PT94331B - Processo de preparacao de uma citosina desaminase termicamente estavel - Google Patents

Description

MEMÓRIA DBSCRITIVA

DA

PATENTE DB INVENÇÃO ' NO· 94.331

NOME: ONOOGEN LIMITED PARTNERSHIP

EPÍGRAFE: PROCESSO DE PREPARAÇAO DE LMA CITOSINA DESAMINASE TERMICAMENTE ESTÁVEL

INVENTORES: Peter Dana Senter, Peter Chong-Dug Su, Hans Marquardt,

Wirtha S. Haydcn, e Peter Linsley, cientistas nortearrer i canos , residentes respectivanvnte em 211 Stmmi t Avenue, East Apt. N9.421, Seattle, Washington 98102, em 6001 84th Avenue, S.E., Mercer fsland, Washington 98040, em 9222 S.E. 46th Street, Mercer ísland, Washington 98040, em 17340 Arbaurn Boulevard, S.N9.19, Seattle, Washington 98148, e em 2340 9th Avenue, W., Seattle, Washington 98119, Estados Unidos da América

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo da Convenção da União de Paris de 20 de Março de 1883.

de Junho de Γ989, e 1 de Junho de 1990, nos Estados Unidos da America, sob ο N9. 363.020, e 331.646 i

Titular :ONCOGEN LIMITED PARTNERSHIP

Epígrafe: PROCESSO DE PREPARAÇAO DE UMA CITOSINA

DESAMINASE TERMICAMENTE ESTÁVEL

MEMÓRIA D- E SCRITIVA

Campo do invento presente invento está relacionado, de uma forma geral, com a enzima citosina desaminase. Mais especificamente, o presente invento está relacionado com a purificação e produção recombinante de uma citosina desaminase termicamente estável derivada de Saccharomyces cerevisiae.

Antecedentes do invento

A citosina desaminase (CDase, EC 3.5.4.1) cataliza a hidrólise da citosina a uracilo pela seguinte reacçao:

NH

C.

'CH

II

XH

Citosina Desaminase

HX

NH-,

O

II

HN^/Cx'CH

I II

H citosina (4-amino-2-oxopirimidina) uracilo (2,4-dioxopirimidina)

A enzima, que desempenha um papel importante no metabolismo sido microbiano das pirimidinas (0'Donovan e Neuhard, 1970), tem isolada a partir de vários microorganismos diferentes, mas nao parece estar presente em células de mamíferos (Nishiyama et al, 1985) .

Tem-se mostrado que as propriedades físicas da CDase de vários organismos diferem significativamente em termos de peso molecular, estabilidade e em>subunidades de composição . Por exemplo, a CDase da Salmonella typhimurium tem sido purificada

até à	homogeneidade	r (através da	SDS-PAGE),	e é	composta	por
quatro	subunidades	de J54 kilodaltons (kDa)	cada	(West	et	al,
1982) ,	enquanto que	a enzima da	Eschericia	coli	tem	um	peso
molecular de 200 kDa	e é composta	de subunidades	de 35 e	40	kDa

(Katsuragi et al, 1986). Ambas estas enzimas têm uma elevada termoestabilidade, e mantêm uma alta actividade a 55° C.

A levedura de p3o (Saccharomyces cerevisiae) também tem sido usada como fonte de CDase . A CDase previamente obtida dai tem um peso molecular de 34 kDa, tal como ê determinado através de filtração em gel (Ipata et al, 1971, 1978) e de 32-33 kDa, tal como é determinada pela análise SDS-PAGE e pela análise de aminoácidos (Yergatian et al, 1977). A enzima CDase que tem sido previamente isolada a partir da levedura de p3o parece ser, portanto, uma proteína monomérica.

Soluções de CDase previamente isolada de levedura de pSo, mantêm actividade durante, pelo menos, 48 horas, quando conservadas a 4°C e a um pH entre 5 e 9 (Ipata et al, 1971, 1978). Contudo, mostrou-se que, a 37°C, uma preparaçSo em bruto de CDase de levedura de pao perde metade da sua actividade em 1 hora (Kream e Chargaff, 1952), e uma forma purificada da enzima

tem uma meia vida de 30 minutos (Katsuragi, 1988). A meia vida a 37°C pode ser aumentada para 28 dias através da imobilização da enzima em esferas de epoxi-acrilico (Katsuragi et al, 1987). Portanto, a instabilidade térmica da CDase de levedura de pão, conjuntamente com o seu baixo peso molecular, distinguem-na das enzimas bacterianas previamente descritas.

A CDase tem sido - terapêuticamente usada para a conversão do profármaco 5-fluorocitosina (5-FC) no fármaco r

anticancerigeno 5-fluorouracilo (5-FU) (Katsuragi et al, 1987; Nishiyama et al, 1985^ Sakai et al, 1985;Senter et al, 1987).Contudo, as fontes bacterianas de CDase nao sao práticas para tais usos, requerendo o cultivo em larga escala de forma a se obter uma actividade adequada (Sakai et al, 1985). Além disso, extractos microbiológicos podem causar efeitos secundários indesejáveis, nos recipientes que os contêm.

A levedura pode ser usada como fonte de CDase para se ultrapassarem estes problemas. Contudo, a instabilidade térmica do produto previamente obtido derivado da levedura requer que a enzima seja imobilizada antes do seu uso (Katsuragi et al, 1987). Assim, o isolamento e a purificação de uma CDase de levedura termicamente estável fornece uma enzima melhorada para uso em terapia anticancerigena. Da mesma maneira,a clonagem do gene para a CDase têrmicamente estável de levedura permite a introdução de alterações ou adições defenidas ao próprio gene, de sequências controlando a sua expressão, e de fusões de genes construídas entre o gene e outras moléculas. Estas novas construções aumentam a eficiência ou utilidade da enzima na terapia anticancerigena.

Sumário da invenção presente invento está baseado na descoberta inesperada de uma CDase térmicamente estável de levedura de p3o. Análises da sequência de aminoácidos para esta enzima revelam que nao há homologia significativa com sequências conhecidas de outras proteínas.

presente invento, directamente relacionado a uma sequência de nucleotidos isolada que codifica uma CDase termicamente estável ou uma proteina funcionalmente equivalente a

J ela, e a vectores de expressão recombinantes que compreendem e sâo eficientes na expressão desta sequência, a células hospedeiras transformadas através deles, e a métodos para produzir recombinantemente, uma CDase termicamenete estável ou a sua equivalente funcional.

presente invento também diz respeito a uma CDase termicamente estável isolada ou a uma proteina que lhe seja funcionalmente equivalente . Numa configuração particularmente preferida, a CDase é isolada a partir de Saccharomyces cerevisiae.

Outros aspectos, benefícios e utilidades do presente invento, depressa ocurrerâo aos especialistas desta técnica, ao longo desta apresentaçao.

Breve descrição das figuras

Nos esquemas, que constituem uma parte desta apresentaçao:

A figura 1 mostra uma análise SDS-PAGE da CDase (poliacrilamida 14% sob condições nao redutoras). As substâncias apresentadas em cada banda sao as seguintes. Nas bandas 1 e 9, proteínas marcadas; na banda 2, sobrenadante proveniente da autôlise da etapa 1 do exemplo 1; na banda 3, produto obtido apôs precipitação em (NH4)2SC>4 (70%)da etapa 2 do exemplo l;banda 4, produto obtido após precipitação em (NH4)2SC>4 (50 — 73%) da etapa 2 do exemplo 1; banda 5, produto derivado da cromatografia em Q-Sephárose da etapa 3 do exemplo 1; banda 6, produto obtido após a utilização de uma coluna G-75 da etapa 4 do exemplo 1; banda 7, produto obtido após purificação em octilJ

Sepharose da etapa 5 do exemplo 1; banda 8, produto final obtido após a utilização de uma segunda coluna G-75 da etapa 6 do exemplo 1.

A figura 2 apresenta o perfil de eluiçao da CDase a partir de uma coluna Sephadex G-50 (l,5xl00cm). (A) 27 U de CDase purificada foram misturadas com ribonuclease A (2 mg), ovalbumina (2 mg) e quimotripsinogene A (1 mg) e eluidas com PBS. As fracções foram lidas a 280 nm de modo a determinar a quantidade de proteina total e a 290 nm, usando como substrato 5 FC, de modo a determinar a actividade da CDase. (B) Eluiçâo da CDase na coluna Sephadex G-50 acima referida, sem os padrões de calibraçâo.

A figura 3 ilustra a estabilidade da CDase a 37°C. A CDase (72 U/mg) em PBS que continha BSA (lmg/ml) livre de protease, foi incubada a 37°C num tubo de polipropileno. A actividade da CDase foi determinada , em vários intervalos, usando 10 μΐ da solução enzimática.

A figura 4 mostra o perfil da CDase purificada através de HPLC. As barras horizontais indicam as fracções que formaram

um reservatório para a análise de sequência de aminoácidos.

A figura 5 ilustra a análise SDS-PAGE da CDase apôs purificação através de HPLC (poliacrilamida 15% sob condiçOes redutoras). Banda 1, reservatório A; banda 2, reservatório B.

A figura 6 apresenta a sequência parcial de aminoácido da CDase. S3o indicados os péptidos obtidos por quebra com CNBr (séries M) , endoproteinase Giu-C (séries E), endoproteinase Lys-C (séries K) e endoproteinase Asp-N (séries D).

A figura 7 mostra as sequências de nucleótidos dos i primers CDA4R1 e CDA5AS, as sequências de aminoácidos correspondentes e a posição relativa destes primers na sequência de aminoácidos da CDase. 0 CDA4R1 tem orientação 5'->3' na cadeia com sentido, enquanto que o CDA5AS tem orientação

5'—>3' na cadeia sem sentido.

A figura 8 apresenta a sequência de nucleotidos de DNA, que codificam a CDase, derivados dos clones genómicos.

A figura 9 apresenta a estrutura de leitura aberta (ORFs) que se encontra na sequência genómica da CDase.

A figura 10 mostra a sequência de nucleotidos e a correspondente sequência de aminoácidos da ORF 2. Aminoácidos adicionais, previsíveis pela sequência de nucleotidos mas nao detectados na sequênciaçao do peptido, estão realçados em bold, e os codões de INICIAÇAO e STOP estão enquadrados.

A figura 11 ilustra o vector de expressão do plasmídeo fusionator que contem o gene da CDase.

A figura 12 mostra o mapa genético do vector pH3M.

Exposição detalhada

A realização prática do presente invento empregará, a não ser quando de outro modo indicado, técnicas convencionais da quimica de proteinas, biologia molecular, microbiologia e tecnologia de DNA recombinante, que estão dentro das técnicas desta especialidade. Tais técnicas estão inteiramente explicadas na literatura. Veja-se, por- exemplo, Scopes, R.K., Protein Purification Principies and Practice, 2nd ed. (Springer-Verlag 1987); Methods in Enzymoloqy (S. Colowick e N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984).

A. Definições

Ao descrever o presente invento, os seguintes termos serão empregues, e tal como são aqui utilizados, pretende-se que sejam definidos como a seguir se indica.

Citosina desaminase termicamente estável refere-se a uma CDase que se mantém pelo menos 50% activa num estado livre, não imobilizado, durante mais de 12 horas a 37°C, de preferência durante mais de um dia a 37°C, e mais preferêncialmente, durante três dias a 37°C, como determinado através da observação da conversão da 5FC a 5FU na presença da enzima isolada pelo ensaio mais promenorisadamente descrito abaixo.

Uma sequência de aminoácidos ou proteina é substancialmente homóloga a outra sequência de aminoácidos ou proteina quando, pelo menos, cerca de 50 %, de preferência pelo menos cerca de 85% e, mais preferivelmente, pelo menos, cerca de 90-95%, dos aminoácidos coincidem com uma extensão definida da molécula. Adicionalmente, as variaçOes nos aminoácidos podem incluir substituições, delecções ou adições.

termo funcionalmente equivalente significa que a sequência de aminoácidos ou proteina define uma cadeia que produzirá uma enzima termicamente estável, como descrito acima, capaz de converter a 5FC em 5FU, como descrito nos exemplos. Uma proteina que é funcionalmente equivalente â CDase termicamente estável nao necessita de 'possuir a sequência exacta ou inteira de aminoácidos, descrita nas figuras. Em vez disso, a proteina pode consistir num fragmento biologicamente activo da mesma, sendo a actividade definida como acima. Adicionalmente, a proteina pode incluir adições, delecções ou substituições nas sequências apresentadas, desde que a proteina permaneça biologicamente activa.

Uma proteina purificada é uma proteina substancialmente livre de outros materiais. Por exemplo, a proteina A é substancialmente livre de B se B é uma mistura de outros componenetes celulares e proteinas, e quando, pelo menos, cerca de 50% do peso total presente de A+B , de preferência, pelo menos 75%, ou mais preferencialmente 90-95% ou mesmo 99% do peso presente é A. Contudo, purificado nao se refere ao método pelo qual a proteina é obtida. Assim, uma proteina purificada pode ser uma proteina produzida por técnicas recombinantes, produzida sintecticamente, ou isolada directamente de um organismo no qual a proteina ocorre naturalmente.

Os termos polipéptido e proteina sao usados no seu

sentido mais lato, i.e., referindo-se a qualquer polimero de aminoácidos (dipéptido ou maior) ligados através de ligações peptidicas. Desta maneira, os termos incluem oligopéptidos, fragmentos de proteinas, análogos, mutantes, proteinas de fusão, e outros. Estes termos incluem proteinas nativas e recombinantes.

As proteinas ou polipéptidos recombinantes referem-se a proteinas expressas 'a partir de uma sequência de nucleótidos recombinante ; i.e., produzidas a partir de células transformadas por uma construção de DNA exógeno que codifica o polipéptido desejado. ^J termo recombinante tal como é aqui usado para caracterizar a sequência de nucleótido que codifica a CDase, descreve ácidos nucleicos com origem genómica, no cDNA, semisintética ou sintética os quais, em virtude da sua origem ou manipulação, s3o ou uma sequência de nucleótidos que nao ocorre na natureza ou uma sequência de nucleótidos ligada a ácidos nucleicos que nao os que estão ligados a ela na natureza.

Uma réplica é um elemento genético qualquer (por exemplo, um plasmideo, um cromossoma, um virus) que se comporta como uma unidade autónoma de replicaçao de polinucleotidos dentro de uma célula; i.e., capaz de se replicar sob o seu próprio controlo.

Um vector é uma réplica à qual está ligado outro segmento polinucleotidico, de forma a provocar a replicaçao e/ou expressão do segmento ligado. Um vector de expressão refere-se a um vector capaz de replicaçao ou integração autónoma e contém sequências de controlo que dirigem a transcrição e tradução da sequência do nucleótido desejado num hospedeiro apropriado.

Uma sequência código é uma sequência polinucleotidica que é transcrita e/ou traduzida para um polipéptido.

Uma sequência promotora é uma região de regulaçao no DNA, capaz de se ligar à RNA polimerase e de iniciar a transcrição (i.e., na direcçao 3') da sequência código a jusante.

Uma sequência código,está sob o controlo da sequência promotora numa célula quando a transcrição da sequência código resulta da ligaçao da RNA polimerase à sequência promotora; a tradução do mRNA obtido 'resulta então no polipéptido codificado na sequência código.

Operacionalmente ligado refere-se a uma justaposição em que os componentes têm uma configuração tal de modo a poderem funcionar como habitualmente. Assim, sequências de controlo operacionalmente ligadas a uma sequência código sào capazes de efectuar a expressão de uma sequência código.

Sequências de controlo refere-se àquelas sequências que controlam a transcrição e/ou a traduçào da(s) sequência(s) código; estas podem incluir, mas nào estào limitadas a, sequências promotoras, sequências de iniciação e de terminação de transcrições, e sequências de iniciação e de terminação de traduções. Para além disso, sequências de controlo refere-se a sequências que controlam o processamento do polipéptido que é codificado pela sequência código; estes podem incluir, sem estarem limitados a, sequências de controlo de secreção, quebra por protease e glicolisaçao do polipéptido.

Uma sequência sinal pode ser incluída antes da sequência código. Esta sequência codifica um péptido sinal, que que se encontra na extremidade N-terminal do polipéptido, que comunica com a célula hospedeira de modo a dirigir o polipéptido para a superficie da célula ou secretar o polipéptido para o meio. Este pêptido sinal é retirado pela célula hospedeira antes da proteina sair da célula. As sequências sinal podem ser encontradas associadas a uma série de proteínas que sao nativas a procariotas e eucariotas. Por,exemplo, o factor alfa, que é uma proteina nativa da levedura, é secretado pela levedura, e a sua sequência sinal pode ser ligada a proteínas heterólogas para ser secretada para o meio (veja-se a patente norteamericana com o no de série 4546082). Para além disso, tem-se verificado que o factor alfa e os seus análogos secretam proteínas heterólogas de uma variedade de leveduras, tais como Saccharomyces e Kluyveromyces (veja-se, por exemplo, EPO Pub. no 0 301 669, data de publicação 1 de Fevereiro de 1989).

A transformação é a inserção de um polinucleõtido exógeno numa célula hospedeira, O polinucleõtido exógeno pode ser mantido como um plasmideo, ou, alternativamente, pode ser integrado no genoma do hospedeiro.

Células hospedeiras recombinantes, células hospedeiras, células e outros termos semelhantes que denotam microorganismos, são usados indistintamente, e referem-se a células que podem ser ou que têm sido usadas como recipientes para vectores recombinantes ou outro DNA transferido, e incluem a descendência da célula original transfectada. E um facto que a descendência de uma única célula parental pode n3o ser, necessariamente, completamente idêntica no complemento genômico ou total de DNA, à célula parental, devido a mutaçOes acidentais ou deliberadas. Assim, os termos denotam descendência da célula parental que seja suficientemente semelhante à progenitora para ser caracterizada pela propriedade relevante, por exemplo, a substituição de um gene nativo que codifica um enzima essencial por um gene clonado ligado a um gene estrutural que codifica o produto genético desejado.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de CDase é uma quantidade que, quando administrada com um substrato sobre o qual a CDase actua, é suficiente para converter o substrato num agente citotóxico activo que por sua vez pode inibir o crescimento de células tumorais.

B. Métodos Gerais presente invento diz respeito a uma CDase isolada de levedura que apresenta estabilidade térmica. Esta CDase tem propriedades que a distinguem das enzimas CDase anteriormente isoladas de levedura. 0 peso molecular da CDase recentemente isolada de levedura é de aproximadamente 32 kDa, como determinado por cromatografia de filtração em gel. 0 gel da SDS-PAGE mostra uma banda maior nos 17 kDa, indicando que a CDase presente consiste num dimero, em que cada subunidade tem um peso molecular de aproximadamente 17 kDa. Para além disso, enquanto se tem verificado que as enzimas CDase anteriormente isoladas da levedura s3o significativamente termolábeis a 37°C, a enzima purificada do presente invento é estável a esta temperatura. Para mais, a sequência de aminoácidos desta nova CDase n3o apresenta homologias significativas de sequência, com outras proteínas de sequência conhecidas. A clonagem e expressão do gene que codifica esta CDase única apresenta uma sequência código com o comprimento de aproxidamente 474 pares de bases, especificando uma proteina de 158 aminoácidos com um peso molecular previsto de cerca de

17506 Da. A CDase termicamente estável pode ser isolada de levedura, incluindo membros dos ascoporogéneos, basidiosporogéneos e leveduras imperfeitas. De preferência, a

CDase é isolada de membros da<familia das Saccharomycetoideae, sendo preferida a Saccharomyces sp. e particularmente preferida a Saccharomyces cerevisiae (levedura de pão). Tem-se verificado í que a Levedura Comprimida” de Fleishmann é uma excelente fonte de

J

CDase termicamente estável, e é de fácil aquisição comercial em padarias e mercearias.

O método corrente de purificação da CDase difere dos métodos reportados (veja-se, por exemplo, Katsuragi et al, 1987; Katsuragi et al, 1986; Ipata et al, 1978; Ipata et al, 1971) assim como dos de Katsuragi, 1988. Especificamente, o método emprega diferentes etapas de purificação, incluindo uma purificação adicional numa coluna de permeaçâo em gel, entre

- etapas de troca aniónica e cromatografia hidrofóbica (descritas

J abaixo), assim como diferentes condiçOes para purificação, incluindo diferentes tampões, pHs e diferentes constituintes de tampões, tais como EDTA e DTT. Para além disso, os métodos anteriores não produzem uma enzima termicamente estável.

primeiro passo na purificação da CDase termicamente estável a partir da levedura envolve a ruptura das células da levedura para obter um autolisado contendo CDase. A autólise pode ser conseguida usando um dos vários métodos conhecidos nesta técnica. Por exemplo, as células de levedura podem ser

Kunitz plasmolisadas com tolueno de acordo com o método de (1947). Particularmente útil é a exposição da levedura a um solvente orgânico tal como acetato de etilo seguido da adiçao de um tampao para manter a solução a um pH de aproximadamente 7. TampOes apropriados incluem o tampao de fosfato de potássio, tampao de fosfato salino, tampao Tris, assim como muitos outros conhecidos nesta técnica. ,0 . tampao contém, de preferência, sulfato de amónia a concentrações que vao desde 1 a 25%, de preferência 15%, assim como EDTA e ditiotreitol (DTT) para estabilizar a CDase. Alternativamente, o EDTA e o DTT podem ser eliminados deste e de tampões subsequentes. A concentração de EDTA, quando presente, varia entre 0.1 mM e 10 mM,sendo de preferência 5 mM, enquanto que o DTT pode estar presente em concentrações desde 0,.01 mM a 10 mM, de preferência 0.1 mM. Esta mistura é agitada durante vários dias, sendo o pH mantido a cerca de 7. Os restos de células podem ser removidos por centrifugação.

A seguir à autôlise, a proteina total é precipitada do autolisado usando sulfato de amónia. 0 sulfato de amónia é adicionado a concentrações suficientes para garantir uma maior razao de CDase em relaçao à proteina. Por exemplo, o sulfato de amónia pode ser primeiramente adicionado, até se atingir uma saturaçao entre 60 e 80%, de preferência uma saturaçao de 70%. 0

EDTA é de preferência incluído na mistura de reacçao a uma concentração entre 1 e 3 g/1, de preferência entre 1.5 e 2.0 g/1, deixando-se então prosseguir a reacçao durante várias horas, sendo o precipitado recolhido após centrifugação. 0 pellet é dissolvido num tampao conveniente, tal como o PBS, a um pH de aproximadamente 7.0, contendo o tampao, de preferência, EDTA e

o mesmo

DTT, como acima, e sendo a solução dialisada contra tampão. 0 dialisado pode ser tratado uma segunda vez com sulfato de amónia para se atingir uma concentração de cerca de 50%, estando a EDTA presente como acima. 0 precipitado é novamente recolhido por centrifugação e é adicionado sulfato de amónia ao sobrenadante para se atingir uma saturação a cerca de 73%. 0 precipitado é recolhido e dissolvido num tampao conveniente com pH entre 6.5 e 8.5, de preferência um tampao Tris a pH 8.0, z

contendo DTT na concentração descrita acima. 0 precipitado reconstituído é então diaTisado contra este tampão durante várias horas. A CDase do dialisado pode ser ainda mais purificada através de cromatografia de troca de aniao usando, por exemplo, um material como uma rede de agarose ou celulose empacotada.

Particularmente convenientes s3o trocadores de aniOes tais como a

Q-Sepharose e a DEAE-Sepharose, disponíveis através do fabricante Pharmacia. Tampões de equilíbrio convenientes incluem, por exemplo, os tampões Tris ou fosfato, sendo a eluiçSo conseguida através do uso de um gradiente linear. Particularmente conveniente é o uso de tampão Tris 20 mM contendo DTT 0,1 mM a um pH de 8.0, com um gradiente linear de KC1 de 0 a 0,3 M, neste tampao.

A seguir à cromatografia por troca de aniônica, as fracções contendo actividade da CDase (tal como se apresenta abaixo) s3o postas num reservatório e concentradas por ultrafiltraçSo usando, por exemplo, um filtro de intercepçao para moléculas com o peso molecular de 30000 daltons (Da) ou menos.

Em seguida, a solução contendo CDase é corrida numa coluna de permeaçao em gel. Particularmente úteis sao as redes de

geles de dextrano , agarose ou dextrano/bisacrilamida, sendo preferidas as para Sephadex G-75, G-100 ou Sephacril S-300. 0 eluente pode ser qualquer tampao convencional, bem conhecidos nesta técnica, a um pH de cerca de 7, com preferência para PBS contendo DTT, tal como dsecrito atrás. As fracções contendo actividade da CDase sao postas num reservatório e dialisadas contra um tampao tal como ,o de fosfato de potássio. De preferência, o tampao contém cerca de 1 a 2 M de sulfato de amónia, e EDTA e DTT tal como acima descrito em relaçao ao tampao do autolisado. Uma segunda coluna de permeaçao em gel pode ser corrida se desejado, e as fracções com actividade concentradas por ultrafiltraçao usando um filtro de intercepçao para moléculas com peso molecular de, por exemplo, 5000 Da.

Em seguida, o material contendo a CDase pode ser aplicado a uma coluna que separa as substâncias baseadas em hidrofobicidade, eluindo-as através do uso ,por exemplo, de um gradiente invertido de sulfato de amónia em tampao de fosfato de potássio. As fracções com actividade da CDase sao combinadas e concentradas por ultrafiltraçao usando um filtro de intercepçao para moléculas com peso molecular de 5000 Da. 0 concentrado pode ser armazenado na forma congelada para outros usos. Contudo, se n3o se correu uma segunda coluna de permeaçao em gel e/ou se a actividade especifica da CDase é baixa, pode ser corrida outra coluna de permeaçao em gel , tal como acima descrito. A CDase assim purificada é termicamente estável e pode, portanto, ser armazenada na forma congelada ou liofilizada na forma livre.

A actividade da CDase pode ser observada durante a purificação através de vários métodos conhecidos nesta técnica.

Por exemplo, a conversão da citosina a uracilo, ou derivados deste, na presença de CDase, pode ser observada através de um ensaio espectofotométrico directo, desde o decréscimo em absorvância a 286 nm a seguir à conversão. (Veja-se, por exemplo, Ipata e Cercignani, 1978.) Alternativamente, a actividade pode ser determinada por observação por espectrofotometrica da conversão da 5FC em 5FU, tal como descrito por Nishiyama et al,

I

1985 e apresentado aqui para referência.

A CDase termicamente estável purificada desta maneira tem sido sequenciada tal jcomo é descrito na secção experimental e sequência parcial de aminoácidos pode ser vista na figura 6. A sequência não apresenta uma homologia significativa com outras proteinas sequenciadas conhecidas. Baseado nesta informação, a CDase termicamente estável pode ser produzida de uma forma recombinante. Por exemplo, as sequências de DNA que codificam a CDase podem ser preparadas sintecticamente, baseadas na sequência de aminoácidos obtida, usando codões apropriados. De um modo geral, uma pessoa escolherá os codões preferidos para o hospedeiro onde se pretende obter a expressão da CDase. A sequência completa é constituída por sobreposição de oligonucleôtidos, preparados pelos métodos Standard. Veja-se, por exemplo, Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et al (1984) Science 223;1299; Jay et al (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Alternativamente, a CDase recombinante e termicamente estável pode ser produzida da seguinte maneira. Podem ser preparadas sondas de oligonucleôtidos contendo codões para uma porção da sequência de aminoácidos determinada, que são usadas para seleccionar nas bibliotecas genómicas ou de cDNA para o gene

que codifica a CDase. As estratégias básicas para preparação das sondas de oligonucleôtidos e bibliotecas de DNA, assim como a sua selecção por hibridizaçOes de ácidos nucleicos, são bastante conhecidas dos especialistas com conhecimentos médios nesta técnica. Veja-se, por exemplo, Oligonucleotide Synthesis, supra; T. Maniatis et al, supra. Assim que um clone da biblioteca que sofreu o processo de selecção é identificado por hibridização positiva, podem ser feitas análises com enzimas de restrição e a

Λ sequenciação de DNA pode também ser realizada para confirmar que o particular inserto da biblioteca contém o gene que codifica a CDase. Para além disso, a reacção de polimerização em cadeia (PCR) pode ser usada para aumentar e, sequentemente, detectar a sequência de nucleótidos que codifica a-CDase. Este método é descrito em Saiki et al (1986) e nas patentes norte americanas com os no de série 4683195 e 4683202 , que são aqui apresentadas para referência. Análises da sequência de nucleótidos dos produtos aumentados da PCR podem ser conseguidas através da análise directa das sequências como descrito por Saiki et al (1988). Alternativamente, a(s) sequência(s) alvo aumentadas podem ser clonadas antes da análise de sequenciação. Um método para a clonagem directa e análises de sequência de segmentos de genoma enzimaticamente aumentados foi descrito por Scharf et al (1986). No método os primers usados na técnica da PCR são modificados perto da sua extremidade 5’ de modo a produzir locais de restrição convenientes para clonagem directa nos mesmos, por exemplo, um vector M13 de sequenciação. Após o aumento, os produtos da PCR são quebrados com as enzimas de restrição apropriadas. Os fragmentos de restrição são ligados no vector M13

e transformados nele, por exemplo, um hospedeiro JM 103 é plaqueado, e as placas resultantes sao seleccionadas através da hibridização com uma sonda de oligonucleótidos marcada. Sao conhecidos nesta técnica outros métodos para clonagem e análises de sequenciaçao.

Num método particularmaente preferido para uso com o presente invento, dois primers de oligonucleótidos foram sintetizados usando a sequência parcial de aminoácidos e o codao usado como padrao da S. cerevisiae (Guthrie e Abelson, 1982) como guia para projectar as sequências guessmer da sequência de DNA. Estes primers foram usados para reacções PCR nas quais estava presente como modelo a biblioteca genómica de DNA clonado de levedura. Os oligonucleótidos foram sintetizados a partir de regiões da CDase nas quais os aminoácidos mostravam os codões usados marcados obliquamente e/ou algumas degenerescências. O primeiro primer, CDA4R1, era de 42-mer contendo 33 nucleótidos correspondentes a um terminal amina de uma sequência de aminoácidos, enquanto que o segundo, CDA5AS, continha nucleótidos complementares à sequência localizada perto do carbono terminal da proteina. A sequência destes oligonucleótidos está ilustrada na figura 7. Foram usadas duas bibliotecas genómicas como modelo de DNA nas reacções PCR e verificou-se que ambas apresentavam um fragmento especifico único, com aproximadamente de 350 pares de bases de comprimento, o tamanho previsto a partir da correspondente sequência de aminoácidos disponivel. Os primers da PCR foram arranjados com locais de restrição EcoRI nos seus terminais 5', de modo a facilitar a clonagem dos fragmentos originados através da PCR. 0 fragmento derivado da PCR com 350 pares de bases foi purificado através de uma electroforese em gel e subclonado num vector apropriado para a sequênciaçao do DNA.

fragmento derivado de PCR foi também usado como uma sonda especifica para a CDase para seleccionar as bibliotecas de leveduras através de técnicas de hibridização com filtros de colónias . As primeiras tentativas para usar os oligonucleôtidos guessmer como sondas, falharam devido a uma baixa relaçao sinal/ruido, após a hibridização. Todos os clones potenciais análises de da reacçao nucleótidos e confirmando a foram repicados e re-seleccionados duas vezes para verificar o sinal de hibridização posj-tivo. Os plasmídeos foram purificados a partir de clones individuais e fez-se o mapa de restrição através da digestão com uma série de enzimas de restrição ambas sózinhas e em várias reacções múltiplas de digestão.

Ambos os fragmentos da PCR clonados e os clones genómicos que codificam a CDase foram sujeitos a sequônciaçáo de DNA. VariaçOes nas condições permitiram a análise de sequências directamente adjacentes ao primer, até pares de bases distando várias centenas. A sequência de DNA obtida está ilustrada na figura 8. Como se pode ver, as sequências sao homólogas em 93% tendo 23 desacordos e 330 acordos. As ORFs encontradas dentro desta sequência estão ilustradas na figura 9. A figura 10 mostra a sequência de a sequência de aminoácidos deduzida da ORF 2, sequência de aminoácidos antes determinada e prevendo a adiçáo de apenas alguns aminoácidos a cada extremidade da sequência parcial obtida através das análises da proteina purificada.

Os dados obtidos a partir da sequência de DNA foram subsequentemente usados para projectar novos primers da PCR de modo a originar cassettes aumentadas de DNA que codificam a CDase. Tais cassettes podem ser usadas em projectos de construções genéticas,que produzam altos níveis de expressão génica tanto em células procariotas como eucariotas e para originar fusões de genes entre a CDase e outras moléculas de interesse biológico, incluindo, mas n3o limitado a, as moléculas de imunoglobulina direccionadas contra os antigenes do cancro.

r

A sequência codificadora da CDase pode ser clonada em qualquer vector ou répl^ica conveniente, bem conhecidos nesta técnica. Exemplos de vectores recombinantes de DNA para clonagem e de células hospedeiras, que eles podem transformar, ( entre parênteses), incluem o bacteriófago lambda (E. coli) , pBR322 (E. coli), pACYC177(E. coli), pKT230 (bactéria gram negativa), pGV1106 (bactéria gram negativa), pLAFRl(bactéria gram negativa), pME290(bactéria gram negativa, mas não E. coli), pHV14(E. coli e Bacillus subtilis), pBD9(Bacillus), pIJ61(Streptomyces), pUC6(Streptomyces), YIp5(Saccharomyces), YCpl9(Saccharomyces) e o virus do papiloma bovino (células de mamíferos).

A sequência código para a proteina CDase pode ser colocada sob o controlo de um promotor,de locais de ligaçao do ribossoma (para expressão bacteriana) e, opcionalmente, um operador (referido aqui e de uma forma conjunta como elementos de controlo), de modo que a sequência de DNA que codifica a proteina é transcrita para RNA na célula hospedeira, transformada através de um vector que contém esta construção para a expressão. A sequência código pode ou nao conter um peptido sinal ou uma sequência leader. As sequências leader podem ser

pôsremovidas através da bactéria hospedeira num processo de tradução. Veja-se, por exemplo, as patentes norte-americanas com os números de série 4.413.739; 4.425.437; 4.338.397.

Em complemento às sequências de controlo pode ser desejável adicionar sequências reguladoras que permitem a regulação das sequências de expressão da CDase, relativamente ao crescimento da célula hospedeira. As sequências reguladoras s3o conhecidas dos especialistas nestas técnicas e os exemplos r

incluem aquelas que fazem com que a expressão de um gene esteja em on ou off, em resposta a estímulos químicos ou físicos, incluindo a presença de um composto de regulação. Outros tipos de elementos reguladores podem também estar presentes no vector, por exemplo, sequências enhancer.

Um vector de expressão é construido de maneira a que a sequência que codifica a CDase esteja localizada no vector com as sequências reguladoras apropriadas, o posicionamento e a orientação da sequência código no que respeita às sequências controlo é tal que a sequência código é transcrita sob o controlo das sequências controlo (i.e., a RNA polimerase que se liga à molécula de DNA nas sequências controlo transcreve a sequência código). Modificações da sequências que codifica a CDase podem ser desejáveis para atingir o seu fim. Por exemplo, em alguns casos pode ser necessário modificar a sequência de modo a que seja possivel a esta ligar-se às sequências controlo, com a orientação apropriada; i.e., para manter a estrutura da leitura. As sequências de controlo e outras sequências reguladoras podem ser ligadas à sequência código, antes da sua inserção num vector, tais como os vectores de clonagem acima descritos.

Alternativamente, a sequência código pode ser clonada directamente num vector de expressão que já contenha as sequências de controlo e um local de restrição apropriado.

Vários vectores de expressão procariotas são conhecidos nestas técnicas. Veja-se, por exemplo, as patentes norteamericanas com os números de série 4.440.859; 4.436.815; 4.431.740; 4.431.739; 4.428.94],; 4.425.437; 4.418.149; 4.411.994; 4.366.246; 4.342.832; veja-se também os pedidos de patentes do Reino Unido com os números de série GB 2121054; GB 2008123; GB 2007675; e o Pedido de -Patente Europeu com o número de série 103395. Os vectores de expressão de leveduras são também conhecidos nestas técnicas. Veja-se, por exemplo, as Patentes norte-americanas com os números de série 4.446.235; 4.443.539; 4.430.428; veja-se também os Pedidos de Patentes Europeus com os números de série 103409; 100561; 96491. Os vectores de expressão mamíferos sâo também conhecidos.

Dependendo do sistema de expressão e do hospedeiro seleccionado, a CDase é produzida por células hospedeiras em crescimento, transformadas através de um vector de expressão descrito acima,sujeitas a condições em que a CDase é expressa. A proteina é depois isolada a partir das células hospedeiras e purificada. Se o sistema de expressão secreta a proteina para o meio de crescimento, a proteina pode ser purificada directamente a partir do meio. Se a proteina não é secretada, ela é isolada a partir dos lisados das células. A selecçâo das condições de crescimento apropriadas e os métodos de recuperação são conhecidos dos especialistas nesta técnica.

Um exemplo de uma construção para a indução controlada

de sequências CDase em levedura envolve a inserção da cassette da CDase num vector de levedura chamado fusionador. Este vector está disponível no Departamento de Genética, Universidade de Washington, Seattle, Washington, e na NIH. Tal construção é apresentada na figura 11. Nesta construção, a CDase é inserida num polilinker que coloca a sua expressão sob o controlo do promotor GAL10 da levedura que apresenta uma elevada expressão e boa regulação (Johnston, M 1987). 0 promotor GAL10 responde à galactose, induzindo a um alto nivel de expressão do gene sob o seu controlo. Este vector pode também ser usado para criar uma fus3o dos genes CDase-lacZ, através das alterações apropriadas da sequência de DNA. As proteínas de fusSo originadas podem facilitar a medição da indução, purificação e análises bioquímicas. Estas construções podem ser transformadas numa estirpe conveniente de levedura, tal como a descrita por Hovland et al, (1989). Esta estirpe de levedura inclui um número de mutações que a fazem própria para usar com uma construção como a descrita acima. Especificamente, está presente uma mutaçSo gall que resulta numa deficiência da enzima que cataliza a primeira etapa da utilização da galactose, prevenindo deste modo a redução do indutor (galactose) no meio. Está também presente a mutaçao regl-501 que elimina a repressão exercida pela glucose na expressão do gene da galactose e permite o estabelecimento de culturas sob condições óptimas de crescimento e viabilidade. A indução pode ser facilmente alcançada através da adição da galactose a um meio rico baseado em glucose. Finalmente, estão presentes na estirpe várias mutações que provocam deficiências nas proteases, aumentando a estabilidade de quaisquer proteínas

heterólogas	ou	fragmentos	destas,	produzidas	durante	o
crescimento.	Tal	construção	de expressão deverá facilitar	o
isolamento e	a	purificação	da CDase a	partir da	levedura	em
quantidades i	antes impossíveis, quando	se usam os	niveis	de
expressão obtidos	com o gene	endógeno.
Podem	ser criadas	outras construções para	utilizar	em
sistemas de	cultura de	c.élulas de	mamíferos.	Numa	das
configurações	preferidas do	invento, a	cassete que	codifica	a

r)

CDase é ligada ao péptido sinal secretor para a oncostatina M (Malik, et al., 1989), através do uso da tecnologia da PCR, e pode depois ser inserido no vector de expressão mamífero, pH3MPy (Stamenkovic,et al., 1990), que contém os enhancers, promotores e sinais de terminação e processamento apropriados para a expressão em mamíferos. A construção pode ser transfectada em células COS, (Aruffo e Seed, 1987), colhidas para um meio de cultura isento de células, e ensaiada a actividade da CDase num sistema em que falta a actividade de enzimas endógenas. Da mesma forma, a construção do cDNA para a fusão de genes entre a CDase e outras moléculas de interesse pode ser construído por técnicas Standard, transfectado em células COS, e o extracto das células ou o sobrenadante testado para as proteínas e para a sua actividade.

Também serão úteis outras fusões de genes para a produção de CDase recombinante. Por exemplo, uma sequência de nucleótidos que codifica para a CDase ou para um mutante funcional ou para um fragmento deste, pode ser fundida com cDNAque codifica moléculas de imunoglobulina direccionadas contra antigenes cancerígenos, para criar uma proteina de fusão anticorpo-enzima. Foram obtidos anticorpos monoclonais que reconhecem determinantes que se expressam, preferencialmente, em células tumorais (Hellstrom, et al., 1984). Então, podem ser criadas proteínas de fusão que têm especificamente como alvo células tumorais seleccionadas. Veja-se,por exemplo, a patente norte-americana com o no de série 4.906.562 e Hellstrom e Hellstrom, 1985. A enzima podé então actuar directamente no local da célula tumoral de modo a converter o profármaco 5FC no agente z

anticancerigeno 5FU. Fusões genómicas entre genes que codificam a enzima de interesse e o anticorpo direccionado para as células cancerígenas, eliminam a necessidade de conjugação quimica das duas proteínas. Da mesma forma, construções de cDNA entre duas moléculas de interesse poderão aumentar a flexibilidade de tais construções em sistemas de expressão heterólogos.

Num sistema, o cDNA para a cadeia pesada de um anticorpo para o cancro é obtida a partir de linhas celulares que produzem este anticorpo. Os fragmentos PCR que codificam todo ou partes deste cDNA podem ser originados através de métodos familiares aos especilalistas na técnica. A fusão da estrutura interna das duas cassetes em vários locais pode ser realizada através de técnicas Standard, e as fusões resultantes testadas para a produção de proteínas com a actividade biológica desejada. A co-transfecção com um segundo plasmídeo transportando o cDNA, que codifica a porção de cadeia leve das moléculas de anticorpo, permite o isolamento de um fragmento de anticorpo biológicamente activo fundido com uma enzima CDase activa. Dado isto, é conseguido o direccionamento da enzima para a localização desejada.

E também desejável a produção de mutantes ou análogos da CDase térmicamente estável, que são funcionalmente equivalentes a esta. Os mutantes ou análogos podem ser preparados por delecçâo de uma porção da sequência que codifica a CDase, por inserção de uma sequência, e/ou por substituição de um ou mais nucleôtidos dentro da sequência. Técnicas para modificar a sequência de nucleôtidos, tais como uma mutagenese directa no local ou uma mutagenese dos oligonucleôtidos PCR, são bem r

conhecidas para os especialistas na técnica. Veja-se, por exemplo, T.Maniatis et al/

A CDase do presente invento é também produzida por sintese quimica tal como a sintese de péptido na fase sólida, usando sequências de aminoácidos conhecidas ou sequências de aminoácidos derivadas da sequência de DNA do gene de interesse. Tais métodos são conhecidos dos especialistas na técnica.

A CDase termicamente estável pode ser usada como agente quimoterapêutico. Especificamente, este enzima pode ser utilizado in vivo, para converter o profármaco 5FC no agente anticancerigeno, 5FU. Então, a CDase pode ser co-administrada com a 5FC, colocando cirurgicamente a CDase perto ou no local do tumor e administrando a 5FC oralmente, como descrito por Katsuragi et al., 1987, a revelação da qual está aqui incorporada para referência. Alternativamente, a enzima pode ser distribuída no local do tumor por distribuição direccionada do complexo CDase/anticorpo para o tumor , usando anticorpos específicos para esses tumores. Este complexo pode ser produzido por métodos químicos, ou genéticamente, através da construção de fusões de genes entre o gene da imunoglobulina apropriada e o gene da

CDase, como descrito acima.

De seguida encontram-se exemplos de configurações especificas para realizaçao do presente invento. Os exemplos sao apresentados apenas com um propósito ilustrativo, e n3o devem, de forma alguma, limitar o âmbito do presente invento.

Exemplo 1

Purificação da enzima, determinação da actividade e caracterização da CDase

J ) A CDase foi purificada a partir de levedura de pâo comprimida de Fleishmann, usando o método que se segue. Todas as etapas de purificação foram realizadas a 4°C. A actividade da enzima foi determinada com 5'fluorocitosina (5FC) a 3 mM em tampao fosfato salino (PBS) a 37°C (Nishiyama, et al., 1985), a exposição da qual está aqui integrada na sua totalidade para referência. Foram adicionadas soluções de enzima e o decorrer da reacçao foi observado espectrofotometricamente em aliquotas que foram neutralizadas com HC1 0.1 N. Foram usadas taxas de absorvância de 255/299 para medir a quantidade de 5-fluorouracilo (5FU) formado. Uma unidade de actividade enzimática é definida como 1 μιηοΐ de 5FU formado por minuto a 37°C. A concentração proteica foi medida utilizando o teste BCA, disponível por Pierce (Rockford, IL). Foi usada a SDS-PAGE para observar a composição em proteínas após cada etapa de purificação.

Etapa 1. Preparação de autolisados de levedura A levedura de pao (2,25 Kg) foi misturada com acetato de etilo (225 ml) e agitada durante 30 minutos. A isto foram adicionados 2,5 1 de tampão de fosfato de potássio 50 mM, pH

7,2, contendo 15% de sulfato de amónia , EDTA 5 mM e ditiotreitol (DTT) 0,1 mM. A mistura ficou em agitaçáo durante três dias e o pH foi ajustado diariamente para um pH de 7,2 com trihidroximetilaminometano (Tris) sólido. Os restos celulares foram removidos por centrifugação a 10 000 rpm durante 15 t

minutos.

r

Etapa 2. Fraccionação por sulfato de amónia

A proteína total do sobrenadante da etapa 1 foi precipitada pela adiçao de EDTA (1.8 g/1) e também sulfato de amónia (371 g/1) de maneira a que a concentração final de sulfato de amónia fosse de 70% de saturação. A solução foi mantida a 4°C durante cerca de 16 horas, após as quais o precipitado foi colhido por centrifugação. 0 pellet foi disssolvido em 1,5 1 de tampão fosfato de potássio 50 mM, a pH de 7,2, contendo EDTA 5mM e DTT 0,1 mM, e foi efectuada a diálise neste tampão, que durou cerca de 12 a 16 horas.

Ao dialisado foi adicionado EDTA (l,8g/l) e sulfato de amónia até que este atinja os 50% de saturação (314 g de sulfato de amónia/ litro de dialisado). Apôs 1 hora, o precipitado foi centrifugado e foi adicionado mais sulfato de amónia ao sobrenadante, até que a concentração final de sulfato de amónia fosse de 73% de saturação. 0 precipitado foi colhido, dissolvido em 11 de tampão Tris 20mM a pH 8,0, contendo DTT 0,1 mM, e sujeito a uma extensa diálise durante cerca de 12 a 16 horas.

Etapa 3. Cromatografia de troca aniônica 0 dialisado da Etapa 2 foi aplicado a uma coluna QSepharose (Pharmacia) de 4,8 x 25 cm, que foi equilibrada em tampão Tris 20mM contendo DTT 0,1 mM a pH 8,0. A coluna foi lavada, e a enzima foi eluida com um gradiente linear de KC1 de 0 a 0,3 M, no tampao referido acima. As fracçOes que continham CDase com actividade foram -colocadas num reservatório e concentradas por ultracentrifugaçao (Amicon, PM filtro 30), até aproximadamente 15ml.

J

Etapa 4. Cromatografia de permeaçâo em gel A solução da etapa 3, que contém a CDase, foi aplicada a uma coluna de Sephadex G-75 (2,5 x 100 cm), e eluida com PBS que continha DTT 0,1 mM. As fracçOes que mostravam actividade da CDase foram postas num reservatório, e sujeitas a diálise usando 4 1 de tampão de fosfato de potássio lOOmM contendo sulfato de amónia 1,8 M, EDTA 5 mM e DTT 0,1 mM a pH 7,0.

Etapa 5. Cromatografia de interacção hidrofóbica O material da Etapa 4 foi aplicado a uma coluna de octil-Sepharose (Pharmacia) com 2,5 x 15 cm que foi equilibrada com fosfato de potássio 100 mM, contendo sulfato de amónia 1,8 M, EDTA 5 mM e DTT 0,1 mM a pH 7,0. A coluna foi lavada com este tampão, e a enzima foi eluida com um gradiente linear de sulfato de amónia de 1,8 a 0 M, no tampão fosfato acima referido. As fracçõea que mostravam actividade da CDase foram combinadas e concentradas por ultrafiltraçâo (Amicon, filtro YM5).

Etapa 6. Cromatografia de permeaçSo em gel

Foi por fim feita uma filtração em gel do material da Etapa 5 numa Sephadex G-75, usando PBS como eluente, tal como descrito na Etapa 4. A enzima purificada foi concentrada por ultrafiltraçao e armazenada a -70°C.

Os resultados da sequência de etapas de purificação encontram-se na tabela 1. Os perfis da SDS-PAGE, usados para observar a composição proteica apôs cada etapa de purificação, encontram-se na Figura 1. O preparado final de enzima consistia numa banda maior aproximadamente nos 17 KDa e numa banda menor aproximadamente nos 19 KDa.

Tabela 1

Purificação	da CDase	a partir de	2.25 Kg de	levedura
		de p3o
	Proteina	Actividade	Actividade	Grau de
	total	total	especifica	purificação
Etapa	(mg)-	2 (U)~	(U/mg)
Extrato livre
de células	120000	1750	0,014	1
(NH4)2SO4	36000	1274	0,035	2,5
Q-Sepharose	4200	685	0,16	11,4
Sephadex G-75	184	648	3,5	250
Octil-Sepharose	20	495	25	1800
Sephadex G-75	6	394	67	4800

Concentração de proteína determinada com o uso de BCA (Pierce).

Uma unidade de actvidade enzimática é definida como a formação de 1 μπιοί de 5FU por minuto, a 37°C.

Foi determinado o peso molecular da CDase através da aplicação da enzima purificada a uma coluna Sephadex G-75, juntamente com ribonuclease A (13.7 KDa), quimotripsinogene A (25 KDa) e ovalbumina (43 KDa). As fracções foram lidas a 280 nm para medir a proteina total e a actvidade da CDase, usando como substrato a 5FC. A actividade enzimática da CDase foi centrada, aproximadamente, nos 32 KDa (Figura 2A). O enzima foi eluido exactamente no mesmo volume quando foi aplicado a uma coluna sem f

os padrões de calibração. (Figura 2B).

Foi determinada' a estabilidade da CDase purificada, a 37°C e em tampão fosfato salino de pH 7,2, usando como substrato a 5FC. Após prolongada incubação, foi observada uma lenta diminuição da actividade enzimática (Figura 3). Sujeita a estas condições, a enzima perde metade da sua actvidade apôs 5,2 dias. Aparentemente não houve perda de actividade enzimática nas primeiras 4 horas de incubação (gráfico incluido na Figura 3).

Exemplo 2

Sequência de aminoácidos da CDase Os reagentes usados para sequenciar a CDase foram obtidos da Applied Biosystems, Inc. Os solventes usados para a HPLC de fase reversa eram da Burdick and Jackson. A 4vinilpirimidina foi obtida da Aldrich Chemical Co., o CNBr era da Kodak, e todos os outros quimicos eram reagentes do mesmo grau de pureza. A endoproteinase Glu-C de Staphylococcus aureus foi obtida da Miles Laboratories. A endoprotainase Asp-N de Pseudomonas fraqi e a endoproteinase Lys-C foram obtidas da Boehringer Mannheim.

As análises automatizadas da sequência foram realizadas por um sequenciador de aminoácidos do modelo 475A (ABI) usando os programas RUN470-L ou PRO470-L. Um total de 1,5 mg de BioBrene (ABI) foi aplicado e sujeito a dois ou três preciclos da degradaçáo de Edman, antes da aplicaçáo da amostra. A conversão dos derivados da tiazolinona a aminoácidos de feniltiohidantoina foi realizada com 25% de TFA a 61°C. Os derivados dos aminoácidos da feniltiohidantoina foram separados por HPLC de fase reversa numa coluna PTH C18 (2,1 x 220 mm, ABI) com um tampáo inicial de acetato de sódio contendei tetrahidrofurano a 5% (v/v), e com um tampáo final de acetonitrilo contendo dimetilfeniltiureia 500 nM (ABI), num analizador de modelo 120A PTH (ABI).

A CDase e os fragmentos peptidicos foram purificados usando uma HPCL de fase reversa num sistema de separaçáo modelo 130A (Applied Biosystems, Inc.). A separaçáo realizou-se a 40°C numa coluna RP-300 (2,1 x 30 mm; ABI). Foi usado um gradiente linear de acetonitrilo de 0 a 60%, em ácido trifluoroacético 0,1% (TFA) em solução aquosa, durante 2 horas a 0,1 ml/min, para eluir as proteínas e os fragmentos péptidicos. Os péptidos CNBr, os t péptidos da endoproteinase Lys-C, da endoproteinase Glu-C, e da endoproteinase Asp-N, foram usados na análise de sequência sem mais purificações.

Reacçáo da CDase com 4-Vinilpiridina

	A	CDase do Exemplo 1, Etapa 6	, foi modificada	pela
adição	de	4-vinilpiridina da seguinte	maneira. A CDase	foi
reduzida	com ditiotreitol 20mM em 0,1 ml	de tampáo Tris-HCl	0,4
M, pH	8,5,	contendo guanidina-HCl 6M,	Na2EDTA 0,1%, a	50°C

durante 2 horas. Fez-se depois a reacção com 4-vinilpiridina 100 mM durante toda a noite, à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi acidificada até um pH 2,0 com TFA 20%, sujeita a fraccionamento salino e purificada por HPLC de fase reversa, como descrito acima.

As análises HPLC do producto resultante indicaram a presença de dois picos distintos (Figura 4), os quais foram separados e re-analisados por SDS-PAGE (Figura 5). 0 pico mais pequeno (reservatório A) correspondeu à banda de 19 KDa da Figura 1 e o pico maior corresporídeu à banda de 17 KDa.

grupo amina terminal da sequência de aminoácidos para a proteina do reservatório A (Figura 4), foi obtido através da identificação, até ao residuo 27, dos derivados do aminoácido de feniltiohidantolna. Viu-se que a sequência era idêntica à sequência N-terminal da dismutase superóxida da levedura de pão (EC 1.15.1.1, Steinman, 1980). Este facto estabeleceu a identidade da banda menor vista em geles da CDase purificada (Figura 1, 5).

Não foi obtida nenhuma sequência de aminoácidos do pico maior da Figura 4 (reservatório B) através da degradação de Edman, sugerindo que houve um bloqueio da amina terminal da CDase. A sequência parcial de aminoácidos da CDase foi assim obtida pela sequenciação de fragmentos seleccionados da degradação enzimática e da degradação com brometo cianogénico, como descrito a seguir.

Quebra enzimática e química da CDase

A quebra da CDase, que foi modificada com 4vinilpiridina, com endoproteinase Lys-C e endoproteinase Glu-C, foi feita em 40 μΐ de tampão Tris-ácido acético 0,1 M (pH 8,0), a 37°C, durante cerca de 12 a 16 horas. A razão enzima/substrato era, respectivamente, de 1:10 (p/p). A quebra pela endoproteinase Asp-N foi feita de maneira semelhante a uma razão enzima/substrato de 1:100, a 37°C, durante cerca de 12 a 16 horas. A digestão enzimática foi acidificada para um pH de 2,0 com TFA 20% e separada por HPLC de fase reversa.

brometo cianogénico (CNBr) foi usado para fazer a quebra da CDase nos resíduos metionil. A CDase (2,25 nmol) que foi modificada com 4-vinilpiridina, foi reconstituída em 40 μΐ de ácido fórmico a 70%, e foi adicionado um excesso molar de 200 vezes deCNBr em ácido fórmico 70%. A reacção prosseguiu a 35°C durante 2 horas, e depois à temperatura ambiente durante cerca de 12 a 16 horas. Os produtos da digestão foram diluidos em água e secos em vácuo de modo a remover o excesso de CNBr. A solução para a análise em HPLC de fase reversa foi preparada em TFA 1%.

A Figura 6 mostra a sequência parcial de aminoácidos da CDase baseada nos fragmentos obtidos pela quebra com brometo cianogénico e pela quebra proteolitica usando as enzimas endoproteinase Glu-C, endoproteinase Lys-C e endoproteinase AspN. Foi identificada uma extensão de 154 aminoácidos que compreende a parte principal da proteína. A numeração dos residuos de aminoácidos não inclui os aminoácidos que se encontram perto da terminação amina, que ainda não foram identificados. A comparação da sequência parcial da CDase com qualquer outra sequência conhecida, incluindo a adenosina desaminase de rato (Yeung et al., 1985) e a dCMP desaminase de levedura do pâo (Mclntosh e Haynes, 1986), não revelou qualquer homologia substancial.

Exemplo 3

Clonaqem e expressão·do gene da CDase 0 gene que codifica a CDase foi isolado de estirpes laboratoriais de S. cerevisiae (levedura do pao) e expresso em linhas de células de mamiferos, usando o seguinte método:

Etapa 1: Produção da sonda especifica da CDase usando a PCR

Dois primers de oligonucleótidos foram sintetizados num sintetizador automático de DNA, usando a sequência parcial de aminoácidos e os padrões de utilização do codâo, a partir de S. cerevisiae (Guthrie e Abelson, 1982) como guia na concepção de segmentos guessmer da sequência de DNA. Estes oligonucleótidos foram depois utilizados como primers nas PCRs, com uma biblioteca genómica de DNA de levedura clonado presente como modelo.

Os primers, denominados de CDA4R1 e CDA5AS, tinham ambos 42-mers contendo 33 nucleótidos da sequência que corresponde ás cadeias com sentido e sem sentido de CDase, respectivamente. 0 que resta de cada oligonucleótido codificado para o local de restrição enzimático para EcoRI. A sequência dos dois primers encontra-se na Figura 7.

Ambos os primers estavam presentes em 50 ou 100 pmoles por reacçao. As duas bibliotecas genómicas usadas como modelo de DNA nas reacções PCR foram construídas a partir do DNA 'Ή genómico de levedura através da digestão parcial por restrição com Sau3A, seguida da ligaçao nos locais BamHI tanto no vector vai e vem CV13 como no vector vai e vem YCp50. Estes dois vectores e a biblioteca genómica estão geralmente à disposição dos especialistas neste campo, e foram obtidos no Departamento de Genética da Universidade de Washington. Ambas as bibliotecas

I foram obtidas já transformadas em bactérias hospedeiras. A biblioteca de DNA foi isolada através de lises alcalinas de preparações de plasmideos que foram de seguida purificados por

J

D centrifugação através de um gradiente de densidades de cloreto de césio - brometo de etidio. Foram preparadas as reacções PCR usando 1 ug de CV13 ou YCp50 da biblioteca genómica de DNA de levedura purificados com CsCl, 50 ou 100 pmoles de cada primer,

1/10 do volume de tampao de 10 x a reacçao PCR (Stratagene),

16/100 do volume de dNTP 1,25 mM (A, G, T, C), água destilada pura da PCR, e 0,5 ug de Taq DNA polimerase (5υ/μ1, Stratagene ), juntos a um volume final de 100 μΐ. As reacções foram realizadas em tubos de microcentrifuga estéreis, sob uma camada de 75 μΐ de óleo mineral purificado para evitar a evaporaçáo. As reacções PCR j decorreram num Perkin-Elmer Cetus Thermal Cycler, num programa de 30 ciclos que incorpora as seguintes mudanças de temperatura: um passo do ciclo a 94° C durante 30 segundos para desnaturar, outro a 55° C durante 45 segundos para hibridizar, e outro a 72° C durante 1,5 minutos (90 segundos) para distender.

Foram analisadas aliquotas das reacções PCR em geles de agarose, para pôr em evidência os já previstos fragmentos de 350 pares de bases que codificam a maior parte da CDase. Os fragmentos de 350 pares de bases foram depois purificados por uma de uma electroforese preparativa em gel de agarose, seguida eluição usando o protocolo e os reagentes fornecidos com o kit GeneClean (BI0101), para remover os primers e os fragmentos heterôlogos da preparação.

Etapa 2: Subclonagem de fragmentos PCR para sequenciaçao

Os primers da PCR-da Etapa 1 foram arranjados com locais de restrição EcoRI na sua extremidade 5' para facilitar a r

clonagem de qualquer fragmento produzido. Uma aliquota do fragmento purificado de 35Ό pb derivado da PCR foi digerida com a enzima de restrição EcoRI e ligado ao corte da EcoRI o vector fagmideo pBSII-SK⁺ (Stratagene). As enzimas de restrição foram obtidas da Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB). Os produtos da digestão foram incubados a 37° C durante 2 horas, seguindo-se a extracção com volumes iguais de fenol: clorofórmio: alcoôl isoamilico, e precipitação em etanol. Os fragmentos foram ressuspendidos em TE (Tris-HCl 10 mM a pH 8,0, EDTA 1 mM a pH 8,0) e ligados entre si usando a DNA ligase do T4 (BMB). As bactérias competentes JM109 foram tranformadas com 1/5 da reacção f de ligação e foram plaqueadas diluições apropriadas em placas com

LB+ampicilina (100 ug/ml), suplementadas com XGal (50 μΐ de um stock de dimetilformamida 2% ) e com IPTG (10 μΐ de um stock de lOOmM). As colónias brancas foram repicadas e foram feitas preparações de plasmideos em pequena escala de acordo com os protocolos descritos no Sambrook et al. (1989). Os plasmideos foram seleccionados para o inserto de 350 pb por digestão com EcoRI. Foram repicados vários isolados diferentes, o DNA do plasmideo foi isolado e purificado, e sujeito a análises de

sequênciaçao de DNA.

Etapa 3; Utilização do fragmento da PCR como uma sonda especifica da CDase para selecçao de bibliotecas genómicas de levedura fragmento da PCR obtido na Etapa 1 foi também usado como sonda para detecçao da sequência que codifica a CDase, fazendo o seleccionamento das bibliotecas genómicas para clones que contêm o gene. 0 fragmento purificado foi marcado com dCTP32

-alfa e um kit de um primer aleatório de DNA da Boehringer Mannheim Biochemicals. As bibliotecas de levedura cresceram durante a noite em LB+amp e as diluições foram plaqueadas em placas com LB+amp para dar densidades de colónias de 250-2000 colónias por placa. A dispersão das colónias foi relizada usando circulos de nitrocelulose com 0,45 um ou quadrados da Schliecher e Schuell. Os filtros foram usados colocando as colónias voltadas para cima em papel Whatman 3MM saturado com SDS 10% durante 5 minutos para se dar a fixaçao, NaOH 0,5M e NaCl 1,5M durante 5 minutos para desnaturar, NaCl 1,5M e TrisHCl 0,5M a pH 7,4 durante 5 minutos para neutralizar, e 2 vezes com SSC durante 5 minutos, antes de cruzados com UV com um Statalinker (Stratagene), de acordo com as instruções do fabricante. Os filtros foram depois submersos por duas vezes com SSC durante 5 minutos e pré-lavados 5 vezes com SSC, SDS 5 %, EDTA lmM, a 50°C.

A pré-hibridizaçao foi realizada em sacos de plástico selados por aquecimento, contendo 20 ml de solução por saco de 12 filtros. A solução de pré-hibridizaçao continha formamida 50 %, 6 vezes SSC, NaP 0,01M a pH 6,8, EDTA lmM (pH 8,0), SDS 0,5 %, 100 gg/ml de DNA desnaturado do esperma de salmao e 5 vezes a Solução de Denhardt. Os sacos de plástico foram submersos num banho de água a 42 ⁰ C e incubados durante cerca de 12 a 16 horas. A sonda marcada foi purificada de nucleótidos nao incorporados por eluiçao de Colunas Push (Stratagene). A sonda foi adicionada a um fluido com aproximadamente 10^ incubada durante cerca de 12 a 16 horas a 42 ° hibridizaçao.

Λ

Os filtros foram lavados várias vezes em 2 x SSC, SDS 0,1 % à temperatura ambiente, seguindo-se uma lavagem em 1 x SSC, SDS aO,l%a55°C durante 1 hora. Os filtros foram secos ao ar, embrulhados numa capa de fibra de cloreto de vinilideno (saran), e expostos durante a noite a filme de raios X a -70° C com analisadores intensificados. As autoradiografias foram alinhadas com os filtros e com as placas iniciais, de modo a seleccionar os clones que exibissem sinais positivos de hibridizaçao. Os clones positivos foram re-analisados duas vezes mais, antes do isolamento do plasmideo, pelo método acima descrito. 0 plasmideo de DNA foi isolado através do crescimento em culturas com cloranfenicol, suplementadas com 500 ml de LB+ampicilina, e que foram de seguida purificadas utilizando a técnica de lise alcalina descrita por Sambrook et al., 1989. Alguns plasmideos foram purificados através de centrifugação em eqilibrio, com cloreto de césio e brometo de etidio, enquanto que outros foram eluidos de colunas PZ253 (5'-> 3') , seguindo-se uma precipitação em polietileno glicol, extração numa mistura de fenol:clorofórmio e precipitação em etanol.

cpm/ml, e C para a

Etapa 4: Sequênciaçâo dos derivados da PCR e dos clones genômicos que codificam a CDase Vários oligonucleótidos de 18-mer foram sintetizados ou ordenados para a sequênciaçâo do DNA proveniente da PCR e dos clones genômicos da CDase. A sequência de alguns primers tem origem na cadeia codificadora, enquanto que outras sequências resultantes têm origem na cadeia complementar. As reacções de sequênciaçâo foram realizadas de acordo com os protocolos e reagentes fornecidos com o kit Sequenase Version 2.0 (United

States Biochemical). 0 -ΌΝΑ foi desnaturado por desnaturação alcalina em NaOH 0,2 N, antes das reacções de sequênciaçâo. As diluições da mistura de reacção marcada e os tempos de reacção foram variados dependendo da região em que se queria efectuar a sequênciaçâo. Para a maioria das reacções usou-se la 1,5 pmol de 35

DNA molde e de primers com 10 a 15 gCi de alfa- S-dATP por reacção. As amostras foram corridas em geles de sequênciaçâo com poliacrilamida 8% e ureia e correram durante 1 a 7 horas, dependendo da sequência a ser lida. Os geles foram fixados durante 30 minutos em metanol 10% e ácido acético 10% e foram secos a 80°C, durante 45 minutos, usando um secador Slab-Gel ligado a uma bomba de vácuo. Os geles secos foram expostos a uma película Kodak XAR-5, à temperatura ambiente, durante 18 a 72 horas. As sequências foram lidas manualmente. 0 alinhamento e análise das informações das sequências foi realizado por computador, usando o Gene Pro Software (Riverside Scientific, Seattle, Washington). A Figura 8 mostra a sequência de nucleótidos dos clones genômicos que codificam a CDase. A Figura 10 mostra a sequência de aminoácidos prevista. Como pode ser visto nas figuras, a sequência codificadora consiste, aproximadamente, em 472 pares de bases e especifica uma proteína com 158 aminoàcidos. 0 peso molecular previsto para a molécula de CDase assim obtida é de cerca de 17 506 dalton.

Etapa 5; Construção de cassetes codificadoras da CDase para expressão em leveduras e em sistemas de células de mamíferos

A sequência de DNA obtida na etapa 4 foi usada para conceber os primers de oligonucleótidos para as cassetes, originadas por PCR, quef codificam a CDase. Alguns destes oligonucleótidos incorporavam sequências adicionais como os péptidos do sinal secretor e locais de restrição usados na clonagem e na expressão. Os primers de oligonucleótidos foram usados aos pares de forma a originar fragmentos PCR, com as sequências apropriadas ligadas às partes terminais.

Mais especificamente, uma cassete que codifica a CDase foi construída através da PCR, usando dois primers que contêm tanto a sequência especifica da CDase como sequências adicionais que codificam os locais de restrição para a clonagem. O primer 5' era de 65-mer, contendo 45 bases das sequências homólogas, mas nào completamente idênticas à extremidade 5' da cópia genómica da CDase ligada a uma cauda 5' que contém os locais de restrição HindIII, Sall e Ncol. 0 primer 3' tinha 39-mer, idêntico à cadeia sem sentido no C-terminal da CDase, com uma cauda Xbal ligada à sua extremidade 5'. 0 molde usado foi o clone genómico da CDase, usando aproximadamente 1 ng por reacção. Cada primer estava presente a uma concentração de 75 pmol. As reacçOes PCR foram realizadas como descrito para a Etapa 1.

ι · - --4 ' ~

Os produtos da reacção PCR foram purificados através de extracção com clorofórmio e precipitação em etanol. 0 DNA foi de seguida digerido com as enzimas de restrição HindIII e Xbal, sujeito a electroforese em gel e purificado através da eluição com GeneClean (B10101), de acordo com as intruçOes do fabricante.

Etapa 6: Expressão da CDase em sistemas de células de mamíferos fragmento purificado da Etapa 5 foi ligado ao vector plasmideo CDM8 ou pH3M, di-gerido com HindIII-Xbal e transformado numa célula bacteriana hospedeira, MC1061 (Aruffo e Seed, 1987). Um mapa do vector pH3M está ilustrado na Figura 12. Foram repicados 20 transformantes, procedendo-se a lise alcalina em pequena escala nas preparações de plasmideos, e à digestão de aliquotas com HindIII+Xbal para verificar a sua estrutura. 0 plasmideo restante de três das preparações foi usado para transfecções de células COS através do método de transfecção DEAE-Dextran (Ausubel, et al., eds. Current Protocols in Molecular Bioloqy).

Foram plaquedas, resumidamente, 3,5x10 células COS para discos de cultura com 6 cm em DME/ 10% de soro bovino fetal (SBF) e incubados durante a noite a 37°C e a 6% de CO2. 0 DNA obtido das mini-preparações foi misturado, como um cocktail, com PBS e com DEAE-Dextrano 50mg/ml, num volume total de 100 μΐ nas quantidades especificadas abaixo.

Amostra	DNA	FBS		DEAE-Dextrano (50mq/ml)
Controlos
Sham	ο μΐ	80	μΐ	20	μΐ
BB1	4 μΐ	76	μΐ	20	μΐ
Transfectantes da	CDase
1-1	13 μΐ	67	μΐ-	20	μΐ
1-4	13 μΐ	' 67	μΐ	20	μΐ
2-6	13 μΐ	67	μΐ	20	μΐ

Cada transfecçao foi feita em duplicado. As culturas do meio com um dia de idade foram aspiradas dos discos e as células foram lavadas 3 vezes em 2 ml de PBS por lavagem. Ao meio de transfecçao foi adicionado 1,7 ml de DMEM-cloroquina por placa e o cocktail de DNA a adicinar foi vertido para o meio. As transfecções foram a incubar por 3 horas, o meio foi de seguida removido, as células agitadas com FBS/ 10% DMSO durante 2 minutos, lavadas três vezes num meio livre de soro e incubadas durante 3 dias em 3,5 ml de DMEM/ 10% PBS por placa.

Etapa 7: Caracterização dos productos da expressão recombinante

1. Radioimunoprecipitações:

As placas da Etapa 6, para serem usadas na radioimunoprecipitaçâo (RIPS), foram incubadas durante cerca de 12 a 16 horas, em DMEM/ 10% FBS fresco contendo 200 gCi/ml de 3⁵S-metionina.

As RIPS foram realizadas através da aspiração do meio marcado, após cerca de 12 a 16 horas de incubação a 37°C, adicionando lml de tampão OG-PO4RIPAE 1% ( Na2HPC>4 50 mM, Nadeoxicolato 1%, triton X-100 1%, SDS 0,1%, NaCl 150 mM, EDTA 5mM, EGTA 5mM, PMSF 2mM e aprotinina=P04-RIPAE lgg/ml com octoglucosido adicionado a 1% ) a cada disco de cultura e que foram incubados 10 minutos em gelo. Os lisados foram transferidos para tubos de centrífuga Oak Ridge de 10 ml e centrifugados a 40

Λ

000 rpm, a 4°C, durante 40 minutos. Os sobrenadantes foram transferidos para dois' tubos de microcentrifuga que se encontravam em gelo (0,4 ml/ tubo). Os tranfectantes BB1 foram incubados em 2 gg de anticorpo, enquanto que 17,5 μΐ ou 31,5 gg de antisoro antiCDase policlonal de coelho foram adicionados aos outros transfectantes. As RIPS foram incubadas em gelo durante uma hora. Anticorpos de cabra contra rato foram adicionados ao tubo BB1 como anticorpos secundários, e foram a incubar em gelo durante 20 minutos.

As colónias de Staphylococcus aureus (Calbiochem) (700 μΐ) foram lavadas em tampão NP-40/TES 0,5 %, depois em tampão NP40/TES 0,05 %, e finalmente ressuspendidas em tampão PO4-RIPAE com 1 mg/ml de ovalbumina ( TES= Tris-Hcl 50 mM , pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM). Aliquotas com 50 microlitros de bactérias de StaphA lavadas, foram adicionadas ao material de RIP e incubadas em gelo durante 10 minutos. Os RIPS foram microcentrifugados, originando pellet, e lavados três vezes em 0,5 ml de TNEN ( Tris-HCl 20 mM a pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, NP-40 0,5 %). Os pellets finais dos 400 μΐ originais das amostras em duplicado, foram ressuspendidos tanto em 35 μΐ de tampão redutor, como em 35 μΐ de tampão n3o redutor para correr na SDS-PAGE. As amostras correram num gradiente de 10 a 20% de gel SDS-PAGE, em conjunto com proteínas marcadoras de baixo peso molecular da Bio-Rad, e sujeitos a uma electroforese a 300 volts durante aproximadamente 2 horas. Os geles ficaram em Comassie Blue durante 1 hora, foram revelados em metanol a 10% , ácido acético 5% durante cerca de 12 a 16 horas, expostas durante 30.minutos para aumentar o contraste e foram finalmente lavadas três vezes em água antes de secarem a 60°C, durante 1 hora. O gel exposto por quatro horas à pelicula de raios-X demonstrou que¹ não havia banda de 17.000 daltons nas amostras sham, que n3o havia banda de 17.000 daltons nas amostras BB1, mas sim uma banda especifica de 45.000 daltons, enquanto que todos os três transfectantes exibiam uma banda especifica aproximadamente nos 17.000 daltons.

2. Análises Western

Os duplicados das placas de transfecçâo da Etapa 6 ficaram nao marcados e foram colhidos após o terceiro dia do periodo de incubação. Os meios foram aspirados para fora, as células foram lavadas em PBS, e foram, depois, suspendidas em 0,5 ml de Tris-HCL 10 mM (pH 8,0) contendo aprotinina 1 pg/ml e PMSF 30 μg/ml. As célula foram removidas dos discos de cultura usando espátulas esterilizadas, e transferidas para tubos de microcentrifuga esterilizados e que se encontravam em gelo. Cada suspensão foi sonifiçada no gelo com bursts de 2-15 segundos, à máxima potência. Os lisados foram centrifugados, durante vinte minutos, numa microcentrifuga refrigerada, de modo a remover os restos de células , e os sobrenadantes foram transferidos para como novos tubos. Os ensaios enzimâticos foram realizados descrito abaixo.

As aliquotas destes lisados foram também utilizadas para realizar tranferências Western, usando o antisoro policlonal de coelho, desenvolvido contra a CDase purificada. Aliquotas com vinte cinco microlitros de lisado de tansfectantes não diluido, foram sujeitas a electroforese,SDS-PAGE, como descrito para as RIPS, com a excepçâo de que diluições seriadas da enzima CDase r

purificada foram corridas no gel, como concentrações padrao. A CDase concentrada a 500 ng/banda foi diluida por cinco vezes para 100 ng, 20 ng, 4 ng e 0,8 ng/banda. O gel foi depois electrotransferido para um filtro de nitrocelulose, de acordo com os protocolos no manual de clonagem CSH (Sambrook et al.,1989).

As transferências foram bloqueadas em Blotto durante 1 hora (Blotto=PBS+ leite nao gordo 1% + NP-40 0,5%). O Blotto fresco contendo 2,5 ug de soro policlonal antiCDase de coelho por ml ,foi adicionado ao filtro e incubado à temperatura ambiente por 1 hora. O filtro foi lavado três vezes em Blotto durante cinco minutos, seguindo-se a incubação em fosfatase alcalina conjugada (Boehringer Mannheim Biochemicals), diluida de 1:1000 em Blotto. 0 excesso de anticorpos conjugados foi retirado com três lavagens em Blotto, e uma lavagem final em tampão substrato de fosfatase alcalina (Tris-HCl 100 mM a pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM). 0 filtro foi depois incubado durante 15 minutos em 40 ml do tampão substrato, ao qual foi adicionado 12 mg de fosfato de bromocorindolil e 7 mg de tetrazolina nitroazul, para desenvolver a cor. As reacções foram interrompidas, através da lavagem do filtro, em água destilada.

Após o desenvolvimento da coloração, todos os três transfectantes mostravam bandas de migração aproximadamente nos 17.000 daltons, com intensidades maiores do que os 0,8 ng e menores do que os 4 ng dos padrOes de concentração para a CDase purificada.

3.MediçOes da actividade da CDaSe expressa recombinantemente

A conversáo da 5-fluorocitosina (5-FC) em 5fluorouracilo (5-FU), foi medida nos extratos das células COS j 5 transformadas, referidas acima. Os tranfectantes (3x10 células cada) contendo CDase (1-1, 1-4, 2-6), a transfecção sham ou a transfecçao de plasmideos controlo (BB1), foram sonifiçados em o,5 ml de tampão Tris 10 mM e centrifugados. A 100 μΐ de cada sobrenadante, e a uma solução de CDase com 1 ug/ml, foram adicionados 170 μΐ de tampão fosfato salino (PBS) e 30 μΐ de uma solução de 5-FC 30 mM. Isto conduziu a uma mistura de reacção com

300 μΐ com a 5-FC a 3 mM. Foi também realizada uma reação controlo em que não se coloca a enzima.

Estes tubos foram a incubar durante 24 horas a 37°C, retirando-se depois 50 μΐ de cada solução, ocorrendo a reacção em 1 ml de HCL 0,1 N. Estas amostras foram lidas num espectofotómetro de UV, a 255 e a 290 nm, utilizando as equaçOes:

( 0,1191xDC>290 - 0,02485xDO255 ) x 20 = 5FC mM e

(0,1849xDC>255 - 0,04907xD0₂90) * 20 = 5FU mM,

Foi medida a quantidade de conversão da 5FC em 5FU. 0 número de unidades de actividade, no extrato de células original, foi depois computarizado (1 unidade= 1 μιηοΐ/min de conversão da

5FC em 5FU). As tranfecções sham e BB1, e a reacçao sem enzima, nao mostram actividade, enquanto que todos os três transfectantes _3 de CDase estavam activos. Os transfectantes 1-1 tinham 0,41x10 _3 unidades, os 1-4 tinham 0,54x10 unidades e os 2-6 tinham _3

0,26x10 unidades. O teste controlo com 1 ug/ml de CDase converteu totalmente a 5-FC em 5-FU. Assumindo que a CDase pura tem uma actividade de 40 U/mg, foram expressas 10 ng (1-1),

13,5 ng (1-4) e 7,3 ng (2-6) de CDase activa.

As mesmas amostras foram também testadas num ensaio independente. Cada tubo de ensaio tinha 50 μΐ do sobrenadante ou pg/ml de CDase, 130 μΐ de PBS, 20 μΐ de 5FC 30 mM, e 1 μΰί de 3

5FC ( H) . Estas reacçOes foram incubadas por 24 horas, evaporadas e o residuo foi redissolvido em 20 μΐ de metanol, e marcado nas placas de silica gel, para cromatografia de camada fina (TLC). As placas foram desenvolvidas numa mistura de acetona/água 96:4, na qual os RfS para a 5FC e 5FU sao, respectivamente, 0,2 e 0,8. As porções apropriadas das placas TLC foram cortadas e colocadas no fluido de cintilação. Estas foram contadas num contador de cintilações e foram determinadas as quantidades relativas de 5FC e 5FU em cada amostra. Os ensaios sham e BB1 nâo mostraram 5FU, enquanto que todos os transfectantes converteram 14 % da 5FC em 5FU. Isto traduz-se em _3

0,6x10 unidades por amostra, o que confirma as quantidades calculdas no ensaio com UV. A reacçao de controlo com ^g/ml de

CDase converteu toda a 5-FC em 5-FU.

Experiências mostram que os transfectantes de CDase expressam, de facto, a enzima activa. Isto, em conjunto com as análises de transferência Western, indica que a actividada

especifica da enzima recombinante ê semelhante à da enzima isolada da levedura.

Assim, foi descrita uma CDase têrmicamente estável, bem como métodos de purificação e de produção recombinante da mesma. Embora tenham sido descritas, com algum detalhe, as formas preferidas deste invento, está subjacente que são ilustrativas e não limitantes e que podem ser-feitas variações óbvias, sem que se saia do espirito e objectivo do invento, como definido pelas reivindicações anexas.

Referências

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Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1- Um método de obtenção de uma sequência de nucleótido que codifica uma citosina desaminase termicamente estável, ou uma proteina funcionalmente equivalente à mesma, caracterizado pelo facto de compreender o isolamento da referida sequência de nucleótido a partir de um património genómico ou de um património de cDNA, ou a produção sintética da referida sequência de nucleótido.
2. 2- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida sequência ser substancialmente:

   Inicio IatgI gtg ACA T GGG G GGA G ATG M ' GCA A AGC AAG TGG W GAT D CAG Q AAG K GGT ATG 211 M V S K G M GAC D ATT I GCC A TAT y GAG E GAG E GCG A ^J GCC A TTA L GGT G TAC Y AAA K GAG E GGT G GGT G 256 GTT V CCT P ATT I GGC G GGA G TGT C CTT L ATC I AAT N AAC N AAA K GAC D GGA G AGT S GTT V 301 CTC L GGT G CGT R GGT G CAC H AAC N ATG M AGA R TTT F CAA Q AAG K GGT G TCC s GCC A ACA T 346 CTA L CAT H GGT G GAG E ATC I TCC s ACT T TTG L ' gaa' E AAC N TGT C GGG G AGA R TTA L GAG E 391 GGC G AAA K GTG V TAC y AAA K GAT D ACC T ACT T TTG L TAT Y ACG T ACG T CTG L TCT s CCA P 436 TGC C GAC D ATG M TGT C ACA T GGT G GCC A ATC I ATC A ATG M TAT y GGT G ATT I CCA P CGC R 481 TGT C GTT V GTC V GGT G GAG E AAC N GTT V AAT N TTC F AAA K AGT s AAG K GGC G GAG E AAA K 526 TAT y TTA L CAA Q ACT T AGA R GGT G CAC H GAG E GTT V GTT V GTT V GTT V GAC D GAT D GAG E 571 AGG R · TGT C AAA K AAG K ATC I ATG M AAA K CAA Q TTT F ATC I GAT D GAA E AGA R CCT P CAG Q 616 GAT D TGG W TTT F GAA E GAT D ATT I GGT G GAG E ItaqI 641
3. 3- Um processo de preparação de um vector de expressão recombinante, caracterizado pelo facto de compreender e ser eficaz na expressão da sequência de nucleótido obtida pelo método das reivindicações 1 ou 2.
4. 4- Um processo de preparação de um vector de expressão recombinante, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência de nucleótido estar funcionalmente ligada a sequências de controlo compatíveis com uma célula hospedeira.
5. 5- Um processo de preparação de células hospedeiras, caracterizado pelo facho das células hospedeiras serem transformadas com o vector de expressão, conforme reivindicado na reivindicação 4 .
6. 6- Um método de produção de uma citosina desaminase recombinante, termicamente estável, ou de uma proteína funcionalmente equivalente a esta, caracterizado pelo facto de compreender o crescimento das células hospedeiras, conforme reivindicado na reivindicação 5 .
7. 7- Um método de obtenção de uma citosina desaminase termicamente estável ou de uma proteína funcionalmente equivalente a esta, caracterizado pelo facto de compreender a expressão de uma sequência de nucleótido codificando a referida citosina desaminase termicamente estável, ou a produção sintética da referida citosina desaminase termicamente estável, ou o isolamento da referida citosina desaminase, termicamente estável, a partir de um organismo produtor da mesma.
8. 8- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a referida citosina desaminase compreender a sequência de aminoácido que se segue:

   1 10 20 30

   C C Μ A S K W D Q K C H D I A Y E E A A L C Y K E C C V P I

   -M6-E4--- -_E7-K7--K540 ^J 50 60

   CCCLINNKDCSVLCRCHNMRFQKCSATLHC

   -M6— -M9-E7-K5-K2-K670 80 90 EISTLENCCRLECKVYKDTTLYTTLSPCDM -H9--K6-K13— —D10100 110 120 CTCAIIMYCIPRCVVCENVNFKSKCEKYLQ

   ---M4-EI a--Kl 3- -D16130 140 150

   TRCHEVVVVDDERCKKIKKQFIDERPQDVF

   -M7-Elb- -E9-K3- -Kll-D5— —Kll— <=—-==

   INICIAÇAO

   IatgI gtg ACA GGG GGA ATG Μ V T G G M GAC ATT GCC TAT GAG GAG D I A Y E E GTT CCT ATT GGC GGA TGT V P I G G C CTC GGT CGT GGT CAC AAC L G R G H N CTA CAT GGT GAG ATC TCC L H G E I S GGC AAA GTG TAC AAA GAT G K V Y K D TGC GAC ATG TGT ACA GGT C D M C T G TGT GTT GTC GGT GAG AAC C V V G E N TAT TTA CAA ACT AGA GGT Y L Q T R G AGG TGT AAA AAG ATC ATG R C K K I M GAT TGG TTT GAA GAT ATT D W F E D I

   GCA A AGC S AAG K TGG W GAT D GCG A J GCC A TTA L GGT G TAC Y CTT L ATC I AAT N AAC N AAA K ATG M AGA R TTT F CAA Q AAG K ACT T TTG L GAA E AAC N TGT C ACC T ACT T TTG L TAT Y ACG T GCC A ATC I ATC I ATG M TAT Y GTT V AAT N TTC F AAA K AGT S CAC H GAG E GTT V GTT V GTT V AAA K CAA Q TTT F ATC I GAT D GGT G GAG E ItagI

   CAG AAG GGT ATG 211 Q K G M AAA GAG GGT GGT 256 K E G G GAC GGA AGT GTT 301 D G S V GGT TCC GCC ACA 346 G s A T GGG AGA TTA GAG 391 G R L E ACG CTG TCT CCA 436 T L s P GGT ATT CCA CGC 481 G I P R AAG GGC GAG AAA 526 K G E K GTT GAC GAT GAG 571 V D D E GAA AGA CCT CAG 616 E R P Q 641

   ou uma sequência de aminoácido substancialmente homóloga e funcionalmente equivalente à mesma.
9. 9- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a referida citosina desaminase ser isolada a partir da levedura.
10. 10- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 7, ) caracterizado pelo facto de a referida citosina desaminase ser isolada a partir de Saccharomyces cerevisiae.

    Lisboa, 8 de Junho de 1990