FI95046C - Menetelmä lämpöstabiilin sytosiinideaminaasin tuottamiseksi - Google Patents

Description

1 95046

Menetelmä lämpöstabiilin svtosiinideaminaasin tuottamiseksi Tämä keksintö koskee yleisesti sytosiinideaminaasi-entsyy-miä. Erityisemmin tämä keksintö koskee lämpöstabiilin sy-5 tosiinideaminaasin, joka on peräisin Saccharomvces cere-visae'sta. puhdistusta ja yhdistelmätuotantoa.

Sytosiinideaminaasi (cDase, EC 3.5.4.1) katalysoi sytosiinin hydrolyysiä urasiiliksi seuraavan reaktion mukaan 10

nh2 O

1 Jl c c

15 CH sytosiinideaminaasi HN CH

I II _____ I II

N.

H H2° h 20 Sytosiini Urasiili (4-amino-2-oksopyrimidiini) (2,4-dioksopyrimidiini)

Entsyymi, jolla on tärkeä osa mikrobien pyrimidiiniaineen-vaihdunnassa (0'Donovan ja Neuhard, 1970), on eristetty 25 useista erilaisista mikro-organismeista, mutta sitä ei näytä olevan läsnä imettäväisten soluissa (Nishiyama et ai., 1985).

Eri organismeista peräisin olevan cDase:n fysikaalisten 30 ominaisuuksien on osoitettu eroavan merkittävästi molekyy- lipainon, stabiilisuuden ja alayksikkökoostumuksen suhteen. Esimerkiksi cDase, joka on peräisin Salmonella tvphimu-rium'sta, on puhdistettu homogeeniseksi (SDS-PAGE: 11a) ja se koostuu 4 alayksiköstä, jotka ovat kukin kooltaan 54 kilo-35 daltonia (kDa) (West et ai., 1982), kun taas Eschericia coli'sta peräisin olevan entsyymin molekyylipaino on 200 kDa ja se koostuu 35-46 kDa:n alayksiköistä (Katsuragi et 2 95046 ai., 1986). Molemmat nämä entsyymit ovat hyvin lärapöstabii-leja ja niiden korkea aktiivisuus pysyy 55’Csssa.

Leipurin hiivaa (Saccharomyces cerevisae) on myös käytetty 5 cDase:n lähteenä. Siitä aikaisemmin saadun cDase:n raolekyy-lipaino on 34 kDa määritettynä geelisuodatuksella (Ipata et ai., 1971, 1978) ja 32-33 kDa määritettynä SDS-PAGE:lla ja aminohappoanalyysillä (Yergatian et ai., 1977). CDase-entsyymi, joka on aikaisemmin eristetty leipurin hiivasta, 10 näyttää siksi olevan monomeerinen proteiini.

Aikaisemmin eristetyt leipurin hiivan cDase:n liuokset säilyttävät aktiivisuutensa ainakin 48 tuntia, kun niitä varastoidaan 4*C:ssa pH:ssa 5-9 (Ipata et ai., 1971, 1978).

15 37*C:ssa kuitenkin raa'an leipurin hiivan cDase-valmisteen on osoitettu hävittävän puolet aktiivisuudestaan yhdessä tunnissa (Kream ja Chargaff, 1952), ja entsyymin puhdistetun muodon puoliintumisaika on 30 minuuttia (Katsuragi, 1988). Puoliintumisaikaa 37*C:ssa voidaan lisätä 28 päivään 20 imraobilisoimalla entsyymi epoksiakryylihelmiin (Katsuragi et ai., 1987). Täten leipurin hiivan cDase.-n lärapöepästa-biilisuus erottaa, alhaisen molekyylipainon ohella, sen bakteerientsyymeistä, joita kuvattiin aikaisemmin.

25 CDasera on käytetty terapeuttisesti esivaiheen, 5-fluo- risytosiinin (5-FC) muuttamiseksi syövänvastaiseksi lääkkeeksi, 5-fluoriurasiiliksi (5-FU) (Katsuragi et ai., 1987; Nishiyama et ai., 1985; Sakai et ai., 1985; Senter et ai., 1987). CDase:n bakteerilähteet ovat kuitenkin sellaiseen 30 käyttöön epäkäytännöllisiä vaatien laajan mittakaavan viljelyä, jotta saataisiin riittävästi aktiivisuutta (Sakai et ai., 1985). Lisäksi mikrobien uutteet voivat aiheuttaa sivuoireita, joita ei haluta, niiden vastaanottajiin.

35 Hiivaa voidaan käyttää cDase:n lähteenä näiden ongelmien voittamiseen. Kuitenkin aikaisemman hiivasta peräisin olevan tuotteen lärapöepästabiilisuus vaatii, että entsyymi on imraobilisoitava ennen sen käyttöä (Katsuragi et ai., 3 · 95046 1987) . Täten lämpöstabiilin hiivan cDase:n eristäminen ja puhdistaminen antaa parannetun entsyymin syävänvastaiseen hoitoon. Samoin lämpöstabiilin cDase:n geenin kloonaaminen sallii määriteltyjen muutosten tai lisäysten tuomisen itse 5 geeniin, sen ilmiasua säätäviin sekvensseihin ja geeni-fuusioihin, jotka on luotu geenin ja muiden molekyylien välillä. Sellainen uusi rakenne lisää entsyymin tehoa tai käyttökelpoisuutta syövänvastaisessa hoidossa.

10 Tämä keksintö perustuu siihen, että on odottamattomasti löydetty lämpöstabiili cDase leipurin hiivasta. Tämän entsyymin aminohapposekvenssien analysointi paljastaa, että ei ole mitään merkittävää homologiaa muiden proteiinien tunnettujen sekvenssien kanssa.

15 Tämä keksintö on kohdistettu eristettyyn nukleotidisek-venssiin, joka koodittaa lämpöstabiilia CDase:a tai proteiinia, joka on toiminnallisesti sitä vastaava ja yhdistel-mäekspressiovektoreihin, jotka käsittävät ja ovat tehokkai- 20 ta ilmentäessään tätä sekvenssiä, isäntäsoluja, jotka on siten transformoitu ja menetelmiä lämpöstabiilin CDase.*n tai sen toiminnallisen ekvivalentin tuottamiseksi yhdistel-mätekniikalla.

25 Tämä keksintö kohdistuu myös eristettyyn, lämpöstabii-liin cDase:een tai proteiiniin, joka on toiminnallisesti sen ekvivalentti. Erityisesti parhaana pidetyssä suoritusmuodossa CDase eristetään Saccharomyces cerevisae’sta.

30 Tämän keksinnön lisäseikat, -edut ja -käytöt ovat ilmeisiä niille, jotka ovat alan ammattilaisia tässä olevan asiasisällön pohjalta.

Piirustuksissa, jotka muodostavat osan tästä selityksestä: 35-

Kuvio 1 esittää CDase.-n SDS-Page-analyysin (14 % polyakryy-liamidia pelkistämättömissä olosuhteissa)'. Kullakin kais-. talla tarkoitetut aineet ovat seuraavat. Kaistat 1 ja 9, - 95046 4 inarkkeriproteiinit; kaista 2, autolyysineste esimerkin 1 vaiheesta 1; kaista 3, tuote esimerkin 1 vaiheen 2 (NH4)2S04-saostuksen (70 %) jälkeen; kaista 4, tuote esimerkin 1 vaiheen 2 (NH4)2S04-saostuksen (50-73 %) jälkeen; kaista 5, 5 tuote, joka on peräisin esimerkin 1 vaiheen 3 Q-Sepharose-kromatografian jälkeen; kaista 6, tuote esimerkin 1 vaiheen 4 G-75-pylvään jälkeen; kaista 7, tuote esimerkin 1 vaiheen 5 oktyyli-Sepharosepuhdistuksen jälkeen; kaista 8, lopullinen tuote, joka on saatu esimerkin 1 vaiheen 6 toisen G- 10 75-pylvään jälkeen.

Kuvio 2 merkitsee CDase:n eluointiprofiilia G-50 Sephadex-pylväästä (1,5 x 100 cm). (A) puhdistetun CDase:n 27 U sekoitettiin ribonukleaasi A:n (2 mg), ovalbumiinin (2 mg) 15 ja kymotrypsinogeeni A:n (1 mg) kanssa ja se eluoitiin PBS:llä. Fraktioita tarkkailtiin 280 nm:n aallonpituudella kokonaisproteiinisisällön määrittämiseksi ja 290 nm:llä käyttäen 5-FC:tä substraattina CDase-aktiivisuuden määrittämiseksi. (B) CDase:n eluointi ylläolevasta G-50 Sephadex-20 pylväästä ilman kalibrointistandardeja.

Kuvio 3 kuvaa CDase:n stabiilisuutta 37*C:ssa. CDase:a (72 U/mg) PBS:ssä, joka sisälsi proteaas.i vapaata BSA:ta (1 rag/ral), inkuboitiin 37*C:ssa polypropyleeniputkessa. Eri 25 aikavälein määritettiin CDase-aktiivisuus käyttäen 10 pl:aa entsyyliliuosta.

Kuvio 4 esittää HPLC-puhdistetun CDase:n profiilin. Vaakasuuntaiset palkit merkitsevät fraktioita, jotka yhdistet-30 tiin aminohapposekvenssin analyysiä varten.

Kuvio 5 kuvaa CDase-.n SDS-PAGE-analyysiä HPLC-puhdistuksen ! jälkeen (15 % polyakryyliamidia pelkistävissä olosuhteis sa) . Kaista 1, yhdistelmä A; kaista 2, yhdistelmä B.

Kuvio 6 merkitsee CDase:n osittaisia aminohapposekvenssejä. Peptidit, jotka on saatu lohkaisemalla CNBr:llä (M-sarja), endoproteinaasilla Glu-C (E-sarja), endoproteinaasilla Lys- 35 95046 Ο C (K-sarja) ja endoproteinaasilla Asp-N (D-sarja) on merkitty.

Kuvio 7 esittää alukkeiden CDA4R1 ja CDA5AS nukleoti-5 disekvenssit, vastaavat aminohapposekvenssit ja näiden alukkeiden suhteelliset asemat CDasem aminohapposekvenssissä. CDA4R1 on orientoitunut 5'-> 3' "sense"-säikeessä, kun taas CDA5AS on orientoitunut 5'-> 3' "antisense"-säikeessä.

10

Kuvio 8 merkitsee DNA:n, joka on peräisin CDase:a koodit-tavista geeniklooneista, nukleotidisekvenssiä.

Kuvio 9 merkitsee avoimia luentakehyksiä (ORF = Open 15 reading frame), jotka on löydetty CDase:n genomisekvenssistä .

Kuvio 10 esittää ORF 2:n nukleotidisekvenssin ja vastaavan aminohapposekvenssin. Lisäaminohapot, jotka voidaan ennus-20 taa nukleotidisekvenssistä, mutta joita ei havaittu pepti-disekventoinnilla, ovat esitettyjä tummennetulla tyypillä ja aloitus- ja lopetuskodonit on pantu laatikkoon.

Kuvio 11 kuvaa plasmidia ilmaisevan vektorin "fuusioijaa", 25 joka sisältää CDase-geenin.

Kuvio 12 esittää pH3M-vektorin kartan.

Tämän keksinnön käytäntö käyttää, ellei muuten merkitty, 30 tavanomaisia proteiinikemian, molekyylibiologian, mikrobio logian ja yhdistelmä-DNA-teknologian tekniikoita, jotka ovat alalla tunnettuja. Sellaisia tekniikoita selitetään 1 täysin kirjallisuudessa. Katso esimerkiksi Scopes, R.K.,

Protein Purification Principles and Practice. 2.painos 35 (Springer-Verlag 1987); Methods in Enzymoloqy (S.Colowick ja N.Kaplan toim., Academic Press Inc.); Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 2. pai- 6 95046 nos (1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait toim. 1984).

A. Määritelmät 5

Kuvattaessa tätä keksintöä käytetään seuraavia termejä ja tässä käytettynä ne ovat tarkoitetut määriteltäväksi, kuten ilmaistaan alla.

10 "Lämpöstabiili sytosiinideaminaasi" viittaa CDase:een, joka säilyy ainakin 50 % aktiivisena vapaassa ei-immobilisoidussa tilassa enemmän kuin 12 tuntia 37*C:ssa, mieluummin enemmän kuin yhden päivän 37*C:ssa ja kaikkein mieluiten enemmän kuin 3 päivää 37’C:ssa, määriteltynä tarkkaile-15 maila 5-FC:n muuttumista 5-FU:ksi eristetyn entsyymin läsnäollessa analyysillä, jota selitetään täydellisimmin alla.

Aminohapposekvenssi tai proteiini on "olennaisen homologi-20 nen" toisen aminohapposekvenssin tai proteiinin kanssa, kun ainakin noin 50 %, mieluummin ainakin noin 85 ja kaikkein mieluiten ainakin noin 90-95 % aminohapoista ovat samoja kuin molekyylin määritelty pituus. Lisäksi aminohappovaihtelut voivat sisältää korvauksia, poistoja tai lisäyksiä.

25 -

Termi "funktionaaliäesti ekvivalentti" merkitsee, että : aminohapposekvenssi tai proteiini määrittää ketjun, joka tuottaa lämpöstabiilia entsyymiä, kuten kuvattiin yllä, joka pystyy muuttamaan 5-FC:n 5-FU:ksi, kuten kuvataan 30 esimerkeissä. Proteiinin, joka on funktionaalisesti ekvivalentti lämpöstabiilin CDase:n kanssa, ei tarvitse omata täsmällistä tai koko aminohapposekvenssiä, joka on merkitty tässä kuvioissa. Pikemminkin proteiini voi muodostua sen biologisesti aktiivisesta fragmentista, jonka aktiivisuus 35 määritellään, kuten yllä. Lisäksi proteiini voi "sisältää lisäyksiä, poistumia tai korvauksia merkittyihin sekvens-seihin niin kauan kuin proteiini pysyy biologisesti aktiivisena.

7 95046 "Puhdistettu proteiini" on sellainen, joka on olennaisen vapaa B:stä, missä B on muiden solukomponenttien ja proteiinien seos ja kun ainakin noin 50 paino-%, mieluummin ainakin 75 % ja kaikkein mieluimmin 90-95 % tai jopa 99 5 paino-% kokonais-A+Bsstä, joka on läsnä, on Asta. "Puhdistettu" ei kuitenkaan viittaa menetelmään, jolla proteiini on saatu. Täten puhdistettu proteiini voi olla sellainen, joka on tuotettu yhdistelmätekniikoilla, synteettisesti tuotettu tai eristetty suoraan organismista, jossa proteii-10 nia tavataan luonnossa.

Termejä "polypeptidi" ja "proteiini" käytetään laajimmassa merkityksessään, s.o. mikä tahansa aminohappopolymeeri (dipeptidi tai suurempi) joka on liitetty peptidisidoksil-15 la. Täten termit sisältävät oligipeptidit, proteiinifrag- raentit, analogit, rauteiinit, fuusioproteiinit ja sen kaltaiset. Termit sisältävät luonnon ja yhdistelmäproteiinit.

"Yhdistelmä"-proteiinit tai -polypeptidit viittavat prote- 20 iineihin, joita ilmennetään yhdistelmänukleotidisekvens- sistä; s.o. joita tuottavat solut, joita on transformoitu ulkoisella DNA-rakenteella, joka koodittaa haluttua poly-peptidiä.

25 Termi "yhdistelmä" tässä käytettynä olemaan tunnusomainen nukleotidisekvenssille, joka koodittaa CDaseta, kuvaa nukleiinihappoa, joka on peräisin geenistä, cDNA:sta, puolisynteettisestä tai synteettisestä lähteestä, joka alkuperänsä tai käsittelyn takia on joko nukleotidisekvens-30 si, joka ei esiinny luonnossa tai nukleotidisekvenssi, joka on liitetty nukleiinihappoihin, jotka ovat muita kuin niitä, joihin se on liitetty luonnossa.

"Replikoni" on mikä tahansa geneettinen elementti (esim.

35 plasmidi, kromosomi, virusj, joka käyttäytyy polynukleoti-din replikaation itsenäisenä yksikkönä solun sisällä; s.o. se pystyy replikoituinaan oman ohjauksensa alaisena.

8 95046 "Vektori" on replikohi, johon on kiinnittynyt toinen polynukleotidisegmentti aiheuttaakseen replikaation ja/tai ilmentääkseen kiinnitetyn segmentin. "Ekspressiovektori" viittaa vektoriin, joka kykenee itsenäiseen replikointiin 5 tai integraatioon ja sisältää ohjaussekvenssejä, jotka suuntaavat halutun nukleotidisekvenssin transkription ja translaation sopivaan isäntään.

"Koodaussekvenssi" on polynukleotidisekvenssi, joka tran-10 skriptoidaan tai transloidaan polypeptidiin.

"Promoottorisekvenssi" on DNAm säätöalue, joka kykenee sitomaan RNA-polymeraasia ja aloittamaan alavirran puolen (s.o. 3'-suunnassa) koodaussekvenssin transkription.

15

Koodaussekvenssi on promoottorisekvenssin "ohjauksen alainen" solussa, kun koodaussekvenssin transkriptio on tuloksena RNA:n sitoutumisesta promoottorisekvenssiin; sitten on tuloksena tulokseksi saadun mRNA:n translaatio 20 polypeptidissä, joka on koodattu koodaussekvenssiin.

"Käytettävästi liitetty" viittaa sellaiseen rinnakkainaset-tamiseen, jossa komponentit on asetettu suorittamaan tavallisen toimintansa. Täten säätösekvenssit, jotka ovat 25 käytettävästi liitettyjä koodaussekvenssiin, kykenevät aikaansaamaan koodaussekvenssin ilmentymän.

"Säätösekvenssit" viittaavat niihin sekvensseihin, jotka säätävät koodaussekvenssien transkriptiota ja/tai translaa-30 tiota; nämä voivat sisältää, mutta eivät ole niihin rajoitettuja, promoottorisekvenssit, transkription aloittavat ja lopettavat sekvenssit ja translaation aloittavat ja lopettavat sekvenssit. Lisäksi "säätösekvenssit" viittaavat sekvensseihin, jotka säätävät polypeptidin, joka on koodi-35 tettu koodaussekvenssissä, käsittelyä; nämä voivat sisältää, mutta eivät ole niihin rajoitettuja, sekvenssit, jotka säätävät erittymistä, proteaasin lohkeamista ja polypeptidin glykosylaatiota.

ί - 95046 ! 9 "Signaalisekvenssi" voidaan sisällyttää ennen koodausse-kvenssiä. Tämä sekvenssi koodittaa signaalipeptidiä, N-terminaalia polypeptidiin, joka on yhteydessä isäntäsoluun suunnatakseen polypeptidin solun pinnalle tai erittääkseen 5 polypeptidin väliaineeseen. Tämän signaalisekvenssin isän-täsolu leikkaa pois ennenkuin proteiini lähtee solusta. Signaalisekvenssejä voidaan löytää erilaisiin luonnostaan prokaryootteihin ja eukaryootteihin kuuluviin proteiineihin liittyvinä. Esimerkiksi alfatekijä, luonnostaan hiivaan 10 kuuluva proteiini, erittyy hiivasta ja sen signaalisekvenssi voidaan kiinnittää heterologisiin proteiineihin erittymään väliaineeseen (ks. US-patentti 4,546,082). Edelleen alfatekijän ja sen analogien on havaittu erittävän hetero-logisia proteiineja lukuisista hiivoista, kuten Saccharomy-15 ces ja Kluyveromyces (ks. esim. EP-julkaisu 0301669, julkaisupäivä 01.02.1989).

"Transformaatio” on eksogeenisen polynukleotidin panemista isäntäsoluun. Eksigeeninen polynukleotidi voidaan pysyttää 20 plasmidina tai vaihtoehtoisesti se voidaan yhdistää isännän perimään.

"Yhdistelraäisäntäsoluja", "isäntäsoluja"_, "soluja" ja muita sellaisia termejä, jotka merkitsevät mikro-organisms-25 ja, käytetään vaihdellen keskenään ja ne viittaavat soluihin, joita voidaan käyttää tai joita on käytetty yhdistel-mävektoreiden tai muun siirretyn DNA:n vastaanottajina ja ne sisältävät alkuperäisen transfektoidun solun jälkeläisiä. Ymmärretään, että yhden eraosolun perimä ei välttämättä 30 ole täysin identtinen genomiltaan tai kokonais-DNA-kömpie-mentiltään verrattuna alkuperäiseen emosoluun johtuen vahingossa tapahtuneesta tai tarkoitetusta mutaatiosta. Täten ·' termit merkitsevät emosolun jälkeläisiä, jotka ovat riittä vän samanlaisia kuin vanhempansa, jotta niille on tunnus-35 omaista asiaan kuuluva ominaisuus, esimerkiksi, luonnostaan siihen kuuluvan geenin, joka koodittaa välttämätöntä entsyymiä, korvaus kloonatulla*geenillä, joka liittyy rakennegeeniin, joka koodittaa haluttua geenituotetta.

10 95046 CDase:n "terapeuttisesti tehokas määrä" on määrä, joka annosteltuna sen substraatin kanssa, johon CDase vaikuttaa, on riittävä muuttamaan substraatin aktiiviseksi solumyrkyl-liseksi aineeksi, joka vuorostaan estää kasvaimen solunkas-5 vun.

B. Yleiset menetelmät Tämä keksintö on kohdistettu CDase:een, joka on eristetty 10 hiivasta, ja joka on lämpöstabiili. Tällä CDase:11a on ominaisuuksia, jotka erottavat sen aikaisemmin eristetyistä hiivan CDase-entsyymeistä. Nyt eristetyn hiivan CDase:n molekyylipaino on noin 32 kDa määritettynä geelisuodatus-kromatografiällä. SDS-PAGE esittää suuren vyöhykkeen 17 15 kDa:n kohdalla, mikä merkitsee, että tämä CDase muodostuu dimeeristä, jonka kumpikin alayksikkö on raolekyylipainol-taan noin 17 kDa. Lisäksi, kun aikaisemmin eristettyjen hiivan CDase-entsyymien on osoitettu olevan hyvin läropöla-biileja 37*C:ssa, tämän keksinnön puhdistettu entsyymi on 20 stabiili tässä lämpötilassa. Edelleen tämän uuden CDase:n aminohapposekvenssi ei osoita mitään merkittävää sekvenssi-homologiaa muiden tunnettujen sekventoitujen proteiinien kanssa. Tätä ainutkertaista CDase:a koodittavan geenin kloonaus ja ekspressio antaa tuloksena koodaussekvenssin, 25 joka on noin 474 emäsparia pitkä, määrittäen 158 aminohapon proteiinin, jonka odotettavissa oleva molekyylipaino on noin 17506 daltonia. Lämpöstabiili CDase voidaan eristää hiivasta, sisältäen ascosporogeenisten, basidiosporogeenis-ten ja epätäydellisten hiivojen jäsenet. CDase eristetään 30 mieluummin Saccharomyces-hiivojen perheen jäsenistä, jolloin Saccharomyces sp. on parhaana pidetty ja Saccharomyces cerevisae (leipurin hiiva) on erityisen parhaana pidetty. Fleishmann’s Compressed Yeast-hiivan on havaittu olevan erinomainen lämpöstabiilin CDase:n lähde ja se on 35 helposti saatava kaupallisesti leipomoista ja sekatavara-liikkeistä.

il 95046 Tässä käytetty menetelmä CDase:n puhdistamiseksi eroaa raportoiduista menetelmistä (ks. esim. Katsuragi et ai., 1987; Katsuragi et ai., 1986; Ipata et ai., 1978; Ipata et ai., 1971) ja myös Katsuragin vuoden 1988 menetelmästä.

5 Erityisesti menetelmä käyttää erilaisia puhdistusvaiheita, sisältäen lisägeeliläpäisypylväspuhdistuksen anioninvaihto-, ja hydrofobisen kromatografiavaiheiden (kuvataan alla) välissä ja myös eri puhdistusolosuhteet sisältäen eri puskurit, pH st ja puskurien ainesosat, kuten EDTAsn ja 10 DTT;n. Edelleen, aikaisemmat menetelmät eivät tee lämpösta-biilia entsyymiä.

Ensimmäinen vaihe lämpöstabiilin CDasesn puhdistamiseksi hiivasta käsittää hiivasolujen rikkomisen CDasesn sisältä-15 vän autolysaatin valmistamiseksi. Autolyysi voidaan aikaansaada käyttäen useita menetelmiä, jotka tunnetaan alalla. Esimerkiksi hiivasolut voidaan plasmolysoida tolueenilla Kunitzin (1947) menetelmän mukaan. Erityisen käyttökelpoinen on hiivan paneminen orgaaniseen liuottimeen, kuten 20 etyyliasetaattiin, mitä seuraa puskurin lisäys liuoksen pitämiseksi noin pH 7:ssä. Sopivat puskurit sisältävät kaliurafosfaattipuskurin, fosfaattipuskuroidun suolaliuoksen, Tris-puskurin ja myös monia muita, jotka tunnetaan hyvin alalla. Puskuri sisältää mieluummin ammoniumsulfaat-25 tia pitoisuuksissa, jotka ovat alueella 1-25 %, mieluummin 15 % ja myös EDTA:'aa ja ditiotreitolia (DTT) CDase:n stabiloiraiseksi. Vaihtoehtoisesti EDTA ja DTT voidaan jättää pois tästä ja seuraavista puskureista. EDTA:n pitoisuus, silloin kun sitä on läsnä, on alueella 0,1 mM-30 10 mM, 5 mM ollessa parhaana pidetty, kun taas DTT:tä voi olla läsnä pitoisuuksissa 0,01 mM-10 mM, mieluummin 0,1 mM. Tätä seosta sekoitetaan useita päiviä ja pH pidetään noin arvossa 7. Solujätökset voidaan poistaa linkoamalla.

35 Seuraten autolyysiä saostetaan kaikki proteiini autolysaa-tista käyttäen ammoniumsulfaattia. Ammoniumsulfaattia lisätään pitoisuuksissa, jotka ovat riittäviä antamaan korkeamman CDase:proteiini-suhteen. Esimerkiksi ammonium- Γ 95046 12 sulfaattia voidaan ensin lisätä saavuttamaan 60-80 % kyllästyminen, mieluummin 70 % kyllästyminen. EDTA:aa sisällytetään mielellään reaktioseokseen pitoisuudessa 1-3 g/1, mieluummin 1,5-2,0 g/1, reaktion annetaan edetä useita 5 tunteja ja saostuma kerätään linkouksen jälkeen. Pelletti liuotetaan sopivaan puskuriin, kuten PBS, noin pH.*ssa 7,0 ja liuos dialysoidaan samaa puskuria vasten. Dialysaattia voidaan käsitellä toisen kerran ammoniumsulfaatilla noin 50 % pitoisuuden saavuttamiseksi, EDTA:n ollessa läsnä kuten 10 yllä. Saostuma kerätään taas linkoamalla ja ammoniumsul-faattia lisätään nesteeseen noin 73 %:n kyllästymisen saavuttamiseksi. Saostuma kerätään ja liuotetaan sopivaan puskuriin, jonka pH on noin 6,5-8,5, mieluummin Tris-puskuriin pH:ssa 8, joka sisältää DTTstä yllä kuvatussa 15 pitoisuudessa. Uudelleen saatua saostumaa dialysoidaan sitten tätä puskuria vasten useita tunteja. CDase dialysaa-tista voidaan puhdistaa edelleen anioninvaihtokromatogra-fialla käyttäen esimerkiksi ristisidostettua agaroosia tai selluloosapakkausraateriaalia. Erityisen sopivia ovat 20 anioninvaihtajat, kuten Q-Sepharose ja DEAE-Sepharose, joita saadaan Pharmacia'1ta. Sopivat tasapainopuskurit sisältävät esimerkiksi Tris- tai fosfaattipuskurit, eluoin-nin ollessa suoritettu käyttäen lineaarista gradienttia. Erityisen sopiva on 20 mM Tris'in käyttö, joka sisältää 0,1 - 25 mM DTT pHrssa 8,0, 0-0,3 M KC1 lineaarisen gradientin ollessa tässä puskurissa.

»

Seuraten anioninvaihtokromatografiaa, yhdistetään fraktiot, jotka sisältävät CDase-aktiivisuutta (arvioidaan kuten 30 kuvataan alla) ja konsentroidaan ultrasuodatuksen avulla käyttäen esimerkiksi suodatinta, joka leikkaa pois molekyy-lipainot noin 30000 daltonia (Da) ja vähemmän.

Seuraavaksi CDase:a sisältävä liuos ajetaan geeliläpäisy-35 pylvääseen. Erityisen käyttökelpoisia ovat ristisidostetut dekstraani-, agaroosi- tai dekstraani/bisakryyliamidigeelit Sephadex G-75:n, G-100:n tai Sephacryl S-300:n ollessa parhaina pidettyjä. Eluentti voi olla mikä tahansa tavan- I 95046 13 omainen puskuri, joka on hyvin tunnettu alalla, noin pH:ssa 7, PBS:n, joka sisältää DTT:tä ollessa, kuten kuvattiin aikaisemmin, parhaana pidetty. Fraktiot, jotka sisältävät CDase-aktiivisuutta, yhdistetään ja dialysoidaan puskuria, 5 kuten kaliumfosfaattia, vastaan. Puskuri sisältää mieluummin noin 1-2 M ammoniumsulfaattia ja EDTAsaa ja DTT:tä, kuten kuvattiin yllä autolysaattipuskurin suhteen. Voidaan ajaa toinen geeliläpäisypylväs haluttaessa ja aktiiviset fraktiot konsentroidaan ultrasuodatuksella käyttäen suoda-10 tinta, joka leikkaa pois esimerkiksi molekyylipainot 5000 Da tai alle.

Seuraavaksl CDase:a sisältävää materiaalia voidaan käyttää pylvääseen, joka erottaa aineet perustuen hydrofobisuuteen 15 ja ne aluoidaan käyttäen esimerkiksi ammoniumsulfaatin käänteisgradienttia kaliurofosfaattipuskurissa. Fraktiot, joissa on CDase-aktiivisuutta yhdistetään ja konsentroidaan { ultrasuodatuksella käyttäen suodatinta, jonka leikkausraja on 5000 Da. Konsentraattia voidaan varastoida jäädytettynä 20 lisäkäyttöä varten. Kuitenkin, jos toista geeliläpäisypyl-västä ei suoritettu ja/tai jos CDase:n ominaisaktiivisuus on alhainen, voidaan suorittaa toinen geeliläpäisypylväs, kuten kuvattiin yllä. Täten puhdistettu CDase on läropösta-biili ja voidaan siksi säilyttää jäädytettynä tai lyofi-25 lisoituna vapaassa muodossa.

: CDase:n aktiivisuutta voidaan tarkkailla puhdistuksen aikana useilla alalla tunnetuilla menetelmillä. Esimerkiksi sytosiinin muuttumista urasiiliksi tai sen johdannaisiksi 30 CDase:n läsnäollessa voidaan tarkkailla suoralla spektrofo- tometrisellä analyysillä muuttumista seuraavan absorbanssin putoamisesta 286 nm:n aallonpituudella. (Ks. esim. Ipata ja Cercignani, 1978). Vaihtoehtoisesti aktiivisuus voidaan määrittää tarkkailemalla 5-FC:n muuttumista 5-FU:ksi 35 spektrofotometrisesti, kuten on kuvannut Nishiyaraa et ai., 1985, johon tässä viitataan.

14 95046 Tällä tavalla puhdistettu lämpöstabiili CDase sekventoi-daan, kuten kuvataan koeosassa ja osittainen aminohapposekvenssi voidaan nähdä kuviossa 6. Sekvenssillä ei ole mitään olennaista homologiaa muiden tunnettujen sekventoi-5 tujen proteiinien kanssa. Tähän tietoon perustuen voidaan lämpöstabiilia CDase:a tuottaa yhdistelmätekniikalla. Esimerkiksi CDase:a koodittavat DNA-sekvenssit voidaan valmistaa synteettisesti, perustuen saatuun aminohapposekvenssiin, käyttäen sopivia kodoneita. Yleisesti valitaan 10 parhaana pidetyt kodonit CDase:n ekspessioon käytettyä aiottua isäntää varten. Täydellinen sekvenssi kootaan päällekkäisistä oligonukleotideista, jotka valmistetaan standardimenetelmillä. Ks. esim. Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et ai., (1984) Science 223: 1299; Jay et ai., 15 (1984) J. Biol. Chem. 259: 6311.

Vaihtoehtoisesti lämpöstabiili yhdistelmä-CDase voidaan valmistaa seuraavasti. Oligonukleotidikoettimia, jotka sisältävät kodoneita määritettävän aminohapposekvenssin 20 osaa varten, voidaan valmistaa ja käyttää seulomaan geeni-tai cDNA-kirjastoja geeniä koodittavaa CDase.-a varten. Perusstrategia oligonukleotidikoettimien ja DNA-kirjastojen valmistamiseksi ja myös niiden seulomiseksi nukleiinihappo-hybridi säätiön avulla ovat alan keskitason ammattilaiselle 25 hyvin tunnettuja. Ks. esim. Oligonucleotide Synthesis.

yllä; T. Maniatis et ai., yllä. Kun seulotusta kirjastosta : on tunnistettu klooni positiivisella hybridisaatiolla, voidaan suorittaa restriktioentsyyraianalyysi ja DNA:n sekventoiminen sen varmistamiseksi, että erityinen kirjas-30 ton osa sisältää CDase:a koodittavan geenin. Lisäksi voidaan käyttää polymeraasiketjureaktiota (PCR) CDase:a koodittavan nukleotidisekvenssin monistamiseksi ja sen jälkeen osoittamiseksi. Tämän menetelmän on kuvannut Saiki et ai.(1986) ja se. on kuvattu US-patenteissa 4,683,195 ja 35 4,683,202, joiden sisältöön tässä viitataan. PCR-monistet- tujen tuotteiden nukleotidisekvenssin analyysi voidaan suorittaa suoralla sekvenssianalyysillä, kuten on kuvannut Saiki et ai. (1988). Vaihtoehtoisesti monistetut kohdesek- is 95046 venssit voidaan kloonata ennen sekvenssianalyysiä. Menetelmän entsymaattisesti monistettujen geenisegmenttien suoraksi kloonaamiseksi ja sekvenssianalyysiksi on kuvannut Scharf et ai. (1986). Menetelmässä muunnetaan alukkeita, 5 joita käytetään PCR-tekniikassa lähellä 5’-päätä mukavien restriktiopaikkojen tuottamiseksi esimerkiksi M13-sekven-tointivektoriin suoraan kloonaamista varten. Monistuksen jälkeen PCR-tuotteet lohkaistaan sopivilla restriktioent-syyraeillä. Restriktiofragmentit liitetään M13-vektoriin ja 10 transformoidaan esimerkiksi JM 103-isäntään, joka on päällystetty levylle ja tulokseksi saatuja plakkeja seulotaan hybridisaatiolla leimatulla oligonukleotidikoettimella. Muitakin menetelmiä kloonaamiseksi ja sekvenssianalyysiksi tunnetaan alalla.

15

Erityisen parhaana pidetyssä menetelmässä käytettäväksi tässä keksinnössä syntetisoitiin kaksi oligonukleotidialu-ketta käyttäen osittaista aminohapposekvenssiä ja kodonin-käyttökuvioita S. cerevisiae:sta (Guthrie ja Abelson, 1982) 20 ohjaimena suunniteltaessa DNA-sekvenssin "guessmer"-sekvenssejä. Näitä alukkeita käytettiin PCR:ää varten, joissa kloonattu hiivageenikirjaston DNA oli läsnä temp-laattina. Oligonukleotidit syntetisoitiin niistä CDase:n alueista, joissa aminohapot osoittivat merkittävää kodonin 25 käytön poikkemaa ja/tai muutamia heikentymiä. Ensimmäinen aluke, CDA4R1, oli 42-meeri, joka sisälsi 33 nukleotidia, jotka vastasivat aminohapposekvenssin aminopäätä, kun taas toinen, CDA5A5, sisälsi nukleotideja, jotka olivat komplementaarisia sekvenssille, joka sijaitsi lähellä proteiinin 30 karboksipäätä. Näiden oligonukleotidien sekvenssi on esitetty kuviossa 7. Kahta geenikirjastoa käytettiin templaat-ti-DNA:na PCR-reaktioissa ja molempien havaittiin antavan yhden spesifisen fragmentin, jonka pituus oli noin 350 emäsparia, koon ollessa odotettavissa vastaavien saatavilla 35 olevien aminohapposekvenssien perusteella. PCR-primerit rakennettiin EcoRI-restriktiopaikoin 5'-päissään PCR:llä luotujen fragmenttien kloonaamisen helpottamiseksi. 350 emäsparin PCRsStä saatu fragmentti puhdistettiin geelie- 95046 lektroforeesilla ja alikloonattiin sopivaan vektoriin DNA-sekventoimista varten.

PCR:stä saatua fragmenttia käytettiin myös CDase-spesifise-5 na koettimena hiivakirjastojen seulomiseksi pesäkesuodatin-hybridisaatiotekniikoilla. Ensimmäiset yritykset käyttää guessmer-oligonukleotideja koettimina epäonnistuivat alhaisen signaali/tausta-suhteen takia hybridisäätiön jälkeen. Kaikki mahdolliset kloonit poimittiin ja seulottiin uudel-10 leen kahdesti positiivisen hybridisaatiosignaalin vahvistamiseksi. Plasmidit puhdistettiin yksittäisistä klooneista ja restriktiokartoitettiin pätkimällä sarjalla restriktio-entsyymejä sekä yksin että erilaisissa monipätkimisreakti-oissa.

15

Sekä kloonatut PCR-fragmentit että geenikloonit, jotka kloonasivat CDaseta, saatettiin DNA-sekvenssianalyysiin. Vaihtelut reaktio-olosuhteissa sallivat niiden sekvenssien analyysin, jotka olivat suoraan alukkeen vieressä ja aina 20 useiden satojen emäsparien päähän asti. Saadut DNA-sekvens-sit on esitetty kuviossa 8. Kuten voidaan nähdä, sekvenssit ovat 93 % homologisia siten, että niissä on 23 ei sopivaa ja 330 sopivaa paria. 0RF:t, jotka on löydetty tästä sekvenssistä, on esitetty kuviossa 9. Kuvio 10 esittää ORP 2:n 25 nukleotidisekvenssin ja päätellyt aminohapposekvenssit vahvistaen aikaisemmin määritellyn aminohapposekvenssin ja ennustaen vain muutaman aminohapon lisäyksen jompaan kumpaan osittaisen sekvenssin, joka oli saatu puhdistetun proteiinin analyysissä, päähän.

30 DNA-sekvenssitietoja käytettiin sen jälkeen uusien PCR-alukkeiden suunnitteluun monistettujen DNA-kasettien, jotka koodittavat CDase:a, luomiseksi. Sellaisia kasetteja voidaan käyttää geenirakenteissa, jotka ovat tarkoitetut tuot-35 taraaan korkeita geeniekspression tasoja joko prokaryootti-tai eukaryoottisoluissa ja luomaan geenifuusioita CDase:n ja muiden- biologisesti kiinnostavien molekyylien välillä sisältäen, mutta ei niihin rajoittuen, immunoglobuliinimo- 17 95046 lekyylit, jotka ovat kohdistettuja syöpäantigeenejä vastaan.

CDase:a koodittava sekvenssi voidaan kloonata mihin tahansa 5 sopivaan vektoriin tai replikoniin, jotka ovat alalla hyvin tunnettuja. Esimerkit yhdistelraä-DNA-vektoreista kloonaamista varten ja isäntäsoluista, suluissa, joita ne voivat transformoida, sisältävät bakteriofaagin lambda (E. coli), PBR322 (E. coin. pACYC177 (E. coli). pKT230 (grara-negatii-10 viset bakteerit), pGV1106 (gram-negatiiviset bakteerit), pLAFRl (gram-negatiiviset bakteerit), pME290 (ei E. coli -gram-negatiiviset bakteerit), pHV14 (E. coli ja Bacillus subtills). pBD9 (Bacillus). pIJ61 (Streotornvces). pUC6 (iS.t£ept0iPY0es), YIp5 (Saccharomvces), YCpl9 (Saccharo-15 mvces) ja härän papillooraavirus (imettäväissolut).

CDase-proteiinia varten oleva koodaussekvenssi voidaan panna promoottorin, ribosorain sitomispaikan (bakteerieks-pressiota varten) ja mahdollisesti operaattorin ohjaukses-20 sa, (joihin viitataan tässä kollektiivisesti "ohjausele- mentteinä"), niin että DNA-sekvenssi, joka koodittaa proteiinia, transkiptoidaan RNAthan isäntäsolussa, joka on transformoitu vektorilla, joka sisältää tämän ekspressiora-kenteen. Koodaussekvenssi voi sisältää tai olla sisältäroät-25 iä signaalipeptidin tai johtosekvenssin. Johtosekvenssit voidaan poistaa bakteeri-isännällä translaation jälkeisessä käsittelyssä. Ks. esim. US-patentit 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397.

30 Säätösekvenssien lisäksi voi olla toivottavaa lisätä sääteleviä sekvenssejä, jotka sallivat ekspressio-CDase-sekvenssien säätelyn isäntäsolun kasvun suhteen. Säätelevät sekvenssit ovat tunnettuja alan ammattilaisille ja esimerkit sisältävät ne, jotka aiheuttavat geenin ilmentymisen 35 kääntämisen päälle tai pois päältä vasteena kemialliseen tai fysikaaliseen ärsytykseen, mukaanlukien säätelevän yhdisteen läsnäolon. Muitakin säätelevien elementtien 18 95046 tyyppejä voi olla läsnä vektorissa, esimerkiksi vahvistus-sekvenssejä.

Ekspressiovektori rakennetaan niin, että CDase:a kooditta-5 va sekvenssi sijaitsee vektorissa, jossa on sopivat säätelevät sekvenssit, koodaussekvenssin asettumisen ja orientoitumisen ollessa säätösekvenssien suhteen sellainen, että koodaussekvenssi transkriptoidaan säätösekvenssien "ohjauksen" alaisena (s.o. RNA-polymeraasi, joka sitoutuu DNA-10 molekyyliin säätösekvensseissä transkriptoi koodaussekvenssin) . CDase.*a koodittavien sekvenssien muuntaminen voi olla toivottavaa tämän pään aikaansaamiseksi. Esimerkiksi joissakin tapauksissa voi olla tarpeen muuntaa sekvenssiä niin, että se voidaan kiinnittää säätösekvensseihin siten, että 15 niissä on sopiva orientoituminen; s.o. luentakehyksen ylläpitämiseksi. Säätösekvenssit ja muut säätelevät sekvenssit voidaan liittää koodaussekvenssiin ennen sen panemista vektoriin, kuten kloonausvektoreihin, joita kuvattiin yllä. Vaihtoehtoisesti koodaussekvenssi voidaan kloonata suoraan 20 ekspressiovektoriin, joka jo sisältää säätösekvenssit ja sopivan restriktiopaikan.

Alalla tunnetaan lukuisia prokaryoottiekspressiovektoreita. Ks. esim. US-patentit 4,440,859; 4,436,815; 4,431,740; 25 4,431,739; 4,428,941; 4,425,437; 4,418,149; 4,411,994; 4,366,246; 4,342,832; ks. myös GB-patenttihakemuksia i 2,121,054; 2,008,123; 2,007,675; ja EP-patenttihakemusta 103,395. Hiivaekspressiovektorit ovat myös tunnettuja alalla. Ks.esiro. US-patentit 4,446,235; 4,443,539; 30 4,430,428; ks. myös EP-patenttihakemuksia 103,409; 100,561; 96,491. Imettäväisekspressiovektorit ovat myös tunnettuja.

Riippuen valitusta ekspressiojärjestelmästä ja isännästä CDaseia tuottaa kasvavat isäntäsolut, joita on transformoi-35 tu ekspressiovektorilla, jota kuvattiin yllä, olosuhteissa, joissa CDase:a ekspressoidaan. Proteiini eristetään sitten isäntäsoluista ja puhdistetaan. Jos ekspressiojärjestelmä erittää proteiinin kasvuväliaineeseen, proteiini voidaan 19 95046 puhdistaa suoraan väliaineesta. Jos proteiinia ei erity, se eristetään solulysaateista. Sopivien kasvuolosuhteiden ja taiteenottomenetelmien valinta kuuluvat alan ammattilaisen taitoihin.

5

Esimerkki yhdestä rakenteesta CDase-sekvenssien ohjatuksi viemiseksi hiivaan käsittää CDase-kasetin viemisen hiiva-vektoriin, jota kutsutaan "fuusionaattoriksi". Tämä vektori on saatavilla Washingtonin yliopiston genetiikan osastolta, 10 Seattlesta, Washingtonin osavaltiosta ja myös NIH:sta.

Sellaista rakennetta on kuvattu kuviossa 11. Tässä rakenteessa CDase pannaan monilinkkeriin, joka panee sen ilmentymisen voimakkaasti ilmentyvän ja tarkasti säädetyn hiivasta saadun GAL10-promoottorin ohjaukseen (Johnston, M. 15 1987) . GAL10-promoottori antaa vasteen galaktoosille aiheuttaen ohjauksensa alaisen geenin korkean tason ilmentymisen. Tätä vektoria voidaan käyttää myös luomaan CDase-IacZ-geenifuusio sopivilla muutoksilla DNA-sekvenssissä. Luotu fuusioproteiini voi helpottaa induktion, puhdistuksen 20 ja biokemiallisen analyysin kvantitoimista. Nämä rakenteet voidaan transformoida sopivaan hiivakantaan, kuten siihen, jota on kuvannut Hovland et ai., (1989). Tämä hiivakanta sisältää lukuisia mutaatioita, mitkä tekevät sen haluttavaksi rakenteen, kuten sen, jota kuvattiin yllä, kanssa 25 käyttöä varten. Erityisesti gall-mutaatio on läsnä, mistä on tuloksena sen entsyymin puute, joka katalysoi galaktoo-sin käytön ensimmäistä vaihetta, täten estäen indusoijän (galaktoosin) tyhjenemisen väliaineesta. Myös reg1-501-mutaatio on läsnä, mikä eliminoi galaktoosigeenin ekspres-30 sion glukoosirepression ja sallii sellaisten viljelmien perustamisen, jotka ovat optimiolosuhteissa kasvua ja elinkykyisyyttä varten. Induktio voidaan helposti aikaansaada lisäämällä galaktoosia rikkaaseen glukoosipohjaiseen väliaineeseen. Lopulta kannassa on läsnä useita mutaatioi-35 ta, joissa ei ole proteaasia, mikä lisää minkä tahansa heterologisten proteiinien tai niiden fragmenttien, joita tuotetaan kasvun aikana, stabiilisuutta. Sellaisen ekspres-siorakenteen tulisi helpottaa CDase:n eristämistä ja 20 95046 puhdistamista hiivasta sellaisissa määrissä, jotka olivat aikaisemmin mahdottomia, käyttäen ekspressiotasoja, joita saadaan endogeenisellä geenillä.

5 Voidaan luoda muita rakenteita käytettäväksi imettäväisso-^viljelyjärjestelmissä. Yhdessä keksinnön parhaana pidetyssä suoritusmuodossa, kasetti, joka koodittaa CDase:a, kiinnitetään käyttäen PCR-teknologiaa, erityssignaalipepti-diin onkostatiini M:ää varten (Malik, et ai., 1989) ja se 10 voidaan sitten panna imettäväisen ekspressiovektoriin pH3MPy (Stamenkovic, et ai., 1990), joka sisältää sopivia vahvistajia, promoottoreita, päättämis- ja käsittelysignaa-leja imettäväisekspressiota varten. Rakenne voidaan siirtää COS-soluihin (Aruffo and Seed, 1987), seerumivapaan vilje-15 lyväliaineen tullessa kerätyksi ja analysoiduksi CDase-aktiivisuuden suhteen järjestelmässä, jossa ei ole endo-geenistä entsyymiaktiivisuutta. Samoin voidaan rakentaa cDNA-rakenteita geenifuusioita varten CDase:n ja muiden mielenkiintoisten molekyylien välillä standarditekniikoil-20 la, transfektoida COS-soluihin ja solu-uutteita tai nesteitä voidaan analysoida proteiinien ja niiden aktiivisuuden suhteen.

Muutkin geenifuusiot ovat käyttökelpoisia CDase:n yhdistel-25 raätuotannossa. Esimerkiksi CDase-.a koodittava nukleoti- disekvenssi tai sen funktionaalinen mutantti tai fragmentti voidaan fuusioida cDNA:ta koodittaviin iraraunoglobuliinimo-lekyyleihin, jotka ovat tähdättyjä syöpäantigeenejä vastaan vasta-aine-entsyymifuusioproteiinin luomiseksi. Monoklonaa-30 lisiä vasta-aineita on saatu, jotka tunnistavat kohteet, joita etupäässä ilmennetään kasvainsoluilla (Hellström, et ai., 1984). Täten voidaan luoda fuusioproteiineja, jotka valitsevat kohteekseen erityisesti kasvainsolut. Ks. esim. US-patentti 4,906,562 ja Hellström and Hellström, 1985.

*35 Entsyymi voi sitten toimia suoraan kasvainsolun paikalla- esivaiheen 5-FC muuttamiseksi syövänvastaiseksi aineeksi 5-FU. Geenifuusiot kiinnostavaa entsyymiä koodittavien geenien ja syöpäsoluja vastaan kohdistettujen vasta-aineiden I ai 95046 välillä poistavat vaatimuksen kahden proteiinin kemiallisesta liittämisestä. Samoin kahden kiinnostavan molekyylin väliset cDNA-rakenteet lisäisivät sellaisten rakenteiden joustavuutta heterologisissa ekspressiojärjestelmissä.

5

Yhdessä järjestelmässä saadaan cDNA syöpävasta-aineen raskasta ketjua varten solulinjoista, jotka tuottavat tätä vasta-ainetta. Koko·tätä cDNAtta tai sen osia koodattavia t PCR-fragmentteja voidaan sitten aikaansaada menetelmillä, 10 jotka ovat tuttuja alana ammattilaisille. Kahden kasetin kehysfuusio voidaan aikaansaada standarditekniikoilla useissa paikoissa ja tulokseksi saadut fuusiot testataan proteiinien, joilla on haluttu biologinen aktiivisuus, tuotannon suhteen. Rinnakkaistransfektio toisella plasrai-15 dilla, jossa on cDNA, joka koodittaa kevyen ketjun osaa vasta-aineraolekyylistä, sallii sen biologisesti aktiivisen vasta-ainefragmentin eristämisen, joka on fuusioitu aktiiviseen CDase-entsyymiin. Täten aikaansaadaan entsyymin kohdistaminen haluttuun paikkaan.

20

On myös toivottavaa tuottaa lämpöstabiilin CDase:n mutant-teja tai analogeja, jotka ovat funktionaalisesti sen kanssa ekvivalentteja. Mutantteja tai analogeja voidaan valmistaa poistamalla osa CDase:a koodittavasta sekvenssistä, inse-25 roimalla sekvenssi ja/tai korvaamalla sekvenssin yksi tai useampia nukleotideja. Tekniikat nukleotidisekvenssien muuntamiseen, kuten paikkasuunnattu metageneesi tai PCR-oligonukleotidimutageneesi, ovat alan ammattilaisille hyvin tunnettuja . Ks. esim. T. Maniatis et ai.

30 Tämän keksinnön CDase:a tuotetaan myös kemiallisella synteesillä, kuten kiinteän faasin peptidisynteesillä, käyttäen tunnettuja aminohapposekvenssejä tai aminohapposekvenssejä, jotka on saatu kiinnostavan geenin DNA-35 sekvensssistä. Sellaiset menetelmät ovat tunnettuja alan ammattilaisille.

22 9 5 0 4 6 Lämpöstabiilia CDase:a voidaan käyttää kerooterapeuttisena aineena. Erityisesti tätä entsyymiä voidaan käyttää in vivo. muuttamaan esivaihe 5-PC syövänvastaiseksi aineeksi 5-FU. Täten CDase:a voidaan annostella rinnan 5-PC:n kanssa, 5 kuten kirurgisesti panna CDase kasvainpaikkaan tai sen lähelle ja annostella 5-FC:tä suun kautta, kuten kuvaa Katsuragi et ai., 1987, jonka sisältö liitetään tähän viitteeksi. Vaihtoehtoisesti entsyymi voidaan viedä kasvaimen paikkaan CDase/vasta-ainekompleksin kohdetoimituksena 10 kasvaimiin käyttäen vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä noille kasvaimille. Tämä kompleksi voidaan tuottaa kemiallisilla menetelmillä tai geneettisesti rakentamalla geeni-fuusioita sopivan iromunoglobuliinigeenin ja CDase-geenin välillä, kuten kuvattiin yllä.

15

Alla on esimerkkejä erityisistä suoritusmuodoista tämän keksinnön suorittamiseksi. Esimerkit tarjotaan vain kuvaa-mistarkoituksessa, eivätkä ne ole aiottuja rajoittamaan millään tavalla tämän keksinnön suojapiiriä.

20

Esimerkki 1

Entsyymin puhdistus, aktiivisuuden määritys 1a CDase:n karakterisointi 25 CDase puhdistettiin Fleishmannin puristetusta leipurin hiivasta käyttäen seuraavaa menetelmää. Kaikki vaiheet puhdistuksessa suoritettiin 4‘C:ssa. Entsyymiaktiivisuus määritettiin 5'-fluorisytosiinilla (5-FC) 3 mM:n väkevyydessä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 37*C:ssa 30 (Nishiyaraa, et ai., 1985), jonka viitteen sisältö liitetään tähän kokonaisuudessaan viitteeksi. Entsyymiliuokset lisättiin ja reaktion kulkua tarkkailtiin spektrofotometrisesti näytteistä, joissa reaktio lopetettiin 0,1 N suolahapolla. 255 ja 290 nm:n absorbanssisuhteita käytettiin muodostuneen 35 5-fluoriurasiilin (5-FU) määrän mittaamiseen. Yksi entsy- * miaktiivisuusyksikkö määriteltiin 1 praol minuutissa muodos--tumitta 5-FU:ta 37*C:ssa. Proteiinipitoisuus mitattiin käyttäen BCA-analyysiä, joka on saatavissa Pierce-yhtiöstä „ 95046 23 (Rockford, IL). SDS-PAGE:a käytettiin proteiinikoosturauksen tarkkailuun kunkin puhdistusvaiheen jälkeen.

Vaihe 1. Hiiva-autolvsaatln valmistus 5

Leipurin hiivaa (2,25 kg) sekoitettiin etyyliasetaatin kanssa (225 ml) ja sitä sekoitettiin 30 minuuttia. Tähän lisättiin 2,25 1 50 raM kaliumfosfaattipuskuria pH.-ssa 7,2, sisältäen 15 % ammoniumsulfaattia, 5 raM EDTA ja 0,1 raM 10 ditiotreitolia (DTT). Seosta sekoitettiin 3 päivää ja pH

säädettiin päivittäin pH 7,2:een kiinteällä trihydroksime-tyyliarainometaanilla (Tris). Solujäte poistettiin linkoamalla 10000 kierroksella 15 minuuttia.

15 Vaihe 2. Ammoniumsulfaattifraktiointi

Kaikki proteiini saostettiin vaiheen 1 liuoksesta lisäämällä EDTA:aa (1,8 g/1) ja araraoniurasulfaattia (371 g/1) siihen niin, että aramoniumsulfaatin lopullinen pitoisuus 20 oli 70 % kyllästetty. Liuosta pidettiin 4*C:ssa noin 16 tuntia, minkä jälkeen saostuma kerättiin linkoamalla. Kiintoaine liuotettiin 1,5 l:aan 50 mM kaliumfosfaattipuskuria pHrssa 7,2, sisältäen 5 mM EDTA ja 0,1 mM DTT ja dialyysin tätä puskuria vastaan annettiin edetä noin 12-16 25 tuntia.

Dialysaattiin lisättiin EDTA:aa (1,8 g/1) ja ammoniumsulfaattia lisättiin niin, että saavutettiin 50 % kyllästyminen (314 g ammoniurasulfaattia/1 dialysaattia). Yhden tunnin 30 jälkeen saostuma lingottiin ja lisää ammoniumsulfaattia lisättiin liuokseen niin, että lopullinen ammoniumsulfaat-tipitoisuus oli 73 % kyllästynyt. Saostuma kerättiin, liuotettiin 1 1 20 mM Tris-puskuria pH:ssa 8,0, sisältäen 0,1 mM DTT ja sitä dialysoitiin laajalti tämän puskurin kanssa 35 12-16 tunnin ajan.

Vaihe 3. Anioninvaihtokromatoarafia 24 95046

Vaiheen 2 dialysaatti pantiin 4,8 x 25 cm:n Q-Sepharose-pylvääseen (Pharmacia), joka tasapainotettiin 20 mM:lla Tris-puskurilla, joka sisälsi 0,1 nM DTT pH:ssa 8,0. Pylväs pestiin ja entsyymi eluoitiin 0-0,3 M KCl:n lineaarisella 5 gradientilla yllämainitussa puskurissa. Fraktiot, jotka sisälsivät CDase-aktiivisuutta, yhdistettiin ja konsentroitiin noin 15 ml:aan ultrasuodatuksella (Amicon, PM 30-suodatin).

10 Vaihe 4. Geellläpäisvkromatografia

Vaiheen 3 CDase:a sisältävä liuos pantiin G-75 Sephadex-pylvääseen (2,5 x 100 cm) ja sitä eluoitiin PBS:llä, joka sisälsi 0,1 mM DTT. Fraktiot, jotka sisälsivät CDase-15 aktiivisuutta, yhdistettiin ja sitten niitä dialysoitiin 4 l:aa vastaan 100 mM kaliumfosfaattipuskuria, joka sisälsi 1,8 M ammoniumsulfaattia, 5 mM EDTA ja 0,1 mM DTT pH:ssa 7,0.

20 Valhe 5. Hydrofobinen interaktiokromatoorafia

Vaiheen 4 materiaali pantiin 2,5 x 15 cm:n oktyyli-Sepharo-se-pylvääseen (Pharmacia), joka oli tasapainotettu 100 mM kaliumfosfaattipuskurilla, joka sisälsi 1,8 M ammoniumsul-25 faattia, 5 mM EDTA ja 0,1 mM DTT pH:ssa 7,0. Pylväs pestiin tällä puskurilla ja entsyymi eluoitiin 1,8-0 M aramoniumsul-faatin lineaarisella gradientilla ylläolevassa fosfaatti-puskurissa. Fraktiot, jotka sisälsivät CDase-aktiivisuutta, yhdistettiin ja konsentroitiin ultrasuodatuksella (Amicon, 30 YM5-suodatin).

Vaihe 6. Geeliläpäisykromatoarafia

Vaiheen 5 materiaalin lopullinen geelisuodatus G-75 Sepha-35 dexslla käyttäen PBSrää eluenttina suoritettiin, kuten kuvattiin vaiheessa 4. Puhdistettu entsyymi konsentroitiin ultrasuodatuksella ja varastoitiin -70‘C:ssa.

25 95046

Puhdistuksen vaihe vaiheelta-tulokset voidaan nähdä taulukossa 1. SDS-PAGE-profiilit, joita käytettiin proteiini-koostumuksen tarkkailuun kunkin puhdistusvaiheen jälkeen, voidaan nähdä kuviossa 1. Lopullinen entsyymivalmiste 5 käsitti suuren vyöhykkeen noin 17 kDa:n ja pienen vyöhykkeen noin 19 kDa: n kohdalla.

Taulukko 1 CDase;n puhdistus 2.25 kq.-sta leipurin hiivaa

Kokonais- Kokonais- Ominais- Puhdist.

10 proteiini aktiiv. aktiiv. kerroin

Vaihe (mg)1 (U)2 (U/rag)

Soluvapaa uute 120000 1750 0,014 1 15 (NH4)2S04 36000 1274 0,035 2,5 Q-Sepharose 4200 685 0, 16 11,4 G-75 Sephadex184 648 3,5 250

Okt.-Sepharose 20 495 25 1800 G-75 Sephadex 6 394 67 4800 20 ..........................................................

1 Proteiinipitoisuus määritettynä käyttäen BCA:ta (Pierce) 2 Yksi yksikkö entsyymiaktiivisuutta määritellään 1 μΜοΙ 5-FU:ta, joka muodostuu minuutissa 37’C:ssa.

25 CDase:n molekyylipaino määritettiin panemalla puhdistettu entsyymi G-50 Sephadex-pylvääseen ribonukleaasi A:n (13,7 kDa), kyrootrypsinogeeni A:n (25 kDa) ja munanalbumiinin (43 kDa) kanssa. Fraktioita tarkkailtiin 280 nm:n aallonpituudella kokonaisproteiinin ja CDase:n aktiivisuuden mittaami-30 seksi käyttäen 5-FC:tä substraattina. CDase-entsyymiaktiivisuus keskittyi noin 32 kDa kohdalle (kuvio 2A). Entsyymi eluoitiin täsmälleen samassa tilavuudessa, kuin se pantiin pylvääseen, ilman kalibrointistandardeja (kuvio 2B).

35 -Puhdistetun CDase:n stabiilisuus 37*C:ssa fosfaattipusku-roidussa suolaliuoksessa pH:ssa 7,2 määritettiin käyttäen 5-FC:tä substraattina. Havaittiin hidas alenema entsyymiaktiivisuudessa pitkän inkuboinnin jälkeen (kuvio 3). Näissä t 26 95046 olosuhteissa entsyymi menetti puolet aktiivisuudestaan 5,2 päivän kuluttua. Ei ollut mitään ilmeistä entsyymiaktiivisuuden häviötä ensimmäisten 4 inkubaatiotunnin aikana (kuvio 3, pikkukuva).

5

Esimerkki 2 CDase:n aminohapposekvenssi

Reagenssit, joita käytettiin CDase:n sekventoimiseen, 10 saatiin Applied Biosystems, Inc.*stä. Liuottimet, joita käytettiin käänteisfaasi-HPLC:tä varten olivat yhtiöstä Burdick and Jackson. 4-Vinyylipyridiini oli yhtiöstä Aldrich Chemical Co., CNBr oli Kodakilta ja kaikki muut kemikaalit olivat reagenssilaatua. Endoproteinaasi Glu-C, 15 jonka alkuperä oli Staphylococcus aureus saatiin Miles

Laboratories'lta. Endoproteinaasi Asp-C, jonka alkuperä oli Pseudomonas fracri ja endoproteinaasi Lys-C saatiin Boehrin-ger Mannheim'lta.

20 Automatisoitu sekvenssianalyysi suoritettiin mallin 475A aminohapposekvensserillä (ABI) käyttäen RUN470-L- tai PR0470-L-ohjelmia. Kaikkiaan käytettiin 1,5 mg BioBrene:ä (ABI) ja niille suoritettiin kaksi tai.kolme Edmanin hajoamisesikierrosta ennen näytteen käyttöä. Tiatsolinoni-25 johdannaisten muuttaminen fenyylitiohydantoiiniarainohapoik- si suoritettiin 25 %:lla TFAslla 61*C:ssa. Fenyylitiohydan-toiiniaminohappojohdannaiset erotettiin käänteisfaasi-HPLCillä PTH C18-pylväässä (2,1 x 220 mm, ABI) natriumase-taattipuskurilla, joka sisälsi 5 % (v/v) tetrahydrofuraania 30 lähtöpuskurina ja asetonitriilillä) joka sisälsi 500 nM dimetyylifenyylitioureaa (ABI) rajoituspuskurina, mallin 120A PTH-analysaattorissa (ABI).

CDase ja peptidifragmentit puhdistettiin käyttäen kään-35 teisfaasi-HPLC:tä mallin 130A-erotusjärjestelmässä (Applied

Biosystems, Inc.). Erottaminen suoritettiin 40*C:ssa RP-300-pylväässä (2,1 x 30 mm; ABI). 0-60 % asetonitriilin lineaarinen gradienttia 0,1 % vesipitoisessa trifluorietik- 27 95046 kahapossa (ΤΡΑ) 2 tunnin aikana 0,1 ml/min nopeudella käytettiin proteiinien ja peptidifragmenttien eluoimiseen. CNBr-peptidejä, endoproteinaasi Lys-C-peptidejä, endopro-teinaasi Glu-C- ja endoproteinaasi Asp-C-peptidejä käytet-5 tiin sekvenssianalyysiin ilman enempää puhdistamista.

CDase:n reaktio 4-vinvvlipvrldiinin kanssa CDase:a esimerkin 1 vaiheesta 6 modifioitiin lisäämällä 4-10 vinyylipyridiiniä seuraavalla tavalla. CDase pelkistettiin 20 mM:lla ditiotreitolilla 0,1 rol:ssa 0,4 M Tris-HCl-puskuria, pH 8,5, sisältäen 6 M guanidiini-HCls a, 0,1 % Na2EDTA:aa, 50*C:ssa 2 tuntia ja sitten sen annettiin reagoida 100 mM:n kanssa 4-vinyylipyridiiniä yli yön 15 huoneen lämpötilassa. Reaktioseös hapotettiin pH 2,0:aan 20 %:lla TFA:lla, suola poistettiin ja puhdistettiin käänteis-faasi-HPLC:llä, kuten kuvattiin yllä.

Tulokseksi saadun tuotteen HPLC-analyysi merkitsi kahden 20 erillisen piikin läsnäoloa, jotka erotettiin ja analysoitiin uudelleen SDS-PAGEilla (kuvio 5). Pienempi piikki (erä A) vastaa 19 kDa:n vyöhykettä kuviossa 1 ja suurempi piikki vastaa 17 kDa:n vyöhykettä.

25 Aminopään aminohapposekvenssi proteiinissa erässä A (kuvio 4) saatiin identifioimalla aminohappo-fenyylitiohydanto-« iinijohdannaiset tähteeseen 27 asti. Sekvenssin huomattiin olevan identtinen leipurin hiivan superoksididismutaasin (EC 1.15.1.1, Steinman, 1980) N-pään sekvenssin kanssa.

30 Tämä varmistaa puhdistetun CDase:n geeleissä nähdyn pienemmän vyöhykkeen identtisyyden (kuvio 1, 5).

Kuvion 4 (erä B) suuremman piikin Edman-hajoamisesta ei saatu mitään aminohapposekvenssiä, mikä viittaa siihen, 35 että CDase:n aminopää oli estetty. CDase:n osittainen aminohapposekvenssi saatiin siksi sekventoimalla valittuja fragmentteja entsymaattisesta ja syanogeenibromidihajoamisesta, kuten kuvataan alla.

•« ' 28 95046 CDase: n entsvmaattinen 1a kemiallinen lohkominen

CDasem, jota oli modifioitu 4-vinyylipyridiinillä endopro-teinaasi Lys-C:n ja endoproteinaasi Glu-C:n kanssa, lohko-5 minen tehtiin 40 plsssa 0,1 M Tris-etikkahappopuskuria (pH

8,0) 37*C:ssa 12-16 tunnin ajan. Entsyymi/substraatti-suhde oli vastaavasti 1:10 (paino/paino). Endoproteinaasi Asp-N-lohkaisu tehtiin samalla tavalla entsyymi/substraat-ti-suhteessa 1:100 37’C:ssa 12-16 tunnin aikana. Entsy-10 maattiset pätkimiset hapotettiin 20 %:lla TFA:lla pH 2,Oraan ja erotettiin käänteisfaasi-HPLC:llä.

Syanogeenibromidia (CNBr) käytettiin lohkaisemaan metionyy-litähteissä oleva CDase. CDase (2,25 nmol), joka oli 15 modifioitu 4-vinyylipyridiinillä, pantiin uudelleen kokoon 40 plrssa 70 % muurahaishappoa ja 200 kertainen mooliyli-määrä CNBr:a 70 % muurahaishapossa lisättiin. Reaktion annettiin edetä 35*C:ssa 2 tuntia ja sitten noin 12-16 tuntia huoneen lämpötilassa. Pilkottu tuote laimennettiin 20 vedellä ja tyhjökuivattiin ylimääräisen CNBr:n poistamiseksi. Liuos valmistettiin 1 % TFArhan käänteisfaasi-HPLC-analyysiä varten.

Kuvio 6 esittää osittaisen CDase;n aminohapposekvenssin 25 fragmenteista, jotka saatiin syanogeenibromidilohkaisusta ja proteolyyttisestä lohkaisusta käyttäen entsyymejä, : endoproteinaasi Glu-C:tä, endoproteinaasi Lys-C:tä ja endoproteinaasi Asp-N:ää. 154 aminohapon alue identifioitiin, joka käsitti proteiinirungon. Aminohappotähteiden 30 numerointi ei sisällä niitä aminohappoja lähellä aminopää-tä, joita ei ole vielä identifioitu. Osittaisen CDase-sekvenssin vertailu minkä tahansa muun tunnetun sekvenssin kanssa, sisältäen hiiren adenosiinideaminaasin (Yeung et ai., 1985) ja leipurin hiivan dCMP-deaminaasin (McIntosh 35 and Haynes, 1986) ei paljastanut mitään olennaista homolo-giaa.

95046

Esimerkki 3 CDase-qeenln kloonaus 1a ilmentäminen

Geeniä koodittava CDase eristettiin cerevlsiaetn (leipu-5 rin hiiva) laboratoriokannoista ja se ilmennettiin imettä-väissolulinjassa käyttäen seuraavaa menetelmää:

Vaihe 1. CDase-speslflsen koettimen luominen käyttäen PCR:ää 10

Syntetisoitiin kaksi oligonukleotidialuketta automaattisessa DNA-syntetisaattorissa käyttäen osittaista aminohapposekvenssiä ja kodoninkäyttökuvioita S. cerevisiea'sta (Guthrie and Abelson, 1982) ohjaimena DNA-sekvenssin \ 15 "guessraer"-segmenttien suunnittelussa. Alukkeet, jotka nimettiin CDA4Rl:ksi ja CDA5AS:ksi, olivat molemmat 42-meerejä sisältäen 33 nukleotidia sekvenssistä, joka vastaa CDase;n "sense"- ja vastaavasti "antisense"-säikeitä.

Kunkin oligonukleotidin loppu on kooditettu EcoRI:n res-20 triktioentsyymin paikkaa varten. Kahden alukkeen sekvenssi on esitetty kuviossa 7.

Kumpikin aluke oli läsnä joko 50 tai 100 pmol määrässä reaktiota kohti. Kaksi geenikirjastoa, joita käytettiin 25 malli-DNA:na PCR-reaktioisssa, rakennettiin hiivan geeni- DNA:sta Sau3A-osittaisella restriktiopilkkomisella, mitä : seurasi kiinnittäminen CV13- tai YCp50-sukkulavektorin

BamHI-paikkoihin. Nämä kaksi vektoria ja geenikirjastot ovat yleisesti saatavia alan ihmisille ja ne saatiin 30 Washingtonin Yliopiston genetiikan osastolta. Molemmat kirjastot saatiin jo transformoituna bakteeri-isäntiin. Kirjaston DNA eristettiin alkaalisilla lyysiplasmidivalrais-teilla, jotka oli sen jälkeen puhdistettu linkoamalla cesiumkloridi-etidiumbromidi tiheysgradienttien läpi. PCR-35 reaktiot suoritettiin käyttäen 1 pg CsCl-puhdistettua CV13-tai YCp50- geenikirjasto-DNA:ta hiivasta, 50 tai 100 pmol kumpaakin aluketta, 1/10 tilavuus 10-kertaista PCR-reak-tiopuskuria (Stratagene), 16/100-tilavuus 1,25 mM dNTP:eitä 30 95046 (A, G, T, C) (5U/pl, Stratagene) lopulliseen 100 ralsn tilavuuteen. Reaktiot suoritettiin steriileissä raikrofuugi-putkissa 75 pl:n kerroksen alla puhdistettua mineraaliöljyä haihtumisen estämiseksi. PCR-reaktion suoritettiin Perkin-5 Elmer Cetus Thermal Cycler-laitteessa 30 syklin ohjelmalla, johon liittyi seuraavat lämpötilaportaat: 94’ C vaihe-sykli 30 sekunnin ajan denaturoimiseksi, 55* C 45 sekunnin . ajan liittämiseksi ja 72’ C 1,5 minuuttia (90 sekuntia) jatkoksi.

10 PCR-reaktion näytteitä analysoitiin agaroosigeeleillä etsittäessä todisteita 350 emäsparin fragmenteista, jotka koodittavat suurinta osaa CDase:a. 350 emäsparin fragmentit puhdistettiin sitten preparatiivisella agaroosigee-15 lielektroforeesilla, mitä seurasi eluointi käyttäen menettelytapaa ja reagensseja, jotka toimitettiin GeneClean-kitin (BIO101) mukana alukkeiden ja heterologisten fragmenttien poistamiseksi valmisteesta.

20 Vaihe 2. PCR-fraomenttien alikloonaus sekventoimista varten PCR-fragmentteja vaiheesta 1 muokattiin EcoRI-restrik-tiopaikoilla niiden 5'-päissä minkä tahansa luotujen fragmenttien kloonauksen helpottamiseksi. Näyte puhdiste-25 tusta 350 emäsparin PCR:stä saadusta fragmentista pilkottiin restriktioentsyymillä EcoRI ja kiinnitettiin EcoRI-leikattuun fagemidivektoriin pBSII-SK+ (Stratagene). Res-triktioentsyymit saatiin Boehringer Mannhein Biochemical-yhtiöltä (BMB) . Pilkkeitä inkuboitiin 37*C:S,sa 2. tuntia, 30 mitä seurasi uuttaminen yhtäläisellä tilavuudella fenoli:-kloroformi:isoarayylialkoholia ja etanolisaostus. Fragmentit suspendoitiin uudelleen TE:hen (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) ja sidottiin yhteen käyttäen T4 DNA-ligaasia (BMB). Kilpailevia JM109-bakteereita transformoi-35 tiin 1/5 kanssa kiinnittyraisreaktiosta ja sopivat laimennokset asetettiin LB+ampisilliini-levyille (100 μΐ/ml), joita oli täydennetty XGal:lla (50 μΐ 2 % ainetta diraetyy-liforraamidissa) ja IPTGtllä (10μ1 100 mM ainetta). Valkeat ! 3i 95046 pesäkkeet poimittiin ja pienen mittakaavan plasmidivalmistuksia suoritettiin menettelytapojen, jotka on esittänyt Sambrook et ai. (1989), mukaan. Plasmidit seulottiin 350 emäsparin osien suhteen pilkkomalla EcoRI:lla. Poimittiin 5 useita erilaisia eristettyjä osia, plasmidi-DNA eristettiin ja puhdistettiin ja sille tehtiin DNA-sekvenssianalyysi.

Vaihe 3. PCR-fragment!n käyttö CDase-soesifisenä koettimena hiivan aeenikiriastoien seulomiseksi 10

Vaiheessa 1 saatua PCR-fragmenttia käytettiin myös koettimena CDase:a koodittavan sekvenssin havaitsemiseksi seulottaessa geenikirjastoja sellaisia klooneja varten, jotka sisältävät geenin. Puhdistettu fragmentti leimattiin käyt-15 täen alfa-32P-dCTP:tä ja satunnaisaluke-DNA-leimaussarjaa, jonka on valmistanut Boehringer Mannheim Biochemicals. Hiivakirjastoja viljeltiin yli yön LB+amp:ssa ja laimennoksia päällystettiin LB+amp-levyille antaakseen 250-2000 pesäkettä/levy pesäketiheyksiä. Pesäkkeiden poimimiseen 20 käytettiin 0,45 pm:n nitroselluloosarenkaita tai -neliöitä, jotka saatiin Schliecher and Schuellita. Suodattimia käsiteltiin asettamalla ne pesäkepuoli ylöspäin Whatman 3MM-paperille, joka oli kyllästetty 10 %:lla SDS:llä, viideksi minuutiksi kiinnitystä varten, 0,5 M NaOHslla, 1,5 25 M NaClslla viideksi minuutiksi denaturoimista varten, 1,5 M NaCl:lla, 0,5 M Tris-HCl:llä, pH 7,4, viideksi minuutiksi : neutralointia varten ja 2 x SSC:llä viideksi minuutiksi ennen UV-ristisidostamista Stratalinkerillä (Stratagene), valmistajan ohjeiden mukaan. Suodattimet upotettiin sitten 30 2 x SSC:hen viideksi minuutiksi ja esipestiin 5 x SSC:ssä, 0,5 % SDS:ssä, 1 mM EDTA:SSa 50*C:SSa.

Esihybridisaatio suoritettiin lämpösaumattavissa muovipusseissa, jotka sisälsivät 20 ml liuosta 12 suodattimen 35 pussia kohti. Esihybridisointiliuos sisälsi 50 % formami-dia, 6 x SSC, 0,01 M NaP pH 6,8, 1 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 % SDS, 100 pg/ml denaturoitu lohen maidin DNA:ta ja 5X Denhardtin liuosta. Muovipussit upotettiin 42*C vesikylpyyn „ 95046 32 ja niitä inkuboitiin noin 12-16 tuntia. Leimattu koetin puhdistettiin kiinnittymattömistä nukleotideista eluoimalla Push-pylväistä (Stratagene). Koetin lisättiin noin määrässä 106 cpm/ml nestettä ja inkubointia suoritettiin noin 12-16 5 tuntia 42*C:ssa hydribisäätiötä varten.

Suodattimia pestiin useita kertoja 2 x SSC, 0,1 % SDS:ssä huoneen lämpötilassa, mitä seurasi pesu 1 X SSC, 0,1 % SDS:ssä 55*C:ssa tunnin ajan. Suodattimet ilmakuivattiin, 10 käärittiin saraanikääreeseen ja ne pantiin yli yöksi röntgenfilmille -70* C:ssa vahvistavien suodattimien kanssa. Autoradiografit asetettiin kohdakkain suodattimien ja kantalevyjen kanssa sellaisten kloonien valitsemiseksi, joissa oli positiivinen hybridisaatiosignaali. Positiiviset 15 kloonit seulottiin uudelleen yllämainitulla menetelmällä vielä kahdesti ennen plasmidin eristämistä. Plasmidi-DNA eristettiin viljelemällä klooriamfenikolimonistettuja LB+arapisilliiniviljelmiä ja sen jälkeen puhdistamalla käyttäen alkaalisen lyysin tekniikkaa, kuten on kuvannut 20 Sarabrook et ai., 1989. Jotkut plasroidit puhdistettiin cesiumkloridi-etidiumbromidi-tasapainolinkouksella, kun taas muut eluoitiin PZ253-pylväistä {5’->3 *), mitä seurasi saostaminen polyetyleeniglykolilla, fenoli-.kloroformiuutta-minen ja etanolisaostus.

25

Vaihe 4. PCR;stä saadun ia geenin CDase;a koodittavien : kloonien sekventoiminen

Useita 18-meerisiä oligonukleotideja syntetisoitiin tai 30 tilattiin DNA:n sekventoiraiseksi PCR:stä ja geenin CDase-klooneista. Eräät alukkeet kehittivät sekvenssin koodaus-säikeestä, kun taas toiset antoivat sekvenssin komplemen-taarisäikeestä. Sekventointireaktiot suoritettiin niiden menettelytapojen ja reagenssien mukaisesti, jotka toimitet-35 tiin Sequanase Version 2.0 Kit.-ssä (United States Biochemical) . DNA denaturoitiin alkaalisella denaturoinnilla 0,2 N NaOH:ssa ennen sekventointireaktioita. Leimausreaktioseok-sen laimennoksia ja reaktioaikoja vaihdeltiin riippuen 33 95046 alueesta, jonka sekvenssiä haluttiin. Useimpia reaktioita varten käytettiin l-l,5.pmol templaatti-DNA:ta ja alukkeita 10-15 pCi:n kanssa alfa-35S-dATP:tä reaktiota kohti. Näytteet ladattiin 8 % polyakryyliamidi-urea-sekventointi-5 geeleihin ja ajettiin 1-7 tuntia riippuen luettavasta sekvenssistä. Geelit kiinnitettiin 10 % metanoli- 10 % etikkahappoon 30 minuutiksi ja kuivattiin 80*C:Ssa 45 minuuttia käyttäen Slab-Gel-kuivaajaa, joka oli kiinnitetty tyhjöpumppuun. Kuivatut geelit pantiin Kodak XAR-5-10 filmille huoneen lämpötilassa 18-72 tunniksi. Sekvenssit luettiin manuaalisesti. Sekvenssin kohdistus ja analyysi suoritettiin tietokoneella käyttäen Gene Pro-ohjelmaa (Riverside Scientific, Seattle, Washington). Kuvio 8 esittää geenin CDase:a koodittavien kloonien nukleoti-15 disekvenssin. Kuvio 10 esittää ennustetun aminohapposekvenssin. Kuten voidaan nähdä kuvioista, koodaussekvenssi käsittää noin 474 emäsparia ja määrittää 158 aminohapon proteiinin. Niin saadun CDase:n ennustettu molekyylipaino on noin 17506 daltonia.

20

Vaihe 5. CDase:a koodittavien kasettien rakentaminen hiivassa ia imettäväisiärlestelmissä tapahtuvaa ilmentämistä varten 25 Vaiheesta 4 saatua DNA-sekvenssiä käytettiin oligönukleo-tidialukkeiden suunnitteluun PCR:n kehittämiä CDase:a koodittavia kasetteja varten. Joihinkin näihin oligonukle-otideihin liittyi lisäsekvenssejä, kuten erityssignaalipep-tidejä ja restriktiopaikkoja käytettäväksi kloonauksessa 30 tai ekspressiossaJ Oligonukleotidialukkeita käytettiin pareina PCR-fragraenttien luomiseen sopivien sekvenssien ollessa lisättyjä päihin.

Erityisesti rakennettiin PCR:n avulla kasetti, joka koodit-35 ti CDase:a käyttäen kahta aluketta, jotka sisälsivät sekä* CDase-spesifisen sekvenssin että lisäsekvenssin, joka - kooditti restriktiopaikkoja kloonausta varten. 5'-aluke oli 65-meeri, joka sisälsi 45 sellaisen sekvenssin emästä, joka 34 95046 oli homologinen, muttei täysin identtinen CDasetn genomiko-pion 5'-pään kanssa, joka oli kiinnittynyt 5'-häntään, joka sisälsi restriktiopaikat Hindlll, Sali ja Ncol. 3'-aluke oli 39-meeri, joka oli identtinen CDase:n C-pään antisense-5 säikeen kanssa, jolloin siinä oli Xbal-häntä kiinnittyneenä sen 5'-päähän- Käytetty templaatti oli CDasesn genomiklooni noin 1 ng:n määrässä reaktiota kohti. Kutakin aluketta oli läsnä 75 pmol pitoisuudessa. PCR-reaktiot suoritettiin, kuten kuvattiin vaihetta 1 varten.

10 PCR-reaktiotuotteet puhdistettiin uuttamalla kloroformilla ja seostamalla etanolilla. DNA pilkottiin sen jälkeen restriktioentsyymeillä Hindlll ja Xbal, niille suoritettiin geelielektroforeesi ja ne puhdistettiin eluoimalla Gene-15 Clean:llä (B10101) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Vaihe 6. CDase:n ilmentäminen imettäväislärlestelmässä

Vaiheen 5 puhdistettu fragmentti kiinnitettiin Hindlll-20 Xbal-pilkottuun CDM8- tai pH3M-plasraidivektoriin ja transformoitiin bakteeri-isäntään MC1061 (Aruffo and Seed, 1987). pH3M-vektorin kartta on esitetty kuviossa 12.

Poimittiin kaksikymmentä transformanttia, suoritettiin pienen mittakaavan alkaalinen lyysi plasmidien valmistami-25 seksi ja eriä pilkottiin HindiII+XbäI:llä niiden rakenteen vahvistamiseksi. Jäljelle jäänyttä plasmidia kolmesta . valmisteesta käytettiin COS-solujen transfektioon DEAE- dekstraani-transfektiomenetelmällä (Ausubel, et ai., toim. Current Protocols on Molecular Biology1.

30

Lyhyesti, 3,5 x 105 COS-solua pantiin 6 cra:n viljelyastioi-hin DMEM/10 % härän sikiöseerumia (PBS) ja sitä inkuboitiin yli yön 6 % C02:ssa 37*C:ssa. Minivalmisteiden DNA sekoitettiin coctailina PBS:n ja 50 mg/ml DEAE-dekstraanin kanssa 35 100 μ1:η lopulliseen tilavuuteen alla annetuissa määrin.

35 9 5 0 4 6 Näyte DNA FBS DEAE-dekstraani _(50 roq/ml)_

Kontrollit 5 Sham 0 μΐ 80 μΐ 20 μΐ ΒΒ1 4 μΐ 76 μΐ 20 μΐ CDase-transfektantit 1- 1 13 μΐ 67 μΐ 20 μΐ 10 1-4 13 μΐ 67 μΐ 20 μΐ 2- 6 13 μΐ 67 μΐ 20 μΐ

Kukin transfektio tehtiin kaksoissarjana. Päivän vanha viljelyväliaine imettiin astioista ja solut pestiin kolme 15 kertaa 2 ml:11a PBS:ää pesua kohti. Lisättiin DMEM-kloro-kiini-transfektioväliainetta 1,7 ml/levyä kohti ja DNA-coctail lisättiin tipoittain väliaineeseen. Transfektioita inkuboitiin 3 tuntia, väliaine poistettiin, soluja ravistettiin FBS/10 % DMSO:11a 2 minuuttia, pestiin kolme kertaa 20 seerumittoraassa väliaineessa ja inkuboitiin 3 päivää 3,5 ml:ssa DMEM/10 % PBS:ää levyä kohti.

Vaihe 7. Yhdistelmäeskoressiotuotteiden karakterisointi 25 1. Radioimmunologiset saostukset:

Vaiheen 6 levyjä käytettäväksi radioimmunologiseen saostukseen (RIPS) inkuboitiin noin 12-16 tuntia tuoreessa DMEM/10 % FBS:ssä, joka sisälsi 200 pCi/ml 35S-metioniiniä.

30 RIPS suoritettiin imemällä leimattu väliaine noin 12-16 tunnin 37*C:ssa inkuboinnin jälkeen, lisäämällä 1 ml 1 % ‘ 0G-P04RIPAE-puskuria (50 mM Na2HP04, 1 % Na-deoksikolaattia, 1 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM 35 EGTA, 2 mM PMSF ja 1 pg/ml aprotiinia=P04-RIPAE, jossa on oktoglukosidia lisättynä 1 % asti) kuhunkin viljelyastiaan ja inkuboimalla 40 minuuttia jäillä jäähdytettynä. Lysaatit siirrettiin 10 ml:n Oak Ridge-linkousputkiin ja niitä * 36 I.

95046 lingottiin 40000 kierr./min, 4*C, 40 minuuttia. Nesteet siirrettiin kahteen mikrolinkousputkeen jäissä (0,4 ral/put-ki). BBl-transfektantteja inkuboitiin 2 pg:n kanssa vasta-ainetta, kun taas 17,5 μΐ tai 31,5 μΐ kanin anti-CDase:n 5 polyklonaalista antiseerumia lisättiin muihin transfektant-teihin. RIPS:iä inkuboitiin jäissä 1 tunti. Vuohen anti-hiiri -vasta-ainetta lisättiin BB1-putkeen toisiovasta-aineena ja inkuboitiin 20 minuuttia jäillä jäähdyttäen.

10 Staphylococcus aureausta (Calbiochem) pestiin (700 μΐ) 0,5 % NP-40/TES-puskurissa, sitten 0,05 % NP-40/TES-puskurissa ja lopulta se suspendoitiin uudelleen P04-RIPAE-puskuriin 1 mg/ml munanalbumiinin kanssa (TES=50 mM Tis-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl). Viidenkymmennen mikrolitran näyttei-15 tä pestyä StaphA-bakteereja lisättiin RIP-materiaaliin ja sitä inkuboitiin 10 minuuttia jäillä. RIPS pelletoitiin mikrolinkousputkissa ja pestiin kolme kertaa 0,5 mltssa TNEN:ä (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % NP-40). Lopulliset pelletit alkuperäisistä 400 μ1:η 20 kaksoisnäytteistä suspendoitiin uudelleen joko 35 pl:aan pelkistävää tai 35 plraan ei-pelkistävää SDS-PAGE-käyttö-puskuria. Näytteet ladattiin 10-20 % SDS-PAGE-gradientti-geeliin yhdessä alhaisen molekyylipainon Bio-Rad'lta saatujen proteiiniraarkkereiden kanssa ja sitä elektrofo-25 resoitiin 300-voltilla arviolta 2 tuntia. Geelit värjättiin Goomassie Blue-väriaineella, väri poistettiin 10 % me-: tanolissa, 5 % etikkahapossa 12-16 tunnin ajan, levitettiin vahvistumista varten 30 minuutiksi, sitten pestiin kolme kertaa vedessä ennen kuivausta 60'C:ssa 1 tunnin ajan.

30 Geelin 4 tunnin levitys röntgenf Hitille havainnollisti 17000 daltonin vyöhykkeen shara-näytteissä, 17000 daltonin vyöhykkeen BB1-näytteissä, mutta noin 45000 daltonin spesifisen vyöhykkeen BB1-näytteissä, kun taas kaikilla kolmella transfektantilla oli spesifinen vyöhyke arviolta 35 17000 daltonin kohdalla.

2-. Western-analvvsi: 95046

Vaiheen 6 kaksoistransfektiolevyt jätettiin leimaamatta ja pesäkkeet kerättiin kolmen päivän inkubaatiojakson jälkeen. Väliaine imettiin pois, solut pestiin PBS:llä, sitten ne suspendoitiin 0,5 ml:aan 10 mM Tris-HCl:a (pH 8,0) sisältä-5 en 1 pg/ml aprotiinia ja 30 pg/ml PMSF:ää. Solut poistettiin viljelyastioista käyttäen steriilejä raapimia ja ne siirrettiin steriileihin mikrolinkousputkiin jäillä jäähdyttäen. Kutakin suspensiota käsiteltiin ultraäänellä jäillä jäähdyttäen 2-15 sekunnin erissä täydellä teholla.

10 Lysaatteja lingottiin kaksikymmentä minuuttia jäähdytetyssä mikrolinkousputkessa solujätteen poistamiseksi ja nesteet siirrettiin uusiin putkiin. Entsyyraianalyysit suoritettiin, kuten kuvataan alla.

15 Eriä näistä lysaateista käytettiin myös Western-blottauksen suorittamiseen käyttäen polyklonaalista kanin antiseerumia, joka oli tehty puhdistettua CDase:a vastaan. 25 μ1:η näytteille laimentaroattomista transfektanttilysaateista suoritettiin SDS-PAGE-elektroforeesi, kuten kuvattiin 20 RIPS:iä varten, paitsi että puhdistetun CDasesn sarjalai- mennolcset ladattiin geeliin pitoisuusstandardeina. Konsentroitu CDase pitoisuudella 500 ng/kaista laimennettiin 5-kertaisin lisäyksin 100 ng, 20 ng, 4 ng ja 0,8 ng/vyöhyke. Geeli blotattiin sitten sähköisesti nitroselluloosasuodat-25 timelle CSH-kloonausohjekirjän (Sambrook et ai., 1989) menettelytapojen mukaisesti.

Täplät suljettiin Blotto'on 1 tunniksi (Blotto=PBS + 1 % rasvatonta maitoa + 0,5 % NP-40). Lisättiin tuoretta 30 Blotto’a, joka sisälsi 2,5 pg/ml polyklonaalista kanin anti-CDase-seerumia, suodattimeen ja sitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunti. Suodatin pestiin kolme kertaa ! 5 minuuttia Blotto'ssa, mitä seurasi inkubointi alkaalises- sa fosfataasikonjugaatissa (Boehringer Mannheim Biochemi-35 cals) laimennettuna 1:1000 Blotto'on. -Ylimääräinen vasta-ainekonjugaatti poistettiin kolmella pesulla Blotto'lla ja loppupesulla alkaalisessa fosfataasisubstraattipuskurissa (100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) . Suoda- 38 95046 tinta inkuboitiin sitten 15 minuuttia 40 ml:ssa substraat-tipuskuria, johon oli lisätty 12 mg bromikorindolyylifos-faattia ja 7 mg nitrosinistä tatratsoliumia värin kehittämiseksi. Reaktiot pysäytettiin pesemällä suodatin tislatus-5 sa vedessä.

Värin kehittyessä kaikilla kolmella transfektantilla oli vyöhykkeitä, jotka jakaantuvat suurinpiirtein 17000 dalto-nin kohdalle voimakkuuksien ollessa suurempia kuin 0,8 ng 10 and pienempiä kuin 4 ng pitoisuusstandardit puhdistettua CDase:a varten.

3. Yhdistelmäekspressoidun CDase.-n aktiivisuuden mittaukset 15 5-Fluorisytosiinin (5-FC) muuttuminen 5-fluoriurasiiliksi (5-FU) mitattiin yllä transformoitujen COS-solujen uutteista. Transfektantit (kukin 3 x 105 solua), jotka sisälsivät CDasesa (1-1, 1-4, 2-6), sham-transfektiota tai vertailu-plasmiditransfektiota (BB1) rikottiin ultraäänellä 0,5 20 ml:ssa 10 raM TRIS-puskuria ja lingottiin. 100 pl:aan

kutakin liuosta ja 1 pg/ral liuokseen CDase:a lisättiin 170 μΐ fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) ja 30 μΐ 30 mM

5-FC-liuosta. Tämä antoi tuloksena 300 μΐ reaktioseosta, joka oli 3 mM 5-FC:n suhteen. Tehtiin myös kontrollireaktio 25 ilman yhtään entsyymiä.

Putkia inkuboitiin 24 tuntia 37*C:ssa, minkä jälkeen 50 μΐ kutakin liuosta otettiin ja reaktio lopetettiin 1 ml :11a 0,1 N HC1:a. Nämä näytteet mitattiin UV-spektrofotometrissä 30 255 ja 290 nm:n aallonpituudella. Käyttäen yhtälöitä: (0,1191 x OD290 - 0, 02485 x OD255) x 20 = mM 5-FC ja (0, 1849 x OD255 - 0,04907 x OD290) x 20 = raM 5-FU, mitattiin 5-FC:n muuttuminen 5-FU:ksi. Sitten laskettiin aktiivisuusyksikköjen lukumäärä alkuperäisessä solu-uut-35 teessä (1 yksikkö = 1 pmol/min 5-FC:n muuttumista 5-FU:-ksi). Sham- ja BBl-transfektioista ja ilman entsyymiä suoritetusta reaktiosta ei saatu yhtään aktiivisuutta, kun taas kaikki kolme CDase:n transfektanttia olivat aktiivi- ! 39 9 5 0 4 6 sia. Transfektantissa 1-1 oli 0,41 x 10'3 yksikköä, l-4:ssä oli 0,54 x 10*3 yksikköä ja 2-6:ssa oli 0,26 x 10*3 yksikköä. Kontrollianalyysi 1 pg/ml CDase:lla muutti kaiken 5-PC:n 5-FU:ksi. Olettaen, että puhtaan CDase:n aktiivisuus on 40 5 U/mg, oli aktiivista CDase:a 10 ng (1-1), 13,5 ng (1-4) ja 7,3 ng (2-6).

Samat näytteet tutkittiin myös riippumattomalla amalyysil-lä. Kukin analyysiputki sisälsi 50 μΐ liuosta tai 1 pg/ral 10 CDase:a, 130 μΐ PBS, 20 μΐ 30 mM 5-PC ja 1 pCi [3H]5-FC. Näitä reaktioita inkuboitiin 24 tuntia, haihdutettiin jäännökseksi, joka liuotettiin uudelleen 20 pl:aan me-tanolia ja ajettiin silikageeli-ohutkerroskromatografiale-vyillä (TLC). Levyt kehitettiin 96:4 asetoni/vedellä, jossa 15 Rf-arvot 5-PC:lie ja 5-FU:lle ovat 0,2 ja vastaavasti 0,8. Sopivat osat TLC-levyistä leikattiin pois ja asetettiin nestetuikenesteeseen. Nämä laskettiin nestetuikelaskurissa ja niistä määritettiin 5-FC:n ja 5-FU:n suhteelliset määrät kussakin näytteessä. Sham- ja BB1-näytteissä ei ollu 20 ollenkaann 5-FU:ta, kun taas kaikki transfektantit muuttivat 14 % 5-PC: stä 5-FU:ksi. Tämä voidaan muuttaa 0,6 x 10’3 yksiköksi per näyte täten vahvistaen UV-kokeessa lasketut määrät. Kontrollireaktio 1 pg/ml CDase:lla muutti kaiken 5-FC:n 5-FU:ksi.

25

Kokeet osoittavat,- että CDase-transfektantit ilmentävät todellakin aktiivista entsyymiä. Tämä, kytkettynä Western-täpläanalyysiin, merkitsee, että yhdistelraäentsyyniin spesifinen aktiivisuus on samanlainen kuin sen, joka on 30 eristetty hiivasta.

Täten on esitetty lämpöstabiili CDase ja myös menetelmät sen puhdistamiseksi ja yhdistelmätuottamiseksi. Vaikka tämän keksinnön parhaat suoritusmuodot onkin kuvattu jossa-35 kin määrin yksityiskohtaisesti, on ymmärrettävä, että se on kuvausta, eikä rajoittavaa ja että voidaan tehdä ilmeisiä muutoksia poikkeamatta oheisissa patenttivaatimuksissa määritellyn keksinnön hengestä ja suojapiiristä.

40 9 5 0 4 6

Viitteet

Aruffo, A., and Seed, B., PNASfUSAl 84:8573-8577. Ausubel, F.M., et al. (eds.), (1988) Current Protocols 5 in Molecular Biology. (Green Publishing Associates, N.Y.). Edge, (1981) Nature 292:756.

Guthrie, C., and Abelson, J., (1982) The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene

Expression, pp. 487-528, (J.N. Strathern et'al. eds., CSH) .

10 Hellström, (1984) Monoclonal Antibodies and Cancer.

pp. 31-47 (Wright et al., eds., Marcel Dekker, Inc., N.Y.).

Hellström, K.E., and Hellström, I., (1985) Monoclonal

Antibodies for Tumor Detecting and Drug Targeting, pp. 17-51 (Baldwin et al., eds., Academic Press, N.Y.).

15 Hovland, P., et al., (1989) Gene 83:57-64.

Ipata, P.L., et al., (1971) Biochemistry 10:4270-4276. Ipata, P.L and Cercignani, G. (1978) Meth. Enz.

51:394-401.

Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

20 Johnston, M. (1987) Microbiol. Rev. 51:458-476.

Katsuragi, T. (1988) Personal communication.

Katsuragi, T., et al., (1986) Agric. Biol. Chem.

50:1721-1730.

Katsuragi, T., et al., (1987) App. 3iochem. Biotech.

25 16:61-69.

Kream, J. and Chargaff, E. (1952) J. Amer. Chem.Soc. 74:5157-5160.

Kunitz, M.J. (1947) J. Gen. Phvsiol. 29:393.

Malik, N., et al., (1989) MCB 9:2847-2853.

30 McIntosh, E.M. and Haynes, R.H. (1986) Mol. Cell Biol.

6:1711-1721.

Nambair et al., (1984) Science 223: 1299.

Nishiyama, T., et al., (1985) Cancer Res. 45:1753-1761. 0'Donovan, G.A. and Neuhard, J. (1970) Bact. Rev.

35 34:278-343.

4i 95046

Sakai, T., et ai., (1985) J. Biotech. 2:13-21.

Sakai, T., et ai., (1986) Nature 324:163.

Sakai, T., et ai., (1988) Science 239:487-491.

Sambrook, J., et ai., Molecular Cloninc: A Laboratory 5 Manual. Second edition, (1989) (CSH Press).

Scharf, et ai., (1986) Science 233:1076.

Scopes, R.K., Protein Purification Principles and Practice. 2nd ed. (Springer-Verlag 1987).

Senter, P.D., et al., (1987) U.S. Patent App. 081,382. 10 Stamenkovic, 1990 (in press).

Steinman, H.M. (1980) J. Biol. Chem. 255:6758-6765. West, T.P., et al., (1982) Biochim. Biophvs. Acta 719:251-258.

Yergatian, S., et al., (1977) Experientia 33:1570-1571. 15 Yeung, C.Y., et al., (1985) J. Biol. Chem.

260:10299-10307.

Claims (6)

42 95046

1. Eristetty nukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, että se koodittaa lämpöstabiilia sytosiinideaminaasia, jossa sekvenssi on sellainen kuin on merkitty kuviossa 10 tai sen 5 kanssa olennaisesti homologinen.

2. Yhdistelmäekspressiovektori, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen nukleotidisekvenssin ja on tehokas sitä ilmentäessään. 10

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmäekspressiovektori, tunnettu siitä, että nukleotidisekvenssi on käyttökelpoi-sesti liitetty säätösekvensseihin, jotka sopivat isäntäso-luun. is

4. Isäntäsolut, tunnettu siitä, että ne ovat hiivasoluja, jotka ovat transformoituja patenttivaatimuksen 3 mukaisella yhdistelmäekspressiovektorilla.

5. Isäntäsolut, tunnettu siitä, että ne ovat imettäväissolu- ja, jotka ovat transformoituja patenttivaatimuksen 3 mukaisella yhdistelmäekspressiovektorilla.

6. Menetelmä lämpöstabiilin yhdistelmäsytosiinideaminaasin 25 tuottamiseksi, tunnettu siitä, että kasvatetaan patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukaisia isäntäsoluja. 43 9 5 0 4 6