DE4143279A1 - Neue plasminogenaktivatoren, die sie kodierenden dna-sequenzen, zugehoerige expressionsplasmide und rekombinante escherichia coli-staemme, verfahren zur produktion dieser proteine und ihre verwendung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst DNA-Sequenzen, die für neuartige Plasminogenaktivatoren kodieren, welche verkürzten Formen des Proteins Staphylokinase 42D (Kurzbezeichnung SAK42D) entsprechen. Die Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Plasmide, die diese erwähnten DNA-Sequenzen mit hochwirksamen Expressionssignalen koppeln, sowie Plasmide, auf denen die kodie­ rende DNA-Sequenz für native reife Staphylokinase (mit anderen Worten: für eine reife Wildtyp-SAK) gleichfalls mit hochwirksamen Expressionssignalen gekoppelt ist (generelle Kurzbezeichnung für derartige Plasmidvektoren: sak-rekombinante Expressionsplasmide). Die Erfindung betrifft damit folgerichtig auch ausgewählte E. coli-Stämme, die nach Transformation mit jeweils einem dieser Expressionsplasmide bei ihrer Kultivierung nunmehr entweder zur Biosynthese der erwähnten neuartigen Plasminogenaktivatoren oder zur Biosynthese einer reifen Wildtyp-SAK befähigt sind. Die Erfin­ dung betrifft außerdem ein Teilverfahren zur Isolierung dieser Proteine im Anschluß an die submerse Fermentation der erhaltenen rekombinanten E. coli-Stämme. Die Erfindung betrifft schließlich die Verwendung der auf mikrobiellem Wege hergestellten neuartigen Plasminogenaktivatoren in der thrombolytischen Therapie.

Staphylokinase, ein Protein aus Staphylococcus aureus-Stämmen, ist in der Lage, die Umwandlung des im humanen Blutplasma lokalisierten Proenzyms Plasminogen in das fibrinolytisch aktive Enzym Plasmin zu vermitteln, ohne selbst proteolytische Aktivität aufzuweisen. Der Mechanismus der Aktivierung ist dabei noch weit­ gehend unklar. Das Anwendungsgebiet für die Sachobjekte der Gesamterfindung liegt somit in der Humanmedizin; das Anwendungsge­ biet für ihre Verfahrensteile liegt hingegen in jenem Sektor der pharmazeutischen Forschung und Industrie, in dem eine Produktge­ winnung auf mikrobiellem Wege betrieben wird.

Ein für eine Staphylokinase kodierendes Gen wurde erstmals von Sako und Mitarbeitern (T. SAKO et al. (1983), Mol. Gen. Genet., 190, 271-277; T. SAKO und N. TSUCHIDA (1983), Nucl. Acids Res., 11, 7679-7693; vergleiche auch Patentschrift EP 77 664) aus dem Staphylococcus aureus-Phagen PhiC isoliert, mittels Sequenzanalyse identifiziert und auf dem Plasmid pBR322 in E. coli kloniert. Das für das Protein kodierende Gen wurde in ein E. coli-Expressions­ system umkloniert und im E. coli-Stamm WA802 überexprimiert (EP 77 664; T. SAKO (1985), Eur. J. Biochem., 149, 557-563).

Ein weiteres Gen für eine Staphylokinase wurde aus dem Staphylococcus aureus-Phagen Phi42D isoliert, identifiziert und auf Plasmiden kloniert, welche nachfolgend zur Transformation von Stämmen der Spezies Escherichia coli, Streptococcus sanguis und Bacillus subtilis eingesetzt wurden (vergleiche Patentschrift DD 2 45 444; D. BEHNKE und D. GERLACH (1987), Mol. Gen. Genet., 210, 528-534). Dieses Gen unterscheidet sich von jenem aus dem Phagen PhiC isolierten Gen durch 3 Basenaustausche in der kodierenden Nukleotidsequenz, von denen 2 zu Änderungen in der Proteinsequenz führen, wodurch auch eine Veränderung des isoelektrischen Verhal­ tens bewirkt wird. Die für SAK42D kodierende Nukleotidsequenz ist vollständig in Abb. 1 angegeben. Weitere Unterschiede in der DNA- Sequenz beider Staphylokinase-Gene werden in den stromauf- und stromabwärts der kodierenden Region gelegenen Bereichen gefunden.

Die in der technischen Lösung gemäß DD 2 45 444 konstruierten Expressionsplasmide wurden zur Familie der pDB-Plasmide zusammen­ gefaßt. Aus dieser Familie erwies sich Vektorplasmid pDB17 als am besten geeignet für die sak42D-Expression im E. coli-, Plasmid pDB15 hingegen als das leistungsfähigste Konstrukt für die Expres­ sion unter anderen im B. subtilis-System.

Das in erster Linie aus B. subtills-Kulturüberständen iso­ lierte Protein wurde hinsichtlich seiner plasminogenaktivierenden Eigenschaften charakterisiert (Patentschrift DD 2 45 444; D. GERLACH et al. (1988), Zbl. Bakt. Hyg., A269, 314-322). Es wurde darüber hinaus gezeigt, daß während der fermentativen Produktion der SAK42D in B. subtilis (D. GERLACH et al. (1988), a. a. O.) neben dem korrekt prozessierten reifen Protein auch Staphylokina­ sen gebildet werden, die am N-Terminus um 10 bzw. 11 Aminosäure­ reste verkürzt sind, aber dessenungeachtet plasminogenaktivierende Eigenschaften besitzen.

Auf ähnliche Weise war von Sako (T. SAKO (1985), a. a. O.) gezeigt worden, daß PhiC-SAK-Präparationen aus E. coli neben der korrekt prozessierten Hauptfraktion noch eine Minoritätsfraktion einer N-terminal um 10 Aminosäuren verkürzten PhiC-SAK enthalten.

Die Unzulänglichkeiten des bisher beschriebenen Verfahrens zur Produktion von SAK42D in E. coli, S. sanguis und B. subtilis bestehen in den geringen Expressionshöhen, die auch im Falle der Expression in B. subtilis noch völlig unbefriedigend sind. Außerdem erfolgt bei der Biosynthese der SAK42D in B. subtilis nach dem obigen Verfahren ein nichtdefiniertes Prozessing des Zielproteins, das die Isolierung eines homogenen Produktes erheb­ lich erschwert. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens besteht in der langwierigen Prozedur zur Isolierung von SAK-Protein.

Auch die von Sako (T. SAKO (1985), a. a. O.) beschriebene technische Lösung zur Überexpression von PhiC-SAK in E. coli ist dadurch limitiert, daß die verwendeten PhiC-sak-Expressionsplas­ mide stets noch die komplette Signalsequenz des nativen Proteins enthalten. Dies führt bei Überexpression in E. coli zu einer Über­ lastung des Sekretionsapparates dieses Organismus und damit zu negativen Auswirkungen auf die Expressionshöhen. Darüber hinaus ist die thermische Induktion der PhiC-SAK-Biosynthese in den verwendeten E. coli-Stämmen unter Fermentationsbedingungen schlecht handhabbar.

Die Erfindung verfolgt die Zielstellung, neue mikrobielle Plasminogenaktivatoren für die thrombolytische Therapie verfügbar zu machen sowie effektive Herstellungsverfahren sowohl für diese neuartigen Plasminogenaktivatoren als auch für eine Wildtyp- Staphylokinase bereitzustellen.

Gegenstand der Erfindung sind zunächst DNA-Sequenzen, die für neuartige Plasminogenaktivatoren kodieren, welche verkürzten Formen des Proteins Staphylokinase 42D entsprechen. Zur Konstruk­ tion dieser DNA-Sequenzen wird erfindungsgemäß auf das rekom­ binante Ausgangsplasmid pMET5 (Abb. 2) zurückgegriffen, welches sich von dem literaturbekannten, für native reife SAK42D kodieren­ den Expressionsplasmid pDB17 ableitet. Die für Phi41D-SAK kodie­ rende Teilsequenz, die vom Plasmid pMET5 her verfügbar ist, wird im gentechnologischen Verfahrensabschnitt der Gesamterfindung durch an sich bekannte Einzelschritte der DNA-Rekombination, die die Anlagerung von chemisch synthetisierten Linkermolekülen ausdrücklich einschließt, zu der Gesamt-DNA

komplettiert, und auf einem Trägerplasmid mit E. coli-Replika­ tionsorigin und Polylinkerbereich für die weiteren Abschnitte der erfinderischen Lösung bereitgestellt. Die voranstehende DNA- Sequenz, die gleichfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, kodiert für reife SAK42D (sie wird im weiteren auch als erfindungsgemäßes sak42D-Strukturgen bezeichnet). Sie unterschei­ det sich von der für die native reife SAK42D kodierenden Sequenz dadurch, daß in ihr der gesamte DNA-Abschnitt, der im ursprüngliche Gen für das zur Sekretion erforderliche Signalpeptid kodiert, entfernt und durch ein ATG-Startcodon ersetzt wurde sowie außerdem dadurch, daß an der Position 389 zweckgerichtet eine stille Punktmutation eingeführt wurde, um einen Spaltort für die Restriktase StyI zu gewinnen.

Aus der oben angegebenen Sequenz werden die eingangs erwähn­ ten, für neuartige Plasminogenaktivatoren kodierenden DNA-Sequen­ zen hergestellt

• - unter wesentlicher Nutzung des Umstandes, daß das erfin­ dungsgemäße sak42D-Strukturgen unikale Restriktionsspaltorte
  • - an Position 46 für die Restriktase BstUI,
  • - an Position 68 für die Restriktase HaeIII,
  • - an Position 389 für die Restriktase StyI
• enthält sowie
• - unter Adaption chemisch synthetisierter Linker der jeweils entsprechenden Struktur an die nach den Spaltungen entste­ henden Enden des sak42D-Strukturgenes.

Im einzelnen wurden auf diese Weise für neuartige Plasminogenaktivatoren kodierende Sequenzen dreier Gruppen gewon­ nen, nämlich

• a) DNA-Sequenzen, bei denen der stromaufwärts der BstUI- Spaltstelle gelegene Abschnitt des ursprünglichen sak42D- Strukturgenes jeweils durch eine in Form von Linkern adap­ tierte neue Teilsequenz ersetzt worden ist; in diese Gruppe gehören die erfindungsgemäßen DNA-Sequen­ zen mit den Segmenten
  • a1) 5′-Teilsequenz mit der Abfolge ATGAAAGGCGATGACG gefolgt von der Sequenz des sak42D-strukturgens ab Position 47; diese Gesamtsequenz kodiert für DN10- SAK42D und wird im weiteren als Strukturgen DN10- sak42D bezeichnet;
  • a2) 5′-Teilsequenz mit der Abfolge ATGGGCGATGACG gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgens ab Position 47; diese Gesamtsequenz kodiert für DN11-SAK42D und wird im weiteren als Strukturgen DN11-sak42D bezeichnet;
  • a3) 5′-Teilsequenz mit der Abfolge ATGGATGACG gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgens ab Position 47; diese Gesamtsequenz kodiert für DN12-SAK42D und wird im weiteren als Strukturgen DN12-sak42D bezeichnet;
  • a4) 5′-Teilsequenz mit der Abfolge ATGGACG gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgens ab Position 47; diese Gesamtsequenz kodiert für DN13-SAK42D und wird im weiteren als Strukturgen DN13-sak42D bezeichnet;
• b) DNA-Sequenzen, bei denen der stromaufwärts der HaeIII- Erkennungssequenz gelegene Abschnitt des ursprünglichen sak42D-Strukturgenes jeweils durch eine in Form von Linkern adaptierte neue Teilsequenzen ersetzt worden ist; zu dieser Gruppe gehören die erfindungsgemäßen DNA-Sequen­ zen mit den Segmenten
  • b1) 5′-Teilsequenz mit der Abfolge ATGGCGAGTTATTTTGAA CCAACAGG gefolgt von der Sequenz des sak42D-Struk­ turgens ab Position 69; diese Gesamtsequenz kodiert für DN14-SAK42D und wird im weiteren als Strukturgen DN14-sak42D bezeichnet;
  • b2) 5′-Teilsequenz mit der Abfolge ATGAGTTATTTTGAACCAA CAGG gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgens ab Position 69; diese Gesamtsequenz kodiert für DN15-SAK42D und wird im weiteren als Strukturgen DN15-sak42D bezeichnet;
  • b3) 5′-Teilsequenz mit der Abfolge ATGTATTTTGAACCAACAGG gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgens ab Position 69; diese Gesamtsequenz kodiert für DN16- SAK42D und wird im weiteren als Strukturgen DN16- sak42D bezeichnet;
  • b4) 5′-Teilsequenz mit der Abfolge ATGTTTGAACCAACAGG gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgens ab Position 69; diese Gesamtsequenz kodiert für DN17- SAK42D und wird im weiteren als Strukturgen DN17- sak42D bezeichnet;
• c) DNA-Sequenzen, bei denen der stromabwärts der StyI-Erken­ nungssequenz gelegene Abschnitt des ursprünglichen sak42D- Strukturgenes jeweils durch eine in Form von Linkern adap­ tierte neue Teilsequenz ersetzt worden ist; in diese Gruppe gehören die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen mit den Segmenten
  • c1) Sequenz des sak42D-Strukturgens bis zur Position 389, gefolgt von einer 3′-Teilsequenz mit der Abfolge CAAGGTTGTTATAGAAAAG; diese Gesamtsequenz kodiert für DC1-SAK42D und wird im weiteren als Strukturgen DC1-sak42D bezeichnet;
  • c2) Sequenz des sak42D-Strukturgens bis zur Position 389, gefolgt von einer 3′-Teilsequenz mit der Abfolge CAAGGTTGTTATAGAA; diese Gesamtsequenz kodiert für DC2-SAK42D und wird im weiteren als Strukturgen DC2-sak42D bezeichnet;
  • c3) Sequenz des sak42D-Strukturgens bis zur Position 389, gefolgt von einer 3′-Teilsequenz mit der Abfolge CAAGGTTGTTATA; diese Gesamtsequenz kodiert für DC3-SAK42D und wird im weiteren als Strukturgen DC3-sak42D bezeichnet.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin rekombinante Expressionsplasmide, die jede der voranstehend charakterisierten 12 DNA-Sequenzen, d. h. sowohl jene Sequenzen, die für die neu­ artigen Plasminogenaktivatoren DNm-SAK42D und DCn-SAK42D (m= 10, ..., 17; n=1, 2, 3) kodieren, als auch diejenige Sequenz, die das in der erfindungsgemäßen Weise modifizierte Strukturgen für reife SAK42D darstellt, in funktioneller Ankopplung an eine in bakte­ riellen Wirtsorganismen wirksame Kombination von Expressions­ kontrollsequenzen enthalten. Vorzugsweise werden zu den erfin­ dungsgemäßen Expressionsplasmiden solche gerechnet, welche

• - jeweils über ein E. coli-Replikationsorigin verfügen sowie
• - hinsichtlich der einbezogenen Expressionskontrollsequenzen zusätzlich durch das Merkmal gekennzeichnet sind, daß das jeweils einbezogene Gen sak42D, DNm-sak42D beziehungsweise DCn-sak42D (m= 10, . . ., 17; n=1, 2, 3) stets unter dem Ein­ fluß einer Expressionskontrollsequenz exprimiert wird, die stromaufwärts des Strukturgenes die Konfiguration (in Lese­ richtung gesehen) Bindungssequenz für den lac-Rpressor - tac-Promoter - zwei in Tandem-Anordnung formierte Ribosomenbindungs­ sequenzen aufweist (Kurzwort: RtacR-Konfiguration).

Die erfindungsgemäßen Expressionsplasmide tragen, wie in die­ sem Zusammenhang hervorzuheben ist, in jenem Abschnitt ihrer DNA- Sequenz, der jeweils Einfluß auf die Expression von heterologen Genen nehmen kann, hingegen keine Teilsequenzen, die für Signal­ peptide kodieren. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird also angestrebt, rekombinante sak-Plasmide für die intrazellu­ läre Expression bereitzustellen, wobei durch den spezifischen Aufbau der RtacR-Kontrollsequenz die Voraussetzung dafür gelegt wird, daß die Biosynthese der oben angegebenen erfindungsgemäßen sak-Gene während der Fermentation zum gewünschten Zeitpunkt indu­ ziert werden kann.

Gegenstand der Erfindung sind auf dieser Grundlage insbeson­ dere die Expressionsplasmide
pMEXDNmsak, m= 10, . . ., 17,
pMEXDCnsak, n= 1, 2, 3, sowie
pMEX503sak und pMEX602sak,
von denen jedes eine der vorangehend offenbarten DNA-Sequenzen enthält, die entweder für jeweils einen neuartigen Plasminogenak­ tivator vom Typ eines SAK42D-Derivates oder wie im Falle von pMEX503sak und pMEX602sak für die erfindungsgemäße reife SAK42D kodieren.

Im Rahmen der hier beschriebenen Erfindung sind alle oben angeführten Expressionsplasmide unter Rückgriff auf das Träger­ plasmid pTZ19Rsak1 konstruiert worden, welches ein Derivat des E. coli-Klonierungsvektors pTZ19R ist und im Polylinkerbereich dieses Vektors das sak42D-Strukturgen auf einem 433 bp großen EcoRI/PstI- Fragment enthält.

Die verfahrensgemäß gewonnenen Expressionsplasmide werden auf an sich bekannte Weise in transformierbare bakterielle Produzen­ tenstämme eingebracht. Für die vorzugsweise hergestellten Expres­ sionsplasmide mit dem oben gekennzeichneten Replikationsorigin werden hierfür transformierbare Rezipientenstämme der Spezies E. coli herangezogen; und mit besonderem Vorteil wird für diesen Ver­ fahrensschritt der Gesamterfindung der Produzentenstamm E. coli TG1 verwendet.

Gegenstand der Erfindung sind nach diesem Verfahrensschritt somit insbesondere auch die rekombinanten Produzentenstämme
E. coli TG1 (pMEXDNmsak), m= 11, . . ., 17,
E. coli TG1 (pMEXDCnsak), n= 1, 2, 3 sowie
E. coli TG1 (pMEX503sak) und E. coli TG1 (pMEX602sak).

Durch die Kultivierung der verfahrensgemäß erhaltenen rekom­ binanten E. coli TG1 (pMEXDNmsak)- sowie E. coli TG1 (DCnsak)-Stämme wird man in die Lage versetzt, die SAK42D-Derivate DNm-SAK42D (m= 10, . . ., 17) und DCn-SAK42D (n=1, 2, 3) überhaupt erstmals herzu­ stellen. Insbesondere wird man auf diese Weise darüber hinaus jedoch auch in die Lage versetzt, diese neuartigen Plasminogenak­ tivatoren in jenen Mengen verfügbar zu machen, wie sie für die systematische Untersuchung ihrer stofflichen Eigenschaften sowie ihrer Eignung in der thrombolytischen Therapie benötigt werden.

Mit den verfahrensgemäß erhaltenen rekombinanten E. coli-Stäm­ men E. coli TG1 (pMEX503sak) und E. coli TG1 (pMEx602sak) liegen außerdem erstmals mikrobielle Produzentenorganismen vor, die reife SAK42D durch intrazelluläre Überexpression in hohen Ausbeuten zu synthetisieren vermögen.

Als Konsequenz dieser Feststellungen umfaßt die Erfindung ebenso mikrobiologische Verfahren zur Herstellung derjenigen Ziel­ proteine, die die mit dieser technischen Lösung gewonnenen sak­ rekombinanten Bakterienstämme, vorzugsweise die erhaltenen sak­ rekombinanten E. coli TG1-Stämme, mittels intrazellulärer Expres­ sion bilden können. Hierzu werden diese Stämme unter sterilen und aerob-submersen Bedingungen in an sich bekannter Weise in den Stufen Vor- sowie Hauptkultur in jeweils einem Nährmedium mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie mit einem definierten Gehalt an Mineralsalzen fermentiert, und die Aufarbei­ tung der geernteten Biomasse wird dabei jeweils durch einen Zell­ aufschluß, vorzugsweise durch einen Aufschluß mittels Ultraschall, eingeleitet. Für die aus der Vorzugsvariante der Erfindung resul­ tierenden sak-rekombinanten E. coli TG1-Stämme sind diese Herstel­ lungsverfahren zusätzlich noch dadurch gekennzeichnet, daß

• - die Fermentation bei Temperaturen zwischen 28°C und 42°C für die Dauer von 4 Stunden bis 16 Stunden in einem Vollmedium beziehungsweise in einem sogenannten synthetischen Medium, jeweils mit Zusatz von 50 mg/l bis 100 mg/l Ampicillin, durchgeführt wird,
• - dabei 2 bis 4 Stunden nach Fermentationsbeginn, wenn die Biomasse in den Kultivierungsgefäßen eine Zelldichte von ca. 0,2 bis 1,0 A600-Einheiten erreicht hat, die Biosynthese des rekombinanten Plasminogenaktivators durch den einbezogenen Mikroorganismus mittels Zugabe von Isopropylthiogalacto­ pyranosid (Kurzbezeichnung IPTG) zum Fermentationsmedium bis zu einer Endkonzentration von 0,3 mmol/l eingeschaltet wird, und daß
• - das jeweilige heterologe Produkt durch eine insgesamt nur 2stufige Kombination aus Ionenaustausch-Chromatographie und Hydrophob-Interaktion-Chromatographie in hoher Reinheit ge­ wonnen wird.

Als Konsequenz aller vorhergehenden Ausführungen sind Gegen­ stand der Erfindung somit auch die unter den angegebenen Fermenta­ tionsbedingungen synthetisierten Zielproteine DNm-SAK42D sowie DCn-SAK42D (m= 10, . . ., 17; n= 1, 2, 3), die verkürzten Formen des Plasminogenaktivators Staphylokinase entsprechen und die dabei durch die in der Tabelle 1 zusammengestellten Aminosäuresequenzen gekennzeichnet sind.

Diese neuartigen Aktivator-Spezies sind nach den bisher vorliegenden biophysikalischen und biochemischen Befunden im Ver­ gleich zu reifer SAK42D mit den Vorteilen versehen, daß sie

• a) auf Grund der geringeren Anzahl von Aminosäureresten eine deutlich verkleinerte Molmasse besitzen, was eine Verminde­ rung ihrer Antigenität zur Folge hat,
• b) auf Grund der geringeren Molekülgröße ein höheres Diffu­ sionsvermögen ins Innere von Thromben besitzen, wodurch die thrombolytische Effektivität gesteigert wird,
• c) bei gleich großer spezifischer Aktivität gegenüber der o.a. Referenzsubstanz teilweise höhere Dissozationskonstanten der intermediär auftretenden Komplexe mit, Humanplasminogen zeigen, was positive Auswirkungen in Hinsicht auf die Redu­ zierung systemischer Effekte erwarten läßt, sowie
• d) bei gleich großer Dissoziationskonstante der Komplexe mit Humanplasminogen bezüglich der Referenzsubstanz höhere spezifische Aktivitäten aufweisen, was jeweils Reduzierun­ gen der für eine Therapie notwendigen Dosen ermöglichen kann.

Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten wird hierbei nach einer im vorliegenden Zusammenhang neuartigen Methodik vorgenom­ men, die folglich ebenfalls dem Gegenstand der vorliegenden Erfin­ dung zugeordnet wird.

Schließlich betrifft die Erfindung auch Arzneimittel, in die neben üblichen Hilfs- und Trägerstoffen als Wirkkomponente die verfahrensmäßig hergestellten, das N-terminale Methionin nicht mehr enthaltenden Zielproteine, und zwar entweder jeweils ein Derivat von DNm- oder von DCn-SAK42D (m= 10, . . ., 17; n=1, 2, 3) oder reife, von den Stämmen E. coli TG1 (pMEX503sak) beziehungs­ weise E. coli TG1 (pMEX602sak) kodierte SAK42D einbezogen sind.

Bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkul­ turen GmbH (DSM), Braunschweig, ist seit dem 02.07.1990 der fol­ gende Stamm hinterlegt:
E. coli TG1 (DSM 6056);
weiterhin wurde am 06.12.1991 bei der DSM hinterlegt:
Plasmid pMET5 (DSM 6841).

In einer vorteilhaften Ausführungsform wird der Verfahrens­ abschnitt der Gesamterfindung (unter Einbeziehung der Abb. 2 bis 8) zweckmäßigerweise wie folgt realisiert:

A. Konstruktion des die reife SAK42D kodierenden Basisplasmides

Das Ausgangsplasmid pMET5 (Abb. 2), leitet sich von dem Plasmid pDB17 ab und ist aus diesem durch eine Folge gentechni­ scher Arbeitsschritte konstruiert worden. Auf dem Plasmid pMET5 fehlen im Vergleich zu pDB17 die nativen 5′-flankierenden regulatorischen Bereiche, die kodierende Sequenz für das Signal­ peptid sowie die Codons für die ersten 3 Aminosäuren der reifen SAK42D, die durch einen TaqI-Restriktaseschnitt vom ursprünglichen Gen abgetrennt werden. Bei der Klonierung des das sak42D-Gen tragende Fragmentes in den AccI-Ort eines pUC19-Derivates wird unmittelbar am 5′-Ende dieses Genes ein unikaler SalI-Ort gebil­ det. Stromabwärts der für SAK42D kodierenden Sequenz sind auf pMET5 noch die 3′-flankierenden nichtkodierenden Bereiche des sak42D-Gens und Teile des Plasmides pBR322 enthalten.

Die Rekonstitution der kompletten kodierenden Sequenz für reife SAK42D einschließlich der Einführung portabler Translations­ signale (Ribosomenbindungssequenz (RBS) und ATG-Startcodon) und einer Übergangssequenz zum Expressionsanschluß des sak42D-Genes an ein geeignetes Transkriptionssignal (Promoter) erfolgt durch Anlagerung eines chemisch synthetisierten Linkerpaares stromauf­ wärts des SalI-Ortes. Zu diesem Zweck wird pMET5 zunächst am sin­ gulären SalI-Ort geöffnet und erfindungsgemäß das Linkerpaar A-1- 36/A-2-36 (vergleiche Tabelle 2), das beim Annealing kompatible Enden zu SalI- und HindIII-Schnittstellen ausbildet, mittels T4- DNA-Ligase an die Enden des linearisierten Plasmides pMET5 li­ giert. Durch nachfolgende HindIII-Verdauung wird ein beidseitig von HindIII-Enden flankiertes SAK42D-kodierendes Fragment erhalten, welches im HindIII-Ort des Vektors pTZ19R (Größe: 2863 bp; Phänotyp-Marker: Ampicillin) zwischenkloniert wird. Dabei ent­ steht unter anderem das Plasmid pTZ19Rsak0 mit in-frame-Orientie­ rung des sak42D-Genes zum lac-Gen des Vektorplasmides.

Zur Abtrennung der 3′-flankierenden, nicht für SAK42D kodie­ renden DNA-Abschnitte wird zunächst das 1.2 kbp große EcoRI/HindIII-Fragment aus pTZ19Rsak0 isoliert und daraus durch konsekutive Restriktaseverdauung mit AvaII und Hinfl auf günstige Weise das 388 bp große EcoRI/Hinfl-Fragment gewonnen, in welchem durch den HinfI-Schnitt die letzten 27 bp der für SAK42D kodierenden Sequenz mit entfernt worden sind. Zur Wiederherstel­ lung der vollständigen Sequenz am 3′-Ende des sak42D-Genes wird das an HinfI- und PstI-Enden adaptierbare Linkerpaar A-3-45/A-4-38 (vergleiche Tabelle 2) in an sich bekannter Weise an den HinfI- Terminus des EcoRI/HinfI-Fragmentes angelagert. Dabei wird durch Änderung der Nukleotidsequenz unter Beibehaltung der Amino­ säureabfolge ein zusätzlicher StyI-Spaltort in Position 389 des reifen Genes eingeführt. Das so entstehende 433 bp große EcoRI/PstI-Fragment mit dem nunmehr kompletten sak42D-Strukturgen wird wiederum in das Vektorplasmid pTZ19R inseriert, welches zuvor mit den gleichen Enzymen behandelt worden ist.

Das derart hergestellte Plasmid pTZ19Rsak1 (Abb. 3) fungiert als Basisplasmid für alle nachfolgenden gentechnischen Verfahrens­ schritte.

B. Konstruktion von Expressionsvektoren für SAK42D und N-terminal verkürzten SAK42D-Formen

Als Expressionsvektoren werden die kommerziellen Plasmide pMEX5 und pMEX6 verwendet, in denen die Expresssion durch den synthetischen tac-Promoter vermittelt wird. Diese Plasmide unter­ scheiden sich nur dadurch, daß sie den die Bildung einzelsträngi­ ger DNA ermöglichenden Bereich aus dem f1-Phagen in unterschiedli­ cher Orientierung enthalten.

Aus dem Basisplasmid pTZ19Rsak1 wird das oben beschriebene EcoRI/PstI-Fragment isoliert und nachfolgend in die mit EcoRI und PstI behandelten Plasmide pMEX5 und pMEX6 inseriert, mit welchen dann der E. coli-Stamm TG1 transformiert wird. Hierbei entstehen die Expressionsplasmide pMEX503sak (Abb. 4) und pMEX602sak (Abb. 5), die im weiteren zur fermentativen Produktion von reifer SAK42D eingesetzt werden. In beiden Plasmiden wird die Expression des Zielproteins durch eine gleichartige Anordnung von Expressions­ signale bewirkt, die dadurch charakterisiert ist, daß zusätzlich zum lac-Repressor sowie zum tac-Promoter zwei in Tandem-Orientie­ rung angeordnete RBS dem zu exprimierenden sak42D-Gen vorgeschal­ tet sind (sogenannte RtacR-Konfiguration). Die zweite RBS ist bereits durch das zur Rekonstitution des 5′-Endes des reifen sak42D-Genes verwendete Linkerpaar A-1-36/A-2-36 (siehe Tabelle 2) ebenso wie die Erkennngssequenzen für die Restriktasen StuI und NdeI in das Plasmid pTZ19Rsak0 eingeführt worden.

Zur Erzeugung der verfahrensgemäßen Expressionsplasmide für definiert verkürzte Staphylokinasen wird die an sich bekannte Methode der Linkeradaption nach dem im folgenden beschriebenen Prinzip benutzt. Die verwendeten Linker sind so aufgebaut, daß sie am 5′-Ende nach der Ligation an eine mit StuI gespaltene DNA die Erkennungssequenz von StuI rekonstituieren. Stromabwärts des StuI- Ortes folgt eine Übergangssequenz bis zum ATG-Startcodon, dem die Nukleotidsequenz des um die entsprechenden Codons deletierten nativen sak42D-Gens bis zu dem im sak42D-Gen nächstfolgenden unikalen Restriktionsspaltort angeschlossen ist. Bei der Konstruk­ tion der in Tabelle 1 aufgeführten Expressionsplasmide werden zunächst die entsprechenden Linkerpaare, von denen jeweils das in Tabelle 2 so gekennzeichnete Oligonukleotid vorher nach Standard­ vorschriften mittels T4-Kinase und ATP phosphoryliert worden ist, an die Enden des durch Spaltung mit StuI geöffneten Expres­ sionsvektors pMEX602sak1 in an sich bekannter Weise mit Hilfe von T4-DNA-Ligase angelagert. Durch nachfolgende Verdauung mit HindIII wird das sak42D-Gen vollständig aus dem Vektor entfernt. Nachfol­ gend wird ein, das jeweilige verkürzte sak42D-Gen tragende BstUI/HindIII-Fragment bzw. HaeIII/HindIII-Fragment durch Spal­ tung von pTZ19Rsak1 mit den entsprechenden Restriktionsenzymen isoliert und mit Hilfe von T4-DNA-Ligase mit dem nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Expressionsvektorfragment verknüpft.

Mit dieser Vorgehensweise wurden unter Verwendung der in Tabelle 2 aufgeführten Linker und Restriktionsspaltorte die Plasmide pMEXDN10sak, pMEXDN11sak, pMEXDN12sak, pMEXDN13sak, pMEXDN14sak, pMEXDN15sak, pMEXDN16sak und pMEXDN17sak konstruiert (Kurzbezeichnung pMEXDNmsak; m= 10, . . ., 17), die die am N-Termi­ nus um 10, 11, 12, 14, 15, 16 bzw. 17 Aminosäuren verkürzten Staphylokinasen exprimieren.

C. Konstruktion der Expressionsvektoren für C-terminal verkürzte SAK-Varianten

Zur Konstruktion der C-terminal verkürzte Staphylokinasen kodierenden Plasmide pMEXDC1sak, pMEXDC2sak und pMEXDC3sak wird das Plasmid pMEX503sak mit dem Restriktionsenzym StyI geöffnet. Dann wird mit Hilfe von T4-DNA-Ligase das vorher mittels T4-Kinase und ATP phoshorylierte Linkergemisch A-21-30/A-22-22, welches an 3 Stellen jeweils die Basen A und T derart enthält, daß im letzten, vorletzten und drittletzten Codon des sak42D-Gens entweder die nativen Codons rekonstituiert oder Stopcodons eingeführt werden, an die Enden der linearisierten DNA angehängt. Durch eine konseku­ tive Behandlung des Ligationsgemisches mit der Restriktase PstI und T4-DNA-Ligase wird ein Plasmidgemisch erhalten, das in den E. coli-Stamm TG1 kloniert wird. Aus einer Vielzahl transformanter Klone werden die Expressionsplasmide pMEXDC1, pMEXDC2 bzw. pMEXDC3, die für C-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren verkürzte SAK42D kodieren, isoliert und durch Sequenzanalyse nach dem Sanger-Verfahren identifiziert.

D. Bestimmung der Expression und der Aktivität der Plasminogen­ aktivatoren

Die mit den Expressionsplasmiden für SAK42D und verkürzte Staphylokinasen transformierten E. coli-Stämme
E. coli TG1 (pMEX503sak), E. coli TG1 (pMEX602sak), E. coli TG1 (pMEXDN10sak), E. coli TG1 (pMEXDN11sak),
E. coli TG1 (pMEXDN12sak), E. coli TG1 (pMEXDN12sak),
E. coli TG1 (pMEXDN13sak), E. coli TG1 (pMEXDN14sak),
E. coli TG1 (pMEXDN15sak), E. coli TG1 (pMEXDN16sak),
E. coli TG1 (pMEXDN17sak), E. coli TG1 (pMEXDC1sak),
E. coli TG1 (pMEXDC2sak) und E. coli TG1 (pMEXDC3sak) werden zum Nachweis der intrazellulär gebildeten reifen bzw. verkürzten Staphylokinasen in einem komplexen Vollmedium oder in einem synthetischen Medium bis zur mittleren oder späten log-Phase submers kultiviert. In dieser Wachstumsphase wird die SAK42D- Expression durch Zugabe von Isopropylthiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Nach weiteren 1-6 Stunden werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in einem Phenylmethylsulfonylfluorid enthaltenden Phosphat-Puffer resuspensiert. Mittels Ultraschall­ aufschluß und hochtouriger Zentrifugation werden aus den Zellen Zellrohextrakte hergestellt. Aus diesen werden in einer Folge mehrerer säulenchromatischer Schritte die Plasminogenaktivator- Spezies (SAK42D und verkürzte SAK42D) bis zur elektrophoretischen Homogenität angereichert.

Die Konzentration der Plasminogenaktivatoren in den Rohex­ trakten oder in den chromatografischen Fraktionen werden auf indi­ rektem Wege über die proteolytische Aktivität der aus Plasminogen freigesetzten Protease Plasmin bestimmt. Methodisch erfolgt der Nachweis qualitativ durch Zymografie nach SDS-PAGE, semiquan­ titativ durch Bestimmung der Größe der Lysehöfe auf Plasminogen- Casein-Agar-Platten und quantitativ durch kolorimetrische Bestim­ mung des aus dem synthetischen Plasminsubstrat Chromozym PL (Boehringer, Mannheim) freigesetzten Nitrophenolates.

Des weiteren werden Dissoziationskonstanten von Komplexen aus Plasminogen und SAK42D bzw. SAK42D-Derivaten durch eine in diesem Zusammenhang neuartige affinitätschromatografische Methode bestimmt.

Abgeleitet vom Schema der Plasminogen-Casein-Agar-Tests wird zur Identifizierung der Klone, die tatsächlich Plasminogenaktiva­ toren ausbilden, ein Verfahren angewendet, bei dem die zu testen­ den Klone in Agarplatten eingestochen werden, die neben Ampicil­ lin, Plasminogen und Casein noch Casaminosäuren und Hefeextrakt als Nährstoffquelle und IPTG zur Induktion der Expression der Plasminogenaktivatoren enthalten (D. BEHNKE und D. GERLACH (1987), a. a. O.). Die Plasminogenaktivatoraktivität-exprimierenden Klone sind durch Lysehöfe um den Einstich zu erkennen, die durch Plasmin verursacht werden, welches durch auf nicht bekanntem Wege aus den Zellen ausgeschleuste Plasminogenaktivatoren aus dem im Agar vor­ handenen Plasminogen gebildet wird.

Beispiele

Die Biosynthese der Plasminogenaktivatoren wird in entspre­ chend transformierten E. coli-Zellen durch die rekombinanten Plas­ mide pMEX503sak, pMEX602sak, pMEXDN10sak, pMEXDN11sak, pMEXDN12sak, pMEXDN13sak, pMEXDN14sak, pMEXDN15sak, pMEXDN16sak, pMEXDN17sak, pMexDC1sak, pMEXDC2sak determiniert. Diese Plasmide sind aus dem Vektorplasmid pMET5 entstanden. Die folgenden Ausfüh­ rungen sollen an Beispielen die einzelnen Schritte der Verfahren zur Konstruktion der Vektoren näher veranschaulichen. Sie enthal­ ten jedoch keine detaillierten Angaben zu standardisierten Einzelverfahren der Gentechnologie wie Gewinnung von Plasmid-DNA, Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen, Isolierung von DNA-Frag­ menten aus Agarose- und Polyacrylamid(PAA)-Gelen, Einfügen von DNA-Bruch­ stücken in Vektorplasmide, Transformation von bakteriellen Rezipientenstämmen mit Plasmid-DNA und DNA-Sequenzanalyse. Solche Verfahren sind in einer Reihe von Veröffentlichungen (z.Bsp. in "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", T.Maniatis, E. R. Fritsch und J.Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Edition, 1989 oder "Recombinant DNA Methodology" J-A.R. Dillon, A. Nasim und E.R.Nestman, John Wiley & Sons,) ausführlich beschrieben und dem Fachmann als Stand der Technik bekannt.

Herstellung von pTZ19Rsak0

Aus dem Stamm E. coli TG1 (pMET5) wird in an sich bekannter Weise Plasmid-DNA isoliert. Eine ausreichende Menge pMET5 (5 bis 10 µg) wird in 20 µl des entsprechenden Reaktionspuffer mit 20 Einheiten SalI 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Phenolextraktion gestoppt und die DNA nach dreimaliger Etherextraktion mit Ethanol gefällt. Der Niederschlag wird in bidestillierten Wasser aufgenommen. Ein Aliquot (200 ng) der linearen Plasmid-DNA wird mit jeweils dem 50fachen molaren Über­ schuß des Linkers A-1-36 und des in an sich bekannter Weise phos­ phorylierten Linkers A-2-36 versetzt und das Gemisch wird mit 10fachem TM-Puffer (700 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM MgCl₂) auf Liga­ tionsbedingungen eingestellt. Die Bildung der doppelsträngigen Linker-DNA wird durch Erwärmen des Reaktionansatzes auf 80°C und nachfolgendes langsames Abkühlen auf Raumtemperatur (RT) erreicht. Zum Reaktionsgemisch werden jeweils 1/10 Volumenäquivalente 100 mM Dithiothreitol (DTT) und 10 mM Adenosintriphosphat (ATP) sowie 0,2 Einheiten T4-DNA-Ligase zugesetzt und 12 Stunden bei 15°C inkubiert. Aus dem Reaktionsgemisch wird die DNA durch Zugabe des 2,5fachen Volumens Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wird in 50 µl B-Puffer (Boehringer) aufgenommen und mit 20 Einheiten HindIII 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Durch Agarose-Gelelektropho­ rese und nachfolgende Elektroelution wird in an sich bekannter Weise ein 1,2 kbp großes Fragment isoliert und der Ligation mit dem zuvor nach Standardvorschriften mit HindIII-Restriktase verdauten Vektor pTZ19R (USB) unterworfen. Die Reaktion wird durch 10-minütiges Erwärmen auf 70°C gestoppt. Die Hälfte des Reaktions­ gemisches wird zur Transformation kompetenter Zellen des Stammes E. coli TG1 eingesetzt. Die Selektion auf Transformanten erfolgt durch Zusatz von 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactosid (X- Gal) und Isopropylthiogalactopyranosid (IPTG) zum Agar und Auswahl weißer Zellkolonien. Aus weißen Transformantenklonen wird in bekannter Weise Plasmid-DNA isoliert und nach Restriktionsanalyse der Sequenzierung nach dem Sanger-Verfahren unterzogen. Unter den so analysierten Klonen befinden sich mehrere, die die erwartete Sequenz des wiederhergestellten sak42D-Genes aufweisen. Eines dieser Plasmide wird ausgewählt und erhält die Bezeichnung pTZ19Rsak0.

Konstruktion des Plasmides pTZ19Rsak1

Zur Abtrennung der auf dem Plasmid pTZ19Rsak0 enthaltenen 3′- flankierenden nicht für SAK42D kodierenden Bereiche wird nach Standardvorschriften die DNA dieses Plasmides pTZ19Rsak0 isoliert und daraus durch Restriktionsverdauung mit EcoRI und HindIII und Agarose-Gelelektrophorese ein 1,2 kbp großes Fragment gewonnen. Dieses Fragment wird in an sich bekannter Weise nacheinander mit den Restriktionsenzymen AvaII und HinfI behandelt, wodurch die elektrophoretische Isolierung des Zielfragmentes erleichtert wird. Durch Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) und nachfolgende Elek­ troelution wird ein 388 bp großes von EcoRI- und HinfI-Enden flan­ kiertes Fragment erhalten. Der nach der der Elektroelution folgen­ den Ethanolfällung erhaltene DNA-Niederschlag wird in Wasser aufgenommen. Ein Aliquot (200 ng) der wäßrigen DNA-Lösung wird mit dem jeweils 50fachen molaren Überschuß des in an sich bekannter Weise phosphorylierten Linkers A-3-45 und des Linkers A-4-38 versetzt und mit 1/10 Volumenäquivalenten 10fach konzentrierten TM-Puffers auf die Reaktion eingestellt. Die Bildung der doppel­ strängigen Linker-DNA wird durch Erwärmen des Reaktionansatzes auf 65°C und nachfolgendes langsames Abkühlen auf Raumtemperatur (RT) erreicht. Zum Reaktionsgemisch werden jeweils 1/10 Volumenäquiva­ lente 100 mM DTT und 10 mM ATP sowie 0,2 Einheiten T4-DNA-Ligase zugesetzt und 16 Stunden bei 15°C inkubiert. Aus dem Reaktionsge­ misch wird die DNA durch Zugabe des 2,5fachen Volumens Ethanol ausgefällt. Der so erhaltene Niederschlag wird in 15 µl Ligations­ puffer (Boehringer) aufgenommen und mit 1 µg des in Wasser gelö­ sten Plasmides pTZ19R versetzt, das zuvor auf an sich bekannte Weise mit den Restriktionsenzymen EcoRI und PstI behandelt worden ist. Zu diesem Reaktionsgemisch werden 0,2 Einheiten T4 DNA Ligase zugefügt und es wird 16 Stunden bei 15°C inkubiert. Die Hälfte dieses Ansatzes wird zur Transformation kompetenter Zellen des Stammes E. coli TG1 nach Standardvorschriften eingesetzt. Die Selektion auf Transformanten erfolgt durch Zusatz von X-Gal und IPTG zum Agar und Auswahl weißer Zellkolonien. Aus weißen Trans­ formantenklonen wird in bekannter Weise Plasmid-DNA isoliert und der Sequenzierung nach dem Sanger-Verfahren unterzogen. Unter den so analysierten Klonen befinden sich mehrere, die die erwartete von EcoRI- und PstI-Orten flankierte Sequenz aufweisen. Eines dieser Plasmide wird ausgewählt und erhält die Bezeichnung pTZ19Rsak1 (Abb. 3).

Herstellung von pMEX503sak und pMEX602sak

Aus dem Basisplasmid pTZ19Rsak1 wird auf bekannte Weise das 433 bp große von EcoRI und PstI flankierte Fragment isoliert und in Wasser aufgenommen. Parallel dazu werden die Vektoren pMEX5 und pMEX6 (Medac) nach Standardvorschriften mit den Restriktions­ enzymen EcoRI und PstI behandelt und die großen Fragmente isoliert. Jeweils 100 ng der so vorbehandelten Vektorplasmide werden mit jeweils 200 ng des das sak42D-Gen enthaltenden Frag­ mentes in Ligationspuffer (Boehringer) vereinigt und nach Zugabe von 0,2 Einheiten T4-DNA-Ligase 16 Stunden bei 15°C inkubiert. Die nach der Transformation in Zellen von E. coli TG1 erhaltenen ampicillinresistenten Kolonien werden durch Einstechen in ein plasminogenhaltiges Caseinmedium (siehe D. BEHNKE und D. GERLACH (1987), a. a. O.), das zusätzlich noch mit 200 µM IPTG ausgestat­ tet ist, auf die Expression von Staphylokinaseaktivität getestet. Die Plasmid-DNA einiger auf dem Testmedium Lysehöfe ergebenden Klone wird in bekannter Weise gewonnen und die Nukleotidsequenz durch Plasmidsequenzierung mit Sequenase^TM (USB) nach dem Standardprotokoll ermittelt. Unter den so analysierten Klonen, die aus dem Vektor pMEX5 hervorgehen, werden Plasmide gefunden, die die richtige Sequenz des sak42D-Genes und der 5′-flankierenden translationsdeterminierenden Bereiche aufweisen. Eines dieses Plasmide erhält die Bezeichnung pMEX503sak (Abb. 4) und wird als Expressionsplasmid für Staphylokinase 42D verwendet. Unter den aus pMEX6 hervorgehenden durch Sequenzanalyse untersuchten Klonen werden ebenfalls Plasmide gefunden, die die richtige Sequenz des sak42D-Genes und der 5′-flankierenden translationsdeterminierenden Bereiche aufweisen. Bei einem dieser Klone wird eine Mutation unmittelbar stromabwärts des sak42D-Genes gefunden, die zum Verlust des unikalen PstI-Ortes führt. Dieses so charakterisierte Plasmid findet als Expressionsplasmid für Staphylokinase Verwen­ dung und erhält die Bezeichnung pMEX602sak (Abb. 5).

Konstruktion der Plasmide pMEXDN10sak, pMEXDN11sak, pMEXDN12sak und pMEXDN13sak

Zur Herstellung der Expressionsplasmide für die verkürzten sak42D-Gene werden je 10 µg der Plasmide pMEX503sak bzw. pMEX602sak in 50 µl H-Puffer (Boehringer) mit je 80 Einheiten StuI 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die lineare DNA wird nach Phenolextraktion auf bekannte Weise durch Agarose-Gelelektropho­ rese und nachfolgende Elektroelutuion isoliert und in Wasser auf­ genommen. Jeweils 2 µg der linearen Plasmid-DNA werden jeweils dem 50fachen molaren Überschuß der Linkerpaare A-5-23/A-6-23, A-7- 20/A-8-20, A-9-17/A-10-17 bzw. A-11-14/A-12-14 versetzt, von denen jeweils ein Linker nach Standardvorschriften phosphoryliert worden ist (siehe Tab. 2). Danach werden 1/10 Volumenäquivalente 10fach konzentrierter TM-Puffer zugefügt. Die Bildung der doppel­ strängigen Linker-DNA wird durch Erwärmen der entsprechenden Reak­ tionansätze auf 80°C und nachfolgendes langsames Abkühlen auf RT erreicht. Zu den Reaktionsgemischen werden jeweils 1/10 Volumen­ äquivalente 100 mM DTT und 10 mM ATP sowie 0,2 Einheiten T4 DNA Ligase zugesetzt und 12 Stunden bei 15°C inkubiert. Aus dem Reaktionsgemisch wird die DNA durch Zugabe des 2,5fachen Volumens Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wird in 20 µl B-Puffer (Boehringer) aufgenommen und mit 20 Einheiten HindIII 2 Stunden bei 37°C inkubiert, wodurch das gesamte für native reife SAK42D kodierende Gen vom restlichen Teil des Vektorplasmides abgespalten wird. Das sak-Gen-freie Plasmidfragment wird durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel mit sich anschließender Elektroelution isoliert. Parallel dazu wird aus 50 µg des Plasmides pTZ19Rsak1 durch Verdauung mit je 50 Einheiten der Restriktasen EcoRI und HindIII, anschließende Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelu­ tuion auf an sich bekannte Weise das 450 bp große Fragment isoliert und in 100 µl Wasser gelöst. 50 µl dieser DNA-Lösung werden durch Zugabe von NEBuffer 2 (New England Biolabs) auf die Reaktion eingestellt und bei 60°C 2 Stunden mit 30 Einheiten BstUI inkubiert. Durch nachfolgende Gelelektrophorese in einem 6%igen PAA-Gel wird das 370 bp große BstUI/HindIII-Fragment abgetrennt und nach Elektroelution isoliert. Jeweils etwa 10 µl (80 ng) des in Wasser gelösten, das sak42D-Gen enthaltenden Fragmentes werden mit 10 µl (50 ng) der entsprechenden in Wasser gelösten, linker­ modifizierten Vektor-DNA vereinigt, mit 10fachem Ligationspuffer auf Ligationsbedingungen eingestellt und mit 3 Einheiten T4 DNA Ligase für 15 Stunden bei 15°C inkubiert.

Die Hälfte dieses Ansatzes wird zur Transformation kompetenter Zellen des Stammes E. coli TG1 nach Standardvorschriften einge­ setzt. Die Transformanten werden nach Einstechen in plasmino­ genhaltigen Caseinagar auf die Expression von Staphylokinaseakti­ vität geprüft, welche in Form von Lysehöfen um die Einstichlöcher zu erkennen ist. Aus den in diesem Test positive Ergebnisse liefernden Klonen wird auf bekannte Weise Plasmid-DNA isoliert. Mittels Restriktionsanalyse unter Verwendung von HindIII und XbaI werden die Plasmide selektiert, die ein Xbal/HindIII-Insert tragen. Durch nachfolgende Plasmidsequenzierung mit Sequenase^TM (USB) nach dem Standardprotokoll wird die Nukleotidsequenz der das sak42D-Gen tragenden Plasmidteile festgestellt. Unter den so un­ tersuchten Klonen werden mehrere Plasmide gefunden, die die jeweils erwarteten von EcoRI- und HindIII-Orten flankierten Sequenzen enthalten. Diese erhalten je nach verwendetem Linkerpaar und exprimierter SAK-Variante die Bezeichnungen pMEXDN10sak, pMEXDN11sak, pMEXDN12sak und pMEXDN13sak und kodieren für Staphylokinasen, bei denen am N-Terminus 10, 11, 12 bzw. 13 deletiert sind.

Herstellung der Plasmide pMEXDN14sak, pMEXDN15sak, pMEXDN16sak und pMEXDN17sak

Jeweils 2 µg der im vorausgehenden Abschnitt beschriebenen, durch StuI-Spaltung linearisierten pMEX602sak- bzw. pMEX503sak- Plasmid-DNA werden mit jeweils dem 50fachen molaren Überschuß der Linkerpaare A-13-32/A-14-32, A-15-29/A-16-29, A-17-26/A-18-26 oder A-19-23/A-20-23 versetzt, von denen jeweils ein Linker nach Standardvorschriften phosphoryliert worden ist (siehe Tab. 2). Die Bildung der doppelsträngigen Linker-DNA wird nach Zugabe von 1/10 Volumenäquivalenten 10fach konzentriertem TM-Puffer durch Erwär­ men des Reaktionansatzes auf 65°C und nachfolgendes langsames Abkühlen auf Raumtemperatur erreicht. Zu den Reaktionsgemischen werden jeweils 1/10 Volumenäquivalente 100 mM DTT und 10 mM ATP und 1 Einheit T4-DNA-Ligase zugesetzt und dann wird 12 Stunden bei 15°C inkubiert. Aus dem Reaktionsgemisch wird die DNA durch Zugabe des 2,5fachen Volumens Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wird in 20 µl B-Puffer (Boehringer) aufgenommen und mit 20 Einheiten HindIII 2 Stunden bei 37°C inkubiert, wodurch das gesamte für native reife SAK42D kodierende Gen vom restlichen Teil des Vektor­ plasmides abgespalten wird. Die lineare sak-Gen-freie Vektor-DNA wird dann durch nachfolgende Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel und anschließende Elektroelution isoliert. Parallel dazu werden 50 µl der im vorigen Abschnitt beschriebenen Lösung des das sak42D-Gen tragenden EcoRI/HindIII-Fragmentes in M-Puffer (Boehringer) gelöst und bei 37°C 2 Stunden mit 30 Einheiten HaeIII inkubiert. Durch Gelelektrophorese unter Verwendung eines 6%igen PAA-Geles und nachfolgende Elektroelution wird das 350 bp große HaeIII/HindIII-Fragment isoliert und in Wasser gelöst (8 ng/µl). 10 pl dieser Lösung werden jeweils mit 10 µl (50 ng) der entspre­ chenden linearen linkermodifizierten Vektor-DNA vereinigt, durch 10fachen Ligationspuffer, ATP und DTT auf die Ligationsbedingun­ gen eingestellt und mit 3 Einheiten T4 DNA Ligase 15 Stunden bei 15°C inkubiert.

Die Hälfte dieses Ansatzes wird nach Standardvorschrift in kompetente Zellen des Stammes E. coli TG1 transformiert. Die Transformanten werden nach Einstechen in plasminogenhaltigen Caseinagar durch Prüfung auf das Auftreten von Lysehöfen um die Einstichlöcher auf die Expression von Staphylokinaseaktivität geprüft. Aus den in diesem Test positive Ergebnisse liefernden Klonen wird auf bekannte Weise Plasmid-DNA isoliert. Durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von XbaI und HindIII werden Plasmide identifiziert, die XbaI/HindIII-Fragmente mit einer Größe von etwa 370 bp tragen. Die Nukleotidsequenzen der von EcoRI und HindIII flankierten, die verkürzten sak42D-Gene tragenden Bereiche der Expressionsplasmide werden durch Plasmidsequenzierung mit Seqenase^TM (USB) nach dem Standardprotokoll festgestellt. Unter den so untersuchten Klonen werden mehrere Plasmide gefunden, die die jeweils erwarteten von EcoRI und HindIII flankierten Sequenzen enthalten. Diese erhalten je nach verwendetem Linkerpaar und exprimierter SAK42D-Variante die Bezeichnungen pMEXDN14sak, pMEXDN15sak, pMEXDN16sak und pMEXDN17sak und kodieren für Staphy­ lokinasen, bei denen am N-Terminus 14, 15, 16 bzw. 17 deletiert sind.

Konstruktion der Plasmide pMEXDC1sak, pMEXDC2sak und pMEXDC3sak

Zur Herstellung der für die C-terminal verkürzten Staphylo­ kinasen kodierenden Plasmide wird der durch das Linkerpaar A-3- 45/A-4-38 in das sak42D-Gen eingeführte singuläre StyI-Ort verwen­ det. Im einzelnen werden dazu je 10 µg der Plasmide pMEX503sak bzw. pMEX602sak in NEBuffer 3 (New England Biolabs) unter Zusatz von Rinderserumalbumin (100 µg/ml) mit je 40 Einheiten StyI 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die lineare DNA wird auf bekannte Weise durch Agarose-Gelelektrophorese und nachfolgende Elektroelu­ tuion isoliert und in Ligationspuffer (Boehringer) aufgenommen. Jeweils 2 µg der linearen Plasmid-DNA werden mit jeweils dem 50fachen molaren Überschuß des nach Standardvorschriften phosphory­ lierten Linkergemisches A-21-30/A-22-22, das an 3 Positionen jeweils 2 unterschiedliche Nukleotide enthält, versetzt. Die Bildung der doppelsträngigen Linker-DNA wird nach Zugabe von 1/10 Volumenäquivalenten 10fach konzentrierten TM-Puffers durch Erwär­ men des Reaktionsansatzes auf 65°C und folgendes langsames Abküh­ len auf Raumtemperatur erreicht. Zu den Reaktionsgemischen werden jeweils 1/10 Volumenäquivalente 100 mM DTT und 10 mM ATP und 1 Einheit T4 DNA Ligase zugesetzt und 16 Stunden bei 15°C inkubiert. Aus dem Reaktionsgemisch wird die DNA durch Zugabe des 2,5fachen Volumens Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wird in 20 µl H- Puffer (Boehringer) aufgenommen und mit 30 Einheiten PstI 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Phenolextrak­ tion gestoppt und die DNA nach dreimaliger Etherextraktion mit Ethanol gefällt. Der Niederschlag wurde in Ligationspuffer aufge­ nommen, es werden jeweils 1/10 Volumenäquivalente 100 mM DTT und 10 nM ATP und 1 Einheit T4-Ligase zu den Reaktionsgemischen zuge­ setzt und 12 Stunden bei 15°C inkubiert. Die Hälfte dieses Ansatzes wird zur Transformation kompetenter Zellen des Stammes E. coli TG1 nach Standardvorschriften eingesetzt. Von 12 der ampicil­ linresistenten Klone wird auf bekannte Weise Plasmid-DNA isoliert und die Nukleotidsequenz durch Plasmidsequenzierung mit Sequenase^TM (USB) nach dem Standardprotokoll festgestellt. Unter den so untersuchten Klonen werden mehrere gefunden, bei denen sich die ursprüngliche Sequenz am 3′-Ende des sak42D-Genes in erwarte­ ter Weise verändert hat. Es wird jeweils ein Plasmid ausgewählt, das für eine am C-Terminus um eine, zwei oder drei Aminosäuren verkürzte SAK42D kodiert. Diese Plasmide erhalten die Bezeichnun­ gen pMEXDC1, pMEXDC2 bzw. pMEXDC3.

Fermentation und Aufarbeitung der die rekombinanten Plasmide ent­ haltenden E. coli-Stämme

Die Fermentation der Stämme erfolgt bei 37°C in mit 200 ml Medium gefüllten 500 ml-Rundkolben unter intensivem Schütteln ohne zusätzliche Belüftung. Dazu werden 25 ml 2fach konzentriertes TY- Medium, das zusätzlich mit 50 µg/ml Ampicillin ausgestattet ist, mit einer Einzelkolonie des entsprechenden Stammes beimpft und ca. 16 Stunden bei 37°C geschüttelt. Jeweils 1 ml dieser Vorkultur wird zum Beimpfen von 200 ml des gleichen Mediums verwendet. Diese Kulturen werden bei 37°C geschüttelt, bis eine bei 600 nm gemes­ sene optische Dichte von 0,4 bis 0,9 erreicht ist. Nach Erreichen dieser Zelldichte wird die Expression der auf den Plasmiden kodierten Staphylokinase-Gene durch Zugabe von 400 µl einer steri­ len wäßrigen IPTG-Lösung (40 mg/ml) induziert. Im Anschluß daran werden die Kulturen weitere 2-6 Stunden bei 37°C geschüttelt und dann durch Zentrifugation bei 4°C und 4000 µm geerntet. Die Zell­ niederschläge werden in 1/20 bis 1/40 Volumenäquivalenten (bezüglich des Kulturvolumens) eines 40 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) suspendiert und mit Phenylmethylsulfonylfluorid bis zu einer End­ konzentration von 1 mM versetzt. Die Suspensionen werden auf 0°C abgekühlt und bei dieser Temperatur 15 Minuten mit Ultraschall (Leistung 100-120 Watt) aufgeschlossen. Die Mengen der in den Zellrohextrakten enthaltenen SAK42D bzw. SAK42D-Derivate im Vergleich zu den übrigen bakteriellen Proteinen kann aus dem in Abb. 6 dargestellten, mit Coomassie-Blue gefärbten Gel aus der diskontinuierlichen SDS-PAGE entnommen werden.

Nach dem Aufschluß werden 300 µl Proben der Zellsuspensionen entnommen. Ein Aliquot von 100 µl dieser Proben wird jeweils mit 25 µl 10fach konzentrierten Proteingel-Probenpuffers (10% Natriumdodecylsulfat (SDS), 25% Glycerol und 25% 2-Mercaptoethanol in Wasser) versetzt. Ein zweites 100 µl-Aliquot wird bei 4°C und 14000 rpm 15 min zentrifugiert. Der Überstand wird in ein neues Eppendorfgefäß überführt und mit 25 µl 10fach konzentiertem Proteingel-Probenpuffer versetzt. Das nach der Zentrifugation des zweiten Aliquotes zurückbleibende Pellet wird in 100 µl 40 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) gewaschen und nach Rezentrifugation und Entfernen des Überstandes in 100 µl des gleichen Puffers resuspen­ diert und mit 25 µl 10fach konzentriertem Proteingel-Probenpuffer versetzt. Die 3 Proben für jeden Zellaufschluß werden 5 min im Wasserbad gekocht und jeweils 15 µl auf ein diskontinuierliches SDS-haltiges Polyacrylamidgel (5% Sammelgel, 15% Trenngel) aufge­ tragen. Nach der Entwicklung wird das Gel nach Standardvorschrift mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt und nachfolgend in wäßrigem essigsaurem Methanol entfärbt.

Ein typisches Gel ist in Abb. 7 dargestellt. Es verdeutlicht die Proteinmenge an SAK42D im Vergleich zu den restlichen lösli­ chen Zellproteinen und zeigt, daß SAK42D unter den geschilderten Fermentationsbedingungen vollständig in gelöster Form vorliegt.

Die Aufschlüsse werden bis zur Aufarbeitung bei -20°C gela­ gert. Am Beginn der Aufreinigung werden maximal 30 ml Aufschluß­ suspension im Wasserbad (60°C) aufgetaut und danach 60 Minuten bei 25000 rpm (Rotor SW 28, Beckman) zentrifugiert. Der Überstand wird mit bidestilliertem Wasser auf das 4fache Volumen verdünnt und anschließend auf eine Chromatografiesäule gepumpt, die S- Sepharose fast flow (Pharmacia) enthält. Das Gelbett hat einen Durchmesser von 2.6 cm und eine Höhe von 30 cm. Daraus ergibt sich ein nutzbares Gelbettvolumen von 160 ml. Vor dem Auftragen des Überstandes ist das Gelbett mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 6.5, äquilibriert worden. Die Flußgeschwindigkeit beim Auftragen beträgt 1.9 ml/min. Anschließend wird mit dem Äquili­ brierungspuffer gewaschen (Flußgeschwindigkeit 3,8 ml/min.) bis die Basislinie der UV-Detektion (280 nm) erreicht wird. Das unge­ bunden die Säule passierende Material enthält nur Spuren von SAK42D bzw. SAK42D-Derivaten und wird verworfen. Die Elution der Säule (Flußrate 3.8 ml/min.) erfolgt mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 6.5, der 250 mM NaCl enthält. Das Elutionsprofil zeigt mehrere Peaks, von denen einer SAK42D bzw. SAK42D-Derivate in angereicher­ ter Form enthält (Nachweis in SDS-PAGE). Die entsprechenden Peak- Fraktionen werden vereinigt und anschließend durch Zugabe von NaCl in Salzform (Endkonzentration 2.0 M NaCl) für die Chromatografie an Phenyl-Sepharose vorbereitet. Für diesen Schritt wird eine fertiggepackte HiLoad-Phenyl-Sepharose HP XK26/10-Säule (Pharmacia) verwendet, die mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 6.5, der 2.0 M NaCl enthält, äquilibriert worden ist. Nach dem Probenauf­ trag (Flußrate 5.0 ml/min.) wird mit Äquilibrierungspuffer bis zum Erreichen der Basislinie der UV-Detektion gewaschen (Flußrate 12.6 ml/min.). Danach werden die SAK bzw. die SAK-Derivate mit einem absteigenden Salzgradienten (Flußrate 12.6 ml/min.) eluiert

100% Puffer A → 25% Puffer A
  0% Puffer B → 75% Puffer B

Puffer A: 10 mM Phosphatpuffer, pH 6,5; 2,0 M NaCl
Puffer B: 10 mM Phosphatpuffer, pH 6,5

Das Gesamtgradientenvolumen beträgt 300 ml. Das Verfahren gestattet die Gewinnung reiner SAK42D bzw. reiner SAK42D-Derivate (Reinheitskriterien SDS-PAGE und isoelektrische Focussierung) in nur zwei Reinigungsschritten. Die Effektivität des Reinigungsver­ fahrens ist aus Abb. 8 ersichtlich, in der die Konzentrierung der SAK42D aus den Zellrohextrakten bis hin zur elektrophoretischen Homogenität anhand eines SDS-Geles dargestellt ist.

Die Bestimmung der spezifischen Aktivität von SAK42D und SAK42D- Derivaten

Die Bestimmung der spezifischen Aktivität ist für den Ver­ gleich der plasminogenaktivierenden Kapazität der SAK42D und der SAK42D-Derivate untereinander notwendig. Die spezifische Aktivität der SAK42D wird definiert als diejenige Menge Plasmin (mg), die von 1 mg SAK42D aus Plasminogen (eingesetzt im Überschuß) pro Minute freigesetzt wird. In separaten Bestimmungen wird deshalb die Plasminfreisetzung durch SAK42D und SAK42D-Derivate (a) und deren Proteinkonzentration (b) ermittelt.

• a1) Zunächst werden Verdünnungsreihen von SAK42D und SAK42D- Derivaten in 100 mM Tris, pH 8.0, hergestellt. Danach wird ein Reaktionsgemisch bestehend aus 30 µl Plasminogenlösung (20 mg Plasminogen (Fluka) gelöst in 1 ml Aqua dest.), 150 µl 100 mM Trispuffer, pH 8.0, und 10 µl Aktivatorlösung (Verdünnungsreihen SAK42D bzw. SAK42D-Derivate) angesetzt. Dieses Gemisch wird 10 Minuten bei 25°C inkubiert.
• a2) Das Plasminsubstrat Chromozym-PL (Boehringer) wird als 2 mM Lösung in Aqua dest. angesetzt. Zu 50 µl dieser Lösung werden 400 µl 100 mM Tris, pH 8.0, und 50 µl aus dem Aktivierungsansatz a1) gegeben. Dieses Gemisch wird 2 Minuten bei 25°C inkubiert. Danach wird die Reaktion mit 25 µl konzentrierter Essigsäure abgestoppt. Gleichzeitig wird im Schritt a2) eine Plasmin-Eichreihe angesetzt, indem je 50 µl einer Plasminverdünnungsreihe mit 400 µl 100 mM Tris- Puffer, pH 6.5, und 50 µl der Chromozym-PL-Lösung unter den gleichen Bedingungen inkubiert und abgestoppt werden. In Bezugsproben wird die Umsetzung des Plasminsubstrats durch Zugabe von 25 µl konzentrierter Essigsäure in Kombination mit der Aktivierungsprobe aus Ansatz a1) unterbunden. Bezugsproben, Eichproben und die eigentlichen Meßproben (je 250 µl) werden in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Flachboden) pipettiert und die Absorption bei 405 nm in einem Multikanalphotometer gemessen.
  Aus den Absorptionswerten der Meßproben kann unter Berücksichtigung der Absorptionswerte der Plasmin-Eichreihe und der Bezugsproben die Menge an Plasmin errechnet werden, die durch die in den Ausgangslösungen (s.a1) enthaltenen SAK42D oder SAK42D-Derivate pro Minute freigesetzt wird.
• b) Die Bestimmung des Proteingehalts der Proben, die SAK42D bzw. SAK42D-Derivate enthalten, erfolgt mittels des Bio-Rad Protein Assays (Bio-Rad) mit Rinderserumalbumin als Standard.

Unter Berücksichtigung des Proteingehalts sowie der Plasminfreisetzung kann nunmehr die spezifische Aktivität der SAK42D bzw. SAK42D-Derivate ermittelt und verglichen werden. Auf diese Weise ergeben sich für SAK42D-Derivate die in Tabelle 3 zu­ sammengefaßten spezifischen Aktivitäten (siehe Tab. 3).

Bestimmung der Dissoziationskonstanten von Staphylokinase- Plasminogen-Komplexen mittels analytischer Affinitätschromato­ graphie

Das Prinzip der Methode besteht darin, daß an einem geeigneten Träger immobilisiertes humanes Plasminogen in eine Chromato­ graphiesäule eingebracht wird und hier mit Staphylokinase in Wech­ selwirkung tritt, die in bestimmten Quantitäten über die Säule ge­ pumpt wird. Zwischen dem Elutionsvolumen VE und der jeweiligen Staphylokinasekonzentration [SAK] in der Probe besteht folgender Zusammenhang:

1/(V_D - V_E) = K_D/M_Pg + [SAK]/M_Pg.

Dabei haben die Variablen folgende Bedeutung:

V_D - Totvolumen der Säule
V_E - Elutionsvolumen der Staphylokinase
M_Pg - Menge des interagierenden immobilisierten Plasminogens in der Säulenpackung
[SAK] - Konzentration der Staphylokinase in der aufgegebenen Probe
K_D - Dissoziationskonstante des temporären Komplexes aus Staphylokinase und Plasminogen.

Die Abhängigkeit des Kehrwertes der Differenz von Säulentot­ volumen und Elutionsvolumen der Staphylokinase von der Staphylokinasekonzentration in der aufgegebenen Probe ist über einen bestimmten Konzentrationsbereich linear. Aus dem Anstieg der Geraden kann M_Pg bestimmt werden. Durch Extrapolation auf [SAK]=0 kann die gesuchte Dissoziationskonstante ermittelt werden.

Experimentell wird das Problem derart gelöst, daß zunächst Plaminogen, das gemäß einer Vorschrift von Deutsch und Mertz (D. G. DEUTSCH und E. T. MERTZ (1970), Science, 170, 1095-1096) aus Humanplasma isoliert worden ist, unter Benutzung einer Vorschrift der Firma Waters an Protein-Pak^TM epoxy-activated (Waters) gekop­ pelt wird. Der festgestellte Beladungsgrad beträgt 5 mg Protein je mg Säulenmatrix. Mit dem so beladenen Affinitätsgel wird eine Chromatographiesäule HR 5/5 (Pharmacia) gefüllt, die mit einem Kühlmantel versehen und mit einem FPLC-Chromatographie-System (Pharmacia) verbunden wird. Alle beschriebenen Versuche werden bei 16°C mit einer Fließgeschwindigkeit vom 0,5 ml/min unter Verwen­ dung von 0,1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,3) ausgeführt.

Nach der Konditionierung der Säule werden die Staphylokinase­ proben jeweils in 25 µl Volumenzonen auf die Säule aufgebracht, wobei die in diesen Volumina enthaltene Proteinmenge zwischen 0,5 und 8 µg variiert wird. Zur exakten Ermittlung des jeweiligen Maximums des Elutionsvolumens (V_E) wird der im System vorhandene FPLC-Controller benutzt.

Unter Verwendung der geschilderten Methode werden die in Tabelle 4 dargestellten Dissoziationskonstanten für die Wechsel­ wirkung von Plasminogen mit SAK42D und SAK42D-Derivaten erhalten (siehe Tab. 4).

Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 Vollständige DNA- und Proteinsequenz von Wildtyp-Staphylokinase 42D mit vorangestelltem ATG-Startcodon,

Abb. 2 Physische und Restriktionskarte des Plasmides pMET5, das als Aus­ gangsplasmid für die gentechnischen Konstruktionen der erfindungs­ gemäßen Plasmide dient,

Abb. 3 Physische und Restriktionskarte des Plasmides pTZ19Rsak1,

Abb. 4 Physische und Restriktionskarte des Plasmides pMEX503sak, das als erfindungsgemäßes Expressionsplasmid für die Expression von Wild­ typ-Staphylokinase 42D dient,

Abb. 5 Physische und Restriktionskarte des Plasmides pMEX602sak, das als erfindungsgemäßes Expressionsplasmid für die Expression von Wild­ typ-Staphylokinase 42D dient,

Abb. 6 Verdeutlichung der Menge SAK42D bzw. SAK42D-Derivate, die im Ver­ gleich zu den übrigen Zellproteinen von nachfolgend aufgeführten E. coli-Stämmen gebildet werden, anhand eines Geles der Zellrohex­ trakte nach dem Ultraschall-Aufschluß der Zellen aus der SDS-PAGE,

Abb. 7 Diskontinuierliches Gel aus der SDS-PAGE zur Verdeutlichung der Menge SAK42D im Vergleich zu den restlichen Zellproteinen und der Verteilung von SAK42D in löslicher und Sedimentfraktion,

Abb. 8 Diskontinuierliches Gel aus der SDS-PAGE zur Verdeutlichung der Effektivität der Reinigungsschritte bei der Isolierung von SAK42D aus Zellaufschlüssen.

Tabelle 1

Tabellarische Aufstellung der bei der Konstruktion der Expressionsplasmide für N-teriminal verkürzte SAK42D verwendeten Linker und Spaltorte

Spezifische Aktivitäten von SAK42D und SAK42D-Derivaten
SAK-Spezies
spezifische Aktivität in mg Plasmin/(mg SAK×min)
SAK42D|5,48×10²
DN10-SAK42D	1,05×10³
DN14-SAK42D	5,94×10²
DC1-SAK42D	1,64×10²
DC2-SAK42D	1,33×10²

Dissoziationskonstanten KD von Komplexen aus humanem Plasminogen und SAK42D sowie SAK42D-Derivaten
SAK42D-Spezies
KD in mol/l
SAK42D
2,6×10-6
DN10-SAK42D	2,8×10-6
DN14-SAK42D	7,1×10-6
DC2-SAK42D	1,7×10-5

Claims (78)

1. DNA-Sequenz die für reife Phi42D-Staphylokinase (Kurzwort: SAK42D) kodiert.

2. DNA-Sequenz aus den Segmenten

• - 5′-Teilsequenz der Abfolge ATGAAAGGCG ATGACG,
• - gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgenes nach An­ spruch 1 ab Position 47,

die für den Plasminogenaktivator DN10-SAK42D kodiert.

3. DNA-Sequenz aus den Segmenten

• - 5′-Teilsequenz der Abfolge ATGGGCGATG ACG
• - gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgenes nach An­ spruch 1 ab Position 47,

die für den Plasminogenaktivator DN11-SAK42D kodiert.

4. DNA-Sequenz aus den Segmenten

• - 5′-Teilsequenz der Abfolge ATGGATGACG
• - gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgenes nach An­ spruch 1 ab Position 47,

die für den Plasminogenaktivator DN12-SAK42D kodiert.

5. DNA-Sequenz aus den Segmenten

• - 5′-Teilsequenz der Abfolge ATGGACG
• - gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgenes nach An­ spruch 1 ab Position 47,

die für den Plasminogenaktivator DN13-SAK42D kodiert.

6. DNA-Sequenz aus den Segmenten

• - 5′-Teilsequenz der Abfolge ATGGCGAGTT ATTTTGAACC AACAGG
• - gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgenes nach An­ spruch 1 ab Position 69,

die für den Plasminogenaktivator DN14-SAK42D kodiert.

7. DNA-Sequenz aus den Segmenten

• - 5′-Teilsequenz der Abfolge ATGAGTTATT TTGAACCAAC AGG
• - gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgenes nach An­ spruch 1 ab Position 69,

die für den Plasminogenaktivator DN15-SAK42D kodiert.

8. DNA-Sequenz aus den Segmenten

• - 5′-Teilsequenz der Abfolge ATGTATTTTG AACCAACAGG
• - gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgenes nach An­ spruch 1 ab Position 69,

die für den Plasminogenaktivator DN16-SAK42D kodiert.

9. DNA-Sequenz aus den Segmenten

• - 5′Teilsequenz der Abfolge ATGTTTGAAC CAACAGG
• - gefolgt von der Sequenz des sak42D-Strukturgenes nach An­ spruch 1 ab Position 69,

die für den Plasminogenaktivator DN17-SAK42D kodiert.

10. DNA-Sequenz aus den Segmenten

• - Sequenz des sak42D-Strukturgens nach Anspruch 1 bis Position 389
• - gefolgt von der 3′-Teilsequenz CAAGGTTGTT ATAGAAAAG,

die für den Plasminogenaktivator DC1-SAK42D kodiert.

11. DNA-Sequenz aus den Segmenten

• -Sequenz des sak42D-Strukturgens nach Anspruch 1 bis Position 389
• -gefolgt von der 3′-Teilsequenz CAAGGTTGTT ATAGAA,

die für DC2-SAK42D kodiert.

12. DNA-Sequenz aus den Segmenten

• -Sequenz des sak42D-Strukturgens nach Anspruch 1 bis Position 389
• -gefolgt von der 3′-Teilsequenz CAAGGTTGTT ATA,

die für den Plasminogenaktivator DC3-SAK42D kodiert.

13. Rekombinantes Trägerplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 enthält.

14. Rekombinantes Trägerplasmid gemäß Anspruch 13, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es ein E. coli-Replikationsorigin aufweist sowie in einem Polylinkerbereich die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 enthält.

15. Rekombinantes Trägerplasmid pTZ19Rsak1 gemäß Anspruch 14, da­ durch gekennzeichnet, daß es

• -ein Derivat des E. coli-Klonierungsvektors pTZ19R ist und
• -im Polylinkerbereich dieses Vektors auf einem 433 bp großen EcoRI/PstI-Fragment die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 enthält.

16. Rekombinantes Epressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es jeweils eine der DNA-Sequenzen nach Anspruch 1 bis 12 in funktioneller Ankopplung an eine in bakteriellen Wirtsorganis­ men wirksame Kombination von Expressionskontrollsequenzen enthält.

17. Rekombinantes Expressionsplasmid gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es

• -ein E. coli-Replikationsorigin trägt sowie
• - jeweils eine der DNA-Sequenzen nach Anspruch 1 bis 12 in funktioneller Ankopplung an Expressionskontrollsequenzen enthält, die stromaufwärts des jeweiligen Strukturgenes die Konfiguration (in Leserichtung gesehen) Bindungssequenz für lac-Repressor - tac-Promotor - zwei in Tandemkonfiguration angeordnete Ribosomen­ bindungssequenzen (Kurzwort: RtacR) aufweisen.

18. Rekombinantes Expressionsplasmid gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es

• -ein Derivat des E. coli-Expressionsvektors pMEX5 ist und
• -jeweils eine der DNA-Sequenzen nach Anspruch 10 bis 12 in funktioneller Ankopplung an die Expressionskontrollsequenz mit der RtacR-Konfiguration enthält.

19. Expressionsplasmid pMEX503sak gemäß Anspruch 15 und 18, da­ durch gekennzeichnet, daß es im Polylinkerbereich von pMEX5 die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 als 433 bp großes EcoRI/PstI- Fragment in funktioneller Ankopplung an die RtacR-Kontroll­ sequenz enthält.

20. Rekombinantes Expressionsplasmid gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es

• -ein Derivat des E. coli-Expressionsvektors pMEX6 ist und
• -jeweils eine der DNA-Sequenzen nach Anspruch 1 bis 9 in funktioneller Ankopplung an die Expressionskontrollsequenz mit der RtacR-Konfiguration enthält.

21. Expressionsplasmid pMEX602sak gemäß Anspruch 15 und 20, da­ durch gekennzeichnet, daß es im Polylinkerbereich von pMEX6 die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 als 433 bp großes EcoRI/PstI- Fragment in funktioneller Ankopplung an die RtacR-Kontroll­ sequenz enthält.

22. Expressionsplasmid pMEXDN10sak gemäß Anspruch 15 und 20, da­ durch gekennzeichnet, daß es im Polylinkerbereich von pMEX6 die DNA-Sequenz nach Anspruch 2 in funktioneller Ankopplung an die RtacR-Kontrollsequenz enthält.

23. Expressionsplasmid pMEXDN11sak gemäß Anspruch 15 und 20, da­ durch gekennzeichnet, daß es im Polylinkerbereich von pMEX6 die DNA-Sequenz nach Anspruch 3 in funktioneller Ankopplung an die RtacR-Kontrollsequenz enthält.

24. Expressionsplasmid pMEXDN12sak gemäß Anspruch 15 und 20, da­ durch gekennzeichnet, daß es im Polylinkerbereich von pMEX6 die DNA-Sequenz nach Anspruch 4 in funktioneller Ankopplung an die RtacR-Kontrollsequenz enthält.

25. Expressionsplasmid pMEXDN13sak gemäß Anspruch 15 und 20, da­ durch gekennzeichnet, daß es im Polylinkerbereich von pMEX6 die DNA-Sequenz nach Anspruch 5 in funktioneller Ankopplung an die RtacR-Kontrollsequenz enthält.

26. Expressionsplasmid pMEXDN14sak gemäß Anspruch 15 und 20, da­ durch gekennzeichnet, daß es im Polylinkerbereich von pMEX6 die DNA-Sequenz nach Anspruch 6 in funktioneller Ankopplung an die RtacR-Kontrollsequenz enthält.

27. Expressionsplasmid pMEXDN15sak gemäß Anspruch 15 und 20, da­ durch gekennzeichnet, daß es im Polylinkerbereich von pMEX6 die DNA-Sequenz nach Anspruch 7 in funktioneller Ankopplung an die RtacR-Kontrollsequenz enthält.

28. Expressionsplasmid pMEXDN16sak gemäß Anspruch 15 und 20, da­ durch gekennzeichnet, daß es im Polylinkerbereich von pMEX6 die DNA-Sequenz nach Anspruch 8 in funktioneller Ankopplung an die RtacR-Kontrollsequenz enthält.

29. Expressionsplasmid pMEXDN17sak gemäß Anspruch 15 und 20, da­ durch gekennzeichnet, daß es im Polylinkerbereich von pMEX6 die DNA-Sequenz nach Anspruch 9 in funktioneller Ankopplung an die RtacR-Kontrollsequenz enthält.

30. Expressionsplasmid pMEXDC1sak gemäß Anspruch 18 und 19, da­ durch gekennzeichnet, daß es im Polylinkerbereich von pMEX5 die DNA-Sequenz nach Anspruch 10 in funktioneller Ankopplung an die RtacR-Kontrollsequenz enthält.

31. Expressionsplasmid pMEXDC2sak gemäß Anspruch 18 und 19, da­ durch gekennzeichnet, daß es im Polylinkerbereich von pMEX5 die DNA-Sequenz nach Anspruch 11 in funktioneller Ankopplung an die RtacR-Kontrollsequenz enthält.

32. Expressionsplasmid pMEXDC3sak gemäß Anspruch 18 und 19, da­ durch gekennzeichnet, daß es im Polylinkerbereich von pMEX5 die DNA-Sequenz nach Anspruch 12 in funktioneller Ankopplung an die RtacR-Kontrollsequenz enthält.

33. Rekombinanter bakterieller Produzentenstamm, dadurch gekenn­ zeichnet, daß er jeweils ein Expressionsplasmid gemäß Anspruch 16 bis 32 trägt.

34. Rekombinanter bakterieller Produzentenstamm gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß er jeweils ein E. coli-Stamm ist sowie ein Expressionsplasmid nach Anspruch 17 bis 32 trägt.

35. Rekombinanter Produzentenstamm nach Anspruch 19 und 34, da­ durch gekennzeichnet, daß er E. coli TG1 (pMEX503sak) ist.

36. Rekombinanter Produzentenstamm nach Anspruch 21 und 34, da­ durch gekennzeichnet, daß er E. coli TG1 (pMEX602sak) ist.

37. Rekombinanter Produzentenstamm nach Anspruch 22 und 34, da­ durch gekennzeichnet, daß er E. coli TG1 (pMEXDN10sak) ist.

38. Rekombinanter Produzentenstamm nach Anspruch 23 und 34, da­ durch gekennzeichnet, daß er E. coli TG1 (pMEXDN11sak) ist.

39. Rekombinanter Produzentenstamm nach Anspruch 24 und 34, da­ durch gekennzeichnet, daß er E. coli TG1 (pMEXDN12sak) ist.

40. Rekombinanter Produzentenstamm nach Anspruch 25 und 34, da­ durch gekennzeichnet, daß er E. coli TG1 (pMEXDN13sak) ist.

41. Rekombinanter Produzentenstamm nach Anspruch 26 und 34, da­ durch gekennzeichnet, daß er E. coli TG1 (pMEXDN14sak) ist.

42. Rekombinanter Produzentenstamm nach Anspruch 27 und 34, da­ durch gekennzeichnet, daß er E. coli TG1 (pMEXDN15sak) ist.

43. Rekombinanter Produzentenstamm nach Anspruch 28 und 34, da­ durch gekennzeichnet, daß er E. coli TG1 (pMEXDN16sak) ist.

44. Rekombinanter Produzentenstamm nach Anspruch 29 und 34, da­ durch gekennzeichnet, daß er E. coli TG1 (pMEXDN17sak) ist.

45. Rekombinanter Produzentenstamm nach Anspruch 30 und 34, da­ durch gekennzeichnet, daß er E. coli TG1 (pMEXDC1sak) ist.

46. Rekombinanter Produzentenstamm nach Anspruch 31 und 34, da­ durch gekennzeichnet, daß er E. coli TG1 (pMEXDC2sak) ist.

47. Rekombinanter Produzentenstamm nach Anspruch 32 und 34, da­ durch gekennzeichnet, daß er E. coli TG1 (pMEXDC3sak) ist.

48. Protein in Form einer verkürzten SAK42D mit Plasminogen­ aktivator-Wirkung.

49. Protein DN10-SAK42D gemäß Anspruch 2 sowie 48 mit Plasmino­ genaktivator-Wirkung und mit der Aminosäuresequenz die der Aminosäureabfolge 11 bis 136 der reifen SAK42D entspricht.

50. Protein DN11-SAK42D gemäß Anspruch 3 sowie 48 mit Plasmi­ nogenaktivator-Wirkung und mit der Aminosäuresequenz die der Aminosäureabfolge 12 bis 136 der reifen SAK42D entspricht.

51. Protein DN12-SAK42D gemäß Anspruch 4 sowie 48 mit Plasmi­ nogenaktivator-Wirkung und mit der Aminosäuresequenz die der Aminosäureabfolge 13 bis 136 der reifen SAK42D entspricht.

52. Protein DN13-SAK42D gemäß Anspruch 5 sowie 48 mit Plasmi­ nogenaktivator-Wirkung und mit der Aminosäuresequenz die der Aminosäureabfolge 14 bis 136 der reifen SAK42D entspricht.

53. Protein DN14-SAK42D gemäß Anspruch 6 sowie 48 mit Plasmi­ nogenaktivator-Wirkung und mit der Aminosäuresequenz die der Aminosäureabfolge 15 bis 136 der reifen SAK42D entspricht.

54. Protein DN15-SAK42D gemäß Anspruch 7 sowie 48 mit Plasmi­ nogenaktivator-Wirkung und mit der Aminosäuresequenz die der Aminosäureabfolge 16 bis 136 der reifen SAK42D entspricht.

55. Protein DN16-SAK42D gemäß Anspruch 8 sowie 48 mit Plasmi­ nogenaktivator-Wirkung und mit der Aminosäuresequenz die der Aminosäureabfolge 17 bis 136 der reifen SAK42D entspricht.

56. Protein DN17-SAK42D gemäß Anspruch 9 sowie 48 mit Plasmi­ nogenaktivator-Wirkung und mit der Aminosäuresequenz die der Aminosäureabfolge 18 bis 136 der reifen SAK42D entspricht.

57. Protein DC1-SAK42D gemäß Anspruch 10 sowie 48 mit Plasmi­ nogenaktivator-Wirkung und mit der Aminosäuresequenz die der Aminosäureabfolge 1 bis 135 der reifen SAK42D entspricht.

58. Protein DC2-SAK42D gemäß Anspruch 11 sowie 48 mit Plasmi­ nogenaktivator-Wirkung und mit der Aminosäuresequenz die der Aminosäureabfolge 1 bis 134 der reifen SAK42D entspricht.

59. Protein DC3-SAK42D gemäß Anspruch 12 sowie 48 mit Plasmi­ nogenaktivator-Wirkung und mit der Aminosäuresequenz die der Aminosäureabfolge 1 bis 133 der reifen SAK42D entspricht.

60. Verfahren zur Herstellung des Plasminogenaktivators SAK42D durch Kultivierung eines rekombinanten bakteriellen Produzen­ tenstammes unter sterilen und aerob-submersen Bedingungen in einem Nährmedium sowie durch Isolierung des bei der Expression gebildeten Proteins nach Zellaufschluß, dadurch gekennzeich­ net, daß man zur Fermentation jeweils einen rekombinanten E. coli TG1-Stamm nach einem der Ansprüche 35 bis 36 einsetzt.

61. Verfahren zur Herstellung der Plasminogenaktivatoren DNm- SAK42D sowie DCn-SAK42D (m= 10, . . ., 17; n=1, 2, 3) gemäß Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Fermentation jeweils einen rekombinanten E. coli TG1-Stamm nach einem der Ansprüche 37 bis 47 einsetzt.

62. Verfahren gemäß Anspruch 60 oder 61, dadurch gekennzeichnet, daß man den jeweils gewählten E. coli TG1-Stamm bei Tempera­ turen zwischen 28°C und 42°C für die Dauer von 4 bis 16 Stunden in einem Vollmedium mit Zusatz von 50 mg/l bis ,100 mg/l Ampicillin inkubiert, hierbei 2 bis 6 Stunden nach dem Fermentationsbeginn zum Medium Isopropylthiogalactopyranosid (Kurzbezeichnung IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 0,3 mmol/l hinzufügt und den jeweiligen Plasminogenaktivator nach Zellaufschluß durch eine Kombination aus Ionenaustausch- Chromatographie und Hydrophob-Interaktion-Chromatographie ge­ winnt.

63. Verfahren gemäß Anspruch 62, dadurch gekennzeichnet, daß man den jeweils gewählten E. coli TG1-Stamm nach Anspruch 35 bis 47 in zweifach konzentriertem TY-Medium bei 37°C inkubiert sowie 2 bis 4 Stunden nach Fermentationsbeginn IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,3 mmol/l hinzufügt.

64. Verfahren gemäß Anspruch 60 oder 61, dadurch gekennzeichnet, daß man den jeweils gewählten E. coli TG1-Stamm bei Temperatu­ ren zwischen 28°C und 42°C für die Dauer von 4 bis 16 Stunden in einem synthetischen Medium mit Zusatz von 50 mg/l bis 100 mg/l Ampicillin inkubiert, hierbei 2 bis 6 Stunden nach dem Fermentationsbeginn zum Medium IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,3 mmol/l hinzufügt und den jeweiligen Plasminogenaktivator nach Zellaufschluß durch eine Kombination aus Ionenaustausch-Chromatographie und Hydrophob-Interaktion- Chromatographie gewinnt.

65. Verfahren gemäß Anspruch 64 dadurch gekennzeichnet, daß man den jeweils gewählten E. coli TG1-Stamm nach Anspruch 35 bis 47 in einem Glukose-Mineralsalz-Medium bei 37°C inkubiert sowie 2 bis 4 Stunden nach Fermentationsbeginn IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,3 mmol/l hinzufügt.

66. Arzneimittel, enthaltend neben üblichen Hilfs- und Träger­ stoffen SAK42D, die nach dem Verfahren gemäß Anspruch 60, sowie 62 bis 65 hergestellt worden ist.

67. Arzneimittel, enthaltend neben üblichen Hilfs- und Träger­ stoffen wenigstens einen Plasminogenaktivator aus der DNm- SAK42D- beziehungsweise der DCn-SAK42D-Kollektion (m=10, . . ., 17; n=1, 2, 3), der nach dem Verfahren gemäß Anspruch 61 bis 65 hergestellt worden ist.