CN110551700B - Adh蛋白家族突变体及其应用 - Google Patents

Adh蛋白家族突变体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110551700B
CN110551700B CN201810554584.5A CN201810554584A CN110551700B CN 110551700 B CN110551700 B CN 110551700B CN 201810554584 A CN201810554584 A CN 201810554584A CN 110551700 B CN110551700 B CN 110551700B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gly
val
ala
lys
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810554584.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110551700A (zh
Inventor
郭敏
王海鹏
姜灵轩
娄旭
许乃庆
代田纯
李海洋
邓蜜妮
于雪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kangma Healthcode Shanghai Biotech Co Ltd
Original Assignee
Kangma Healthcode Shanghai Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kangma Healthcode Shanghai Biotech Co Ltd filed Critical Kangma Healthcode Shanghai Biotech Co Ltd
Priority to CN201810554584.5A priority Critical patent/CN110551700B/zh
Priority to US17/059,416 priority patent/US20210214693A1/en
Priority to JP2020566962A priority patent/JP7342040B6/ja
Priority to EP19811465.4A priority patent/EP3805379A4/en
Priority to KR1020207038030A priority patent/KR102584789B1/ko
Priority to PCT/CN2019/088833 priority patent/WO2019228353A1/zh
Publication of CN110551700A publication Critical patent/CN110551700A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110551700B publication Critical patent/CN110551700B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01001—Alcohol dehydrogenase (1.1.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及ADH蛋白家族突变体及其应用。具体地，本发明提供一种ADH蛋白的突变体。相比野生型ADH蛋白，本发明的ADH蛋白突变体可显著(i)提高体外无细胞合成体系中外源蛋白的表达纯度、效率、和得率；和/或(ii)降低突变蛋白与Ni介质的结合能力。

Description

ADH蛋白家族突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及ADH蛋白家族突变体及其应用。
背景技术
蛋白质分离纯化，是指通过在目的蛋白的一端融合多聚标签或目的蛋白的特定性状，将混合物、抽提物、细胞破碎液或反应产物等，经由层析(chromatography)方法达到分离其他物质、纯化目的蛋白的过程。亲和层析是指将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化的方法。常见的用来亲和层析的多聚标签主要有组氨酸(Histidine, His)，谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase, GST)和麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein,MBP)等。固定化金属离子亲和层析(immobilized metal-chelating affinitychromatography， IMAC)的原理主要是基于蛋白表面的氨基酸残基与金属离子能形成不同的亲和力，主要分为三种：静电吸引、共价结合与配位键结合。当蛋白表面含有组氨酸、半胱氨酸或色氨酸，对应的咪唑基、巯基或吲哚基便可与金属离子形成配位键。该方法凭借表达方便、成本低廉以及对目的蛋白性质影响小等优点，已成为常用的蛋白纯化手段。
然而，在实际应用过程中，该纯化方式也存在一定的问题。以Ni-NTA树脂为例，有些非目的蛋白在其三维结构表面也存在若干不连续的组氨酸残基，导致该蛋白对Ni-NTA树脂也有一定程度的结合，从而使最终目的蛋白的纯度受到干扰。
因此，本领域迫切需要发明一种改造非目的蛋白组氨酸残基的方法，使其不能与Ni离子亲和介质，如Ni-NTA树脂相结合，达到提升目的蛋白纯度的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种改造非目的蛋白组氨酸残基的方法，使其不能与Ni离子亲和介质，如Ni-NTA树脂相结合，达到提升目的蛋白纯度的效果。
本发明第一方面提供了一种乙醇脱氢酶(ADH)突变蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，并且所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH)的第45-149位氨基酸中的至少1个组氨酸(H)发生突变。
在另一优选例中，所述突变不包括野生型的乙醇脱氢酶(ADH)第67位、69位、93位和/或94位组氨酸（H）。
在另一优选例中，与野生型的乙醇脱氢酶（ADH）相比，所述乙醇脱氢酶(ADH)突变蛋白与Ni介质的结合能力降低了10％，较佳地，降低了25％，更佳地，降低了50%，更佳地，降低了80%，最佳地，降低了100%。
在另一优选例中，所述组氨酸可各自独立地突变为碱性氨基酸。
在另一优选例中，所述组氨酸各自独立突变的类型可以相同，可以不同。
在另一优选例中，所述组氨酸可各自独立地突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、或其组合。
在另一优选例中，所述突变蛋白来源于K. lactis。
在另一优选例中，所述乙醇脱氢酶(ADH)包括ADH1、ADH2、ADH3和/或ADH4蛋白。
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH1)的对应于SEQ IDNO.: 1的选自下组的一个或多个核心氨基酸发生突变：
第47位组氨酸(H)；
第51位组氨酸(H)；
第124位组氨酸(H)。
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH2)的对应于SEQ IDNO.:26的选自下组的一个或多个核心氨基酸发生突变：
第45位组氨酸(H)；
第49位组氨酸(H)；
第122位组氨酸(H)。
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH3)的对应于SEQ IDNO.:27的选自下组的一个或多个核心氨基酸发生突变：
第71位组氨酸(H)；
第75位组氨酸(H)；
第148位组氨酸(H)。
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH4)的对应于SEQ IDNO.:28的选自下组的一个或多个核心氨基酸发生突变：
第72位组氨酸(H)；
第76位组氨酸(H)；
第149位组氨酸(H)。
在另一优选例中，所述第47位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、或其组合，较佳地，赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)和/或精氨酸(R)，更佳地，赖氨酸(K)、和/或天冬酰胺(N)。
在另一优选例中，所述第51位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合，较佳地，赖氨酸(K)、和/或精氨酸(R)，更佳地，精氨酸(R)。
在另一优选例中，第124位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合，较佳地，赖氨酸(K)。
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH)的对应于SEQ IDNO.: 1的选自下组的核心氨基酸发生突变：
第47位组氨酸(H)；和
第124位组氨酸(H)。
在另一优选例中，第45位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、或其组合。
在另一优选例中，第49位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合。
在另一优选例中，第122位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合。
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH)的对应于SEQ IDNO.:26的选自下组的核心氨基酸发生突变：
第122位组氨酸(H)；和
第45位组氨酸(H)。
在另一优选例中，第71位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、或其组合。
在另一优选例中，第75位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合。
在另一优选例中，第148位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合。
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH)的对应于SEQ IDNO.:27的选自下组的核心氨基酸发生突变：
第148位组氨酸(H)；和
第71位组氨酸(H)。
在另一优选例中，第72位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、或其组合。
在另一优选例中，第76位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合。
在另一优选例中，第149位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合。
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH)的对应于SEQ IDNO.:28的选自下组的核心氨基酸发生突变：
第149位组氨酸(H)；和
第72位组氨酸(H)。
在另一优选例中，所述的突变选自下组：H47K；H47N；H47Q；H47R；H51K；H51R；H124K；H124R；H47K和H124K；H47N和H124K；H47Q和H124K；H47R和H124K。
在另一优选例中，所述突变选自下组：H47K；H47N；H51R；H124R；H47K和H124K；H47N和H124K。
在另一优选例中，所述突变选自下组：H122K；H122R；H45K；H45R；H45N；H45Q；H49K；H49R；H122K和H45K；H122K和H45R；H122K和H45N；H122K和H45Q。
在另一优选例中，所述突变选自下组：H148K；H148R；H71K；H71R；H71N；H71Q；H75K；H75R；H148K和H71K；H148K和H71R；H148K和H71N；H148K和H71Q。
在另一优选例中，所述突变选自下组：H149K；H149R；H72K；H72R；H72N；H72Q；H76K；H76R；H149K和H72K；H149K和H72R；H149K和H72N；H149K和H72Q。
在另一优选例中，所述乙醇脱氢酶(ADH)突变蛋白的氨基酸序列选自下组：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.:2-13任一所示的多肽。
(2)将SEQ ID NO.: 2-13任一所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(1)所述多肽功能的由SEQ ID NO.:2-13所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2-13所示。
在另一优选例中，所述突变蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.: 2-13所示的序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选至少95%、96%、97%、98%、99%以上的序列相同性。
在另一优选例中，所述的突变蛋白除所述突变(如47、51和/或124位)外，其余的氨基酸序列与SEQ ID NO.: 1所示的序列相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的突变蛋白除所述突变(如45、49和/或122位)外，其余的氨基酸序列与SEQ ID NO.: 26所示的序列相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的突变蛋白除所述突变(如71、75和/或148位)外，其余的氨基酸序列与SEQ ID NO.: 27所示的序列相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的突变蛋白除所述突变(如72、76和/或149位)外，其余的氨基酸序列与SEQ ID NO.: 28所示的序列相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白仍具有(i)提高体外无细胞合成体系中外源蛋白的表达纯度、效率、和/或得率；和/或(ii) 降低突变蛋白与Ni介质的结合能力。
在另一优选例中，与SEQ ID NO.:1、26、27或28所示序列的同源性至少为80%，较佳地至少为85%或90%，更佳地至少为95%，最佳地至少为98%或99%。
本发明第二方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的突变蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:2-13任一所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:14-25任一所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与野生型ADH1蛋白的核苷酸序列所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%)，且编码如SEQ ID NO.:2-13任一所示多肽的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的多核苷酸在所述突变蛋白的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。
在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列、或其组合。
本发明第三方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。
在另一优选例中，所述载体包括质粒、病毒载体。
在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、SV40、痘病毒、或其组合。
在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。
在另一优选例中，所述酵母细胞选自下组的一种或多种来源的酵母：毕氏酵母、克鲁维酵母、或其组合；较佳地，所述的酵母细胞包括：克鲁维酵母，更佳地为马克斯克鲁维酵母、和/或乳酸克鲁维酵母。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、麦胚细胞，昆虫细胞，SF9、Hela、HEK293、CHO、酵母细胞、或其组合。
本发明第五方面提供了一种产生本发明第一方面所述的乙醇脱氢酶(ADH)突变蛋白的方法，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达乙醇脱氢酶(ADH)突变蛋白；和/或
分离所述乙醇脱氢酶(ADH)突变蛋白。
本发明第六方面提供了一种酶制剂，所述酶制剂包含本发明第一方面所述的乙醇脱氢酶(ADH)突变蛋白。
在另一优选例中，所述的酶制剂包括注射剂、和/或冻干制剂。
本发明第七方面提供了一种本发明第一方面所述的突变蛋白的用途，所述的突变蛋白用于制备(i)提高体外无细胞合成体系中外源蛋白的表达纯度、效率、和/或得率；和/或(ii) 降低突变蛋白与Ni介质的结合能力的酶制剂。
在另一优选例中，所述的Ni选自下组：镍元素、镍离子、游离镍离子、结合有镍的层析介质、Ni+、Ni-beads、Ni-NTA、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了通过改造K. lactis基因组中ADH1以消除其与Ni介质结合的设计路线图。
图2是KlADH家族蛋白ADH1-4的序列同源性对比。其中黑色区域代表序列高度同源。
图3是KlADH1与ScADH1的序列同源性对比，二者序列同源性为84.9%。
图4是以2HCY为模板对KlADH4进行的同源建模，二者均为四聚体，每个单体的6个His聚集区分别用方框表示。
图5是ScADH1四聚体结构图，A和B两个亚基通过NADH/NAD+结合域构成二聚体，两个AB二聚体组成“背靠背”四聚体。
图6是ScADH1中H66周围氨基酸结构图，H66在两种ADH1的构象中均参与螯合具有催化作用的Zn2+。A图表示结合了NAD的封闭构象，B图表示未结合NAD的开放构象。
图7是ScADH1中H48周围氨基酸结构图，H48参与三元复合体的形成，影响底物的质子转移过程。
图8是ScADH1中H44周围氨基酸结构图，H44咪唑环上的ND1可能参与NAD+/NADH的结合。
图9是pKMCas9_StR_KlADH1质粒图谱。该质粒带有tRNA-Tyr启动子和SNR52终止子，并带有kana筛选标记。
图10是pKMD1-ΔKlADH1质粒图谱。homologous arm 1和homologous arm 2分别为KlADH1基因的ORF上、下游各800 bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图11是pKMD1-KlADH1-H47K质粒图谱。homologous arm 1和homologous arm 2分别为KlADH1基因的ORF上、下游各800 bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图12是pKMD1-KlADH1-H47N质粒图谱。homologous arm 1和homologous arm 2分别为KlADH1基因的ORF上、下游各800 bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图13是pKMD1-KlADH1-H47Q质粒图谱。homologous arm 1和homologous arm 2分别为KlADH1基因的ORF上、下游各800 bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图14是pKMD1-KlADH1-H47R质粒图谱。homologous arm 1和homologous arm 2分别为KlADH1基因的ORF上、下游各800 bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图15是pKMD1-KlADH1-H51K质粒图谱。homologous arm 1和homologous arm 2分别为KlADH1基因的ORF上、下游各800 bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图16是pKMD1-KlADH1-H51R质粒图谱。homologous arm 1和homologous arm 2分别为KlADH1基因的ORF上、下游各800 bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图17是pKMD1-KlADH1-H124K质粒图谱。homologous arm 1和homologous arm 2分别为KlADH1基因的ORF上、下游各800 bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图18是pKMD1-KlADH1-H124R质粒图谱。homologous arm 1和homologous arm 2分别为KlADH1基因的ORF上、下游各800 bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图19是pKMD1-KlADH1-H47KH124K质粒图谱。homologous arm 1和homologous arm2分别为KlADH1基因的ORF上、下游各800 bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图20是pKMD1-KlADH1-H47NH124K质粒图谱。homologous arm 1和homologous arm2分别为KlADH1基因的ORF上、下游各800 bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图21是pKMD1-KlADH1-H47QH124K质粒图谱。homologous arm 1和homologous arm2分别为KlADH1基因的ORF上、下游各800 bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图22是pKMD1-KlADH1-H47RH124K质粒图谱。homologous arm 1和homologous arm2分别为KlADH1基因的ORF上、下游各800 bp左右的基因序列，质粒带有Amp筛选标记。
图23是经由Ni-NTA纯化的聚丙烯酰胺凝胶分析。如图所示，KlADH1的基因敲除和不同位置的His突变可显著降低KlADH1与Ni-NTA的亲和性。目的条带大小约为37KD，从左至右分别是marker，K. lactis野生型细胞株WT，KlADH1敲除细胞株ΔADH1，KlADH1单突变细胞株H47K，H47N，H47R，H51K，H124K，H124KH47K和H124KH47N。
图24是野生型细胞株WT、KlADH1基因敲除细胞株ΔADH1和KlADH1单突变细胞株H47K的无细胞转录翻译活性的分析。如图所示，从左至右分别是ΔADH1，KlADH1 H47K，K. lactis野生型细胞株WT和阴性对照。
图25是野生型细胞株WT和KlADH1单突变细胞株H47K(Mut)的无细胞转录翻译制备出的目标蛋白质的纯化分析。如图所示，从左至右分别是KlADH1单突变细胞株H47K(Mut)和K. lactis野生型细胞株WT。A图是没有加入外源目标蛋白时KlADH1与Ni-NTA的亲和性分析。B图是在KlADH1单突变细胞株H47K的无细胞转录翻译体系中加入目标蛋白N-His8-eGFP时eGFP的纯化分析。C图是在KlADH1单突变细胞株H47K的无细胞转录翻译体系中加入目标蛋白N-His8-Strep-eGFP时Strep-eGFP的纯化分析。
图26总结了通过KlADH1基因敲除和定点突变来消除其与Ni介质结合的能力，提高目的蛋白的纯度和特异性。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地获得一种ADH家族蛋白突变体。相比野生型ADH家族蛋白，本发明的ADH家族蛋白的突变体可显著(i)提高体外无细胞合成体系中外源蛋白的表达纯度、效率、和/或得率；和/或(ii) 降低突变蛋白与Ni介质的结合能力。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
序列同一性(或同源性)通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。
如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊、长颈鹿、鹿、骆驼、玲羊、野兔和家兔。
ADH家族蛋白
乙醇脱氢酶ADH家族蛋白，大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中，作为生物体内主要短链醇代谢的关键酶，它在很多生理过程中起着重要作用。例如，在人和哺乳动物体内,乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶(ALDH)构成了乙醇脱氢酶系,参与体内乙醇代谢。
ADH家族蛋白包括ADH1、ADH2、ADH3和/或ADH4蛋白。
如图2所示，本发明首次发现，ADH2（SEQ ID NO.:26中的45位－122位），ADH3（SEQID NO.:27中的71-148位），ADH4（SEQ ID NO.:28位中的72-149位）与ADH1（SEQ ID NO.:1中47-124位）高度同源（约98.7%），并且，ADH2(H45, H49，H122)，ADH3(H71, H75，H148)和ADH4(H72, H76，H149)分别对应于ADH1中的H47，H51和H124，即ADH1、ADH2、ADH3、ADH4的突变位点之间的对应关系如下所示。
Figure 831334DEST_PATH_IMAGE002
野生型ADH家族蛋白
如本文所用，“野生型ADH家族蛋白”是指天然存在的、未经过人工改造的ADH家族蛋白，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型ADH家族蛋白的来源为K. lactis野生型细胞株。野生型ADH家族蛋白包括ADH1、ADH2、ADH3和/或ADH4蛋白。
在本发明的一个优选例中，所述野生型ADH家族蛋白（如ADH1、ADH2、ADH3、ADH4）的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:1、26、27或28所示。
ADH家族蛋白的突变体及其编码核酸
如本文所用，术语“突变蛋白”、“本发明突变蛋白”、“本发明ADH突变蛋白”、“本发明突变的ADH蛋白”、ADH突变体”、“ADH家族蛋白的突变体”均可互换使用，均指非天然存在的突变的ADH蛋白，并且所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH)的第45-149位氨基酸中的至少1个组氨酸(H)发生突变。
并且，在本发明中，所述突变不包括野生型的乙醇脱氢酶(ADH)第67位、69位、93位和/或94位组氨酸（H）。
在本发明中，所述组氨酸可各自独立地突变为碱性氨基酸，并且所述组氨酸各自独立突变的类型可以相同，可以不同。
在一优选实施方式中，所述组氨酸突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、或其组合。
在一优选实施方式中，本发明的所述突变的ADH蛋白为对SEQ ID NO.: 1、26、27或28所示蛋白进行人工改造的蛋白。
其中，所述的突变蛋白含有与活性相关的核心氨基酸，且所述核心氨基酸中至少有一个是经过人工改造的；并且本发明突变蛋白具有显著(i)提高体外无细胞合成体系中外源蛋白的表达纯度、效率、和/或得率；和/或(ii) 降低突变蛋白与Ni介质的结合能力的活性。
术语“核心氨基酸”指的是基于SEQ ID NO.: 1、26、27或28，且与SEQ ID NO.: 1、26、27或28同源性达至少80%，如84%、85%、90%、92%、95%、98%的序列中，相应位点是本文所述的特定氨基酸，如基于SEQ ID NO.: 1所示的序列，核心氨基酸为：
第47位组氨酸(H)；和/或
第51位组氨酸(H)；和/或
第124位组氨酸(H)；
如基于SEQ ID NO.: 26所示的序列，核心氨基酸为：
第45位组氨酸(H)；和/或
第49位组氨酸(H)；和/或
第122位组氨酸(H)；
如基于SEQ ID NO.:27所示的序列，核心氨基酸为：
第71位组氨酸(H)；和/或
第75位组氨酸(H)；和/或
第148位组氨酸(H)；
如基于SEQ ID NO.:28所示的序列，核心氨基酸为：
第72位组氨酸(H)；和/或
第76位组氨酸(H)；和/或
第149位组氨酸(H)；
且对上述核心氨基酸进行突变所得到的突变蛋白具有显著(i)提高体外无细胞合成体系中外源蛋白的表达纯度、效率、和/或得率；和/或(ii) 降低突变蛋白与Ni介质的结合能力的活性。
在另一优选例中，所述第47位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)或其组合，较佳地，赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)和/或精氨酸(R)，更佳地，赖氨酸(K)、和/或天冬酰胺(N)。
在另一优选例中，所述第51位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)或其组合，较佳地，赖氨酸(K)、和/或精氨酸(R)，更佳地，精氨酸(R)。
在另一优选例中，第124位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)或其组合，较佳地，赖氨酸(K)。
在在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH)的对应于SEQ IDNO.: 1的选自下组的核心氨基酸发生突变：
第47位组氨酸(H)；和
第124位组氨酸(H)。
在另一优选例中，第45位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、或其组合。
在另一优选例中，第49位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合。
在另一优选例中，第122位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合。
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH)的对应于SEQ IDNO.:26的选自下组的核心氨基酸发生突变：
第122位组氨酸(H)和
第45位组氨酸(H)。
在另一优选例中，第71位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、或其组合。
在另一优选例中，第75位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合。
在另一优选例中，第148位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合。
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH)的对应于SEQ IDNO.:27的选自下组的核心氨基酸发生突变：
第148位组氨酸(H)；和
第71位组氨酸(H)。
在另一优选例中，第72位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、或其组合。
在另一优选例中，第76位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合。
在另一优选例中，第149位组氨酸(H)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、或其组合。
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶(ADH)的对应于SEQ IDNO.:28的选自下组的核心氨基酸发生突变：
第149位组氨酸(H)；和
第72位组氨酸(H)。
应理解，本发明突变的ADH蛋白中的氨基酸编号基于野生型ADH蛋白(优选地，SEQID NO.: 1、26、27或28)作出。当某一具体突变蛋白与SEQ ID NO.: 1、26、27或28所示序列的同源性达到80%或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于SEQ ID NO.: 1、26、27或28的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的N末端或C末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当由于氨基酸编号的错位而使同源性达80%(如90%、95%、98%)的、具有相同或相似活性的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。
本发明突变蛋白是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的突变蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的突变蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括所述突变蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述突变蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。
本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(iii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据表I进行氨基酸替换而产生。
表 I
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gln (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro; Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe Leu
Leu (L) Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Leu
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala Leu
本发明的活性突变蛋白具有显著(i)提高体外无细胞合成体系中外源蛋白的表达纯度、效率、和/或得率；和/或(ii) 降低突变蛋白与Ni介质的结合能力的活性。
在本发明中，所述突变蛋白如本发明第一方面所述，优选地，所述的突变蛋白为如SEQ ID NO.:2-13任一所示的氨基酸序列。
应理解，本发明突变蛋白与SEQ ID NO.:2-13任一所示的序列相比，通常具有较高的同源性(相同性)，优选地，所述的突变蛋白与SEQ ID NO.:2-13任一所示序列的同源性至少为80%，较佳地至少为85%-90%，更佳地至少为95%，最佳地至少为98%。
此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。
术语“编码突变蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明突变蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO.:2-13任一所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:2-13任一所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或突变蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的突变蛋白的功能。
核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。核酸序列可以是基因组的、重组的或合成的。核酸序列可以是分离的或纯化的。核酸序列可以是单链或双链的。优选地，核酸序列将编码如本文描述的光敏蛋白。核酸序列可以通过克隆衍生，例如使用包括限制性酶切、连接、凝胶电泳的标准的分子克隆技术，例如在Sambrook 等Molecular Cloning:Alaboratory manual ,Cold Spring Harbour Laboratory Press)中描述的。核酸序列可是分离的，例如使用PCR技术分离的。分离意指从任何杂质和从被自然地发现与其来源中的核酸序列缔合的其他核酸序列和/或蛋白中分离核酸序列。优选地，其还将不含细胞材料、培养基或来自纯化/生产过程的其他化学物质。核酸序列可以是合成的，例如通过直接的化学合成产生。核酸序列可以作为裸露的核酸被提供，或可与蛋白或脂质复合提供。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1% Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。
本发明的突变蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
在本发明中，所述ADH蛋白突变体的DNA编码序列为SEQ ID NO.:14-25任一所示的核苷酸序列
表达载体和宿主细胞
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的突变蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明突变蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码突变蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明突变蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞(如大肠杆菌)，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有：大肠杆菌、麦胚细胞，昆虫细胞，SF9、Hela、HEK293、CHO、酵母细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择酵母细胞(如毕氏酵母、克鲁维酵母、或其组合；较佳地，所述的酵母细胞包括：克鲁维酵母，更佳地为马克斯克鲁维酵母、和/或乳酸克鲁维酵母)为宿主细胞。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的主要优点包括：
(1) 本发明通过对细胞中与Ni介质结合成分的质谱鉴定，确定了能够与Ni介质结合的细胞内蛋白的种类；
(2) 本发明通过对细胞基因组中ADH家族蛋白进行系统分析，首次提供了一系列ADH家族蛋白中可能与Ni介质结合的组氨酸位点。
(3) 本发明对ADH1进行基因敲除并对ADH1中一系列可能与Ni介质结合的组氨酸位点进行定点突变，首次得到了多株可显著降低ADH1与Ni介质结合能力的菌株。
(4) 本发明通过对上述多个细胞株进行无细胞体系转录翻译活性分析，发现相对于基因敲除，ADH1的定点突变对无细胞体系转录翻译活性的影响较小，并首次得到了一株既不影响无细胞体系转录翻译活性，又显著降低ADH1与Ni介质结合能力的细胞株。
(5) 本发明以乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis，K. lactis)为实施例，但同样的设计和分析、实验方法也适用于其他原核细胞，真核细胞，酵母，人源细胞，Hela,CHO, HEK293，Saccharomyces cerevisiae 等细胞。
(6) 本发明首次发现，对ADH家族蛋白的核心氨基酸进行突变，会显著(i)提高体外无细胞合成体系中外源蛋白的表达纯度、效率、和/或得率；和/或(ii) 降低突变蛋白与Ni介质的结合能力。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非有特别说明，否则本发明实施例中的试剂和材料均为市售产品。
本发明以乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis，K. lactis)为实施例，但同样的设计和分析、实验方法也适用于其他原核细胞，真核细胞，酵母，人源细胞，Hela, CHO,HEK293，Saccharomyces cerevisiae 等细胞。
通用方法
本发明提供了一种设计和方法，即通过Ni纯化和质谱分析，鉴定Ni结合蛋白，并以此对基因组中ADH家族蛋白进行点突变，降低其与Ni介质结合的能力，从而提高经由Ni纯化蛋白的效率、得率和纯度等优点。包括以下步骤：
（1） ADH家族蛋白的鉴定分析，方法如下：
A、经由Ni纯化的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；
B、非特异性条带(35-50 kDa)的质谱分析；
C、质谱分析结果的肽段比对，鉴定主要非特异性条带为ADH蛋白；
（2） K. lactis ADH家族蛋白与Ni介质潜在结合位点分析，方法如下：
A、K. lactis中ADH1与Saccharomyces cerevisiae中ADH1蛋白进行序列比对；
B、以ScADH为模板进行同源建模，并找出KlADH中的His富集区域位点，如ADH1的H47，H51，H124；ADH2的H45，H49，H122；ADH3的H71，H75，H148；ADH4的H72，H76，H149；
C、对该区域内的His位点进行可改造性分析，如是否影响ADH的催化活性，并最终选定替代氨基酸，如ADH1的定点突变选自下组：H124K, H124R, H47K, H47R, H47N, H47Q,H51K, H51R，H124KH47K, H124KH47R, H124KH47N, H124KH47Q或其组合；ADH2的定点突变选自下组：H122K, H122R, H45K, H45R, H45N, H45Q, H49K, H49R，H122KH45K,H122KH45R, H122KH45N, H122KH45Q或其组合；ADH3的定点突变选自下组：H148K, H148R,H71K, H71R, H71N, H71Q, H75K, H75R，H148KH71K, H148KH71R, H148KH71N, H148KH71Q或其组合；ADH4的定点突变选自下组：H149K, H149R, H72K, H72R, H72N, H72Q, H76K,H76R，H149KH72K, H149KH72R, H149KH72N, H149KH72Q或其组合；
（3） Cas9-gRNA克隆载体的构建，构建方法如下：
A、针对特定基因的序列，分别设计引导该基因切割的gRNA序列；
B、将上述gRNA序列重组至含有Cas9的载体中，得到gRNA和Cas9共表达的第一载体；
（4） 构建敲除特定基因的供体DNA，方法如下：
A、从基因数据库中下载特定基因核苷酸序列，用基因上下游序列各800 bp构建第二载体；
B、利用引物M13F和M13R对第二载体进行扩增，获得的PCR产物进行乙醇沉淀浓缩，最终获得供体DNA；
（5） 构建特定基因组氨酸残基点突变的供体DNA，方法如下：
A、从基因数据库中下载特定基因核苷酸序列，用目的基因和上下游序列各800bp构建第二载体，同时对部分组氨酸残基进行相应的点突变，并对gRNA进行同义突变；
B、利用引物M13F和M13R对第二载体进行扩增，获得的PCR产物进行乙醇沉淀浓缩，最终获得供体DNA；
（6） 获得敲除或点突变特定基因的细胞株，方法如下：
A、将第一载体和供体DNA同时转化到感受态细胞中；
B、筛选出单克隆细胞进行扩大培养，抽提基因组，设计引物对ADH基因及同源臂进行扩增，扩增的PCR产物经测序验证；
（7） 检测基因敲除或点突变菌株和Ni介质的结合能力，方法如下：
A、将得到的基因敲除或点突变菌株进行扩大培养，并进行细胞破碎，得到细胞裂解液；
B、对细胞裂解液通过Ni介质进行纯化，并对纯化产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；
(8)无细胞体外蛋白质合成体系
利用基因改造后的细胞株制备成酵母细胞裂解液，加入到蛋白体外翻译体系中，20-30 ℃的环境中，静置反应2-12 h，利用多功能酶标仪(Perkin Elmer)读数，检测增强型绿色荧光蛋白活性。
实施例1 K. lactis中ADH家族基因的分析和特异性改造
1.1 K. lactis中ADH家族基因的分析
当用Ni介质对K. lactis 中表达的含有His标签的目的蛋白进行亲和纯化时，在35-50 kDa处有明显的非特异性条带。质谱结果表明该非特异性蛋白主要来源于K. lactis中的ADH家族蛋白(表1)。ADH是一种依赖NAD(P)的氧化还原酶，几乎存在于所有生物体中，它们催化伯醇和仲醇的可逆氧化分别生成醛和酮。K. lactis中的ADH家族蛋白包括KlADH1、KlADH2、KlADH3、KlADH4四种，均由染色体DNA编码。其中，ADH1基因序列(SEQ IDNO.164)，KEGG数据库编码为KlLA0F21010g，位于F染色体；ADH2基因序列(SEQ ID NO.29)，KEGG数据库编码为KlLA0F18260g，位于F染色体；ADH3基因序列(SEQ ID NO.30)，KEGG数据库编码为KlLA0B09064g，位于B染色体；ADH4基因序列(SEQ ID NO.31)，KEGG数据库编码为KlLA0F13530g，位于F染色体。其中ADH1和ADH2在细胞溶质中发挥功能，ADH3和ADH4在线粒体中发挥功能，相对分子量分别为37.3 kDa、37.1 kDa、39.6 kDa、40.2 kDa。这四种ADH的氨基酸序列同源性很高，三级结构也很接近。
表1 质谱鉴定Ni介质纯化非特异性蛋白所得肽段及所指向的
K. lactis 内源蛋白
peptide sequence target protein in K.lactis SEQ ID NO.:
EAIDFFSR ADH1 32
SNGTVVLVGLPR ADH1&ADH2 33
SISIVGSYVGNR ADH1 34
DLGGEYFIDFTK ADH1 35
GVIFYENGGELQYK ADH1&ADH2 36
LPLVGGHEGAGVVVAMGENVK ADH1&ADH2&ADH3(mitochondria) 37
APIHVVGLSELPSIYEK ADH1 38
GGAHGVINVSVSEFAIEQSTNYVR ADH1&ADH2 39
AGDWVAISGAAGGLGSLAVQYAK ADH1&ADH3(mitochondria) 40
GVIFYENGGKlEYK ADH3&ADH4(mitochondria) 41
SDVFNQVVK ADH1 42
NIPEEVIEATK ADH1 43
ANEILINVK ADH4 44
由于K. lactis 中ADH家族蛋白的晶体结构还未知，我们采用了同源建模的方式预测其空间三级结构。K. lactis 中KlADH1与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中ScADH1(PDB编号4W6Z)的一级序列比对表明两者同为四聚体，序列同源性84.9%。以ScADH1为模板进行的同源建模显示，K. lactis 中KlADH1的每个单体共含有6个His，分别位于47位、51位、69位、124位、243位、321位。整个四聚体共含有4个His富集区，每个单体除第5个His相对独立外，另5个His空间靠近，其中空间上(同时也是序列上)最为靠近的是每个单体的前3～4个His。
由于K. lactis中的四种ADH高度同源，且有5个His高度保守，所以KlADH2，KlADH3和KlADH4的空间结构也与KlADH1相近，即每种ADH蛋白的前4个His可能在空间上成簇，从而与Ni介质产生亲和作用。
1.2 K. lactis中ADH家族基因的特异性改造
鉴于在消除ADH与Ni介质的亲和作用的同时，需要尽可能地减少对ADH活性的影响，所以分析KlADH中His的功能成为关键。通过大量比对和筛选发现，ScADH1蛋白与KlADH1同源的6个His中，H44、H48、H66、H121由于与KlADH1中成簇的4个His同源而成为本发明分析的重点。由于H66在ScADH1的两种构象中均参与螯合具有催化作用的Zn2+，如图6所示，可能对ADH的催化活性有重大影响，故而没有成为本发明的改造靶点。而H48虽不与辅酶结合，但参与三元复合体的形成，影响底物的质子转移过程，如图7所示。本发明的研究发现，H44咪唑环上的ND1可能与NAD+的O2A形成氢键，从而参与了NAD+/NADH的结合，H44R可以将NAD+和NADH的解离常数降低2-4倍，并且使转换数减少4-6倍。此外，H121的侧链可与T130形成氢键。
基于上述研究，本发明将对ScADH1中对ADH1功能影响较小的三个His位点(分别为H44，H48和H121)突变为功能相近的氨基酸，最终在KlADH1上设计的点突变方案为H124K,H124R, H47K, H47R, H47N, H47Q, H51K, H51R，H124KH47K, H124KH47R, H124KH47N,H124KH47Q。
由于K. lactis中ADH2，ADH3，ADH4与ADH1高度同源（图2），即ADH2(H45, H49，H122)，ADH3(H71, H75，H148)和ADH4(H72, H76，H149)分别对应于ADH1中的H47，H51和H124。
因此在本发明中，以ADH1为例来减少ADH1对Ni介质的结合，具体表现在ADH1基因的敲除及H47，H51和H124的定点突变。ADH2，ADH3和ADH4也可在对应的位点用类似ADH1的方法进行改造。
实施例2 通过CRISPR/Cas9靶向敲除ADH1基因
2.1 KlADH1 CRISPR gRNA序列确定
根据在KlADH1设计的点突变，选择PAM序列(NGG)，并确定对应的gRNA序列。本实施例中gRNA选择的原则为：GC含量适中(40%-60%)，避免poly T结构的存在。在本实施例中，KlADH1 gRNA1序列为TGGGTGAAAACGTCAAGGGC （SEQ ID NO.:45）。
质粒构建及转化方法如下：使用引物pKMCas9-KlADH1-gRNA1-PF：TGGGTGAAAACGTCAAGGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC（SEQ ID NO.:46）和pCas9-KlADH1-gRNA1-PR：GCCCTTGACGTTTTCACCCAAAAGTCCCATTCGCCACCCG（SEQ ID NO.:47），以pCAS质粒为模板，进行PCR扩增。取扩增产物17 µL，加入1 µL Dpn I，2 µL 10 × digestion buffer，混匀后37 oC温浴3 h。取Dpn I处理后产物10 µL加入50 µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激45 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取2个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMCas9_StR_KlADH1。
2.2 供体 DNA质粒构建及扩增
为了便于线性供体DNA的保存及扩增，本实施例将供体DNA插入到pKMD1质粒中，并通过PCR扩增得到线性供体DNA序列。
以pKMD1质粒为模板，以引物pKMD1-PF：ATCGTCGACCTGCAGGCATG（SEQ ID NO.:48）和pKMD1-PR：ATCTCTAGAGGATCCCCGGG（SEQ ID NO.:49）进行PCR扩增，取扩增产物17 µL，加入1 µL Dpn I，2 µL 10 × digestion buffer，混匀后37 oC温浴3 h，获得质粒骨架线性片段pKMD1-T。
2.2.1 构建供体质粒pKMD1-ΔKlADH1
以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR1-PF：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG（SEQ ID NO.:50）和KlADH1-HR1-PR：GAAGAGATTTCATTTATCTTTTTTTAGTATAGAGTTTGTGTGTTTAAAGCTTG（SEQ ID NO.:51）进行PCR扩增，产物名为ΔKlADH1-F1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR2-PF：CAAACTCTATACTAAAAAAAGATAAATGAAATCTCTTCCGCATTCAAGTCATGAC（SEQ ID NO.:
52)和KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC（SEQ ID NO.:53）进行PCR扩增，产物名为ΔKlADH1-F2。
将扩增产物ΔKlADH1-F1、ΔKlADH1-F2、pKMD1-T各1 µL，加入5 µL Cloning Mix(试剂盒名为Transgene pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，来源于全式金公司，下同)与2 µL水，混匀后50 oC水浴1 h。水浴结束后置于冰上2 min，将10 µL反应液全部加入50 µL Trans-T1感受态细胞(来源于全式金公司，下同)中，冰上放置30 min，42 oC热激30 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-ΔKlADH1。
2.3 K. lactis电转化
从-80 ℃ 冰箱取出感受态，冰上融化，加入400 ng gRNA&Cas9质粒(或gRNA/cas9片段)和1000 ng Donor DNA 片段，混匀后全部转入电击杯中，冰浴 2 min；将电击杯放入电转仪中进行电击(参数为1.5 kV，200 Ω，25 μF)；电击结束后立即加入 700 μL YPD，30℃，200 rpm 摇床孵育 1～3 h；取 2～200 μL 接种于YPD(含G418抗性)平板，30 ℃ 培养2～3天至单菌落出现。
2.4 阳性鉴定
在细胞转化后的平板上挑取12-24个单克隆，以细胞为模板，用鉴定引物 ADH1-CF: GTGATGGAACACGGGAATAG（SEQ ID NO.:54）和ADH1-CR：CACATATACCTTGGCAGTAG（SEQ IDNO.:55）对样品进行PCR检测。PCR结果阳性并经测序鉴定的细胞株，确定为阳性细胞株并分别命名为ΔADH1。
实施例3 通过CRISPR/Cas9定点突变ADH1 H47位点
3.1 KlADH1 CRISPR gRNA序列确定
根据在KlADH1设计的点突变，选择PAM序列(NGG)，并确定对应的gRNA序列。本实施例中gRNA选择的原则为：靠近设计的突变位点，GC含量适中(40%-60%)，避免poly T结构的存在。在本实施例中，KlADH1 gRNA1序列为TGGGTGAAAACGTCAAGGGC(SEQ ID NO.:56)。
质粒构建及转化方法如下：使用引物pCas9-KlADH1-gRNA1-PF：TGGGTGAAAACGTCAAGGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO.:57)和pCas9-KlADH1-gRNA1-PR：GCCCTTGACGTTTTCACCCAAAAGTCCCATTCGCCACCCG(SEQ ID NO.:58)，以pCAS质粒为模板，进行PCR扩增。取扩增产物17 µL，加入1 µL Dpn I，2 µL 10 × digestion buffer，混匀后37 oC温浴3 h。取Dpn I处理后产物10 µL加入50 µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激45 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取2个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMCas9_StR_KlADH1。
3.2 供体 DNA质粒构建及扩增
为了便于线性供体DNA的保存及扩增，本实施例将供体DNA插入到pKMD1质粒中，并通过PCR扩增得到线性供体DNA序列。
以pKMD1质粒为模板，以引物pKMD1-PF：ATCGTCGACCTGCAGGCATG(SEQ ID NO.:59)和pKMD1-PR：ATCTCTAGAGGATCCCCGGG(SEQ ID NO.:60)进行PCR扩增，取扩增产物17 µL，加入1 µL Dpn I，2 µL 10 × digestion buffer，混匀后37 oC温浴3 h，获得质粒骨架线性片段pKMD1-T。
3.2.1 构建供体质粒pKMD1-KlADH1-H47K
以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR1-PF：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG(SEQ ID NO.:61)和KlADH1-H47K-PR：aGCaTGaAggTCaGTtTtACAGACACCGGAGTACTTGACG(SEQ ID NO.:62)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47K-F1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H47K-PF：GTaAaACtGAccTtCAtGCtTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG(SEQ ID NO.:63)和KlADH1-gRNA1-m-PR：CCAaCCtTTaACaTTcTCtCCCATAGCAACAACGACACCAG(SEQ ID NO.:64)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47K-F2；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-gRNA1-m-PF：GGGaGAgAAtGTtAAaGGtTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG(SEQ ID NO.:65)和KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC(SEQ ID NO.:66)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47K-F3。
将扩增产物KlADH1-H47K-F1、KlADH1-H47K-F2、KlADH1-H47K-F3、pKMD1-T各1 µL，加入5 µL Cloning Mix 与1 µL水，混匀后50 oC水浴1 h。水浴结束后置于冰上2 min，将10µL反应液全部加入50 µL Trans-T1感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激30 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-KlADH1-H47K。
3.2.2 构建供体质粒pKMD1-KlADH1-H47N
以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR1-PF：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG(SEQ ID NO.:67)和KlADH1-H47N-PR：aGCaTGaAggTCaGTaTtACAGACACCGGAGTACTTGACG(SEQ ID NO.:68)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47N-F1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H47N-PF：GTaAtACtGAccTtCAtGCtTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG(SEQ ID NO.:69)和KlADH1-gRNA1-m-PR：CCAaCCtTTaACaTTcTCtCCCATAGCAACAACGACACCAG(SEQ ID NO.:70)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47N-F2；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-gRNA1-m-PF：GGGaGAgAAtGTtAAaGGtTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG(SEQ ID NO.:71)和KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC(SEQ ID NO.:72)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47N-F3。
将扩增产物KlADH1-H47N-F1、KlADH1-H47N-F2、KlADH1-H47N-F3、pKMD1-T各1 µL，加入5 µL Cloning Mix与1 µL水，混匀后50 oC水浴1 h。水浴结束后置于冰上2 min，将10µL反应液全部加入50 µL Trans-T1感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激30 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-KlADH1-H47N。
3.2.3构建供体质粒pKMD1-KlADH1-H47Q
以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR1-PF：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG(SEQ ID NO.:73)和KlADH1-H47Q-PR：aGCaTGaAggTCaGTtTGACAGACACCGGAGTACTTGACG(SEQ ID NO.:74)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47Q-F1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H47Q-PF：GTCAaACtGAccTtCAtGCtTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG(SEQ ID NO.:75)和KlADH1-gRNA1-m-PR：CCAaCCtTTaACaTTcTCtCCCATAGCAACAACGACACCAG(SEQ ID NO.:76)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47Q-F2；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-gRNA1-m-PF：GGGaGAgAAtGTtAAaGGtTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG(SEQ ID NO.:77)和KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC(SEQ ID NO.:78)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47Q-F3。
将扩增产物KlADH1-H47Q-F1、KlADH1-H47Q-F2、KlADH1-H47Q-F3、pKMD1-T各1 µL，加入5 µL Cloning Mix与1 µL水，混匀后50 oC水浴1 h。水浴结束后置于冰上2 min，将10µL反应液全部加入50 µL Trans-T1感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激30 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-KlADH1-H47Q。
3.2.4构建供体质粒pKMD1-KlADH1-H47R
以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR1-PF：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG(SEQ ID NO.:79)和KlADH1-H47R-PR：aGCaTGaAggTCaGTtctACAGACACCGGAGTACTTGACG(SEQ ID NO.:80)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47R-F1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H47R-PF：GTagaACtGAccTtCAtGCtTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG(SEQ ID NO.:81)和KlADH1-gRNA1-m-PR：CCAaCCtTTaACaTTcTCtCCCATAGCAACAACGACACCAG(SEQ ID NO.:82)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47R-F2；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-gRNA1-m-PF：GGGaGAgAAtGTtAAaGGtTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG(SEQ ID NO.:83)和KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC(SEQ ID NO.:84)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47R-F3。
将扩增产物KlADH1-H47R-F1、KlADH1-H47R-F2、KlADH1-H47R-F3、pKMD1-T各1 µL，加入5 µL Cloning Mix与1 µL水，混匀后50 oC水浴1 h。水浴结束后置于冰上2 min，将10µL反应液全部加入50 µL Trans-T1感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激30 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-KlADH1-H47R。
3.3 K. lactis电转化(同实施例2.3)
3.4 阳性鉴定
在细胞转化后的平板上挑取12-24个单克隆，以细胞为模板，用鉴定引物 ADH1-m-CF:TGGGAGAGAATGTTAAAGGT(SEQ ID NO.:85)和ADH1-m-CR：TGACGGTCGTTAACTAAGAT(SEQ IDNO.:86)对样品进行PCR检测。PCR结果阳性并经测序鉴定的细胞株，确定为阳性细胞株并分别命名为ADH1 H47K，ADH1 H47N, ADH1 H47Q和ADH1 H47R。
实施例4 通过CRISPR/Cas9定点突变ADH1 H51位点
4.1 KlADH1 CRISPR gRNA序列确定
根据在KlADH1设计的点突变，选择PAM序列(NGG)，并确定对应的gRNA序列。本实施例中gRNA选择的原则为：靠近设计的突变位点，GC含量适中(40%-60%)，避免poly T结构的存在。在本实施例中，KlADH1 gRNA1序列为TGGGTGAAAACGTCAAGGGC(SEQ ID NO.:87)。
质粒构建及转化方法如下：使用引物pCas9-KlADH1-gRNA1-PF：TGGGTGAAAACGTCAAGGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO.:88)和pCas9-KlADH1-gRNA1-PR：GCCCTTGACGTTTTCACCCAAAAGTCCCATTCGCCACCCG(SEQ ID NO.:89)，以pCAS质粒为模板，进行PCR扩增。取扩增产物17 µL，加入1 µL Dpn I，2 µL 10 × digestion buffer，混匀后37 oC温浴3 h。取Dpn I处理后产物10 µL加入50 µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激45 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取2个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMCas9_StR_KlADH1。
4.2 供体 DNA质粒构建及扩增
为了便于线性供体DNA的保存及扩增，本实施例将供体DNA插入到pKMD1质粒中，并通过PCR扩增得到线性供体DNA序列。
以pKMD1质粒为模板，以引物pKMD1-PF：ATCGTCGACCTGCAGGCATG(SEQ ID NO.:90)和pKMD1-PR：ATCTCTAGAGGATCCCCGGG(SEQ ID NO.:91)进行PCR扩增，取扩增产物17 µL，加入1 µL Dpn I，2 µL 10 × digestion buffer，混匀后37 oC温浴3 h，获得质粒骨架线性片段pKMD1-T。
4.2.1 构建供体质粒pKMD1-KlADH1-H51K
以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR1-PF：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG(SEQ ID NO.:92)和KlADH1-H51K-PR：CCAaGCtTtaAggTCaGTaTGACAGACACCGGAGTACTTGACG(SEQ ID NO.:93)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H51K-F1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H51K-PF：GTCAtACtGAccTtaAaGCtTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG(SEQ ID NO.:94)和KlADH1-gRNA1-m-PR：CCAaCCtTTaACaTTcTCtCCCATAGCAACAACGACACCAG(SEQ ID NO.:95)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H51K-F2；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-gRNA1-m-PF：GGGaGAgAAtGTtAAaGGtTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG(SEQ ID NO.:96)和KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC(SEQ ID NO.:97)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H51K-F3。
将扩增产物KlADH1-H51K-F1、KlADH1-H51K-F2、KlADH1-H51K-F3、pKMD1-T各1 µL，加入5 µL Cloning Mix与1 µL水，混匀后50 oC水浴1 h。水浴结束后置于冰上2 min，将10µL反应液全部加入50 µL Trans-T1感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激30 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-KlADH1-H51K。
4.2.2构建供体质粒pKMD1-KlADH1-H51R
以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR1-PF：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG(SEQ ID NO.:98)和KlADH1-H51R-PR：CCAaGCtctaAggTCaGTaTGACAGACACCGGAGTACTTGACG(SEQ ID NO.:99)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H51R-F1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H51R-PF：GTCAtACtGAccTtagaGCtTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG(SEQ ID NO.:100)和KlADH1-gRNA1-m-PR：CCAaCCtTTaACaTTcTCtCCCATAGCAACAACGACACCAG(SEQ ID NO.:101)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H51R-F2；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-gRNA1-m-PF：GGGaGAgAAtGTtAAaGGtTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG(SEQ ID NO.:102)和KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC(SEQ ID NO.:103)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H51R-F3。
将扩增产物KlADH1-H51R-F1、KlADH1-H51R-F2、KlADH1-H51R-F3、pKMD1-T各1 µL，加入5 µL Cloning Mix与1 µL水，混匀后50 oC水浴1 h。水浴结束后置于冰上2 min，将10µL反应液全部加入50 µL Trans-T1感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激30 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-KlADH1-H51R。
4.3 乳酸克鲁维酵母电转化(同实施例2.3)
4.4 阳性鉴定
在细胞转化后的平板上挑取12-24个单克隆，以细胞为模板，用鉴定引物 ADH1-m-CF:TGGGAGAGAATGTTAAAGGT(SEQ ID NO.:104)和ADH1-m-CR：TGACGGTCGTTAACTAAGAT(SEQID NO.:105)对样品进行PCR检测。PCR结果阳性并经测序鉴定的细胞株，确定为阳性细胞株并分别命名为ADH1 H51K和ADH1 H51R。
实施例5 通过CRISPR/Cas9定点突变ADH1 H124位点
5.1 KlADH1 CRISPR gRNA序列确定
根据在KlADH1设计的点突变，选择PAM序列(NGG)，并确定对应的gRNA序列。本实施例中gRNA选择的原则为：靠近设计的突变位点，GC含量适中(40%-60%)，避免poly T结构的存在。在本实施例中，KlADH1 gRNA1序列为TGGGTGAAAACGTCAAGGGC(SEQ ID NO.:106)。
质粒构建及转化方法如下：使用引物pCas9-KlADH1-gRNA1-PF：TGGGTGAAAACGTCAAGGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO.:107)和pCas9-KlADH1-gRNA1-PR：GCCCTTGACGTTTTCACCCAAAAGTCCCATTCGCCACCCG(SEQ ID NO.:108)，以pCAS质粒为模板，进行PCR扩增。取扩增产物17 µL，加入1 µL Dpn I，2 µL 10 × digestion buffer，混匀后37 oC温浴3 h。取Dpn I处理后产物10 µL加入50 µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激45 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取2个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMCas9_StR_KlADH1。
5.2 供体 DNA质粒构建及扩增
为了便于线性供体DNA的保存及扩增，本实施例将供体DNA插入到pKMD1质粒中，并通过PCR扩增得到线性供体DNA序列。
以pKMD1质粒为模板，以引物pKMD1-PF：ATCGTCGACCTGCAGGCATG(SEQ ID NO.:109)和pKMD1-PR：ATCTCTAGAGGATCCCCGGG(SEQ ID NO.:110)进行PCR扩增，取扩增产物17 µL，加入1 µL Dpn I，2 µL 10 × digestion buffer，混匀后37 oC温浴3 h，获得质粒骨架线性片段pKMD1-T。
5.2.1构建供体质粒pKMD1-KlADH1-H124K
以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR1-PF：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG(SEQ ID NO.:111)和KlADH1-gRNA1-m-PR：CCAaCCtTTaACaTTcTCtCCCATAGCAACAACGACACCAG(SEQ ID NO.:112)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H124K-F1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-gRNA1-m-PF：GGGaGAgAAtGTtAAaGGtTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG(SEQ ID NO.:113)和KlADH1-H124K-PR：CCaTCtTttGTaTAtCCactCAAGTCAGCTTCTGGACAGTTGG(SEQ ID NO.:114)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H124K-F2；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H124K-PF：CTTGagtGGaTAtACaaAaGAtGGTTCTTTCCAACAATACGCTACTGC(SEQ ID NO.:115)和KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC(SEQ ID NO.:116)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H124K-F3。
将扩增产物KlADH1-H124K -F1、KlADH1-H124K -F2、KlADH1-H124K -F3、pKMD1-T各1 µL，加入5 µL Cloning Mix与1 µL水，混匀后50 oC水浴1 h。水浴结束后置于冰上2min，将10 µL反应液全部加入50 µL Trans-T1感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激30 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-KlADH1-H124K。
5.2.2构建供体质粒pKMD1-KlADH1-H124R
以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR1-PF：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG(SEQ ID NO.:117)和KlADH1-gRNA1-m-PR：CCAaCCtTTaACaTTcTCtCCCATAGCAACAACGACACCAG(SEQ ID NO.:118)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H124K-F1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-gRNA1-m-PF：GGGaGAgAAtGTtAAaGGtTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG(SEQ ID NO.:119)和KlADH1-H124R-PR：CCaTCtcttGTaTAtCCactCAAGTCAGCTTCTGGACAGTTGG(SEQ ID NO.:120)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H124R-F2；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H124R-PF：CTTGagtGGaTAtACaagaGAtGGTTCTTTCCAACAATACGCTACTGC(SEQ ID NO.:121)和KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC(SEQ ID NO.:122)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H124R-F3。
将扩增产物KlADH1-H124R -F1、KlADH1-H124R -F2、KlADH1-H124R -F3、pKMD1-T各1 µL，加入5 µL Cloning Mix与1 µL水，混匀后50 oC水浴1 h。水浴结束后置于冰上2min，将10 µL反应液全部加入50 µL Trans-T1感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激30 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-KlADH1-H124R。
5.3 K. lactis电转化(同实施例2.3)
5.4 阳性鉴定
在细胞转化后的平板上挑取12-24个单克隆，以细胞为模板，用鉴定引物 ADH1-m-CF:TGGGAGAGAATGTTAAAGGT(SEQ ID NO.:123)和ADH1-m-CR：TGACGGTCGTTAACTAAGAT(SEQID NO.:124)对样品进行PCR检测。PCR结果阳性并经测序鉴定的细胞株，确定为阳性细胞株并分别命名为ADH1 H124K和ADH1 H124R。
实施例6 通过CRISPR/Cas9同时定点突变ADH1 H47和H124位点
6.1 KlADH1 CRISPR gRNA序列确定
根据在KlADH1设计的点突变，选择PAM序列(NGG)，并确定对应的gRNA序列。本实施例中gRNA选择的原则为：靠近设计的突变位点，GC含量适中(40%-60%)，避免poly T结构的存在。在本实施例中，KlADH1 gRNA1序列为TGGGTGAAAACGTCAAGGGC(SEQ ID NO.:125)。
质粒构建及转化方法如下：使用引物pCas9-KlADH1-gRNA1-PF：TGGGTGAAAACGTCAAGGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO.:126)和pCas9-KlADH1-gRNA1-PR：GCCCTTGACGTTTTCACCCAAAAGTCCCATTCGCCACCCG(SEQ ID NO.:127)，以pCAS质粒为模板，进行PCR扩增。取扩增产物17 µL，加入1 µL Dpn I，2 µL 10 × digestion buffer，混匀后37 oC温浴3 h。取Dpn I处理后产物10 µL加入50 µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激45 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取2个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMCas9_StR_KlADH1。
6.2 供体 DNA质粒构建及扩增
为了便于线性供体DNA的保存及扩增，本实施例将供体DNA插入到pKMD1质粒中，并通过PCR扩增得到线性供体DNA序列。
以pKMD1质粒为模板，以引物pKMD1-PF：ATCGTCGACCTGCAGGCATG(SEQ ID NO.:128)和pKMD1-PR：ATCTCTAGAGGATCCCCGGG(SEQ ID NO.:129)进行PCR扩增，取扩增产物17 µL，加入1 µL Dpn I，2 µL 10 × digestion buffer，混匀后37 oC温浴3 h，获得质粒骨架线性片段pKMD1-T。
6.2.1构建供体质粒pKMD1-KlADH1-H47KH124K
以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR1-PF：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG(SEQ ID NO.:130)和KlADH1-H47K-PR：aGCaTGaAggTCaGTtTtACAGACACCGGAGTACTTGACG(SEQ ID NO.:131)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47KH124K-F1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H47K-PF：GTaAaACtGAccTtCAtGCtTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG(SEQ ID NO.:132)和KlADH1-gRNA1-m-PR：CCAaCCtTTaACaTTcTCtCCCATAGCAACAACGACACCAG(SEQ ID NO.:133)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47KH124K-F2；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-gRNA1-m-PF：GGGaGAgAAtGTtAAaGGtTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG(SEQ ID NO.:134)和KlADH1-H124K-PR：CCaTCtTttGTaTAtCCactCAAGTCAGCTTCTGGACAGTTGG(SEQ ID NO.:135)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47KH124K-F3；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H124K-PF：CTTGagtGGaTAtACaaAaGAtGGTTCTTTCCAACAATACGCTACTGC(SEQ ID NO.:136)和KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC(SEQ ID NO.:137)进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47KH124K-F4。
将扩增产物KlADH1-H47KH124K-F1、KlADH1-H47KH124K-F2、KlADH1-H47KH124K-F3、KlADH1-H47KH124K-F4、pKMD1-T各1 µL，加入5 µL Cloning Mix，混匀后50 oC水浴1 h。水浴结束后置于冰上2 min，将10 µL反应液全部加入50 µL Trans-T1感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激30 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-KlADH1-H47KH124K。
6.2.2构建供体质粒pKMD1-KlADH1-H47NH124K
以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR1-PF：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG（SEQ ID NO.:138）和KlADH1-H47N-PR：aGCaTGaAggTCaGTaTtACAGACACCGGAGTACTTGACG（SEQ ID NO.:139）进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47NH124K-F1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H47N-PF：GTaAtACtGAccTtCAtGCtTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG（SEQ ID NO.:140）和KlADH1-gRNA1-m-PR：CCAaCCtTTaACaTTcTCtCCCATAGCAACAACGACACCAG（SEQ ID NO.:141）进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47NH124K-F2；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-gRNA1-m-PF：GGGaGAgAAtGTtAAaGGtTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG（SEQ ID NO.:142）和KlADH1-H124K-PR：CCaTCtTttGTaTAtCCactCAAGTCAGCTTCTGGACAGTTGG（SEQ ID NO.:143）进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47NH124K-F3；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H124K-PF：CTTGagtGGaTAtACaaAaGAtGGTTCTTTCCAACAATACGCTACTGC（SEQ ID NO.:144）和KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC（SEQ ID NO.:145）进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47NH124K-F4。
将扩增产物KlADH1-H47NH124K-F1、KlADH1-H47NH124K-F2、KlADH1-H47NH124K-F3、KlADH1-H47NH124K-F4、pKMD1-T各1 µL，加入5 µL Cloning Mix，混匀后50 oC水浴1 h。水浴结束后置于冰上2 min，将10 µL反应液全部加入50 µL Trans-T1感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激30 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-KlADH1-H47NH124K。
6.2.3构建供体质粒pKMD1-KlADH1-H47QH124K
以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR1-PF：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG（SEQ ID NO.:146）和KlADH1-H47Q-PR：aGCaTGaAggTCaGTtTGACAGACACCGGAGTACTTGACG（SEQ ID NO.:147）进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47QH124K-F1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H47Q-PF：GTCAaACtGAccTtCAtGCtTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG（SEQ ID NO.:148）和KlADH1-gRNA1-m-PR：CCAaCCtTTaACaTTcTCtCCCATAGCAACAACGACACCAG（SEQ ID NO.:149）进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47QH124K-F2；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-gRNA1-m-PF：GGGaGAgAAtGTtAAaGGtTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG（SEQ ID NO.:150）和KlADH1-H124K-PR：CCaTCtTttGTaTAtCCactCAAGTCAGCTTCTGGACAGTTGG（SEQ ID NO.:151）进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47QH124K-F3；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H124K-PF：CTTGagtGGaTAtACaaAaGAtGGTTCTTTCCAACAATACGCTACTGC（SEQ ID NO.:152）和KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC（SEQ ID NO.:153）进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47QH124K-F4。
将扩增产物KlADH1-H47QH124K-F1、KlADH1-H47QH124K-F2、KlADH1-H47QH124K-F3、KlADH1-H47QH124K-F4、pKMD1-T各1 µL，加入5 µL Cloning Mix，混匀后50 oC水浴1 h。水浴结束后置于冰上2 min，将10 µL反应液全部加入50 µL Trans-T1感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激30 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-KlADH1-H47QH124K。
6.2.4构建供体质粒pKMD1-KlADH1-H47RH124K
以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-HR1-PF：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG（SEQ ID NO.:154）和KlADH1-H47R-PR：aGCaTGaAggTCaGTtctACAGACACCGGAGTACTTGACG（SEQ ID NO.:155）进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47RH124K-F1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H47R-PF：GTagaACtGAccTtCAtGCtTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG（SEQ ID NO.:156）和KlADH1-gRNA1-m-PR：CCAaCCtTTaACaTTcTCtCCCATAGCAACAACGACACCAG（SEQ ID NO.:157）进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47RH124K-F2；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-gRNA1-m-PF：GGGaGAgAAtGTtAAaGGtTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG（SEQ ID NO.:158）和KlADH1-H124K-PR：CCaTCtTttGTaTAtCCactCAAGTCAGCTTCTGGACAGTTGG（SEQ ID NO.:159）进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47RH124K-F3；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlADH1-H124K-PF：CTTGagtGGaTAtACaaAaGAtGGTTCTTTCCAACAATACGCTACTGC（SEQ ID NO.:160）和KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC（SEQ ID NO.:161）进行PCR扩增，产物名为KlADH1-H47RH124K-F4。
将扩增产物KlADH1-H47RH124K-F1、KlADH1-H47RH124K-F2、KlADH1-H47RH124K-F3、KlADH1-H47RH124K-F4、pKMD1-T各1 µL，加入5 µL Cloning Mix，混匀后50 oC水浴1 h。水浴结束后置于冰上2 min，将10 µL反应液全部加入50 µL Trans-T1感受态细胞中，冰上放置30 min，42 oC热激30 s后，加入1 mL LB液体培养基37 oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37 oC倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKMD1-KlADH1-H47RH124K。
6.3 K. lactis电转化(同实施例2.3)
6.4 阳性鉴定
在细胞转化后的平板上挑取12-24个单克隆，以细胞为模板，用鉴定引物 ADH1-m-CF:TGGGAGAGAATGTTAAAGGT（SEQ ID NO.:162）和ADH1-m-CR：TGACGGTCGTTAACTAAGAT（SEQID NO.:163）对样品进行PCR检测。PCR结果阳性并经测序鉴定的细胞株，确定为阳性细胞株并分别命名为ADH1 H47KH124K、ADH1 H47NH124K、ADH1 H47QH124K和ADH1 H47RH124K。
实施例7 KlADH1改造细胞株的内源蛋白对Ni介质结合能力的分析
7.1 蛋白纯化体系的试剂配制
Binding buffer: 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM咪唑，pH 7.9。
Wash buffer: 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 60 mM咪唑，pH 7.9。
7.2 KlADH1改造细胞株内源蛋白的纯化和Ni介质结合能力的分析
用binding buffer对Ni-NTA beads进行平衡；加入适量KlADH1改造细胞株的细胞裂解液，4 ℃孵育60 min；用wash buffer洗涤beads；去除wash buffer后加入少许loadingbuffer于96 ℃处理5 min。取上述样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
实施例8 体外蛋白质合成体系
8.1 体外蛋白质合成体系的储存液配制
终浓度为22 mM pH为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，30-150 mM醋酸钾，1.0-5.0 mM醋酸镁，1.5-4 mM核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸)，0.08-0.24 mM的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，25 mM磷酸肌酸，1.7 mM二硫苏糖醇，0.27 mg/mL磷酸肌酸激酶，0.027-0.054 mg/mL T7 RNA 聚合酶，1% - 4% 的聚乙二醇，0.5% - 2% 的蔗糖，最后加入50 %体积的细胞提取物。
8.2 体外蛋白质合成反应
将上述的反应体系放置在20-30 ℃的环境中，静置反应2-12 h；
增强型绿色荧光蛋白(eGFP)活性测定：反应若干小时后，在96孔白板或384孔白板中加入10 µL反应液，立即放置于Envision 2120多功能酶标仪(Perkin Elmer), 读数，检测增强型绿色荧光蛋白活性，相对荧光单位值(Relative Fluorescence Unit，RFU)作为活性单位，如图24所示。
实施例9 体外蛋白质合成纯化
9.1 体外蛋白质合成
鉴于相较于野生型来说，ΔADH1细胞株的无细胞体系转录翻译活性明显降低，而ADH1 H47K细胞株无明显变化，ADH1 H47K因此成为我们研究体外蛋白合成材料。在ADH1H47K细胞株的无细胞转录翻译体系中加入N-His8-eGFP和N-His8-Strep-GFP的模板，将上述的反应体系放置在20-30 ℃的环境中，静置反应2-12 h。
9.2 体外蛋白质纯化
用binding buffer对Ni-NTA beads进行平衡；加入适量上述反应体系，4 ℃孵育60 min；用wash buffer洗涤beads；去除wash buffer后加入少许loading buffer于96 ℃处理5 min。取上述样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果如图25所示。
本发明实施例结果表明：
本发明实施例7的结果表明：与野生型细胞株相比，本发明的改造细胞株与Ni介质的亲和力均有明显降低。
其中，细胞株如ΔADH1，ADH1 H47K，ADH1 H47N，ADH1 H51R，ADH1 H124K, ADH1H47KH124K和ADH1 H47NH124K与Ni介质的亲和力最低。
ΔADH1，ADH1 H47K，ADH1 H47N，ADH1 H51R，ADH1 H124K, ADH1 H47KH124K和ADH1H47NH124K与Ni介质的亲和力相近，本发明从中选取ΔADH1和ADH1 H47K进行无细胞体系转录翻译活性的分析。
结果如图24所示，野生型无细胞体系转录翻译活性的相对荧光单位值为442 RFU，ΔADH1的相对荧光单位值为12 RFU，相对于野生型显著降低，说明ADH1基因敲除对无细胞体系转录翻译活性有较大的负面影响。而ADH1 H47K的相对荧光单位值为419 RFU，相对于野生型来说没有明显变化。
采用相同方法，对其他突变细胞株进行无细胞体系转录翻译活性的分析，结果表明，其他突变细胞株的无细胞体系转录翻译活性的相对荧光单位值为300-400 RFU，与野生型的无细胞体系转录翻译活性的相对荧光单位值相当。
此外，本发明对外源蛋白N-His8-eGFP和N-His8-Strep-eGFP在KlADH1 H47K的无细胞转录翻译体系中的表达纯度进行了分析，结果如图25所示，相对于野生型细胞株WT，KlADH1 H47K细胞株在37 kD处所示的ADH1蛋白条带明显减弱，说明外源蛋白N-His8-eGFP和N-His8-Strep-eGFP的纯度在KlADH1 H47K的无细胞转录翻译体系中得到明显提升。
对其他突变细胞株用同样方法进行纯度分析，结果表明，相对于野生型细胞株WT，外源蛋白N-His8-eGFP和N-His8-Strep-eGFP的纯度在其他突变细胞株的无细胞转录翻译体系中也得到明显提升。
以上所有结果说明，本发明对ADH家族蛋白进行的定点突变既可以降低其与Ni介质结合的能力，又不影响该菌株的无细胞体系转录翻译活性，更可有效提高外源蛋白在该细胞株无细胞体系转录翻译活性中的表达纯度。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 康码（上海）生物科技有限公司
<120> ADH蛋白家族突变体及其应用
<130> P2018-0635
<141> 2018-05-31
<160> 164
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 350
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 1
Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr
35 40 45
Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser
100 105 110
Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu
195 200 205
Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly
225 230 235 240
Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu
245 250 255
Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile
305 310 315 320
His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu
325 330 335
Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 2
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Lys Thr
35 40 45
Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser
100 105 110
Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu
195 200 205
Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly
225 230 235 240
Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu
245 250 255
Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile
305 310 315 320
His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu
325 330 335
Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 3
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Asn Thr
35 40 45
Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser
100 105 110
Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu
195 200 205
Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly
225 230 235 240
Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu
245 250 255
Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile
305 310 315 320
His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu
325 330 335
Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 4
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Gln Thr
35 40 45
Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser
100 105 110
Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu
195 200 205
Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly
225 230 235 240
Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu
245 250 255
Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile
305 310 315 320
His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu
325 330 335
Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 5
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Arg Thr
35 40 45
Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser
100 105 110
Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu
195 200 205
Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly
225 230 235 240
Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu
245 250 255
Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile
305 310 315 320
His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu
325 330 335
Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 6
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr
35 40 45
Asp Leu Lys Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser
100 105 110
Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu
195 200 205
Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly
225 230 235 240
Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu
245 250 255
Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile
305 310 315 320
His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu
325 330 335
Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 7
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr
35 40 45
Asp Leu Arg Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser
100 105 110
Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu
195 200 205
Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly
225 230 235 240
Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu
245 250 255
Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile
305 310 315 320
His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu
325 330 335
Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 8
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr
35 40 45
Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser
100 105 110
Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu
195 200 205
Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly
225 230 235 240
Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu
245 250 255
Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile
305 310 315 320
His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu
325 330 335
Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 9
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr
35 40 45
Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser
100 105 110
Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Arg Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu
195 200 205
Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly
225 230 235 240
Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu
245 250 255
Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile
305 310 315 320
His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu
325 330 335
Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 10
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Lys Thr
35 40 45
Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser
100 105 110
Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu
195 200 205
Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly
225 230 235 240
Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu
245 250 255
Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile
305 310 315 320
His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu
325 330 335
Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 11
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Asn Thr
35 40 45
Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser
100 105 110
Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu
195 200 205
Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly
225 230 235 240
Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu
245 250 255
Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile
305 310 315 320
His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu
325 330 335
Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 12
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Gln Thr
35 40 45
Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser
100 105 110
Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu
195 200 205
Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly
225 230 235 240
Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu
245 250 255
Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile
305 310 315 320
His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu
325 330 335
Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 13
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Arg Thr
35 40 45
Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser
100 105 110
Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu
195 200 205
Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly
225 230 235 240
Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu
245 250 255
Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile
305 310 315 320
His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu
325 330 335
Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 14
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60
ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120
aagtactccg gtgtctgtaa aactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180
accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240
aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300
atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360
ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420
aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480
gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540
gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600
ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660
ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720
ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780
tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840
tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900
agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960
cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020
gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053
<210> 15
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60
ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120
aagtactccg gtgtctgtaa tactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180
accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240
aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300
atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360
ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420
aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480
gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540
gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600
ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660
ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720
ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780
tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840
tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900
agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960
cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020
gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053
<210> 16
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60
ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120
aagtactccg gtgtctgtca aactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180
accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240
aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300
atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360
ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420
aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480
gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540
gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600
ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660
ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720
ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780
tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840
tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900
agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960
cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020
gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053
<210> 17
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60
ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120
aagtactccg gtgtctgtag aactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180
accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240
aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300
atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360
ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420
aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480
gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540
gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600
ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660
ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720
ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780
tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840
tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900
agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960
cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020
gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053
<210> 18
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60
ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120
aagtactccg gtgtctgtca tactgacctt aaagcttgga agggtgactg gcctttgcca 180
accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240
aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300
atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360
ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420
aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480
gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540
gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600
ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660
ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720
ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780
tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840
tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900
agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960
cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020
gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053
<210> 19
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60
ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120
aagtactccg gtgtctgtca tactgacctt agagcttgga agggtgactg gcctttgcca 180
accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240
aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300
atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360
ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420
aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480
gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540
gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600
ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660
ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720
ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780
tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840
tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900
agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960
cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020
gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053
<210> 20
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60
ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120
aagtactccg gtgtctgtca caccgatttg cacgcatgga agggtgactg gcctttgcca 180
accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240
aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300
atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgagt 360
ggatatacaa aagatggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420
aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480
gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540
gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600
ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660
ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720
ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780
tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840
tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900
agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960
cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020
gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053
<210> 21
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60
ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120
aagtactccg gtgtctgtca caccgatttg cacgcatgga agggtgactg gcctttgcca 180
accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240
aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300
atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgagt 360
ggatatacaa gagatggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420
aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480
gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540
gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600
ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660
ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720
ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780
tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840
tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900
agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960
cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020
gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053
<210> 22
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60
ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120
aagtactccg gtgtctgtaa aactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180
accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240
aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300
atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgagt 360
ggatatacaa aagatggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420
aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480
gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540
gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600
ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660
ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720
ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780
tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840
tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900
agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960
cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020
gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053
<210> 23
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60
ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120
aagtactccg gtgtctgtaa tactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180
accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240
aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300
atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgagt 360
ggatatacaa aagatggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420
aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480
gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540
gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600
ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660
ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720
ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780
tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840
tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900
agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960
cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020
gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053
<210> 24
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60
ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120
aagtactccg gtgtctgtca aactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180
accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240
aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300
atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgagt 360
ggatatacaa aagatggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420
aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480
gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540
gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600
ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660
ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720
ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780
tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840
tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900
agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960
cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020
gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053
<210> 25
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60
ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120
aagtactccg gtgtctgtag aactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180
accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240
aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300
atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgagt 360
ggatatacaa aagatggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420
aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480
gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540
gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600
ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660
ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720
ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780
tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840
tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900
agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960
cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020
gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053
<210> 26
<211> 348
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 26
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Asn Gly
1 5 10 15
Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn
20 25 30
Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu
35 40 45
His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro Leu Val
50 55 60
Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu Asn Val
65 70 75 80
Lys Gly Trp Asn Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser Asn Cys
100 105 110
Pro Asp Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln
115 120 125
Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Arg Ile Pro Lys Gly Thr
130 135 140
Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asp Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ala Cys Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Ile Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Thr Gly Ala Glu Lys Ala
195 200 205
Lys Leu Phe Lys Glu Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Val Asp Tyr Ala Val
210 215 220
Ser Lys Asp Leu Ile Lys Glu Ile Val Asp Ala Thr Asn Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu Gln Ser
245 250 255
Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly Leu Pro
260 265 270
Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Thr Gln Val Val Lys Ser
275 280 285
Val Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val His Ala Pro Ile Lys Ile
305 310 315 320
Val Gly Leu Ser Glu Leu Ala Asp Val Tyr Asp Lys Met Val Lys Gly
325 330 335
Glu Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345
<210> 27
<211> 374
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 27
Met Leu Arg Leu Thr Ser Ala Arg Ser Ile Val Ser Pro Leu Arg Lys
1 5 10 15
Gly Ala Phe Gly Ser Ile Arg Thr Leu Ala Thr Ser Val Pro Glu Thr
20 25 30
Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Asn Gly Gly Lys Leu Glu Tyr Lys
35 40 45
Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Pro Asn Glu Ile Leu Ile Asn Val
50 55 60
Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp
65 70 75 80
Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala
85 90 95
Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu Asn Val Lys Gly Trp Asn Ile Gly
100 105 110
Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu
115 120 125
Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser Asn Cys Pro Asp Ala Asp Leu Ser
130 135 140
Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala
145 150 155 160
Val Gln Ala Ala Arg Ile Pro Lys Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala
165 170 175
Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala
180 185 190
Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly
195 200 205
Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val
210 215 220
Val Gly Ile Asp Gly Gly Glu Glu Lys Gly Lys Leu Val Lys Gln Leu
225 230 235 240
Gly Gly Glu Ala Phe Val Asp Phe Thr Lys Thr Lys Asp Met Val Ala
245 250 255
Glu Ile Gln Glu Ile Thr Asn Gly Gly Pro His Gly Val Ile Asn Val
260 265 270
Ser Val Ser Glu Ala Ala Met Asn Ala Ser Thr Gln Phe Val Arg Pro
275 280 285
Thr Gly Thr Val Val Leu Val Gly Leu Pro Ala Gly Ala Val Ile Lys
290 295 300
Ser Glu Val Phe Ser His Val Val Lys Ser Ile Asn Ile Lys Gly Ser
305 310 315 320
Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu Ala Ile Asn Phe Phe Ala
325 330 335
Asn Gly His Val His Ser Pro Ile Lys Val Val Gly Leu Ser Glu Leu
340 345 350
Pro Lys Val Tyr Glu Leu Met Glu Gln Gly Lys Ile Leu Gly Arg Tyr
355 360 365
Val Val Asp Thr Ser Asn
370
<210> 28
<211> 375
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 28
Met Phe Arg Leu Ala Arg Ala Gln Thr Ala Leu Ala Asn Lys Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Arg Ser Phe Leu Arg Leu Asn Ser Ser Phe Ala Ile Pro Glu
20 25 30
Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Asn Gly Gly Lys Leu Glu Tyr
35 40 45
Lys Asp Leu Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn Glu Ile Leu Ile Asn
50 55 60
Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala Trp Lys Gly
65 70 75 80
Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val Gly Gly His Glu Gly
85 90 95
Ala Gly Ile Val Val Ala Lys Gly Glu Asn Val Lys Asn Phe Glu Ile
100 105 110
Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys
115 120 125
Glu Leu Cys Glu Gln Gly Tyr Glu Ser Asn Cys Leu Gln Ala Asp Leu
130 135 140
Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp
145 150 155 160
Ala Val Gln Ala Ala Gln Ile Pro Lys Gly Thr Asp Leu Ala Glu Ile
165 170 175
Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Lys Ala Leu Lys Thr
180 185 190
Ala Asp Leu Lys Pro Gly Gln Trp Val Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly
195 200 205
Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys Ala Met Gly Leu Arg
210 215 220
Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Asp Gly Lys Glu Glu Leu Phe Lys Gln
225 230 235 240
Cys Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Arg Lys Ser Lys Asp Met Val
245 250 255
Ala Asp Ile Gln Glu Ala Thr Asn Gly Gly Pro His Gly Val Ile Asn
260 265 270
Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Ser Met Ser Thr Glu Tyr Val Arg
275 280 285
Pro Thr Gly Val Val Val Leu Val Gly Leu Pro Ala Asp Ala Tyr Val
290 295 300
Lys Ser Glu Val Phe Ser His Val Val Lys Ser Ile Ser Ile Lys Gly
305 310 315 320
Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu Ala Thr Asp Phe Phe
325 330 335
Thr Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Ile Ile Gly Leu Ser Glu
340 345 350
Leu Pro Glu Ala Tyr Glu Leu Met Glu Gln Gly Lys Ile Leu Gly Arg
355 360 365
Phe Val Val Asp Thr Tyr Lys
370 375
<210> 29
<211> 1047
<212> DNA
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 29
atgtccattc ctgaaactca aaagggtgtt atcttttacg aaaacggtgg tgaattgcaa 60
tacaaggaca ttccagttcc aaagccaaag gccaacgaac ttttgatcaa cgtcaagtac 120
tccggtgtct gtcacaccga tttgcacgca tggaagggtg actggccttt gccaaccaaa 180
ttgccattag ttggtggtca cgaaggtgct ggtgtcgttg ttgctatggg tgaaaatgtc 240
aagggctgga acattggtga ctttgctggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatgtcc 300
tgtgaatact gtgaattgtc caatgaatcc aactgtcccg atgctgactt gtctggttac 360
acccacgatg gttctttcca acaatatgct accgctgatg ccgttcaagc tgctagaatt 420
ccaaagggta ccgatttggc tgaagttgct ccaattctat gtgccggtgt taccgtttac 480
aaggctctaa aatctgctga cttgaaggcc ggtgactggg ttgccatttc cggtgcctgt 540
ggtggtctag gttctttggc tatccaatac gccaaggcta tgggttacag agtcttgggt 600
attgataccg gtgctgaaaa ggctaagttg ttcaaggagc taggtggtga atacttcgtc 660
gattatgccg tctctaagga tttgattaaa gaaattgttg acgctactaa cggtggtgcc 720
cacggtgtca ttaacgtctc tgtctccgaa tttgctatag aacaatccac caattacgtt 780
agatcaaacg gtaccgttgt attggtcggt ctaccaaggg acgccaaatg taagtctgat 840
gtctttacac aagttgtcaa atcggtctcc attgttggtt cttacgtcgg taacagagct 900
gacaccagag aagctctaga tttcttcgca agaggtttag tgcatgctcc aattaagata 960
gtcggattat ctgaattggc agatgtttat gacaagatgg tcaagggtga aatcgttggt 1020
agatacgttg tcgacacctc aaaataa 1047
<210> 30
<211> 1125
<212> DNA
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 30
atgttgagat tgacttccgc cagatccatt gtttccccat tgcgtaaggg tgcttttggt 60
tccatcagaa ccttagctac ctctgtgcca gaaacccaaa agggtgttat tttctatgag 120
aatggtggta aattggaata caaggacatt ccagttccaa agccaaagcc aaatgaaatc 180
ttgatcaacg tcaagtactc cggtgtgtgt cataccgatt tgcacgcatg gaagggtgac 240
tggccattgc caaccaagtt gccattggtc ggtggtcacg aaggtgctgg tgtcgttgtt 300
gctatgggtg aaaacgtcaa gggctggaac attggtgact ttgcgggtat caaatggttg 360
aacggttctt gtatgtcctg tgaatactgt gaattgtcca atgaatccaa ctgtccagat 420
gctgacttgt ctggttacac ccacgatggt tctttccaac aatacgctac cgcagatgct 480
gttcaagctg ccagaattcc aaagggtacc gatttggctg aagttgctcc aattctatgt 540
gccggtgtta ctgtttacaa ggctttgaaa agtgctaact tgaaggctgg tgactgggtt 600
gccatctctg gtgctgctgg tggtctaggt tctctagctg tccaatacgc caaggccatg 660
ggttacagag tcgttggtat cgacggtggt gaagaaaagg gtaagttggt caagcaattg 720
ggtggtgaag cctttgttga tttcaccaaa accaaggaca tggttgctga aatccaagaa 780
atcaccaacg gtggtccaca cggtgtcatt aacgtctctg tttctgaagc tgccatgaac 840
gcttccactc aattcgtcag accaactggt actgtcgtat tggtcggttt gccagctggt 900
gccgtcatca agtccgaagt cttctcccac gtcgttaagt ctattaacat caagggttct 960
tacgtcggta acagagctga caccagagaa gctatcaact tcttcgctaa cggtcacgtc 1020
cactctccaa tcaaggttgt tggtttgtcc gaactaccaa aggtttacga attgatggaa 1080
caaggtaaga ttttgggtag atacgttgtt gacacctcca actag 1125
<210> 31
<211> 1128
<212> DNA
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 31
atgttcagat tagcccgtgc ccaaactgct ctagcgaaca aagcttctgt ttccagaagc 60
tttttgagat taaactcttc tttcgctatc ccagaaactc aaaagggtgt tatcttctac 120
gaaaatggtg gtaagttgga atacaaggat ttgccagttc caaagccaaa ggctaacgaa 180
attttgatta acgttaagta ctccggtgtt tgtcacaccg atttgcacgc ctggaagggt 240
gactggccat tgccagttaa attgccatta gtcggtggtc acgaaggtgc tggtatcgtt 300
gttgccaagg gtgaaaacgt taagaacttc gaaattggtg attacgctgg tatcaagtgg 360
ttgaacggtt cttgtatgtc ttgtgaattg tgtgaacaag gttacgaatc taactgtttg 420
caagctgact tgtctggtta cacccatgac ggttctttcc aacaatacgc taccgctgat 480
gccgttcaag ctgctcaaat tccaaagggt accgatttgg ctgaaatcgc cccaatcttg 540
tgtgccggtg ttaccgttta caaggctttg aagaccgctg acttgaaacc aggccaatgg 600
gttgctatct ccggtgctgc cggtggttta ggttcccttg ctgtgcaata cgccaaggcc 660
atgggtttga gagtcctagg tattgacggt ggtgatggta aggaagaatt gttcaagcaa 720
tgtggtggtg aagtcttcat cgacttcaga aagtctaagg acatggtcgc cgatatccaa 780
gaagctacca acggtggtcc tcacggtgtc attaacgtct ccgtctccga ggctgctatc 840
tccatgtcta ccgaatacgt tagaccaacc ggtgttgttg tcttggtcgg tttgccagct 900
gacgcttacg tcaagtccga agtcttctcc cacgtcgtta agtccatctc catcaagggt 960
tcttacgtcg gtaacagagc tgacaccaga gaagccaccg acttcttcac cagaggtttg 1020
gtcaagtctc caatcaagat catcggtcta tctgaattgc cagaagctta tgaactaatg 1080
gaacaaggta agatcttggg tagattcgtc gttgacactt acaaataa 1128
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 32
Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg
1 5
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 33
Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly Leu Pro Arg
1 5 10
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 34
Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg
1 5 10
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 35
Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe Thr Lys
1 5 10
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 36
Gly Val Ile Phe Tyr Glu Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys
1 5 10
<210> 37
<211> 21
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 37
Leu Pro Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met
1 5 10 15
Gly Glu Asn Val Lys
20
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 38
Ala Pro Ile His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Lys
<210> 39
<211> 24
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 39
Gly Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile
1 5 10 15
Glu Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg
20
<210> 40
<211> 23
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 40
Ala Gly Asp Trp Val Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser
1 5 10 15
Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
20
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 41
Gly Val Ile Phe Tyr Glu Asn Gly Gly Lys Leu Glu Tyr Lys
1 5 10
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 42
Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val Lys
1 5
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 43
Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys
1 5 10
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 44
Ala Asn Glu Ile Leu Ile Asn Val Lys
1 5
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 45
tgggtgaaaa cgtcaagggc 20
<210> 46
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 46
tgggtgaaaa cgtcaagggc gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 47
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 47
gcccttgacg ttttcaccca aaagtcccat tcgccacccg 40
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 48
atcgtcgacc tgcaggcatg 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 49
atctctagag gatccccggg 20
<210> 50
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 50
tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atcatggaca atacgttacc gagatgagg 59
<210> 51
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 51
gaagagattt catttatctt tttttagtat agagtttgtg tgtttaaagc ttg 53
<210> 52
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 52
caaactctat actaaaaaaa gataaatgaa atctcttccg cattcaagtc atgac 55
<210> 53
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 53
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tcttatactg ggtagatttc aaacgggac 59
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 54
gtgatggaac acgggaatag 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 55
cacatatacc ttggcagtag 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 56
tgggtgaaaa cgtcaagggc 20
<210> 57
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 57
tgggtgaaaa cgtcaagggc gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 58
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 58
gcccttgacg ttttcaccca aaagtcccat tcgccacccg 40
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 59
atcgtcgacc tgcaggcatg 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 60
atctctagag gatccccggg 20
<210> 61
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 61
tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atcatggaca atacgttacc gagatgagg 59
<210> 62
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 62
agcatgaagg tcagttttac agacaccgga gtacttgacg 40
<210> 63
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 63
gtaaaactga ccttcatgct tggaagggtg actggccttt g 41
<210> 64
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 64
ccaaccttta acattctctc ccatagcaac aacgacacca g 41
<210> 65
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 65
gggagagaat gttaaaggtt ggaagattgg tgacttcgct gg 42
<210> 66
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 66
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tcttatactg ggtagatttc aaacgggac 59
<210> 67
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 67
tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atcatggaca atacgttacc gagatgagg 59
<210> 68
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 68
agcatgaagg tcagtattac agacaccgga gtacttgacg 40
<210> 69
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 69
gtaatactga ccttcatgct tggaagggtg actggccttt g 41
<210> 70
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 70
ccaaccttta acattctctc ccatagcaac aacgacacca g 41
<210> 71
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 71
gggagagaat gttaaaggtt ggaagattgg tgacttcgct gg 42
<210> 72
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 72
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tcttatactg ggtagatttc aaacgggac 59
<210> 73
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 73
tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atcatggaca atacgttacc gagatgag 58
<210> 74
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 74
agcatgaagg tcagtttgac agacaccgga gtacttgacg 40
<210> 75
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 75
gtcaaactga ccttcatgct tggaagggtg actggccttt g 41
<210> 76
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 76
ccaaccttta acattctctc ccatagcaac aacgacacca g 41
<210> 77
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 77
gggagagaat gttaaaggtt ggaagattgg tgacttcgct gg 42
<210> 78
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 78
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tcttatactg ggtagatttc aaacgggac 59
<210> 79
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 79
tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atcatggaca atacgttacc gagatgag 58
<210> 80
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 80
agcatgaagg tcagttctac agacaccgga gtacttgacg 40
<210> 81
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 81
gtagaactga ccttcatgct tggaagggtg actggccttt g 41
<210> 82
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 82
ccaaccttta acattctctc ccatagcaac aacgacacca g 41
<210> 83
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 83
gggagagaat gttaaaggtt ggaagattgg tgacttcgct gg 42
<210> 84
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 84
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tcttatactg ggtagatttc aaacgggac 59
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 85
tgggagagaa tgttaaaggt 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 86
tgacggtcgt taactaagat 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 87
tgggtgaaaa cgtcaagggc 20
<210> 88
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 88
tgggtgaaaa cgtcaagggc gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 89
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 89
gcccttgacg ttttcaccca aaagtcccat tcgccacccg 40
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 90
atcgtcgacc tgcaggcatg 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 91
atctctagag gatccccggg 20
<210> 92
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 92
tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atcatggaca atacgttacc gagatgagg 59
<210> 93
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 93
ccaagcttta aggtcagtat gacagacacc ggagtacttg acg 43
<210> 94
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 94
gtcatactga ccttaaagct tggaagggtg actggccttt g 41
<210> 95
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 95
ccaaccttta acattctctc ccatagcaac aacgacacca g 41
<210> 96
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 96
gggagagaat gttaaaggtt ggaagattgg tgacttcgct gg 42
<210> 97
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 97
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tcttatactg ggtagatttc aaacgggac 59
<210> 98
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 98
tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atcatggaca atacgttacc gagatgagg 59
<210> 99
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 99
ccaagctcta aggtcagtat gacagacacc ggagtacttg acg 43
<210> 100
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 100
gtcatactga ccttagagct tggaagggtg actggccttt g 41
<210> 101
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 101
ccaaccttta acattctctc ccatagcaac aacgacacca g 41
<210> 102
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 102
gggagagaat gttaaaggtt ggaagattgg tgacttcgct gg 42
<210> 103
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 103
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tcttatactg ggtagatttc aaacgggac 59
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 104
tgggagagaa tgttaaaggt 20
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 105
tgacggtcgt taactaagat 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 106
tgggtgaaaa cgtcaagggc 20
<210> 107
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 107
tgggtgaaaa cgtcaagggc gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 108
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 108
gcccttgacg ttttcaccca aaagtcccat tcgccacccg 40
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 109
atcgtcgacc tgcaggcatg 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 110
atctctagag gatccccggg 20
<210> 111
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 111
tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atcatggaca atacgttacc gagatgagg 59
<210> 112
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 112
ccaaccttta acattctctc ccatagcaac aacgacacca g 41
<210> 113
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 113
gggagagaat gttaaaggtt ggaagattgg tgacttcgct gg 42
<210> 114
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 114
ccatcttttg tatatccact caagtcagct tctggacagt tgg 43
<210> 115
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 115
cttgagtgga tatacaaaag atggttcttt ccaacaatac gctactgc 48
<210> 116
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 116
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tcttatactg ggtagatttc aaacgggac 59
<210> 117
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 117
tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atcatggaca atacgttacc gagatgagg 59
<210> 118
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 118
ccaaccttta acattctctc ccatagcaac aacgacacca g 41
<210> 119
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 119
gggagagaat gttaaaggtt ggaagattgg tgacttcgct gg 42
<210> 120
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 120
ccatctcttg tatatccact caagtcagct tctggacagt tgg 43
<210> 121
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 121
cttgagtgga tatacaagag atggttcttt ccaacaatac gctactgc 48
<210> 122
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 122
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tcttatactg ggtagatttc aaacgggac 59
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 123
tgggagagaa tgttaaaggt 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 124
tgacggtcgt taactaagat 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 125
tgggtgaaaa cgtcaagggc 20
<210> 126
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 126
tgggtgaaaa cgtcaagggc gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 127
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 127
gcccttgacg ttttcaccca aaagtcccat tcgccacccg 40
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 128
atcgtcgacc tgcaggcatg 20
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 129
atctctagag gatccccggg 20
<210> 130
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 130
tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atcatggaca atacgttacc gagatgagg 59
<210> 131
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 131
agcatgaagg tcagttttac agacaccgga gtacttgacg 40
<210> 132
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 132
gtaaaactga ccttcatgct tggaagggtg actggccttt g 41
<210> 133
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 133
ccaaccttta acattctctc ccatagcaac aacgacacca g 41
<210> 134
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 134
gggagagaat gttaaaggtt ggaagattgg tgacttcgct gg 42
<210> 135
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 135
ccatcttttg tatatccact caagtcagct tctggacagt tgg 43
<210> 136
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 136
cttgagtgga tatacaaaag atggttcttt ccaacaatac gctactgc 48
<210> 137
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 137
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tcttatactg ggtagatttc aaacgggac 59
<210> 138
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 138
tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atcatggaca atacgttacc gagatgagg 59
<210> 139
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 139
agcatgaagg tcagtattac agacaccgga gtacttgacg 40
<210> 140
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 140
gtaatactga ccttcatgct tggaagggtg actggccttt g 41
<210> 141
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 141
ccaaccttta acattctctc ccatagcaac aacgacacca g 41
<210> 142
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 142
gggagagaat gttaaaggtt ggaagattgg tgacttcgct gg 42
<210> 143
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 143
ccatcttttg tatatccact caagtcagct tctggacagt tgg 43
<210> 144
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 144
cttgagtgga tatacaaaag atggttcttt ccaacaatac gctactgc 48
<210> 145
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 145
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tcttatactg ggtagatttc aaacgggac 59
<210> 146
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 146
tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atcatggaca atacgttacc gagatgagg 59
<210> 147
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 147
agcatgaagg tcagtttgac agacaccgga gtacttgacg 40
<210> 148
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 148
gtcaaactga ccttcatgct tggaagggtg actggccttt g 41
<210> 149
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 149
ccaaccttta acattctctc ccatagcaac aacgacacca g 41
<210> 150
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 150
gggagagaat gttaaaggtt ggaagattgg tgacttcgct gg 42
<210> 151
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 151
ccatcttttg tatatccact caagtcagct tctggacagt tgg 43
<210> 152
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 152
cttgagtgga tatacaaaag atggttcttt ccaacaatac gctactgc 48
<210> 153
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 153
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tcttatactg ggtagatttc aaacgggac 59
<210> 154
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 154
tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atcatggaca atacgttacc gagatgagg 59
<210> 155
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 155
agcatgaagg tcagttctac agacaccgga gtacttgacg 40
<210> 156
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 156
gtagaactga ccttcatgct tggaagggtg actggccttt g 41
<210> 157
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 157
ccaaccttta acattctctc ccatagcaac aacgacacca g 41
<210> 158
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 158
gggagagaat gttaaaggtt ggaagattgg tgacttcgct gg 42
<210> 159
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 159
ccatcttttg tatatccact caagtcagct tctggacagt tgg 43
<210> 160
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 160
cttgagtgga tatacaaaag atggttcttt ccaacaatac gctactgc 48
<210> 161
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 161
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tcttatactg ggtagatttc aaacgggac 59
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 162
tgggagagaa tgttaaaggt 20
<210> 163
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 163
tgacggtcgt taactaagat 20
<210> 164
<211> 1053
<212> DNA
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 164
atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60
ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120
aagtactccg gtgtctgtca caccgatttg cacgcatgga agggtgactg gcctttgcca 180
accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggtgaa 240
aacgtcaagg gctggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300
atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360
ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420
aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480
gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540
gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600
ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660
ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720
ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780
tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840
tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900
agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960
cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020
gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053

Claims (7)

1.一种乙醇脱氢酶ADH1 突变蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白为非天然蛋白，并且所述突变蛋白在野生型的乙醇脱氢酶ADH1的对应于SEQ NO.:1的第45-149位氨基酸中的至少1个组氨酸(H)发生突变，所述突变为选自下组之一： H47K,H47N,H47Q,H51R，H124K，H47KH124K, H47NH124K。
2.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的突变蛋白。
3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或酵母细胞，所述宿主细胞含有权利要求3所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
5.一种产生权利要求1所述的乙醇脱氢酶ADH1突变蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞，从而表达乙醇脱氢酶ADH1突变蛋白；和/或
分离所述乙醇脱氢酶ADH1突变蛋白。
6.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含权利要求1所述的乙醇脱氢酶ADH1突变蛋白。
7.一种权利要求1所述的突变蛋白的用途，其特征在于，所述的突变蛋白用于降低突变蛋白与Ni介质的结合能力的酶制剂。
CN201810554584.5A 2018-05-31 2018-05-31 Adh蛋白家族突变体及其应用 Active CN110551700B (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810554584.5A CN110551700B (zh) 2018-05-31 2018-05-31 Adh蛋白家族突变体及其应用
US17/059,416 US20210214693A1 (en) 2018-05-31 2019-05-28 Adh protein family mutant and use thereof
JP2020566962A JP7342040B6 (ja) 2018-05-31 2019-05-28 Ａｄｈタンパク質ファミリー変異体およびその使用
EP19811465.4A EP3805379A4 (en) 2018-05-31 2019-05-28 MUTANT OF THE ADH PROTEIN FAMILY AND ASSOCIATED USE
KR1020207038030A KR102584789B1 (ko) 2018-05-31 2019-05-28 Adh 단백질 계열 돌연변이 및 이의 용도
PCT/CN2019/088833 WO2019228353A1 (zh) 2018-05-31 2019-05-28 Adh蛋白家族突变体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810554584.5A CN110551700B (zh) 2018-05-31 2018-05-31 Adh蛋白家族突变体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110551700A CN110551700A (zh) 2019-12-10
CN110551700B true CN110551700B (zh) 2022-06-21

Family

ID=68698536

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810554584.5A Active CN110551700B (zh) 2018-05-31 2018-05-31 Adh蛋白家族突变体及其应用

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20210214693A1 (zh)
EP (1) EP3805379A4 (zh)
JP (1) JP7342040B6 (zh)
KR (1) KR102584789B1 (zh)
CN (1) CN110551700B (zh)
WO (1) WO2019228353A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111484998B (zh) 2019-05-30 2023-04-21 康码（上海）生物科技有限公司 体外定量共表达多种蛋白的方法及其应用
CN112111042B (zh) 2019-06-21 2024-04-05 康码（上海）生物科技有限公司 一种生物磁性微球及其制备方法和使用方法
US20230134868A1 (en) 2019-11-30 2023-05-04 Kangma-Healthcode (Shanghai) Biotech Co., Ltd Biomagnetic microsphere and preparation method therefor and use thereof
CN111996206B (zh) * 2020-06-19 2023-01-31 清华大学 光控无细胞蛋白质合成方法、该方法使用的质粒以及使用该方法的产品

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013146236A (ja) * 2012-01-20 2013-08-01 Daicel Corp 有機溶媒耐性型二級アルコール脱水素酵素
US8629255B2 (en) * 2010-05-20 2014-01-14 Ut-Battelle, Llc Nucleic acid molecules conferring enhanced ethanol tolerance and microorganisms having enhanced tolerance to ethanol
CN105861457A (zh) * 2016-05-26 2016-08-17 无锡佰翱得生物科学有限公司 一种酶活提高的乙醇脱氢酶突变体及其制备方法与应用
CN106987623A (zh) * 2017-03-20 2017-07-28 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种焦磷酸测序联合测序法检测酒精代谢基因的引物及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0905249A3 (en) * 1997-09-25 1999-08-04 Smithkline Beecham Corporation Alcohol dehydrogenase
KR101437041B1 (ko) 2012-12-31 2014-09-02 삼성전자 주식회사 숙신산 내성 효모균주를 이용한 숙신산의 제조방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8629255B2 (en) * 2010-05-20 2014-01-14 Ut-Battelle, Llc Nucleic acid molecules conferring enhanced ethanol tolerance and microorganisms having enhanced tolerance to ethanol
JP2013146236A (ja) * 2012-01-20 2013-08-01 Daicel Corp 有機溶媒耐性型二級アルコール脱水素酵素
CN105861457A (zh) * 2016-05-26 2016-08-17 无锡佰翱得生物科学有限公司 一种酶活提高的乙醇脱氢酶突变体及其制备方法与应用
CN106987623A (zh) * 2017-03-20 2017-07-28 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种焦磷酸测序联合测序法检测酒精代谢基因的引物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP7342040B2 (ja) 2023-09-11
US20210214693A1 (en) 2021-07-15
EP3805379A4 (en) 2022-03-02
EP3805379A1 (en) 2021-04-14
JP7342040B6 (ja) 2024-02-21
KR20210016585A (ko) 2021-02-16
CN110551700A (zh) 2019-12-10
KR102584789B1 (ko) 2023-10-05
WO2019228353A1 (zh) 2019-12-05
JP2021525528A (ja) 2021-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110551700B (zh) Adh蛋白家族突变体及其应用
US8900814B2 (en) Variant reverse transcriptase
CN108239633B (zh) 一种催化活性得到提高的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用
WO2017074962A1 (en) Modified cas9 compositions and methods of use
CN110551701B (zh) 羰基还原酶突变体及其在环戊二酮类化合物还原中的应用
AU2020242724B2 (en) Aminoacyl-tRNA synthetase for efficiently introducing lysine derivative in protein
CN110408635B (zh) 一种含有链霉亲和素元件的核酸构建物在蛋白质表达、纯化中的应用
CN110408636B (zh) 多重标签串联的dna序列及其在蛋白质表达纯化系统的应用
CN113481226B (zh) 信号肽相关序列及其在蛋白质合成中的应用
CN111793118B (zh) 一种CheY2突变型蛋白及其应用
CN110938649A (zh) 一种提高外源蛋白表达量的蛋白合成体系及其应用方法
Moore et al. Expression and purification of aspartate β-semialdehyde dehydrogenase from infectious microorganisms
CN108239632B (zh) 一种热稳定性得到改善的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用
CN111575251B (zh) 一种用于达托霉素生物合成的dptC1突变体的构建
US20230332116A1 (en) Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof in production of amino acid
CN112662642B (zh) 突变型鱼大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒逆转录酶及其应用
JP2006320238A (ja) 変異型チロシンフェノール・リアーゼ
JPH0638771A (ja) ヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼ遺伝子の発現方法および該遺伝子との共発現によるポリペプチドの製造方法
CN113249351A (zh) 抗除草剂基因、多肽及其在植物育种中的应用
CN111118065A (zh) 一种真核生物的基因改造方法及其相应的基因工程细胞及应用
CN108624574B (zh) 一种s-腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体及其应用和制法、核酸、表达载体及宿主细胞
CN114381442B (zh) 一种可快速延伸的高保真dna聚合酶及其制备方法和应用
JPH07274970A (ja) 組換えベクターと、この組換えベクターを保持する形 質転換体、およびこの形質転換体による抗菌性ペプチ ドの製造方法
CN116003570A (zh) 热稳定性提高的重组hLIF突变体及其制备方法和应用
CN115094047A (zh) 一种直扩型Bst DNA聚合酶及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant