴：（Ｄ）他の情報：９位は、決定されていない配列である。（xi）配列：配列番号２：（２）配列番号３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：７アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号３：（２）配列番号４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：mＲＮＡ（xi）配列：配列番号４：（２）配列番号５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ix）他の情報：１２位および１５位の記号「Ｉ」は、デオキシイノシンを示す。（xi）配列：配列番号５：（２）配列番号６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１３８２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cＤＮＡ（xi）配列：配列番号６：（２）配列番号７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２７４アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号７：（２）配列番号８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（xi）配列：配列番号８：（２）配列番号９の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１９１４塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（xi）配列：配列番号９：（２）配列番号１０の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６３７アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号１０：かくして、本発明者らは、本発明の好ましい具体例を説明および記載するが、本発明は、変形および修正が可能であると解されるべきであり、したがって、本発明者らは、説明された正確な用語に限定しようとせず、種々の慣例および条件に本発明を適合させるのに役立つかかる変化および変更を利用することを望む。したがって、かかる変化および変更は、当然、完全に同等な範囲内に、したがって、以下の請求の範囲の範囲内にあることを意図する。かくして、当該技術が属する技術分野、または、最も密接に関係する技術分野の当業者が本発明を製造および使用することができるように、充分、明瞭、簡潔かつ正確な用語で、本発明およびそれを製造および使用する方法を説明してきた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 9/00 9452−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ // Ｃ１２Ｑ 1/68 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者アンダーソン，メリー・イーアメリカ合衆国10021ニューヨーク州、ニューヨーク、イースト・シックスティサード・ストリート450番

Claims

【特許請求の範囲】１．であり、２７４アミノ酸残基をコードする８２２トリプレットヌクレオチドコドンによって示されるオープンリーディングフレーム、６０ヌクレオチドの５'− 非翻訳領域および５００ヌクレオチドの３'−非翻訳領域を含有することを特徴とする、γ−グルタミルシステインシンセターゼｍＲＮＡの軽サブユニットに対応する単離cＤＮＡ配列。２．オープンリーディングフレームがである２７４アミノ酸残基をコードするトリプレットヌクレオチドコドン６１〜８２２ヌクレオチドによって示される請求項１記載の配列。３．以下の配列：を有するγ−グルタミルシステインシンセターゼの軽サブユニットである単離および精製ペプチド。４．ＧＳＨレベル産生の増加が望まれる細胞中にオリゴヌクレオチド配列：を導入することを特徴とする、細胞のＧＳＨ産生の正常なレベルを増加させる方法。５．細胞中に導入される配列がヌクレオチド６１〜８２２によって定義されるオープンリーディングフレームである請求項４記載の方法。６．さらに、細胞中にオリゴヌクレオチド配列：を導入することからなる請求項５記載の方法。７．さらに、細胞中にオリゴヌクレオチド配列：を導入することからなる請求項４記載の方法。