KR100221150B1 - 시그날-펩타이드-유리 스태필로키나제의 발현 - Google Patents

시그날-펩타이드-유리 스태필로키나제의 발현 Download PDF

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Abstract

본 발명은 플라스미노겐 활성화제 효과를 갖는 재조합 스태필로키나제 폴리펩타이드 및 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 상기 폴리펩타이드 시그날-펩타이드-암호화 영역이 없는 DNA 서열의 발현에 의해 수득된다.

Description

시그날-펩타이드-유리 스태필로키나제의 발현
제1도는 서열 동정 번호 1에 상응하는 성숙 야생형 스태필로키나제 SAK 42D에 대해 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터의 아미노산 서열.
제2도는 서열 동정 번호 2에 상응하는 성숙 야생형 스태필로키나제 SAKФC소에 대해 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터의 아미노산 서열.
제3도는 서열 동정 번호 3에 상응하는 성숙 야생형 스태필로키나제 STAR(에스.아우레우스(S. aureus) 균주 23으로부터의 게놈성 DNA에 대해 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터의 아미노산 서열.
제4도는 서열 동정번호 4에 상응하는 단축된 성숙 스태필로키나제 SAK△N10에 대해 암호화하는 단편의 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터의 아미노산 서열.
제5도는 서열 동정번호 5에 상응하는 단축된 성숙 스태필로키나제 SAK△N14에 대해 암호화하는 단편의 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터의 아미노산 서열.
제6도는 서열 동정 번호 6에 상응하는 스태필로키나제 SAKM26C에 대해 암호화하는 인위적인 대립형질 변이체의 단편의 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터의 아미노산 서열.
제7도는 서열 동정 번호 7에 상응하는 스태필로키나제 SAKM26L에 대해 암호화하는 인위적인 대립형질 변이체의 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터의 아미노산 서열.
제8도는 서열 동정 번호 8에 상응하는 RBS 병렬 배위에 뉴클레오타이드 서열.
제9도는 서열 동정 번호 9에 상응하는 천연 야생형 스태필로키나제 SAK42D에 대한 스태필로코커스 아우레우스 파아지 42D의 게놈상에서 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터의 아미노산 서열.
제10도는 플라스미드 pMET5의 유전자 및 제한지도.
제11도는 플라스미도 pUC19s마의 유전자 및 제한지도.
제12도는 플라스미드 족 pMEX6sak의 유전자 및 제한지도.
제13(a)도는 조 세포 용해물의 SDS-PAGE로부터 겔을 사용한, 기술된 스태필로키나제 폴리펩타이드의 과발현을 나타냄.
제13(b)도는 제13(a)도에서 분리된 조 세포 용해물의 웨스턴 블롯에 의한 기술된 모든 스태필로키나제 폴리펩타이드에 대한 모노클로날 항체 IG8/H6의 결합을 나타냄.
제14도는 SAK472D의 처리예로서 수행하는 정제 공정의 효율을 나타냄.
제15도는 스태필로키나제 폴리펩타이드 SAK42D의 정량 검출을 위한 ELISA 시험의 검량 곡선.
제16도는 mAB IG8/H6을 사용하는 면역-침전 반응의 평가.
본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 공정은 하기 제시된 부분-단계를 포함한다.
[부분-단계 A : 성숙 SAK42D를 암호화하는 기본]
[플라스미드의 작제(플라스미드 표시 : pTZ19Rsak1)]
재조합 플라스미드 pMET5(제10도)를 성숙 SAK 42D를 암호화하는 기본 플라스미드 pTZ19R sak1의 작제용 유전자 공여체 DNA로서 사용한다. 전자는 일련의 유전공학적 공정 단계에 의해 플라스미드 pDB17로부터 작제한다.
이동식 해독 시그날(리보솜 결함 서열(RBS) 및 ATGRO시 코돈) 및 적합한 전사시그날(프로모터)에 sak42D 유전자를 연결하는 발현에 대한 전이 서열의 도입을 포함하는 성숙SAK42D에 대한 완전 암호화 서열의 재구성은 단일칼라 Sa1Ⅰ부위로부터 상부에 화학적으로 합성된 링커쌍을 가함으로써 일어난다. 말기에, pMET5가 독특한 Sa1Ⅰ부위에서 먼저 개방되고 본 발명에 따라서 T4-폴리뉴클레오타이드 키나제에 의해 세미-포스포릴화되고, 어니얼링시 양립성 말단을 Sa1Ⅰ 및 HindⅢ 상호반응으로 발달시키는 링커쌍 L1/L2＊(비교 표 1;다음 기술에서 *는 포스포릴화된 링커 파트너를 나타낸다)는 T4-DNA 리가제를 사용하여 선형화된 플라스미드 pMET5의 말단에 연결시킨다. 후속 HindⅢ 분해단계를 통하여, HindⅢ 말단에 의해 양 면상에 플랭킹된 약1.2kb 크기의 SAK42D 암호화 단편이 수득되고, 이는 즉시 시판되는 벡터 플라스미드 pTZ19R (USB,Bad Homburg)의 HindⅢ 부위에서 클로닝된다. 상기 공정에서, 특히, sak42D 유전자가 벡터 플라스미드의 1ac 유전자로 프레임내 배향된 플라스미드 pTZ19Rsak0이 형성된다.
SAK 42D에 대해 암호화하지 않는 3'- 플랭킹 DNA 분획을 분리시키기 위하여, 1.2kb 크기 EcoRI/HindⅢ 단편을 pTZ19Rsak0으로부터 먼저 단리시키고 이로부터 유리한 방식으로, Aval, AvalⅠ 및 HinfⅠ을 사용한 연속적인 제한효소 분해로, 388bp의 크키의 EcoRI/HindfⅠ 단편이 수득되고, 여기서 SAK42D에 대해 암호화하는 최종 27bp의 서열이 또한 HinfⅠ 절단에 의해 제거된다. sak42D 유전자의 3'-말단에서 완전 서열을 재현시키기 위하여, HindfⅠ 및 PstⅠ 말단에 적용할 수 있는 링커쌍 L3*/L4(표 1참조)을 자체 공지된 방법으로 EcoRI/HindfⅠ단편의 HinfⅠ말단에 가한다. 상기 형성된, 완전 sak42D 구조 유전자를 갖는 433bp 크기의 EcoRI/PstⅠ 단편을 다시 동일한 효소로 미리 처리한 벡터 플라스미드 pTZ19R 내로 삽입한다.
상기 제조된 플라스미드 pTZ19Rsak1은 SAK42D에 대한 발현 벡터 및 N-말단 단축된 SAK42D형의 생산을 위한 다음 유전공학적 공정 단계에 대한 기본 플라스미드로서 작용한다.
[부부단계 B : SAK42D 및 N-말단 단축된 SAK]
[42D 폴리펩타이드에 대한 발현 벡터의 작제]
시판되는 플라스미드 pMEX5 및 pMEX6 (모두 Medac 제품, Hamburg)를 발현 벡터로서 사용하고, 여기서 발현은 합성 tac 프로모터에 의해 조정되며 전사는 2개의 병렬 전사 종결자 rrnBT1 및 rrnBT2에 의해 종결된다. 발현시킬 유전자를 조절 시 그날 서열(이후 R; tac;SD;-;rrBT1T2 배열로 명명) 사이에 삽입된다. 2개의 상기 플라스미드는 이들이 상이한 배향으로 이.콜리-f1 파아지로부터 단일사 DNAFMF 추가로 형성시킬 수 있는 영역을 함유하는 점 만이 서로 상이하다.
상술한 EcoRⅠ/PstⅠ 단편을 기본 플라스미드 pTZ 19R sak1으로부터 단리하고, 이어서 EcoRⅠ 및 PstⅠ으로 처리한 플라스미드 pMEX5 및 pMEX6 중심으로 삽입한다. 이.콜리 균주 TG1으로 형질 전환시킨 후, 발현 플라스미드 pMET503sak 및 pMEX602sak를 함유하는 균주 이.콜리 TG1(pMET503sak), 이.콜리 TG1(pMEX602sak)가 형성된다(제12도). 두 플라스미드 모두에서, 표적 폴리펩타이드의 발현이 R; tac;SD;-;rrnBT1T2 배위에서 제8도에서 따라서 병렬 배향으로 배열된 2개의 RBS는 발현 시킬 sak42D 유전자로부터 상부에 연결됨을 특징으로 하는 발현 시그날의 유사한 배열에 의해 수행된다. 제2 RBS는 이미 제한효소 StuⅠ 및 NdeⅠ에 대한 인식 서열과 유사하게 성숙 sak42D 유전자의 5'-말단 재구성용으로 사용되는 링커쌍 L1/L2(표 1참조)에 의해 플라스미드 pTZ19Rsal0내로 도입된다.
균주. 이.콜리 TG1 (pMEX602sak)이 성숙 SAK42D발효 생산용으로 바람직하게 사용된다.
명백하게 N-종결 단축된 스태필로키나제에 대한 본 발명에 따르는 발현 플라스미드를 생성시키기 위하여, 자체 공지된 링커 적용법을 이후 기술되는 면에서 사용한다. 사용되는 링커는 매회 이들이 StuⅠ으로 분리시킨 DNADP 결합된 후5'-말단에서 인식 서열을 재구성하는 방식으로 축적된다. Stu-Ⅰ부위로부터 하부에 전이 서열에서 ATG개시 코돈까지 뒤따르며, 여기서 상응하는 코돈 주위에서 결실된 천연 sak42D 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 sak42D 유전자 중 이후 뒤따르는 단일 칼라 제한분해 부위 아래까지 연결된다.
sak42D 유전자 중 단일칼라 BstUⅠ분해 부위는 N-말단에서 10개의 아미노산에 의해 단축된 SAK42D 형태에 대한 발현 플라스미드 작제용으로 사용하고, sak42D 유전자 중 단일칼라 HaeⅢ 분해 부위는 N-말단에서 14개의 아미노산에 의해 단축된 SAK42D 형태에 대한 발현 플라스미드 작제용으로 사용한다. 상기 공정에 따라서, 두 경우 모두 세미포스포릴화된 링커쌍 L5*/L6(△N10SAK42D△용) 및 L7*/L8(△N14-SAK42D용)가 먼저 시도되는 시험된 방식으로 T4-DNA 리가제를 사용하여 StuⅠ으로 개방시킨 발현 플라스미드 pMEX602sak의 두 말단에 첨가된다. HindⅢ에 의한 후속의 분해를 통하여, sak42D유전자가 해당 링커-개질된 벡터로부터 완전히 제거된다. 이제 BstUⅠ/HindⅢ 또는 HaeⅢ/HindⅢ 말단J에 의해 플랭킹된, 수득된 선형 발현 벡터를 T4-DNA 리가제를 사용하여 관련된 단축sak42D 유전자를 함유하는 BstUⅠ/HindⅢ 또는 HaeⅢ/HindⅢ 단편에 연결시킨다(두 단편은 상응하는 제한효소 쌍으로 분해시킨 후 pTZRsak1으로부터 단리된다.)
이.콜리 TG중에서 클로닝시킨 후, 발현 플라스미드 pMEX6N10sak 및 pMEX6N14sak를 복제하는 각각의 균주 이.콜리 TG1 (pMEX6N10sak) 및 이.콜리 TG1(pMEX6N14sak)이 기술된 공정에 따라 수득된다.
[부분단계 C : 성숙 SAKM26Xs를 함유하는 pUC19sakM26X형 기본]
[플라스미드의 작제(여기서X는 I,R,V,K,L,C,A,H,G 및 S이다)]
pUC19sakM26X형 플라스미드 족(제11도 참조)의 유전공학적 방법에 의한 작제를 다음 3개의 부분단계로 수행한다 :
▶ 제1단계(부분단계 C1)로, 해독 연결 서열을 포함하는 SAK42D의 아미노산 1 내지 22에 대한 암호화 서열을 먼저 축척하고,
▶ 제2단계(부분단계2)로, SAK42D의 아미노산 32로부터 암호화하는 서열을 축척하며,
▶ 최종 제3단계(부분단계 C)로, 성숙 SAKM26Xs에 대한 완전한 유전자를 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드 링커의, 표 1에 기재된 범위를 사용하여 축적시킨다.
[부분단계 C1]
이동식 해독 시그날 서열(RBS) 및 발현 개시 코돈 ATGDP 대한 전이서열 뿐만 아니라 SAKM26X의 암호화 DNA 서열을 해독 시그날 서열(pMEX6으로부터)에 연결하는 최종 발현에 대한 추가 서열의 도입을 포함하는 아미노산 위치 1내지 22의 암호화 서열의 축적은 중간체 플라스미드 pUC19sak0를 통하여 2단계로 상응하는 뉴클레오타이드 시리즈를 사용하여 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드 링커의 클로닝을 통해 일어난다.
먼저, 세미포스포릴화 링커쌍 L9*/L10을 자체 공지된 방법으로 T4-DNA 리가제를 사용하여 EcoRⅠ 분해에 의해 선형화된 벡터 플라스미드 pUC19의 두 말단에 첨가한다. 사용되는 링커쌍은 해독 연결에 대한 이동식 뉴클레오타이드 서열외에, 아미노산 1내지 3에 대한 암호화 DNA 서열 및 아미노산 4의 첫 번째 2개의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 pUC19상에 나타나지 않는, 제한 효소 SfuⅠ의 인식 서열 및 BamHⅠ-양립성 5'-뉴클레오타이드 말단을 함유하는 방식으로 상기 공정에 따라서 축적된다. 폴리클로닝 서열(PCS)상에 첨가된 것과 마찬가지로 링커쌍은 다시 BamHⅠ을 사용한 후속의 분해 단계를 통하여 분리된다. 형성된 L9/L10-개질된 선형 pUC19벡터는 이제 T4-DNA 리가제에 의해 폐환되고 이어서 즉시 클로닝된다. 플라스미드 pUC19Sak0가 형성된다.
후속 공정 단계로, 원리적으로 동일한 공정을 사용하여, 부분적으로 포스포릴화된 링커쌍 L11*/L12(참조 : 표 1)를 도입된 Sful 부위를 통하여 개방된 플라스미드 pUC19sak0상에 첨가한다. 성숙 sakM26X 유전자의 코돈4의 서열이 완결되고 이동식 전이 서열을 포함하는 성숙 SAK 생성물의 아미노산 1 내지 13에 대한 일정하게 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 축적된다. 이어서, PCS상에 첨가된 링커쌍 L11*/L12는 다시 제한효소 SphⅠ을 사용한 분해에 의해 제거된다. 미리 키나제로 처리된 링커쌍 L13*/L14는 이제 T4-DNA 리가제를 사용하여 선형 플라스미드의 형성되는 SphⅠ말단에 연결시킨다. 상기 방법으로, 코돈 22 및 SphⅠ 부위와 중복되는 아미노산 22내지 16 및 제한효소 NaeⅠ에 대한 독특한 분해 부위의 암호화 뉴클레오타이드 서열이 링커쌍의 중복적으로 매달린 5'-말단으로의 판독 방향으로 재구성된 SphⅠ부위로부터 도입된다. 형성되는 선형 pUC19 유도체는 또한 이의 말단에 어니얼링후 코돈 14 및 15를 완결시키는 서로에 대한 상보적인 6개의 뉴클레오타이드 환 단일사 DNA 서열을 함유한다.
유리된 중복적으로 매달린 5'-뉴클레어타이드 말단을 포스포릴화시킨 후, 링커-개질된 벡터 단편을 기술된 방법으로 폐환시킨다. 클로닝을 통하여, 플라스미드 pUC19Sak1??가 수득되는데 이는 그 중에서도 코돈 23에 대한 연결 서열과 함께 NaeⅠ에 대한 독특한 분해 부위를 포함한다.
[부분 단계 C2]
표면상으로 아미노산 32로부터 SAKM26X의 C-말단에 대해 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 pUC19SakA2의, 다음 공정 단계에 대해 적용되는 형태의 작제는 2개의 유전공학적 공정 단계로 수행하는데, 이는 부분단계 C1으로부터의 중간체 플라스미드 pUC19sakA1을 사용하여 서로 매치시킨다.
플라스미드 pMET5를 다시 사용하여 SAKM26X의 아미노산 44내지 124에 대해 암호화하는 공정에 따라서 필요한 DNA 부분-서열을 제공한다. 3'-플랭킹 DNA 분획을 분리시키기 위하여, 이 경우 1.2kb크기의 Sa1Ⅰ/PstⅠ 단편을 먼저 pMET5로부터 단리시키고, 이로부터 유용한 방식으로 이미 기술된 바와 같이 AvaⅠ, AvaⅡ 및 HindfⅠ을 사용하는 연속적인 제한효소 분해에 의해 361bp크기의 Sa1Ⅰ/HinfⅠ 단편이 수득되는데, 여기서 SAK42D에 대해 암호화하는 서열의 최종 27bp는 마찬가지로 제거된다.
대립하는 공정 단계로, HinfⅠ/PstⅠ-적용가능한 링커쌍 L15/L16*(참조 : 표 1)을 벡터 pUC19의 PstⅠ-말단상에 첨가한 다음, Sa1Ⅰ으로 분해시킨 후, 이제 선형인 Sa1Ⅰ/HinfⅠ-양립성, L15/L16-링커-개질된 클로닝 벡터 pUC19를 수득한다. 첨가된 링커쌍은 미리 조작된 방법으로 성숙 sak42D 유전자의 코돈 125부터 하부로 회복된 암호화 서열을 함유하며, 또한 이때 성숙 SAD42D유전자의 아미노산 129와 130사이의 아미노산 시리즈(정적 돌연변이)(즉, 뉴클레오타이드 위치 391에서), 제한효소 S쇼Ⅰdp 대한 추가의 인식 서열을 보유한다.
이미 기술된 개질된 선형 벡터 pUC19에, 단리된 361bp 크기의 Sa1Ⅰ./HINFⅠ 단편(pMET5로부터)이 T-4DNA 리가제에 의해 삽입되고, 형질전환후, 중간체 플라스미드 pUC19sakA1이 먼저 수득되는데, 이는 코돈 4로부터 상부로 성숙 sak42D 유전자의 완전 암호화 DNA 서열을 함유한다.
상기 생산된 중간체 플라스미드는 연속적인 유전공학적 공정으로 EcoRⅠ 분해 부위를 통하여 선형화되고 기술된 원리에 따라서, 세미-포스포릴화 링커쌍 L17*/L18에 의해 개질된다. 서로 상보적인 이들 링커는 특히 코돈 32내지 43의 암호화 부분-서열 뿐만 아니라 SAKM26X에 대한 성숙 표적 서열의 코돈 44의 첫 번째 2개의 뉴클레오타이드를 함유하며, 이에 의해, 코돈 32 및 33, 38 내지 40 및 또한 42 및 43에서, 성숙 천연 sak42D 유전자의 동일한 유전자 분획으로부터 유래되는 방법으로, 9개의 정적 돌연변이가 추가로 도입된다. 결과로써 상기 공정에 따라서 상기 영역 중에 SAKM26X의 아미노산 서열이 유지된, 제한효소 Sa1Ⅰ, SacⅠ 및 SacⅡ에 대한 추가로 목적하는 독특한 인식 부위가 형성된다. 링커-치환된 플라스미드의 후속 HindⅢ 분해후, 선형L17/L18-HindⅢ-플랭킹된 벡터 pUC19 및 414bp크기의 sak 유전자 아-단편이 동일한 시기에 분해 혼합물로부터 단리된다. 이들의 후자로부터, 분해효소 Mn1Ⅰ를 사용한 분해를 통하여 그 중에서도 5'-면 상에서 링커쌍 L17/L18의 3'-말단에 대해 양립성이고 아미노산 46상으로부터 SAKM26X의 C-말단을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 290bp 크기 Mn1Ⅰ/HindⅢ 단편이 형성되는데, 이는 TAA 종결 코든 후 절단된다.
상기 수득된 DNA단편은 공지된 방법으로 T4-DNA 리가제를 사용하여 함께 혼합된다. 형질전환 및 선별후, 최종적으로 제2기본 플라스미드 pUC19sakA2가 수득되는데, 이는 pUC19sak△1과 함께 하기 유전공학적 공정 단계에 대한 출발 플라스미드로서 작용한다.
[부분단계 C3]
부분단계 C1 및 C2에서 기술되고 즉시 클로닝되어 일정하게 성숙 SAKM26X 유전자를 생산하는 N- 및 C-말단 유전자 분획의 통합은 아미노산 23 내지 31 사이의 영역을 포함하는 지금까지 소실된 DNA 부분-서열에 대해 암호화하는 상보적인 적응인자 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행한다.
상기 공정에 따라서, 2개의 일련의 적응인자 쌍(표 1참조)이 사용되는데, 이는 하기와 같은 통상의 특성에 의해 특징화된다 :
-이들은 동일한 서열 길이를 갖는다;
-이들은 NaeⅠ-에 대해 적용가능한 5'종결 및 Sa1Ⅰ제한 분해에 대해 적용가능한 3'-종결 말단을 갖는다; 또한
-이들은 코돈 위치 26에 대해, 각각의 경우 12개의 상이한 코돈에 상응하는 것과 같은 뉴클레오타이드 시리즈를 함유한다.
이들 양태로부터, 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성을 통하여 생산된 상기 축적된 적응인자 올리고뉴클레오타이드는 매회 12개의 상이한 올리고뉴클레오타이드 서열(AG)의 혼합물을 나타내며 결과적으로 매 시리즈에서 매회 12개의 상이한 적응인자 쌍의 혼합물이 생성된다. 올리고뉴클레오타이드의 합성중 뉴클레오타이드의 혼합물이 적응인자 시리즈 AG1/AG2 11을 통해서 및 적응인자 시리즈 AG3/AG4를 X HD해, 6개의 상이한 아미노산이 위치 26에서 암호화되고, 잠재적으로, 결과로서, 아미노산 26에 대해 전체 17개의 상이한 코돈이 도입될 수 있는 방식으로 될 것으로 생각된다.
유전공학적 공정 중, 상술한 적응인자 쌍 AG1/AG2* 및 AG3/AG4*는 각각 먼저 별개의 반응 단계로 자체 공지된 방법으로 pUC19sakA2의 SalⅠ 분해 후 형성되는 유리 말단에 커플링된다. 이제 각각 AG1/AG2-HindⅢ 및 AG3/AG4-HindⅢ-종결된, 성숙유전자의 코돈 24로부터 암호화 서열 영역을 포함하는 단편 혼합물이 후속의 HindⅢ 분해에 의해 분리된다. 당해 적응인자형으로 결정된 단편 혼합물은 NaeⅠ 및 HindⅢ으로 개방시킨 기본 플라스미드 벡터 pUC19sak1에서 최종적으로 클로닝된다. 형질전환후 스득된 클론은 sakM26X 유전자-함유 플라스미드 상에서 EcoRⅠ 및 HindⅢ을 사용하여 수득한 플라스미드 DNA의 이중 분해에 의해 미리 선별된다. 대표적인 수의 미리 선별된 재조합 플라스미드의 DNA 서열 분석후, 성숙 SAKM26I, SAKM26R, SAKM26V, SAKM26T, SAKM26K 및 SAKM26L에 대해 암호화하는, 플라스미드 pUC19sakM26I, pUC19sakM26R, pUC19sakM26V, pUC19sakM26T, pUC19sakM26K 및 pUC19sakM26L을 적응인자 쌍 AG1/AG2를 사용하여 수득한 클론으로부터 선별한다. 동일한 방법으로, SAKM26C, SAKM26A, SAKM26G, SAKM26G 및 SAKM26S에 대해 암호화하는 플라스미드 pUC19sakM26C, pUC19sakM26A, pUC19sakM26H, pUC19sakM26G 및 pUC19sakM26S가 AG3/AG4 시리즈로부터 선별된다.
[부분 단계 D : 재조합 생산 균주로부터 수득하는 발현 플라스미드 pMEX6sakM26X의 작제]
발현이 합성 tac 프로모터에 의해 조정되는 것으로 공지되어 있는, 상업적으로 구입할 수 있는 플라스미드 pMEX6을 다시 발현 벡터로서 사용한다. EcoRI/PstI 단편을 성숙 sakM26X 유전자를 함유하는, 이미 기술된 pUC19sakM26X 족 플라스미드 11개로부터 단리하고, 이어서 이들을 EcoRI 및 PstI으로 처리한 발현 벡터 pMEX6내로 삽입하여, 이. 콜리 균주 TG1의 샘플을 수득한 재조합 DNA로 형질전환시킨다. 관련된 대표적인 플라스미드 족 pMEXsakM26X를 조정하는 일련의 발현 균주 이. 콜리 TG1 (pMEX6sakM26X)이 형성된다. 상기 족의 플라스미드 모두에 있어서, 해당 표적 폴리펩타이드의 발현은 상기 기술한 발현 플라스미드와 유사한 발현 시그날의 조정에 의해 수행된다.
형성된 SAKM26X 폴리펩타이드를 플라스미노겐 활성화제 활성의 발달에 대해 1차 스크리닝-하기 기술되는 방법으로 수행-CM로 체크한후, 균주 이. 콜리 TG1(pMEX6sakM26l) 및 이. 콜리 TG1(pMEX6sakM26C)를 표적 폴리펩타이드의 발효 및 농축을 위한 추가의 가동 단계용의 SAKM26L 및 SAKM26C를 수득하기 위한 생산 균주로서 설별한다.
[부분 단계 E : 발현 및 플라스미노겐 활성화제의 활성의 측정]
형정전환된 이. 콜리 균주 이. 콜리 TG1(pMEX602sak), 이. 콜리 TG1(pMEX6△N10sak), 이. 콜리 TG1(pMEX6△N14sak), 이. 콜리 TG1(pMEX6sakM26L), 및 이. 콜리 TG1(pMEX6sakM26C)를 복합 완전 배지 또는 합성 배지 중에서 세포내 SAK 형성 검출용으로 중기 또는 말기 대수기까지 액침 배양한다. 상기 성장기에, SAK 폴리펩타이드의 발현은 이소프로필 티오갈락토피라노시드(IPTG)를 가함으로써 유발된다. 추가로 1 내지 6시간후, 원심분리로 세포를 하베스트하고 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF)를 함유하는 인산염 완충액 중에 재현탁시킨다. 조 세포추출물을 초음팝 NS해 및 고속 원심분리로 세포로부터 생산한다.
플라스미노겐 활성화제 폴리펩타이드, 특히 SAK42D, SAKN10, SAKN14, SAKM26L 및 SAKM26C를 등명한 - 원심분리된 조 추출액으로부터 S-세파로스의 신속한 유동(Pharmacia, Freiburg) 및 힐로드(Hiload)-페닐세파로스(Pharmacia, Freiburg)를 사용하는 연속 크로마토그라피를 포함하는 2-단계 컬럼 크로마토그라피 정제 공정으로 전기영동적 균질성까지 정제한다.
조 추출물 및 크로마토그라피 분획물 중 플라스미노겐 활성화제의 농도는 SDS-PAGE 후 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법 (Coomassie brilliant blue colouring)에 따라서 또는 플라스미노겐으로부터 방출된 프로테아제 플라스민의 단백분해 활성을 통한 간접 경로로 밴드 강도를 측정하여 반-정량적으로 측정한다. 방법학적으로, 상기 검출은 플라스미노겐-카제인-아가 판 상에서 용해 지역의 크기의 측정을 통해서 [참조 : D.Behnke and D. Gerlach, Mol. Gen. Genet., 210 (197), 528-534] 및 합성 플라스민 기질 크로모짐(chromozym) PL로부터 방출된 니트로페놀레이트의 비색검정법 검측을 수행한다.
플라스미노겐 및 SAK42D 또는 본 발명에 따르는 SAK 폴리펩타이드를 포함하는 착화합물의 해리상수는 또한 이와 관련하여 신규한 친화성 크로마토그라피법으로 측정한다.
[양태]
다음 양태는 실시예를 참고로 하여, 벡터의 작제, 생성물 합성의 수행 및 섭생처리를 위한 공정의 개별 단계를 설명하기 위함이다. 그러나, 이들은 플라스미드 DNA의 수득, 제한효소를 사용한 DNA의 분해, 아가로스겔로부터 DNA 단편의 단리(독점적으로 GenecleanR, Bio 101, La Jolla를 사용하는 유리 우유법으로), 벡터 플라스미드내로의 DNA의 삽입, 플라스미드 DNA를 사용한 세균성 수용체 균주의 형질전환 및 DNA 서열 분석과 같은 표준화된 개별적 유전공학적 공정에 관한 상세한 데이타는 포함하지 않는다. 그러한 공정은 일련의 문헌[참조 : "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", T. Maniatis, E.R. Fritsch J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Edition, 1989 or in "Recombinant DNA Methodology", J-A. R. Killon, A. Nasim and E.R. Nestman, John Wiley & Sons]에 기술되어 있으며 당해 기술수준의 전문가에게 공지되어 있다.
본 발명에 따라서 사용되는 모든 올리고뉴클레오타이드는 포스포르아미다이트법을 사용하는 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성(Model 380B, DNA 합성기, Applied Biosystems, Weiterstadt)으로 생산한다.
본 발명은 신규한 형태의 스태필로키나제를 포함하는, 세균성 플라스미노겐 활성화제 스태필로키나제(약자 : SAK)의 시그날-펩타이드 유리 발현형, 및 또한 유전공학을 이용한 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 본 발명에 따르는 SAK 형태에 대해 암호화하는 DNA서열, 이들 DNA서열이 존재하며, 고도로 효과적인 발현 시그날과 커플링되어 있고, 이들 중 하나에 재조합 숙주 세포가 혼입된 후, 배양 조건하에서 본 발명에 따르는 SAK형태를 생합성할 수 있도록 선택된 재조합 플라스미드, 및 상기 배양 및 수득한 배양액으로부터 스태필로키나제 형태(표적 폴리펩타이드)의 단리에 대한 부분 공정을 포함한다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한 모노클로날 항-스태필로키나제 항체(anti-SAKmABs)의 1차 공급을 포함한다.
랙크[참조 : CH, LACK, Nature, 161(1948), 588-560] 및 로빈스 [참조 : K.C. ROBBINS et al., J. Biol, Chem., 242 (1967), 2333-2342] 및 잭슨 [참조 : K.W. JACKSON et al., Methods in Enzymology, 80 ,(1981), 387]에 의해 수행된 연구 이후 공지된 바와 같이, 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 균주로 부터의 폴리펩타이드인 스태필로키나제는 사람또는 동물 혈액 혈장중에 편재된 프로효소(proenzyme)플라스미노겐이 섬유소용해 활성효소 플라스민으로, 자체적인 단백 분해 활성을 나타내지 않으면서 변형되는 것을 배열하는 위치에 있다. 상기 활성화 메카니즘은 아직까지 자세하게 설명되어 있지 않다.
따라서 본 발명에 따르는 스태필로키나제 형태는 사람 및 또한 임의로 수의약에서 혈전색전증(thromboembolic angioses)치료중 약제로서 적합하며, 반면 항-SAKmABs는 활성 성분 수득과정, 및 이후 상세하게 설명되는 바와 같이, 약제로서 모두 사용될 수 있다.
스태필로코키나제 (분자길이 : 136개의 아미노산)는 플라스미노겐의 플라스민으로서의 변형을 통한 섬유소용해 시스템 및 이에 의해 야기된 섬유소의 분해를 활성화시킬 수 있는 물질군 중 일원이다. 널리 알려진 내인성 활성화제는 사람-조직 플라스미노겐 활성화제 (t-PA) 및 유로키나제이다. 세균기원의 다른 플라스미노겐 활성화제는 스트렙토키나제이다. 상기 물질은 이미 혈전색전증 환자의 치료용으로 치료학적으로 사용되고 있다. 이들 질병의 발병률이 높아짐에 따라, 고순도 표준을 갖는 물질이 상당량 요구되고 있다.
스트렙토키나제의 경우와는 다르게, 상기 세균성 플라스미노겐 활성화제가 예를 들어,
-열 및 화학적 영향에 대해 높은 단백질 안정성,
-이황화 가교가 없는 3차 구조 및
-작은 분자크기(15.8kD)의 잇점을 제공함에도 불구하고. 통상의 산업 미생물학을 이용한 SAK의 산업적 생산방법이 개발되어 있지 않다.
이런 현실의 주요 원인은 수많은 독성 부산물이 스태필로코커스 아우레우스 생산주에 의해 형성된다는 사실이다.
재조합DNA 기술을 도입시킨후, 재조합 숙주 미생물에 의한 SAK 합성이 가능해졌으며, 그 결과 상기 폴리펩타이드를 활성 성분으로서 갖는 약제의 기술적으로 효과적인 생산이 실현되었다.
스태필로코커스 아우레우스 파아지의 게놈으로부터 단리된, 스태필로키나제에 대한 암호화 유전자 2개가 당해 기술분아에 기술되어 있다. 한편으로 S. 아우레우스 파아지 C[참조 : T. SAKO et al., Mol. Gen. Genet., 190(1983), 271-277; T. SAKO/N. TSUCHIDA, Nucl. Acids Res., 11(1983), 7679-7693; cf. EP 0 077 664], 및 또 다른 한편으로 S. 아우레우스 파아지 42D[참조 : DD 245 444 and also D. BEHNKE/D. GERLACH, Mol. Gen. Gent., 210(1987), 528-534]가 유전자 공여체로서 사용된다. 상기 유전자는 먼저 이. 콜리 플라스미드 pBR 322상에서 매회 1차 클론되어 여러 단계의 서브클로닝 후 DNA 서열 분석법을 이용하여 확인한다.
기타스태필로키나제 유전자의 단리가 최근에 기술되었다[참조 : D. COLLEN et al., Fibrinolysis, 6 (1992), 226-231]. 상기 유전자, 소위 STAR은 S.아우레우스 균주의 염색체 DNA로부터 수득한다. 이들 모든 유전자는 천연적으로 스태필로키나제의 대립형질형 변이체를 나타낸다.
SAK-C 폴리펩타이드에 대한 암호화 유전자는 이. 콜리 발현시스템 중으로 재클로닝된 후 이.콜리 균주WA802에서 과발현된다[참조 : EP 0 077 664; T. SAKO, Eur. J. Biochem., 149 (1985), 557-563].
한편 서열 동정 번호 9에 따르는 SAK 42D에 대한 암호화 유전자는 그램-음성 및 또한 그램-양성 플라스미드 백터상으로 클로닝되어 에체리키아 콜리, 바실러스 서브틸리스 및 스트렙토코커스 생귀스에서 발현된다[참조 : DD 245 444 and D. BEHNKE/D. GERLACH, Mol. Gen. Genet., 210 (1987), 528-534].
sak-STAR 유전자는 먼저 이.콜리중에서 이의 천연 시그날 조정하에서만 발현된다[참조 : D. COLLEN et al., Fibrinolysis.,6(1992), 203-213].
인용문헌으로부터 밝혀진 바와 같이, 3종의 유전자 sak 42D, sak-C 및 sak-STAR는 먼저 주로 이들의 천연형태. 즉, 시그탈-펩타이드-함유 프리폴리펩타이드가 주산물로서 존재하는 형태로 발현되었다. 시그날 서열을 갖는 상기와 같은 프로폴리펩타이드의 합성은 형성된 생성물로부터 주변세포질 또는 주위 배양 매질중으로 배수시키는 것을 필요로 한다. 상기 공정은 그램-양성 재조합 숙주 세포를 사용할 경우 배양 매질중으로 배수(spluicing-out)시킬 때, SAK 폴리펩타이드가 이들 세포의 세포외 프로테아제의 작용에 노출되어, 그 결과 폴리펩타이드의 신속한 분해가 일어나는 실질적인 단점을 갖는다.
콜리형 숙주 세균을 사용할 경우, EP 0 077 664에 상세하게 기술되어 있는 바와 같이, 표적 폴리펩타이드를 주변세포질 공간내로 배수시킴으로써 상기 단점에 빠지게 되며, 그 결과 단백분해성 분해 및 세포분해시 표적 폴리펩타이드로의 용이한 접근에 대한 보호를 제공하고자 하는 봉쇄 정도를 성취하는 이 고려된다. 그러나, 이런 형태의 발현은 이의 일부에 대하 SAK 표적 폴리펩타이드를 기술적으로 효과적인 생산을 방해하는 다른 단점을 포함한다. 이의 원인은 다음과 같다. :
▶대량의 표적 폴리펩타이드를 그램-음성 숙주 세포의 주변세포질내로 배수(이는 기술적으로 효율적인 생산 방법에 있어 필수적임)시키면 이들 세포의 분비 장치를 무리하게 혹사시켜 미생물의 물리적 붕괴를 일으킨다.
▶전체 공정의 배양 단계에서, 발현에 유효한 시간 및 해당 표적 폴리펩타이드의 수율이 크게 감소된다.
▶발효 프로그램의 재현이 더욱 어렵게 되며
▶상기 형태의 생합성 결과, 성숙 SAK 폴리펩타이드 및 SAK 프리폴리펩타이드의 이질성 혼합물이 형성된다.
EP 0 077 664에 따르면, SAK-C는 천연 발현 시그날을 사용하여 이질성 숙주에서 발현시키면, 그 결과 적절한 기술적 효율성을 갖는 공정에 대해 발현 정도 가 낮다. 사코[참조 : T. SAKO, Eur. J. Biochem., 149(1985), 557-563]에 의해 제안된 바와 같은 SAK-C의 열적 과발현은 상술한 문제점 뿐만아니라 추가로 산업용 발효 조건하에서의 열적으로 유발된 단백질 생합성이-적어도-높은 비용 및 부정확하게 진행될 수 있다는 단점으로 특징화된다.
합성된 SAK 42D DD 245 444에 따라서 주로 B. 서브틸리스 배지 상등액으로부터 단리된다. 상기 공정의 경우, 발현 및 분비를 SAK 42D 유전자의 상응하는 천연 조절 서열을 사용하여 재조합 플라스미드 pDB 15에 의해 배열시킨다. 그러나, 상기 공정도 또한 만족스럽지 못한 발현 정도를 갖는다; 이는 또한 발현된 SAK 폴리펩타이드의 이유전성(heterogeneity) 및 연장된 배양후 표적 폴리펩타이드의 배양 매질내에서의 신속한 분해로 특징된다[참조 : D. GERLACH et al., Zbl. Bakt. Hyg., A269(1988), 314-322].
SAK-STAR로 공지된 기타 천연 대립형질형 SAK는 또한 지금까지 이.콜리 중에서 이의 천연 시그날을 사용하여 이질적으로 합성되었으며[참조 : D. COLLEN et al., Fibrinolysis, 6(1992), 203-213], 따라서 SAK-C에 대해 상기한 바와 동일한 문제점을 갖는다.
따라서 지금까지 SAK-C, SAK-42D또는 SAK-STAR에 대해 기술한 공정은 예외없이 완전한 천연 유전자 서열의 발현에 의지하고 있어 불가피하게 상기한 단점을 갖게 된다.
상술한 기술 수준의 배경에 대하여, 본 발명의 목적은 혈전색전증 치료중 사람 또는 수의학에서 사용하기에 적합한 표적 폴리펩타이드의 고도로 순수하고 균질한 제재의 생산을 가능케하는. SAK 폴리펩타이드의 기술적으로 효율적인 생합성 방법을 개발하는 것이다.
상기 목적을 성취하기 위히여 플라스미노겐 활성화제 효과를 갖는 스태필로키나제 폴리펩타이드의 재조합 제조시 이들 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA서열--즉 시그날 펩타이드에 대해 암호화하는 영역이 없는-sak 유전자--을 사용하는 것이 제한되었다. 시그날 펩타이드에 대해 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 제거를 통하여, 이후 설명되며, 기술적으로 효율적인 SAK 표적 폴리펩타이드의 생산을 1차로 허용하는 본 발명에 따르는 장점이 놀랍게도 성취된다.
본 발명에 따라서 생산된 시그날-펩타이드-유리 폴리펩타이드는 세포의 내부에서 수거하며 이는 놀랍게도 특히 불용성, 생물학적 불활성 단백질 응집체의 형성과 같은, 예측이되는 복잡성이 나타나지 않는 것으로 밝혀졌다[참조 : Kane, J.F. et al., TIBTECH 6, p .95(1988), Mitraki, A. et al., Bio/Techn. 7, p. 690(1989)]. 또한, 세포내적으로 발현된 SAK 표적 폴리펩타이드는 놀랍게도 수용성이며 생물학적으로 활성인 형태로 존재하며, 그 결과 복잡하고 비용이 많이 소요되는 재생 단계(renaturing step)없이 기술적 정제 공정을 수행할 수 있게 한다.
이후 나열되는 장점은 본 발명에 따르는 공정으로 성취된다;
▶ 발현된 표적 폴리펩타이드가 세포내에 편재되어 따라서 생성물의 기술적 농축공정이 용이하게 되며;
▶ 프로폴리펩타이드가 더 이상 형성되지 않음에 따라 SAK표적 폴리펩타이드가 균질한 형태로 존재하고;
▶ SAK표적 폴리펩타이드의 세포내 과발현은 생성물 합성기(synthesis phase)를 길게하여; 세포의 물리적 분해가 없어, 그 결과 SAK표적 폴리펩타이드의 수율이 높아질 수 있으며 (세포의 전체 단백질의 10내지 15);
▶ 본 발명에 따르는 발현 벡터를 사용하여 가능할 수 있는, SAK표적 폴리펩타이드 과발현의 화학적 유발은 발효 공정중 양호하고 단순한 기술적 취급성을 가능케 한다.
본 발명에 따라서 세포내적으로 발현된 SAK 폴리펩타이드는 N-말단 메티오닌이 없으며, 따라서 천연 발현된 성숙 분비 SAK 폴리펩타이드와 구별되지 않는 것으로 밝혀 졌다.
SAK 표적 폴리펩타이드 시그날-펩타이드-유리 과발현의 이들 장점 이외에, 서열 동정 번호 6 및 7에 따르는 인위적인 대립형질 SAK 변이체 및 또한 서열 동정 번호 4 및 5에 따르는 SAK 단편의 본 발명에 따르는 표적 폴리펩타이드는 플라스미노겐 활성화에 대한 증가된 특이 활성, 더욱 신속한 플라스미노겐 활성화 반응속도 및/또는 더욱 낮은 분자량 및 따라서 더욱 낮은 항원성과 같은 유리한 특성을 나타낸다. 이들 특성은 특별한 중요성, 특히 사람 및 동물에서 혈전색전증성 질병 치료시 SAK 표적 폴리펩타이드의 사용애 대한 중요성을 갖는다.
따라서 본 발명에 따라서 사용되는 DNA 서열은 기본적으로 하기와 같이 특징화 된다 :
▶ 이들은 시그날-펩타이드-유리 성숙 천연 스태필로키나제 및 천연 분자의 공지된 플라스미노겐 활성화제의 효과와 동등한 효과를 갖는 대립 형질 SAK 변이체 또는 SAK 단편에 대해 암호화하고, 또한
▶ 매회, 해독-개시 코돈 ATG는 이들의 5'-말단 상부로 즉시 연결된다.
본 발명의 목적을 성취하는데 있어 상기 설명된 바와 같은 DNA서열이 제1도에 따르는 뉴클레오타이드 서열(서열 동정 번호 1)또는 서열 동정 번호 1에 따르는 대립형질 변이체 또는 단편의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것이 바람직하다. 특히 -제1도에 따르는 뉴클레오타이드외에 -제1도에 따르는 1차 뉴클레오타이드 서열의 천연 대립형질 변이체인, 서열 동정 번호 2 및 서열 동정 번호 3에 따르는 뉴클레오타이드 서열을 또한 본 목적을 위하여 사용한다.
제1도에 따른 뉴클레오타이드(서열 동정 번호 1)는 본 발명에 따라서
-ATG 개시 코돈 갖는 5'-말단 및
종결 코돈 TAA를 갖는 3'-말단에서 연결된 천연 SAK 42D구조 유전자를 나타낸다.
SAK 42D구조 유전자는 재조합 출발 플라스미드 pMET 5 (제10도)에 대한 본 발명의 필요에 대해 공급될 수 있다. 플라스미드 pMET5-통상의 클로닝 백터 pUC19의 유도체 - 는 sak 42D유전자에 대해 암호화하고 문헌에 공지된 pDB족[참조 : DD 245 444 또는 D. BEHNKE/D. GERLACH, Mal. Gen. Genet., 210 (1987), 528-534]플라스미드중 하나, 바람직하게는 pDB 15 또는 pDB17로부터 자체 공지된 재조합 DNA 기술의 공정 단계를 사용하여 분리시킨 DNA 분획을 함유한다. 상세하게, 플라스미드 pMET5는 뉴클레오타이드 서열 436 내지 1023에 의해 제9도 (서열 동정 번호 9)에서 특징화된 천연 sak 42D) 유전자 분획을 갖는다. 예를 들어 pDB17상에서 sak 42D 서열[참조 : 서열 동정 번호 9에 주어진 바와 같은 완전 서열)과 비교되는 5'-말단에서 상기 분획으로부터 천연5'-플랭킹 조절 영역인, 시그날 펩타이드에 대한 암호화 서열 및 성숙 SAK 42D의 처음 4개의 아미노산에 대한 코돈이 빠진다; 처음 4개의 아미노산에 대한 코돈은 원래 유전자로부터 Taq Ⅰ 제한효소 절단법으로 분리시킨다. (5'-말단에서, pMET5-DNA중 단일칼라(unicalar) salⅠ-분해점이 상기 대신 형성된다.) 그러나 SAK 42D에 대해 암호화하는 서열로부터의 하부인, 주로 단리된 sak 42D-DNA의 3'-플랭킹 비-암호화 영역 및 이.콜리 플라스미드 pBR 322의 DNA분획은 여전히 pDB17상에서와 같이 pMET15상에 함유되어 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 플라스미드 pMET5 sak 42D 유전자 분획을, 제1도에 나타낸 바와 같은 성숙 천연 SAK 42D에 대한 시그날-펩타이드-유리 암호화 서열로 재구성시키는 것은 상응하는 특정 뉴클레오타이드 서열을 갖는 화학적으로 합성된 링커 쌍을 부가함으로써 수행할 수있다.
유사한 방법으로, 화학적으로 합성된 링커 분자의 연결을 특징적으로 포함하는 재조합 DNA 기술의 자체 공지된 각 단계를 통하여, 본 발명에 따르는 sak-DNA 서열의 추가의 천연 및 인위적인 대립형질 형태 및 단편을 플라스미드 pMWT5로부터 제거가능한 sak 42D-DNA 분획으로부터 생산할 수 있는데, 상세하게는
a) 제2도 및 3도에 따르는 뉴클레오타이드 서열 (서열 동정 번호2 및 3)을 갖는 2개의 움 서열-이는 언급한 바와 같이 ATG개시 코돈과 종결 코돈 사이에 박혀있는-은 지금까지는 쳔연 성숙 SAK 폴리펩타이드의 것으로 공지된 천연 대립형질 변이체에 대한 구조 유전자이고, 또한
b) 제4도 및 5도에 따르는 뉴클레오타이드 서열(서열 동정 번호 4 및 5)을 갖는 2개의 DNA서열은 천연 성숙 폴리펩타이드 SAK 42D의 신규한N-말단 단축된 단편에 대한 시그날-펩타이드-유리 구조 유전자이며, 최종적으로
c) 제6도 및 7도에 따르는 뉴클레오타이드 서열 (서열 동정 번호 6 및 7)을 갖는 2개의 DNA 서열은 천연 성숙 폴리펩타이드 SAK 42D의 신규한 인위적인 대립형질 변이체에 대한 시그날-펩타이드-유리 구조 유전자이다.
상술한 DNA서열, 특허 서열 동정 번호 1내지 7하에 서열 프로토콜에 나열된 DNA서열은 원핵 또는 진핵 숙주 세포내로 자체 공지된 방법으로 도입시켜 플라스미노겐 활성화제 효과를 갖는 시그날-펩타이드-유리 스태필로키나제 형태로 발현시킬 수 있다.
상술한 DNA서열에 추가로, 바람직하게는 서열 동정 번호 1내지 7하의 서열 프로토콜에 언급된 DNA서열 외에도, 원핵 또는 진핵 숙주 세포내로 도입된 후 당해 1차 구조의 적어도 일부 및 본 발명에 따르는 SAK 폴리펩타이드의 생물학적 또는 면역원성 특성 중 한가지 이상을 갖는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 DNA서열은 모두 상기 의미에 있어서 본 발명의 대상에 포함된다. 특히 하기의 것들이 포함된다.
a1) 상술한 DNA 서열의 SAK-폴리펩타이드-암호화 영역, 바람직하게는 서열 동정 번호 1내지 7하의 서열 프로토콜에 나열된 DNA서열 또는 상기와 동일한 것의 단편과 표준 조건(하기참조)하에서 하이브리드화되는 것과 같은 DNA서열, 및 또한
b1) 유전적 코드의 변성에 기인한 편차를 제외하고, a)하에 명시된 DNA서열을 갖는 일부에 대해 하이브리드화되는 것과 같은 DNA서열.
본 발명에 따라서, 표준조건은 하이브리드화가 55내지 68의 온도 및 5 X SSC완충액의 염 농도에서 수행되는 조건이다.
본 발명에 따라서, a) 또는 a1)하에 요약된 DNA 서열은 동정 번호 1 내지 7에 따르는 뉴클레오타이드 서열에 포함된 소위 정적 돌연변이(quiet mutation)를 함유하는 것으로, 즉 선택적 뉴클레오타이드 교환을 나타내는데, 그러나 이는 이후 각각의 경우 상응하는 스태필로키나제 형태의 아미노산 서열에서의 어떠한 변화도 포함하지 않는다.
본 발명에서는 본 발명에 따르는 DNA 서열은 모두 형질전환에 의해 적합한 원액 및/또는 진액 숙주 세포중으로 도입되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라서, 본 발명에 따르는 sak구조 유전자 및 ATG개시 코돈+TAA 종결 코돈의 배합물을 발현 조절 서열에 커플링시키는 발현 플라스미드의 DNA분획은 시그날 펩타이드에 대해 암호화하는 영역에 없는 상태로 유지된다.
이 방법으로, 본 발명에 사용되는 sak-재조합 발현 플라스미드는 매회 사용되는 숙주 세포중에서 시그날-펩타이드-유리 및 따라서 표적폴리펩타이드의 세포내 발현을 보장한다.
본 발명과 연관하여, 원핵세포 DNA로부터 작제된 sak-재조합 발현 플라스미드가 독점적으로, 특히 이의 발현 구획(expression box ; 이후 상세하게 기술되는 바와 같은 발현 시그날의 총체성)이 제1도 내지 7도에 따르는 sak유전자(서열 동정 번호 1내지 7)를 함유하는 것과 같이 사용되고, 원핵세포 기원의 숙주세포가 본 발명에 따르는 SAK폴리펩타이드 발현을 위해 제공되는 경우 원핵세포성 조절서열과 기능적으로 연결된다.
백터의 발현 구획중에서 -판독방향으로 관찰시-원핵세포성 조절 서열의 하기 배합을 배열하는 것이 본 발명에 있어서 편리한 것으로 입증되었다;
▶ tac 프로모터+lac리프레서에 대한 결합 서열.
▶ 정의된 스페이서와 함께 샤인-달가노(Shine-Dalgarno)서열의 병렬 배치 형태의 해독-개시 영역,
▶ 전사 종결체.
(하기 배합과 같은 생략형 : R; tac;SD;T-배위)
기술된 바와 같이 매회 이미 ATG개시 코돈 및 TAA코돈과 연결된 본 발명에 따르는 sak서열은 R; tac;SD;T-배위와 같은 것 중 적합하게 도입된다.
본 발명의 범주내에서, 특히 높은 발현 성능은 해독-개시 서열로서 제8도에 따르는 DNA서열(서열 동정 번호 8)을 함유하는 경우 R; tac;SD;T-배위를 갖는 구획의 혼입시 성취될 수 있다.
본 발명에 따라서, 상술한 양태로부터 세균성 DNA로부터 발현 플라스미드와 숙주 세포로서 세균 세포-바람직하게는 그램-음성 세균,특히 이.콜리 균주, 뿐만아니라 바실러스(Bacillus)종 균주를 합하여 사용하는 것이 특히 유리한 것으로 입증되었다. 본 발명에 따르는 시그날-펩타이드-유리 SAK 표적 폴리펩타이드의 고도로 효율적인 발현은 그러한 세균성 발현 시스템을 사용하여 성취될 것이다. 본 발명에 따르는 SAK표적 폴리펩타이드의 합성중 이.콜리 발현 시스템 중에서 특히 유리한 효과가 수득된다. 본 발명의 상기 바람직한 양태에 대해, 복제기원, 선택적 마커 및 폴리링커 영역과 같은 양태외에,
a) 매회 혼입된 제1도 내지 7도에 따르는 DNA서열 (서열 동정 번호 1내지 7)이 제8도에 따르는 해독-개시 영역(서열 동정 번호 8)과 직접 연결된 R; tac;SD;T-배위를 갖는 발현구획을 가지며;
b) 통상의 이.콜리 클로닝 또는 발현 벡터, 바람직하게는 pUC 및 pMEX 벡터로부터 유래하는 발현 플라스미드가 작제된다.
sak유전자를 함유하는 본 발명에 따라서 제조된 발현 플라스미드의 예(참조 : 제11도 및 12도 및 실시예 3,4,7,8)는 다음과 같다.
-pMEX602sak
-pMEX6△N10sak
-pMEX6△N14sak
-pMEX6sakM26C
-pMEX6sakM26L
따라서 pUC, PBR 및 p15A형 플라스미드가 또한 사용될 수 있다.
이.콜리 숙주 세포는 매회 표준 원리에 따라서 본 발명에 따르는 이들 이.콜리 발현 플라스미드를 사용하여 형질전환 시킨다.
SAK표적 폴리펩타이드의 세포내 발현의 경우, 예를들어 JM101, K12 또는 C600과 같은 이.콜리 수용체 균주가 상기 바람직한 발현 시스템으로 사용될 수 있다. 이.콜리 TG1 숙주 세포 사용시 특히 양호한 발현 결과가 수득된다.
본 발명에 따라서 제조된 재조합 균주의 예는 다음과 같다. (참조 : 실시예 3,4,7,8) :
이.콜리 TG1 (pMEX602sak), 이.콜리 TG1 (pMEX6△N10sak), 이.콜리 TG1 (pMEX6△N14sak), 이.콜리 TG1 (pMRX6sakM26C), 이.콜리 TG1 (pMEX6sakM26L).
상술한 균주는 본 발명에 따르는 장점을 나타내는 숙주 세포의 예이다. 즉;
-이들은 본 발명에 따르는 sak유전자를 정확하고 높은 수준으로 발현시키고 (제13a도 참조)
-이들은 완전하게 세포내 생성물의 형성을 실현시키고 매회 숙주 세포의 세포질중에 표적 폴리펩타이드를 농축시키며 (표적 폴리펩타이드는 세포의 주변세포질 공간내로 배수되지 않는다);
-매회, 이들은 수용성이고 생물학적으로 활성인 표적 폴리펩타이드를 합성하여 축적시키고;
-이들은 배양 중 화학적 유도의 연산방식에 대해 효과적으로 반응하며;
-이들은 대규모 발효뿐만 아니라 높은 세포 밀도 공정에 대해 적합하게 안정한 재조합 미생물인 것으로 입증되었으며, 생성물의 효율적인 기술적 수득을 위한 표적 폴리펩타이드의 필수적인 고수율이 수득될 수 있다(숙주 세포의 전체 단백질의 15이하)
또한, 놀랍게도 본 발명에 따라서 사용되는 이.콜리 TG1 균주가 이의 아미노산 서열중에 N-종결 메티오닌을 갖지 않는 SAK형태를 합성하는 것이 발견되었다.
본 발명에 따르는 sak-재조합 숙주 세포- 특히 재조합 이.콜리 TG1 균쥬의 배양은 멸균 및 호기적-수중 조건하에서 자체 공지된 방법으로 매회 동화성 탄소 및 질수 공급원과 또한 정의된 무기염 성분을 갖는 영양 배지중에서 전- 및 주 배양 단계로 수행된다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에 따라서, sak-재조합 이.콜리 TG1 균주를 추가로 하기와 같이 특징화되는 발효 공정에 도입시킨다.
▶ 배양은 28내지 42에서 4시간 내지 16시간 동안 완전 배지 또는 소위 합성 배지 중에서 매회 암피실린 50mg/1내지 100mg/1를 가하여 수행하고,
▶ 발효 개시 후 2내지 4시간 경과 후, 숙주 세포에 의한 재조합 표적 폴리펩타이드의 생합성이 배지에 이소프로필 티오갈락토피라노시드(IPTG)를 바이오매스의 세포밀도가 약 0.2내지 1.0 A600 단위에 도달되었을 때 최종농도 0.3mmo1/1 이하로 첨가함으로써 개시된다.
SAK표적 폴리펩타이드는 숙주 세포로부터 다음 방법으로 바람직하게 단리된다 :
숙주 세포를 바람직하게는 초음파로 분해하고, 분해된 이물질의 가용성 분획을 불용성 분획과 분리시킨다. 그 다음 가용성 분획을 직접 이온 교환기에 도입시킨다.
다음단계로, 표적 폴리펩타이드를 NaCl 수용액으로 이온 교환기로부터 선택적으로 용출시킨다. 용출물을 소수성 상호반응 크로마토그라피에 직접 유리하게 통과기키고 이후 NaCl을 사용하여 단일 농축시킨다. 최종적으로, NaCl 구배를 낙하시킴으로써 표적 폴리펩타이드가 소수성 상호작용 크로마토그라피 배지로부터 높은 선택성을 갖고 용출되고 이어서 용출물로부터 수득한다. 재조합 이.콜리 TG1 세포의 용해물로부터 표적 폴리펩타이드의 상기 정제법은 2개의 정제 단계 사이의 완충액을 적용시키는 단순한 가능성을 통하는 특히 효율적인 방법이다.
상술한 처리 공정은 제1 용출 단계의 NaCl농도가 30 내지 500, 바람직하게는 200내지 300mM인 경우 특히 효울적이고, 소수성 상호작용 크로마토그라피에 공급하기 전에 낙하 NaCl 구배를 적절하게 2.0내지 3.0M의 초기 농도는 최종 농도가 15내지 100mM로 낙하되는 것을 지시하도록 선택한다(제14도 참조).
상술한 처리 공정은 단지 2개의 크로마토그라피 단계로 기술적인 측면에서 용이하게 수행가능하고 비싸지 않게 표적 폴리펩타이드를 분리시킬 수 있게끔 한다. 표적 폴리펩타이드가 상기 공정으로 고도의 순수한 형태 및 크로마토그라피적으로 균질하게 수득된다. 상기 정제 공정은 산업적 규모로 용이하게 확장시킬 수 있다. 상기 공정은 또한 조 세포 용해물 중에서 수득한 SAK표적 폴리펩타이드의 완만하고 손실이 적은 처리(변성 및 재생 단계 없이)가 되도록 한다. 본 발명의 발효 단계에서, 표적 폴리펩타이드가 프리-폴리펩타이드 및 성숙 표적 폴리펩타이드의 혼합물로서 존재하지 않는다는 사실이 상기한 정제 공정에 있어 특히 유리하다. SAK 42D, SAK-C 및 SAK-STAR과 같은 이미 공지된 천연 대립형질 스태필로키나제 형태외에, 특정한 신규 SAK 형태가 또한 유선적으로 본 발명의 범주내에서 이용될 수 있는데, 이는 특히 유리한 특성을 갖는다.
▶ 제4도에 따르는 아미노산 서열(서열 동정 번호 4)을 갖는 SAM 단편 형 N10△SAK42D
▶ 제5도에 따르는 아미노산 서열(서열동정 번호 5)을 갖는 인위적인 대립형질 SAK형 SAKM 26C, 및
▶ 제6도에 따르는 아미노산 서열(서열동정 번호 6)을 갖는 인위적인 대립형질 SAK형 SAKM 26C , 및
▶ 제7도에 따르는 아미노산 서열(서열동정 번호 7)을 갖는 인위적인 대립형질 SAK형 SAKM 26L.
단편형 N10△SAK42D 및 M14△SAK42D의 경우, 플라스미노겐 활성화제 효과를 갖는 N-종결 단축된 SAK 폴리펩타이드가 존재하며, 이들의 분자 길이는 각각 126 및 122개 아미노산이다.
인위적인 대립형질 형 SAKM26C 및 SAKM26L은 우선 플라스미노겐 활성화제 효과를 갖는 메티오닌-유리 S마형을 나타낸다; 이들은 136게 아미노산의 분자 길이를 갖는다.
플라스미노겐에 대해 가속된 활성화 반응속도가 상기 단편에 대해 발견되었다. 감소된 분자의 크기는 또한 더욱 적은 항원성을 타나낸다.
일부의 경우 특히 활성이 2배 더높은 것으로 나타나는 것 외에 (참조 : 표 2), 플라스미노겐에 대한 가속된 활성화 반응속도가 또한 인위적인 대립형질 형에 대해서 발견되었다. 이들 신규한 특성은 S마형이 사람 및 동물의 혈전색전증 질병의 치료용으로 특히 유용할 수 있도록 한다.
본 발명은 또한 스태필로키나제에 대한 모노클로날 항체를 포함한다. 이전까지, 홀리클로날 항-SAK 항체만이 유용할 수 있었다[참조 : T. SAKO/N. TSUCHIDA, Nucl, Acids Res., vol. 11(1983), 7679-7693, and D. GERLACH et al., Z1, Bakt. Hyg., vol. A269(1988), 314-322)]. 바람직하게는 재조합 이.콜리 숙주 세포로부터 생산된 순수한 SAK 42D 폴리펩타이드에 따라서, 항-SAK 항체를 형성하는 하이브리도마 세포주가 개량된 쾨흘러/밀스타인 (KOHLER/MILSTEIN)방법에 따라서 먼저 수득되었다.
이들 2개의 세포주-이들은 알파-SAK IG/H6(ZIM 0511로 기탁, DSM으로 전환) 및 알파-SAK Ⅱ A4/A10(ZIM 0512로 기탁, DSM으로 전환) 명칭을 포함한다 -는 시험관내 배양에 사용되며 모노클로날 항-SAK 항체 IG/H6 및 ⅡA4/A10은 배양 상등액으로부터 자체 공지된 방법으로 면역-친화성 크로마토그라피에 의해 분리 스킨다. 이들 모노클로날 항체는 본 발명에 따르는 SAK 형태의 플라스미노겐 활성화제 특성을 불활성화시키는 위치에 존재한다 (참조 : 실시예 17)
상기 특성을 이용하여, 본 발명에 따르는 항-SAK mABs를.
a) 미생물학적 및 의학적 진단에 있어서 스태필로키나제의 검출용 시스템에, 예를들면,
a1) 샘플 액체 중 웨스턴 블롯팅(Western blotting)또는 면역 침전법에 의해 SAK의 정성 검출용으로, 및
a2) 샘플 액체 중 SAK의 정량 검출용 ELISA시험 시스템으로, 뿐만아니라
b) 면역-친화성 크로마토그라피에 의해 발효액 또는 조 추출액으로부터 순수한 형태의 SAK폴펩타이드를 직접 제조하는 데 사용될 수 있다. 후자는 고도로 효율적인 처리 공정에 대한 다른 가능성을 창출한다.
이들의 플라스미노겐 활성화제 특성 때문에, 본 발명에 따라서 SAK폴리펩타이드, 먼저 시그날-펩타이드-유리 형태이고 따라서 세포내 합성되는 천연 대립형질 SAK 형태 및 신규한 인위적인 대립형질 SAK 형태 또는 단편은 둘다 혈전색전증 질병의 치료를 위한 약제학적 조성물로 사용하기가 탁월한 활성 성분이다.
본 발명에 따르는 공정에 의해 합성된 SAK 형태 하나 이상이 약제학적으로 적합한 희석제, 보조제 및/또는 담체 물질과 함께 함유된 약제학적 조성물이 상기 목적에 대해 특히 관심을 끈다. 상기 제형은 바람직하게는 비경구용으로, 특히 바람직한 방법으로는 정맥내 주사용으로 제공된다. 바람직한 투여량은 주사액 당 폴리펩타이드 3내지 100mg 범위이다.
본 발명에 따르는 모토클로날 항-SAK 항체는 항-도트(dot)제제, 즉 스태필로키나제에 의한 원치않는 강력한 플라스미노겐 활성화의 억제용 제재에 있어서 가치있는 활성 성분이다. 따라서 본 발명은 또한 상기와 같은 항체를, 임의로 약제학적으로 허용되는 희석제, 보조제 및/또는 담체 물질과 함께 함유하는 약제학적 제제를 포함한다.
본 발명과 관련하여, 하기와 같은 생물학적으로 순수한 샘플이 독일연방공화국 D-3300 브룬스윅크, 마쉐로더 벡크 1B 소재의 독일 미생물 수탁기관(DSM)에 기탁되었다 :
플라스미드 pMET5 (DSM 6841)
하이브리도마 세포주 알파-SAK IG8/H6 (AIM 0511)
(DSM )
하이브리도마 세포주 알파-SAK IIA4/A10 (ZIM 0512)
(DSM )
또한 하기 기탁된 플라스미드 또는 수용체 균주가 사용된다.
플라스미드 벡터/pUC19 (DSM 3425)
수용체 균주 이. 콜리 TG1 (DSM 6056)
본 발명은 이후 본 발명에 따르는 sak 유전자 작제, 발현 플라스미드 및 숙주세포와 관련한 바람직한 양태의 상세한 기술 및 양태를 이용하여 설명된다.
실시예에서 사용되는 올리고뉴클레오타이드 링커는 표 1에 기재하였다.
[pTZ19Rsak0의 생산]
플라스미드 DNA를 자체 공지된 방법으로 균주 이. 콜리 TG1(pMET5)로부터 단리한다. 적절한 양의 pMET5(5 내지 10㎍)를 Sall(Boehringer, Mannheim) 20단위를 갖는 상응하는 반응 완충액 20중에 37에서 2시간동안 배양시킨다. 페놀 추출에 의해 반응을 중단시키고 에탄올(EtOH)을 사용한 3중 에테르 추출후 DNA가 침전된다. 침전물을 이중-증류수(H2O) 중에 흡수시킨다. 선형 플라스미드 DNA의 분취량(200ng)을 매회 50배 몰과량의 링커 L1 및 포스포릴화된 링커 2와 자체 공지된 방법으로 혼합하고 혼합물을 10-배 TM 완충액(700 mM 트리스-HCL (pH 7.5), 60mM MgCl2)을 사용하여 결합 조건하에 놓는다. 반응 혼합물을 80로 가열하고 이어서 실온(RT)으로 서서히 냉각시킴으로써 이중사 링커 DNA가 형성된다.
1/10 용적 등가물 100mM 디티오트레이톨(DTT)(Serva, Heidelberg) 및 10mM 아데노신트리포스페이트(ATP)(Boehringer) 및 0.2단위 T4-DNA 리가제(Boehringer)를 각 경우 반응 혼합물에 가하고 15에서 12시간동안 배양시킨다. 2.5배 용적으로 EtOH를 가함으로써 반응 혼합물로부터 DNA가 침전된다. 침전물을 50B-완충액(Boehringer) 중에 흡수시키고 HindⅢ 20단위와 함게 2시간동안 37에서 배양시킨다. 아가로스 겔 전기영동 및 후속의 전기용출을 통하여, 1.2kb 크기의 단편을 자체 공지된 방법으로 단리시키고 HindⅢ 제한효소를 사용하여 표준 지침을 따라서 미리 분해시킨 벡터 pTZ19R (USB, Bad Homburg)과 결합시킨다. 70로 10분 가열하여 반응을 종결시킨다. 반응 혼합물의 반을 균주 이. 콜리 TG1의 경쟁세포를 형질전환시키는데 사용한다.
형질전환체에 대한 선별은 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-갈락토시드 (X-Gal, Boehringer) 및 이소프로필오-갈락토피라노시드를 아가에 가하고 백색 세포콜로니를 선별함으로써 수행한다. 플라스미드-DNA를 10개의 백색 형질전환체 콜로니로부터 표준 프로토콜에 따르는 미니 제조법(Plasmid Miniprep)으로 단리시키고, 제한분석 후, 시쿼나제(Sequenase)TM(USD)를 사용하는 생거 공정(Sanger Process)에 따라서 서열화시킨다. 분석한 클론중에서 회복된 sak42D 유전자의 기대 서열을 나타내는 것이 8개인 것으로 밝혀졌다. 이들 플라스미드 중 하나를 선별하여 pTZ19Rsak0로 명명한다.
[실시예 2]
[플라스미드 pTZ19Rsak1의 작제]
플라스미드 pTZ19Rsak0 상에 함유된, SAK42D에 대해 암호화하지 않은 3'-플랭킹 영역을 단리시키기 위하여, 상기 플라스미드 pTZ19Rsak0의 DNA를 표준 지침에 따라서 분리시키고 EcoRI 및 HindⅢ (Boehringer)을 사용한 제한 분해 및 아가로스 겔 전기영동법으로 1.2kb 크기의 단편을 수득한다. 상기 단편 중 일부 2㎍을 자체 공지된 방법으로 연속적으로 제한효소 AvaⅡ 및 HindfⅠ (모두 Boehringer)으로 처리하고 그 결과 표적 단편의 전기영동적 단리가 용이해진다. 반응시 매우 작은 분해 단편외에 형성하는 388bp 크기의 HindⅢ/Hinf-sak42D 유전자 단편이 유용한 방법으로 1.8아가로스 겔 중에서의 전기영동법에 의해 분리된다. DNA 수용액의 분취량(200ng)을 매회 50배 몰과량의 포스포릴화된 링커 L3* 및 링커 L4와 자체 공지된 방법으로 반응시키고 1/10 용적 등가물의 10배 농축된 TM 완충액과 반응시킨다. 반응 혼합물을 65로 가열하고 이어서 실온(RT)으로 서서히 냉각시킴으로써 이중사 링커 DNA가 형성된다.
1/10 용적 등가물 100mM DTT 및 100mM ATP와 0.2단위 T4-DNA 리가제를 매회 상기 반응 혼합물에 가하고 15에서 16시간동안 배양시킨다. 2.5배 용적의 EtOH를 가함으로써 반응 혼합물로부터 DNA가 침전된다. 상기 수득한 침전물을 15결합 완충액(Boehringer)중에 흡수시키고 자체 공지된 방법으로 제한효소 EcoRI 및 PstI(Boehringer)으로 미리 처리한 수중에 용해된 플라스미드 pTZ19R 약 50ng과 함께 배양한다. 0.2단위의 T4R DNA 리가제를 상기 반응 혼합물에 가하고 15에서 16시간 동안 배양시킨다. 상기 혼합물 중 반을 표준 지침에 따라서 균주 이. 콜리 TG1의 감응성 세포를 형질전환시키는데 사용한다. 형질전환체에 대한 선별은 - 이미 기술된 바와 같이 - 아가에 X-Gal 및 IPTG를 가하고 백색 세포 콜로니의 선별을 통해 수행한다.
플라스미드 미니제제(minipreps)는 공지된 방법으로 10개의 백색 형질전환체 클론으로부터 제조하여 이들 플라스미드 중 4개의 플라스미드 서열화시킨다. 상기 분석된 클론 중 3개의 성숙 SAK42D에 대해, EcoRI 및 PstI 부위에 의해 플랭킹된, 기대되는 암호화 서열을 나타낸다. 이들 플라스미드 중 하나를 선택하여 pTZ19Rsak으로 명명한다.
[실시예 3]
[pMEX503sak 및 pMEX602sak의 제조]
EcoRI 및 PstI에 의해 플랭킹된 433bp 크기의 단편을, 1.6아가로스에서 반응 혼합물을 전기영동시킨 후 공지된 방법으로 기본 플라스미드 pTZ19Rsak1으로부터 단리시킨다. 이와 병행하여, 벡터 pMEX5 및 pMEX6(medac)을 표준 지침에 따라서 제한효소 EcoRI 및 PstI 및 단리된 벡터 단편으로 처리한다. 상기 미리 처리한 벡터 플라스미드 50ng을 결합 완충액(Boehringer) 중에서 매회 약 433bp 단편 50ng과 합하고 T4-DNA 리가제 0.2단위를 가한 후 15에서 16시간동안 배양시킨다. 이. 콜리 TG1 세포중에서 형질전환후 수득한 암피실린 내성 콜로니를 IPTG 200㎛가 또한 추가로 제공되는 플라스미드겐-함유 카제인 아가 [참조 : D. Behnke and D. Gerlach (1987), loc. cit.]으로 옮겨 스태필로키나제 활성의 발현에 대해 시험한다.
카제인 시험판상에 용해 영역을 생산하는 클론 4개마다 플라스미드 DNA를 공지된 방법으로 수득하고 표준 프로토콜에 따라서 플라스미드 서열화에 의해 뉴클레오타이드 서열을 확립한다. 예외없이, 상기-분석된 플라스미드는 성숙 sad42D 유전자 삽입물 및 5'-플랭킹 해독-결정 영역의 정확한 서열을 나타낸다.
pMEX5 시리즈로부터의 이들 플라스미드 중 하나를 pMEX503sak로 명명하고, pMEX6으로부터 유래된 다른 플라스미드를 pMEX602sak로 나타낸다. 발현 플라스미드 pMEX602sak로 형질전환시킨 균주 이. 콜리 TG1(pMEX602sak)을 SAK42D의 발효 및 농축을 위한 다음 공정 단계에 생산 균주로서 사용하기 위해 선택한다.
[실시예 4]
[플라스미드 pMEX6△N10sak 및 pMEX6△N14sak의 작제]
단축된 sak42D 유전자에 대한 발현 플라스미드를 제조하기 위하여, 플라스미드 pMEX9602sak 10㎍을 H-완충액(Boehringer, Mannheim) 50중에서 매 80단위의 StuI (Boehringer)와 함께 2시간동안 37에서 배양시킨다. 1겔에서 아가로스 겔 전기영동법(AGE) 후 공지된 방법으로 선형 백터 DNA를 단리한다. 2개의 별개의 반응 혼합물에, 매회 선형 플라스미드 DNA 2㎍를 매회 50배 몰량과의 링커쌍 L5*/L6 및 L7*/L8(여기서 표시된 링커는 각 경우 표준 지침에 따라서 미리 포스포릴화시킨 것이다)과 반응시킨다. TM 완충액 중에서 상응하는 링커 파트너를 80로 가열하고 후속해서 실온으로 서서히 냉각(어니얼링)시킴으로써 이중사 (ds) 링커 DNA가 형성된다.
1/10 용적 등가물 100mM DTT 및 10mM ATP와 0.2단위 T4 DNA 리가제를 매회 반응혼합물에 가하고 15에서 12시간동안 배양시킨다. 2.5배 용적의 EtOH를 가하여 반응 혼합물로부터 적절한 L5/L6 또는 L7/L8-플랭킹된 플라스미드 DNA를 침전시킨다. 침전물을 B-완충액(Boehringer) 20에 흡수시키고 매회 Hind Ⅲ(Boehringer) 20단위와 함께 37에서 2시간동안 배양시켜, 그 결과 천연 성숙 SAK42D에 대해 암호화하는 전체 유전자를 각 경우 벡터 플라스미드의 나머지 부분으로부터 배수시킨다. sak 유전자-유리, 링커-개질된 pMEX6 단편을 전기영동에 의해 1아가로스 겔(AG) 중에서 단리시킨다.
이와 병행하여, 450bp크기의 sak42D 유전자 단편을 먼저 각각 50 단위의 제한효소 EcoRI 및 Hind Ⅲ(Boehringer) + 후속의 AGE로 이중 분해시켜 자체 공지된 방법으로 플라스미드 pTZ19sak1 50㎍으로부터 단리시킨다. 다시 병행하여, 상기 sak42 단편 중 매회 반응 혼합물 50(약 800ng)를 적합한 10배 농축 반응 완충액을 가하여 반응 조건에 도입시킨다. 하나의 혼합물에서, 단편을 BstUI(NEB) 10단위로 60에서 분해시키고, 제2혼합물에서는 Hae Ⅲ(Boehringer) 10단위로 37에서 2시간동안 분해시킨다. 1.8AG 중 후속의 AGE를 통하여, 370bp 크기의 Bst UI/Hind Ⅲ 단편이 분리되어 어떤 경우 단리되고, 또 다른 경우에는 358bp 크기의 Hae Ⅲ/Hind Ⅲ 단편이 단리된다.
물에 용해되어 있고 sak42D 유전자를 함유하는 단편 중 일부 10(80ng)를 매회 미리 제조한, 수중에 용해된 링커-개질된 벡터 DNA 각 10(50ng)와 합하고 10배의 결합 완충액을 사용하여 결합 조건하에 놓아 T4 DNA 리가제 3 단위와 함께 15시간동안 15에서 배양시킨다.
각 경우 이들 결합 혼합물을 용적 중 반을 균주 이. 콜리 TG1의 경쟁 세포의 형질전환을 위해 표준 지침에 따라서 사용한다. 암피실린 영양소 아가판 (Amp-NA) 상에 성장된 각 20개의 형질전환체중 일부를 플라스미노겐-함유 카제인 영양소 아가상으로 옮긴 후 스태필로키나제 활성 발현에 대해 시험하고, 37에서 2내지 5시간 배양 후 세포의 휴지 홀(recess hole) 주변에 용해 영역이 형성되면 활성인 것으로 인식한다. 플라스미드 DNA가 공지 방법으로 상기 시험에서 양성을 나타내는 각각의 클론 10개로부터 단리된다.
기대되는 StuI/HindⅢ 삽입물을 함유하는 플라스미드를 HindⅢ 및 StuI(Boehringer)를 사용하는 제한 분석으로 미리 결정한다. 상응하는 시리즈의 각 플라스미드 미니제제 4개의 후속의 플라스미드 서열화를 통하여, 적합한 플라스미드 삽입물의 뉴클레오타이드 서열이 확정된다. 예외없이, 상기 조사된 두 시리즈의 4개의 클론은 EcoRI 및 HindⅢ 부위에 의해 플랭킹된 기대되는 sak42D 서열 삽입물을 함유한다. 10개의 아미노산에 의해 N-말단 단축된 sak42D 유전자를 함유하는 발현 플라스미드는 pMEX6△N10sak로 표시되며, 반면 14개의 아미노산으로 단축된 sak42D 유전자를 함유하는 발현 플라스미드는 pMEXn14sak로 표시한다. 각 경우 이들 플라스미드로 형질전환시킨 각각의 균주 이. 콜리 TG1 (pMEX6△10sak) 및 이. 콜리 TG1 (pMEX6△14sak)을 각각 SAKN10 및 SAKN14에 대한 생산 균주로서 본 발명에 따라서 사용한다.
[실시예 5]
[pUC19sakA1의 제조]
먼저 벡터 pUC19를 자체 공지된 방법으로 에티듐 브로마이드-CsCl-밀도 구배 원심분리를 통하여 균주 이. 콜리 JM 109 (pUC19)로부터 단리하여, 후속되는 모든 유전 공학적 공정단계에 공급한다.
pUC19중 일부 2㎍을 EcoRI 10단위와 함께 H-완충액 30중에서 벡터가 완전히 선형화될 때까지 (약 1시간) H-완충액 30중에서 배양시킨다. 1M 트리스-HCl(pH 8.5) 90및 10에 H2O를 가한후, 수-포화시키고 0.58-옥시퀴놀린으로 안정화시킨 페놀(이후 단순히 페놀로 명명한다) 100로 추출을 수행하고 혼합물을 2분 동안 15000 rpm에서 원심분리시킨다. 분리된 수상의 암모늄 아세테이트 (NH4아세테이트) 농도를 2.5M로 고정시킨 후, EcoRI-분해된 벡터를 EtOH로 침전시키고, 침전물을 70EtOH로 2회 세척한 다음 H2O 20에 용해시킨다.
이와 병행하여, 선형 벡터 pUC19의 유리 EcoRI 말단의 50-내지 80배 몰과량에 상응하는 양의 링커 L9(선형벡터 ㎍당 뉴클레오타이드 길이 30 내지 40의 약 0.1A260단위 링커)를 15반응 용적 중의 37PNK에서 키나제 조건하에 2mM ATP의 존재하에서 포스포링화시킨다. 20분 후, 70로 15분간 가열시켜 반응을 완전히 종결되고, 혼합물을 빙용중에서 냉각시킨 후, 동일한 몰 양의 링커 L10을 가한다. 어니얼링시킴으로서 ds 링커쌍 L9*/L10이 형성된다. 상기 생산된 링커쌍 L9*/L10에 EcoRI-분해된 pUC19-DNA 18를 가하고 10배 농축된 T4-DNA 리가제 완충액 및 H20를 갖는 반응용적 100중에서 DNA 리가제 조건을 맞춘다. T4-DNA 리가제 5단위를 가한후, 15에서 밤새(o.n.) 배양시킨다. 링커-개질된 벡터를 NH4-Ac 존재하에서 EtOH로 침전시치고, 침전물을 70EtOH로 2회 세척한 다음, 건조시킨후 50H-완충액에 흡수시킨다. 15 단위의 BamHI(Boehringer)를 가한 후, 37에서 2시간 동안 배양시킨다. 반응 혼합물을 1아가로스 겔 중에서 나누고 벡터 단편을 5유리 우유를 사용하여 요오드화칼륨 겔 용액으로부터 분리시킨다.
L9/L10-BamHI-플랭킹된 pUC19벡터 중 일부 50ng을 T4-DNA 리가제 0.5단위와 함께 리가제 조건하에 최종 용적 20중에서 2시간 동안 15에서 배양시킨다음 표준지침에 따라서, 이. 콜리 TG1의 경쟁 세포중으로 형질전환시킨다. 형질전환후, 이들을 80암피실린/㎖ 아가, X-Gal 및 IPTG (X-Gal-Amp-NA)가 공급된 영양 아가판상에 피복시킨다. 플라스미드 DNA를 6개의 백색 클론으로부터 미니-제조법으로 단리시키고, 독특한 SfuI 부위(Boehringer)의 존재에 대해 상응하는 제한효소로 분해시켜 시험하여, 링커의 정확한 삽입물을 플라스미드 서열화로 동정한다. 양선 클론중 하나를 중간체 플라스미드 분리용으로 선택하고, pUC19sak0으로 명명한다.
실시예에 의해 이미 기술된 방법으로, 약 10㎍ pUC19sak0를 100H-완충액중에서 SfuI 30 단위로 선형화하여, 반응 혼합물로 페놀로 추출하고, 개방된 벡터 플라스미드를 EtOH로 침전시켜, 침전물을 70EtOH로 세척하고 H2O 30에 용해시킨다.
동시에 올리고뉴클레오타이드 L11 0.4A260단위를 PNK로 4㎍에 가하여 키나제를 작용시키고 PNK를 불활성시킨 후, ds 링커쌍에 대한 어니얼링 반응을 통하여 동일몰 양의 링커 L12로 보충시킨다. SfuI-분해시킨 벡터 플라스미드 12를 상기에 가하고, 결합 완충액을 100로 맞추어 T4-DNA 리가제 5단위와 함께 16에서 4시간 동안 배양시킨다. EtOH 침전 및 세척 후, M-완충액(Boehringer) 80에 용해시킨 플라스미드를 pUC19 레플리콘의 폴리클로날 서열(PCS) 중 37에서 SphI(Boehringer) 20단위로 분해시킨다. L11/L12-개질되고 SphI-말단-함유 플라스미드 단편을 1아가로스 겔 중에서 전기영동시켜 정제하고 이어서 단편을 단리한다.
상기 기술된 방법에 적용시켜, 제2 링커쌍, 즉 L13/L14*를 밤새 70반응 용적 중에서 정제된 단편 약 600ng에 T4-DNA 리가제 4단위를 사용하여 첨가하여, 다음 단계에서 키나제 완충액 15중 L14 약 0.05A260단위를 어니얼링 단계 전에 동일 몰량의 L13으로 5'말단에서 PNK를 사용하여 포스포릴화한다. 결합 혼합물을 65로 15분간 가열시켜 T4-DNA 리가제를 불활성화시킨다. 두면상의 링커 첨가후 (L12- 및 L13 스트랜드 말단에서) 존재하는 유리 5'-OH 말단을 키나제 처리하기 위하여, 온도-조절된 결합 혼합물을 3mM ATP로 정하고 PNK 2단위와 함께 37에서 25분동안 배양시킨다. 이제 5'-L12*/L13*-플랭킹된 플라스미드 단편을 상술한 바와 같이 AGE에 의해 과량의 링커로부터 제거하여 분리시킨다.
상기 수득한 벡터 DNA 일부 30ng을 밤새 시험관 내에서 최종 유전공학적 작제 단계로 L12- 및 L13-상보적인 헥사뉴클레오타이드 말단을 통해 T4-DNA 리가제 1단위로 폐환시킨다. 결합 혼합물을 이. 콜리 TG1의 경쟁 세포내로 형질전환시키고, 결합혼합물 중 1/3을 Amp-NA 상에 코팅시킨다. 플라스미드 미니제제를 12개의 클론으로부터 생산하여 이들은 독특한 NaeI 제한효소 분해 부위(Boehringer)의 존재에 대해 시험한다, NaeI-양성 클론 중 하나를 DNA 서열분석 후 기대되는 링커 삽입물을 갖는 기본 플라스미드에 대한 공여체로서 선택한다.
상기 플라스미드를 pUC19sakA1 (제1 기본 플라스미드)로 명명하고 다음 작제 단계를 위하여 제조적 규모로 공급한다.
[실시예 6]
[중간체 플라스미드 pUC19sakA2의 작제]
pUC19sak0의 제조에 대해 상술한 바와 동일한 방법을 사용하여, L14*/L15-플랭킹된 pUC19 벡터 단편을 링커쌍 L14*/L15 상에 선형화된 벡터 pUC19의 PstI-말단(PstI, Boehringer)을 가하여 먼저 생산하고 이어서 PCS중에서 SalI로 분해시킨다.
천연 성숙 SAK42D의 아미노산 5 내지 124의 영역에 대해 암호화하는 유전자 서열을 수득하기 위하여, 목적하는 유전자 서열을 함유하는 1.26Kb 크기의 Sal I/PstI 단편의 적합한 양을 플라스미드 pMET5로부터 분리시킨다. 상기 말기에, H-완충액 250중 pMET 5 DIR 50㎍을 SalI 200단위로 먼저 분해시키고, 완전 분해후, 동일한 활성을 갖는 PstI로 재분해시킨다. SalI/PstI 단편을 1.2아가로스 겔로부터 단리시킨다. SAK42D에 대해 암호화하지 않는 3'-플랭킹 DNA 영역을 분리시키기 위하여, 일부의 상기 단편 2㎍을 각 경우 15단위의 AvaI, AvaⅡ로 실시예 2에 기술된 부분적 프로세스에 따르는 M-완충액 조건하에 150중에서 동시에 배양시키고 HinfI(모든 효소는 Boehringer 제품)으로 분해시킨다. 매우 작은 분해 단편 외에 형성되는 36lbp 크기의 SalI/Hinf-sak42D 유전자 단편을 1.8아가로스겔 중에서 전기영동시킨 후 유리한 방법으로 단리시킨다.
수득한 SalI/HinfI 단편 중 일부 50ng을 선행면에서 기술된 개질된 pUC19 벡터 30ng 중에 삽입시켜 이. 콜리 TG1 중에서 클로닝시킨다. 선택된 클론 중에서 StyI 제한 분해 부위 (StyI Boehringer)의 존재에 대해 선별하고 DNA 서열 분석하여 대표적인 수의 플라스미드 미니제제 중 기대되는 삽입물 서열의 존재를 동정한다. 상기 특성화된 클론 중 하나를 선택하여 pUC19sakA1로 명명된 플라스미드에 대한 공급원으로 사용한다.
동일한 유전공학적 가공 단계를 적용하여, 링커쌍 L16*/L17을 EcoRI-개방된 플라스미드 pUC19sakA1의 말단상에 가한다. 페놀 추출 및 EtOH 침전후, 링커-치환된 플라스미드 단편 중 일부 3㎍을 HindⅢ 15 단위와 함께 B-완충액 80중에서 분해시키고 분해 혼합물을 1.6AG중에서 전기영동적으로 분할한다. 다음 부분 단계에서 벡터 단편으로 작용하는 L16/L17-HindⅢ-플랭킹된 DNA 단편 둘 다, 및 sak 유전자-함유 414bp 크기 아단편을 겔로부터 단리한다.
최종 언급된 아단편 중 일부 250ng을 NE2-완충액 50중에서 MnlI (NEB) 10단위로 재-분해시키고, 그 결과 290bp 크기 MnlI/HindⅢ 단편을 1.8AG로부터 겔 전기영동후 반응 혼합물로부터 단리시킬 수 있다. SAK42D의 아미노산 46면상으로부터의 영역에 대해 암호화하는 상기 수득된 DNA 단편 중 일부 25ng을 표준 방법에 따라서 상기 분리된 베터 단편 30ng 중에 이. 콜리 TG1 중에서 최종적으로 클로닝 시킨다.
대표적인 수의 플라스미드 미니제제를 Sall와 HindⅢ 및 SacⅡ (Boehringer) 및 HindⅢ으로 각 경우 적합한 조건하에서 이중 분해시켜 목적하는 DNA 분획의 존재에 대해 시험한다. DNA 서열 분석 후, 양성 클론 중 하나를 제2 기본 플라스미드의 분해를 위하여 선택하고, 이를 pUC19sakAS로 표시한다.
[실시예 7]
[SAKM26X 암호화 공여체 플라스미드 pUC19sakM26X의 제조]
자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성법을 사용하여, 매회 12개의 서열 변이체를 나타내는, 적응인자 혼합물 AG1, AG2, AG3 및 AG4를 3 또는 4개의 상이한 뉴클레오타이드 빌딩 블록을 성숙 ASK42D의 코돈 26의 첫번째 2개의 위치내로 동시에 혼입시켜 제조한다. 상술한 공정에 따라서, 제1단계로 적응인자 혼합물 AG2 및, 다른 혼합물로, 적응인자 혼합물 AG4를 키나제처리한다. 적합하게 상보적인 적응인자 혼합물 AG1 또는 AG3과 함께 어니얼링시켜 포스포릴화된 링커 혼합물을 합하여 이중사 DNA 단편을 제조한다. 별개의 반응 단계로 상기 수득이 적응인자 쌍 혼합물을 개방된 기본 플라스미드 pUC19sakA2의 SalI-말단에 상기 효소를 사용하여 커플링시키고, 이어서 HindⅢ 분해시킨후, 겔 전기영동 분리를 통하여 이로부터 적합한 반응 혼합물을 수득하고, 어떤 경우에는 AG1/AG2-결정된 단편 혼합물을 단리시키고 다른 경우에는 AG3/AG4-결정된 단편 혼합물을 단리시킨다. 이들 혼합물을 각 경우 HindⅢ- 및 평활, 따라서 NaeI-양립성 말단으로 제한한다.
각 경우, 각 단편 혼합물 150ng을 NaeI/HindⅢ-선형화된 제1 기본 플라스미드 pUC19sakA1 100ng과 합하고 이. 콜리 TG1에서 클로닝시킨다. 두 시리즈 중 다수의 클론을 436bp 크기의 DNA 삽입물의 존재에 대해 EcoRI 및 HindⅢ으로 플라스미드 미니제제를 제한효소 이중 분해시켜 미리 선택한다. 프라이머 S26을 사용하는 DNA 서열 분석의 확대 프로그램으로, 성숙 sakM26X의 위치 26에서 다음 코돈을 함유하는 플라스미드가 AG1/A2 시리즈로부터 최종적으로 발견된다 :
ATA(Ile), AGA(Arg), GTA(Val), ACA(Thr), AAA(Lys) 및 CTA(Leu) AG3/AG4 시리즈로부터 출발하여, sakM26X 유전자의 위치 26에서 다음 코돈을 나타내는 플라스미드가 동일한 방법으로 선택된다.
[실시예 8]
[pMEX6sakM26X 족 발현 플라스미드의 제조]
벡터 pMEX6 중 일부 20㎍을 선형화가 완결될 때까지 EcoRI 100단위로 분해시키고 동일한 조건하에서 PstI 100단위로 재분해시킨다. 상기 분해된 벡터를 1AG 중에서 전기영동법으로 PCS 단편으로부터 분리한다. 상이한 sak 유전자 변이체를 암효화하는 11개의 공여체 플라스미드로부터, 각 경우 5'-말단에서 추가로 해독 시그날 서열(RBS 및 ATG 개시 코돈)을 함유하는 433bp 크기 EcoRI/PstI 단편을 기술된 바와 같이 1.6AG로부터 겔 전기영동에 의해 단리시킨다.
이를 발현-개작된 sak 유전자 단편 중 일부를 매 하나마다 50ng을 매회 EcoRI/PstI-선형화된 PMEX 6벡터 약 20ng과의 별도의 혼합물로 결합되어 이. 콜리 TG1중에서 클로닝된다. 당해 발현 플라스미드를 함유하는 이. 콜리 균주의 각 배양액 10㎖로부터, 상응하는 플라스미드가 미니제조법으로 분리되어 EcoRI 및 PstI을 사용한 제한효소 분석 및 또한 두 스트랜드의 서열 분석으로 특성화한다. 각 경우 기대되는 sak 유전자를 함유하는 플라스미드를 플라스미드 형 pMEX 6sakM26X로 정한다.
[실시예 9]
[본 발명에 따르는 SAK43D 및 SAK 폴리펩타이드의 과발현의 정성적 분석]
플라스미드 pMEX602sak, pMEX6△N14sak 및 pMEX6sakM26X로 형질전환시킨 상응하는 이. 콜리 TG1 균주에서 본 발명에 따르는 SAK 폴리펩타이드의 유발성 과발현의 분석적 검출을 위하여, 각 경우 암피실린 50㎍/㎖이 추가로 공급된 2배 농축된 트립톤 효모 추출물 배지(2xTY-amp 배지) 5㎖를 적합한 재조합 이. 콜리 TG1 생산 균주의 단일 콜로니로부터 제조된 o.n. 컬쳐 100로 접종시킨다.
진탕시키면서 37에서 3시간 동안 배양시킨 후 멸균 ITPG 용액(40㎎/㎖ 이소프로판올)을 최종 농도 0.2mM 까지 가하여 발현을 유발시킨다. 4시간 동안 발효를 계속하고 1㎖ 컬쳐 배지의 세포를 원심분리로 수거한다. 세포 펠릿을 40mM 인산염 완충액(pH 7.0) 중에 현탁시키고, 5배 통축된 세포 분해 용액(20SDS 용액/머캅토에탄올/글리세롤/0.02브로모페놀 블루 용액; 6 : 1 : 1 : 0; V/V)과 반응시키고 비등하는 수욕 중에서 5분 동안 분해시킨다. 상기 생산된 용해물의 분취량(2 내지 6)을 과발현된 단백질을 함유하는 밴드의 출현(제13a도)을 위하여 쿠마시 브릴리언트 블루 G250 염색후 1㎜ 두께의 15SDS 폴리아크릴아미드 겔 중에서 표준 프로토콜에 따라서 분석한다. 분석된 모든 용해물은 돌출되는 단백질 밴드의 형상으로 당해 SAK 폴리펩타이드의 과발현을 나타낸다.
[실시예 10]
[이. 콜리 TG1 생산 균주의 발효 및 본 발명에 따른는 SAK 폴리펩타이드의 정제]
모든 균주는 기본적으로 발효시켜 다음 기술에 따라서 후 처리한다.
균주의 발효는 추가의 환기없이 강력한 진탕하에서 배지 200㎖가 충전된 500㎖ 환저 플라스크 중에 37에서 수행한다. 이에 대해, 5㎖ 2x쇼 amp 배지를 상응하는 균주의 단일 콜로니로 접종하여 약 16시간 동안 37에서 진탕시키며 예비배양시킨다. 각 경우 상기 예비 컬쳐 2㎖를 동일한 배지 200㎖를 접종하는데 사용한다. 광학 밀도가 0.4 내지 0.9 A600단위가 될 때까지 이들 컬쳐를 37에서 진탕시킨다.
상기 세포 밀도에 도달된 후, 발현 플라스미드 상에 암호화된 스태필로키나제 유전자의 발현을 멸균 IPTG 수용액 400(400㎎/㎖)를 가함으로써 유발시킨다. 이후, 상기 컬쳐를 37에서 2 내지 6시간 동안 진탕시킨 다음 4, 4000 rpm에서 원심분리시켜 하베스트한다. 세포 침전물을 1/20 내지 1/40 용적 등가물(컬쳐 용적에 대해) 분해 완충액(40mM 인산염 완충액 (pH 6.5), 30mM NaCl, 10mM EDTA, 10mM EGTA 및 10mM β-머캅토에탄올)에 현탁시켜 최종 농도 1mM로 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드와 반응시킨다. 상기 현탁액을 0로 냉각시키고 상기 온도에서 15분 동안 초음파(output 100 내지 120 와트)로 분해시킨다. 상기 분해물을 처리할 때까지 -20에서 보존한다. 정제 초기에, 매회 최대 30㎖의 분해물 현탁액을 빙욕(30) 중에서 해동시킨 다음 4, 25000 rpm에서 60분 동안 원심분리시킨다. 상등액을 H2O를 사용하여 4배 용적으로 희석시킨 다음 10mM 인산염 완충액(pH 6.5)으로 평형시키고 S-세파로스 신속 유동(Pharmacia, Freiburg)을 함유하는 크로마토그라피 컬럼상으로 펌핑시킨다. 겔 상의 직경은 2.6㎝이고 높이는 30㎝이다. 침착시 유속은 2㎖/분을 초과해서는 안된다. UV 검출의 기본선(280nm)에 도달될 때까지 평형 완충액(유속 3 내지 4㎖/분)으로 세척한다. 미결합 상태로 컬럼을 통과하는 물질은 미량의 표적 폴리펩타이드를 함유하므로 경사시켜 버린다. 250mM NaCl을 함유하는 10mM 인산염 완충액(pH 6.5)으로 컬럼을 용출시킨다(유속 3 내지 4㎖/분). 용출 프로필은 수개의 피이크를 나타내는데, 이중 하나는 농축된 형태로 상응하는 SAK 폴리펩타이드를 함유한다(SDS-PAGE로 검출). 상응하는 피이크 분획을 합한 다음, 고체 NaCl을 가하여 NaCl의 최종 농도를 2.0M로 고정시킨다. 이 방법으로, 수거된 분획을 페닐세파로스르 사용하는 크로마토그라피를 위해 직접 준비한다. 이 단계으 LRUDDN, 즉시 팩킹된 힐로드(Hiload) 페닐 세파로스 HPXK 26/10 컬럼(Pharmacia)을 사용하는데, 여기서 컬럼은 2.0M NaCl을 함유하는 10mM 인산염 완충액(pH 6.5)으로 평형시킨다.
시도성 침착(유속 5.0㎖/분)시킨 후, UV 검출의 기본선에 도달될 때까지(유속 12.6㎖/분) 평형 완충액으로 세척한다. 그다음 SAK 형태를 낙하 NaCl 구배(유속 12.6㎖/분)로 용출시킨다.
100완충액 A -----> 25완충액 A
0완충액 B -----> 75완충액 B
완충액 A : 10mM 인산염 완충액, pH 6.5;2.0 M NaCl
완충액 B : 10mM 인산염 완충액, pH 6.5
본 규모에 대한 전체적인 구배 용량은 300㎖이다. 본 공정은 단지 2개의 정제단계로 순수한 SAK 폴리펩타이드(순도 기준 SDS-PAGE 및 등전 포커싱)를 수득케한다. 정제 공정의 수행은 제14도에서 알 수 있으며, 여기서 조 세포 추출물로부터 표적 펩타이드 SAK26L의 전기영동적 균질성까지의 농도예는 SDS 겔로 나타낸다.
[실시예 11]
[본 발명에 따르는 SAK 폴리펩타이드의 특이활성의 측정]
SAK 형태의 특이 확성은 플라스민(과량사용)으로부터 상기 SAK 폴리펩타이드를 1μmol 사용하여 분 방 방출시킨 플라스민의 양(μmol)으로 정의된다.
적절한 SAK 폴리펩타이드-함유 모액의 단백질 함량은 표준 단백질로서 소 혈청알부민을 사용하여 바이오-라드(Bio-Rad) 단백질 검정법(Bio-Rad, Munich)으로 설정한다.
SAK 폴리펩타이드에 의한 플라스민 방출 측정은 2단계로 수행된다 :
-먼저, SAK 폴리펩타이드의 희석 시리즈 (1ng 내지 500ng)를 100mM 트리스 (pH 8.0)로 제조한다. H2O 1㎖ 중에 용해된, 플라스미노겐 용액 3020㎎ 플라스미노겐, 100 mM 트리스 완충액(pH 8.0) 150및 활성화제 용액 10(희석 시리즈 SAK 폴리펩타이드)로 이루어진 반응 혼합물을 제조한다. 상기 혼합물을 25에서 10분간 배양시킨다(활성화 샘플).
-플라스민 기질 크로모짐(Chromozym)-PL(Boehringer)을 H2O 중 2mM 용액으로 제조한다. 100mM 트리스(pH 8.0) 400및 활성화 혼합물로부터 500를 상기 용액 50에 가한다. 상기 혼합물을 25에서 2분 동안 배양시킨다. 이와 병행하여, 플라스민 보정 시리즈를 제조하는데, 여기서 100mM 트리스-완충액(pH 6.5) 400를 각는 각 플라스민 희석 시리즈 50와 크로모짐-PL 용액 50를 동일 조건하에서 배양하고 종결시킨다. 참고 샘플(제로(zere)값 샘플)에서, 활성화 샘플과 함께 농축 아세트산 25를 가하여 플라스민 기질의 전환을 방지한다. 참고용 샘플, 보정샘플 및 실제 측정치 샘플(각각 250)을 96개 공동(평저)을 갖는 미세역가판상에 피펫팅하고 405nm에서의 흡광도를 다중-채널 광도계로 측정한다.
개시 용액(희석 샘플) 중에 함유된 SAK 폴리펩타이드에 의해분당 방출된 플라스민의 양은 측정된 샘플의 흡광치로부터 계산할 수 있는데, 플라스민 보정 시리즈 및 참고용 샘플의 흡광치를 고려한다.
단백질 함량 및 플라스민 방출량을 고려하여, SAK 폴리펩타이드의 특이 활성을 이제 확립하여 비교할 수 있다. 이 방법으로 기술된 스태필로키나제 형태에 대한 특이 활성을 표 2에 요약한다.
[실시예 12]
[분석적 친화성 크로마토그라피에 의한 스태필로키나제 플라스미노겐 복합체의 해리 상수 측정]
방법의 원리는 적합한 담체상에 고정화된 사람 플라스미노겐을 크로마토그라피 컬럼에 도입시키고 특정양으로 컬럼상에 펌핑된 SAK 폴리펩타이드와 상호 반응시킨다. 다음 관계가 용출 용적 V와 샘플 중 적절한 SAK 농도[SAK] 사이에 존재한다 :
변수는 다음 의미를 갖는다.
VD- 컬럼의 사 용적(dead volume)
VE- SAK 폴리펩타이드의 용출 용적
Mpg- 컬럼 팩킹 중 상호반응 고정화된 플라스미노겐의 양
[SAK] - 적용된 샘플의 적절한 SAK 폴리펩타이드의 농도
KD- SAK형태및플라스미노겐을포함하는일시적인착화합물의해리상수
주어진 샘플 중 SAK 폴리펩타이드의 농도에 대한 컬럼 사용적으로부터 SAK 형태의 용출 용적 차이의 반비례 의존성은 일정 농도 범위에 걸쳐 선형이다. Mpg는 직선의 상승치로부터 측정할 수 있으며, 따라서 목적하는 해리상수는 [SAK] = 0으로 외삽하여 설정할 수 있다.
실험적으로, 상기 문제점은 다음 방법으로 해결하는데, 먼저, 문헌[참조 : Dund Mertz's instructions, D.G. DEUTSCH and E.T. MERTZ, Science, 170(1970), 1095-1096)] 에 따라서 사람 혈장으로부터 분리시킨 플라스미노겐을 워터스컴퍼니(Waters Company)의 지침을 이용하여 단백직-PakTM에폭시-활성화된(Waters)에 커플링시킨다. 설정되는 하전 정도는 컬럼 매트릭스 mg 당 단백질 5mg이다. 냉각 재킷이 고정되어있고 FPLC 크로마토그라피 시스템(Pharmacia)과 연결된 HR 5/5 크로마토그라피 컬럼(Pharmacia)을 상기-하전된 친화성 겔로 충전시킨다. 상술한 모든 시험은 16에서 0.5㎖/분의 유속으로 0.1M 트리스-HCL(pH 값 7.3)을 사용하여 수행한다.
컬럼을 컨디셔닝시킨 후, SAK 샘플을 컬럼상에 매회 25용적 영역에 침착시키는 데, 이들 용적 중에 함유된 단백질의 양은 0.5g 내지 8㎍이다. 시스템 중에 존재하는 FPLC 조절기는 용출 용적(VE)의 적절한 최대치를 설정하기위해 사용한다.
기술된 방법을 사용하여, 표 2에 나타낸 해리상수를 플라스미노겐과 선택된 SAK 폴리펩타이드의 상호반응에 대해 수득한다.
[실시예 13]
[모노클로날 항-SAK-항체 생산 하이브리도마 클론의 제조]
암컷 Balb/c/Han 마우스(연령 : 6 내지 8주)의 면역화는 상술한 방법을 이용하여 재조합 생산 이. 콜리 TG1(pMEX602sak)로부터 수득한, 고도로 순수한 성숙 SAK42D로 수행하는데, 하기 면역화 모드가 관측된다 :
▶ 제1 면역화 투여량인 50㎍의 순수한 SAK42D를 완전 프로인트 애주번트와 함께 각 동물에 피하주사한다.
▶ 상기로부터 4주후, 제2 투여량인 50㎍의 순수한 SAK42D를 다시 불완전 프로인트 애주번트와 함께 각 동물에 주사한다.
▶ 3주후, 최종 투여량으로 1회 이상 50㎍의 순수한 SAK42D를 보조제없이 각 동물에 정맥주사한다.
(파. 디프코(Fa. Difco)에 의해 시판되는 제제는 완전 및 불완전 프로인트 애주번트로서 사용된다).
SAK42D 정맥 투여 3일 후, 면역화된 동물을 희생시키고, 주로 임파구를 함유하는 세포 현탁액을 자체 공지된 방법으로 비장으로부터 제조한다(HAT 배지 중에; 성분은 Fa. Serva에 의해 공급된다). 그 다음 표준 방법으로 골수종 세포주 P3-X-63 Ag8-653과 융합시킨다. 상세하게, 107개의 골수종 세포를 5x107개의 비장 세포와 함께 50㎖ HAT 배지의 용적으로 함께 배양한다.
비-융합된 골수종 세포로부터 형성된 세포 하이브리드를 후속적으로 분리시키기 위하여, 상기 세포 현탁액을 세포 배양관(공동 96개; Fa. Nunc)의 공동 내로 200씩 나누어 분배시킨다(공동 당 세포 1 내지 2개). 이들 조건하에서, 공기 습윤화 및 5CO2를첨가하며 배양기 중에서 37에서 3주간 배양시킨다. HT 배지 (성분은 Serva로부터 마찬가지로 공급된다) 중에서 다음 단일-클론 배양을 수행한다 (지속 기간 2주; 기타 조건은 상기와 동일). 그 다음 단일 컬쳐 클론을 모두 15소태아 혈청(Flow)을 함유하는 RPMI 표준 배지(Serva) 중에서 추가로 배양한다. 상기 가공 단계에서, 고체-상 ELISA를 사용하여 SAK-특이 항체 생산에 대해 각각의 하이브리도마 세포 클론을 시험한다. SAK42D가 공동 표면에 결함되어 있는 미세시험판(5㎍/공동; PBS 완충액)을 상기 검정에 사용한다. 0.05트윈-20(Serva)을 함유하는 젤라틴-함유(0.5젤라틴) PBS 완충액으로 공동을 미리 처리한다. 그다음 시험할 하이브리도마 컬쳐 상등액을 공동에 붓는다. 컬쳐 상등액 중에 함유된 항-SAK 항체의 결합을 퍼옥시다제로 표지시킨 염소-항-마우스 면역글로불린항체(medac 제품)로 이루어진 항체 결합체로 확립시킨다.
이 방법으로, 11개의 하이브리도마 클론이 동정되는 데, 이들은 항-SAK 항체의 생합성을 수행할 수 있다. 세포 클론을 보존하여 본 단계에서 동결시킨다.
알파 SAK 1G8/H6 및 알파 SAK ⅡA4/A10으로 표시한 2개의 하이브리도마 세포주를 재클로닝 과정(지소기간 14일; 37; 공기 습윤화 및 5CO2를 첨가하는 배양기)을 통해 15FCS 첨가물(공급자, 상기참조)을 가한 RPMI 배지 중에 통과시킨다. 이후, 2개의 클론 각각으로부터 (RPMI 배지 중에서 연속 배양시켜) 대량의 켤쳐 상등액을 축적식으로 수득하는데, 각 경우에 고정화된 SAK42D를 이용하는 친화성 크로마토그라피에 의해 순수한 형태로 항-SAK 항체 1G8/H6 및 ⅡA4/A10을 수득할 수 있다. 말기에 재조합 SAK42D를 CNBr-세파로스-4B(Pharmacia)에 커플링시킨다(단백질 10㎎/세파로스 ㎖). 상응하는 하이브리도마 컬쳐 상등액을 추가로 NaCl(최종 농도 0.5M) 및 트윈-20(최종농도 0.05;Serva)과 반응시킨다. 추가로 0.5M NaCl을 함유하는 PBS 완충액으로 컬럼을 세척한다. 결합된 항-SAK 항체를 0.5M NaCl; 0.2M 글리신; pH 2.8로 용출시킨다. 단백질-함유 용출액 분획을 즉시 NaOH로 중화시킨다.
이후 정제된 항체는 제시된 목적에 대해 즉시 사용할 수 있다(참조 : 실시예 14 내지 18).
[실시예 14]
[웨스턴 블롯 시험을 위한 모노클로날 항-SAK 항체 ⅡA4/A10 의 용도]
SAK42D-함유 단백질 샘플(예 : 조 용해물)을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 중에서 전기영동적으로 분리시킨 다음 자체 공지된 방법으로 니트로셀룰로스상으로 옮긴다.
폰세우스(Ponceau)-S(Serva)를 사용한 일시적 단백질 염색을 통하여, 니트로셀룰로스 수용기 층 상의 단백질 밴드의 위치가 가시화되고, 경우에 따라 특정 분자량 마커에 속하게 되거나 표지화된다. 니트로셀룰로스 블럿을 유정분말 5를 함유하는 세척 완충액 (0.5M NaCl, PBS, 0.05트윈 20; Serva)으로 차단시킨다(실온에서 약 2시간).
다음 단계로, 세척 완충액(유청분말 1함유) 중에 1000배 희석된 항체 ⅡA4/A10 으로 처리한다. 그 다음 니트로셀룰로스 블럿을 염소-항-마우스 면역 글로불린 항체 POD 접합체(medac) (1유청분말을 함유하는 세척 완충액 중에 1000배 희석)로 처리한다. 과산화 수소의 존재하에 디아미노벤지딘으로 웨스턴 블럿을 전개시킨다. SAK42D 밴드와 기타 SAK 폴리펩타이드의 밴드만이 니트로셀룰로스 수용 층 상에 착색된다(제13b도). 상기 방법은 천연 SAK42D의 동정 및 스태필로키나제 폴리펩타이드를 포함하는 에피토프 특성화를 위하여 이용할 수 있다.
[실시예 15]
[스태필로키나제의 정량적 검출을 위한 ELISA 시험 시스템]
미세적정판을 친화성 크로마토그라피로 정제한 폴리클로날 돼지 항-SAK 항체로 먼저 코팅시킨다(2㎍/공동).
매회 500㎍ 순수한 SAK42D로 3회 돼지를 먼저 면역화시켜 상기 항체를 수득한다. 그 다음 수득된 과면혁 혈청을 고정화된 SAK42D에서 정제한다(실시예 13에 기술된 공정과 유사). 코팅 공정의 지속 과정은 4에서 15시간 또는 37에서 2시간이다. 그 다음 실시예 13에 기술된 바와 같이 젤라틴-함유 PBS 완충액으로 처리하여 플라스틱 판을 차단시킨다.
그다음 젤라틴-함유 PBS 완충액 중에 순수한 SAK42D를 포함하는 표준 희석 시리즈를 생산한다. 동시에, 처리할 샘플의 후처리 희석액을 제조한다. 표준 시리즈와 후처리 희석액을 공동에 붓고 37에서 60분 동안 배양시킨다. 세척 공정 후, 퍼옥시다제-결합된 항-SAK 항체 IG8/H6을 1000배 희석액(희석 매질은 젤라틴-함유 PBS 완충액이다)중의 시험판의 공동에 붓는다. 기질 H2O2및 오르토페닐렌 디아민을 사용하여 492nm 파장에서 색도계로 시험의 정량적 평가를 수행한다. 상기로부터 수득한 보정 곡선은 300pg/㎖ 내지 7.5ng/㎖ SAK 농도 범위에 걸쳐 선형으로 통과한다(제15도 참조)
상기 시험은 세균 분해물, SAK 정제시 후속 분석 사람 혈청 중 SAK의 정량적 검출을 가능케한다.
[실시예 16]
[SAK 폴리펩타이드의 면역 침전에 대한 모노클로날 항체 IG8/H6의 용도]
면역 침전 기술을 사용하여 세포 용해물 중 생체내 및 시험관내 합성된 방사활성 표지된 SAK 폴리펩타이드를 동정한다.
시험할 세포 용해물을 SDS 용액과 혼합하여 비등시킨 다음 (SDS 최종 농도 1), SDS 트리스-완충액(0.9NaCl, 1트리톤 X-100, 0.5나트륨 데속시콜레이트, 0.1M 트리스-HCl; pH 8.2)으로 희석시킨다. 항체 IG8/H6(황산 암모늄 침전물의 현탁액[50포화]) 1를 상기 혼합물에 가하고 4에서 밤새 배양시킨다. 항원-항체 복합체를 침전시키기 위하여, STD-트리스 완충액 100중에서 미리 팽윤시킨 단백질 A-세파로스-CL-4B(Pharmacia) 10㎎을 가하고 실온에서 60분 동안 진탕시킨다. 그 다음 상기 혼합물을 원심분리시키고, 상등액을 경사시켜 버리고 펠릿을 매회 STD-트리스 완충액 5700로 3회 세척한다. 세척 후, 펠릿을 SDS-PAGE 샘플 완충액 40에 흡수시켜 비등시키고 SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에 침착시킨다. 자동방사선 그래피로 평가한다. 면역 침전 혼합물의 결과를 제16도에 나타낸다.
[실시예 17]
[SAK 폴리펩타이드의 플라스미노겐-활성화능을 억제하는 mABs IG8/H6 및 ⅡA4/A10의 활성의 검출]
2개의 하이브리도마 클론의 희석시키지 않은 컬쳐 상등액(각 25)을 인산염 완충액(10mM pH 6.5) 중에 희석시킨 SAK42D 샘플(농도 : 단백질 20ng/25) 각 25와 혼합한다(시험 제제). SAK42D 대신 상기 인산염 완충액 또는 인산염 완충액 중에 희석시킨 스트렙토키나제(카비키나제, 카비비트륨)를 가한 제제를 대조균으로서 사용한다. 이들 제제를 실온에서 30분 동안 배양시킨다. 다음 각 10를 시험 및 대조 제제로부터 제거하여 보 발명에 따르는 SAK 폴리펩타이드, 바람직하게는 SAK42D에 의해 유발된 플라스민 방출을 측정체하는 다른 시험 제제에 도입시킨다(시험은 96개 공동을 갖는 미세 시험판에서 수행한다). 상기 말기에, 상기 언급한 분취량 10를 플라스미노RPS 용액(20㎎/㎖ 플라스미노겐[Behring], H2O에 용해) 30및 트리스-완충액(100mM 트리스, pH 8.0) 150와 반응시키고 25에서 10분동안 배양시킨다. 그 다음 각각 50를 회수하여 트리스-완충액 400(100mM 트리스, pH 8.0) 및 플라스민 기질 CHROMOZYM-PL (Boehringer;H20 중 ZmM 용액) 50로 이루어진 다른 제제에 가하여 25에서 2분 동안 배양시킨다. 각각 농아세트산 25를 사용하여 반응을 중단시킨다. 파장 405nm에서 측정한 흡광도는 SAK42D에 의해 유발된 원래 플라스민 방출량에 비례한다. SAK 폴리펩타이드 활성을 나타내는 항체의 활성은 감소된 흡광치로, 따라서 감소된 플라스민 방출량으로 나타낸다.
모노클로날 항체 IG8/H6 및 ⅡA4/A10의 경우, 상기 효과를 명백하게 검출할 수 있다; 제시된 시험 배치에서 항체 IG8/H6 및 ⅡA4/A10은 각각 플라스민 방출을 18.8- 및 17.5배 억제한다.
[실시예 18]
[스태필로키나제의 면역 친화성 크로마토그라피]
[정제를 위한 mAB IG8/H6의 용도]
상기 공정은 2개의 부분 단계로 이루어져 있다. 제1단계(1)에서, mAB IG8/H6을 크로마토그라피가능 담체에 고정화시킨다. 제2단계(2)는 천연 SAK42D 또는 SAK 폴리펩타이드를 예를 들면 세균성 조추출물로부터 크로마토그라피적으로 직접 수득할 수 있다.
(1) 친화성 크로마토그라피로 정제한 mAB IG8/H6(총량 20㎎)을 먼저 커플링 완충액(0.5M NaCl, 0.1M, NaHCO3; pH 8.3)에 대해 투석시킨다. CNBr-세파로스 CL-4B(Pharmacia)를 커플링시킨다. 상응하는 양의 상기 세파로스(0.7g)을 1mM HCl에 미리 팽윤시킨다. 커플링 완충액 중에서 mAB 자체를 커플링시킨다(실온에서 2시간 동안 가끔 교반시키고 밤새 교반시킨다). 상등액을 회수하여 세파로스를 커플링 완충액으로 수회 세척한다.
mAB IG8/H6으로 충전한 세파로스를 IM 에탄올아민(pH 8.0)으로 처리한다(실온에서 2시간). 0.1M 붕산염 완충액(이는 0.5M NaCl(pH 8.0)을 함유한다), 및 0.1M 아세테이트 완충액(이는 0.5M NaCl (pH 4.0)을 함유한다)으로 세척하는 단계를 상기 단계와 연결시킨다. 각각 붕산염 완충액 및 아세테이트 완충액을 변화시키며 5회 세척한다. 말기에, 0.5M NaCl을 함유하는 0.2M 글리신/HCl 완충액(pH 2.8)으로 세척하고 세파로스를 PBS 완충액으로 옮긴다.
(2) mAB IG8/H6을 충전한 세파로스를 크로마토그라피 컬럼(직경 1㎝)으로 옮기고 0.05트윈-20 및 추가로 0.5M NaCl을 함유하는 PBS 완충액으로 세척한다(적어도 20 컬럼 용적). 프로테아제 억제 물질을 가한 4배 농축된 PBS 완충액중에 제조된 SAK-함유 세균성 분해물을 증류수로 희석시켜 NaCl 및 트윈-20을 가하여 컬럼 수세 완충액에 상응하는 완충액 조성물에 도입시킨다. 상기 물질로 친화성 컬럼을 충전시킨다. 단백질이 더이상 컬럼으로부터 용출되지 않을 때까지(UV 검출기; 파장 280nm) 0.5M NaCl(트윈 20을 가하지 않는다)을 함유하는 PBS 완충액으로 세척한다(적어도 20 컬럼 용적). 0.5M NaCl을 함유하는 0.2M 글리신/HCl 완충액 (pH 2.8)으로 컬럼을 용출시킨다. 단백질-함유 용출물 분획을 컬럼 매트릭스와 마찬가지로 즉시 중화시킨다.
SAK42D 또는 SAK 폴리펩타이드가 전기영동적으로 순수한 형태로 컬럼 용출물중에 존재한다.

Claims (17)

  1. 서열이 시그날 펩타이드에 대해 암호화하는 영역을 갖지 않으며 발현 조절 서열에 기능적으로 연결되어 있고, 서열 동정 번호 7에 따르는 인위적인 대립형질 변이체의 뉴클레오타이드 시리즈를 나타냄을 특징으로하는 DNA 서열.
  2. 발현 조절 서열과 기능적으로 연결되어 있으며, 스태필로키나제 시그날 펩타이드에 대해 암호화하는 서열이 없는, 제1항에 따르는 DNA 서열을 함유함을 특징으로 하는 발현 플라스미드.
  3. 제2항에 있어서, 제8도(서열 동정 번호 8)에 따르는 해독-개시 영역과 5'-말단에서 기능적으로 연결된, 제1항에 따르는 DNA 서열을 함유함을 특징으로 하는 발현 플라스미드.
  4. 제2항 또는 제3항에 따르는 발현 플라스미드를 함유하며 플라스미노겐 활성화제 효과를 갖는 스태필로키나제 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있음을 특징으로 하는 숙주 세포.
  5. 제4항에 있어서, 이들이 원핵 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서, 이들이 이. 콜리 종에 속함을 특징으로 하는 숙주 세포.
  7. 제5항에 있어서, 이들이 바실러스 종 속에 속함을 특징으로 하는 숙주 세포.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따르는 숙주 세포를 적합한 배지 중에서 배양시켜 가용성 스태필로키나제를 숙주 세포의 세포질로부터 분리시킴을 특징으로하는, 표적 폴리펩타이드로서 플라스미노겐 활성화제 효과를 갖는 스태필로키나제 폴리펩타이드의 재조합 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 숙주 세포가 이. 콜리 종에 속함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 표적 폴리펩타이드의 단리를 위하여 a) 숙주 세포를 분해하여 분해물의 가용성 분획을 불용성 분획과 분리시키고, b) 가용성 분획을 이온 교환기 상에 직접 통과시켜, c) 표적 폴리펩타이드를 이온 교환기로부터 NaCl 수용액으로 선택적으로 용출시키고, d) NaCl로 농축시킨 후 용출물을 직접 소수성 상호작용 크로마토그라피시켜, e) 표적 폴리펩타이드를 소수성 상호작용 클로부터 낙하 NaCl 구배로 선택적으로 용출시킨 다음 용출물로부터 수득함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단계 중 NaCl 농도가 c) 30 내지 50mM, d) 2.0 내지 30mM 및 e) 초기 농도 20 내지 30 mM에서 최종 농도 15 내지 100mM 임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항의 DNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 스태필로키나제 폴리펩타이드.
  13. 제8항에 있어서, 단리된 스태필로키나제 폴리펩타이드를 약제학적 조성물로 제형화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제형화 단계를 표적 폴리펩타이드를 약제학적 적합한 희석제, 애주번트 또는 담체 물질과 합함으로써 수행하는 것인 방법.
  15. 제8항 내지 제11항에 따르는 방법을 이용하여 제조된 스태필로키나제 폴리펩타이드 또는 제12항에 따르는 스태필로키나제 폴리펩타이드에 대응하는 면역 반응성을 나타내며 이들 폴리펩타이드의 플라스미노겐 활성화 효과를 억제시킬 수 있음을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
  16. 제15항에 있어서, 하이브리도마 세포주 α-SAK IG8/H10 (ZIM 0511) 또는 α-SAK ⅡA4/A10 (ZIM 0512)로부터 유래됨을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
  17. 하이브리도마 세포주 ZIM 0511 및 ZIM 0512.
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