JPH02117694A - デスルファトヒルジン変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は変更された蛋白質、その製造方法、該蛋白質を
含有する医薬組成物及び酵素の阻害のためのその使用に
関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕水蛭ヒ
ルド・メディシナリス（Ｈｉｒｕｄ。

ｍｅｄｉｃｉｎａｌユリ−中に天然に存在する抗凝固成
分であるヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）は６５個のアミノ
酸から成り３個のジスルフィド橋を有するポリペプチド
である。このものは、１８８４年における水蛭の唾液に
ついての最初の研究及びＭａｒｋｉｎａｒｄｔ　　（Ｎ
ａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ　　４２．５９
７（１９５５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏ】、　
１９９２４　（１９７０）の先駆的研究以来長い間知ら
れていたが、ヒルジンの構造がＤｏｄ　を等（ＦＥＢＳ
　Ｌｅｔｔ、　１６５　。

１８０（１９８４）　）により解明されたのは最近のこ
とである。最も新しい知見によれば、ヒルジンはヒルジ
ン変形体（ｖａｒｉａｎｔ）　　１　（ＨＶＩ）　、ヒ
ルジン変形体２（ＨＶ２）、ヒルジンＰＡ、及び他の類
似体とじて記載される幾つかの変形体として存在する。

ヒルジンは知られている最も強力なスロンビン阻害物質
であって、凝固カスケードの他の酵素には影響を与えな
い。従来の抗凝固療法において好ましい抗凝固剤である
ヘパリンとは対照的に、ヒルジンはその作用をスロンビ
ンに対して発揮し、ヘパリンのようにアンチスロンビン
■を介して任用するのではない。ヒルジンとスロンビン
との間の相互作用は非常に高い能力をもって起こり、こ
の能力はフィブリノーゲンへの、血小板への又は７７−
ｆ−スロンビン■へのスロンビンの結合ヨリモ多オーダ
ー大である。従って、ヒルジンは低濃度においてさえ、
スロンビンのすべての相互作用及びそれらの生物学的結
果を克服することができる。

さらに、ヒルジンは低い毒性を有し、非抗原性であり、
そして腎臓を介しての生物学的に活性な形でのほとんど
完全なりリアランスを示す。

最近、ヒルジン又はヒルジン変形体をコードするｃＤＮ
Ａ及び合成遺伝子がクローン化され、そして大腸菌（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）及びサン力ロミセ
ス。

セレビシェ−狐並吐肛竺り競　ｃｅｒｅｖ　ｉｓ　１ａ
ｅ）のごとき微生物宿主において発現されている（ヨー
ロッパ特許出願Ｎｏ、１５８５６４及びＮｏ、１６８３
４２を参照のこと）。

発現生成物はＴｙｒｌ′１における硫酸モノエステル基
を欠き、そしてそれ故に「デスルファトヒルジン」（ｄ
ｅｓｕｌｐｈａｔｏｈｉｒｕｄｉｎ）　と称されるが、
これらはチロシン残基が硫酸モノエステルとして存在す
る天然ヒルジンとおよそ同じ生物活性を示す。

ヒルジンは静脈内経路及び皮下経路の両方によりヒトに
投与されている。静脈内経路により平均除去半減期は０
．８４時間でありそして投与された量の約５０％がその
ままの形で尿に排出されることが見出された。皮下投与
の後、ヒルジンの阻害レベルは少なくとも４時間血漿中
に見出された。従って、ヒルジンはヘパリンに類似する
保持時間をもって非常に短時間ＩＹ用すると考えられる
。この欠点を考慮して、生体内で一層長い半減期を示し
選択的抗スロンビン活性を有するポリペプチドが強く要
求されている。対応するポリペプチドは、日常治療に使
用できれば、深部静脈及び動脈の血栓症において既存の
療法を超える利点を有するであろう。この様な抗スロン
ビン活性ポリペプチドを提供するのが本発明の目的であ
る。

低下した抗スロンビン活性を有するヒルジン化合物に対
する強い要求も存在する。抗スロンビン活性の低下は、
スロンビンがその最も強い親和性リガンド特に血小板受
容体と相互作用するのを防止するヒルジン化合物の活性
の低下をもたらす。

しかしながら、ヒルジンの抗スロンビン活性の慎重な選
択により、それはフィブリノーゲン凝固、スロンビンの
低い親和性、を阻害するその活性を保持する。この様な
ヒルジン化合物は、フィブリンにより支配される事象で
ある血栓症に対して阻害効果を有するがしかし血小板に
支配される効果である止血に対してほとんど影響を与え
ないという利点を有する。低下した抗スロンビン活性を
有するこの様なヒルジン化合物を提供するのが本発明の
更なる目的である。

〔課題を解決するための手段〕

驚くべきことに、コアー領域における塩基性アミノ酸（
Ｌｙｓ）をコードするヌクレオチドの部位特定変異誘発
により及び／又は該領域における他の変更により惹起さ
れるヒルジンの疎水性の増加が抗スロンビン活性の低下
及び／又は生体内での半減期の延長を導くことが見出さ
れた。

従って本発明は、次のアミノ酸配列（Ｉ）：Ｈ−Ｚｏ−
Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｓｅｒ−ＧｌｙＧＩｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ
−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−
Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｚ
＋−Ｃｙｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ａｓｐ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−２，−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｖ
ａ１Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
−Ｚ＋−Ｚａ−Ｚｓ−５ｅｒＺ、、−２４−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐ
ｒ。

Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−ＯＨ（配列
中、ＺｏはＶａｌ又はジペプチド残基Ｇｌｙ−Ｖａｌも
しくはＮｅｔ−Ｖａｔ　であり、Ｚｌ　はＬｙｓ、　Ｇ
ｌｎ＋　Ａｓｎ。

Ｌｅｕ、　Ａｒｇ又はＶａｌ　であり、ＺｌはＬｙｓ、
八ｒｇ、　Ａｓｎ。

Ｖａｌ、　Ｌｅｕ又はＧｉｎであり、Ｚ３はＬｙｓ、　
Ａｒｇ＋　＾３ｎ＋Ｖａｌ又はＬｅｕであり、Ｚ４はＰ
ｒｏ又はＧｕｙであり、Ｚ、及びｚ７は相互に独立にＧ
ｌｎ、　Ａｓｎ又はＭｅｔであり、そしてＺ６は旧ｓ、
　Ｇｉｎ又はＡｓｎであり；但しＺｏがＶａｌであり、
ＺｌがＬｙｓ又はＧｌｎであり、ＺｌがＬｙｓ又はＧｌ
ｎであり、Ｚ３がＬｙｓであり、Ｚ４がＰｒｏであり、
ＺｓがＧｉｎであり、ＺｈがＧｉｎ又は旧Ｓであり且つ
Ｚ７がＡｓｎである場合を除く） を有するデスルファトヒルジン変異体、及びその塩を提
供する。

〔具体的な説明〕

本発明の変異体は、１〜５個のアミノ酸残基特に１〜４
個のアミノ酸残基について天然デスルファトヒルジン（
２０がＶａｌであり、２．．２２及びＺ３がそれぞれＬ
ｙｓであり、Ｚ４がＰｒｏであり、Ｚ５がＧｉｎであり
、Ｚ、が旧ＳでありそしてＺ７がＡｓｎである）と異る
。

本発明は特に、ＺｏがＶａｌ又はジペプチド残基Ｇｌｙ
−Ｖａｌ　もしくはＭｅｔ−Ｖａｌであり、Ｚ、がＬｙ
ｓ。

Ｇｉｎ、　Ａｓｎ又はＡｒｇであり、２２がＬｙｓ、　
Ａｒｇ、八ｓｎ。

Ｖａｌ又はＧｌｎであり、Ｚ、がＬｙｓ又はＡｒｇであ
り、Ｚ４がＰｒｏ又はＧｕｙであり、Ｚ、がＧｌｎ又は
Ｍｅｔであり、Ｚ６が旧Ｓ又はＡｓｎであり、そしてＺ
。

がＡｓｎ又はＭｅｔであり；但しＺｏがＶａｌであり、
Ｚ、がＬｙｓ又はＧｌｎであり、ＺｌがＬｙｓ又はＧｌ
ｎであり、Ｚ３がＬｙｓであり、Ｚ、がＰｒｏであり、
Ｚ、がＧｉｎであり、Ｚ６が！ｌｉｓであり且つＺ７が
Ａｓｎである場合を除＜−′　　　　−工　（Ｉ）のデ
スルファトヒルジン変異体、及びその塩に関する。

この様なデスルファトヒルジン変異体の例として、（Ａ
ｓｎ”　）−デスルファトヒルジン、（Ａｓｎ”　）−
デスルファトヒルジン、（Ｖａｌ”　）デスルファトヒ
ルジン、（Ｇｌｙ”　）　−デスルファトヒルジン、（
Ｍｅｔ”　）−デスルファトヒルジン、（Ｍｅｔ”　）
−デスルファトヒルジン、〔八５ｎ５１　）−デスルフ
ァトヒルジンＡ　ｒｇ　４　７　）−デスルファトヒル
ジン、〔Ｇｌｎ”Ｇｌｎ”、Ａｒｇ”　）−デスルファ
トヒルジン、〔八ｒｇ３ｂ、Ａｒｇ４１　）−デスルフ
ァトヒルジン〔ＡｒｇＺ’ｌ，＾ｒ　ｇ　４　ｊ　）−
デスルファトヒルジン、グリシル−〔Ｇｌｎ２７＋Ｇ１
ｎ”、Ａｒｇ”　）−デスルファトヒルジン及びメチオ
ニル−〔Ｇｌｎ”、Ａｒｇ”　）デスルファトヒルジン
が挙げられる。

本発明の化合物は遊離の形で存在し得るが、しかしさら
にそれらの塩の形でも存在し得る。これらは幾つかのア
ミノ酸残基中に遊離アミノ基を含有するので、本発明の
化合物は酸付加塩ともて存在し得る。適当な酸付加塩は
特に、常用の医薬として許容される塩との薬理学的に許
容される塩である。代表的な無機酸，は、ハロゲン化水
素酸（例えば塩酸）、そしてさらに硫酸、リン酸及びピ
ロリン酸である。代表的な有機化合物は特にアレーンス
ルホン酸（例えばベンゼンスルホン酸又はｐ−トルエン
スルホン酸）、又は低級アルカンスルホン酸（例えばメ
タンスルホン酸）、さらにはカルボン酸、例えば酢酸、
乳酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リンゴ酸、酒石酸
、アスコルビン酸、及びクエン酸である。しかしながら
、本発明の化合物はまた幾つかのアミノ酸残基中に遊離
カルボキシル基を含有し、該カルボキシル基はペプチド
全体に酸性を付与するから、これらはまた、無機塩基又
は有機塩基との塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、
カルシウム塩もしくはマグネシウム塩、又はアンモニア
もしくは薬理学的に許容される窒素含有有機塩基由来の
アンモニウム塩の形で存在することもできる。しかしな
がら本発明の化合物は遊離カルボキシル基及び遊離アミ
ノ基を同様に含有するから、これらはまた内部塩の形で
も存在し得る。薬理学的に許容される塩が好ましい。

本発明のデスルファトヒルジン変異体の製造方法は、プ
ロモーター、シグナルペプチドをコードする第一ＤＮＡ
配列（該プロモーターは該第一ＤＮＡ配列に作用可能に
連結されている）、デスルファトヒルジン変異体をコー
ドする第二ＤＮＡ配列（該第一ＤＮＡ配列と該第二ＤＮ
Ａ配列とは適切なリーディングフレーム中に連結されて
いる）、及び転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列か
ら成る発現カセットを含んで成るハイブリドベクターに
より形質転換されている微生物宿主株を培養し、該デス
ルファトヒルジン変異体を単離し、そして所望により遊
離カルボキシ基及び／又はアミノ基を有する得られたポ
リペプチドを塩に、又は得られた塩を遊離化合物に転換
することを含んで成る。

適当な微生物宿主株には、例えばバシルス・ズブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の株、大腸
菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ）の株及びサツ
カロミセス・セレビシエーー住主匹ｌ■μす９狙　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）の株が含まれる。

形質転換された微生物宿主株は、当業界において知られ
ている方法を通用しながら、資化性の炭素源、窒素源及
び無機塩を含有する液体培地中で培養される。

種々の炭素源を使用することができる。好ましい炭素源
の例として資化性炭水化物、例えばグルコース、マルト
ース、マンニトール、フラクトースもしくはラクトース
、又は酢酸塩、例えば酢酸ナトリウムが挙げられ、これ
らは単独で又は適当な混合物として使用することができ
る。適当な窒素源には例えばアミノ酸、例えばカザミノ
酸、ペプチド並びに蛋白質及びその分解生成物、例えば
トリプトン、ペプトン又は肉エキス、さらには酵母エキ
ス、マルトエキス、コーンステイープリカ、並びにアン
モニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム又は硝酸アンモニウムが包含され、これらは単独で又
は適当な混合物として使用することができる。使用し得
る無機塩には例えばナトリウム、カリウム、マグネシウ
ム及びカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩及び炭酸
塩が包含される。さらに、栄養培地はまた増殖促進物質
を含有することができる。増殖を促進する物質には例え
ば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等、又は個々の
アミノ酸が包含される。

ハイブリドベクターにより形質転換された微生物宿主細
胞は該ベクターを喪失する傾向を有する。

この様な細胞は選択条件下で、すなわち、ハイブリドベ
クターにコードされた遺伝子の発現が増殖のために必要
であるような条件下で増殖せしめなければならない。現
在使用されておりそして本発明のハイブリドベクター（
後記）中に存在するほとんどの選択マーカーはアミノ酎
生合成又はプリン生合成の酵素をコードする遺伝子であ
る。これは、対応するアミノ酸又はプリン塩基を欠く合
成最少培地の使用を必要とする。しかしながら、適当な
殺生物剤に対する耐性を付与する遺伝子（例えばアミノ
−グリコシドＧ４１８に対する耐性を付与する遺伝子）
を同様に使用することもできる。抗生物質耐性遺伝子を
含有するベクターにより形質転換された宿主は対応する
抗生物質を含有する複合培地中で増殖せしめ、これによ
り一層速い増殖速度及び−層高い細胞密度が達成される
。

構成的プロモーターを有するハイブリドベクターを含有
する宿主細胞は該プロモーターにより制御される変異体
遺伝子を、誘導を必要としないで発現する。しかしなが
ら、デスルファトヒルジン変異体遺伝子が制御されるプ
ロモーターの制御のものにある場合には、ｍＲＮＡ転写
物の最大レベルが得られるように増殖培地の組成を適合
させなければならない。すなわち、酵母においてＰ　１
１０５プロモーターを使用する場合、このプロモーター
の抑制解除のためには低濃度の無機塩を含有しなければ
ならない。

培養は常法により行われる。培養条件、例えば培地のｐ
Ｈ１及び発酵時間は最高レベルのデスルファトヒルジン
が生産されるように選択される。選択された酵母又は大
腸菌株は好ましくは好気的条件下で、液中培養により、
振とう又は撹拌しながら、約２５°Ｃ〜３５°Ｃ５好ま
しくは約２８°Ｃの温度において、４〜７のｐＨにおい
て、例えば約ｐＨ５において、そして１２時間〜３日間
、好ましくはデスルファトヒルジン変異体の満足すべき
収量が得られる期間にわたり培養される。

使用される宿主株、プロモーター及びシグナルペプチド
に関係なく、生産されたデスルファトヒルジン変異体の
ほとんどが培地又はペリプラズム空間に分泌され、わず
かな部分のみが細胞内に結合して残る。分泌される化合
物と細胞結合化合物との正確な比率は発酵の条件に依存
する。

デスルファトヒルジン変異体は常用手段により単離され
得る。例えば、最初の段階で遠心分離により培養液から
細胞を分離する。ポリエチレンアミノでの処理によるほ
とんどの非蛋白質性物質の除去及び硫酸アンモニウムで
溶液を飽和することによる蛋白質の沈澱により、前記の
得られる上清を分泌されたデスルファトヒルジン変異体
について濃縮することができる。宿主の蛋白質は、もし
存在するとすれば、酢酸で酸性化する（例えば０．１％
、ｐ１１４〜５）ことによって沈澱せしめることもでき
る。ｎ−ブタノールによって酢酸上清を抽出することに
より、デスルファトヒルジン変異体の更なる濃縮を達成
することができる。他の精製段階には、例えば脱塩、ク
ロマトグラフ法、例えばイオン交換クロマトグラフィー
、ゲル濾過クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィ
ー）ＩＰＬＣ１逆相）ＩＰＬｃ等が含まれる。蛋白質混
合物の成分の分離はまた、透析により、ゲル電気泳動も
しくはキャリヤー−フリー電気泳動により電荷に従って
、適当なセファデックスカラムにより分子サイズに従っ
て、例えば抗体特にモノクローナル抗体又は適当なアフ
ィニティークロマトグラフィー用キャリヤーに連結され
たスロンビンを用いるアフィニティークロマトグラフィ
ーにより、あるいは他の方法、特に文献から知られる方
法により、行うこともできる。

ペリプラズム空間に蓄積したデスルファトヒルジン変異
体を単離することが好ましい場合には、幾つかの補完的
精製段階が必要である。すなわち、デスルファトヒルジ
ン変異体は、該生成物の放出を可能にする細胞壁の破壊
を生じさせる手段により、すなわち細胞壁の酵素的除去
により、化学薬物、例えばチオール試薬もしくはＥＤＴ
Ａによる処理により、又は細胞壁を浸透圧ショックにか
けることにより、回収される。

精製工程において得られる両分中のデスルファトヒルジ
ン変異体活性を検出するために、抗−ヒルジン抗体又は
抗−デスルファトヒルジン抗体（例えばハイブリドーマ
細胞から得られるモノクローナル抗体）を用いる試験、
スロンビン試薬（Ｍ、Ｕ、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ（’Ｗ集
）　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ八ｎ
ａｌｙｓｉｓへＶｏｌ　　ＩＩ　、ｐ３１４−３１６．
Ｖｅｒｌａｇ　　Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（Ｆ
ＲＧ）１９８３　）　、又は血液凝固試験（Ｆ、Ｍａｒ
ｋｗａｒｄｔ等、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ、　４
７，２２６（１９８２））を用いることができる。

用いる方法に依存して、本発明の化合物は遊離の形で、
酸付加塩の形で、内部塩の形で、又は塩基との塩の形で
得られる。遊離化合物は既知の方法で酸付加塩又は塩基
との塩から得ることができる。医薬として許容される酸
付加塩は遊離化合物から酸との反応により、例えば上記
の塩を形成する酸との反応により、そして蒸発又は凍結
乾燥により得られる。内部塩はｐｕを適当な中性点に調
整することにより得られる。

本発明の形質転換された微生物宿主は、◎　プロモータ
ー、シグナルペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列（該
プロモーターは該第一ＤＮＡ配列に作用可能に連結され
ている）、デスルファトヒルジン変異体をコードする第
二ＤＮＡ配列（該第一ＤＮＡ配列と該第二ＤＮＡ配列と
は適切なリーディングフレーム中に連結されている）、
及び転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列から成る発
現カセットを含んで成るハイブリドベクターを用意し； ◎　該ハイブリドベクターにより微生物宿主株を形質転
換し；そして ◎　未形質転換細胞から形質転換された微生物宿主細胞
を選択する； 段階を含んで成る組換ＤＮＡ技法により調製することが
できる。

溌Ｊヒ乞第一二 本発明のハイブリドベクターは、プロ゛モーターシグナ
ルペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列（該プロモータ
ーは該第一ＤＮＡ配列に作用可能に連結されている）、
デスルファトヒルジン変異体をコードする第二ＤＮＡ配
列（該第一ＤＮＡ配列と該第二ＤＮＡ配列とは適切なリ
ーディングフレーム中に連結されている）、及び転写停
止シグナルを含有するＤＮＡ配列から成る発現カセット
を含んで成る。

適当なベクターの選択は、形質転換のために与えられる
微生物宿主細胞により決定される。適当な宿主は上に記
載したもの、特にサツカロミセス・セレビシェ−の株、
並びに細菌株、特に大腸菌の株及びバシルス・ズブチリ
スの株である。

大腸菌の株でのデスルファトヒルジン変異体遺伝子の発
現のために適当なベクターは、例えば、バクテリオファ
ージ、例えばバクテリオファージλの誘導体、又はプラ
スミド、例えばプラスミドｃｏｌＥ及びその誘導体、例
えばｐＭＢ９．　ｐｓＦ２１２４−。

ｐＢＲ３１７もしくはｐＢＲ３２２である。適当なベク
ターは完全なレプリコン及びマーカー遺伝子を含有し、
このマーカー遺伝子は発現プラスミドにより形質転換さ
れた微生物の単離及び同定を表現型性質により可能にす
る。適当なマーカー遺伝子は微生物に例えば重金属、抗
生物質、例えばアンピシリン又はテトラサイクリン等に
対する耐性を付与する。

大腸菌において発現カセットを制御するために幾つかの
プロモーターを使用することができる。

特に、強力に発現される遺伝子のプロモーターが使用さ
れる。適当なプロモーターはｌａｃプロモーター　ｔａ
ｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＩＰＰプロモ
ーター、さらにはファージスＮプロモーター又はファー
ジλｐＬプロモータ、等である。本発明において、大腸
菌で使用するための好ましいプロモーターはＩｐｐプロ
モーター又はｌａｃプロモーターである。

Ｓ、セレビシェ−中での複製及び発現のために適当なベ
クターは酵母複製起点及び酵母用選択遺伝子マーカーを
含有する。酵母複製起点、例えば染色体自律複製セグメ
ン）（ａｒｓ）を含有するハイブリドベクターは形質転
換の後酵母細胞内に染色体外に保持され、そして有糸分
裂の間に自律的に複製する。さらに、酵母２μプラスミ
ドＤＮＡに対して相同な配列を含有するハイブリドベク
ターを用いることができる。この様なハイブリドベクタ
ーは細胞内にすでに存在する２μプラスミド中に組換に
より組み込まれ、又は自律的に複製する。酵母用のマー
カー遺伝子は特に、宿主に抗生物質耐性を付与する遺伝
子、又は栄養要求性酵母変異株の場合には宿主の欠陥を
補完する遺伝子である。対応する遺伝子は、例えば、抗
生物質シクロへキシミドに対する耐性を付与し、又は栄
養要求性酵母変異株において原栄養性を提供するもので
あり、例えば用県、ｕ弗、肛録又は工遺伝子である。

好ましくは、酵母ハイブリドベクターはさらに細菌宿主
、特に大腸菌用の複製起点及びマーカー遺伝子を含有し
、その結果ハイブリドベクター及びその前駆体の作製及
びクローニングを大腸菌中で行うことが可能となる。酵
母中での発現のために適当なプロモーターは例えばＡＤ
ＨＩ　、　　ＡＤｌｌＩ［又はＰＩ（０５遺伝子のプロ
モーター、そしてさらに解糖に関与するプロモーター、
例えばＰＧＫプロモーター又はＧＡＰプロモーターであ
る。

シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列（「シグナル
配列」）は通常分泌されるポリペプチドをコードする微
生物宿主の遺伝子に由来する。

宿主微生物として大腸菌が使用される場合、ｏｍｐＡ。

ｔｐｐ　、マルトース結合蛋白質、λ受容体、ロイシン
結合蛋白質又はβ−ラクタマーゼシグナル配列を選択す
ることができる。酵母において使用するために、水蛭の
ゲノムＤＮＡから得られるヒルジンシグナル配列を選択
することができる。酵母において使用するための一層好
ましいシグナル配列は例えば、酵母インベルターゼ、β
−ファクターフェロモンペプチダーゼ（ＫＥＸＩ）、「
キラー・トキシンＪ及び抑制性酸性ホスファターゼ（Ｐ
Ｈ０５）の各遺伝子のシグナル及びプレプロ配列、並び
にアスペルギルス・アワモリ旦■肛紅旦並　ａｗａｍｏ
ｒｉ）からのグルコアミラーゼシグナル配列である。あ
るいは、使用されるプロモーター（例えば江邦）に天然
に連結されているシグナル配列（もし存在するなら）の
部分とヒルジンシグナル配列の部分との連結により融合
シグナル配列を作製することができる。シグナル配列と
デスルファトヒルジン変異体のアミノ酸配列との間の正
確な開裂を可能にする組み合わせが好ましい。追加の配
列、例えば、特異的プロセシングシグナルを担持するか
又は担持しないプロ配列又はスペーサー配列を構成物中
に含有せしめることにより前駆体分子の正確しくは、転
写停止のための適切なシグナルを含有する選択された微
生物宿主由来の３′−フランキング配列である。適当な
３′−フランキング配列は、例えば、使用されるプロモ
ーターに天然にリンクしている遺伝子のそれである。

本発明のハイブリドベクターは、当業界において知られ
ている方法により、例えばプロモーターシグナルペプチ
ドをコードする第一ＤＮＡ配列（該プロモーターは該第
一ＤＮＡ配列に作用可能に連結されている）、デスルフ
ァトヒルジンＫＮ体をコードする第二ＤＮＡ配列（該第
一ＤＮＡ配列と該第二ＤＮＡ配列とは適切なリーディン
グフレーム中に連結されている）、及び転写停止シグナ
ルを含有するＤＮＡ配列から成る発現カセットを含んで
成るハイブリドベクター、又は該ハイブリドベクターの
前記構成要素を、選択遺伝マーカー及び選択された微生
物宿主用の複製起点を含有するＤＮＡ断片に、所定の順
序に連結することを含んで成る方法により製造すること
ができる。

本発明のデスルファトヒルジン変異体をコードするＤＮ
Ａは当業界において知られている方法により製造するこ
とができる。このＤＮＡの製造方法は、鏡デスルファト
ヒルジン遺伝子から不所望のアミノ酸残基のコドンを含
んで成るＤＮＡの部分を切除し、そしてこれを、前記コ
ドンが所望のアミノ酸残基をコードするデオキシリボヌ
クレオチドトリプレットで置き換えられているＤＮＡセ
グメントにより置き換えることを含むか、あるいは部位
特定変異誘発により変異を行うことを含む。

デスルファトヒルジン変異体をコードするＤＮＡの調製
のため、デスルファトヒルジンＤＮＡの部分の切除は制
限酵素を用いて行うことができる。

この方法の前提条件は、変更されるべきコドンの近傍で
適当な制限部位が利用できることである。

例えば、不所望のアミノ酸のコドンを含有する小制限断
片をエンドヌクレアーゼによる開裂によって除去する。

対応する二本鎖ＤＮＡ配列を例えば化学合成により調製
し、この場合に所望のアミノ酸をコードするトリプレッ
トを使用する。ＤＮＡ断片を残りの長い断片に適切な方
向に連結して変異体をコードする二本鎖ＤＮＡ配列を得
る。この得られた二本鎖ＤＮＡは、便宜上及び該変異体
遺伝子の取り扱を容易にするため、クローニングベクタ
ーへの挿入及びクローニングを可能にする適当なリンカ
−を備えたより大きなりＮＡ断片中に含まれているのが
好ましい。

本発明の好ましい態様において、デスルファトヒルジン
変異体をコードするＤＮＡの調製は部位特定変異誘発に
より行われる。この方法はインビトロ変異誘発法であっ
て、この方法によりクローン化ＤＮＡの領域中の定めら
れた部位を変えることができるＣＭ、Ｊ、Ｚｏｌｌｅｒ
及びＭ、Ｓｍ１ｔｈ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、
１０（し、４６８（１９８３）　ＨＤ、Ｂｏｔｓｔｅｉ
ｎ及びり。

５ｈｏｒｔｌｅ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２９．１１９３（
１９８５）を参照のこと］。

変異誘発は、完全なデスルファトヒルジン遺伝子に対し
て、又は不所望のアミノ酸のコドンを含有する該遺伝子
の機能的部分に対して行うことができる。変異誘発の後
、変異した機能的部分をデスルファトヒルジン遺伝の他
の部分に連結して完全なデスルファトヒルジン変異体Ｄ
ＮＡを得る。

デスルファトヒルジン遺伝子又はその機能的部分を変異
せしめる方法は、デスルファトヒルジン遺伝子又はその
部分を含んで成る単鎖ＤＮＡ又は単鎖遺伝子を、変異を
指令するミスマツチを除くばか変異されるべきバイブリ
ド遺伝子の領域に対して相補的であるオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドブライマーにハイブリダイズせしめ、こ
のハイブリダイズしたオリゴデオキシリボヌクレオチド
をプライマーとして用いて相補的ＤＮＡ鎖の合成を開始
し、生ずる（部分的）二本鎖ＤＮＡを受容体微生物株に
形質転換し、この微生物を培養し、そして変更された（
変異体）デスルファトヒルジン遺伝子を有するＤＮＡを
含有する形質転換体を選択することを特徴とする。

ノー、パ− 本発明はさらに、プロモーター、シグナルペプチドをコ
ードする第一ＤＮＡ配列（該プロモーターは該第一ＤＮ
Ａ配列に作用可能に連結されている）、デスルファトヒ
ルジン変異体をコードする第二ＤＮＡ配列（該第一ＤＮ
Ａ配列と該第二ＤＮＡ配列とは適切なリーディングフレ
ーム中に連結されている）、及び転写停止シグナルを含
有するＤＮＡ配列から成る発現カセットを含んで成るハ
イブリドベクターにより形質転換された微生物宿主株；
並びに該ハイブリドベクターにより微生物宿主を形質転
換することを特徴とする前記形質転換された微生物宿主
株の製造方法に関する。

微生物宿主株は前記のものである。本発明のハイブリド
ベクターによる形質転換は例えば文献に記載されている
方法により、例えばＳ、セレビシェ−については＾、旧
ｎｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、互、　１９２９　（１９７８）に記載されてい
るようにして、Ｂ、ズブチリスについてはＡｎａｇｎｏ
ｓ　ｔｏｐｏｕ　Ｉｏｓ等、Ｊ、ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、
、　８１，７４１＜１９６１）に記載されているように
して、そして大腸菌についてはＭ、Ｍａｎｄｅｌ等、Ｊ
、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　５３．１５９（１９７０）に記
載されているようにして行われる。形質転換された宿主
細胞の単離は、例えば、発現プラスミド中に含まれてい
るマーカー遺伝子がそれに対して耐性を付与する殺生物
剤が添加された選択栄養培地から有利に行われる。例え
ば、ハイブリドベクターがａｍｐ”遺伝子を含有する場
合、栄養培地にアンピシリンを添加する。ハイブリドベ
クターを含有しない細胞はこの様な培地中で破壊される
。

区粂■双腹 本発明に従って得られるデスルファトヒルジンの新奇な
変異体は価値ある薬理学的性質を有し、そしで水蛭から
抽出されたヒルジンと同様に、予防的に又は特に治療法
に使用され得る。

本発明のデスルファトヒルジン変異体は、天然ヒルジン
と同様に、スロンビンの強力な阻害剤である。例えば、
これらは１０−’Ｍ−１０−”　Ｍ（７）Ｋｉ値（デス
ルファトヒルジン変異体−スロンビン複合体解離定数）
を有する。これらのデスルファトヒルジン変異体はスロ
ンビンに対して完全に特異的であり、そして血液凝固系
の他のプロテイナーゼと相互作用を示さない。毒性は極
めて低い。同様に、過敏反応又はアレルギー反応は観察
されない。さらに、本発明の変異体は天然デスルファト
ヒルジンに匹敵するか又はそれより良好な生体内作用持
続性を有する。

従って、本発明の新規なデスルファトヒルジン変異体は
天然ヒルジンと同様にして、術後血栓症の予防を含む血
栓症及び血栓塞栓症の治療及び予防のため、急性ショッ
ク（例えば敗血性ショック又は多外傷性ショック）の療
法のため、消費凝血異常症の療法のため、血液透析にお
いて、血液分離において、及び体外血液循環において使
用することができる。

本発明はまた、本発明の化合物の少なくとも１種類又は
その塩を、場合によっては医薬として許容されるキャリ
ヤー及び／又は助剤と一緒に含んで成る医薬組成物に関
する。

これらの組成物は、それが例えば非経口的に、例えば静
脈内に、皮肉に、皮下にもしくは筋肉内に、又は局所的
に投与される場合、特に上記の症状において使用され得
る。

本発明はまた、ヒト又は動物体の予防的又は治療的処置
のため、特に前記の臨床症状に対して、特にヒト又は動
物の体内又は体外での血液の凝固を阻害するための、本
発明の新規化合物の使用及び該化合物を含有する医薬組
成物に関する。

投与量は特に、特定の投与形態及び治療又は予防の目的
に依存する。個々の投与量のサイズ及び投与方法は病気
の特定の症例の個々の判断により最もよく決定される。

この目的のために必要な関連ある血液因子の決定方法は
当業者によりよく知られている。通常、注射の場合、本
発明の化合物の療法的有効量は約ｏ、ｏｏｓ〜約０．１
　ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。約０．０１〜約０．０
５■／ｋｇ体重の範囲が好ましい。投与は静脈内注射、
筋肉的注射又は皮下注射により行われる。従って、単位
形の非経口投与用医薬組成物は投与形態に依存して約０
．４〜約７．５■の本発明の化合物を含有する。活性成
分に加えて、これらの医薬組成物は通常、緩衝剤、例え
ば約３．５〜７のｐＨを維持することが意図されるリン
酸緩衝剤、そしてさらに等張性を調整するための塩化ナ
トリウム、マンニトール又はソルビトールを含有する。

これらは凍結乾燥形でも溶解した形でもよく、溶液は有
利には抗細菌活性防腐剤、例えば０．２〜０．３％の４
−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル又はエチルエステ
ルを含有していてもよい。

局所投与用組成物は水溶液、ローション又はゲル、油性
溶液もしくは懸濁液、又は油を含有するかもしくは乳化
した軟こうの形であることができる。水溶液の形の組成
物は例えば、本発明の活性成分又はその医薬として許容
される塩をｐＨ４〜６．５の水性緩衝液に溶解し、そし
て所望により追加の活性成分、例えば抗炎症剤及び／又
はポリマー結合剤、例えばポリビニルピロリドン、及び
／又は防腐剤を添加することにより得られる。活性成分
の濃度は、１０戚の溶液又は１０ｇのゲル当り約０．１
〜約１．５■、好ましくは０．２５〜１．０■である。

局所投与のための油状投与形は、例えば、本発明の活性
成分又はその医薬として許容される塩を、油中に、場合
によっては湿潤剤、例えばステアリン酸アルミニウム及
び／又は１０未満のＨＬＢ値（「親水性−親脂性」バラ
ンス）を有する界面活性剤、例えば多価アルコールの脂
肪酸モノエステル、例えばグリセリンモノエステル、ソ
ルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステアレート
又はソルビタンモノオレエートを添加して懸濁すること
により得られる。脂肪含有軟こうは例えば、本発明の活
性成分又はその塩を伸展性脂肪基剤中に、場合によって
は１０未満のＨＬＢ値を有するテンシト（ｔｅｎｓ　１
ｄｅ）を加えながら懸濁することにより得られる。活性
成分の濃度は約１０ｇの基剤中に約０．１〜約１．５　
ｍｇ、好ましくは０．２５〜１．０　ｍｇである。

ヒト又は動物の体での直接医療用に意図される前記の組
成物に加えて、本発明はまたヒト又は動物の生体外での
医療的使用のための医薬組成物に関する。この様な組成
物は特に、体外での循環又は処理（例えば、体外循環又
は人工腎臓での透析）、保存又は修飾（例えば血液分離
）にかけられるべき血液への抗凝固添加削として使用さ
れる。これらの組成物、例えばストック溶液又は単位投
与形の組成物は前記の注射用組成物の組成に類似する。

しかしながら、活性成分の量又は濃度は有利には処理さ
れるべき血液の体積に基き、さらに正確にはスロンビン
含量に基く。これに関して、本発明の活性成分（′ｆ１
離形）は約５倍重量のスロンビンを完全に不活性化し、
比較的多量でも生理的に無害であり、そして高濃度にお
いてさえ循環器から迅速に除去され、それ故に例えば輸
注の間でも過剰投与の危険がないことを心に留めるべき
である。

特定の目的に依存して、適当な投与量は血液！当り約０
．０１〜約１．０■の活性成分であるが、上限を超えて
も危険はない。

本発明は特に、例に記載するデスルファトヒルジン変異
体、ハイブリドベクター、該ハイブリドベクターにより
形質転換された微生物宿主株、及びこれらの製造方法に
関する。

次に、図面に言及しながら本発明の種々の態様を記載す
る。

スＡしλ餓 班玉　ブースミドＭＬ３５０の　−１１（第１図参照）
ａ）ブースミドＩｌＮ−１１第一ＯＡ−２のＤＮＡの１
０ｇのプラスミドｐｌＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ−２（Ｊ、
Ｇｈｒａｙｅｂ等、ＥＭＢＯ−Ｊ、　３．２４３７（１
９８４）　）を２５１１１の１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｇ　　（ｐＨ７，５）　、５０ｍＭ　ＮａＣ１及び１１
００ｕ／戚ゼラチンに溶解し、そして制限エンドヌクレ
アーゼＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ１により消化する。この
ン容液をＴＮＥに調整し、そしてフェノール／クロロホ
ルムにより抽出する。ＤＮＡをエタノールにより沈澱せ
しめる。ベクターＤＮＡ　ｐｌＮ−１１第一ｏ糟ｐ＾−
２／ＥｃｏＲＩ　／　ＢａｍＨＩをアガロースでの電気
泳動後にゲル溶出により単離する。

ｂ）ブースミドＭＬ３１０のＤＮＡの２゛′２０ｐｇの
プラスミドｐＭＬ３１０　（ヨー口・ンノマ特許出願Ｎ
ｏ、１６８３４２を参照のこと）を５０４の１００ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−１１ＣＮ（ｐｌ＋　７．５　）　、５０ｍ
Ｍ　ＮａＣ１及び１００μｇ／戚ゼラチン中で制御辰エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ　Ｉ＝こよ
り消化する。溶液をＴＮＥに調整し、そしてフェノール
／クロロホルムにより抽出スる。ＤＮＡをエタノールに
より沈澱せしめる。アガロース中でのゲル電気泳動の後
ゲル溶出によりＦｌ−Ｆｚ−ＤＮＡ（ヒルジン遺伝子）
を単離する。

１１！ｇのＦ、−Ｆ、−ＤＮＡ（ヒルジン遺伝子）／Ｅ
ｃｏＲＩ／ＢａｍＨ１及び３０鱈のベクターＤＮＡ　ｐ
ｌＮ−ＩＩ［−ｏｍｐＡ−２／　ＥｃｏＲＩ　／　Ｂａ
ｍＨＩを５０１１１の１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃ４
　　（ｐｉｔｌ−５）　、５０＋＋＋Ｍ　ＮａＣ１及び
１００ｘ／Ｉｎ１．ゼラチンに溶解し、そしてＴ　ＨＥ
に調整する。溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し
、そしてＤＮＡをエタノールで沈澱せしめる。ＤＮＡ沈
澱物を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，８）
　、１０ｍＭ　Ｍｇ（、ｅｚ　、１０ｎ＋Ｍ　ＤＴＴ、
０゜５ｍＭＡＴＰ及び１００ｎ／／！ゼラチンの？容ン
＆２０ｔｔｌに？容解し、そして２５ユニツト／ａｌの
Ｔ、　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）により１５°
Ｃにて３時間処理する。こうして、ＦＩ　　Ｆｇ　　Ｄ
ＮＡ（ヒルジン遺伝子）が挿入された組換プラスミドｐ
ＭＬ３５Ｑを形成する。

ｄ〕ズブ−ミ　ＭＬ３５０による　　　ＩＩ　８１０１
のＭａｎｄｅｌ等（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　５３；１
５９（１９７０）により記載されているようにして、カ
ルシウムにより処理された大腸菌１１８１０１を調製す
る。組換プラスミド′ｐ？ＩＬ３５０を含有するＣ）で
得られた溶液を６５°Ｃにて１０分間加熱してＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを不活性化し、そして次に３７°Ｃに冷却し
た。１０μｌの得られる反応混合物を１０ｍＭ　ＭｇＣ
Ｑ　ｚ及び１０ｍＰＩ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ
７，５）中の大腸菌１１８１０１１１Ｉ胞１５０μｌに
加えて全容量２００μｌとする。

次に、この混合物を３０分間冷却し、４２°Ｃにて２分
間加熱し、そして次に１　ｄのし一培地（ノマクレトリ
プトン１０ｇ／Ａ、バクト酵母エキス５ｇ／Ａ、ＮａＣ
β５　ｇ　／　ｉ、グルコース５ｇ／ｌ、アンピシリン
０．１ｇ／ｌ）中で３７°Ｃにて５０分間放置する。

次に、この混合物を、６０Ｉ４／ｍのアンピシリン（セ
ルバ）を含有する５枚の寒天プレート（マ、ンコンキー
寒天、デイフコ）上に０．２　ｍｆｌずつ撒く。

次に、この寒天プレートを３７°Ｃにて１６〜１８時間
保持する。形質転換された大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞のアン
ピシリン耐性コロニー１８５個を得る。

ｅ）Ｆ　−Ｆ　−０ＮＡ　　Ａ　　　　コロニーの６個
の形質転換されたコロニー（例１ｄ）をニトロセルロー
スフィルター８８５　（Ｓｃｈｌｅｃｉｃｈｅｒ及び５
ｃｈｕｌｌ）に押し付ける。Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨ
ｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ
、ＵｓＡ、　　７２，３９６Ｈ１９７９）　　）　　の
方法に従ってコロニーを溶解しそしてそれらの変性され
たＤＮＡをフィルター上に固定する。次に、フィルター
のプレハイブリダイゼーションを２０戚（フィルター当
り）の４　Ｘ５ＥＰ　　（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃ
ｊ！（ｐＨ８）、１５０ｎ＋Ｍ　ＮａＣ１、１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡの溶液〕、０．１％（−／す）フィコール４００
（ファルマシア）、０．５％ＳＤＳ、５０鱈／ｄ変性ウ
シ胸腺ＤＮＡ中で６４°Ｃにて４時間行う。次に、ニト
ロセルロースフィルターを２０ｄ（フィルター当り）の
５　Ｘ５ＥＴ　（ｗ／ｖ）０．１％（ｗ／ｖ）フィコー
ル４００．０．２％ｓｏｓ及び５０Ｉ１１／ｌ１ｆｆｉ
変性ウシ胸腺ＤＮＡ中で６４°Ｃにて１６時間３２ｐ放
射性標識プローブ（フィルター当り約１０３〜１０’　
Ｃｅｒｅｎｃｏｖ　ｃｐｌＩ＋）により処理する。オリ
ゴヌクレオチド４６／６４相補的、１１５８．９６／６
７及び１５４／６４相補的から成る混合物（ヨーロッパ
特許出１１ｉＮｔｌＬ１６８３４２を参照のこと）をプ
ローブとして使用する。

次に、フィルターを２　Ｘ５ＦＦ　、　０．２％ＳＤＳ
中で室温にて２回（最初３０分間、次に６０分間）洗浄
する。次に、フィルターを３聞ペパー（ワットマン）の
間で乾燥し、そして−８０°Ｃにて強化スクリーン（イ
ルフォード）と共にＸ−線フィルム（フジ）上に１〜２
日間置く。

得られるオートラジオグラムは５個の陽性コロニー（ク
ローン）を示し、これらは更なる処理のために使用する
ことができ、その１つをｐＭＬ３５０と命名する。

貫ｌ　ブースミ　′ＢＨ１０９の　−１＋プラスミドｐ
ＭＬ３５０はマルチクローニングリンカ−（ＥｃｏＲＩ
　、旧ｎｄ　ＩＩＩ　、　Ｂａ５Ｈ１部位）を含有する
プラスミドｐｌＮ−Ｉ［［−ｏｍｐＡ−２に由来するた
め、成熟ヒルジン遺伝子の前にＡｌａ、　Ｇｉｎ、　Ｐ
ｈｅ、　Ｍｅｔをコードする１２個の追加の塩基対を含
有する。成熟デスルファトヒルジンを発現せしめるため
、２７ｍａｒオリゴヌクレオチドを用いるインビトロ変
異誘発によりこれらの１２塩基対をループアウトする。

ａ　）　ＭＬ３５０　　Ｘｂａ　Ｉ　ＢａｍＨＩ　Ｓ　
Ｉ　）の５ｎのプラスミドｐＭＬ３５０をエンドヌクレ
アーゼＸｂａ　Ｉ及びＢａｍＦＩ　Ｉにより消化する。

２個のＸｂａ　第一ＢａｍＨＩ断片（３１）の大きい方
をアガロース上での電気泳動の後ゲル溶出により単離し
そして１ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　　（ｐＨ７，５）　
、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解する。

ｂ　）　ＭＬ３５０　　Ｐｖｕ　Ｔ　（Ｓ　Ｕ　）の５
河のプラスミドｐＭＬ３５０をエンドヌクレアーゼＰｖ
ｕ　Ｉにより消化する。次に、線状化されたＤＮＡｐＭ
Ｌ３５０／　Ｐｖｕ　１を３ユニツトの腸アルカリホス
ファターゼ（ベーリンガー）により３７°Ｃにて３０分
間消化する。この溶液を６５℃にて６０分間加熱するこ
とにより酵素を不活性化する。線状ｐＭＬ３５０／　Ｐ
ｖｕｌ　（Ｓ　ＩＩ　）ＤＮＡをアガロース上での電気
泳動の後ゲル溶出により単離し、そして１　ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＩＪ！　　（ｐｌ＋１．５　）　、０．１ｍＭ
　ＥＤＴＡに？容量する。

Ｃ）第１ゴヌクレオチ゛　２７ｍｅｒ　　２のヨーロッ
パ特許出願Ｎａ１６８３４２に記載されている方法と同
様にして、次のＤＮＡ断片（Ｉ２７と称する）： ５　’　−ＧＴＡ　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＧＣＣＧＴＴ　Ｇ
ＴＴ　ＴＡＣＡＣＣＧＡＣ−３’を合成する。

５′−末端のリン酸化を、（ｒ　−３２Ｐ　）　−ＡＴ
Ｐ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ヘーリンガー）
を用いて、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｔ、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ等編）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏ
ｒＬａｂ、　（１９８２）、１２５頁に記載されている
ようにして行った。

ｄ）ブースミドＢＨ１０９の　−＋１ ０、３　ｔｔｇずつの５ＩＤＮＡ及びＳＩ［ＤＮＡを４
０ｐｍｏ　Ｉのリン酸化ＤＮＡ断片１２７と、２７ｍの
１　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）　、０．１
　ｍＭ　ＥＤＴＡ中で混合する。この混合物に３Ｉｌｌ
の１０×ポリメラーゼ−リガーゼ緩衝液（Ｉ　Ｍ　Ｎａ
Ｃ１，６５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩＣｊ！　　（ｐＨ７，
５）　、８０ｍＭＭｇＣ１，及び１０ｍＭ　　β−メル
カプトエタノール〕を加える。この混合物を沸騰水浴中
で３分間加熱してＤＮＡ断片を変性する。次に、この混
合物を徐々に冷却しく約１゛Ｃ／分）で３０゛Ｃとし、
そしてこの温度で３０分間インキュベートする。さらに
、この混合物を４℃にて３０分間インキュベートしそし
て次に水中で１０分間インキュベートする。

４種類のデオキシリボヌクレオチドホスフェート（各７
．５　ＬＩＩＭ）　１ｈ＝ｆ、６ｐ１の１０ｍＭ　ＡＴ
Ｐ、　６　ｐｌの↑４ＤＮＡ　リガーゼ（２，５Ｕ／Ｉ
ｉ）及び１．２ｔｔｌのＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラー
ゼ（ベーリンガー、５Ｕ／μりを加え、そしてこのＤ　
Ｎ　Ａ　？！ｕ合物（合計容量５５μｌ）を１２．５°
Ｃにて１６時間インキュベートする。

このＤ　Ｎ　Ａ　混合物を２ユニツトのエンドヌクレア
ーゼＥｃｏＲｌにより３７°Ｃにて１時間消化すること
により未変化の出発プラスミドｐＭＬ３５０を破壊する
。

この方法によりプラスミドｐＢ８１０９が形成される。

プラスミドｐＢＨ１０９は、ｏｍｐＡ−２シグナル配列
に作用可能に連結されたｌａｃプロモーター／オペレー
ター及びＩｐｐプロモーター並びに該シグナル配列とフ
レームを合わせて連結された成熟デスルフアトヒルジン
をコードする遺伝子を含有する。

■ Ｍ１３ｍ　　１９ ヒルジン いてのヒルシ カルシウム処理された大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞を用いる形
質転換を例１、ｄ）に記載したようにして行う。使用し
た合計反応混合物は５５μ！である。

１００個の形質転換されたコロニーを培養し、各コロニ
ーからプラスミドＤＮＡを調製しそしてＥｃｏＲＩによ
り消化する。ＥｃｏＲＩにより消化されないすべてのプ
ラスミドＤＮＡは、ＥｃｏＲ１部位を欠く、可能性ある
プラスミドｐＢｌ１１０９である。２個の同一のコロニ
ーが同定された。これらの内の１つを選択し、そしてｐ
ＢＨ１０９と称する。

０１１１１）Ａ−２リ一ダー配列に続＜Ｆ＋　　Ｆｚ　
　ＤＮＡの正しい配列が配列分析により確認される。

変異した］　　５’　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＡＡＣＡＡＴ　
ＴＧＣＡＴＣＣＴＧ　３’−ド鎖　　　　　　　　　　
Ｇｉｎ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｔｉｉ　　Ｃｙｓ　　
夏ｉｅ　　Ｌｅｕ変異原プライマーはアプライド・バイ
オシステムス（モデル３８０Ｂ）合成機においてホスホ
ルアミダイト法（Ｍ、Ｈ，Ｇａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｃｈｅ
ＩＩｌｉｃａｌ　ａｎｄ　ＥｎｚｙｍａｔｉｃＳｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｈ
，Ｇ、Ｇａ５５ｅｎ及びＡ。

Ｌａｎｇ編）Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗｅｉｎｈ
ｅｉｍ、西独〕を用いて合成する。

５ＩＪ１のＭ１３ｍｐ１９二木鎖ＤＮＡ　（ｄｓ−ＤＮ
Ａ：　０．１　、ｉ／ｍ；ＢＲＬ）に２Ｊ１１のＲｅａ
ｃｔ２　（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　　（ｐＨ８
，０）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ　２．５００ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１）　（ＢＲＬ）　、１　ｕｌのＸｂａ　Ｉ　　（Ｉ
ＯＵ／ｊｄ）　、０．５　ｔｔｌのＢａｍＨＩ　　（１
０Ｕ　／　ｔｄ　）、及び１２１１！の水を加える。３
７°Ｃにて１．５時間のインキュベーションの後、０．
５１Ｊ１のＢａ１ｌｌＨＩ、２．５１１１のＲｅａｃｔ
３　（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２　　（ｐＨ８，
０）　、１００ｍＭＭｇＣｊｌ！ｚ　、１０００ｍＭ　
ＮａＣ１）　（ＢＲＬ）　、及び２Ｊｌ！の水を加え、
そして３７°Ｃにて１時間インキュベーションを続ける
。容量を水で１００μ！にする。ｄｓ−ＤＮＡをフェノ
ール抽出及びエタノール沈澱により単離し、そして３０
ｔｔｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１ｔ（Ｊ、
１ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０）に溶解する。

Ｂ、ＤざノＳプ押ノ、 ５／／ｇのプラスミドｐＢ１１１０９を前記のようにし
てＸｂａ　Ｉ及びＢａｍＨＩにより切断し、そして消化
物を１５０Ｖにて３時間３．５％ポリアクリルアミドゲ
ル及びＩＸＴＢＥ緩衝液（ＩＯＸＴＢＥ緩衝液：ｌｌ当
り１０８ｇ　Ｔｒｉｓ　、５５ｇ硼酸、９．３　ｇ　Ｅ
ＤＴＡ　　・２１ｈＯ）を用いて電気泳動する。ヒルジ
ン遺伝子（２５０ｂｐ　）を含有するＸｂａ　Ｉ　−Ｂ
ａｍＨＩ断片を、１０Ｉｌｌの臭化エチジウム溶液（水
中１０１！ｇ／ｒｎｉ、）を含有する４００ｄの１ＸＴ
ＢＥ緩衝液にゲル浸漬した後、ＵＶ光のもとで可視化す
る。制限断片を含有するゲル部分をゲルから切り出し、
そして５００．ｕｌの０．５　ＸＴＢＥと共に透析バッ
グに入れ、そして移行緩衝液として０、５　ＸＴＢＢを
用いてＢＩＯ−Ｒ２Ｏミニゲル電気泳動装置において１
７０■で３０分間ＤＮＡを電気泳動する。

ＤＮＡを、０．５　ＸＴＢＨにより平衡化されたエルチ
ップ−ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕ
ｌｌ）上に負荷する。カラムを２１ｎ１．の０．５ＸＴ
ＢＢで洗浄し、そしてＤＮＡを０．５　ＸＴＢＥ（１ｒ
ｔｄｌ　）中Ｉ　Ｍ　ＮａＣ４により溶出する。ＤＮＡ
をエタノールで沈澱せしめそして１０ｔｔｌのＴＥ緩衝
液に再溶解する。

５ＩＪＩのＸｂａ　Ｉ　　ＢａｍＨＩヒルジン挿入部、
２ｐ！のＸｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ切断Ｍ１３ｍｐ１９
．１ｊｌｌのＩＯＸリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−１１ｃｌ（ｐｌ＋７．５　）　、１０ｍＭＭｇＣｆ
、　、１０ｍＭジチオスレイトール〕、ｌｌ１１のＡＴ
Ｐ　、及び１．５４のＴ、　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ　
：　Ｉ　Ｕ／Ｉ）を混合し、そして１４°Ｃにて一夜イ
ンキユベートする。５Ｉの連結混合物を用いて、Ｊ、Ｍ
ｅｓｓｉｎｇｌ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、１０１．２ｌ−７８（１９８３））の方法に
従って大腸菌ＪＭＩＯＩを形質転換する。１２個の透明
なプラークを拾い、そして各プラークからＪ、Ｍｅｓｓ
ｉＢ（前掲）により記載されているようにして単鎖ＤＮ
Ａ　（ｓｓ−ＤＮＡ）を調製する。Ｍ１３ｍｐ１９　／
ヒルジンと命名されたＤＮＡを５０ｊｌ！のＴＥ緩衝液
に再溶解する（０．１〜０．５μｌｇ／パ）。

２００ｐｍｏｌ（２３ｐりの変異原プライマー１（前記
を参照のこと）を、１０×キナーゼ緩衝液（Ｉ　Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣ４、０，１Ｍ　Ｍｇｃｌ　ｚ　、０．１　
Ｍジチオスレイトール、ｐＨ８，３）、３Ｉｌｌの１０
ｍＭ　ＡＴＰ及びＩ１１！のＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼＣＢＲＬ、１００／ｍ）の添加によりリン酸化する
。３７°Ｃにて１時間のインキュベーションの後、６５
℃にて１０分間加熱することにより反応を停止する。

６μ７（０，５１ｐｇ）の単鎖Ｍ１３ｍｐ１９　／ヒル
ジン（セクションＩ−Ｃ）を３　ｔｉ　（２０ｐｍｏｌ
）のリン酸化変異原オリゴデオキシリボヌクレオチド（
６，６ｐｍｏｌ／ｌ！り及び１１の緩衝液Ａ　（０，２
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐｌ＋７．５）　、Ｏ，１Ｍ　
　Ｍｇ（ｆ！ｚ　、０．５Ｍ　ＮａＣｊ！、　０．０１
ＭＤＴＴ　）と共に７０°Ｃにて５分間インキュベート
し、そして３０分間にわたり徐々に室温に冷却する。

Ｃ０延に産猪反息 前記のアニールされた混合物に、１μｌの緩衝液Ｂ　［
０，２Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（ｌ（ｐＨ７，５）　、Ｏ，Ｌ
Ｍ　ＭｇＣｆｆ１ｚ、０、ＯＩＭ　ＤＴＴ）　、１　ｐ
ｌの１０ｍＭ　ＡＴＰ、　４　ｔｔｌの２　ｍＭ　ｄＮ
ＴＰ混合物、５ＩｉのＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ（ベー
リンガ、ＩＵ／Ｉ）、及び５μｌのＴ４　ＤＮＡリガー
ゼ（ＢＲＬ、ＩＵ／μｌ）を加える。この混合物を１６
°Ｃにて３時間インキュベートする。６５°Ｃにて１０
分間インキュベートすることにより反応を停止する。

Ｄ、　　　　　　　　び　　　　　　ＤＮＡの−制連結
混合物を無菌水により１：２０に稀釈し、その稀釈物１
ｊｌｌ及び５μ！、並びに未稀釈混合物１μｌを用いて
コンピテント大腸菌ＢＭＩＩ　７第一７第一８ｌ　Ｓ細
胞［Ｂ、Ｋｒａｎｅｒ、　Ｗ、Ｋｒａｍｅｒ及び［＋、
−Ｊ　Ｆｒ１ｔｚ、Ｃｅ１ｌ　３８８７９−８８７（１
９８４）　）を形質転換する。細胞を、“Ｍ１３ｃｌｏ
ｎｉｎｇ　ａｎｄ　５ｅｑｕｅｎｃｉＢ　ｌ１ａｎｄｂ
ｏｏｋ”　（アメルシ中ムより発行）に記載されている
ようにしてプレートする。１２個の無色のプラークを拾
い、そしてセクションＩ−Ｃに記載されているようにし
て５ｓＤＮＡを調製する。

Ｅ、　　　についての　　ＤＮＡのスフ第一二ｌ久 変異した単ｔｉ　Ｄ　Ｎ　Ａをスクリーニングするため
、１２個の５ｓ−ＤＮＡサンプルのそれぞれをジデオキ
シヌクレオチド・チエインターミネーション法（Ｆ。

Ｓａｎｇｅｒ、　Ｓ、Ｎ１ｃｋｌｅｒ及びＡ、Ｒ，Ｃｏ
ｕｌｓｏｎ＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７４．５４６３−５４６
７（１９７７））により配列決定した。まず、予想され
る変異した塩基に相補的なジデオキシヌクレオチドのみ
を反応に用いる。

次に、幾つかの陽性変異体からの５ｓ−ＤＮＡを、Ｔａ
ｂｏｒ及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８４＋４７６７−４
７７Ｈ１９８７）　）の方法に従って７７　ＤＮＡポリ
メラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、　ｌｌ５Ｂ）を用いて
配列決定して変異体の十分なりＮＡ配列を確立する。組
換ヒルジンの２７位におけるＬｙｓ−＋Ａｓｎ変異をコ
ードする予想通りの塩基変化がＤＮＡ配列中に観察され
る。

予想通りの配列を有するファージＤＮＡをＭ１３ｍｐ１
９／ヒルジンに２７Ｎと命名する。

コンピテント大腸菌ＪＭＩＯＩ細胞を１０〜２０ｎｇの
単鎖ヒルジンに２７Ｎ変異体ＤＮＡにより形質転換し、
そして”Ｍ１３　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ　１ｌａｎｄｂｏｏｋ’（アメルシャムによ
り発行）に記載されているようにしてｄｓ−ＤＮＡを調
製する。　１００ｍｆｆ１の培養物から４０〜５０ｘｙ
のｄｓ−ＤＮＡが得られる。

Ｇ、　　　ヒルジンＸｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨ［の２５ｐ
ｇのｄｓ−ＤＮＡから変異したヒルジンＸｂａ　ｌ−Ｂ
ａｍ１ｌ　Ｉ挿入部を切り出し、そしてセクションＩＢ
に記載されているようにして精製する。ＤＮＡを２０μ
ｌの無菌水に溶解する。

６　μｌのＲｅａｃｔ　２緩衝液（ＢＲＬ）　、２ＪＩ
Ｉ（２０ユニ１７ト）のＸｂａＬｌｌＩｆのＢａｍＨＩ
　　（１０ユニツト）、１μｌのＥｃｏＲＩ　　（１０
ユニツト）及び３７μｌの水（合計容１１５０ｊ１りを
加えそして３７°Ｃにて３時間インキュベートすること
により約１．５題のｐＴＮ−ｍ−ｏｍｐＡ−２プラスミ
ドの消化物を調製する。１μ！　（１０ユニツト）のＢ
ａｎ＋ＨＩ、１ｍ（１０ユニツト）のＥｃｏＲＩ、５Ｉ
ＪＩのＲｅａｃｔ　３　（ＢＲＬ）及び１２μ！の水を
添加し、そして３７°Ｃにて１時間インキュベーション
を続ける。

ント細胞を形質転換する。３戚の２×ＹＴ／アンピシリ
ン（５０１！ｇアンピシリン／ａｔｅ２ＸＹＴ）をサン
プルに加え、そして細胞を室温にて１時８間増殖せしめ
る０次に、培養物のサンプルｌｌＲ１を取り、そしてＬ
Ｂ／アンピシリンＣ３０ｎアンピシリン／ｄＬＢ−寒天
）プレートに性別し、そして３７℃にて一夜増殖せしめ
る。この形質転換プラスミドＤＮＡをｐｌＮ−ｍ　−ｏ
ｍｐＡ−２／ＨＩＲ−に２７Ｎと称する。

９ｊ１１のヒルジンに２７Ｎ　Ｘｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨ
Ｉ挿入部ＤＮＡ、２１！ｌのＸｂａ　Ｉ　　Ｂａｍ１ｌ
　Ｉ切断ｐｌＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ−２ベクターＤＮＡ
、３μｌのｌＯ×連結緩衝液（ＢＲＬ）及び１μＺ（１
０／μＺ）　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を混合し
、そして１４°Ｃにて１６〜２０時間インキュベートす
る。

５Ｊ１！の連結混合物を用いて、Ｊ、　Ｍｅｓｓ　ｉｎ
ｇ　（前掲）の方法に従って、０゜３　ｍｌの大腸菌Ｊ
ＭＩＯＩコンビテＬＢ／アンピシリンプレートから１０
個の細菌コロニーを拾い、そして５−のＬＢ／アンピシ
リン（５０１ｔｇ７７ピ’ｉ　’Ｊ　７ｌｍｌ　Ｌ　Ｂ
　）中で３７°Ｃにて５時間別々に増殖せしめる。各培
養チューブから１　ｍｌのサンプルを採取し、そして遠
心分離（３０００ｘ　ｇにて５分間）により細胞を回収
する。細胞の各サンプルを１００４の１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−Ｈ（Ｊ　　（ｐＨ８，１）により０°Ｃにて３０分
間処理することにより浸透圧ショックをかけて、細菌の
ペリプラズム空間中の物質を放出せしめる。前記のよう
にして遠心分離により細胞を回収し、そしてセクション
Ｖ−Ｂに記載したようにして上清のヒルジン活性を試験
する。

最も高い阻害活性を与えるサンプルを回分培養のために
選択する。

最も活性なサンプルからの残りの細胞（４ｍｌ　）をＩ
ｌのＬＢ／アンピシリン（５０ｐｇアンピシリン／　ｍ
ｌｌ　Ｌ　Ｂ　）に接種する。培養物を３７°Ｃにて一
夜増殖せしめ、そして遠心分離（３０００Ｘ　ｇ、１５
分間）により細胞を回収する。細胞を５０ｍ１の１０ｍ
Ｍ　ＴｒｉｓＨＣｆ　　（ｐＨ８，１）中に０°Ｃにて
１時間再懸濁することにより該細胞に浸透圧ショックを
与える。６０００Ｘｇにて１０分間の遠心分離によりペ
リプラズム画分から細胞を除去する。

Ｄ、　　Ａｓｎ”　　−デスルフ　　ヒルジンのペリプ
ラズム画分のｐＨを０．１ＭＨ（ｊ！により６．５に調
整し、そして０．４５声フイルター（Ｎａｌｇｅｎ）を
通して濾過する。蛋白質を、５０ｍＭ　ｂｉｓ−Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩｌ（ｐＨ６，５）緩衝液により平衡化された
Ｍｏｎｏ−ＱカラムＦＰＬＣ系（Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　
。

ファルマシアーＬＫＢ）に負荷する。デスルファトヒル
ジン変異体を、カラムから、ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
ｌ（ｐｌ＋６．５　）中０〜３００１ＩＩＭＮａＣ１の
４５分間にわたる直線塩グラジェントにより溶出する。

カラム溶出液の０．８　ｄずつの画分を集め、そしてセ
クション［［−Ｂに記載したようにしてヒルジン活性を
試験する。デスルファトヒルジン変異体を含有する両分
をプールし、上記のようにして濾過し、そして水中０．
０９％（ｖ／ｖ））リフルオロ酢酸により平衡化された
Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　Ｌａｂｓ　Ｃ８逆相１１ＰＬｃカラ
ムを用いるミリポアーーウォーターズＩＩＰＬＣ系でク
ロマトグラフ処理する。水中０．０９％（ｖ／ｖ）トリ
フルオロ酢酸中７〜２８％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの
直線グラジェントによりカラムからヒルジン変異体を溶
出する。

約９８％以上の純度を有する（Ａｓｎ”　）−デスルフ
ァトヒルジンが２８分における単一ピークとして溶出す
る。

■、　　　　　　の　　　　・　、′１　・　け精製さ
れた（Ａｓｎ”　）−デスルファトヒルジンを、そのア
ミノ酸組成、Ｎ−末端配列、及びペプチドマツピングに
より特徴付けた。

２〜５Ｉ！ｇの蛋白質をガラス管中で６ＮＨ（／！の萎
気中１１０℃にて加水分解する（Ｒ，Ｌ、Ｈｅｎｒｉｋ
ｓｏｎ　。

及びＳ、Ｃ，Ｍｅｒｅｄｉｔｈ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、１３６　＋６５−７４（１９８４）　）。アミノ
酸を真空乾燥し、フェニルイソチオシアネートにより誘
導体にし、そして逆相カラム上で分離する［Ａ、Ｂ、　
Ｂｉｄ　ｌｉｎｇｍｅｙｅｒ、　Ｓ、Ａ、Ｃｏｈｅｎ及
びＴ、Ｌ、Ｔａｒｕｉｎ＋Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ＋３３６　＋９３−１０４（１９８４）　）。分
子１ｔ６８８９　Ｄを用いてアミノ酸組成を計算する。

約５Ｑｐｍｏ　ｌの（Ａｓｎ”　）−デスルファトヒル
ジンをＡｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓＬｅｍｓ　４７０
八気相シーケンサ−（Ｍ、Ｗ、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ
及びり、Ｅ、１ｌｏｏｄ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、　９１，４８６−４９４（１９８３）
）を用いて５サイクルの自動化されたエドマン分解にか
けてＮ−末端アミノ酸配列を確立する。生ずるフェニル
チオヒダントインアミノ酸を、八ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓタイプ１２０オンライン分析機を用いて
、逆相ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃ系（Ｒ，Ｍ、Ｈｅｗｉｃｋ、Ｍ
、Ｗ、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、Ｌ、Ｅ、Ｈｏｏｄ及び
−。

Ｊ、Ｄｒｅｙｅｒ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５６
．７９９０−７９９７（１９８１））上で分離する。

（Ａｓｎ”　）−７’スルフアトヒルジンのペプチドマ
ツプを得るため、５０Ｉ！ｇの蛋白質を真空乾燥し、そ
して３７°Ｃで１時間、過蟻酸で処理する（Ｃ，Ｈ，１
１゜Ｈｉｒｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ　　１１，１９７−１９９（１９６７））。

この反応混合物に４５ｍの冷水を加え、凍結し、そして
真空乾燥する（２回）。酸化されたヒルジン変異体を５
０１１！の５０１１１Ｍ　ＮＨ４１（ＣＯ３に溶解し、
そして１屑のサーモライシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ
）　（ベーリンガー）により３７°Ｃにて４時間消化す
る。分画に先立って、この消化物を真空乾燥し、そして
水中０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）に溶解する。

水中０．１％トリフルオロ酢酸により平衡化されたＶｙ
ｄａｃ　Ｃ１Ｂカラムを用いて逆相ＨＰＬＣによりペプ
チドを精製する。

Ｌｍｌ１分の流速で９０分間にわたる０〜２８％アセト
ニトリルの直線グラジェントによりペプチドを溶出する
。

変異を含有するペプチドのアミノ酸配列を前記のように
して決定し、アミノ酸置換Ｌｙｓ２７→八５ｎ２７が確
認された。

拠炙　ヒルジンの　　Ｌ　ｓ３６のＶａ１３６への変異
原プラ イマー２　　　３’　ＣＴＧ　ＣＣＡ　ＣＴＴ　ＴＴＡ
　ＴＴＧ　ＧＴＣＡＣＧ　５’変異したコ　５′ 一ド配列 ＧＡＣＧＧＴ　　Ｇへ＾　ＡＡＴ　　ＡＡＣＣＡＧ　　
ＴＧＣ３’八ｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　
Ａｓｎ　　Ｇｉｎ　　Ｃｙｓ変異原プライマー２と例３
（セクションＩ及び■）に記載した旧３ｍｐ１９　／ヒ
ルジンを用いて部位特定変異誘発を行う。形質転換プラ
スミドＤＮＡをｐｌＮ−ｍ　−ｏｍｐＡ−２／　ＨＩＲ
−に３６Ｎと称し、そして変異体蛋白質をＥ、コリ中で
発現せしめそして例３（セクション■）に記載したよう
にして精製する。

この変異体蛋白質においてＬｙｓ２７がＡｓｎ２７によ
り置き換えられていることがアミノ酸組成及びＮ末端配
列分析（例３；セクション■）により確認され、その阻
害性が決定される（例１９）。この変異体を〔Ａｓ　ｎ
　３　ｂ　）−デスルファトヒルジンと称する。

変異原プライマー３を用いて例３及び４に記載した方法
を反復し、Ｌｙｓ３６がＶａ１３６に置き換えられた目
的の変異体蛋白質を得、そして特徴付ける。

形質転換プラスミドＤＮＡをｐｌＮ−Ｉ［第一ｏｍｐＡ
−２／　ＩＩＩＲＫ３６Ｖと称する。この変異体を（Ｖ
ａｎ３６）−デスルファトヒルジンと称する。

変異原ブライマー４を用いて例３及び４に記載した方法
を反復し、Ｐｒｏ４８がＧ１ｙ４８に置き換えられた目
的の変異体蛋白質を得、そして特徴付ける。

形質転換プラスミドＤＮＡをｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ
−２／ＨＩＲＰ４８Ｇと称する。この変異体を（Ｇｌｙ
”　）−デスルファトヒルジンと称する。

変異原ブラ イマー５　　３’　ＧＧＣＴＴＴ　ＧＧＣＴＡＣＡＧＡ
　ＧＴＧ　ＴＴＧ　５’変異原プライマー５を用いて例
３及び４に記載した方法を反復し、ＧＩｎ４９力（Ｍｅ
ｔ４９により置き換えられた目的の変異体蛋白質を得、
そして特徴付ける。形質転換プラスミドＤＮＡをｐｌＮ
−ｍ　−ｏｍｐＡ−２／ＨＩＲ−Ｑ４９Ｎと称する。こ
の変異体蛋白質を（Ｍｅｔ”　］−デデスルファトヒル
ジと称する。

例８．　ヒルジンの　　Ａｓｎ５２のＭｅ　ｔ５２への
ヒルジンの　　　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ａ
ｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐコード鎖　　　５’　　ＣＡＧ　
ＴＣＴ　ＣＡＣ瓜Ｇ＾ＣＧＧＴ　ＧＡＣ３’変異原プラ イマー６　　　３’　ＧＴＣＡＧＡ　ＧＴＧ　’ｊ＾コ
；、　ＣＴＧ　ＣＣＡ　ＣＴＧ　５’変異したコ　５’
　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＣＡＣ幻’Ｇ　ＧＡＣＧＧＴ　ＧＡ
Ｃ３’−ドｇ　　　　　　　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　［ｌｉｓ
　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ変異原プライマー６
を用いて例３及び４に記載した方法を反復して、Ａｓｎ
５２がＭｅ　ｔ５２により置き換えられた変異原蛋白質
を得、そして特徴付ける。

形質転換プラスミドＤＮＡをｐｌＮ−ｍ　−ｏｎ＋ｐＡ
−２／　ＨＩＲＮ５２Ｍと称する。この変異体を（Ｎｅ
ｔ”　）−デスルファトヒルジンと称する。

ヒルジンの　　　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａ
ｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙコード配列　５’　ＣＣＧ　ＣＡ
Ｇ　ＴＣＴＣＡＡＣＧＡＣＧＧＴ　３’変異原プラ イマー６　　　３’　ＧＧＣＧＴＣＡＧＡ　ＴＴＧ　Ｔ
ＴＧ　ＣＴＧ　ＣＣＡ　５’変異したコ　　５’　ＣＣ
Ｇ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＡＡＣＡＡＣＧＡＣＧＧＴ　３’
−ド配列　　　　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　譚１Ａｓｎ
　Ａｓｐ　Ｇｌｙ変異原ブライマー６を用いて例３及び
４に記載した方法を反復し、旧ｓ５１がＡｓｎ５１に置
き換えられた目的の変異体蛋白質を得、そして特徴付け
る。

形質転換ＤＮＡをｐｌＮ−Ｉ［第一ｏｍｐＡ−２／ＨＩ
Ｒ−Ｈ５１Ｎと称する。変異体を（Ａｓｎ”　）−デス
ルファトヒルジンと称する。

び４に記載の方法を反復し、Ｌｙｓ２７がＧ１ｎ２７に
置き換えられておりそしてＬｙｓ４７がＡｒｇ４７によ
り置き換えられている目的の変異体蛋白質を得そして特
徴付ける。形質転換プラスミドＤＮＡをｐｌＮ−■−ｏ
ｍｐＡ−２　／１ｌｌＲ４２７（１、Ｋ４７Ｒと称する
。変異体を〔Ｇｌｎ２７、Ａｒｇ”　）−デスルファト
ヒルジンと称する。

ヒルジンの　　　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｅ　Ｃ
ｙｓコード鎮　　　５’　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＡＡＣＡＡ
Ａ　ＴＧＣｒｌｅ　　Ｌｅｕ ＡＴＣＣＴＧ　　３’ 変異原プラ イマー８　Ａ　　３’　ＧＴＣＣＣＡ　ＴＴＧＴＣＴ　
ＡＣＧ　ＴＡＧ　ＧＡＣ５’変異したコ　　５’　ＣＡ
Ｇ　ＧＧＴ　ＡＡＣＣＡＡ　ＴＧＣＡＴＣＣＴＧ　３’
−ド鎖　　　　　　　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　；　Ｃ
ｙｓ　　ｌｌｅ　ＬｅｕＢ、Ｌｓ４７のＡｒ４７への゛
。

ヒルジンの　　　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ＬＬＩＡＰ
ｒｏ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒコード鎖　　５’　ＧＧＴ　ＡＣ
ＣＣＣＧＣＣＧＧ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　３’変異原プラ イマー８８　３’　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＧＧＣＴＣＴ　Ｇ
ＧＣＧＴＣＡＧＡ　５’変異したコ　　５’　ＧＧＴ　
ＡＣＣＣＣＧ　ＡＧＡ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　３’
−ド配列　　　　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｙ、　Ｐ
ｒｏ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ変異原プライマー８Ａ及び８Ｂを
用いて例３及Ｌｙｓ２７のＧ１ｎ２７への変異は例１０
．　Ａに記載したようにして行う。

Ｃ：Ｌｓ４７のＡｒ４７への゛ Ｌｙｓ４７のＡｒｇ４７への変異は例１０．８に記載し
たようにして行う。

変異原プライマー８Ａ、８Ｂ及び９を用いて例３及び４
に記載した方法を反復し、Ｌｙｓ２７がＧ１ｎ２７によ
り置き換えられており、Ｌｙｓ３６がＧＩｎ３６により
置き換えられており、そしてＬｙｓ４７がＡｒｇ４７に
より置き換えられている目的の変異体蛋白質を得、そし
て特徴付ける。形質転換プラスミドＤＮＡをｐｌＮ−ｍ
　−ｏｍｐＡ−２／　ＨＩＲ−に２７Ｑ　、　Ｋ３６０
．に４７Ｒと称する。

変異体を〔Ｇｌｎ２７、Ｇｉｎ”、＾ｒ　ｇ　４　？　
）−デスルファトヒルジンと称する。

Ｂ：Ｌｓ４７のＡｒ４７への゛ Ｌｙｓ４７のＡｒｇ４７への変異は例１０．８に記載し
た方法により行う。

変異原プライマー８Ｂ及び１０を用いて例３及び４に記
載した方法を反復し、Ｌｙｓ３６がＡｒｇ３６により五
き換えられており、そしてＬｙｓ４７がＡｒｇ４７によ
り置き換えられている目的の変異体蛋白質を得、そして
特徴付ける。形質転換プラスミドＤＮＡをｐｌＮ−１１
［−ｏｍｐＡ−２／旧Ｒ−に３６［？　、　Ｋ４７Ｒと
称する。変異体を〔Ａｒｇ′１６、Ａｒｇ４？　）−デ
スルファトヒルジンと称する。

変異原プラ イ？−１０３’　ＣＧＴ　ＣＣＡ　ＣＴＴ　ＴＣＴ　Ｔ
ＴＧ　ＧＴＣＡＣＧ　５’変ＩＬＪ、：コ５’　ＧＡＣ
ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＣＣＡＧ　ＴＧＣ３’−
ドｔｉ　　　　　　　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　幻ＩＡ
ｓｎ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ変異原プラ イマー１１　　３’　ＧＴＣＣＣＡ　ＴＴＧ　ＴＣＴ　
ＡＣＧ　ＴＡＧ　ＧＡＣ５’変異したコ　５’　ＣＡＧ
　ＧＧＴ　ＡＡＣＡＣＣＣＡＴＣＣＴＧ　３’−ド鎖　
　　　　　　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ幻：ＪＩ　Ｃｙｓ
　　Ｉｌｅ　ＬｅｕＢ：Ｌｓ４７のＡｒ４７への゛ Ｌｙｓ４７の＾ｒｇ４７への変異は例１０．８に記載し
た方法により行う。

変異原プライマー８Ｂ及び１１を用いて例３及び４に記
載した方法を反復し、Ｌｙｓ２７がＡｒｇ２７により置
き換えられておりそしてＬｙｓ４７がＡｒｇ４７により
置き換えられている目的の変異体蛋白質を得、そして特
徴付ける。形質転換プラスミドＤＮＡをｐｌＮ−ＩＩＩ
　−ｏｍｐＡ−２／　ＩＩＩＲ−に２７Ｒ、Ｋ４７Ｒと
称する。変異体を〔＾ｒｇＺ１、Ａｒｇ４Ｔ　）−デス
ルファトヒルジンと称する。

ルジンのＮ−Ｌ“のグリシン　　による長 変異原プラ イマー１２　　３’　　ＣＧＣＧＴＣＣＧＧ　Ｃ（通Ｃ
ＡＡ　ＣＡ八へＴＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　Ａ部５′変異し
たコ ード鎖 ５’　　　　ＧＣＧ　　ＣＡＧ　　ＧＣＣＧＧＴ　　Ｇ
ＴＴ　　ＧＴＴ　　ＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣ３’ジグ
ナノ’Ｌ６１ＪＩ　ＧＪｑ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　
Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ変異原プライマー８Ａ、８Ｂ、
９及び１２を用いて例３及び４に記載した方法を反復し
、〔Ｇｌｎ”。

Ｇｌｎ”、Ａｒｇ”　）−デスルファトヒルジンのＮ−
末端がｃｔｙにより延長された目的の変異原蛋白質を得
、そして特徴付ける。この蛋白質をグリシル−［ＧＩｎ
”、Ｇ１ｎ３＆、Ａｒｇ”　）−デスルファトヒルジン
と称する。

変異原プラ イマー１３　　　　　３’　　　　ＣＧＣＧＴＣＣＧＧ
　　Ｔ＾ＣＣ八八　へへＡ　　ＡＴＧ　　ＴＧＧ　　Ｃ
ＴＧ　　ＡＣＣ５’変異したコ　５’　　ＧＣＧ　ＣＡ
Ｇ　ＣＧＣ頂”Ｇ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＴＡＣＡＣＣＧＡ
ＣＴＧＣ３’−ド１貞　　　　　　　　ジグナノＬ４ｃ
ＶＩＪ　　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　Ｔｈ
ｒ　八ｓｐ　Ｃｙｓ変異原プライマー８Ａ、８Ｂ及び１
３を使用し例３及び４に記載した方法を反復して、〔Ｇ
ｌｎｔ７゜Ａｒ、、４’ｌ　）−デスルファトヒルジン
のＮ−末端がＭｅｔにより延長されている目的の変異原
蛋白質を得、そして特徴付ける。この蛋白質をメチオニ
ル−〔Ｇｌｎ”、Ａｒｇ”　）−デスルファトヒルジン
と称する。

罰、　　　にお番る　Ａｓｎ”　　−デスルファトヒ（
Ａｓｎ”　）−デスルファトヒルジンはアミノ酸変化Ｌ
ｙｓ２７→＾５ｎ２７を有する変異体蛋白質であって、
この変化は部位特定変異誘発（例３を参照のこと）によ
って達成されている。ｐＩＮ−ｍ−ｏｍｐＡ−２ベクタ
ーでの変異したポリペプチドのコード配列のクロニング
は例３．　　ＩＩに記載されている。酵母での発現のた
め、適切な変異を有するコード配列を、強力な構成的プ
ロモーター、酵母シグナル配列及び酵母転写ターミネー
タ−を備えた適当な酵母発現ベクターに挿入して機能的
発現カセットを構成する。

２５犀のプラスミドｐｌＮ−ＩＩＩ　−ｏｍｐＡ−２／
　ＨＩＲ−に２７Ｎ（例３．　ＩＩＩを参照のこと）を
Ｘｂａ　Ｉ及びＢａｍＨＩで消化する。０．３　ｋｂ　
Ｘｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片を分取用２％アガロース
ゲル上で単離する。ＤＮＡを電気溶出しそしてエタノー
ルで沈澱せしめる。Ｘｂａ　ｒＢａｍＨＩ断片は０１１
１１）Ａシグナル配列及び変異したヒルジンコード配列
を含んで成る。この断片を旧ｎｆｌによりさらに切断す
る。旧ｎｆＩはヒルジン配列内のヌクレオチド位置２２
を開裂せしめる。１７６ｂｐのＨ４ｎｆ　Ｉ　−Ｂａｍ
ＨＩ断片を前記の様にして単離する。

このＤＮＡ配列は（Ａｓｎ”　）−デスルファトヒルジ
ンをコードしている。

ズ 酵母プラスミドｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ
（第２図；ヨーロッパ特許出願Ｎα２２５６３３）をＢ
ａｔ　Ｉで消化する。３個のＢａｌ　Ｉ部位が存在し、
１個はＰＨ０５シグナル配列中にあり、２個はベクター
内にある。

Ｂａ１１部位からＢａｍｆ（１部位までのｐ１３Ｒ３２
２配列、短い構成的ＧＡＰＦＬプロモーターへのＢａｍ
１ｌ　Ｉ　／　Ｂａｌ　Ｉ連結部及びＢａ１１部位まで
のＰＨ０５シグナル配列を含有する１、　５　ｋｂ　Ｂ
ａｌ　Ｉ断片を単離する。

次の式（１）及び（２）： Ｂａ１ｌ　　　　　　　　　　　　　　Ｈｉｎｆｌ（１
）　５’　ＣＣＡＡＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＴＡＣＡＣＣ
ＧＡＣＴＧＣＡＣＣＧ　　　　３’（２）　　３’　　
ＧＧＴＴＡＣＧＴＣＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣ
ＧＴＧＧＣＴＴＡ　　　５’で表わされる２種類のオリ
ゴヌクレオチド二本鎖ＤＮＡリンカ−を構成し、このリ
ンカ−はＢａ１１部位から皿シグナル配列の末端までの
８ヌクレオチド及び旧ｎｆ１部位（第２図には示してな
い）までのヒルジンコード配列の２２ヌクレオチドを提
供する。オリゴヌクレオチド（１）及び（２）をそれぞ
れ１Ｏｔｔｌの６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７、
５）　、１０ｍＭＭｇＣｊ２ｚ　、５ｍＭ　ＤＴＴ、　
０．５ｍＭ　ＡＴＰ及び２７ＵのＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（ペーリンガー）中で３７°Ｃにて４５分間キ
ナーゼ処理する。オリゴヌクレオチド（１）及び（２）
の反応混合物を一緒にし、７５°Ｃにて１０分間加熱し
、そして室温に放冷する。

アニールされたオリゴヌクレオチドリンカーを一２０°
Ｃにて貯蔵する。

２ピコモルの１．３　ｋｂ　Ｂａｌ　Ｉ　　ＤＮＡ断片
を１５°Ｃにて１６時間、キナーゼ処理されそしてアニ
ールされたオリゴヌクレオチドリンカー１００倍量と共
に１０ｍの６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）
　、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、５ｍＭ　ＤＴＴ、３．５
　ｍＭ　ＡＴＰ及び４００ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（
バイオラプス）中でインキエベートする。８５℃にて１
０分間Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを不活性化した後、１０ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ、３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０
）及び０．５４容量のイソプロパツールの存在下でＤＮ
Ａを沈澱せしめることによ勺過剰のリンカ−を除去する
。ＤＮＡを５ａｉｌにより消化する。生ずる断片をＴＢ
ＥＷ街液中１％分取用アガロースゲル上で分離する。５
６４ｂｐ断片を電気溶出及びエタノール沈澱によりゲル
から回収する。このＤＮＡを０．１ｐｓｏｌ／ｐｉの濃
度で再懸濁する。この６５４ｂｐの５ａ１第一Ｈｌｎｆ
　Ｉ断片は２７６ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　ｐ
ＢＲ３２２ＯＮ＾断片、ＧＡＰＦＬプロキーター、ＰＩ
＋０５シグナル配列及びヌクレオチド位置２２　（Ｉｌ
ｉｎｆ　１部位）までのヒルジンのコード配列を含んで
成る。

プラスミドｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＦＬ−１（ＩＲ（
前記参照のこと）をＳａｌ　Ｉ及びＢａｍＨＩで消化し
、そして６．７　ｋｂＳａｌ　Ｉ　−ＢａｍＨＩベクタ
ー断片を単離する。ベクター断片はまた鷹転写ターミネ
ータ−を含有する。

上記のようにして単離された３個のＤＮＡ断片を次の反
応により連結する。すなわち、０．２　ｐｍｏｌの５６
４ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ−旧ｎｆｌ断片、Ｑ、　２ｐｍｏｌ
の１７６ｂｐＨｉｎｆ　Ｉ　　ＢａｍＨＩ断片及び０．
１　ｐｎ＋ｏｌの６．７　ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ−ＢａｍＨ
Ｉベクター断片を１０Ｊ１１の６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｊ！（ｐＨ７，５）　　、　１０＋ａＭ　　ＭｇＣ１
ｚ　　、　５ｍＭ　　ロＴＴ、　　　ｌｄ　　ＡＴＰ及
び２００ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼ中で１５℃にて６時
間連結する。各連結混合物のＩＩのアリコートを１００
４のカルシウム処理された形質転換コンピテント大腸菌
ＨＢＩＯＩ細胞に添加する。

１２個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを、
１００■／２のアンピシリンを含有するＬＢ培地中で増
殖せしめる。プラスミドＤＮＡを調製しくＨｏｌｍｅｓ
等、八ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１４　（１９８１
）、１９３）、そしてＢａｍＨＩ及び５ａｌＩによる二
重消化によって分析する。リンカ−とシグナル配列及び
ヒルジンコード配列へのインフレーム連結をＤＮＡ配列
決定（Ｓａｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４（１９７７）　５４６３　）に
より確認する。正しい配列を有する１つのクローンをｐ
ＪＤＢ２０？　／ＧＡＰＰＬ−ＨＩＲ−に２７Ｎと称す
る。

同様にして、下記のプラスミド： ｐｌＮ−Ｉｌｌ−ｏｎ＋ｐＡ−２／ＨＩＲ−に３６Ｎ　
（例４）、ｐＴＮ−１１第一ｏｍｐＡ−２／）ＩＩＲ−
に３６Ｖ　（例５）、ｐｌＮ−ＩＩ［−ｏｍｐＡ−２／
ＨＩＲ−Ｐ４８Ｇ　（例６）、ｐｌＮ−ＩＩＩ−ｏ＋５
ｐＡ−２／ＨＩＲ−０４９Ｍ　（例７）、ｐｌＮ−Ｉｌ
ｌ−ｏｍｐＡ−２／ＨＩＲ−Ｎ５２Ｍ　（例８）、ｐｌ
Ｎ−Ｉｌｌ−ｏ＋ｗｐＡ−２／ＨＩＲ−Ｈ５１Ｎ　（例
９）、ｐｌＮ−ｍ　−ｏｍｐＡ−２／　ＨＩＲ−に２７
Ｑ　、　Ｋ４７Ｒ（例１０）、ｐｌＮ−ｍ　−ｏｒａｐ
＾−２／ＨＴＲ−に２７０．　Ｋ３６（１、Ｋ４７Ｒ（
例１１）、ｐｌＮ−ｍ−ｏｍｐ＾−２／旧Ｒ−に３６Ｒ
、Ｋ４７Ｒ（例１２）及びｐＩＮ−１［−ｏｍｐ＾−２
／ＨＩＲ−に２７Ｒ、Ｋ４７Ｒ（例１３）から出発して
酵母発現プラスミドを得る。得られる酵母発現プラスミ
ドを、 ｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−に３６Ｎ。

ｐＪＤＢ２０？　／ＧＡＰＦＬ−１＋１Ｒ−に３６Ｖ。

ｐＪＤＢ２０？　／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−Ｐ４８Ｇ。

ｐＪＤＢ２０？　　／ＧＡＰＦＬ−旧Ｒ−０４９Ｍ、ｐ
Ｊ口８２０７　　／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−Ｎ５２Ｍ、ｐ
ＪＤＢ２０？　／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−１１５１Ｎ。

ｐＪＤＢ２０７ ９ＪＤＢ２０７ ｐＪＤＢ２０？ ｐＪＤＢ２０７ と称する。

／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−に２７（１、Ｋ４７Ｒ。

／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−に２７Ｑ　　、に３６０　、に
４７Ｒ。

／ＧＡＰＦＬ−旧Ｒ−に３６Ｒ、Ｋ４７Ｒ及び／ＧＡＰ
ＦＬ−旧Ｒ−に２７Ｒ、Ｋ４７Ｒサツカロミセス・セレ
ビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）ＧＦＲ１８株（ＤＳＭ　３６６５；　ａ、　　
ｈｉｓ　３−１１゜ｈｉｓ　３−１５．１ｅｕ２−３．
　ｌｅｕ　２−１１２．ｃａｎ”　）　、及びＨＴ２４
６　　株（口ＳＭ　　４０８４；ａ、　　ｌｅｕ　　２
−３．　　　Ｉｅｕ　　２−１１２．ｐｒｂ）を、１１
ｉｎｎｅｎ等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＬＩＳＡ、７５．１９２９（１９７８）　）に記載さ
れている形質転換法を用いて、例１６．Ｂに挙げただ母
発現プラスミドにより形質転換する。形質転換された酵
母細胞を、ロイシンを欠く酵母最少培地プレート上で選
択する。形質転換された単一酵母コロニーを単離し、そ
して次の様に命名する。

サツカロミセス・セレビシェ− ＧＲＰ１８／ｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−
に２７Ｎ、３Ｘ１０’細胞／ｉの密度になるまで増殖せ
しめる。

変異したデスルファトヒルジン種の構成的発現及び分泌
のため、細胞をペプトン（５ｇ、＃り、酵母エキス（１
０ｇ／ｊり、グルコース（２０ｇ／／り、シュークロー
ス（４０ｇ／ｊ２）、硫酸アンモニウム（３ｇ／ｆ）　
、ＫＨｚＰＯ４（２ｇ／ｆ）　、Ｍｇ５Ｏｉ（０，５ｇ
／ｌ）、ＮａＣｆ　（０，１ｇ／　ｌ）、Ｃａ（、ｅｘ
（０，１ｇ／ｌ）及びビオチン（１０ｘ／　Ｉ！　）を
含と・複合培地中で増殖せしめる。３０’Ｃ１２００回
／分にて４８時間インキエベートした後、約Ｉ　ＸＩＯ
’細胞／ｄが得られる。

Ｓ、セレビシェ−ＧＲＦ１８及びＨＴ２４６形質転換体
の細胞をそれぞれ、１０ｄの酵母最少培地（アミノ酸を
含有しないデイフコ・イースト・ニトロゲン・ベースに
２％グルコース及び２０■／ｆｆ１Ｌ−ヒスチジンを添
加したもの）中で５０ｄエルレンマイヤーフラスコ内で
、振とうしながら３０°Ｃにて２４時間、培養液をアン
バーライトχＡＤ−７と混合し、そして２５℃にて約４
時間の吸着にかける。カラム中で細胞を樹脂から分離す
る。Ｉ　Ｍ　ＮａＣｊ！により洗浄した後、Ｔｒｉｓ＄
３［１衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７，０〜８．５　）により
樹脂を溶出処理する。主画分（３０ｆ＞　　をｐＨ２，
９に調製し、そして２！のベツドボリウムを有するＳ−
セファロースカラム〔２５蒙Ｈ蟻酸アンモニウム緩衝液
（ｐＨ２，９）により平衡化されたアミコンＰＡ）に適
用する。４０ｍＭ蟻酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３，６
）により洗浄した後、５０ｍＭ蟻酸アンモニウム（ｐＨ
３，８）により溶出を行う。主溶出画分（１０１）をΩ
３に膜を装着したＦｉｌｔｒｏｎ　ＭｉｎｉｓｅＬｌｅ
限外濾過系により濃縮する。得られる透明な蛋白質溶液
の０．５１のアリコートを、１．５１のベツドボリウム
を有するＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ−６フアインカラム（０，
５％酢酸により平衡化されたアミコンＧＦ）に適用する
。０．５％酢酸により溶出を行う。主溶出画分（１りを
限外濾過により濃縮し、そして次に２２のベツドボリウ
ムを有するＱ−セファロース・ファスト・フローカラム
［２５ｍＭ蟻酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ２，９）によ
り平衡化されたアミコンＰＡ］に適用する。５０ｍＭ蟻
酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４，２）により溶出を行う
。主溶出画分を限外濾過により濃縮し、そして次に水に
対してダイアフィルトレージョンする。得られる透明な
水性液を凍結乾燥する。この固体は純粋なデスルファト
ヒルジン変異体から成る。

■飢、動功１ＪＩＩ創土辻 Ｓ、Ｒ，５ｔｏｎｅ及びＪ、Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ　（
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ部、　４６２２−４６２８　
（１９８６）　）により記載されているようにしてスロ
ンビンを精製しそして特徴付ける。活性スロンビンの濃
度を４−メチルーウムベリフェリルｐ−グアニジノベン
ゾエートによる活性部位のタイトレージョンにより決定
する（Ｊａｍｅｓｏｎ、Ｇ。

Ｗ’、　＋　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｄ、Ｖ、’　、’Ａｄ
ａｍｓ、　Ｒ，Ｗ、　、にｙｌｅ、Ｗ、Ｓ、八、及びＥ
１ｍｏｒｅ＋Ｄ、Ｔ、＋Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、＋　１３
１　＋１０第一１１７（１９７３））。

８８首】Ｌ乙２±Ａ− ペプチジルｐ−ニトロアニリド基質の加水分解から生ず
るｐ−ニトロアニリンの放出を、品性ＵＶ　２４０分光
光度計を用いる４０５ｎｍでの吸光の増加によって追跡
する。０１１％ポリエチレングリコール６０００、Ｏ，
ｌ　Ｍ　ＮａＣ４及びｐ−ニトロアニリド基質を含有す
る０、０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ’緩衝液（ｐＨ７，８
）中３７°Ｃにてポリエチレンキュベツト中で測定を行
う。基質Ｄ−Ｖａｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ｐ−二）ロアニ
リド（Ｓ−２２６６；Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ）を３０
０団の濃度において、変異体ヒルジンの濃度の測定に用
いられるタイト・パインディング・タイトレージョン（
ｔｉｇｈｔ−ｂｉｎｄｉｎｇｔｉｔｒａｔｉｏｎ）実験
において用いる。各アッセイのため１．　ＯｎＭのスロ
ンビン濃度を用いる。１００岸の濃度での基質ローＰｈ
ｅ−ピペコリルーＡｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２
２３８；にａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ）及び２０〜５０ｐ？
ｌのスロンビン濃度を、ヒルジン変異体の動力学的特性
（下記参照のこと）を決定するためのスローイング・パ
インディング（ｓｌｏｗｉｎｇ−ｂｉｎｄｉｎｇ）阻害
実験において使用する。スロンビンの添加によりアッセ
イを開始する。生成物の量は４０５ｎｍでのｐ−ニトロ
アニリンについての９＋９２０Ｍ−’ｃｍ−’の吸光係
数を用いて計算し、そして基質の濃度は８．２７０Ｍ−
’ｃｍ−’の吸光係数を用いて３４２ｎｍにおいて吸光
光度計により決定する（Ｌｏｔｔｅｎｂｅｒｇ、Ｒ，＆
　Ｊａｃｋｓｏｎ　ｃ、Ｍ、ＩＢｔｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　　７４２．５５８−５６４（１９
８３））。

基質の存在下での酵素の阻害は、次の構成（スキーム１
）： Ｉ！■ により表わすことができる。阻害剤の解離に、はに２／
ｋＩに等しい。酵素への阻害剤の結合が遊離阻害剤の濃
度の有意な消耗を生じさせる場合には、全阻害剤濃度（
ＩＬ）による定常状態速度（Ｖ、）の変化は、次の等式
（１）： ％式％（１） 月２７．３２１〜３３３（１９７２）　）により記載さ
れるであろう。

この式中、ｖｏは阻害剤の非存在下で観察される速度で
あり、Ｅ、は全酵素濃度であり、そしてＫｌ’は見かけ
阻害定数である。阻害剤と基質とが活性部位に対して競
する場合、Ｋｌ’は次の等式（２）： ％式％（２） により阻害剤の解離定数（Ｋｌ　）と関連付けられる。

この等式中、Ｓは基質濃度であり、そしてに１はミバエ
リス定数である。酵素又は阻害剤の濃度が正確に知られ
ていない場合には、この事実を許容するために追加の因
子を導入することができる［ＷｉｌｌｉａＩＩＩｓ、Ｊ
、Ｗ、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ、Ｆ、、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓＥｎｚｙｍｏｌ、６３，４３７−４６７（１９７９）
）　、ヒルジンによるスロンビンの阻害については、ス
ロンビンの濃度は活性部位タイトレージョンから知られ
るが、ヒルジンの濃度は重量によってのみ知られ、そし
てデーターは次の等式（３）： ％式％（３） によって解析することができる。この等式において、■
８は容積当り重量によって表わされる阻害剤の濃度であ
り、そして■８に乗じた場合に阻害剤のモル濃度をもた
らす定数である。

タイト−パインディング・タイトレージョン実験におい
て、ヒルジン及びその濃度についての解離定数は、スロ
ンビンの濃度を一定に維持し、そしてヒルジンの濃度を
、スロンビンの濃度より低い幾種類かの濃度及びスロン
ビンの濃度より高い幾種類かの濃度を含む、範囲にわた
ってヒルジンの濃度を変えることによって決定される。

測定点の合計数は通常７〜ｌＯである。次に、各濃度に
おいて得られた定常状態速度を、ウェイトを付けた非線
形回帰により等式（３）に適合せしめる。回帰のため、
定常状態速度について観察された値をそれらの値の逆数
に従ってウェイト付けする。このタイプのウェイト付け
が最良の結果を与えることが経験的に見出されている（
Ｓｔｏｎｅ、Ｓ、Ｒｏ、及びＨｏｆｓｔｅｅｎｇｅ、Ｊ
、Ｉｌｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５．４６２２−４６
２８（１９８６））。

阻害剤と酵素との相互作用の速度が遅（、その結果阻害
された定常状態速度が遅く達成される場合、スキーム（
１）についての生成物の生成の進行曲線が次の等式（４
）： ％式％ （１９７９）　）により記載されよう。この等式におい
て、Ｐは時点ｔにおいて生成される生成物の量であり、
ｄはＥ＝、Ｉｔ及びに、の関数であり、そしてに′はこ
れらのパラメーター及び阻害剤と酵素との間の相互作用
についての観察される二次会合速度定数（ｋ＋’　）　
（Ｃｈａ等、前掲）の関数である。変異体ヒルジンにつ
いての動力学的パラメーターを得るため、少なくとも６
種類の異るヒルジン濃度において得られた進行曲線デー
ターを非線形回帰により等式（４）に適合せしめる。こ
の解析がＫ。

ｋｌ′及び観察される解離速度定数（ｋＺ’　）の概算
をもたらす。ｋ、ｌの値が活性部位における基質の結合
と独立であること、しかしながら真の価に２及びに＋を
得るためにはに２′及びＫｌ’の観察された値は（１＋
　（Ｓ）／に、）によって除されるべきことがすでに示
されている（Ｓ、Ｒ，５ｔｏｎｅ及びＪ、ＩｌｏｆｓＬ
ｅｅｎｇｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５＋４６２
２−４６２８（１９８６）　；５ｔｏｎｅ、　Ｓ、Ｒ，
＋　Ｂｒ５ｕｎ、　Ｐ、Ｊ、、及びｌｌｏｆａｔｅｅｎ
ｇｅ。

アニリドのに、についてのすでに得られている値３．６
−を使用する（Ｈｏｆ　ｓ　Ｌｅｅｎｇｅ＋　Ｊ、　、
　Ｔａｇｕｃｈ　ｔ、　１１．、及び５ｔｏｎｅ、Ｓ、
Ｒ，、ＢｉｏｃｈｅｌＩｌ、Ｊ、　匪、２４３−２５１
（１９８６）　）　。

これらの動力学的方法を用いて、Ｋ１及びに、について
の下記の値が得られる。

ｎ、ｄ、　＝未決定 貫■、　　　　　　　−゛スルフ　トヒルジン前記の例
のいずれかによるデスルファトヒルジン変異体を含有す
る溶液を０．９％ＮａＣ１溶液に対して透析する。次に
、溶液の濃度を、同じＮａＣ１溶液により０．２■／　
ｍｌ又は２　ｍｇ／ｄに稀釈することにより調整する。

これらの溶液を限外濾過（０，２２Ｉ！ｍ孔の膜を用い
る）により無菌化する。

この無菌化された溶液を、例えば静脈内投与のために直
接用いることができる。

微滋Ｊυγ【匝 次の微生物は、トイチエ・ザンメルンク・フォノ・ミク
ロオルガニスメン（Ｄｅｕｔｓｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ
　ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ；ＤＳＭ）、
Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ｌｂ、Ｄ−３３００
Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ　（西独）に寄託されている
。

サツカロミセス・セレビシェ− （Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）　ＧＲＦ１８寄託日　１９８６年３月４日 寄託番号　ＤＳＭ　３６６５ サツカロミセス・セレビシェ− （Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）　ＨＴ２４６寄託日　１９８７年４月１５日 寄託番号　ＤＳＭ　４０８４

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＭＬ３５０の作製過程を模式的に
示す。 第２図はプラスミドｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＦＩ；−
ＨＩＲのプラスミドマツプを模式的に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のアミノ酸配列（ I ）： 【遺伝子配列があります。】（ I ） （配列中、Ｚ＿０はＶａｌ又はジペプチド残基Ｇｌｙ−
   ＶａｌもしくはＭｅｔ−Ｖａｌであり、Ｚ＿１はＬｙｓ
   、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ又はＶａｌであり、
   Ｚ＿２はＬｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又は
   Ｇｌｎであり、Ｚ＿３はＬｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｖａ
   ｌ又はＬｅｕであり、Ｚ＿４はＰｒｏ又はＧｌｙであり
   、Ｚ＿５及びＺ＿７は相互に独立にＧｌｎ、Ａｓｎ又は
   Ｍｅｔであり、そしてＺ＿６はＨｉｓ、Ｇｌｎ又はＡｓ
   ｎであり；但しＺ＿０がＶａｌであり、Ｚ＿１がＬｙｓ
   又はＧｌｎであり、Ｚ＿２がＬｙｓ又はＧｌｎであり、
   Ｚ＿３がＬｙｓであり、Ｚ＿４がＰｒｏであり、Ｚ＿５
   がＧｌｎであり、Ｚ＿６がＧｌｎ又はＨｉｓであり且つ
   Ｚ＿７がＡｓｎである場合を除く） を有するデスルファトヒルジン変異体、及びその塩。 ２、Ｚ＿０がＶａｌ又はジペプチド残基Ｇｌｙ−Ｖａｌ
   もしくはＨｅｔ−Ｖａｌであり、Ｚ＿１がＬｙｓ、Ｇｌ
   ｎ、Ａｓｎ又はＡｒｇであり、Ｚ＿２がＬｙｓ、Ａｒｇ
   、Ａｓｎ、Ｖａｌ又はＧｌｎであり、Ｚ＿３がＬｙｓ又
   はＡｒｇであり、Ｚ＿４がＰｒｏ又はＧｌｙであり、Ｚ
   ＿５がＧｌｎ又はＭｅｔであり、Ｚ＿６がＨｉｓ又はＡ
   ｓｎであり、そしてＺ＿７がＡｓｎ又はＭｅｔであり；
   但しＺ＿０がＶａｌであり、Ｚ＿１がＬｙｓ又はＧｌｎ
   であり、Ｚ＿２がＬｙｓ又はＧｌｎであり、Ｚ＿３がＬ
   ｙｓであり、Ｚ＿４がＰｒｏであり、Ｚ＿５がＧｌｎで
   あり、Ｚ＿６がＨｉｓであり且つＺ＿７がＡｓｎである
   場合を除く、請求項１に記載の式（ I ）のデスルファ
   トヒルジン変異体、及びその塩。 ３、請求項１に記載の〔Ａｓｎ＾２＾７〕−デスルファ
   トヒルジン。 ４、請求項１に記載の〔Ａｓｎ＾３＾６〕−デスルファ
   トヒルジン。 ５、請求項１に記載の〔Ｖａｌ＾３＾６〕−デスルファ
   トヒルジン。 ６、請求項１に記載の〔Ｇｌｙ＾４＾８〕−デスルファ
   トヒルジン。 ７、請求項１に記載の〔Ｍｅｔ＾４＾９〕−デスルファ
   トヒルジン。 ８、請求項１に記載の〔Ｍｅｔ＾５＾２〕−デスルファ
   トヒルジン。 ９、請求項１に記載の〔Ａｓｎ＾５＾１〕−デスルファ
   トヒルジン。 １０、請求項１に記載の〔Ｇｌｎ＾２＾７、Ａｒｇ＾４
   ＾７〕−デスルファトヒルジン。１１、請求項１に記載
   の〔Ｇｌｎ＾２＾７、Ｇｌｎ＾３＾６、Ａｒｇ＾４＾７
   〕−デスルファトヒルジン。 １２、請求項１に記載の〔Ａｒｇ＾３＾６、Ａｒｇ＾４
   ＾７〕−デスルファトヒルジン。１３、請求項１に記載
   の〔Ａｒｇ＾２＾７、Ａｒｇ＾４＾７〕−デスルファト
   ヒルジン。１４、請求項１に記載のグリシル−〔Ｇｌｎ
   ＾２＾７、Ｇｌｎ＾３＾６、Ａｒｇ＾４＾７〕−デスル
   ファトヒルジン。 １５、請求項１に記載のメチオニル−〔Ｇｌｎ＾２＾７
   、Ａｒｇ＾４＾７〕−デスルファトヒルジン。 １６、請求項１に記載のデスルファトヒルジン変異体を
   含んで成る医薬組成物。 １７、請求項１に記載のデスルファトヒルジン変異体の
   製造方法であって、プロモーター、シグナルペプチドを
   コードする第一ＤＮＡ配列（該プロモーターは該第一Ｄ
   ＮＡ配列に作用可能に連結されている）、デスルファト
   ヒルジン変異体をコードする第二ＤＮＡ配列（該第一Ｄ
   ＮＡ配列と該第二ＤＮＡ配列とは適切なリーディングフ
   レーム中に連結されている）、及び転写停止シグナルを
   含有するＤＮＡ配列から成る発現カセットを含んで成る
   ハイブリドベクターにより形質転換されている微生物宿
   主株を培養し、該デスルファトヒルジン変異体を単離し
   、そして所望により遊離カルボキシ基及び／又はアミノ
   基を有する得られたポリペプチドを塩に、又は得られた
   塩を遊離化合物に転換する、ことを含んで成る方法。 １８、プロモーター、シグナルペプチドをコードする第
   一ＤＮＡ配列（該プロモーターは該第一ＤＮＡ配列に作
   用可能に連結されている）、請求項１に記載のデスルフ
   ァトヒルジン変異体をコードする第二ＤＮＡ配列（該第
   一ＤＮＡ配列と該第二ＤＮＡ配列とは適切なリーディン
   グフレーム中に連結されている）、及び転写停止シグナ
   ルを含有するＤＮＡ配列から成る発現カセットを含んで
   成るハイブリドベクター。 １９、請求項１８に記載のハイブリドベクターの製造方
   法であって、プロモーター、シグナルペプチドをコード
   する第一ＤＮＡ配列（該プロモーターは該第一ＤＮＡ配
   列に作用可能に連結されている）、デスルファトヒルジ
   ン変異体をコードする第二ＤＮＡ配列（該第一ＤＮＡ配
   列と該第二ＤＮＡ配列とは適切なリーディングフレーム
   中に連結されている）、及び転写停止シグナルを含有す
   るＤＮＡ配列から成る発現カセットを含んで成るハイブ
   リドベクター、又は該ハイブリドベクターの前記構成要
   素を、選択遺伝マーカー及び選択された微生物宿主用の
   複製起点を含有するＤＮＡ断片に、所定の順序に連結す
   ることを含んで成る方法。 ２０、プロモーター、シグナルペプチドをコードする第
   一ＤＮＡ配列（該プロモーターは該第一ＤＮＡ配列に作
   用可能に連結されている）、請求項１に記載のデスルフ
   ァトヒルジン変異体をコードする第二ＤＮＡ配列（該第
   一ＤＮＡ配列と該第二ＤＮＡ配列とは適切なリーディン
   グフレーム中に連結されている）、及び転写停止シグナ
   ルを含有するＤＮＡ配列から成る発現カセットを含んで
   成るハイブリドベクターにより形質転換されている微生
   物宿主株。 ２１、請求項１８に記載のハイブリドベクターにより微
   生物宿主株を形質転換することを含んで成る、請求項２
   ０に記載の形質転換された微生物宿主の製造方法。