CN101509005B - 川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H及所述基因SmG10H的酵母表达载体和植物表达载体。本发明还公开了所述基因SmG10H在毕赤酵母和川西獐牙菜植株中催化香叶醇生成10-羟基香叶醇的应用。实验证明，本发明为在毕赤酵母和川西獐牙菜植株中提高目标产物10-羟基香叶醇含量提供了理论依据和实践基础，本发明所述转基因植株比非转基因植株的在积累獐牙菜苦苷的能力上得到了很大程度的提高。

Description

川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及川西獐牙菜药效成分相关基因——香叶醇-10羟化酶基因SmG10H及其应用。

背景技术

高寒藏药材川西獐牙菜(Swertia mussotii Franch)系龙胆科(Gentianaceae)、獐牙菜属(Swertia)，为青藏高原特有种，俗称“藏茵陈”。生长在青藏高原海拔3600-3800米的山坡、灌丛草地、林缘、河滩，以通天河畔两岸最为集中。其含有黄酮甙(flavonoidglycoside)、三萜香豆精微量生物碱、当药黄素、芒果甙、齐墩果酸、苦龙胆甙，还有八种山酮成份。作凉、糙、味苦，有清肝利胆、退诸热之功能。用于黄疽性肝炎、病毒性肝炎以及血病、胃病、退烧、缓泻、消化不良、急性骨髓炎、急性菌痢、结膜炎、咽喉炎及烫伤、胆囊炎、血虚头晕、高血压、月经不调等，并有滋补作用。其有效成分主要为齐墩果酸，獐牙菜苦甙(Swertiamarin)等，野生资源极其匮乏。

獐牙菜苦苷味苦、性寒，归肝、胆、肾经，具有抗氧化、抗菌消炎、抗癌、抗突变以及调节免疫系统，降血脂和胆固醇等一系列药理作用。獐牙菜苦苷为环烯醚萜类化合物，从GPP(活性焦磷酸香叶酯)合成开始，其代谢途径框架基本清楚，但其完整的生物合成步骤尚未探明。香叶醇-10羟化酶(geraniol 10-hydroxylase，G10H)属于P450单加氧酶，能够催化香叶醇C10位的羟基化，使香叶醇再次酶的作用下生成10-羟基香叶醇。此类酶能够催化环烯醚萜类化合物以及几类单萜生物碱类的合成，已经在不同生物物种中发现此酶，目前国内外焦点主要集中在长春花中的G10H上。在一些物种中环烯醚萜类化合物作为一种主要的中产物而积累，而在其他一些植物中则进一步代谢形成不同种类的单萜类生物碱，例如喹啉，四氢异喹啉类生物碱。由于生物碱类化合物在川西獐牙菜相关药效成分中并不占主流成分，因此我们认为此酶在此可能为合成环烯醚萜类化合物的关键酶。

P450单加氧酶基因为一个超基因家族，在植物的P450超家族中又分为127个亚家族，而亚家族成员间的氨基酸同源性一般情况下＞55％。但是，由于植物P450的底物多样性和其酶功能的多样性，使其亚家族成员间在酶活力和催化等功能上也不尽相同。本发明中的川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H，隶属于植物P450中的76亚家族，与本家族其他成员间的核苷酸同源性最大为75.87％。该基因SmG10H所表达的蛋白在C端有着与其他亚家族成员不同的信号肽，可能导致其在细胞中的定位不同于其他亚家族成员所编码的蛋白在细胞中的定位。另外，该基因SmG10H所表达蛋白的酶活力明显高于已报道的植物P450的76亚家族其他成员的酶活力。综上所述，本发明所报道的川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H非等同于其亚家族其他成员，具有一定的特异性。

发明内容

本发明的目的是提供一种獐牙菜苦苷相关基因——香叶醇-10羟化酶基因SmG10H及其应用。

本发明的技术方案是：从川西獐牙菜中分离得到香叶醇-10羟化酶基因SmG10H，体内实验证明其功能，然后在真核系统中验证功能，最后将该基因转到原植株川西獐牙菜中得到獐牙菜苦苷含量高的转基因植株。

本发明提供的基因名称为川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H，所述基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种含上述的川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H的酵母表达载体pPICZA，其特征在于：所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种含上述的川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H的植物表达载体pROK II，其特征在于：所述植物表达载体核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明所述香叶醇-10羟化酶基因SmG10H在酵母或植株中表达香叶醇-10羟化酶和提高獐牙菜苦苷含量的应用。其中：所述酵母是毕赤酵母；所述植株是川西獐牙菜。

首先在川西獐牙菜植株中克隆到了香叶醇-10羟化酶基因SmG10H；然后通过转化的方法在大肠杆菌中得到大量克隆，接着通过双酶切把此基因SmG10H连接到酵母表达载体pPICZA上，并在酵母上表达；接着筛选转基因酵母，并提取川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H在酵母中表达的SmG10H蛋白提取液，加入底物香叶醇，使其催化成10-羟基香叶醇，通过LC/MS的方法检测此催化反应的生成物，从而验证异源表达的SmG10H的功能。

其次将川西獐牙菜植株中克隆到了香叶醇-10羟化酶基因SmG10H通过转化的方法在大肠杆菌中得到大量克隆，接着通过双酶切把此基因SmG10H连接到植物表达载体PROKII；将此携带基因SmG10H的植物表达载体PROK II转化进原植株川西獐牙菜中，通过该基因的过表达使獐牙菜苦苷含量得到大的提高，而獐牙菜苦苷的含量是通过HPLC方法测定。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H并在毕赤酵母中进行表达，使转基因酵母获得了非转基因酵母所不具备的催化香叶醇为10-羟基香叶醇的能力。通过基因枪转化的方法将该基因转入原植株川西獐牙菜中，经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株的獐牙菜苦苷含量可提高1倍以上。本发明为环烯醚萜类化合物獐牙菜苦苷的代谢途径中10-羟基香叶醇的积累起到了关键性的作用，为提高川西獐牙菜植株中药效成分獐牙菜苦苷的积累起到了关键性的作用。

附图说明

图1为川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H的cDNA电泳图，其中：泳道1为基因的cDNA，M为Marker。

图2为转基因川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H的DNA鉴定图，其中：泳道M为Marker，泳道1、5、8、10、11、12均为川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H阳性DNA。

图3为川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H在转基因毕赤酵母和川西獐牙菜植株中表达，通过LC/MS进行的功能验证。10-羟基香叶醇保留时间为8.3分钟，分子量为171.4；香叶醇保留时间为11.6分钟，分子量为153.2；A，为标准品，购自Sigma公司；B，川西獐牙菜的SmG10H提取蛋白液在加入香叶醇后的反应液；C，为转基因毕赤酵母的SmG10H提取蛋白液，在加入香叶醇后的反应液；D，为A，B和C中保留时间为8.3分钟时的保留峰的质谱图，即10-羟基香叶醇的质谱图。

图4转基因的川西獐牙菜愈伤组织再生植株。

图5为转基因的川西獐牙菜植株和原生植株中獐牙菜苦苷含量变化的HPLC分析图。其中獐牙菜苦苷保留时间为15.1分钟，分子量为374.34。A，为獐牙菜苦苷标准品；B，为原生植株中的獐牙菜苦苷；C，为转基因的川西獐牙菜植株的獐牙菜苦苷。

具体实施方式

实施例1、SmG10H的克隆

1.1川西獐牙菜总RNA的提取

(1)川西獐牙菜材料放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成均匀的粉末。注意研磨过程中要保证材料浸在液氮中。

(2)待液氮挥发后将材料迅速转入预冷的离心管中，每50-100mg组织材料加入1ml TRIZOL溶液，混匀后，于室温放置5min，12000r/min，2-8℃离心10min去沉淀。

(3)每1ml TRIZOL溶液中加入0.2ml氯仿，振荡15sec充分混匀，于室温放置5min，12000r/min，2-8℃离心15min。

(4)取上清，每1ml TRIZOL加入0.5ml的异丙醇，混匀，室温放置10～20min。

(5)2-8℃12000r/min离心10min，弃上清。

(6)加1ml 75％乙醇洗涤沉淀2次，4℃不超过7500r/min离心5min，弃上清。

(7)室温放置晾干后，加入15μl DEPC处理的双蒸水溶解RNA。

1.2逆转录合成第一链cDNA

(1)0.2ml Eppendorf管中，加入下列成分：

用DNaseI纯化的上述总RNA(0.1μg/μl)    2.0μl

Olige(dT)anchored primer(2μM)    2.0μl

(2)0℃水浴变性10分钟，立即置于冰浴中。

(3)在10μl反应体系中加入下列成分：2.0μl 5×MMLV RT buffer；1.0μl 250μmol/L dNTP mix；0.25μl Rnasin；0.5μl(200u/μl)MMLV逆转录酶；2μl上述RNA变性液。42℃进行逆转录反应1hr。反转录第一链cDNA用于后面的反应。

1.3PCR

以上述逆转录合成第一链cDNA为模板，PCR法扩增基因片段。

(1)PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成

引物P0：5′-AAACTTCCWCCAGGDCCAT-3′

引物P1：5′-CAGCACCAAATGGAATCAGC-3′

W＝A/T    D＝T/A/G

(2)PCR反应体系

10×PCR buffer    2μl

MgCl₂(25mmol/L)          1.5μl

dNTP(each 250μmol/L)    0.2μl

P0(10μmol/L)            1μl

P1(10μmol/L)            1μl

逆转录第一链产物         4μl

Ex Taq                   0.2μl

无菌水                   10.1μl

(3)PCR反应程序

94℃3min；94℃30sec，51℃30sec，72℃1.5min，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物电泳如图1所示。

1.45′-RACE

按照TaKaRa 5′-Full RACE Core Set说明书所示步骤操作。电泳5′-RACE产物。

1.5目的片段的回收

(1)用刀片切下上述电泳结果中含目的条带的胶条置于1.5mlEppendorf管中。

(2)称重，加入3-4倍体积的DR-I Buffer，65℃加热10min融化胶块，每隔2min混匀一次保证胶块能充分融化。

(3)加入DR-I Buffer量的1/2体积的DR-IIBuffer，均匀混合。

(4)将Spin Cloumn安置于Collection Tube上，将上述溶液转移至Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。

(5)将500μl Rinse A加入Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。

(6)将700μl Rinse B加入Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。

(7)重复步骤6，然后12000rpm再离心1min。

(8)将Spin Cloumn安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Cloumn膜的中央处加入预热到60℃的25μl的水或洗脱缓冲液，室温静置1min。

(9)12000rpm离心1min洗脱DNA。

(10)重复步骤9，2次，将所有洗脱液集中收集于一管内，混匀，取少量电泳检查回收效率，其余加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1hr。

(11)然后4℃，12000rpm离心15min，用70％冷乙醇洗涤沉淀，弃尽液体，用40μl无菌水溶解沉淀。回收的片段用于后面的连接反应。

1.6连接

用上述的回收目的片段与pMD18-T载体(购自TAKARA有限公司，下同)按摩尔比约1∶1的比例进行连接，连接体系如下：

目的片段                    7μl

T-vector                    1μl

10×T4DNA Ligase Buffer     1μl

T4DNA Ligase                1μl

混匀并短暂离心，16℃连接过夜。得到重组质粒pGEM-GCS，用于后面的反应。

1.7CaCl₂法制备感受态细胞

(1)挑取DH10B单菌落接种于5ml LB(购自TAKARA有限公司，下同)液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

(2)按1∶100-1∶50的比例，取1ml菌液接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.3-0.6。

(3)将菌液冰浴10min，4℃4000rpm离心10min，收集菌体。

(4)沉淀加10ml预冷的0.1M CaCl₂悬浮后，冰浴30min。

(5)4℃4000rpm离心10min。沉淀重悬浮于1ml预冷的0.1M CaCl₂，混匀并冰水浴中保存，备用或加入15％的甘油置于-70℃中保存。

1.8热击法转化E.coli DH10B

(1)在无菌条件下吸取100μl感受态细胞，加入1.5ml预冷的无菌Eppendorf管中，加入10μl连接产物(1.6中的重组质粒)，轻轻混匀，立即置于冰上30min。

(2)在42℃恒温水浴中热激90sec(准确记时)。

(3)冰浴3-5min。

(4)加入800μl不含抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃振荡培养45-60min。

(5)短暂离心收集菌体，用150μl LB液体培养基重悬菌体，转至含抗生素Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上，用无菌涂布棒涂布。

(6)将平板于37℃正向放置15-30min至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养12-16hr，观察平板会有蓝白斑。白斑用于后面的质粒提取。

1.9碱裂解法提取大肠杆菌质粒

(1)挑取白色单菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3ml LB液体培养基中，同时也要保存所挑取的白色单菌落于含抗生素Amp(50mg/L)的固体LB平板中，37℃震荡培养12-16h；

(2)12000rpm离心30sec，收集培养物中的菌体，尽量弃尽上清；

(3)加入100μl冰预冷的溶液I，在涡旋器上使菌体充分重悬；

(4)加入200μl溶液II，立即将离心管缓缓颠倒数次，冰浴5-10min；

(5)加入150μ.l冰预冷的溶液III，缓缓颠倒离心管数次直至白色沉淀充分形成，冰浴5-10min；

(6)12000rpm离心3min，取上清转入另一微量离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后，室温静置3min；12000rpm离心3min，使质粒DNA沉淀；

(7)弃尽上清，取200μl TE溶液溶解沉淀；

(8)加入等体积冰预冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的RNA；

(9)12000rpm，离心3min；

(10)转移上清到另一离心管中，加入2倍体积的95％乙醇，混匀后于室温静置3min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；

(11)弃上清后用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，弃尽液体；

(12)室温干燥后，取20μl含RNaseA(20μg/ml)的TE溶液溶解沉淀，37℃水浴30～60min消化RNA。

(13)为减少损失，可先用TE将总体积补充至200μl，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，充分振荡5-10min，12000rpm离心5min；

(14)取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇，重复以上操作；

(15)取上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃放置15min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；

(16)弃上清用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，弃液体，用40μl TE或无菌水溶解沉淀。质粒用于后面的反应。

1.10质粒酶切验证

用EcoRI酶切上述质粒，酶切反应体系如下表所示：

重组质粒pMD18-t-SmG10H    16μl

EcoRI限制性内切酶         2μl

10×Buffer                2μl

将上述反应体系混匀并5000rpm离心1min，37℃水浴反应过夜，然后进行1％的TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

1.11DNA测序

挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海博亚生物技术有限公司测序，得到测序结果：基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

经过NCBIblast分析，上述cDNA序列与长春花的G10H的核苷酸同源75.87％。，证明实验得到的就是川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因，命名为川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H。

实施例2、在酵母中表达的川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H的功能验证

2.1酵母表达载体的构建

2.1.1目的基因的获得

(1)引物设计：设计一对PCR扩增带EcoRI和KpnI酶切位点都SmG10H基因。

P2：5’-GAATTCATGGATTTTGATTTCCTCACC-3’

          EcoRI

P3：5’GGTACCTCACAGAGGAGTCGCAACA-3′

          KpnI

(2)PCR反应体系：

10×PCR buffer            2μl

MgCl₂(25mmol/L)           1.5μl

dNTP(each 250μmol/L)     0.2μl

P2(4μmol/L)                1μl

P3(4μmol/L)              1μl

重组质粒pMD18-T-SmG10H    1μl

Ex Taq(TaKaRa)            0.2μl

无菌水                    13.1μl

(3)PCR反应条件为

94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物电泳回收后用于后面的反应。

2.1.2表达载体的构建步骤

引入酵母表达载体pPICZA(购自Invitrogen有限公司，下同)，该载体上含有中所含有EcoR和KpnI两个酶切位点。

将带有EcoR和KpnI酶切位点的cDNA与质粒分别进行EcoR和KpnI的双酶切，再按照5∶1的比例在T4连接酶的催化下进行连接16小时以上。反应体系及条件如下：

(1)cDNA酶切反应体系和条件：

cDNA/EcoR+KpnI      6μl

EcoR                1μl

KpnI                1μl

10×M Buffer        2μl

37℃16h；

(2)质粒酶切反应体系和条件：

pPICZA质粒        6μl

EcoR              1μl

KpnI              1μl

10×M Buffer      2μl

37℃16h；

连接反应用T4DNA Ligase进行，体系和条件同T载体的连接体系和条件。用连接产物转化大肠杆菌，从Zeocin抗性的菌落中筛选出重组子，得到酵母表达载体pPICZA-SmG10H。提取阳性克隆pPICZA-SmG10H的质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，反应体系和条件同鉴定重组子。

2.2DNA导入酵母

(1)挑取酵母菌株(毕赤酵母)的单克隆，接种至10ml液体YPD(购自Invitrogen有限公司，下同)培养基，30℃，200rpm，培养2-3天；

(2)按照1∶50的比例将菌液转移至50ml YPD液体培养基中30℃，200rpm，培养3～5h，此时的菌液OD 0.4～0.6。

(3)将菌液分装至10ml无菌离心管中，每管5ml；

(4)3000rpm离心5min，收集细胞。用2.5ml无菌ddH2O重悬菌体；

(5)3000rpm离心5min，收集细胞。用0.1ml 100mM(1×)LiAc/TE buffer重悬菌体；

(6)3000rpm离心1～2min沉淀细胞(仅需将菌体离心至离心管底即可)，用微量移液器小心吸走上清；

(7)用50μl 100mM(1×)LiAc/TE buffer重悬菌体，将菌悬液移至灭菌的1.5mlEppendorf管中；

(8)将1ml单链担体DNA煮沸5min，快速在冰水中冷却；(注：无需每次使用时都煮沸担体DNA，可分装成小份冻存；冻融3～4次后应再煮沸，取出后应保持在冰上)

(9)将步骤7准备的样品，3000rpm离心1～2min沉淀细胞，用微量取样器小心吸走上清；

(10)按下列顺序加入：240μl PEG(50％w/v)(加入后用枪头上下吹打，尽量将菌体悬浮)；36μl 1M(10×)LiAc；25μl单链担体DNA(2.0mg/ml)50μl水和质粒DNA(0.1～10μg)(一般情况下，质粒加入10～40μl即可)；

(11)涡旋振荡Eppendorf管1min，直到细胞完全混匀，30℃水浴30min；

(12)42℃水浴中热激20～25min；

(13)5000rpm离心1～2min，用微量移液器除去转化混合液；

(14)吸取0.2～1.0ml无菌水加到每个反应管中，用移液器轻轻抽提以悬浮沉淀；

(15)取50μl转化液，均匀涂布在含卡那霉素抗性的培养基上，30℃培养2～4d。用未转化的酵母做对照。

2.3酵母重组子的鉴定

2.3.1菌落PCR鉴定初筛

(1)平板上的菌落长到肉眼可见时。

(2)将除了模板以外的其他PCR反应液组分准备好，并分装。

(3)用一根灭菌牙签挑取菌落，在PCR管中测一下，放入一个灭菌的1.5ml离心管，对PCR管和1.5ml离心管编号。

(4)PCR扩增，0.8％琼脂糖凝胶电泳。对PCR扩增显现特异性条带的克隆，置于1.5ml离心管中的半截牙签扔到5mlYPD培养基中，30℃培养，24±1小时提取DNA，用DNA作为模板再进行PCR进一步确定。

PCR反应体系及条件如下：

10×PCR buffer            2μl

MgCl₂(25mmol/L)           1.5μl

dNTP(each 250μmol/L)     0.2μl

P2(4μmol/L)              1μl

P3(4μmol/L)              1μl

菌液                      1μl

rTaq(TaKaRa)              0.2μl

无菌水                   13.1μl

PCR反应条件为：

94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1.min，35个循环；最后72℃延伸10min。

2.3.2酵母总DNA为模板进行二次鉴定

酵母基因组的提取

(1)接种重组和空质粒转化子于5ml MD(购自Invitrogen有限公司，下同)培养基，接菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16-18小时。

(2)室温下，1500g离心5-10min收集菌体。

(3)100uL TE(pH7.0)重悬后1500g离心5-10min收集菌体。

(4)用2ml的SCED(PH7.5)重悬。

(5)加入1～3mg蜗牛酶，37℃，50min。

(6)加入2ml 1％SDS，轻摇混匀，然后置于冰上5min。

(7)加入1.5ml 5M醋酸钾，轻轻混匀。

(8)10000g离心5-10min，弃上清。

(9)加入2倍体积无水乙醇，室温放置15min。

(10)10000g离心20min，弃上清。

(11)加入0.7mlTE缓冲液。

(12)加入等体积的苯酚∶氯仿(1∶1V/V).

(13)加入1/2体积的7.5M醋酸铵溶液。

(14)加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置1hr。

(15)10000g离心20min。

(16)加入1ml 75％乙醇漂洗沉淀一次。

(17)干燥后，加入50ul的TE或H₂O溶解，-20℃备用。

PCR反应体系的组成和反应条件同菌落PCR，PCR产物0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物电泳如图2所示。

2.4转基因酵母中SmG10H基因表达及生成SmG10H蛋白的功能验证

2.4.1转基因酵母的培养

(1)挑取阳性酵母单克隆菌落，置于含有25mlMGYH(购自Invitrogen有限公司，下同)的250ml三角瓶中，于28℃转速为250rpm的培养箱中培养，直到菌体浓度达到OD₆₀₀＝2。

(2)收集细胞培养液，在室温下于1500×g离心5分钟。弃上清液并重悬菌体于MMH(购自Invitrogen有限公司，下同)培养基中，调整菌体浓度到OD₆₀₀＝1。

(3)把重悬的菌体放置于1L的三角瓶中，瓶口用两成无菌纱布覆盖，重新置于培养箱中培养48小时。

(4)平均每24小时加入100％的甲醇溶液至终浓度为0.5％

2.4.2转基因酵母中SmG10H的蛋白提取

(1)取上述酵母细胞培养液10ml，在室温下10000×g离心1分钟，去除上清液。

(2)收集沉淀，并置于研钵中，加入液氮研磨10分钟。

(3)研磨后的细胞破碎物迅速加入0℃预冷的抽提液[50mM磷酸氢二钾缓冲液(pH 7.6)含有0.5M蔗糖，1mM EDTA，1mM DTT and 10μM亮肽酶素；2mL/g鲜重]，冰浴5分钟。

(4)上述细胞混合液通过48mm孔径的尼龙膜过滤后，在4℃200×g离心20分钟。

(5)去除上清液，收集沉淀，在4℃20000×g离心60分钟。

(6)去除上清液，收集沉淀，并重悬于等体积的储存液中[50mM磷酸氢二钾缓冲液(pH 7.6)，含有30％(v/v)丙三醇，1mM EDTA，1mM DTT and 10μM亮肽酶素]。

(7)冻存于-80℃，直到需要时取出。

2.4.3转基因酵母中SmG10H反应体系的配制

(1)取上述冻存液于冰浴融化，在4℃20000×g离心10分钟。

(2)去除上清液，收集沉淀，于100μg/550μl的比例重悬于孵育液中[50mM磷酸氢二钾缓冲液(pH 7.6)，含有1mMEDTA，1mM DTT，10μM FAD和10μM FMN]。

(3)在孵育液中加入1U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，4.5mM6-磷酸葡萄糖，1mM NADP+。

(4)取550μl的孵育液作为反应液，之后在30℃的条件下静置5分钟。

(5)在反应液中加入1mM的香叶醇作为底物反应物，在30℃的条件下反应30分钟。

(6)加入3ml的乙酸乙酯终止反应，震荡反应体系2分钟，混匀，静置5分钟。

(7)在真空浓缩仪中室温下干燥掉乙酸乙酯层，残余液中加入150μl甲醇，制备为液相质谱前液。

2.4.4LC/MS验证转基因酵母中SmG10H的功能

(1)上述反应液，室温下10000×g离心10分钟，取上清于一干净的新离心管中。

(2)上清液通过48mm孔径的尼龙膜过滤，-20℃冻存。

(3)冻存液室温下融化，上样量为4μl进行LC/MS分析。

(4)色谱条件为：流动相甲醇∶水＝60∶40，流速1ml/min，检测波长为210nm。LC/MS仪器为美国ABI公司提供的API4000型，色谱柱由Agela Technologies公司提供的Venusil柱，柱参数为：C 18；5μm；46mm×250mm。

LC/MS分析如图3所示，证明川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H能够在酵母中表达并生成有酶活力的蛋白SmG10H，此蛋白酶能够催化香叶醇加羟基生成10-羟基香叶醇。10-羟基香叶醇保留时间为8.3分钟，分子量为171.4；香叶醇保留时间为11.6分钟，分子量为153.2；A，为标准品，购自Sigma公司；C，为转基因毕赤酵母的SmG10H提取蛋白液，在加入香叶醇后的反应液；D，为A和C中保留时间为8.3分钟时的保留峰的质谱图，即10-羟基香叶醇的质谱图。

实施例3、川西獐牙菜植株中香叶醇-10羟化酶基因SmG10H的功能验证

3.1川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H的功能验证

3.1.1川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶SmG10H的蛋白提取

(1)取川西獐牙菜植株，置于研钵中，加入液氮研磨10分钟。

(2)研磨后的细胞破碎物迅速加入0℃预冷的抽提液[50mM磷酸氢二钾缓冲液(pH 7.6)含有0.5M蔗糖，1mM EDTA，1mM DTT and 10μM亮肽酶素；2mL/g鲜重]，冰浴5分钟。

(3)上述细胞混合液通过48mm孔径的尼龙膜过滤后，在4℃200×g离心20分钟。

(4)去除上清液，收集沉淀，在4℃20000×g离心60分钟。

(5)去除上清液，收集沉淀，并重悬于等体积的储存液中[50mM磷酸氢二钾缓冲液(pH 7.6)，含有30％(v/v)丙三醇，1mM EDTA，1mM DTT and 10μM亮肽酶素]。

(6)冻存于-80℃，直到需要时取出。

3.1.2川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶SmG10H反应体系的配制

(1)取上述冻存液于冰浴融化，在4℃20000×g离心10分钟。

(2)去除上清液，收集沉淀，于100μg/550μl的比例重悬于孵育液中[50mM磷酸氢二钾缓冲液(pH 7.6)，含有1mMEDTA，1mM DTT，10μM FAD和10μM FMN]。

(3)在孵育液中加入1U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，4.5mM6-磷酸葡萄糖，1mM NADP+。

(4)取550μl的孵育液作为反应液，之后在30℃的条件下静置5分钟。

(5)在反应液中加入1mM的香叶醇作为底物反应物，在30℃的条件下反应30分钟。

(6)加入3ml的乙酸乙酯终止反应，震荡反应体系2分钟，混匀，静置5分钟。

(7)在真空浓缩仪中室温下干燥掉乙酸乙酯层，残余液中加入150μl甲醇，制备为液相质谱前液。

3.1.3LC/MS验证川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶SmG10H的功能

(1)上述反应液，室温下10000×g离心10分钟，取上清于一干净的新离心管中。

(2)上清液通过48mm孔径的尼龙膜过滤，-20℃冻存。

(3)冻存液室温下融化，上样量为4μl进行LC/MS分析。

(4)色谱条件为：流动相甲醇∶水＝60∶40，流速1ml/min，检测波长为210nm。LC/MS仪器为美国ABI公司提供的API4000型，色谱柱由Agela Technologies公司提供的Venusil柱，柱参数为：C 18；5μm；46mm×250mm。

LC/MS分析如图3所示，证明川西獐牙菜植株中香叶醇-10羟化酶基因SmG10H能够表达并生成有酶活力的蛋白SmG10H，此蛋白酶能够催化香叶醇加羟基生成10-羟基香叶醇。10-羟基香叶醇保留时间为8.3分钟，分子量为171.4；香叶醇保留时间为11.6分钟，分子量为153.2；A，为标准品，购自Sigma公司；B，川西獐牙菜的SmG10H提取蛋白液在加入香叶醇后的反应液；D，为A和B中保留时间为8.3分钟时的保留峰的质谱图，即10-羟基香叶醇的质谱图。

实施例4、植物表达载体的构建

4.1目的基因的获得

引物设计及PCR反应的体系和条件：

(1)设计如下一对PCR扩增引物，引入植物表达载体pROK II(购自宝生物工程有限公司)中所含有的两个酶切位点SacI和XbalI。

P4：5’-CGAGCTATGGATTTTGATTTCCTCA-3’

       SacI

P5：5’-TCTAGATCACAGAGGAGTCGCAACA-3’

       XbalI

(2)PCR反应体系：

10×PCR buffer           2μl

MgCl₂(25mmol/L)          1.5μl

dNTP(each 250μmol/L)    0.2μl

P4(4μmol/L)             1μl

P5(4μmol/L)             1μl

重组质粒pMD18T-AS1       1μl

rTaq(TaKaRa)             0.2μl

无菌水                   13.1μl

(3)PCR反应条件为

94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1.5min，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物电泳回收后用于后面的反应。

4.2表达载体的构建

将带有SacI，XbalI酶切位点的cDNA与质粒分别进行SacI和XbalI的双酶切，再按照5∶1的比例在T4连接酶的催化下进行过夜连接。反应体系及条件如下：

(1)酶切反应体系和条件：

cDNA/SacI+XbalI    6μl

SacI               1μl

10XBuffer          2μl

ddH₂O              1μl

上表体系30℃1h，下表体系37℃1h

原反应液            10μl

XbalI               1μl

0.1％BSA            2μl

0.1％TritonX-100    2μl

10X Buffer          2μl

ddH₂O               3μl

(2)质粒酶切反应体系和条件：

pROK II质粒        6μl

SacI               1μl

10X k Buffer       2μl

ddH₂O              1μl

上表体系30℃1h，下表体系37℃1h

原反应液           10μl

XbalI              1μl

0.1％BSA           2μl

0.1％TritonX-100   2μl

10X H Buffer       2μl

ddH₂O              3μl

连接反应用T4DNA Ligase进行，体系和条件同pMD18-T的连接体系和条件。用连接产物转化大肠杆菌，从卡那霉素抗性的菌落中筛选出重组子，提取阳性克隆pROK-SmG10H的质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，反应体系和条件同鉴定重组子。

4.3测序

将含有重组质粒的阳性菌株送上海博亚生物技术有限公司测序，得到的测序结果经过NCBIblast分析，阳性质粒中确实含有川西獐牙菜植株中香叶醇-10羟化酶基因SmG10H的cDNA序列。至此得到了重组表达载体，即含基因SnG10H的植物表达载体pROK-SmG10H。

实施例5、基因枪转化川西獐牙菜植株中香叶醇-10羟化酶基因SmG10H

5.1基因枪转化方法

转化使用继代两周的川西獐牙菜胚性愈伤组织。在微弹轰击之前转至含有渗透剂的MS继代培养基上于黑暗、26℃保温4h进行高渗处理。渗透剂为甘露醇，浓度采用0.4mol/L。将2mg金粒(直径1μm)、质粒DNA各2.5μl(1μg/μl)、25μl亚精胺(0.1mol/L)和50μl CaCl2(215mol/L)混合，涡旋或超声波处理多次使之均匀，10000r/min离心5s后去上清，沉淀用250μl乙醇洗涤并重新悬浮于240μl乙醇溶液。将包被有DNA的金粒悬浮液涂于微弹承载片，每片涂3.5μl，放置几分钟干燥后用于基因枪轰击；每次涂液前将悬浮液旋涡处理使之均匀。每次轰击的微弹量约2912μg。基因枪型号为PDS1000PHe(BioRad)，气压采用1100psi。

5.2培养选择和再生体系

轰击后16h将胚性愈伤组织块从高渗培养基移至含600mg/mlKan的IB继代培养基上进行筛选，将褐色和黑色愈伤去掉，最终获得绿色再生植株。

5.3CTAB法提取转基因植株基因组DNA

(1)称取0.5g的再生植株叶片，剪碎后用液氮研磨，迅速将粉末转移至1.5ml离心管中，然后加入700μl预热至65℃的2xCTAB提取缓冲液及0.1％的疏基乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，然后置于65℃水浴保温2h，不时颠倒混匀。

(2)混合物冷却至室温后加入等体积的酚∶氛仿∶异戊醇(25∶24∶1)，4℃下10000g离心10min。

(3)将水相转移至一干净离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，4℃下10000g离心10min。

(4)将水相转移至一干净离心管中，加入两倍体积无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA。

(5)4℃下10000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入100闪含无DNA酶的RNA酶的TE液溶解，37℃水浴30min

(6)加入200μl无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA.4℃下10000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入40μl无菌水溶解DNA，4℃保存待用。

5.4PCR检测转基因植株

以CTAB法提取的DNA为模板，PCR法扩增以35S启动子片段。

35S片段启动子引物序列：

35SS：5’-GCAGAGGCATCTTCAACG-3’

35SA：5’-GACGATCTACCCGAGCAA-3’

(1)PCR反应体系

10×PCR buffer         2μl

MgCl₂(25mmol/L)        1.5μl

dNTP(each 250μmol/L)  0.2μl

35SS(4μmol/L)         1μl

35SA(4μmol/L)         1μl

DNA模板                1μl

rTaq(TaKaRa)           0.2μl

无菌水                 13.1μl

(2)PCR反应程序

94℃5min；94℃30sec，53℃30sec，72℃2min，35个循环；最后72℃延伸7min。

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例6、转化后阳性再生植株獐牙菜苦苷测定

(1)转化后筛选得到的阳性植株经液氮研磨后加入10ml氯仿，超声40min

(2)上述反应液，室温下10000×g离心10分钟，取上清于一干净的新离心管中。

(3)上清液通过48mm孔径的尼龙膜过滤，-20℃冻存。

(4)冻存液室温下融化，上样量为20μl进行LC/MS分析。

(5)色谱条件为：流动相甲醇∶水＝70∶30，流速0.8ml/min，检测波长为254nm。LC/MS仪器为美国ABI公司提供的API4000型，色谱柱由Agela Technologies公司提供的Venusil柱，柱参数为：C 18；5μm；46mm×250mm。

HPLC分析如图5所示，证明转基因的川西獐牙菜植株比非转基因植株的獐牙菜苦苷含量可提高1倍以上。图5为转基因的川西獐牙菜植株和原生植株中獐牙菜苦苷含量变化的HPLC分析图。其中獐牙菜苦苷保留时间为15.1分钟，分子量为374.34。A，为獐牙菜苦苷标准品；B，为原生植株中的獐牙菜苦苷；C，为转基因的川西獐牙菜植株的獐牙菜苦苷。

序列表

<110>山东大学

<120>川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H及其应用

<141>2009-3-17

<160>3

<210>1

<211>1488

<212>cDNA

<213>川西獐牙菜(Swertia mussotii Franch)

<221>川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H核苷酸序列

<222>(1)…(1488)

<400>1

atggattttg atttcctcac cattgctatt ggattcctt ttcaccataac tttgtatcaa  60

gctctaaact ttttttcaag aaaaagcaaa aacctacctc ctggtccatc tcctctgcca  120

ctcattggca atcttcactt actaggtgac caaccacata aatctttagc aaaacttgcc  180

aaaaaacatg gtccaattat gggtttacag cttggacaag tgacaacaat tgttgttaca  240

tcttctggta tggctaaaga agtccttcaa aaacaagatt tagccttttc gagtcgatcg  300

attcctaatg ctattcatgc ccatgatcag tacaaatact ctgttatttg gctcccggtt  360

gcatctcgat ggagaggtct ccgtaaagct ttgaactcga atatgttctc cggtaaccgg  420

cttgatgcta atcagcattt gagaagtcga aaagtgcaag aacttattgc atattgtagg  480

aaaagtagtc aaacagggga tgcaattgat gtggggcgag ctgcatttag gacatcattg  540

aatttgttgt ccaacacgat gttttcgaaa gatttaaccg acccctattc ggattctgct  600

aaagagttta aggatttggt ctggaatgtg atggtggagg ctggtaagcc taatttggtg  660

gattatttcc cacttcttga taaagttgat cctcaaggaa ttaggaaacg tatgactata  720

cactttggga agatacttga gctttttggt ggtcttattg atgaaagatt gcagcagaag  780

aaagccaaag gtgttaatga tgatgttctt gatgttctcc tcactactag tgaagaaagt  840

cctgaagaaa tcgacaggac tcatatccaa cgcatgtgtt tggacttgtt tgtggctggg  900

acggatacaa catcaagcac actggagtgg gcgatgtcag agatgcttaa aaacccagag  960

aaaatgaagg cagctcaagc cgagttagca caagtcatcg gaaaaggaaa ggcggtagaa  1020

gaagcggacc ttgcccgcct gccttactta cgttgtgcaa tcaaagaaac tctaaggata  1080

catccaccag tcccactctt gattcctagg cgaaccgagc aagaagttga agtatgtggt  1140

tacacagtac caaagaactc acaagttctt gtcaatgtat gggcaattag tcgagatgat  1200

gcaatctgga aagacccttt atcgtttaag cccgagaggt tcttagaatc agaacttgaa  1260

atgcgtggca aagatttcga gctgatccca tttggtgctg gtaggagaat ttgccctggg  1320

ttgccattgg cagttaggat ggtgcctgtt atgttaggtt cactgctgaa ctcatttgat  1380

tggaaactag aaggtgggat tgcaccaaaa gatttggata tggaagagaa gtttggcatc  1440

acattgcaga aggctcatcc tttgcgtgct gttgcgactc ctctgtg                1488

<210>2

<211>4509

<212>DNA

<213>人工序列

<221>酵母表达载体pPICZA核苷酸序列

<222>(1)…(4509)

<400>2

gcgaggttca tgtttgttta tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca    60

ctccagatga gggctttctg agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca    120

aaactgacag tttaaacgct gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa    180

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aaagtcggca taccgtttgt cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc    300

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caaatgggga aacacccgct ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc    420

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gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag cgcggtccag    3240

gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct ggacgagctg  3300

tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg gccggccatg  3360

accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc ggccggcaac  3420

tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac tgacacgtcc gacggcggcc cacgggtccc  3480

aggcctcgga gatccgtccc ccttttcctt tgtcgatatc atgtaattag ttatgtcacg  3540

cttacattca cgccctcccc ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc  3600

tgaagtctag gtccctattt atttttttat agttatgtta gtattaagaa cgttatttat  3660

atttcaaatt tttctttttt ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa  3720

aaccttgctt gagaaggttt tgggacgctc gaaggcttta atttgcaagc tggagaccaa  3780

catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt  3840

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg  3900

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg  3960

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag  4020

cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc  4080

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa  4140

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg  4200

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc  4260

taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac  4320

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg  4380

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt  4440

gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt  4500

catgagatc                                                          4509

<210>3

<211>12883

<212>DNA

<213>人工序列

<221>植物表达载体pROK II核苷酸序列

<222>(1)…(12883)

<400>3

ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag  60

aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg  120

aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac  180

ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc    240

cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga    300

caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat    360

gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat    420

tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt    480

ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg    540

tttttaacca gggctgcgcc ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc    600

cttctcgaac cctcccggcc cgctaacgcg ggcctcccat ccccccaggg gctgcgcccc    660

tcggccgcga acggcctcac cccaaaaatg gcagcgctgg cagtccttgc cattgccggg    720

atcggggcag taacgggatg ggcgatcagc ccgagcgcga cgcccggaag cattgacgtg    780

ccgcaggtgc tggcatcgac attcagcgac caggtgccgg gcagtgaggg cggcggcctg    840

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gcaattttta ccttgggcat tcttggcata gtggtcgcgg gtgccgtgct cgtgttcggg    960

ggtgcgataa acccagcgaa ccatttgagg tgataggtaa gattataccg aggtatgaaa    1020

acgagaattg gacctttaca gaattactct atgaagcgcc atatttaaaa agctaccaag    1080

acgaagagga tgaagaggat gaggaggcag attgccttga atatattgac aatactgata    1140

agataatata tcttttatat agaagatatc gccgtatgta aggatttcag ggggcaaggc    1200

ataggcagcg cgcttatcaa tatatctata gaatgggcaa agcataaaaa cttgcatgga    1260

ctaatgcttg aaacccagga caataacctt atagcttgta aattctatca taattgggta    1320

atgactccaa cttattgata gtgttttatg ttcagataat gcccgatgac tttgtcatgc    1380

agctccaccg attttgagaa cgacagcgac ttccgtccca gccgtgccag gtgctgcctc    1440

agattcaggt tatgccgctc aattcgctgc gtatatcgct tgctgattac gtgcagcttt    1500

cccttcaggc gggattcata cagcggccag ccatccgtca tccatatcac cacgtcaaag    1560

ggtgacagca ggctcataag acgccccagc gtcgccatag tgcgttcacc gaatacgtgc    1620

gcaacaaccg tcttccggag actgtcatac gcgtaaaaca gccagcgctg gcgcgattta    1680

gccccgacat agccccactg ttcgtccatt tccgcgcaga cgatgacgtc actgcccggc    1740

tgtatgcgcg aggttaccga ctgcggcctg agttttttaa gtgacgtaaa atcgtgttga    1800

ggccaacgcc cataatgcgg gctgttgccc ggcatccaac gccattcatg gccatatcaa    1860

tgattttctg gtgcgtaccg ggttgagaag cggtgtaagt gaactgcagt tgccatgttt    1920

tacggcagtg agagcagaga tagcgctgat gtccggcggt gcttttgccg ttacgcacca    1980

ccccgtcagt agctgaacag gagggacagc tgatagacac agaagccact ggagcacctc    2040

aaaaacacca tcatacacta aatcagtaag ttggcagcat cacccataat tgtggtttca    2100

aaatcggctc cgtcgatact atgttatacg ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg    2160

ttttctggta tttaaggttt tagaatgcaa ggaacagtga attggagttc gtcttgttat    2220

aattagcttc ttggggtatc tttaaatact gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc  2280

taaaatgaga atatcaccgg aattgaaaaa actgatcgaa aaataccgct gcgtaaaaga  2340

tacggaagga atgtctcctg ctaaggtata taagctggtg ggagaaaatg aaaacctata  2400

tttaaaaatg acggacagcc ggtataaagg gaccacctat gatgtggaac gggaaaagga  2460

catgatgcta tggctggaag gaaagctgcc tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca  2520

tgatggctgg agcaatctgc tcatgagtga ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta  2580

tgaagatgaa caaagccctg aaaagattat cgagctgtat gcggagtgca tcaggctctt  2640

tcactccatc gacatatcgg attgtcccta tacgaatagc ttagacagcc gcttagccga  2700

attggattac ttactgaata acgatctggc cgatgtggat tgcgaaaact gggaagaaga  2760

cactccattt aaagatccgc gcgagctgta tgatttttta aagacggaaa agcccgaaga  2820

ggaacttgtc ttttcccacg gcgacctggg agacagcaac atctttgtga aagatggcaa  2880

agtaagtggc tttattgatc ttgggagaag cggcagggcg gacaagtggt atgacattgc  2940

cttctgcgtc cggtcgatca gggaggatat cggggaagaa cagtatgtcg agctattttt  3000

tgacttactg gggatcaagc ctgattggga gaaaataaaa tattatattt tactggatga  3060

attgttttag tacctagatg tggcgcaacg atgccggcga caagcaggag cgcaccgact  3120

tcttccgcat caagtgtttt ggctctcagg ccgaggccca cggcaagtat ttgggcaagg  3180

ggtcgctggt attcgtgcag ggcaagattc ggaataccaa gtacgagaag gacggccaga  3240

cggtctacgg gaccgacttc attgccgata aggtggatta tctggacacc aaggcaccag  3300

gcgggtcaaa tcaggaataa gggcacattg ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag  3360

gagggtgaat gaatcggacg tttgaccgga aggcatacag gcaagaactg atcgacgcgg  3420

ggttttccgc cgaggatgcc gaaaccatcg caagccgcac cgtcatgcgt gcgccccgcg  3480

aaaccttcca gtccgtcggc tcgatggtcc agcaagctac ggccaagatc gagcgcgaca  3540

gcgtgcaact ggctccccct gccctgcccg cgccatcggc cgccgtggag cgttcgcgtc  3600

gtctcgaaca ggaggcggca ggtttggcga agtcgatgac catcgacacg cgaggaacta  3660

tgacgaccaa gaagcgaaaa accgccggcg aggacctggc aaaacaggtc agcgaggcca  3720

agcaggccgc gttgctgaaa cacacgaagc agcagatcaa ggaaatgcag ctttccttgt  3780

tcgatattgc gccgtggccg gacacgatgc gagcgatgcc aaacgacacg gcccgctctg  3840

ccctgttcac cacgcgcaac aagaaaatcc cgcgcgaggc gctgcaaaac aaggtcattt  3900

tccacgtcaa caaggacgtg aagatcacct acaccggcgt cgagctgcgg gccgacgatg  3960

acgaactggt gtggcagcag gtgttggagt acgcgaagcg cacccctatc ggcgagccga  4020

tcaccttcac gttctacgag ctttgccagg acctgggctg gtcgatcaat ggccggtatt  4080

acacgaaggc cgaggaatgc ctgtcgcgcc tacaggcgac ggcgatgggc ttcacgtccg  4140

accgcgttgg gcacctggaa tcggtgtcgc tgctgcaccg cttccgcgtc ctggaccgtg  4200

gcaagaaaac gtcccgttgc caggtcctga tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg  4260

gcgaccacta cacgaaattc atatgggaga agtaccgcaa gctgtcgccg acggcccgac  4320

ggatgttcga ctatttcagc tcgcaccggg agccgtaccc gctcaagctg gaaaccttcc  4380

gcctcatgtg cggatcggat tccacccgcg tgaagaagtg gcgcgagcag gtcggcgaag  4440

cctgcgaaga gttgcgaggc agcggcctgg tggaacacgc ctgggtcaat gatgacctgg  4500

tgcattgcaa acgctagggc cttgtggggt cagttccggc tgggggttca gcagccagcg  4560

ctttactggc atttcaggaa caagcgggca ctgctcgacg cacttgcttc gctcagtatc  4620

gctcgggacg cacggcgcgc tctacgaact gccgataaac agaggattaa aattgacaat  4680

tgtgattaag gctcagattc gacggcttgg agcggccgac gtgcaggatt tccgcgagat  4740

ccgattgtcg gccctgaaga aagctccaga gatgttcggg tccgtttacg agcacgagga  4800

gaaaaagccc atggaggcgt tcgctgaacg gttgcgagat gccgtggcat tcggcgccta  4860

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tcacaaggcg catctgtccg gcgttttcgt ggagcccgaa cagcgaggcc gaggggtcgc  4980

cggtatgctg ctgcgggcgt tgccggcggg tttattgctc gtgatgatcg tccgacagat  5040

tccaacggga atctggtgga tgcgcatctt catcctcggc gcacttaata tttcgctatt  5100

ctggagcttg ttgtttattt cggtctaccg cctgccgggc ggggtcgcgg cgacggtagg  5160

cgctgtgcag ccgctgatgg tcgtgttcat ctctgccgct ctgctaggta gcccgatacg  5220

attgatggcg gtcctggggg ctatttgcgg aactgcgggc gtggcgctgt tggtgttgac  5280

accaaacgca gcgctagatc ctgtcggcgt cgcagcgggc ctggcggggg cggtttccat  5340

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gccaatcccg atgcctacag gaaccaatgt tctcggcctg gcgtggctcg gcctgatcgg  5520

agcgggttta acctacttcc tttggttccg ggggatctcg cgactcgaac ctacagttgt  5580

ttccttactg ggctttctca gccccagatc tggggtcgat cagccgggga tgcatcaggc  5640

cgacagtcgg aacttcgggt ccccgacctg taccattcgg tgagcaatgg ataggggagt  5700

tgatatcgtc aacgttcact tctaaagaaa tagcgccact cagcttcctc agcggcttta  5760

tccagcgatt tcctattatg tcggcatagt tctcaagatc gacagcctgt cacggttaag  5820

cgagaaatga ataagaaggc tgataattcg gatctctgcg agggagatga tatttgatca  5880

caggcagcaa cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt  5940

gtttcaaacc cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag  6000

tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat  6060

cgagtggtga ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga  6120

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taatgtactg gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc  6240

accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga  6300

aaatcctgtt tgatggtggt tccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaatagc  6360

ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg  6420

actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat  6480

cacccaaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag  6540

ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga  6600

agaaagcgaa aggagcgggc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg  6660

cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt  6720

tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcccg  6780

atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt  6840

gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa cccatctcat  6900

aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca acagaaatta  6960

tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt attgccaaat  7020

gtttgaacga tcggggaaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag tcccccgtgt  7080

tctctccaaa tgaaatgaac ttccttatat agaggaaggg tcttgcgaag gatagtggga  7140

ttgtgcgtca tcccttacgt cagtggagat atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt  7200

ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc  7260

actgtcggca gaggcatctt caacgatggc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta  7320

ggagccacct tccttttcca ctatcttcac aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa  7380

tccgaggagg tttccggata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaattgccc tttggtcttc  7400

tgagactgta tctttgatat ttttggagta gacaagtgtg tcgtgctcca ccatgttgac  7500

gaagattttc ttcttgtcat tgagtcgtaa gagactctgt atgaactgtt cgccagtctt  7560

tacggcgagt tctgttaggt cctctatttg aatctttgac tccatggcct ttgattcagt  7620

gggaactacc tttttagaga ctccaatctc tattacttgc cttggtttgt gaagcaagcc  7680

ttgaatcgtc catactggaa tagtacttct gatcttgaga aatatatctt tctctgtgtt  7740

cttgatgcag ttagtcctga atcttttgac tgcatcttta accttcttgg gaaggtattt  7800

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tctaaccatc tgtgggttag cattctttct gaaattgaaa aggctaatct ggggacctgc  7920

aggcatgcaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg  7980

ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa  8040

tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac  8100

ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt  8160

gggccaaaga caaaagggcg acattcaacc gattgaggga gggaaggtaa atattgacgg  8220

aaattattca ttaaaggtga attatcaccg tcaccgactt gagccatttg ggaattagag  8280

ccagcaaaat caccagtagc accattacca ttagcaaggc cggaaacgtc accaatgaaa  8340

ccatcgatag cagcaccgta atcagtagcg acagaatcaa gtttgccttt agcgtcagac  8400

tgtagcgcgt tttcatcggc attttcggtc atagccccct tattagcgtt tgccatcttt  8460

tcataatcaa aatcaccgga accagagcca ccaccggaac cgcctccctc agagccgcca  8520

ccctcagaac cgccaccctc agagccacca ccctcagagc cgccaccaga accaccacca  8580

gagccgccgc cagcattgac aggaggcccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga  8640

taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg  8700

cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat  8760

tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg  8820

attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tcggggatca tccgggtctg  8880

tggcgggaac tccacgaaaa tatccgaacg cagcaagata tcgcggtgca tctcggtctt  8940

gcctgggcag tcgccgccga cgccgttgat gtggacgccg ggcccgatca tattgtcgct  9000

caggatcgtg gcgttgtgct tgtcggccgt tgctgtcgta atgatatcgg caccttcgac  9060

cgcctgttcc gcagagatcc cgtgggcgaa gaactccagc atgagatccc cgcgctggag  9120

gatcatccag ccggcgtccc ggaaaacgat tccgaagccc aacctttcat agaaggcggc  9180

ggtggaatcg aaatctcgtg atggcaggtt gggcgtcgct tggtcggtca tttcgaaccc  9240

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ccatgggtca cgacgagatc atcgccgtcg ggcatgcgcg ccttgagcct ggcgaacagt  9540

tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac aagaccggct  9600

tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta  9660

gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac tttctcggca  9720

ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc  9780

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attgagagtg aatatgagac tctaattgga taccgagggg aatttatgga acgtcagtgg 10140

agcatttttg acaagaaata tttgctagct gatagtgacc ttaggcgact tttgaacgcg 10200

caataatggt ttctgacgta tgtgcttagc tcattaaact ccagaaaccc gcggctgagt 10260

ggctccttca acgttgcggt tctgtcagtt ccaaacgtaa aacggcttgt cccgcgtcat 10320

cggcgggggt cataacgtga ctcccttaat tctccgctca tgatcagatt gtcgtttccc 10380

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agagcgttta ttagaataat cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc 10500

catttgtatg tgcatgccaa ccacagggtt ccccagatct ggcgccggcc agcgagacga 10560

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attgcaccaa cgcatacagc gccagcagaa tgccatagtg ggcggtgacg tcgttcgagt 10680

gaaccagatc gcgcaggagg cccggcagca ccggcataat caggccgatg ccgacagcgt 10740

cgagcgcgac agtgctcaga attacgatca ggggtatgtt gggtttcacg tctggcctcc 10800

ggaccagcct ccgctggtcc gattgaacgc gcggattctt tatcactgat aagttggtgg 10860

acatattatg tttatcagtg ataaagtgtc aagcatgaca aagttgcagc cgaatacagt 10920

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gatggaaacg gccgacgcgc agcttcgctt cctctgcgag gcgggttttt cggccgggga 11280

cgccgtcaat gcgctgatga caatcagcta cttcactgtt ggggccgtgc ttgaggagca 11340

ggccggcgac agcgatgccg gcgagcgcgg cggcaccgtt gaacaggctc cgctctcgcc 11400

gctgttgcgg gccgcgatag acgccttcga cgaagccggt ccggacgcag cgttcgagca 11460

gggactcgcg gtgattgtcg atggattggc gaaaaggagg ctcgttgtca ggaacgttga 11520

aggaccgaga aagggtgacg attgatcagg accgctgccg gagcgcaacc cactcactac 11580

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cccgctacgg gctttttcat gccctgccct agcgtccaag cctcacggcc gcgctcggcc 11700

tctctggcgg ccttctggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 11760

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gctggcgaag atcgaagaga agcaggacga gcttggcaag gtcatgatgg gcgtggtccg 12720

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ccaagcacgt ccccatgcgc tccatcaaga agagcgactt cgcggagctg gtgaagtaca 12840

tcaccgacga gcaaggcaag accgagcgcc tttgcgacgc tca                   12883

Claims (5)

1.一种川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H，其特征在于所述基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.一种含有权利要求1所述川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H的酵母表达载体pPICZA-SmG0H，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

3.一种含有权利要求1所述基因SmG10H的植物表达载体pROK-SmG0H，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，所述载体非克隆区域核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。

4.权利要求1所述香叶醇-10羟化酶基因SmG10H在酵母中表达香叶醇-10羟化酶的应用。

5.权利要求1所述香叶醇-10羟化酶基因SmG10H在川西獐牙菜中表达香叶醇-10羟化酶和提高獐牙菜苦苷含量的应用。

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