CN101067136B - 芦苇γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS及所述基因PcGCS的植物表达载体，本发明还公开了所述基因PcGCS在培育抗重金属植物特别是剪股颖中的应用。实验证明，本发明所述转基因植株比非转基因植株的富集重金属的能力得到了很大程度的提高。

Description

芦苇γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及芦苇富集重金属相关基因——γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其应用。

背景技术

随着工业的发展和人类生产活动的加剧，重金属污染已成为全球关注的问题。目前我国存在数千万亩的重金属污染土壤，对人类健康造成了极大地危害。因此，有效地去除重金属污染成为当前一个十分迫切的任务。

利用转基因改良植物技术将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基因植物修复系统，用于重金属污染的土壤修复是一项具有广阔应用前景的技术。

基因工程在植物重金属的富集方面已取得了一些相关的研究进展，已识别和克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于重金属污染的土壤修复研究。许多实验表明，将细菌、真菌、动物及植物本身与重金属脱毒相关的基因转入高生物量植物，异源表达产物可介导转基因植物耐受和高积累重金属及类似物。

目前，已证明对重金属修复有显著作用的主要有：植物络合素(phytochelatins，PCs)。它是由重金属诱导而合成的一类小分子多肽，能鳌合重金属，从而减轻重金属对植物的毒害。PCs并非基因的直接产物，而是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylsysteine synthetase，γ-ECS)、谷胱甘肽合成酶(GS)和植物络合素合酶(PCS)分三步催化而合成。目前，已克隆了多个参与PCs生物合成的基因，并在生物量小的拟南芥和印度芥菜中证实了它们富集重金属的功能。

芦苇(Phragmites communis Trirn)可超富集重金属(Cd²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺)，为湿地处理污水的主要植物物种，然而其重金属富集相关基因的克隆特别是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的克隆尚未见报道。

多花黑麦草、高羊茅、剪股颖为生物量大、生长快的优良草坪草。但是，经检索，将芦苇的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因转入剪股颖以提高它的抗重金属的性能尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种芦苇富集重金属相关基因——γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其应用。

本发明的技术方案在于从芦苇中分离得到γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS，然后将该基因转到高生长量的草坪草中以实现土壤重金属污染的修复。

本发明提供的基因名称为芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS，所述基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种含上述的芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS的植物表达载体pROK2，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

本发明所述基因PcGCS在培育抗重金属植物中的应用。

将本发明所述基因导入植物细胞，植物就可以获得富集重金属的能力，为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对本发明所述植物表达载体pROK2进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，优选的载体是pROK2。

本发明所述的基因可广泛用于培育抗重金属的生物量大、生长快的植物品种，其中所述植物优选剪股颖。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了芦苇的γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入生物量大、生长快的植物品种特别是剪股颖中，经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株的富集重金属的能力得到了很大程度的提高。

附图说明

图1为芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因的cDNA电泳图，其中：泳道1为基因的cDNA，M为Marker。

图2为剪股颖抗卡那霉素筛选培养基选择压力的确定图，其中：1为0mg/L卡那霉素，2为5mg/L卡那霉素，3为10mg/L卡那霉素。

图3为转基因剪股颖的DNA鉴定图，其中：泳道1、2、3、4、5均为剪股颖转基因植株的cDNA，泳道6为Marker。

图4为GCS标准曲线。

具体实施方式

实施例1、PcGCS的克隆

1.1芦苇总RNA的提取

(1)芦苇材料放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成均匀的粉末。注意研磨过程中要保证材料浸在液氮中。

(2)待液氮挥发后将材料迅速转入预冷的离心管中，每50-100mg组织材料加入1ml TRIZOL溶液，混匀后，于室温放置5 min，12000r/min，2-8℃离心10min去沉淀。

(3)每1ml TRIZOL溶液中加入0.2ml氯仿，振荡15sec充分混匀，于室温放置5min，12000r/min，2-8℃离心15min。

(4)取上清，每1ml TRIZOL加入0.5ml的异丙醇，混匀，室温放置10～20min。

(5)2-8℃ 12000r/min离心10min，弃上清。

(6)加1ml 75％乙醇洗涤沉淀2次，4℃不超过7500r/min离心5min，弃上清。

(7)室温放置晾干后，加入15μl DEPC处理的双蒸水溶解RNA。

1.2逆转录合成第一链cDNA

(1)0.2ml Eppendorf管中，加入下列成分：

用DNaseI纯化的上述总RNA(0.1μg/μl)    2.0μl

Olige(dT)anchored primer(2μM)    2.0μl

(2)0℃水浴变性10分钟，立即置于冰浴中。

(3)在10μl反应体系中加入下列成分：2.0μl 5×MMLV RT buffer；1.0μl 250μmol/L dNTP mix；0.25μl Rnasin；0.5μl(200u/μl)MMLV逆转录酶；2μl上述RNA变性液。42℃进行逆转录反应1hr。反转录第一链cDNA用于后面的反应。

1.3PCR

以上述逆转录合成第一链cDNA为模板，PCR法扩增基因片段。

(1)PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成

引物P1：5′-TTA TCG GTC TCA AGC AGG-3′

引物P0：5′-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-3′

(2)PCR反应体系

(3)PCR反应程序

94℃ 5min；94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃2min，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物电泳如图1所示。

1.4 5′-RACE

按照TaKaRa 5′-Full RACE Core Set说明书所示步骤操作。电泳5′-RACE产物。

1.5目的片段的回收

(1)用刀片切下上述电泳结果中含目的条带的胶条置于1.5mlEppendorf管中。

(2)称重，加入3-4倍体积的DR-I Buffer，65℃加热10min融化胶块，每隔2min混匀一次保证胶块能充分融化。

(3)加入DR-I Buffer量的1/2体积的DR-II Buffer，均匀混合。

(4)将Spin Cloumn安置于Collection Tube上，将上述溶液转移至Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。

(5)将500μl Rinse A加入Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。

(6)将700μl Rinse B加入Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。

(7)重复步骤6，然后12000rpm再离心1min。

(8)将Spin Cloumn安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Cloumn膜的中央处加入预热到60℃的25μl的水或洗脱缓冲液，室温静置1min。

(9)12000rpm离心1min洗脱DNA。

(10)重复步骤9，2次，将所有洗脱液集中收集于一管内，混匀，取少量电泳检查回收效率，其余加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1hr。

(11)然后4℃，12000rpm离心15min，用70％冷乙醇洗涤沉淀，弃尽液体，用40μl无菌水溶解沉淀。回收的片段用于后面的连接反应。

1.6连接

用上述的回收目的片段与pGMT载体(购自宝生物工程有限公司，下同)按摩尔比约1∶1的比例进行连接，连接体系如下：

混匀并短暂离心，16℃连接过夜。得到重组质粒pGEM-GCS，用于后面的反应。

1.7CaCl₂法制备感受态细胞

(1)挑取DH10B单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

(2)按1∶100-1∶50的比例，取1ml菌液接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液OD600为0.3-0.6。

(3)将菌液冰浴10min，4℃ 4000rpm离心10min，收集菌体。

(4)沉淀加10ml预冷的0.1M CaCl₂悬浮后，冰浴30min。

(5)4℃4000rpm离心10min。沉淀重悬浮于1ml预冷的0.1M CaCl₂，混匀并冰水浴中保存，备用或加入15％的甘油置于-70℃中保存。

1.8热击法转化Ecoli DH10B

(1)在无菌条件下吸取100μl感受态细胞，加入1.5ml预冷的无菌Eppendorf管中，加入10μl连接产物(1.6中的重组质粒)，轻轻混匀，立即置于冰上30min。

(2)在42℃恒温水浴中热激90sec(准确记时)。

(3)冰浴3-5min。

(4)加入800μl不含抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃振荡培养45-60min。

(5)短暂离心收集菌体，用150μl LB液体培养基重悬菌体，转至含抗生素Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上，用无菌涂布棒涂布。

(6)将平板于37℃正向放置15-30min至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养12-16hr，观察平板会有蓝白斑。白斑用于后面的质粒提取。

1.9碱裂解法提取大肠杆菌质粒

(1)挑取白色单菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3ml LB液体培养基中，同时也要保存所挑取的白色单菌落于含抗生素Amp(50mg/L)的固体LB平板中，37℃震荡培养12-16h；

(2)12000rpm离心30sec，收集培养物中的菌体，尽量弃尽上清；

(3)加入100μl冰预冷的溶液I，在涡旋器上使菌体充分重悬；

(4)加入200μl溶液II，立即将离心管缓缓颠倒数次，冰浴5-10min；

(5)加入150μl冰预冷的溶液III，缓缓颠倒离心管数次直至白色沉淀充分形成，冰浴5-10min；

(6)12000rpm离心3min，取上清转入另一微量离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后，室温静置3min；12000rpm离心3min，使质粒DNA沉淀；

(7)弃尽上清，取200μl TE溶液溶解沉淀；

(8)加入等体积冰预冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的RNA；

(9)12000rpm，离心3min；

(10)转移上清到另一离心管中，加入2倍体积的95％乙醇，混匀后于室温静置3min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；

(11)弃上清后用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，弃尽液体；

(12)室温干燥后，取20μl含RNaseA(20μg/ml)的TE溶液溶解沉淀，37℃水浴30～60min消化RNA。

(13)为减少损失，可先用TE将总体积补充至200μl，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，充分振荡5-10min，12000rpm离心5min；

(14)取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇，重复以上操作；

(15)取上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃放置15min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；

(16)弃上清用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，弃液体，用40μl TE或无菌水溶解沉淀。质粒用于后面的反应。

1.10质粒酶切验证

用EcoRI酶切上述质粒，酶切反应体系如下表所示：

重组质粒pGEM-GCS         16μl

EcoRI限制性内切酶        2μl

10×Buffer               2μl

将上述反应体系混匀并5000rpm离心1min，37℃水浴反应过夜，然后进行1％的TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

1.11DNA测序

挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海博亚生物技术有限公司测序，得到测序结果：基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

经过NCBIblast分析，上述cDNA序列与禾本科的GSHI同源，证明实验得到的就是芦苇的γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因，命名为芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS。

实施例2、植物表达载体的构建

2.1目的基因的获得

引物设计及PCR反应的体系和条件：

(1)设计如下一对PCR扩增引物，引入植物表达载体pROK2(购自宝生物工程有限公司)中所含有的两个酶切位点SacI和XbalI。

P11：5’-CGAGCTCGA TGG AAG AAA ACC ATG TTA TCG-3’

SacI

P12：5’-GCTCTAGAGCTCA GTA TAA CAA GTG CTC G-3’

XbalI

(2)PCR反应体系：

(3)PCR反应条件为

94℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃2min，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物电泳回收后用于后面的反应。

2.2表达载体的构建

将带有SacI，XbalI酶切位点的cDNA与质粒分别进行SacI和XbalI的双酶切，再按照5∶1的比例在T4连接酶的催化下进行过夜连接。反应体系及条件如下：

(1)酶切反应体系和条件：

上表体系30℃ lh，下表体系37℃ lh

(2)质粒酶切反应体系和条件：

上表体系30℃ lh，下表体系37℃ lh

连接反应用T4 DNA Ligase进行，体系和条件同pGEM-T的连接体系和条件。用连接产物转化大肠杆菌，从卡那霉素抗性的菌落中筛选出重组子，提取阳性克隆pROK-GCS的质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，反应体系和条件同鉴定重组子。

2.3测序

将含有重组质粒的阳性菌株送上海博亚生物技术有限公司测序，得到的测序结果经过NCBIblast分析，阳性质粒中确实含有芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS的cDNA序列。至此得到了重组表达载体，即含基因PcGCS的植物表达载体pROK-GCS。

实施例3、芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS的功能验证

3.1酵母表达载体的构建

3.1.1目的基因的获得

(1)引物设计：设计一对PCR扩增引物(P9、P10)引入酵母表达载体pDR195(购自宝生物工程有限公司)中所含有的两个酶切位点BamHI和NotI。

P9：5’CGG GAT CCA TGG AAG AAA ACC ATG TTA TCG 3’

BamHI

P10：5’ATT TGC GGC CGC TCA GTA TAA CAA GTG CTC G 3’

NotI

(2)PCR反应体系：

(3)PCR反应条件为

94℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 2min，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物电泳回收后用于后面的反应。

3.1.2表达载体的构建步骤

将带有BamHI和NotI酶切位点的cDNA与质粒分别进行BamHI和NotI的双酶切，再按照5∶1的比例在T4连接酶的催化下进行过夜连接。反应体系及条件如下：

(1)cDNA酶切反应体系和条件：

上表体系30℃ lh，下表体系37℃ lh

(2)质粒酶切反应体系和条件：

上表体系30℃ lh，下表体系37℃ lh

连接反应用T4 DNA Ligase进行，体系和条件同T载体的连接体系和条件。用连接产物转化大肠杆菌，从卡那霉素抗性的菌落中筛选出重组子，得到酵母表达载体pDR-GCS。提取阳性克隆pDR-GCS的质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，反应体系和条件同鉴定重组子。

3.2DNA导入酵母

(1)挑取酵母菌株(野生型酿酒酵母)的单克隆，接种至10ml液体YPD培养基，30℃，200rpm，培养2-3天；

(2)按照1∶50的比例将菌液转移至50ml YPD液体培养基中30℃，200rpm，培养3～5h，此时的菌液OD0.4～0.6。

(3)将菌液分装至10ml无菌离心管中，每管5ml；

(4)3000rpm离心5min，收集细胞。用2.5ml无菌ddH2O重悬菌体；

(5)3000rpm离心5min，收集细胞。用0.1ml 100mM(1×)LiAc/TE buffer重悬菌体；

(6)3000rpm离心1～2min沉淀细胞(仅需将菌体离心至离心管底即可)，用微量移液器小心吸走上清；

(7)用50μl 100mM(1×)LiAc/TE buffer重悬菌体，将菌悬液移至灭菌的1.5mlEppendorf管中；

(8)将1ml单链担体DNA煮沸5min，快速在冰水中冷却；(注：无需每次使用时都煮沸担体DNA，可分装成小份冻存；冻融3～4次后应再煮沸，取出后应保持在冰上)

(9)将步骤7准备的样品，3000rpm离心1～2min沉淀细胞，用微量取样器小心吸走上清；

(10)按下列顺序加入：240μl PEG(50％w/v)(加入后用枪头上下吹打，尽量将菌体悬浮)；36μl 1M(10×)LiAc；25μl单链担体DNA(2.0mg/ml)50μl水和质粒DNA(0.1～10μg)(一般情况下，质粒加入10～40μl即可)；

(11)涡旋振荡Eppendorf管1min，直到细胞完全混匀，30℃水浴30min；

(12)42℃水浴中热激20～25min；

(13)5000rpm离心1～2min，用微量移液器除去转化混合液；

(14)吸取0.2～1.0ml无菌水加到每个反应管中，用移液器轻轻抽提以悬浮沉淀；

(15)取50μl转化液，均匀涂布在含卡那霉素抗性的培养基上，30℃培养2～4d。用未转化的酵母做对照。

3.3酵母重组子的鉴定

3.3.1菌落PCR鉴定初筛

(1)平板上的菌落长到肉眼可见时。

(2)将除了模板以外的其他PCR反应液组分准备好，并分装。

(3)用一根灭菌牙签挑取菌落，在PCR管中测一下，放入一个灭菌的1.5ml离心管，对PCR管和1.5ml离心管编号。

(4)PCR扩增，0.8％琼脂糖凝胶电泳。对PCR扩增显现特异性条带的克隆，置于1.5ml离心管中的半截牙签扔到5mlYPD培养基中，30℃培养，24±1小时提取DNA，用DNA作为模板再进行PCR进一步确定。

PCR反应体系及条件如下：

PCR反应条件为：

94℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 2min，35个循环；最后72℃延伸7min。

3.3.2酵母总DNA为模板进行二次鉴定

酵母基因组的提取

(1)接种重组和空质粒转化子于5ml MD培养基，菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16-18小时。

(2)室温下，1500g离心5-10min收集菌体。

(3)100uL TE(pH7.0)重悬后1500g离心5-10min收集菌体。

(4)用2ml的SCED(PH7.5)重悬。

(5)加入1～3mg蜗牛酶，37℃，50min。

(6)加入2ml 1％SDS，轻摇混匀，然后置于冰上5min。

(7)加入1.5ml 5M醋酸钾，轻轻混匀。

(8)10000g离心5-10min，弃上清。

(9)加入2倍体积无水乙醇，室温放置15min。

(10)10000g离心20min，弃上清。

(11)加入0.7mlTE缓冲液。

(12)加入等体积的苯酚∶氯仿(1∶1 V/V).

(13)加入1/2体积的7.5M醋酸铵溶液。

(14)加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置1hr。

(15)10000g离心20min。

(16)加入1ml 75％乙醇漂洗沉淀一次。

(17)干燥后，加入50ul的TE或H₂O溶解，-20℃备用。

PCR反应体系的组成和反应条件同菌落PCR，PCR产物0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。

3.4GCS含量测定

3.4.1温差破碎法提取GCS

酵母发酵液4000r/min离心5min，收集菌体，菌体加水-20冰冻过夜，沸水浴煮沸5min，离心上清液用于测定。

DTNB处理方法：每1mL待测样品或标准品加入3mL0.15mol/LNaOH溶液中，摇匀，加入体积分数U＝0.03甲醛1mL，摇匀，静置2min加入5mLDTNB分析溶液，摇匀，在25水浴保温5min。

3.4.2标准品的制备

准确称量1.00g/L GCS标准溶液，50.00mg GCS溶于双蒸水中，在50mL容量瓶中定容，避光放置，当日现配。分别取0.10，0.20，0.40，0.80，1.00mL的GCS标准溶液经DTNB处理后，进行测定，制作标准曲线。见图4

3.4.3样品的测定

挑取六个转基因阳性克隆J-1，J-2，J-3，J-4，J-5，J-6和六个未转基因克隆w-1，w-2，w-3，w-4，w-5，w-6，进行测量统计。

(1)分别挑取阳性克隆和未转化的克隆至30ml培养基中，培养过夜。

(2)取15ml菌液4000r/min离心5min，水洗两次，收集菌体。

(3)85℃烘干至恒重，称量。

(4)另外15ml菌液用温差破碎法处理。

(5)上清液由DTNB处理。

(6)测定样品在波长412nm处的吸光度，通过计算或从标准曲线上得出GCS含量。

表1样品中GCS的质量浓度

表2样品干重

表3样品中GCS的含量

对表2和3中的两组数据进行分析，可以得出结论，转基因酵母与未转基因的酵母相比，干重并无显著变化而GCS含量提高了30％。

实施例4、农杆菌介导的芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS的剪股颖转化

4.1DNA导入农杆菌

4.1.1农杆菌感受态细胞的制备

(1)活化农杆菌AGL1(购自宝生物工程有限公司)，然后挑取单菌落到10mlYEP中，28℃振摇过夜。

(2)取2ml菌液于100mlYEP中稀释，28℃振摇过夜。将菌液倒入离心管后，冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10m in后去上清。

(3)用预冷的0.05mol/L的CaCl₂溶液每管5ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min后，4℃下3000g离心10min。

(4)弃去上清，用含15％甘油的预冷的。0.05mol/L的CaCl₂溶液每管1ml轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟后，即成感受态细胞悬液。

(5)将感受态细胞分装成200μl的小份，-70℃保存待用。

4.1.2转化

(1)向200μl农杆菌感受态细胞中加入0.5-1.0μg重组质粒pGEM-GCS，冰上放置5min后，立即放入液氮中5min。取出离心管，37℃保温5min后，用1mLYEP在无菌条件下稀释，28℃振摇2-4h。

(2)取200涂布于含50mg/L卡那霉素(Kan)和40mg/L利福平(Rio)的YEP平板中，28℃培养得到单菌落。

4.1.3转化鉴定

(1)挑取农杆菌单菌落，扩增抽提重组质粒pGEM-GCS。

(2)将重组质粒pGEM-GCS转化至DH10B感受态细胞并进行鉴定。

4.2农杆菌介导的剪股颖转化

(1)草坪草愈伤组织的诱导

剪股颖种子在70％乙醇中浸泡30sec，经10％NaCl0消毒10min，无菌水漂洗8次，接种于愈伤诱导培养基上，得到的愈伤用同样的培养基继代。

(2)筛选培养基选择压力的确定

将未转化的剪股颖愈伤组织转移到含不同卡那霉素浓度(0，5，10mg/L)的继代培养基上，25℃暗培养两周，然后转移到新的含相应卡那霉素浓度的继代培养基上继续25℃暗培养两周。结果如图2所示。

4.2.1农杆菌准备

(1)从-70℃冰箱取出含重组质粒的农杆菌AGL1，于含有抗生素的LB固体培养基上活化。

(2)两天后YEP培养基上长出农杆菌单菌落，挑取单菌落于含有抗生素的10ml液体培养基中振摇培养。

(3)两天后，液体培养的农杆菌OD₆₀₀为0.8±0.01，将农杆菌划线培养于含有抗生素的固体培养基上。用来转化的农杆菌在培养基上需要生长3天左右。

4.2.2转化方法

(1)草坪草愈伤组织转移到新鲜的继代培养基上预培养7天。

(2)农杆菌在固体培养基上生长3天后，离心收集农杆菌再悬浮培养在含乙酰丁香酮的继代培养基上，使初始的OD₆₀₀＝0.8。

(3)将预培养的愈伤收集到无菌的三角瓶中，倒入上述的农杆菌液，浸没愈伤，静置30min，接着用无菌滤纸吸干愈伤表面多佘菌液后，转移到铺有滤纸的共培养基上共培养3天。

(4)共培养3天后，从共培养基上收集愈伤到三角瓶中，经过如下洗涤先用无菌水漂洗愈伤，然后用加有Cef(头孢霉素)的继代培养基洗，这样作为一个循坏，洗2-3个循环，然后无菌滤纸吸干。

(5)然后将愈伤组织转移到选择培养基上，进行筛选。

(6)经过一个月(两轮)的筛选后，将愈伤组织转移到分化培养基上进行再分化。

(7)再分化的愈伤转移到生根培养基上进行生根培养。

4.3CTAB法提取转基因植株基因组DNA

(1)称取0.5g的剪股颖叶子，剪碎后用液氮研磨，迅速将粉末转移至1.5ml离心管中，然后加入700μl预热至65℃的2xCTAB提取缓冲液及0.1％的疏基乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，然后置于65℃水浴保温2h，不时颠倒混匀。

(2)混合物冷却至室温后加入等体积的酚∶氛仿∶异戊醇(25∶24∶1)，4℃下10000g离心10min。

(3)将水相转移至一干净离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，4℃下10000g离心10min。

(4)将水相转移至一干净离心管中，加入两倍体积无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA。

(5)4℃下10000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入100闪含无DNA酶的RNA酶的TE液溶解，37℃水浴30min

(6)加入200μl无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA.4℃下10000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入40μl无菌水溶解DNA，4℃保存待用。

4.4PCR检测转基因植株

以CTAB法提取的DNA为模板，PCR法扩增芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS

(1)PCR反应体系

(2)PCR反应程序

94℃5min；94℃30sec，50℃30sec，72℃2min，35个循环；最后72℃延伸7min。

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图3所示，得到了5株阳性植株。

4.5阳性植株富集Cd离子的能力

将阳性植株和非转基因植株分别转到含有5mM的CdCl₂IB培养基中生长，结果转基因的阳性植株能够存活11天，而非转基因植株生长到6天时间叶子几乎全变黄而死去。

注：上述实验中用到的试剂等购自TAKARA、Promega、Sigma等公司。

实验中用到的LB培养基配方：0.5％酵母粉、1％NaCl、1％蛋白胨。

继代培养基配方：MS培养基+2ppm2，4-D。

生根培养基配方：MS培养基+0.5ppmIAA+0.5ppm6-BA。

其它试剂配方：见《分子克隆》第三版。

序列表

<110>山东大学

<1 20>芦苇γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其应用

<141>2007-5-22

<210>1

<211>1125

<212>cDNA

<213>芦苇

<400>1

atggaagaaa accatgttat cggtctcaag cagggaaagc aaagcatttc gctagaacct  60

ggtggccagt ttgaacttag cggtgctcct cttgaaacat tacatcaaac ttgtgctgag  120

gtcaattcac atctttatca ggtcaaagca gttggagaag aaatgggtat aggatttctt  180

ggacttggtt ttcagccgaa gtgggcgctg agtgatatac caataatgcc caagggaaga  240

tacgaaataa tgaggaatta catgcctaaa gttggttctc ttggccttga tatgatgttc  300

cgcacgtgca ctgttcaggt taatcttgac ttcagttcag agaaggatat gataaggaaa  360

tttcgtgcta gccttgcatt gcaacctatt gcaacagcaa tatttgctaa ttctcccttt  420

aaagaaggaa aaccaaatgg gtttctcagc ttaagaagcc atatctggac agatactgat  480

aacaaccgct ctgggatgct tccttttgtc tttgatgact cgtttggatt tgagcaatat  540

gtggattatg cattagatgt cccaatgtat tttgtatatc gaaataagaa gtacattgac  600

tgtaccggaa tgccatttcg ggattttatg gaaggaaagc tcccacaagc tcctggggag  660

ttgcctactc taaatgattg ggagaaccat ctaacaacaa tttttcctga ggttaggttg  720

aagagataca tagagatgcg gggtgctgat ggtggcccat ggaggagatt gtgtgctttg  780

cctgcatttt gggttgggct gttatatgac gaggaatcat tacaaagcat tttggatatg  840

acttttgatt ggacaaagga agagagagag atgctacgac ggaaggtacc gttgactggt  900

ttgaagacac catttcgtga cggatatgta agagatttag gtgaagatgt tctaaaatta  960

gccaagagtg gactagaaag aagaggatac aaggaggttg gtttcttgag agaggtcgac  1020

gaagtagtga gaacaggagt gacaccttct gagaggcttt tgaatctgta cgagaccaag  1080

tggcaacgca gcgtggaccc tgtcttcgag cacttgttat actga                  1125

<210>2

<211>12883

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag  60

aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg  120

aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac   180

ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc   240

cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga   300

caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat   360

gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat   420

tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt   480

ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg   540

tttttaacca gggctgcgcc ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc   600

cttctcgaac cctcccggcc cgctaacgcg ggcctcccat ccccccaggg gctgcgcccc   660

tcggccgcga acggcctcac cccaaaaatg gcagcgctgg cagtccttgc cattgccggg   720

atcggggcag taacgggatg ggcgatcagc ccgagcgcga cgcccggaag cattgacgtg   780

ccgcaggtgc tggcatcgac attcagcgac caggtgccgg gcagtgaggg cggcggcctg   840

ggtggcggcc tgcccttcac ttcggccgtc ggggcattca cggacttcat ggcggggccg   900

gcaattttta ccttgggcat tcttggcata gtggtcgcgg gtgccgtgct cgtgttcggg   960

ggtgcgataa acccagcgaa ccatttgagg tgataggtaa gattataccg aggtatgaaa  1020

acgagaattg gacctttaca gaattactct atgaagcgcc atatttaaaa agctaccaag  1080

acgaagagga tgaagaggat gaggaggcag attgccttga atatattgac aatactgata  1140

agataatata tcttttatat agaagatatc gccgtatgta aggatttcag ggggcaaggc  1200

ataggcagcg cgcttatcaa tatatctata gaatgggcaa agcataaaaa cttgcatgga  1260

ctaatgcttg aaacccagga caataacctt atagcttgta aattctatca taattgggta  1320

atgactccaa cttattgata gtgttttatg ttcagataat gcccgatgac tttgtcatgc  1380

agctccaccg attttgagaa cgacagcgac ttccgtccca gccgtgccag gtgctgcctc  1440

agattcaggt tatgccgctc aattcgctgc gtatatcgct tgctgattac gtgcagcttt  1500

cccttcaggc gggattcata cagcggccag ccatccgtca tccatatcac cacgtcaaag  1560

ggtgacagca ggctcataag acgccccagc gtcgccatag tgcgttcacc gaatacgtgc  1620

gcaacaaccg tcttccggag actgtcatac gcgtaaaaca gccagcgctg gcgcgattta  1680

gccccgacat agccccactg ttcgtccatt tccgcgcaga cgatgacgtc actgcccggc  1740

tgtatgcgcg aggttaccga ctgcggcctg agttttttaa gtgacgtaaa atcgtgttga  1800

ggccaacgcc cataatgcgg gctgttgccc ggcatccaac gccattcatg gccatatcaa  1860

tgattttctg gtgcgtaccg ggttgagaag cggtgtaagt gaactgcagt tgccatgttt  1920

tacggcagtg agagcagaga tagcgctgat gtccggcggt gcttttgccg ttacgcacca  1980

ccccgtcagt agctgaacag gagggacagc tgatagacac agaagccact ggagcacctc  2040

aaaaacacca tcatacacta aatcagtaag ttggcagcat cacccataat tgtggtttca  2100

aaatcggctc cgtcgatact atgttatacg ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg  2160

ttttctggta tttaaggttt tagaatgcaa ggaacagtga attggagttc gtcttgttat  2220

aattagcttc ttggggtatc tttaaatact gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc  2280

taaaatgaga atatcaccgg aattgaaaaa actgatcgaa aaataccgct gcgtaaaaga  2340

tacggaagga atgtctcctg ctaaggtata taagctggtg ggagaaaatg aaaacctata  2400

tttaaaaatg acggacagcc ggtataaagg gaccacctat gatgtggaac gggaaaagga  2460

catgatgcta tggctggaag gaaagctgcc tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca  2520

tgatggctgg agcaatctgc tcatgagtga ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta  2580

tgaagatgaa caaagccctg aaaagattat cgagctgtat gcggagtgca tcaggctctt  2640

tcactccatc gacatatcgg attgtcccta tacgaatagc ttagacagcc gcttagccga  2700

attggattac ttactgaata acgatctggc cgatgtggat tgcgaaaact gggaagaaga  2760

cactccattt aaagatccgc gcgagctgta tgatttttta aagacggaaa agcccgaaga  2820

ggaacttgtc ttttcccacg gcgacctggg agacagcaac atctttgtga aagatggcaa  2880

agtaagtggc tttattgatc ttgggagaag cggcagggcg gacaagtggt atgacattgc  2940

cttctgcgtc cggtcgatca gggaggatat cggggaagaa cagtatgtcg agctattttt  3000

tgacttactg gggatcaagc ctgattggga gaaaataaaa tattatattt tactggatga  3060

attgttttag tacctagatg tggcgcaacg atgccggcga caagcaggag cgcaccgact  3120

tcttccgcat caagtgtttt ggctctcagg ccgaggccca cggcaagtat ttgggcaagg  3180

ggtcgctggt attcgtgcag ggcaagattc ggaataccaa gtacgagaag gacggccaga  3240

cggtctacgg gaccgacttc attgccgata aggtggatta tctggacacc aaggcaccag  3300

gcgggtcaaa tcaggaataa gggcacattg ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag  3360

gagggtgaat gaatcggacg tttgaccgga aggcatacag gcaagaactg atcgacgcgg  3420

ggttttccgc cgaggatgcc gaaaccatcg caagccgcac cgtcatgcgt gcgccccgcg  3480

aaaccttcca gtccgtcggc tcgatggtcc agcaagctac ggccaagatc gagcgcgaca  3540

gcgtgcaact ggctccccct gccctgcccg cgccatcggc cgccgtggag cgttcgcgtc  3600

gtctcgaaca ggaggcggca ggtttggcga agtcgatgac catcgacacg cgaggaacta  3660

tgacgaccaa gaagcgaaaa accgccggcg aggacctggc aaaacaggtc agcgaggcca  3720

agcaggccgc gttgctgaaa cacacgaagc agcagatcaa ggaaatgcag ctttccttgt  3780

tcgatattgc gccgtggccg gacacgatgc gagcgatgcc aaacgacacg gcccgctctg  3840

ccctgttcac cacgcgcaac aagaaaatcc cgcgcgaggc gctgcaaaac aaggtcattt  3900

tccacgtcaa caaggacgtg aagatcacct acaccggcgt cgagctgcgg gccgacgatg  3960

acgaactggt gtggcagcag gtgttggagt acgcgaagcg cacccctatc ggcgagccga  4020

tcaccttcac gttctacgag ctttgccagg acctgggctg gtcgatcaat ggccggtatt  4080

acacgaaggc cgaggaatgc ctgtcgcgcc tacaggcgac ggcgatgggc ttcacgtccg  4140

accgcgttgg gcacctggaa tcggtgtcgc tgctgcaccg cttccgcgtc ctggaccgtg  4200

gcaagaaaac gtcccgttgc caggtcctga tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg  4260

gcgaccacta cacgaaattc atatgggaga agtaccgcaa gctgtcgccg acggcccgac  4320

ggatgttcga ctatttcagc tcgcaccggg agccgtaccc gctcaagctg gaaaccttcc  4380

gcctcatgtg cggatcggat tccacccgcg tgaagaagtg gcgcgagcag gtcggcgaag  4440

cctgcgaaga gttgcgaggc agcggcctgg tggaacacgc ctgggtcaat gatgacctgg  4500

tgcattgcaa acgctagggc cttgtggggt cagttccggc tgggggttca gcagccagcg  4560

ctttactggc atttcaggaa caagcgggca ctgctcgacg cacttgcttc gctcagtatc  4620

gctcgggacg cacggcgcgc tctacgaact gccgataaac agaggattaa aattgacaat  4680

tgtgattaag gctcagattc gacggcttgg agcggccgac gtgcaggatt tccgcgagat  4740

ccgattgtcg gccctgaaga aagctccaga gatgttcggg tccgtttacg agcacgagga  4800

gaaaaagccc atggaggcgt tcgctgaacg gttgcgagat gccgtggcat tcggcgccta  4860

catcgacggc gagatcattg ggctgtcggt cttcaaacag gaggacggcc ccaaggacgc  4920

tcacaaggcg catctgtccg gcgttttcgt ggagcccgaa cagcgaggcc gaggggtcgc  4980

cggtatgctg ctgcgggcgt tgccggcggg tttattgctc gtgatgatcg tccgacagat  5040

tccaacggga atctggtgga tgcgcatctt catcctcggc gcacttaata tttcgctatt  5100

ctggagcttg ttgtttattt cggtctaccg cctgccgggc ggggtcgcgg cgacggtagg  5160

cgctgtgcag ccgctgatgg tcgtgttcat ctctgccgct ctgctaggta gcccgatacg  5220

attgatggcg gtcctggggg ctatttgcgg aactgcgggc gtggcgctgt tggtgttgac  5280

accaaacgca gcgctagatc ctgtcggcgt cgcagcgggc ctggcggggg cggtttccat  5340

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cgcctggcaa ctggcggccg gaggacttct gctcgttcca gtagctttag tgtttgatcc  5460

gccaatcccg atgcctacag gaaccaatgt tctcggcctg gcgtggctcg gcctgatcgg  5520

agcgggttta acctacttcc tttggttccg ggggatctcg cgactcgaac ctacagttgt  5580

ttccttactg ggctttctca gccccagatc tggggtcgat cagccgggga tgcatcaggc  5640

cgacagtcgg aacttcgggt ccccgacctg taccattcgg tgagcaatgg ataggggagt  5700

tgatatcgtc aacgttcact tctaaagaaa tagcgccact cagcttcctc agcggcttta  5760

tccagcgatt tcctattatg tcggcatagt tctcaagatc gacagcctgt cacggttaag  5820

cgagaaatga ataagaaggc tgataattcg gatctctgcg agggagatga tatttgatca  5880

caggcagcaa cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt  5940

gtttcaaacc cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag  6000

tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat  6060

cgagtggtga ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga  6120

tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt  6180

taatgtactg gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc  6240

accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga  6300

aaatcctgtt tgatggtggt tccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaatagc  6360

ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg  6420

actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat  6480

cacccaaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag  6540

ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga  6600

agaaagcgaa aggagcgggc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg  6660

cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt  6720

tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcccg  6780

atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt  6840

gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa cccatctcat  6900

aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca acagaaatta  6960

tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt attgccaaat  7020

gtttgaacga tcggggaaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag tcccccgtgt  7080

tctctccaaa tgaaatgaac ttccttatat agaggaaggg tcttgcgaag gatagtggga  7140

ttgtgcgtca tcccttacgt cagtggagat atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt  7200

ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc  7260

actgtcggca gaggcatctt caacgatggc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta  7320

ggagccacct tccttttcca ctatcttcac aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa  7380

tccgaggagg tttccggata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaattgccc tttggtcttc  7400

tgagactgta tctttgatat ttttggagta gacaagtgtg tcgtgctcca ccatgttgac  7500

gaagattttc ttcttgtcat tgagtcgtaa gagactctgt atgaactgtt cgccagtctt  7560

tacggcgagt tctgttaggt cctctatttg aatctttgac tccatggcct ttgattcagt  7620

gggaactacc tttttagaga ctccaatctc tattacttgc cttggtttgt gaagcaagcc  7680

ttgaatcgtc catactggaa tagtacttct gatcttgaga aatatatctt tctctgtgtt  7740

cttgatgcag ttagtcctga atcttttgac tgcatcttta accttcttgg gaaggtattt  7800

gatttcctgg agattattgc tcgggtagat cgtcttgatg agacctgctg cgtaagcctc  7860

tctaaccatc tgtgggttag cattctttct gaaattgaaa aggctaatct ggggacctgc  7920

aggcatgcaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg  7980

ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa  8040

tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac  8100

ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt  8160

gggccaaaga caaaagggcg acattcaacc gattgaggga gggaaggtaa atattgacgg  8220

aaattattca ttaaaggtga attatcaccg tcaccgactt gagccatttg ggaattagag  8280

ccagcaaaat caccagtagc accattacca ttagcaaggc cggaaacgtc accaatgaaa  8340

ccatcgatag cagcaccgta atcagtagcg acagaatcaa gtttgccttt agcgtcagac  8400

tgtagcgcgt tttcatcggc attttcggtc atagccccct tattagcgtt tgccatcttt  8460

tcataatcaa aatcaccgga accagagcca ccaccggaac cgcctccctc agagccgcca  8520

ccctcagaac cgccaccctc agagccacca ccctcagagc cgccaccaga accaccacca  8580

gagccgccgc cagcattgac aggaggcccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga  8640

taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg  8700

cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat  8760

tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg  8820

attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tcggggatca tccgggtctg  8880

tggcgggaac tccacgaaaa tatccgaacg cagcaagata tcgcggtgca tctcggtctt  8940

gcctgggcag tcgccgccga cgccgttgat gtggacgccg ggcccgatca tattgtcgct  9000

caggatcgtg gcgttgtgct tgtcggccgt tgctgtcgta atgatatcgg caccttcgac  9060

cgcctgttcc gcagagatcc cgtgggcgaa gaactccagc atgagatccc cgcgctggag  9120

gatcatccag ccggcgtccc ggaaaacgat tccgaagccc aacctttcat agaaggcggc  9180

ggtggaatcg aaatctcgtg atggcaggtt gggcgtcgct tggtcggtca tttcgaaccc  9240

cagagtcccg ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg  9300

ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca  9360

gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca  9420

cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg  9480

ccatgggtca cgacgagatc atcgccgtcg ggcatgcgcg ccttgagcct ggcgaacagt  9540

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tcaccgacga gcaaggcaag accgagcgcc tttgcgacgc tca                   12883

Claims (3)

1.一种基因，其特征在于所述基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示，该基因分离自芦苇，应用于培育抗重金属Cd²⁺的翦股颖。

2.一种含有权利要求1所述基因的植物表达载体pROK2，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

3.权利要求1所述基因在培育抗重金属Cd²⁺的翦股颖中的应用。 

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