HUT51671A - Process for producing new proteins - Google Patents

Description

A talólaóny Bódééit ott proteinekre, olóéllitó*» euk aódezorolre, ilyen proteineket terteloezó gyógyezerkéezitaónyekre éo enziagótlóere veié heeznóletukre vénétkozik« * 2 A hlrudin antikoaguláne a taraésaetben · piócá* ben (Hirudo aadicinalia) fordul old. Héra· dlszulfld híd* dal OeszekOtOtt 65 aalnoeaból álló polipeptid.

A plóoanyállal kapcsolatos eled vizsgálatok aár 1984*bdl és Markwardt uttOrdaunkáooéga ót· ioaortok tNaturwlMenochaften 42. 537 (1955)/ Hot hód· Enzyaol· 19· 924 (1970)], napjainkig azonban nea volt lséért a hlrudin szerkezete, aaelyet Doth ás aunkatárea állapított oog IFEBS Lett. 180 (1984)]. A legújabb felfedezések szerint · hlrudin többféle variánsban látásik. Leírták a hlrudin 1 variánst (HV1), a hlrudin 2 variánst (HU2), a hlrudin PA-t éa további analógokat.

A hlrudin a legerdsobb troabin-inhlbitorként lsMrt, alg a koagulációé kaszkád tdbbi onzlajét ne· bsfolyá* eolja. Szeaben a hsparinnal, aeely a hsgyoaényos antlkoagu* léciés terápiában ajánlott antikoaguláns, a hlrudin haté* tát kdzvetlendl a treablnon fejti ki és oltáráén az oldbbitdl az antitroabin XXX-on körtestül ne· hat. A hlrudin ás a troabin közti kölosönhatá· sséladságesen aagas hatás* bsn nyilvánul asg. Ez a hatás tObb nagyságrenddel nagyobb, •int · troabinnak a fibrinogénhez, a várleaszkékhoz, vagy az antitroabin III-hoz való kOtddéeo. Ezért a hlrudin aég alacsony koncentrációjában le képes a troabinnak és biológiai kávétkazaényeinsk deezaa kölcsönhatását lagyózni. Továbbá a hlrudin alacsony toxicitáou, nea antigén, ás a • · · ♦ ··· * ··« «· ··· ·· · ·· vasén keresztel jutva aajdnoa telj·· kiválasztás útin 1· biológiailag aktív faraiban van.

Napjainkban a hirudlnt vagy hlrudlnvarláneokat kódold aDNS-okat éa azlntotlkua gónakat elkroblológlal hordozókon, alnt

Pl· »ίΛ·η (ld. 158 564 éa 168 342 az. európai szabadalai bajalantóaakat) tonyóaztlk. Bér · kitanyóaztott toreékokbon a Tyr⁶³ róazon hiányzik a azulfátaonoéaztor aaaport · éa azért doazulfátohlrudinaknak navazlk éket * úgy létoznak, hogy aagközalltélag ugyanazon biológiai aktivitással ren dolkeznok, alnt a toraéozot·· hírűdin, aaolybon a tlrozln gyök szulfátaonoéeztor fórBájéban van jelen.

A hirudlnt «ind Intravénáson, alnd azubkután juttathatjuk ba az aabor azervazotába· Intravénáson a fó •Halnáaió folozéal idaja 0,84 óra éa közalltélog a hajút· látott dózis 50 %·· változatlan foraában választódik ki • vlzalotban. Szubkután bajuttatáa után a hírűéin gátló azintja a plazaában aég négy óra után la aérhotó volt. Következéakáppon a hlrudln a hoparinhoz hasonló haté«idővel rendelkezik. Tekintettel orra a hátrányra, igen nagy •zOkaég van azolektlv antltrostotikua hatású pollpaptIdákra, •aalyok hosszabb falezéai idővel randalkaznak a «zárvázét ben. Megfelelő pollpoptldek népi egyezer1 kezelés eorán elényöeek vénáé ée artériáé troabózle elleni terápiában. A találmány ilyen antitroatotlkuoen aktív poll peptidőkre vonatkozik.

» ·

Nagy oaökeág van olyan hirudinvegyölotokro· amelysk az antitrönkötikua hatást csökkentik. A hlrudlnvegyQlatsk antitroabotlkuo hatást csökkentő kápaaaáge ebben nyíl· vánul aag, hogy Mggátolják e troabln kölooönhatáoát ennek llgandumaival, novozotoaen a várlaMzko receptorokkal. Az antitroabotikue hatású hlrudln gondos szelekciója során Mgtartja ezt a kápaeoágát, hogy meggátolja a fibrinogán· olvadást, a tronbinhoz ságié alacsony az affinitása· Az ilyen hirudinvagyöletek előnye abban áll, hogy gátolják a fibrin által irányított ttyeaetokat a trombózisra, ugyanakkor kicsi a hatásuk a várlemezkák által irányított haeaooztázis folyaaatára· A találmány tárgyát továbbá ilyen antltrombotikue hatást csökkentő hirudlnvegyOletek kápozik.

Meglepő nődön azt találtuk, hogy a hlrudln hidroföbleitáaának mognövokodáso, anelyot a eora ráglökben lávő bázikua aninosavakkal (Lyo) ködeit nuklootldok helyi opocifikua mutációi áe/vagy az említett rágiőkban lávő aáa módosítáeok okoznak, csökkent ontitrockotl|uo hátáéhoz áo/vagy az álŐ szervezetben hosszabb felezáai időhöz vezet.

A találmány uj, az alábbi aainosav-azakvan· cláju daszulfatohlrudin mutánsokra ás sálra vonatkozik: 10 H-Z^Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Qly·

-Gln-Asn-Leu-Cys-Lsu-Cys-Glu-Gly-Ssr-Asn· •Vsl-Cy8-01y-Gln-Gly«Asn-Z| -Cys-Ile-Lsu·

-Gly-Ssr-Asp-Gly-Glu-Zg-Asn-Gln-Gys-Val• · · · 5 *

-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Zg-Z^-Zg-Ser60

-Zg-Zy-Aap-Gly-Aep-Pha-Glu-Glu-Xle-Pro•G lu~G lu-Ty r-Leu-G ln-OH (X) ahol Z_Q jelenté·· Vei vagy Gly-Val vagy Mat-Val dipaptidil gyök, Z* jelentéé· Lye, Gin. Aen, Leu. Arg. vagy Val. Z* jelenté·· Lya. Arg. Aen. Val. Leu vagy Gin. Zj jelenté·· Lya. Arg. Aen. val vagy Leu. Z₄ jelentéee Pre vagy Gly. Zg ée Z? jelentéee agyaiétól föggetlenöl Gin. Aen vagy Hat ée Zg jelentéee Hie, Gin vagy Aen. ex olyan (X) élte* lánoe képletQ vegyületek kivételével, amelyekben Z_Q jelen* téee val. Z^ jelentéee Lye vagy Gin. z* jelentéee Lya vagy Gin. Zj jelentéee Lya. Z₄ jelentéee Pre. Zg jelentéee Gin. Zg jelentéee Gin vagy Hle éa Z? jelenté·· Aen.

A találaény ezerinti euténeok kölönböznak a tér* néozet·· doezu&tohirudintöl (Z_Q jelenté·· val. Z^, Zg éa Zg Mindegyike Lya. z* Pre. Zg Gin, Zg Hit ée Z? jelentéee Aen) tekintettel az 1-5. főként az 1-4 aeinoaavgyökökre.

A telélaény eleőeerban az olyan (X) éltelénoe képlete deezulfetohirudin auténeekre ée eóikre vonatkozik, •hol a képletben z₀ Val«t vagy Gly*Val vagy Met*Val dipep* tidil gyököt jelent, Z^ jelenté·· Lye. Gin. Aen vagy Arg. Zg jelentéee Lye. Arg, Aen, Vei vagy Gin, Zg jelenté·· Lye

- 6 vagy Arg, Z₄ jelentése Pro vagy öly, Z₅ jelentéee Gin vagy Met, Z_fi jelentéee Hit vagy Aen éa Z? jelentéee Aen vagy Met, az olyan (X) általános képleta vegyületek kivétő* lével, melyek képletében Z_o jelentéee Val, Z^ jelentéee Lyo vagy Gin, Z2 jelentéee Lye vagy Gin, Z₃ jelentéee Lyo, Z₄ jelentése Pro, Z& jelentéee Gin, Z_ft jelentéee Hle ée Z₇ jelentéee Aen.

Ilyen doezulfetohirudin euténeok ez (Aen ]· se se

-deszulfatohirudln,[Aen ]-doezulfetohirudin, (Val ]-doszulfatohirudin, [Oly⁴⁸]-deszulfatohirudln, (Met⁴⁹]-deszulfatohirudin, [Met⁵²]-deszulfatohirudln, [Asn⁵^]-dsszulfatohlrudln, (Gin²⁷, Arg⁴⁷]-deszulfatohirudln, (Gin²⁷, Gin⁵⁶, Arg⁴⁷]-deszulfatohirudln. (Arg⁵⁶, Arg⁴⁷]-deszulfatohlrudin, (Arg²⁷, Arg⁴⁷]•deszulfatohirudln*, gIldi*(Gin²⁷, Gin⁵⁶, Arg⁴⁷]-deszulfatohirudln és aotionil-(Gin²⁷, Arg⁴⁷]· •deszulfatohirudln·

A találmány szerinti vegyületek aind szabadon, aind sóik formájában Is előfordulhatnak· Mivel ezek a vegyületek néhány aminooavréozben szabad aainooeoportokat tartalmaznak, a találmány vegyületa1 eavaddicióe sók fór· aéjéban ia létezhetnek· A megfelelő savaddlolóo sók elsősorban a hagyományos gyógyászatilag alkalmas savakkal kép· zett farmakológiallag alkalmazható sók. Tipikus szervetlen savak a halogén-hidrogén-eavak (aint pl· a sósav), kéneav, foezforeav ée pirofoezforeav. Tipikus szerves savak elsősorban az arénszulfonsavak (mint pl· bonzolozulfon*

- 7 ••v vagy ρ-toluolszulfonsav) vagy rövidazónléneu alkán* ezulfoneavak (mint metánezuífoneav), valamint a karbonaavak, aint ecetsav, tejeav, peleit in sav, sztsárinsav, alaaeav, borkőeav, aezkorbinaav Aa oitroeeav· A találaány szerinti vsgyOletek szabad karbéxlleaoportekat la tartalmaznak néhány aainosav maradékban, aaaly ksrboxllceoportok az agát* paptldnak savas jelleget adnak. A vsgyálstsk szerves vagy ezarvetlan bázlaokkal is képezhetnek sókat, ilyenek pl. nátrium-, kálcium-, kalcium- vagy aagnóziuasók, vagy ammóniával, vagy farmakológlallgg alkalmae szerves nitrogéntartalmú bázissal alkotott aaaóniuaeók· sőt, elvei e vegyietek egyezerre tartalmaznak szabad karboxllcaoportokat és szabad aainocooportokat is, bóléé sóik formájában le létezhetnek· Előnyőeek a faraakológiailag alkalmas sók·

A találmány szerint1 deezulfatehirudin mutáneok előállítási módszere mikrobiológiai tórzotanyéoztósan alapszik, melynek során a tenyészetet olyan tenyészthegységet tartalmazó hibridvektorral alakítjuk át, amely promotorbél áll, ez egy olyan jelzőpeptldet kódoló első DM8-azekvenclához kapeeolódik, aaaly peptid ezerkezetleolvasóként egy aáoodik DNS-ezokvenolához kapeeolódik· Utóbbi DMS-azakveneia a deezulfatehirudin auténét kódolja, tartalmazza az átvivő terminális jeleket. Az eljáráshoz tar* tozik a doazulfatohirudin mutáns izolálása éa kivánt esetben a szabad karboxil- ée/vagy aminoeeoportokat tartalmazó kinyert polipeptid, aóvó alakítása vagy egy keletkezett eé szabad vegyOletté való átalakítómé.

— 8 —

Alkalmas mikrobiológiai tOrzetenyéezotok pl, • SfifeUlm .f.kfe.UM.0· *« ® Saocharomvcaa

MTáMfr törzsek.

A transzformált mikrobiológiai törzsek a technika élléeéból leaart aódezareket alkalmazva aeezimiléIható szón*, nitrogénforráét ót ezervatlon aókat tartalaazó folyékony közegben tenyészthetek.

KOlónféle ezéforráeok alkalmazhatók. BlOnyÖe ezénforráeok az aeezimllálhetó szénhidrátok· ilyen a glukóz, maltóz, mannltol, fruktóz vagy laktóz, vagy acetát, például a nétrlum-acetát, amelyek Önmagukban vagy megfeleld keverékeik formájában használhatók. Alkalmas nitrogénforrások például az aminosavak, igy kazaminosavak, poptldek és proteinek, ezek degradációe termékei, igy trlpton, pepton vagy hús extraktumok, továbbá élesztOkivonat, maláta extraktum, gabona páolé, valamint ammóniumók, igy ammónium-klórid, -szulfát vagy -nitrát, amelyek egyedül vagy megfelelő keverékeik formájában használhatók. Alkalmazható szervetlen sók, például a nátrium, kálium, magnézium éa kálcium szulfátjai, kloridjal, foszfátjai és karbonátjai. Továbbá a tápközeg tartalmazhat növekedést elOsogitO anyagokat, ilyenek a nyomelemek, pl. vas, cink, mangán és hasonlók, vagy egyes aminosavak.

Mikrobiológiai baktériumsajtek hibridvektorokkal alakulnak át. Az ilyen sejtek szelektív kOrOOmények « « « <

- 9 között növekednek, pl· olyan körülmények között, amelyek szakcégetek azoknak a hibrid vektoroknak a kialakítdódra, amelyek a növekedési géneket kódolják. A toldladny szerinti hibrid vektorokban jelenlévő de napjainkban le alkalmazott légszelektívebb jelek az aolnoeav vagy purln bioszintézle enzimjeit kódold gének· Ez a megfelelő amlnooovban vagy purinbdzioban szegény, szintetikus minimum tdpközeg sikál•azdsdt tsszi szükségessé· Olysn gdnsk is alkalmezhetók, amelyek a rezisztenciát agy alkalmas bicéidre viszik dt lpl« a rezisztenciát az amlno-gllkozid G 418-ra átvivő géni· Az antibiotikum-rezisztens igéneket tartalmazó vektorokkal átalakított bdktériuaeejtek a megfelelő antibiotikumot tartalaazó komplex közegben növekednek éo széltől gyoroabb növekedési arányt és nagyobb sojtsöröséget érnek ol« A hibrid vektorokat a lényegéé promoterokkol együtt tartalaazó bektérlumoejtok megtermelik az említett promoterről irényitott deszulfatohirudln mutáns gént· Ha a deezulfatohlrudin mutáns gén a szabályozó promotor irányítása alatt van, akkor a növekedési tdpközeg kompozíciót adoptálni kell a mRNS-átvitol maximálle szintjének elérése Géljéből, pl. élesztőben lévő ΡΗΟΒ promotort alkalmazva e tépközognek tartalmaznia kell kis koncontrációban szervetlen foszfátot ennek a promotornek a működtetésére.

A tenyésztéshez élteiében hagyományos technikát alkalmaznak· A tenyésztési körülményeket, igy e hőméroéklatot, a tdpközeg pH-jót éo a fermentációs időt úgy kell megválasztani, hogy a deezulfatohlrudin mutánsok maximális * 10 Mennyisége terhelődjék. A kiválasztott élesztő vagy e.ooll törzs kedvezően növekszik aerob körülmények között, elárasztott táptalajon, rázással vagy keveréssel, 25-3S°C között, előnyösen 28°C körüli hőaérséklsten, 4-7 közötti, előnyösen 5-öe pH-értéknél és 12 őrs ée 3 nép közötti időtartan alett, előnyösen olyan Időtartanban, helyben a deszulfatohlrudin auténeok kielégítő terheléssel nyerhetők.

A terhelődött deszulfatohlrudin auténeok legtöbbje a felhasznált baktériuntörzstől, pronotertől és jelzőpeptldtől függetlenül kiválasztódik a tépközegbe vegy a perlplazalkue térbe és csak egy kis része sarad a sejt belső részével asszociálva. A pontos arány (kiválasztott vegyületek/eejttel asszociált vegyületek) a fereentáclóe körülnényektől függ.

A deszulfatohlrudin auténeok hagyonányos eszközökkel izolálhatók. Például az első lépés után a sejtek tápközegtől való elválasztása rendszerint centrifugáidénál történik. A keletkező felöluezót polletllén-lalnnel történő kezeléssel a deszulfatohlrudin autónsokra dúsíthatjuk, Így eltávolítható a legtöbb neaprotelnee anyag és az oldat annónluaezulféttal való kezelésével a kicsapódó proteinek eltévollthatók. A baktérluaprotélnék, ha vannak, szintén kicsaphatók ecetsavval történő savanyítással (pl. 0,1 % pH 4-5). A deszulfatohlrudin nutáns további dúsítása érhető el az ecetsavas felü}uezó n-butanollal való extraháléeéval. További tisztItéal lépések például a « · í 1 * 11 oótalanitáe, kromatográfiás eljárások, Így pl· ionoserés-, 0Ó1-, mogoszléeoskromatográfia, HPLC, revorzfázisu HPLC, stb· A proteinelegy alkotóinak elválasztása dlallziaaal la megvalóaltható, iontöltés alapjón gá^lektroferózióséi vagy hordozómentse elektroferóziósai, molekulámérét alapjón megfelelő Sephsdex kolonnán, afflnltóaos kromatográfiával, például antitestekkel, különösen monoklonálio antitestekkel, vagy troablnnal, aaely affinitássá kroaatogróflóra alkalmas hordozóhoz van kötve, vagy* más alj áré «okkal, különösen azokkal, amelyek irodalomból leaortek.

Ha a periplazmikus térben összegyűlt deezulfetohirudin mutánsokat kívánjuk izolálni, néhány kiegészítő tisztítóéi lépésre ven szükség: a deszulfatohirudin mutánsok a sejtfal enzimetlkus eltávolitóoéval, vegy kémiai utón (példéul tiolreagensek, vagy EOTA) történő kezeléssel, vagy a sejtfal ozmótlkue sokknak való alávetóeévol nyerhetők ki· Az ozmótlkue sokk a sejtfal ronceolásával lehetővé teszi a termék foltérését·

Az anti-hirudin vagy anti-dsszulfatohlrudin antitestekkel (pl. hibridemé sejtekből nyerhető monoklonálio antitestekkel) való teszt, a trombin teszt (M.U. Borgaoyor (ozerk·), Mothode in Enxymatic Analysis, II. kötőt, 314-316« oldal, Vorlag Cheeie, Woinhela (NSzK) 1983] vagy véralvadási teszt IF« Markwerdt és mto-a, Throab. Hősnőét. 47. 226 (1982)] használható a deszulfatohirudin mutáns aktivitás jelzésére a tisztitéei eljárás sorén nyert frakciókban.

- 12 Az alkalmazott módszerektől föggően a találmány szerinti vegyületek szabad formában, savaddioiós sók, belső sók vagy bázisokkal képzett sók formájában nyerhetők ki. A szabad vegyületek Ismert módon állíthatók elő a savaddΙοί ós sókból vsgy bázisokkal képzett sókból. A gyógyászatilag alkalmazható savaddioiós sók a szabad vsgyOletekből állíthatók elő savakkal való reagáltatáeukkal, olyan savakat alkalmazva, amelyek a fentemlitett sókat képezik, továbbá a sóképzést követő bapárlássál vagy llofllizálással· A belső sók a pH-nak egy alkalmas, semleges pontra történő beállításával alakíthatók ki.

A transzformált mikrobiológiai baktériumsejtek a találmány szerint a következő lépéaekat tartalmazó rekomblnáne DNS-technlkával állíthatók élőt

- egy olyan tenyésztőagyaéget tartalmazó hibrid vektor előállítása, amely az első DNS-szekvenciához kapcsolódó promotorbői áll, ez a DNS-szekvencia egy olyan jelzőpeptldet kódol, amely szerkezetleolvasóként kapcsolódik egy második DNS szekvenciához, amely a dsszulfatohlrudln mutánst kódolja, és tartalmazza az átvivő terminális jeleket,

- egy mikrobiológiai baktériumtörzs átalakítása az esti*» tett hibrid vektorral,

- és az átalakult mikrobiológiai bektérluooojtek elválasztása az átalakulatlan baktériumosátéktől.

A találmány szerinti hibrid vektorok olyan te* nyóoztőegységet tartalmaznak, amely az eled DNS*ezekven* ciához kapcsolódó promótmrből áll, ez e DNS szekvencia egy olyan jelzőpeptldet kódol, amely azerkezotleolveeókónt kép* ceolódik egy második DNS ezokvenolához a doezulfmtohirudin mutánst kódolja ás tartalmazza az átvivő terminális jeleket.

A megfelelő vektor kiválasztásét a transzformált mikrobiológiai baktóriumeejtek határozzák meg. A megfeleli törzsek azok a törzsek, amelyek a fentieket kielágitik, ilyen mikrobiológiai baktériumtörzsek a Saccharomvcee

Az E.coli tőrzőben végzett deezulfatohlrudln mutáne gén tenyéeztéeére megfelelő vektorok a bakteriofágok példul a X bakteriofág származékai, vagy plazmidok, mint CO1E1 és származékai, például pMB9, pSF2124, pBR317 vagy pBR322. A megfelelő vektorok tartalmazzák e teljes repli* kon éa jelző gént, amely lehetővé teezi azoknak a transz* formált mikroorganizmusoknak a kiválasztásét és azonosíté· sét, amelyeket a fenotipusos módon tenyésztett plazmidok transzformáltak· A megfelelő jelző gének a mikroorganlz* muanak rezisztenciát biztositanak nehézfémekkel, antibiotikumokkal mint pl· ampicillinnel vagy tetraciklinnel és hasonlókkal szeaben.

Az Ε-* sói törzsben a tenyésztőegység szabályozáséra néhány promotor alkalmazható. Főként erősen kifejlesztett gének promoterjeit használják. Megfelelő promoterek a lac, tac, trp ás Ipp promoterek, továbbá a Λ N fág, vagy a / pl fág ás egyebek· A találmány szerint az E.coli törzsben előnyösen alkalmazott promoterek az Ipp ás lac promoterek.

Az S. cerevlelae törzsben a replikádéhoz és tenyésztéshez szükségéé megfelelő vektorok tartalmazzák az élesztő számára az élesztő replikációs kozdőhelyét ée a szelektív genetikus jelet· A hibrid vektorok, amelyek az áleeztő replikáddá kezdőpontját tartalmazzák, például a kromoszómálisan függetlenül ismétlődő ezegmeneet (arc) extrakromoszomálisan az élesztőoojt belesjében marodnak a transzformáció után ée a mltózie során függetlenül replikáidnak. Tehát olyan hibrid vektorok használhatók, amelyek az élesztő 2 /1 plazmid ONS-éhoz homológ szekvenciákat tartalmaznak. Az ilyen hibrid vektorok mér sejten belül a 2/i plazmidban rekombinációval Integrálódnak, vagy önállóan replikáidnak. Az élesztőhöz alkalmas jelző gének főként azok, amelyek antibiotikum-rezisztenciát biztosítanak a törzsnek vagy auxotróf éisztőmutánaok esetében olyan gének, amelyek kiegészítik a törzehiányokat* Megfelelő gének rezisztenciát biztosítanak a dkloheximid antibiotikumnak vagy auxotróf élesztőmutónéban prototrófiáról gondoskodnak, pl, az URAS, tfiUR, HX8S vagy TRPX gén.

IS

ElőnyÖo élesztő hibrid vektorok tartalmaznak to· vábbá egy repllkációe kozdőholyet és egy jelző gént a baktér luatőrzs, főként az b. ooll szénére, úgy, hogy a hibrid vektorok ée prekurzorok szerkezete éo klónozása E. Coli-ban megvalósítható. Élesztőben kifejlesztésre alkalmas promotorok például az AOHI, ADRII vagy PHO5 gén ée a gllkollzlot eredményező promoterek is, pl· a pgk vagy e OAP promotor·

A jelzöpeptidst (Signsl szekvencia) kódoló

DMS szekvenciát ennek a polipeptidet kódoló mikrobiológiai törzsnek a génjéből származtatjuk, amelyet a azokáaoa módon vélaeztunk ki. Ha a törzsmlkroorganlzmuo E.ooll. akkor ompA, lpp, aaltóz kötő protein λ receptor, leucin kötő protein vagy S-laktamáz Jelző ezekvenciát lehet választani· élesztőkhöz a hlrudln jelző szekvenciát a pióca genom OHS-bŐl nyerhetjük. Az élesztőkhöz még előnyösebb jelző szekvenciák például az élesztő invsrtéz jelző és prspo szskvsnicái, «-faktor, faromon peptidáz (KEX1). ”klllor toxin” ée gátló sav foszfatáz (PHOS) gének ée az awamori glukoamiláz jelző szekvencia. A hlrudln jelezekVandájának részével fuzionált jelző szekvencia álltiható elő ez alkalmazott promoterhoz (pl· PHOS) természetesen kapcsolódó gén jelző szekvenciájának (ha van) lekötő részével. Azok a kombinációk kedvezőek, amelyek a jelző ezokvoncia éa a doszulfatohirudln mutáns aminosav szekvencia között pontos sejtosztódást tesznek lehetővé· Kiegészítő szekvenciák a pro- vagy opacer-ezokvonelák, amelyek f · F · • · * a ·«« ··« « · · ·· ·- 1« f ezer kezet ökbo beépítve hordoznak, vagy nem hordoznak apaolflkua azintézlo jeleket, hogy lehetővé tegyék a prekurzor molekulák pontos termelését. A terminális átvivő jeleket tortalmazó DNS szekvencia előnyösen ebből a kiválaoztott mikrobiológiai törzsből származó génnek a 3* oldalszekvenciája, amely tartalmazza a lényeges Jeleket a torainál átviteléhez. Megfelelő 3* oldalszekvenciák, például az alkalmazott proaoterhez természetesen kapcsolódó gének szekvenciái.

A találmány szerinti hibrid vektorokat a technika álláséból lemert módon állítjuk elő, például ez első DNS ezekvonclához kapcsolódó promotérből álló tenyésztőogyoég kapcsolásával, az eleő DNS szekvencia egy olyan JolzŐpoptldot kódol, amely szerkezetleolvasóként kapcsolódik egy második DNS szekvenciához, aaely a deezulfatohirudin autánet kódolja ás tartalmazza a terminális átvivőjeleket, vagy a tonyásztőogység alkotórészét az előre kiválasztott mikrobiológiai törzs replikációs pontjait és a kiválasztott genetikai Jeleket tartalmazó DNS-fragmeneekhez kapcsoljuk·

A találmány szerinti deezulfatohirudin autánsokat kódoló DNS a technika állásából ismert sódon állítható elő. A DNS előállitási módszerei szerint az eredeti deezulfatohirudin génjéből szárászé neakivénatos amlnoeav gyökok kodónjait tartalmazó DNS részeket le kell metszéni a DNS-rÖl és azokat olyan DNS ezegaensekkel kell helyette• ♦ ♦ · · • · · · * · • «4 ·-· » ·«

- 17 ölteni, melyekben ez említett kodonoket olyan dozozlrlbonukleotid triplettek helyetteeitik, amelyek a kívánt érninosavgyököket kódolják vagy helyzet-irányítású műt egén ez le eel Megvalósítják a Mutációt.

A doszulfatohirudin Mutánst kódoló DNS előállításéhoz a doszulfatohirudin DNS egy részének lomotozásét restrikcióé enzimekkel lehet negvelósitani. A Módszer előfeltétele, hogy a megfelelő restrikciós helyek elérhetők legyenek szoknak a kodonoknak a szomszédságéban, amelyeket aeg ókorunk változtatni. Például egy kicsi restrikciós fragsene, amely a nemkívánatos aminosav kodónját tartalmazza, endomukleéz hasítással eltávolítható. A megfelelő kettősszálu DNS szekvencia például kémiai szintézissel állítható elő, amelyben a kívánt aminosavakat kódoló triplettek kerülnek felhasználásra. A DNS fragmenoot Megfelelő irányban a megmaradt nagy fragmonshez kötjük, ée igy egy duplaezálu DNS szekvenciát kapunk, amely a suténét kódolja. A mutáns gén kézbentartásénak megkönnyítése céljából · gént előnyösen egy nagyobb, megfelelő kapcsolóláncokkal ellátott DNS szegmens tartalmazza, amely lehetővé teszi a klónozó vektorban a szegmens inszerciőját áo klónozását.

A találmány előnyös megvalósítása szerint a doszulfatohirudin mutánsokat kódoló DNS-ek előállítását a helyi irányítású mutagenezis váltja ki. Ez a módszer egy In vitro mutagenezés eljárás, ami által a klónozott

DNS régiójában egy Meghatározott hely átalakulhat· (ld. Μ. Z. Zeller áe M. Smith, Msthodo Enzymol, 1OQ. 488 (1983)f 0. Bototoin ée D. Shortle, Science 229. 1193 (1985)1. A mutagonezis megvalósítható a teljes doszulfatohirudin génen, vagy annak egy olyan funkcionális részén, aaely e neakivánt aminosav(ak) kondonja(i)t tartalmazza. Mutagenozés után a autált funkcionális rész a deszulfatohirudin gén másik rá* szóhoz kapcsolódik, hogy ezáltal a teljes doszulfatohirudin mutáns DNS-t szolgáltassa.

A doszulfatohirudin génnek vagy funkcióé részé* nek mutálési módszerét az jellemzi, hogy az egyozálu gént vagy a doszulfatohirudin gént, vagy annak részét tartalmazó egyszélu DNS-t hibridizáljék egy oligodezoxiribonuklsotid primőrré, aaely kiegészíti a hibrid gén régióját azért, hogy mutáljon, kivéve a hibás illesztés(eke)t, aml(k) irányit jé(k) a mutációt, a hibrldizált ollgo-dezoxiribonuk* leotidot használják primőrként, hogy elősegítsék a komp* lementsr-ONS szél szintézisét, a (részlegesen) keletkező kétszálu DNS-t alakítják át agy reeipione mikroorganizmus törzzsé, a mikroorganizmus törzset tenyésztik, ée az átalakított terméket, amely DNS-t a módosított (mutáns) dsszulfatohirudin génnel együtt tartalmazza, elválasztják.

··· «····· * «· ·«· ·· · · ·

- 1β ÁMlritlWM jmtrabtoMaUi fnv.Mt.fk

A találmány továbbá egy olyan Mikrobiológiai törzetenyászetre vonatkozik, amelyet egy tényásztőegyságet tartalmazó hibrid vektorral alakítanak át, ez az egység az első DNS azekvenciához kapcsolódó élesztő promotárból áll, amely DNS szekvencia kódol egy második DNS azekvenclához kapcsolódó, szerkezetleolvasóként működő jelzőpap* tidet, az utóbbi DNS szekvencia kódolja a deezulfatobira* din mutáns és tartalmazza a transzkripcióé terminális jeleket. A találmány vonatkozik még a gyártási módszerre, amely az említett mikrobiológiai törzstenyóazetnek ez am* litett hibrid vektorral való átalakítását tartalmazza·

A mikrobiológiai törzatenyészetek azok, amelyeket a fentiekben már említettünk. A találmány szerinti hibrid vektorokkal való transzformációt az irodalomban

S. cereviaiae-re ÍA. Hinne ás mte-a, Proc. Natl. Acad· Sci. Uea. 75, 1929, (1978)], B, subtilia-ra ÍAnagnoatopouloe ás mte-a, □. Becteriol. 81.. 741 (1961)] és coli-ra ÍM. Mandel ée mts-a, □. Mól. Bioi. 53.

159 (1970)] leirt módon valóoltottuk meg. Az átalakított baktériumsejtok izolálásának előnyös megvalósitáaa eze* lektiv tápközegből történik, amelyhez például biocidet adnak, amellyel szemben a kifejlesztett plazmidban lévő jelzőgén rezisztenciát ad. Ha például a hibrid vektor az amp^R gént tartalmazza, akkor a tápközoghez ampidllint adunk. Ilyen közegben azok a sejtek, amelyek nem tartalmazzák a hibrid vektort, azétronceolódnak.

• « · · • ··· ··« 4 · <« • · · · · · · «« «« · * · · · «

- to axtexaMüsiasluiiuali

A találmány szerint nyerhető uj deszulfatohlrudin mutánsoknak értékes farmakológial tulajdonságaik vannak ée - a piócából extrahált hirudinhez hasonlóan megelőzően vagy - főként - gyógyászati célra alkalmazhatók.

A találmány szerinti deszulfatohirudin mutánsok

- a természetes hirudinhoz hasonlóan - hatékony trombin inhibitorok. (deszulfatohirudin mutáns - trombin komplex disszociációé állandó) értékük 10“⁹M - 10*^²M. A deszulfatohirudin mutánsok trombinra teljesen specifikusak ás nem mutatnak kölcsönhatást a véralvadási rendszer többi proteinázával. A toxicitás rendkívül alacsony. Hasonlóképpen túlérzékenységi vagy allergiás rsakciók nem figyelhetők meg. Sőt, a találmány szerinti mutánsok in vivő hatástsrtama összehasonlítható vagy jobb a természetes doszulfatohirudinénál.

A találmány szerinti uj deszulfatohirudin mutánsok ezért a természetes hirudinnal analóg módon használhatók trombózisok és tromboembóliák gyógyítására ás megelőzésére, beleértve a műtét utáni trombózisok megelőzését is, akut sokk-gyógyításra (pl. szeptikus vagy politraumáa sokk), az alvadással kapcsolatos betegségek gyógyítására, hemodializieekben, hemoszeparációkban ée extrakorporális vérkeringésben.

·-· * »♦ — 21 * találmány olyan gyógyezerkészítményökre lo vonatkozik, amelyek legalább egy találmány szerinti vogyöletet, vagy annak gyógyszerészetileg alkalmazható sóját tartalmazzák, adott esetben agy gyógyszerészetileg alkalmsa hordozóval ée/vagy adjuvánooal együtt.

Ezek a készítmények használhatók főként e font említett indikációkban, ha ezeket bejuttatjuk, például parenterállean, intravénásén, Intrakutén vagy szubkután sódon intranuszkulárisan vagy toplkélisan a szervezetbe·

A találmány vonatkozik a találmány szerinti uj vegyületek használatára és ezsket a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítményekre az emberi és az állati test megelőző és gyógyító kezelése céljából, főként e font említett klinikai szindrómák tekintetében, különösen az emberi és állati testen belül és kívül a véralvadás gátlására·

A dozirozée főként a kezelés specifikus formájé· tói és a gyógyítás vagy megelőzés céljától függ· Az egyse dózisok mértékét és a bejuttatás módját a legjobban a betegség pontos okának egyéni elbírálása utján lehet megakadályozni, az ebből a szempontbél szükséges releváns vérfaktorok meghatározási módszerei a szakember ezémére ismertek· Általában egy Injekció ecetében a találmány szerinti vegyületek gyógyászetllag hatásos mennyisége O,OOS-O,1 sg/tostsuly kg· Az előnyös dózis 0,01-0,05 mg/testsúly kg· A kezelés intravénás, lntramuszkulárlo vagy szub*» hután injekció formájában történik. Következésképpen, a parenterális kezelésre szolgáló gyógyszerkészítmények egyedi dózisformában tartalmaznak a kezelés módjától függően, dózisonként 0,4-7,5 mg találmány szerinti vegyületet· A gyógyszerkészitaények a hatóanyag mellett rendszerint puffért le tartalmaznak, pl. foszfát puffért, amely a pH értéket 3,5 ée 7 között tértje, továbbá nátrium-kloridot, nannitolt vagy ^zorbitolt le az izotonicitáe elérésére· Lőhetnek fagyasztva-ezáritott vagy oldott formában, ez lehetővé teszi, hogy az oldatok előnyöeen tartalmaznak antibaktoriálie konzervélóezert, például 0,2-0,3 % 4-hldrexi-benzoeeav-aetll-észtert vagy -etil-észtert.

A topikálle alkalmazásra szolgáló készítmény lehet vizes oldat, 1oution vagy gél, olajos oldat vagy szuszpenzió vagy zsírtartalmú vagy főként emulgeált kenőcs· Vizes oldat formájú készítményt nyerőnk például a találmány szerinti hatóanyagnak vagy gyógyászatilag alkalmas sójának 4-6,5 ρΗ-ju vizes pufferőidetben való oldásával ée kívánt esetben további aktív komponens hozzáadásával, például gyulladásgátló ezer és/vagy polimer kötőanyag, például poli(vinll-plrolidon), és/vagy konzerválóezer· A hatóanyag koncentráció 0,1-1,5 mg előnyöeen 0,25-10 mg 10 ml oldatban vagy 10 g gélben·

Topikálle alkalmazású kezelésre egy olajos formájú készítmény állítható elő, például a találmány szerinti • 4·· ··· ··*· • · 9 · · · ♦

9« «·« ·· · .··

- 23 · hatóanyagnak vagy gyógyászatilag alkalmazható sójának olajban való ezuszpendálésával, adott esetben duzzadószereknek, Így aluminium-sztearétnak ée/vagy 10 alatti HLB (hydrophillie-llpophlllle-balance) értékű felületaktív anyagoknak (tenzidek), így többértékü alkoholok zsírsavval képzett mcnoésztereinek, például gllcerin-monooztearátnak vagy szorbltén-aonooleátnak a hozzáadásával. Zsírtartalmú kenőcs állítható elő például a találmány szerinti hatóanyagnak vagy sójának kenhető zeiralapban való ezuszpendáláoéval, adott esetben egy 10 alatti HLB értékű tenzid hozzáadásával. EmuIgeált kenőcs állítható elő a találmány szerinti hatóanyag vagy sója vizéé oldatának lágy, kenhető vlvőanyagban való trituráláséval, hozzáadva egy 10 alatti HLB értékű tenzidet. Mindezek a topikális alkalmazásra szolgáló formák konzerválóezereket le tartalmazhatnak. A hatóanyagkoncentráció 0,1-1,5 mg, előnyösen 0,25-1,0 mg 10 g vivőanyegban.

Azon túl, hogy a fent leirt készítmények alkalmasak emberi vagy állati testben közvetlenül gyógyezerhasználatra, a találmány olyan gyógyszerkészítményekre is vonatkozik, amelyek az emberek vagy állatok élő testén kívül alkalmazhatók gyógyszeres kezelésre. Az ilyen készítményeket főként vérhez adott antikoaguláne adalékként használják a keringés vagy a testen kívüli kezelés (például extrakorporélis keringés vagy dialízis művesében) fenntartáséra, konzerválására vagy módosításra (pl. hemoszeparéció).

• ο · · • ··· ♦·♦ * *·· • · · * · * · ·« ·« · ·· · · ·

Az ilyen készítmények, igy törzooldatok vagy különféle egyszeri dózlsformáju készítmények összetételben hasonlók a fant leirt injekciós készítményekhez; azonban a hatóanyag Mennyisége vagy koncentrációja előnyösen a kezelni kívánt évr térfogatától vagy pontosabban annak trombin tartalmától függ. Ezzel kapcsolatban figyelemmel kell lenni arra, hogy a találmány szerinti hatóanyagok (szabad formában), amelyek a trombin tömegének körülbelül ötezörösét teljesen hatás* talanitják, fiziológiailag még relatív nagy mennyiségben is ártalmatlanok ás a keringő vérből még magae koncentrá* dóban is gyorsan eltávoznak, igy nincs túladagolás! kockázat, még transzfuzió alatt sem, A speciális céltól függően az alkalmas dózis 0,01-1,0 mg hatóanyag a vér 1 literére vonatkoztatva, bár a felső hatér kockázat nélkül túlléphető· A találmány főként a deszulfatohirudin mutánsokra, hibrid vektorokra, mikrobiológiai törzstenyészetok ilyen hibrid vektorokkal való átalakításéra és a példákban leirt előállítási eljárásokra vonatkozik.

a. ......

A következő kísérleti részben a találmány különböző magva* lódtáei módjait ismertetjük, hivatkozva a mellékelt rajzok* ra, amelyeken:

1. ábra * sematikusan ábrázolja a pML350 plazmid szerkezetét, • ··» — 25 —

2. ábra - sémátikuean mutatja be a p3DB207/GAPFL-HIR plazmid plazmidtérképét.

Kísérleti rész

1. példa a PML350 (ld. 1. ábra) plazmid szerkezete

a. ) A pIN-III-omljA-2 plazmid DNS feltárása /ig pIN-III-ompA-2 plazmidot [□. Ghrayeb ás ints-a; EMB0-3, 3, 2437 (1984)] 25 /11 7,5 pH-ju 100 mM

Tris-HCl, 50 mM NaCl éa 100/ig/ml zselatin elegyében oldunk és EcoRl és BamHI restrikciós endonukleáz enzimekkel érleljük· Az oldatot TNE-re beállítjuk és fenol/kloroform eleggyel extraháljuk. A DNS-t etanollal csapjuk ki. A pIN-III-ompA-2/ /EcoRI/BamHI DNS vektort agavázoiy gélelucióval történő elektroforézis után Izoláljuk.

b. ) A pML310 plazmid DNS feltárása

20/ig pML310 plazmidot (ld. 168 342 ez. európai szabadalmi bejelentést) 50/il 100 mM 7,5 pH-ju Tris-HCl, 50 mM NaCl és 100/jg/ml zselatin elegyében oldunk ée EcoRl és BamHI restrikciós endonukleáz enzimekkel kezeljük· Az oldatot TNE-re beállítjuk ée fenol/kloroform eleggyel extrahóijuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk. Az F^-Fg-DNS (hirudin-gén) agarózon, gélelucióval történő elektroforézie után izolálható.

• ··

c. ) A pML31O-ből származó F^-Fg-DNS (hlrudin gén) lekötése DlN-III-onpA-2/EcoRI/BamHI DNS vektorral /ug F^-Fg-DNS (hlrudin gén)/EcoRI/BamHI-t és /jg pIN-III-ompA-2/EcoRI/BamHI DNS vektort 50 /11 100 mM

7,5 pH-ju Trio-HCl, 50 mM NaCl ée 100/ig/ml zselatin elegyé* ben oldunk, TNE-re beállítjuk. Az oldatot fenol/klaroform eleggyel extrahéljuk és cjoNS-t etanollal kicsapjuk. A DNS csapadékot 20/11 50 mM 7,8 pH-ju Trls-HCl, 10 mM MgClg, 10 mM OTT, 0,5 mM ATP és 100/i g/1 zselatin elégyében feloldjuk és 25 U//11 T4 DNS ligázzal (Blolabs) 15°C-on 3 órán át kezeljük. Ily nődön a pML350 rekombináns plazmid keletkezik, amely inszorcióként tartalmazza az F^-Fg-DNS-t (hlrudin gén).

d. ) E.coli HB101 átalakítása PML350 plazmiddal·

A kálclummal előkezelt E.coll HB101 eajteket a Mandel által Ismertetett (3. Mól. Bioi. 53. 159 (1970)] eljárással állítjuk elő. A c.) pont szerint kapott oldatot, amely a pML350 rekombináns plazmidot tartalmazza, a T4 DNS ligáz inaktiválása céljából 10 percig 65°C-on melegítjük, majd 37°C-ra hűtjük., A kapott reakcióelegy 10/Ul-át 150/11 kálclummal előkezelt E.coli HB101 sejthez adjuk 10mM MgClg-ot és 10 mM 7,5 pH-ju Trls-HGl-at tartalmazó 200 /11 térfogatban.

Végül az Így kapott reakcióelegyet 30 porcig jégben hütjük, 2 perc alatt 42°C-ra melegítjük, majd 50 percig állni hagyjuk 1 ml L-közegben (10 g/1 Bacto-trypton;

OS ···· ·· • · ··· · ···

Ο · · · ·· · ·· ♦··· ·«·· ·

• ···

4 · • 4 440 g/1 Booto élesztő oxtrektua, 5 g/1 NeCl; S g/1 glukóz;

0,1 8/1 aspiciIlin) 37°C-on. Az «légyből 0,2-0,2 al Mennyiségeket 60 /ig/Ml aapioillint (Serve) tartalaazó 5 agaiból* kára (Me Conkey Agár, Difco) terítjük ki. Az egar tálkákat 37°C-on tartjuk 16-18 őrén át. 185 átalakított, aepicillinrszisztens E.coli HB101 sejtkolóniát kapunk.

e.) Az 1. példa szerint átalakított 6 eejttelapet B 85 nitrocellulóz szűrőre (Schleichsr ée Schull) visszük Grunstsin és Hogneas [Proc. Natl. Acad. Sol USA 72. 3961 (1979)1 szerint roncsoljuk ée a denaturált DNS-t a szűrőn fixáljuk. Ezután a szűrők előhibridizáclóját 20 al (szűrőnként) 4XSET í«30 mM Tris-HCl (pH 8); 150 eM NeCl;

nM EDTA], 0,1 tÖneg/térfogat% Ficoll 400 (Pharaacla),

0,5 % SOS, 50 /ig/nl denaturált borjuceeceenŐMlrigy DNS tartalmu slsgyben 4 órán át 64°C-on végezzük. Ezután a nitrocellulóz szűrőket 20 Ml (szűrőnként) 5X SET (töneg/térfogat); 0,1 töaeg/térfogat% Ficoll 400, 0,2 % SOS ée 50/u1/m1 denaturált borjucsecseaőnirigy DNS tartalau elegyben 16 órán át 64°C-on radioaktív izotóppal (közelítőleg) 10⁵-1Ö* Cerenov cpm szűrőnként) jelzett szondával közöljük. Szondánként 46/64 komplenenter, 1/58, 96/67 és 154/64 konplenenter oligonukleotidőkből álló elegyet (ld. 168 342 ez. európei szabadéin! bejelentést) használunk.

Végül a szűrőket kétszer kimossuk 2X SET, 0,2 %-os SDS-ben szobahőfokon, najd kétszer 2X SET 0,5 %-os SDS-ben mse· • eme ··· ···· • · se·· · es ··· ··4 se * 28 6O°C-on (először 30 percig, utána 60 percig)· A szőröket 3 MM-ss Wathman papír között szárítjuk, majd 1-2 napig -BO°C-on röntgen fiiéra (Fuji) helyezzük erőeitő ernyővel (Xlford). Az eredményül kapott diagramok 5 pozitív kolóniát ábrázolnak, amelyek a további folyamatokhoz használhatók, s amelyek közül az egyik a pML350 jelzésű·

2, példa

A PBH109 plazmid szerkezete

Mivel a pML350 plazmid a multi-klón láncot (EcoRI, HindlII, BamHI telepeket) tartalmazó pXN-III-ompA-2 plazmidból származik, 12 kiegészítő bázispárt tartalmaz az Alá, Gin, Phe, Met aminosavekat kódoló kifejlett hirudln gén előtt· A kifejlett deszulfatohirudin gén a 12 bázis párból in vitro mutagenezis sorén 27 mer cllgonukleotidot használva hurokká formálódik· ^a·) a pML350ZXba_TI/Ba^HI ( J^Il plazmid előállít^ /tig pML35O plazmidot Xbal ée BamHI endonukleázokkal kezelünk. A két Xbal-BamHI fragmene (Sí) közül a nagyobbat agaron történő elektroforézie után gélelucióval izoláljuk és 1 mM 7,5 pH-ju Trls-HCl és 0,1 mM EOTA miegyében oldjuk.

) A pML350/PvuI ( Síi) plazmid előállítása /üg pML350 plazmidot Pvul endonukleázzal digeráljuk. A lineáris DNS pML350/PvuI-et ezután 3 egységnyi bélalkéllfoszfatázzal (Boehringer) 30 percen át 37°C-on ke• · · • · ·

- 29 zeljük. Az enzimet az oldat 60 percig, 65*C-on történő malagitáaával Ínaktiváljuk. A lineáris pML350/PuvX (8XX) DNS agaron történő elektroforázie után gélaluolóval izolálható ée 1 mM 7,5 ρΗ-ju Tris-HCl és 0,1 mM edta elogyéban oldható·

c.) Az JÉ ,g,i ,w.)

A 168 342 számú európai szabadalmi bejelentésben ismertetett eljárás szerint szintetizáljuk sz alábbi DNS fragmenset, amely az I 27 jelzést kapja* 5» - GTA GCG CAB GCC GTT GTT TAC ACC GAC - 3*

I 27

Az 5* terminál foszforilezése l y³²-PJ-ATP és T4 polinukleotid kinéz (Boehringer) alkalmazáséval a leírtak szerint történik. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual (szerk. T. Mániát le és mte-a), Cold Spring Harbor Láb. (1982), 125. oldali.

0,3-0,3/jg SX DNS-t és SXI DNS 40 paci foszforilezett I 27 DNS-fragmenssel keverünk össze 27/11 1 mM

7,5 ρΗ-ju Tris-HCl ée o,1 mM EDTA miegyében. Az elegyhez 3/Ul 10x polimeráz-ligáz puffért (1M NaCl, 65 mM 7,5 pH-ju Tris-HCl, 80 mM MgClg és 10 mM β-aerkapto-etanol) adunk· Az igy kapott keveréket a DNS-fragmensek denaturálása céljából 3 percig forró vízfürdőn melegítjük. Végül az elegyet *9 • · · • · • ·

- 30 fokozatosan (kb, 1°C/perc sebességgel) 30°C-ra hötjük ée ezen e hőfokon tartjuk 30 percen ét. A továbbiakban az elegyet 4°C-on 30 percig, majd azt követően jégben 10 percig Inkubáljuk.

A négy dezoxirlbonukleotid foszfatáz (mlndagylk

7,5 mM) 12/01-ét 6yul 10 mM ATP-t, 6/11 T4 DNS-llgézt (2,5 U/Xil) ée 1,2/il Klenow DNS pollmarázt (Boehringer, 5 U/ül) adunk hozzá és a DNS elegyet (összes térfogat 55/01) 16 órán át 12,5°C-on inkubáljuk,

A DNS elegyet 2 egységnyi EcoRI endonukleázzal órán át 37°C-on digeráljuk, hogy a változatlan kiindulási pML.350 plazmid szétroncsolódjón. Ebben a folyamatban képződik a pBH109 plazmid, amely 1 pp promotert és az ompA-2 jelző szekvenciához funkcionálisan kapcsolódó 1ac promoter/operátort tartalmazza, az ompA-2 a kifejlett deszulfatohirudint kódoló génhez kapcsolódik.

e.) Az E.ooli HB101 transzformációja PBH109 plazmiddal

A kálclum kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációját az j.d. példában leírtak szerint végezzük. A teljes reakcióelegy térfogata 55/ul.

- 31 · ^f·) * pBH1_09 plazmidot tartalmazó ee.1t telepek

Ylzeflálata

100 transzformált sejttelepet tenyésztőnk, minden kolóniából DNS plazmidot preparálunk, amit EcoRl-val kezelünk· Minden DNS plazmid, amely nem digerálható EcoRI-val, képes olyan pBH109 plazmidokat termelni, amelyeknek az EcoRI része hiányzik,

A pozitiv egyforma kolóniákat azonosítjuk. Közülük egyet kiválasztunk és pBH109 plazmldjellel jelöljük.

Az F^-Fg ^DNS pontos szekvenciáját, amely az ompA-2 vezető szekvenciát követi, szekvencia analízissel bizonyltjuk.

3, példa

A hírűdin Lvs27 gyökének mutációja Asn27-té egvszálu M13mp19/hirudln használatéval

	24
hirudin	Gin Gly
kódoló szál	5* CAG GGT
mutagén
primer 1	3* GTC CCA
mutált	5 CAG GGT
kódoló szál	Gin Gly

2830

Asn Lys Cys IleLeu

AAC MA TGC ATC CTG3*

TTG TTA ACG TAG GAC5'

AAC MT TGC ATC CTG3*

Asn Asn Cys Ile Leu

A műtágén primereket foezforamidit módszerrel állítjuk elő áM. H, Caruthers, Chemical and Enzymatic Synthe- 32 sis of Gsne Fragments (H. G. Gaaoan és A. Láng, Ed·.) Verlag Chemie, weinhalm, Német Szövetségi Köztársaság) Applied Blosystems, 380B modell szintetizátoron.

I* ^A* Ml.3mp_19/hirudln előállítása

A. Az M13mp19 kettősszélu DNS-hez (ds-DNA;

0,1Λ9/·1| BRL) 2 JU1 reagens 2-t (500 mM ö,0 pH-ju Tris-HCl;

100 mM MgClg, 500 mM NaCl) (BRL), 1/Ul Xbal-t (10 U/^l), 0,5/11 BamHI-t (10 U//1) és 12/ul vizet adunk. 1,5 órán át 37°C-on történő inkubélés után 0,5 jul BamHI-t, 2,5 jul reagens 3-t (500 mM 8,0 pH-ju Tris-HCl; 100 mM MgClg/ 1000 mM NaCl) (BRL) ée 2 /11 vizet adunk hozzá és további 1 órán át kezeljük 37°C-on. A térfogatot 100 /il-re egészítjük ki vízzel A ds-DNS-t fenolos extrakcióval és etanoloe kicsapással Izoláljuk, majd 30/11 TE pufferben (10 mM Tris-HCl, 1 mM 8,0 pH-ju (EDTA) oldjuk.

^Β· DN.S

Ötször 5 /ig pBH1O9 plazmidot Xbal és BamHI enzimekkel az előzőekben ismertetett módon hasítunk, a kivonatot elektroforézisnek vetjük alá 3 órán át 150 Volt feszültséggel 3,5 %-ős poliakril-amid gélen 1x TBE pufferrel (10x TBE puffér: 108 g Tris, 55 g bórsav, 9,3 g EOTA.2H₂O/1). Az Xbal-BamHI fragmens a hirudin gént (250 bp) tartalmazza, amely UV fény alatt láthatóvá vélik, miután a gélt 400 ml 1x TBE pufferbe mártjuk, amely 10/il etidium-bromid oldatot (10yug/ml viz) tartalmaz. A restrikciós fragmenst tártál- 33 mzó gól egy részét kihasítjuk a gólból ée az 500yul

O,5x TBE tartalmú dialízis egységbe helyezzük és a DNS-t elektroeludónak vetjük álé BIO-RAD min lg él elektroforézls készüléken vezető puffarként 0,5x TBE-t alkalmazva 170 Volt feszültségen 30 percen ét. A DNS-t Elutip-d tipueu kolonnára (Schleicher et Schull) visszük 0,5x TBE pufferral beállítjuk. A kolonnát 2 ml 0,5x T3E pufferral mossuk és a DNS-t 1 M NaCl-ot tartalmazó 0,5x TBE (1 ml) pufferral eluáljuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 10/il TE pufferbe visezaoldjuk.

C. Xbal-BamHI hlrudln inezerció lekötése M13wo19 plazmidba és egyszálas DNS előállítása üt /il Xbal-BamHI hlrudln inszerciót 2/11 Xbal-BamHI által hasított M13mpl9 plazmidot, 1 /11 10x ligáz puffért (50 mM 7,5 pH-ju Tris-HCl, 10 mM MgClg, 10 nM ditiotreítol), 1/11 ATP-t, 1,5/11 T4 DNS ligázt (BRLj 1 U//11) összekeverünk és éjszakán át 14°C-on inkubáljuk. Ot /11 Isköt ősi egyet az E.coli 0M101 kompetens sejtek transzformációjához használunk a □. Messing (Methods in Enzymology 101. 21-76 (1983)] által leirt módszer szerint. Tizenkét átlátszó lemezkét veszünk és egyszálas DNS (ss-DNS) szekvenciákat preparálunk ki mindegyik lemezből □. Messing (ld. előbb) szerint. Az M13mp19/hirudin jelzésű DNS-t 50/il TE pufferben (0,1-0,5ujraoldjuk.

- 34 IX. Helvi irányítású mutaoenszis ^A· Hutagén primer foszforilezése

200 peol (23 yul) mutagén primer 1-et (ld. előbb) 3/11 10x kinéz puffer (1M Tris-HCl, 0,1 M MgClg, 0,1 M ditiotrsitol, pH 8,3) 3 /11 10 aiM ATP és 1 /11 T4 polinuklsotid kinéz (BRL, 10 U/ul) hozzáadásával foszforilezünk. 37°C-on 1 érén át történő inkubálás után a reakciót 65°C-on 10 percig tartó melegítéssel állítjuk meg·

B, A mutacén primer 1 hőkezelése egvszálu M13mp19/hirudin t.W.yttá

6/ul (0,5/ig) egyszálu M13rap19/hlrudint (ld. I.C. pont) 3/11 (20 pmol) foszforilezett mutagén oligodszoxlribonukleotiddal (6,6 pmol/01) és 1 /11 A pufferral (0,2 M 7,5 pH-ju Tris-HCl, 0,1 M MgClg, 0,5 M NaCl, 0,01 M DTT) 7°C-on 5 percig kezeljük, majd lassan, 30 perc alatt szobahőfokra hütjük.

C. Kitérlesztéses-lekötési reakció

Fenti hőkezelt elegyhez 1 /11 B puffer (0,2 M

7,5 pH-ju Tris-HCl, 0,1 M MgClg, 0,01 M DTT), 1/11 10 mM

ATP-t, 4/il 2 mM dNTP keveréket, 5/11 T4 DNS polimmrézt (Boehringer, 1 U//11), 5/11 T4 DNS ligázt (BRL, 1 U/Jul). Az igy kapott elegyet 3 órán át 16°C-on inkubáljuk. A reakciót 65°C-on 10 percen át történő melegítéssel állítjuk meg.

♦ 9 · · · · · · « . , . , .

* · · · · · « ·· «·· ·· · 4 « °· gftvezálu DNS mutáns transzformációja és előállítása

A lekötési elegyet 1:20 arányban steril vízzel higitjuk és 1 /11, 5 /11 valamint 1 /il híg itat lan lekötési elegyet az E.coli BMH 71-81 kompetens S sejtek transzformációjához használunk. [B. Kramer, W. Kramer és H.-D. Fritz, Cell 38. 879-887 (1984)]. A sejteket az M13 cloning and sequoncing Handbook (kiadó: Amersham) szerint ismertetett módon lekezeljük. Tizenkét átlátezó lemezkét veszünk és az ss-DNS-t az I-C. pontban leírtak szerint preparáljuk.

E. Ecyszálu DNS mutén vizsgálata

Az egyezálu DNS mutáns vizsgálatéhoz a 12 ss-DNS minta mindegyikét didezoxinukleotiddal hasítjuk láncvégi módszerrel [F. Sanger, S. Nickler ée A.R. Coulaon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 5463-5467 (1977)]. Kezdetben csak a vért mutációs bázis didezoxinukleotid komplementere vesz részt a reakcióban. Ezután néhány pozitív mutánsból az ss-DNS-ek 19 résztvesznek a mutáns teljes DNS szekvenciájának kialakításában a T7 DNS polimeráz enzim segítségével (Sequenase, USB) Tábor és Richardson [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767-4771 (1987)] által ismertetett módon. A várt bázis változás, amely a rekombinációs hlrudln 27 helyén a Lys —> Asn mutációs kódolja, a DBS szekvenciában figyelhető meg. A kívánt szekvenciéju DNS fágot az M13mp19/hirudin K27N-nel jelöljük.

- 36 F· PNS (RE) slőállltásaeavszálu N13mo19/hlrudin

10-20 /ig egyszálú hlrudin K27N mutáns DNS ás ds-DNS segítségével transzformált kompetens 6.coll 0M101 sejteket az M13 dloning and sequencing Handbook” (kiadó: Amersham) előírása szerint állítunk elő. A 40-50/ig-nyi ds-DNS—t 100 ml tápközsgből nyerjük ki.

G. A hlrudin Xbal-BamHI inszerclós mutáns Izolálása

A mutált hlrudin Xbal-BamHI lnszerciót 25/ig ds-ONS-böl hasltjuk ki és az X-B. pontban ismertetett módon tisztítjuk. A DNS-t 20 /il steril vízben oldjuk.

ténő hasítással

1,5/ig pIN-III-ompA-2 plazmid kivonatot 6/11 reagens 2 puffer (BRL), 2 /ül (20 egység) Xbal, 1 /il BaaHI (10 egység), 1 /1 EcoRI (10 egység) és 37/il víz (teljes térfogat 50/il) elagyéből nyerünk 37°C-on 3 órán át történő inkubálás után. 1/il (10 egység) BamHI, 1/il (10 egység) EcoRI, 5/il reagens 3 (BRL) és 12/11 és 12/11 viz hozzádáaa után az inkubálást még egy órán át 37°C-on folytatjuk.

I. K27N Xbal-BamHI inszerclós DNS hlrudin mutáns lekötése pIN-III-ompA-2 plazmiddal hasított. XbaX-BAmHI-ba

Kilenc /11 K27N Xbal-BamHI inszerclós DNS hirudin, 2/il pIN-III-ompA-2 DNS vektor által hasított Xbal-BamHI, ·

3/il 1Gz lokötö puffor (ML) ée 1 /il (1 ty$ul) T4 DNS ligéz (ML) elegyét U®C*on 1Η» érén ét inkubéljuk·

XXX· ÍAon⁸⁷]deozulfatehirudin auténo tenyóeztéee 3M101 B-eell .Ί.1Λ.Ϊ

a. an.91

0,3/11 XM101, DM101 E.coli koapeteno eejt trenez foraéciójéhoz S /11 lekitdelegyet hoeznélunk a «3· Meeoing (ld. előbb) éltal lésértotett aódezer ezerint. 3 al BxYT/Aapiclllint (BO/ig eeploiUin/SUYT al) adunk a mint éhez ée a eejteket 1 érén ét ozobohöfekon hagyjuk ezaporodni. A tonyéezotből 1 al aintét veezünk éo LB/Anploillin (5 ag eapicillin/al LB agar) lenezre öntjük, majd éjezekén ét 37°C-on hagyjuk ezaporodni· Az étalakuló plazaid DNS-t pXN-XII~oepA-2/HIR-K27N jellel jelöljük.

b. mrwU .tttawh MyIIwbUm

Az LB/Aapioillin leaezekröl tiz baktérium tör* zeot veezünk éo elkülönítve 5 érén ét 37®C-on B al LB/Anpioillinbon (SOyug AmpiciUin/ml LB) növeeztjük. Minden ogyoe kulturéból 1 el alntét voezQnk éo e eejteket oontrifu* géléeoal térjük fel (3000xg 5 porcon ét)« A oojtmintékat külön-külön 100/11 10 mM 8,1 pM*ju Trie-HCl oldattal ezzétlkuean eokkoljuk O°C-on 30 porcon ét, hogy az anyag a baktériumok periplazmikue terébe kerüljön· A eejteket eentri• · · a • ·«« · ♦ ♦ · «·· • · ♦ · · · · • · < a · · · » ♦ · * 18 * fugéláooal távolitjuk el, e folüluozó hlrudinaktlvltésát ex V-B. szekcióban leírtok szerint vizsgáljuk. Azokat e Mintákat, eeelyek e legmagasabb inhibitor aktivitással rendelkeznek, kádkulturábe kiválasztjuk.

C. Kádkultur. t. n lAwi^,7l-damai^f.trtirMdln ü«UUn

A legaktívabb Mintából ezáreezó eejtok viasza* eeredó Mennyiségét (4 el) heoználjuk 1 liter LB/AepioiUin (50/ig Aepicillin/el LB) beoltására. A kultúrát éjszakén át 37^öC-on növesztjük ée a sejteket contrifugálással (SOOOxg 15 porcon ét) tárjuk fel. A eojtgöebökot 50 el 10 mm

8,1 pH-ju Trls-HCl oldatben való ujraszuexpondáláseal ozaótikuo eokkoláonak vetjük elé 0°c-on 1 órán át. A eejtok e porlplaznikus frakcióból contrifugáláoeal (SOOOxg 10 porcon át) távolithátók el.

Ο. Αχ lA.n 1-d.Mulf.tohlrudln tlaztlt.M

A poriplezMlkuo frakció pH értékét 0,1 M HCl oldottál 6,5-ro állítjuk ée 0,45 /ia-oo ezfirőn (Nalgono) leszűrjük. A proteint FPIjC rendezőre (Fást Protein Liquid ChroMtography, Pharuacia-LKB) Nono-Q kolonnára visszük, 50 mH bis-Trie-HCl pufforrol pH 6,5-ro beállítjuk· A doozulfatohirudin Mutánst ez oszlopról lineáris oégredionoü 0-300 mM NaCl-tartalmú 5,5 pH-ju bis-Trls-HCl oldattál Mossuk le 45 perc alett. 0,8 al-nyi frakciókat gyűjtőnk az oszlopeluátumból és a III-B. pontban leírtak szerint hírűéin akti* vitást vizsgálunk· A doazulfatohlrudln mutánst tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, szűrjük, mint fent és Millipore-watera HPLC rendszeren kromatograféljük Brownlee Uabe C8 reverz-fázlau HPLC kolonnán, amelyet trlfluor-oootesv 0,©g térfogatba vizes oldatéval állítottunk ba· A hlrudln mutánst az oszlopról lineáris gradlensü 7-28 térfogat^ acetonltrllt tartalmazó trlfluor-aceteav 0,09 térfogatX-oo vizes oldatéval eluéljuk· Az (Aen²⁷)-deszulfatohlrudin tisztasága így meghaladja a 98 %-ot, agyatlan csúcsként jelenik meg a 28· percnél.

ív.

A tUztltott lAwi^l-dMZMlfat^iirudln* a d·» terminálé aminosav Összetevőkkel, az N*tarmlnália szekvenciával és a peptldtérkóppel jellemezzük.

2*5 )ug proteint Üveglombikban ÖN sósavgőzben 110°C-on IR.U Henrlkson és S.C. Meredlth, Anal. Blochem. 1Sö. 85*74 (1984)] hldrollzálunk. Az amlnoaavakat vákuumban megezáritjuk, fonllizotioclanát származékokká alakítjuk és reverzs-fézieu kolonnát szétválasztjuk tB.A. Bldllngmeyer, 8·A. céhén és T. L. Terűin, 3. Cromatography 95*104 (1984)]· Az aminosav Összetétel 5889 0 molekulasúlynak felel meg·

Közelítőleg 50 pmol tAen^⁷]-doezulfatohlrudlnt 5 ciklusos automatizált Edman degragéciónak vetjük alá

- 40 Applied Bloeyoteme 470 A tipotu gázfázisú analizátort alkalmazva (H.W. HunkapiUer áa L.6. Hodd, Hatoda in Enzymology SÍ, 486-494, (1983)1, hogy meghatározzuk az N-torainálla aminosav szekvenciát. A keletkező feniltlohidantoin aminosavakat rsverz-fázisu HPUC rendszeren ÍR.M. Hewlck, M.w. HunkapiUer, L.E. Hood áa w.3. Dreyor, 3. Biál. Chem. 286. 7990-7997 (1981)1, Applied Bloeyotoae 120 tipusu on-line analizátort alkalmazva szétválasztjuk.

Az lAsn^S7l-deezulfatohirudin peptid-térképének maghatározása céljából SOyug proteint vákuum alatt megazéritunk és perhangyasavval 37°C-on 1 érén ét kozoljOk, ÍC.H. w. Kire, Hothodo in Enzymology Jl, 197-199 (1967)3. A reakclóelogyhoz 45 /il hideg vizet odúnk megfagyasztjuk ée vákuumban szárítjuk (kétszer). Az oxidált hirudln mutánst 50/il 5 mM NH₄CO₃-ot tartalmazó oldatban digeráljuk 1 /ig toraolizinnel (Beohringor) 4 árán át 37*C-on. Frakoionáláo előtt az elegyet vákuumban ozáritjuk, majd 0,1 térfogatezázalókoo trifluor-ecstsav/vlz elegyben oldjuk. A paptidőket revorz-fáziou HPLC-vol tieztitjuk. Vydac 0 18 tipuou kolonnát haoználva, amelyet 0,1 térfogatozázalékoe trifluor-eoeteav/viz eleggyel állítottunk be. A poptidekot 0-28 térfogatezázalékoo, lineário gradioneO aootonitrlllol 90 porcon át 1 ml/paro átfolyó ooboeoéggol oluáljuk.

A mutációkat tartalmazó poptidok aminoeav azakveneiáját az előzőekben leírtak szerint határozzuk meg, bizonyítva a Lys27 > Aon27 aminoeav ozubaztituciót.

······· · ··· ♦ · · · · ♦ · ·· ··· · ♦ · t«

hlrudin

* 41 * 4· n*M« A hlrudin la 36 avakéntk .utáeiój. A,n aa ovMtk. 34 36 38 Asp Gly Glu Lva Asn Gin Gye

kódoló szála 5' GAC GGT GM AAA AAC CAG TGC 3* mutagén

primer 2	3’ CTG CCA CTT TT£ TTG GTC AGG 5·
sutáit	5* GAC GGT GAA AAT AAC CAG TGC 3*
kódoló szél	Asp Gly Glu Asn Asn Gin Cya A 3. példában (X. ée XX. rész) megadott folya-

atót mutagén priaer 2 éa M13ap19/hirudin használótóval ságié aé te Ive helyi irányítású mutagenezla valósítható meg. Az átalakuló DNS plazmidot pXN-XXX*cmpA-2yHXR-K36N jellel jelöljük éa a autána proteint B.cell törzsben tenyésztjük· tisztításét a 3. példában (XXX*réaz) ismertetett módon végezzük. A mutáns protein azonosításét, amelyben a Lys 27 gyököt Asn 27 gyök helyettesíti, amlnoaavöeazetétellel ée N-teralnálla azekvenclaanallzlseal végezzük, az inhibitor sajátságokat a 19, példa szerint határozzuk meg. A mutáns jelölése: (Aan^l-doezulfatohlrudln.

A 3. és 4. példában ismertetett eljárást mutagén primer 4 használatával megismételve a kivént mutáns proteint kapjuk, amelyben a Pro 48 aminoeavgyökölt Gly 48 gyök helyettesíti. Az átalakuló DNS plazmid a pIN-XXX-ompA-2/HXR-P48G jelölést, a mutáns a (Gly⁴⁸]-doszulfatohirudin jelölést kapta.

7, példa

A hírűdín Gin 49 gyökének mutációja Met 49 gyökké

			47		49
kódoló		Pro	Lys	Pro	£ia	Sor	His	Asn
hírűd in szél	5»	CCG	AAA	CCG	CAG	TCT	CAC	AAC	3*
mutagén	3·	GGC	TTT	GGC	TAC	AGA	GTG	TTG	5·
primer 5
mutált	5*	CCG	AAA	CCG	ATG	TCT	CAC	AAC	3*
kódoló szál		Pro	Lys	Pro	Met	Ser	His	Asn

A 3. és 4. példában megadott eljárást mutagén primer 5 használatéval megismételve a kivánt mutáns proteint kapjuk, amelyben a Gin 49 aminosavgyököt Met 49 gyök helyettesiti. Az átalakuló DNS plazmid jele pIN-III-ompA-2/HIR-Q49M. A mutánst (Met⁴⁹]-doozulfatohirudin-nal jelöljük.

• · · ·

Mn, aaJrfffWi mi M.....jxWeí • · · • · · · · « · • · · · · · ·· ··« ·« ν »«

	52
kódoló	Gin Ser Hie Aen Aep Gly Aep
hirudin szál	5* CAG TCT CAC AAC GAC GGT GAC 3*

«ütegén

primer 6	3· GTC AGA GTG TAC CTG CCA CTG 5*
mutált	5' CAG TCT CAC ATG GAC GGT GAC 3*
kódoló ezól	Gin Ser Hie Met Asp Gly Aep

A 3. ée 4. példában leírt sljóráet autogén primer 6 heeználatával megismételve e kívánt mutáns pro telnt kapjuk, amelyben as Aon 52-t Hot 52 helyottemitl. As étalakuló DNS plazmid jele pIN-III-o«pA-2/HIR-N52M. A mutánst lMet⁵²]-deezulfatohlrudin-nel jelöljük.

9. Példa

A hírudln Hie 51 övökének mutációim Asn 51 övökké kódoló hírudln szól «ütegén primer 7 mutált kódoló ezól

Pro Gin Sor Hit Aon Aep Gly

5' CCG CAG TCT CAC AAC GAC GGT 3'

3* GGC GTC AGA ΤΤθ TTG CTG CCA 5*

5* CCG CAG TCT AAC AAC GAC G6T 3* Pro Gly Sor Aen Aon Aep Gly

• 45 A 3. és 4. példában megadott eljáróét mutagén primer 7 használatával megismételve a kivánt mutáns proteint kapjuk, amelyben a His 51 gyök Asn 51 gyökkel van helyettesítve· Az átalakuló ONS plazmid jele pIN-III-ompA-2/HIR-H51N. A mutánst [Asn®^l-deszulfatohirudin-nal jelöljük.

AJ>_lni41n_UYa· 27 gyök mutáciáia Gin 27-té és a kXi· ,V.

Ai Lvs 27 mutációia Gin 27-té

					27
kódoló		Gin	Gly	Asn		Cys	Zla	Leu
hlrudin szál	5*	CAG	GGT	AAC		TGC	ATC	CTG 3*
műtagán	3*	GTC	CCA	TTG	fiJT	ACG	TAG	GAC 5*
primer 8A
mutált	5·	CAG	GGT	AAC		TGC	ATC	CTG 3*
kódoló szál		Gin	Gly	Asn	Gin	Cys	Xle	Leu

Bi Lve 47 mutációja Arg 47-tó

kódoló	Gly Thr Pro Lvs Pro Gin Ser
hirudin szál	5* GGT ACC CCG AAA CCG CAG TCT 3’
mutagén primer 8B	3* CCA TGG GGC T£T GGC GTC AGA 5*
mutált	5* GGT ACC CCG AGA CCG CAG TCT 3*
kódoló szól	Gly Thr Pro Ara Pro Gin Ser

• ·♦ ·

- 46 A 3. ás 4· példában ismertetett eljárást mutmgén primer 8A ée B használatával megismételve a kivént mutáns proteint kapjuk, amelyben a Lys 27-t Gin 27, és a Lys 47-t Arg 47 gyök helyettesíti· Az átalakuló DNS plazáid jele pIN-III-ompA-2/HIR-K27Q, K47R. A mutánst [Gin²⁷,Arg⁴⁷]-de* ezulfatohirudin-nal jelöljük·

Ib.^Ald.a

A hlrudln Lys 27 gyökének mutációja Gin 27-té. a Lve 36 mutációja Gin 36-tá és a Lvs 47 már. dója Arg 47-té

A: Lve 36 mutációja Gin 36-tá

kódoló hirudin szál	34 Aep Gly 5* GAC GGT
mutagán
primer 9	3* CTG CCA

38

Glu Lvs Asn Gin Cys

GAA AAA AAC CAG TGC 3'

CTT £TT TTG GTC ACG 5* mutált

5’ GAC GGT GAA CAA AAC CAG TGC 3* kódoló szál

Asp Gly Glu Gin Asn Gin Cys • · · • 47

Bt Lys 27 mutációja Gin 27-t*

A Lys 27 mutációja Gin 27-té a 10 A példában bemutatott módon játszódik la· c> *nYJ ΛΖ. JWMWJf Λπ ΛΖγΙΛ

A 3. és 4. pólóéban iemertotett eljárást autogén primer 8A, 9 ás ΘΒ használatéval megismételve, a kivént mutána proteineket kapjuk, amelyekben a Lye 27 Gin 27-tel, a Lye 36 Gin 36-tal ée a Lys 47 Arg 47-tel van helyettesítve· Az átalakuló DNS plazmidot pIN-IXI-ompA-2/HIR-K27Q, K36Q, K47R jellel, a mutánst ÍGln²⁷,Gin³⁶,Arg⁴⁷]-dsszulfatohirudin névvel jelöljük·

1²f......

A hírűéin Lvs 36 gYÖkénsk mutáoiója Arc_^ft-tó fa & Μ2,·⁴7,γΛ*

A: Lvs 36 mutációja Arc 36-tá kódoló hirudln szál

36 38

Asp Gly Glu Lvs Asn Gin Cys

5· GAC GGT GAA AAA AAC CAG TGC 3* műtegén primer 10

3* CGT CCA CTT T£T TTG GTC ACG 5 mutált

5· GAC GGT GAA AGA AAC CAG TGC 3*

Asp Gly Glu Arc Asn Gin Cys kódoló szál • ·· • · · · • 4 ·· ··9 · • · · · · · « ·· ··· 4· · ··

- 48 Βι Lva 47 nutációja Ara 47-té

A Lys 47 autódója Arg 47-té a 10 B példa szerint négy végbe.

A 3. ée 4. példában ismertetett éljéráét «ütegén primer 8B és 10 használatával megismételve a kívánt mutáns proteint kapjuk, amelyben a Lys 36 Arg 36-tal és a Lys 47 Arg 47-tel van helyettesítve. Az átalakuló DNS plazmid jele pIN-III-ompA-2/HIR-K36R, K47R. A mutánst lArg^®,Arg⁴⁷]-deszulfatohirudin-nal jelöljük._z

ALys²⁷ gyftk mutációja Ara 27-té.és a Lva 4? mutációja Ara 47 övökké

Aj Lva 27 mutációja Ara 27-té

				25		27		29
kódoló			Gin	Gly	Asn	LVS	Cys	Ile	Leu
hirudin	szál	5*	CAG	GGT	AAC	AAA	TGC	ATC	CTG	3*
nutagén
primer	11	3*	GTC	CCA	TTG	T£T	ACG	TAG	GAC	5*
mutált		5«	CAG	GGT	AAC	£GA	TGC	ATC	CTG	3*
kódoló	szál		Gin	Gly	Aen	Α££ Cys	Ile	Leu

- 48 Βι |.ν» 47 «utéeiAj» Ara 47-t«

A Lys 47 Mutációja Arg 47-té ι 10 B példában ioaertetett módon aegy végbe.

A 3. ée 4. példában ienerletett eljáróét «ütegén primer 88 ée 11 haezálatéval aegisaétolvo e kívánt au* tánc proteint kapjuk, esélyben a Lys 27 gyök Arg 27-tel ée e Lye 47 gyök Arg 47-tel van helyetteeltve. Az átalakuló DNS plazmid jele pIN-III-oapA-2/HXR-K27R, K47R. A mutánst lArg²⁷,Arg⁴⁷]-deezulfatohirudin-nal jelöljük.

A^My.Oln^^Ar^j-dmazulfettolrudln N-ter13 5 kódoló jelezokvencle ... Vei Val Tyr Thr Asp Oye hlrudln őzéi 5»GCG CAG GCC ... OTT GTT TAC ACC GAC TAC 3* autogén primer 12 3⁴CGC GTC CGG CCA CAA CAA ATG TGG CTG ACG 5' mutált 5*GCG CAG GCC GGT GTT GTT TAC ACC GAC TGC 3' kódoló szál jelszekvencia Glv val Val Tyer Thr Aip Cys

A 3. ée 4. példában ismertetett eljárás autogén priaor 8A, 88 és 12 használatéval aeglsaótelve a kívánt autánc proteint kapjuk» esélyben a ÍGln²⁷,Gln^S6,Arg⁴⁷J-do* szulfatohlrudin N-teralnélja Gly gyökkel van bővítve. A proteint Glycyl- iGln^Gln^Arg^l-deszulfatohlrudln-nel jelöljük.

··· ·· • 50 ·

W. pdld.

A iGln .Arg⁴⁷l-d.tzulfatohlrud In N-t.rulnál·iának kibővítése mattonin övökkel

1

3

5

kődolő jelszekvencia

Val

Val

Tyr

Thr

Asp

Cys

hírűdin szál

5*

GCG

CAG

GCC

a a e

GTT

GTT

TAC

ACC

GAC

TGC

3*

mutagén

primer 13

3*

CGC

GTC

CGG

TAG

CAA

CAA

ATG

TGG

CTG

ACG

5»

mutált

5*

GCG

CAG

GCC

ATG

GTT

GTT

TAC

ACC

GAC

TGC

3·

kódoló szél

jelezekvencia

MSX

Val

Val

Tyr

Thr

Asp

Cyo

A 3. és 4. példában ismertetett eljárást mutagén primer 8A, 8B ée 13 használatéval megismételve s kivént mutáns proteint kapjuk, amelyben a áGln ,Arg ^z]-deszulfátohirudin N-terminélja Met gyökkel van bővítve. A proteint metionil-[Gln .Arg I-deszulfatohirudin-nal ja* löljük.

1&,.....pJAJa

Az lAen 1-deszulfatohirudin tenvéezté.M. élesztőben

Az [Asn ]-deszulfatohirudln egy mutáns pro27 27 tein Lys —> Asn aminosavcserével, amelyet helyi irányítású műtagenezisse1 érhetünk el (ld. 3. példa).

A pXN-XXX-oapA-2 vektorban lévő étit ált polipeptid kódoló szekvenciájának klónozását a 3. példában lemrtettOk. éleez* tóben való előállítóéhoz e helyes autációvel rendelkező ezek* véneiét a Megfelelő élesztő tenyésztő vektorba illesztjük, eeely biztositja az erős, lényeges proaotert, az élesztő jelző MEekvenciét ée ez élesztő átvivő terainélt, hogy kialakuljon e funkcionális tenyésztőegyeág.

A. fa IA_;n²⁷l-d««ulf»tohi.rudln kódoló .z.kv.ncUJán.k

Uol*lá»a

2S yog pXN-XXX-oapA-2/HXRKE7N plazaldot (ld.

3. példa, XXX, rész) Xbal ée BaaHX enziMael kezelünk· A

0,3 kb XbaX-BeaHX fregaenset 2 %-os preparetiv agar gélen izoláljuk. A DNS-t elektroelueiónak vetjük elé ée etanollal kicsapjuk. Az xbel-BaeHX fregeene tartalmazza az oapA jelző szekvenciát ée a «utált hirudin kódoló szekvenciát. A fragaeneet tovább hasítjuk HinfX enzimei, «Mely a hirudin szekvenciában a 22 nukleotid helyen eetezi « szekvenciát· A 176 bp HinfX-BaeHX fregaeneet a fent leírtak szerint izoláljuk. Ez a DNS fregeene az (Aen²⁷}-deezulfetohirudint kódolja.

B« Az ^en²⁷l-deszulfatohirudinkódoló szekvenciaklónozása él^^g.tj^Yészt^. v^tor.baj.

A p3DB207/GAPFL-HIR (ld. 2. ábra, 225 663 az.

európai szabadéiul bejelentés plazaldot BalX enzimei ke• · • · · · · • · · · • · · · ·

- 52 zeljük. A plazmidban három BalX-hely van, egy a PH05 jel* szekvenciában, kettő a vektorban. Az 1,3 kb Ball fragaenet izoláljuk, amely tartalmazza a BalI-től a BamHI helyig a pBR322 szekvenciát, a BamHX/BglII kapcsolódást a rövid, lényeges GAPFL promoterhez ás a PH05 jelző szekvenciát a Ball helyig.

Két szintetikus ollgonukleotid, melynek képlete az alábbi:

Ball Hifi (1) 5* CCAATGCAGTTGTTTACACCGACTGCACCG 3* (2) 3* GGTTACGTCAACAAATGTGGCTGAGGTGGCTTA alakítja ki a kettőszálu DNS láncot, amely biztosítja a nyolc nukleotidot a Ball helytől a PH05 jelző szekvencia végéig és a kirudin kódoló szekvenciájának 22 nukleotidjét a HinfI helyig (a 2. ábrán nincs jelölve). Az (1) és (2) oligonukleotideket 10yul 60 mM 7,5 pH*ju Tris-HCl, 10 mM MgClg, 5 mM OTT, 0,5 mM ATP és 27 U T4 polinukleotid kinéz (Boehringer) elegyében 45 percig 37°C*on kezeljük. A reakcióelegyeket (1) és (2) egyesítjük, 10 percig 75°C-on melegítjük, majd hagyjuk lehűlni szobahőfokra· A hőkezelt ollgonukleotid láncot -20°C-on tároljuk.

Az 1,3 kb Ball ONS fragmensből 2 pmol-t

100-szórős feleslegben vett enzim* és hőkezelt oligonukleotid lánccal 10/11 60 mM 7,5 pH*ju Trie-HCl, 10 mM MgClj mM OTT, 3,5 mM ATP ée 400 U T4 DNS-ligáz (Biolabe) elegyében 15°C-on 16 órán át inkubálunk. A T4 DNS-ligáz 10 per* *

cig 8O°c-on történő ÍnaktÍvélé·· után az oligonuklaotid láncok feleslegét a DNS kicoapáséval eltávolítjuk. A DNS klcoapáoét 10 aM EDTA, 300 aM 6,0-oe pH-Ju nátrium-ecetét ée a térfogat 0,54 százalékában Jelenlevő izopropanol segítségével végezzük. A DNS-t salX enzimei digoréljuk· A l keletkező fragmenoekot 1 %-oe preparativ agai^gélen választjuk el, Az 564 bp fragmenset a gélből elektrooluclóval tárjuk fal és etanollal kicsapjuk. A DNS*t 0,1 paol^ul koncentrációban ujraszuszpendáljuk.

Az 564 bp Sall-HinfX fragsone tartalmazza a 276 bp Sall-BsbHI pBR322 DNS fragasnsst, a GAPFL promotort, a PH05 jelző szekvenciát és a hirudin kódoló szekvenciáját a 22 nukleotid helyig (HinfX hely),

A p3DB207/GAPFL-HIR plazmidot (Id, feljebb) SalX és BaaHX enzimekkel kezeljük és a 6,7 kb Sall-BamHl vektor fragmoneot izoláljuk» A vektor fragmone a I átvivő terainátort la tartalmazza, A fentiek szerint izolált három DNS fragmoneot a következő reakcióban kötjük les 0,2 pmol 564 bp SalX-HinfX fragmoneot 0,2 pmol 176 bp HinfX-BaaHX fragmenset óe 0,1 pmol

6,7 kb SalX-BaeHI vektor fragmoneot 10^ul 60 mM 7,5 pH-Ju Tris-HCl, 10 mM MgClg, 5 mM OTT, 1 mM ATP óe 200 U T4 DNS ligáz miegyében 15®C-on 6 órán át kezelőnk, A lekötőelogybői 1yul-nyi mennyiséget kiveszünk, és 100yul kálcium-kozalt, transzformációs fi,coll kompetens sejtekhez adjuk, 12 transzformált amplcillln-rszisztone törzset enyésztünk 100/Ug/l ampicillin tartalmú LB tépközogben.

• ·

- 54 A DNS plazmidot preparáljuk és (Holmes ás mts-a Anal. Biochem. 114. (1981), 1931 BamHI ás Sáli kettős digerélássál analizáljuk. A láncot keret-kapcsolódásait a jelző ezek venciához és a hirudin kódoló szekvenciához DNS-szekventá lással bizonyítjuk (Sanger és mts-a Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 54631. A helyes szekvenciával rendelkező klón jele p0DB207/GAPFL-HIR-K27N.

Hasonló módon építhetjük fel az élesztőben kifejlesztett plazmldokat az alábbi kiindulási anyagokból:

pIN-III-ompA-2/HIR-K36N (4. példa), pIN-III-ompA-2/HIR-K36V (5. példa), pIN-III-ompA-2/HIR-p48G (6. példa).

pIN-III-ompA-2/HIR-Q49M (7. példa), pIN-III-ompA-2/HIR-N52M (8. példa), pIN-III-ompA-2/HIR-H51N (9. példa).

pIN-III-ompA-2/HIR*K27Q,K47R (10. példa), pIN-III-ompA-2/HIR-K27Q,K36Q,K47R (11. példa), pIN-III-ompA-2/HIR-K36R,K47R (12. példa) és pIN-III-ompA-2/HIR-K27R,K47R (13. példa).

A kapott élesztőben előállított plazaidők a következők:

p0DB207/GAPFL-HIR-K36N, p3DB207/GAPFL-HIR-K36V, pDDB207/-GAPFL-HIR-P48G, · · ·

- 55 p3DB207/GAPFL-HXR*Q49M, p3DB207/GAPFL-HIR-N52M, p3DB207/GAPFL-HIR-H51N, p3DB207/GAPFL-HIR-K27Q,K47R, p30B207/GAPFL-HIR-K27Q,K36Q,K47R, PÜDB207/GAPFL-HIR-K36R.K47R és p3DB207/GAPFL-HIR-K27R,K47R.

±7. példa

A GRF18 és ΗΤ246 Saccharomyces cerevisiae törzsek transzformációJa

A GFR 18 (DSM 3665; a, hlsS-11.. his3-15. Xsu2-3. Ieu2-112. can^R) és a HT246 (DSM 4084 a; leu2-3. Ieu2-112. prb) Saccharomyces cerevisiae törzseket a 16B példában felsorolt, élesztőben előállított plazmidokkal a Hinnen és mts-a által leirt transzformációs eljárás szerint iProc. Natl. Acad. sci. USA 75. 1929 (1978)] alakítjuk át. Az átalakított élesztősejtekét leucinban szegény élesztős minimál tápközegben választjuk ki. Az egyszer transzformált élesztőtelepeket izoláljuk ée az alábbiak szerint nevezzük el:

Saccharomyces cerevisiae GRF18/p3DB207/GAPFL-HIR-K27N, Saccharomyces cerevisiae GRF18/p3DB207/GAPFL-HIR-K36N, Saccharomyces cerevisiae GR FI8/p30B207/GAPF L-HIR- K36V, Saccharomyces cerevisiae GRF18/p3DB207/GAPFL-HIR-P48G, • · ♦ » · * 56 *

SftfiCharffBYÍMML.CIirAYÁŐlift G*H 8/p3DP207/GAPFL-HXR-Q49M, Saccharoeycas cerovlBiae GRFl8/p3DB207/GAPFL-HIR-N52M, Saoeharoavces cerevlsiae GRF18/p3DB207/GAPFL-HXR-H5lN, Saoaharoaveas cerevlsiae GRF18/p30B207/GAPFL-HXR-K27Q,K47R, Saccharoavces corovlslae GRF18/p3DB207/GAPFL-HIR-K27Q,ia6Q,K47R, Saccharoavcae ceraviaiae GRF1B/p3DB207/GAPFL-HIR-K36R,K47R, Saccharoavcee cereviaiaa GRF18/p3DB207/GAPFL-HIR-K27R, K47R, Saccharoavcee careviaiaa HT246/p3DB207/GAPFL-HXR-K27N, Saccharoavces cerevlBiae HT246/p30B207/GAPFL-HIR-K36N, Saccharoavcee cerevielae HT246/p30B207/GAPFL-HIR-K36V, Saccharoavcee ceraviaiae HT246/p30B207/GAPFL-HIR-P48G, Saccharoavcea carevialaa HT246/p3DB207/GAPFL-HIR-Q49M, Saccharoavces ceraviaiae HT246/p0DB207/GAPFL-HXR-N52M, Saccharoavces cerevielae HT246/p3DB207/GAPFL-HXR-H51Ν, Saccharoavcee coreviaiae HT246/p30B207/GAPFL-HIR-K27Q_tK47R, Saccharoavcee ceraviaiae HT246/p30B207/6APFL-HXR-K27Q, K36Q,K47R, Saccharoavces carevialaa HT246/p30B207/GAPFL-HIR-K36R,K47R ét

HT246/P3DB207/6APFL-HIR-K27R.K47R.

J&. PÁW.^fl.

A Sccheromvcae cerevielae tranexieraánaok jüosaUaíája

A GRF18 éa HT246 S.aerovlalae tranazforaánsok sejtjeit egyenként 10 al élesztöa ainiaal tápközegben (Olfco Yeaat Nitrogén alap, aainoeav nélkül, 2 % glukóz, mg/1 L-aszparagln éa 10 mg/1 L-hisztldln hozzáadásával) 50 ml-es Erlenmeyer lombikban 30°C-on 24 órán át történő rázással 3x10⁷ sajt/ml sejtsűrűségűre szaporítjuk*

A kialakuló tenyészet és a mutált deszulfatohirudln helyek kiválasztására a sejteket teljes tápközegben növesztjük. A teljes tépközeg összetétele (g/1): 5 pepton, 10 élesztőextraktum, 20 glukóz. 40 sucroz. 3 ammónlum-szulfát, 2 KH₂P0₄, 0.5 MgS0₄, 0,1 NaCl, 0,1 CaClg és 10/jg/l biocin. 48 órán át, 30°c-on kevertetve az elegyet 200 fordulat/perc sebességgel közelítőleg 1x10⁹ sejt/ml sejtsürüségü elegyet kapunk.

.IP.t-PJJ-da

A_dejBZulfa.tohinidin mutánsok feltárása 50 l-es S^crevialae

A kultúra táptalaját Amberlit XAD-7-tel keverjük össze és 4 órán át 25°C-on adszorpcióé kezelésnek vetjük álé. A sejteket a gyantáról kolonnán választjuk el· A gyantát 1 M NaCl-dal mossuk, majd Tris pufferrel (50 mM, pH 7,0-8,5) mossuk. A fő frakció (30 1) pH-ját 2,9-re állítjuk és S-Sepharose kolonnára visszük (Aaicon PA, 25 mM 2,9 pH-ju ammónia-formiét pufferral beállított), amelynek az ágytérfogata 2 1, Ammónlum-formiét pufferrel (40 mM, 3,6 pH-ju) való mosás után az eluclót la ammónlum-formiét * 56 puffarról (50 mM, 38, ρΗ-ju) végezzük· A fő élűétfrakatét (10 1 íl 3 K membránnal ellátott Filtron Minioetto ultraszűré rendszer segíteágével koncentráljuk. A kapott tiszta proteinolat 0,5 1-nyi mennyiségét Bio-Gel P-6 finom kolonnára (Amicon G7, 0,5 %-os ecotoawal beállított) visszük, melynek ágytérfogata 1,5 1. Az oluoiót 0,5 %-os ecotoavval végezzük, A fő eluciós frakciót (1 1) ultraszürő segítségével koncentráljuk és ezután Q-Sopharooo gyorefolyéeu oszlopra (Amicon PA, 25 mM 2,9 ρΗ-ju ammónium-formiát pufforrel beállított) visszük, melynek égytérfogmta 2 1. A mosást ammónium-formiát pufferrel (50 mM 4,2 ρΗ-ju) végezzük. A fő eluátfrakciót ultraszürővel koncentráljuk és ezután vízzel szemben diaszüréenek vetjük alá· A keletkező tiszta vizes oldatot liofilizáljuk.

A szilárd anyag tiszta deszulfatohirudin mutánsból áll.

lymi&yuaaJ&Káft

A. A ,t_r0Kb.in

A trombint 8. R. Stono és □· Hofteenge [Biochomistry 25. 4622-4628 (1986)] módszerével tisztítjuk és jellemezzük. Az aktív trombin koncentrációt 4-motil-umbelliforil-p-quanidino-benzoáttal történő titrálássál határozzuk meg· lOamoeon, G.W·, Roberto, O.V., Adass, R.W., Kyle, W.S.A, és Elsőre, O.T., Biochem. 3. 111, 101-117 (1973)1.

- 59 Β» Enzimelemzést

A peptidll-p-nitro-enllid ezuboztrátok tromblnnel végzett hidrolízise során keletkezd p-nitro-enilin feltárását e 405 nm-nál bekövetkező olnyoléonövekodéo mérése követi. A mérést Shimadzu UV 240 tipusu spektrofotométerrel végezzük. Az elemzés polisztirol kOvottákban 37°C-on 0,05 M Tria-HCl pufferelegybon (pH 7,8) történik. A puffer 0,1 % polietilénglikol 6000-et, 0,1 M NaCl-ot ée p-nitro-anilid ezubeztrátot tartalmaz. A D-Val-Leu-Arg-p-nitro-anllid ezubeztrátot (S-2266; Kabl Vitrua) 300/uM koncentrációban alkalmazzuk a szoros kötésű titráláai kísérletokhoz, amelyek során a mutáns hirudinek koncentrációját határozzuk meg. Ilyen elemzés sorén a trombint 1,0 nM koncentrációban használjuk. A D-Phe-pipecolyl-Arg-p-nitro-anilid szubsztrátot (S-2238; Kabl Vitrua) 100/iM és a trombint 20-50 pH koncentrációban alkalmazzuk a lassított kötésű lnhibiciós kísérletekben a műténe hirudinek kinetikai jellemzőinek meghatározása céljából (ld. alább). Az elemzéseket a trombln adagoláséval kezdjük. A képződő termék mennyiségét a p-nitro-anilin 405 nm-nél vett 9,920 értékű abszorpciós koefficiensének segítségével számítjuk ki, a ezuboztrét koncentrációját pedig a 342 nm-nál opektrofötömet riáean mért 8,270 M^cm^ értékű abszorpciós koefficiens alkalmazásával határozzuk meg. (Lottenborg, R. & Oackson C.M., Bio eh len. Biophys. Acta 742. 558-564 (1983)1.

• · · · · · · ·· ·*· ··

- BO C« Kinetikai elmélet éa datanallzle

Szoros-kötésű titrálát» Az enzim gátlását a szubsztrát jelenlétében a következő mechanizmus segitségével ábrázolhatjuk (1, mechanizmusvázlat)» . Km __ ^ko _ _

E + ES ---------=*·E ♦ P

1. mechanizmuevázlat

Az. inhibitor disszociációja (Kj) megegyezik ⁸ ^2^1 értékével. Ha az inhibitor enzimhez való kötődése a 8zabad inhibitor koncentrációjának jelentőe csökkenését okozza, az állandó állapotban vett eebeeeég (V_g) értékének változáea, amely a teljes inhibitor koncentrációval (I*) áll összefüggésben, az (1) egyenlettel irható le. [Morieson, □.F., Biochlm. Biophye. Acta 185. 269-286 (1969);

Henderson P.O.F., Biochem. □. 127. 321-333 (1972)]» %<- leqr((K_It ♦ I_t - E_t)² * (1) ahol v_Q az Inhibitor jelenléte nélkül mért eebeeeég, E* a teljes enzimkoncentráció, K^, a látszólagos Inhiblciós • · • ··· ··· · ·····♦· ♦·♦·♦··· «·

- 61 állandó. Ha az inhibitor óa a azubaztrót vereenyexnok az aktív helyekért, a K*, az inhibitor dloezoclócléa állandójóra (Kj) van vonatkoztatva a (2) egyenlet azorinti •4. » *4 <1 - s/κ,) (a) ahol 8 a ezuboztrát koncentrációt, K* pedig a azubaztrót Hiohaelia állandóját jelenti. Ha az enzia vagy az inhibitor koncentrációja non pontonon Ionért, akkor agy kiegészíti faktort viazOnk be az (1) egyenletbe ftvilliaaa, 9.W. ée Morrieon, O.F., Hathodo Enzyaol. 437-467 (1979)]. A hirudin által okozott tronbin inhibicióhoz a tronbin koncentrációja az aktív réozok titráláaával Mghatározható, a hirudin koncontrációja azonban coak aóróaaol éa az adatok (3) egyenlet azorinti anallziaévolt ^v. -2- lw|r((KI,.xIx-et)^a ♦ 44.6,)-(14,*xIx-S_t)l (3) “t ahol Χ_χ az inhibitor koncentrációja auly/térfogat egyaégbon ée x agy olyan faktor, Mellyel Χ_χ értékét azorozxuk, igy az inhibitor nolário koncentrációját kapjuk aeg.

A ezoroo-kfttéeO titróláai kiaórlatokbon a hirudin koncentrációja óa a hirudln diaazeeiáeióa állandója a troabin koncentráció állandó értéken való tartódéval ée a hirudln koncentráció Olyan érték fölötti változtatóéival határozható aeg, Mely néhány OMtban aagaaabb, néhány eeotben alaceonyabb, mint a tronbin kenoentrációja. Az ada• ·

• ··· ··· · ··· • · · · · · • ♦ ··· ·· β · · tok széna általában 7 ás 10 között van· A stacionárius állapotban vett sebesség értékek, anelyek a hlrudln koncentrációkhoz tartoznak a (3) egyenlet alapján nemlinoérie regresszióval meghatározhatók· A regresszióhoz a V* értékeket a roclprok értékeihez súlyozzuk· A súlyozásnak azt a tlpu* óét találták empirikusan legmegfelelőbbnek, anoly alapján • legjobb eredmények kaphatók. Istene, 8.R. éa Hofateonge, 3. Blochenlstry 25. 4622-4628 (1888)].

L»MM. MQro»-köt<.ü lnhlblclői

Ha az inhibitor és enzim közötti kölcoönhatéa sebessége lae* au, a gátolt stacionárius állapothoz tartozó sebesség csak lassan éli be, a termékképződés folyamatát sz 1· mechsnlz* nusvázlst mutatja, és s (4) sgyenlst Írja la fcha, 8«, BiochoM. Pharmacol· 2605-2702 (1976); Wllllame, 3.W., Morrison, 3.F., és Ougglsby, R«G., Bioohsnlstrv 18.

2567-2573(1970)11

P · v_t.t ♦ <^vo-^va)H-^d)

d.k· lóg (

1-d.axp(-k*

1-d

ahol P a t idő alatt képződő termék mennyisége, d az E_t, X_f és Kj, függvénye, éo k* ezeknek a paramétereknek a függvénye, éo k^ az inhibitor éa enzim közötti kölcsönhatás néaodrendO asszociációé sebességi állandója (Cha és mte-a, ld, előbb)· A hlrudln mutánsok kinetikai paramétereinek meg- 63 * határ·**·· «áljából · folyamatábra kapott adatait legalább hat különböző hlrudin koncantráoiónál a (4) agyonlatba halyazzük naalinaária ragraaazlóval· Sz az analizia arodményazi a Kpj k|* ártókakat áa a kg diaazooláeióa aabaaaágl állandót. Korábban kiautatták, hogy a k^* függatlan azubaztTóthoz az aktív holyan való kötődóatől, da · kg* áa Kj, ártókait oaxtani kall (1«· (SJ/K^-val, hogy a valódi ártókakat kapjuk mag (kg áa Kp 8. R. Stona áa □· Hofataongo, Bioohamiatry 85. 4622-4628 (1986)> Stona S. R., Braun, P.O. áa Hofatoanga, 3«, Biochemietry £6, 4617-4624 (1987)]· shhoz a azáaltáahoz a D-Pho-pipokelll-Arg-p-nitro-anllld K_B ártókát korábban 3,6yuM-ban határozaták aag áa alkalmazták (Hofatoanga, 3·, Taguahi, H., áa Stona, 8.R., Blochom· 3· 237. 243-251 (1986)]· Szokat a klnatikal módazarokot alkalmazva, Kj áa k^ ártákalt a kövatkoző táblázat tartalmazz·!

a daazulfatohirudin (·Η) formája	- Η-1..*1	*1 (PH)
rakomblnána daazul-	1.37* 0,03	0,231 + 0,006
fatohirudin
(Gin27, Arg47 j -H	1,08 ♦ 0,08	X 1,85 ♦ 0,04
toIn27,Gin30,Arg47]-H	n.d.	1,39 ♦ 0,02

(n.d. nam maghatározott)

9 9

999 ··«

* 64

P»wulf»t<>hlru<iln wtánlt t»rt«l»«x<l avAav.x.rΜμκΜπυ mrintiríM».

Az előző példák bármelyike ezerinti doozulfatohirudln «titánét tartolaszé oldatot 0,9 %-os NoCl oldattal dializáljuk. Az oldat koneontrációját azután hígítással 0,2 mg/ml vagy 2 mg/ol-ra állítjuk ugyanazzal a NoCl oldattal. Az igy kapott oldatokat azután ultraszüréesal sterilizáljuk (0,22 um pórusu membránon).

A sterilizált oldatok közvetlenül felhasználhatók pl. intravénás adagolásra.

A olkroorflanizmueok deponálása

Az alábbi aikroorganizmuookat helyezték el a oeutoehe Semalung von Mikroorganioaen (08N), Nascherorder wog 16, 0-3300 Braunschwoig (NSzK).

mikroorganizmus

Saocharomvcas caravisiaa GRF18

..<ieh.ro.vc.» e.r.vi.U» HT246 letét ideje Katalógus szám

1986. 03. 04. DSM 3665

1987. 04. 15. DSM 4084 • · · · • . ··· ί·· · ··· ν * » .. ... ·..· : ·..

• 6S SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Éljári· (X) általános képlet0 aminooov-szokvenciáju doszulfatohirudin auténsok éa sóik előállítására

H-Z₀-Val-Tyr-Thr-Asp-Cyo-Thr-Glu-Ssr-Gly20 -Gln-Asn-Lou-Cys-Lou-Cye-Glu-Gly-Sor-Aon30 -Vol-Cye-Gly-Gln-Gly-Asn-Z^-Cys-Xlo-Lou40

-Gly-Sor-Sop-Gly-Glu-Zg-Aen-Gln-Cys-Vol50 •Th r-G ly-G lu-G ly-Th r-P ro-ZZ₄-Z_g-So r60 -Zg-Z^-Asp-G ly-Asp-Phs-G lu-G lu-I la-P ro-Glu-Glu-Tyr-Lou-Gln-OH (X) ahol Z_Q jelöntés· Val vagy Gly-Vol vagy Met-Val dipoptidil gyök, Z^ jelentése Lye, Gin, Asn, Leu, Arg vagy Val, Zg jelentés· Lye, Arg, Asn, Val, Leu vagy Gin, Z_s jolontéoo Lye, Arg, Aon, Val vagy Leu, Z* jolontéoo Pro vagy Gly, Z_g és Ζγ jelentése agyaiétól fOggotlonQl Gin, Asn vagy Hat éo Z_g jelentése His, Gin vagy Aen, azoknak az (X) általánoe képlete vogyDlotoknok a kivételével, amelyekben Z_Q jolonté·· Val, Z^ jolontéoo Lye vagy Glu, Zg jolontéoo Lye vagy Gin, Zg jelentéoe Lyo, Z₄ jolontéoo Pro, Z_g jolontéoo Gin,

I

Ζ.& jelenté·· 61n vagy Hie éa Zj jalanté·· Aen, azzal jellemezve, hogy mikrobiológiai törzetenyéesetet olyan tenyéeztóegyaéget tartalmazó hibrid vektorral alakítunk ét, amely egyeég · jolzöpoptidot kódoló eled DNS-ezekvenciéhez kapcsolódó promotorböl éli, a jolzöpoptid ezerkezetleolvasóként egy méeodik DNS-ezekvencléhoz kapcsolódik, utóbbi ONS-ezekvenoia a doezulfetohirudin muténat kódolja éa tartalmazza az átvivő terminállá jeleket, az eljáráe következe lépéseként a deezulfatohlrudin muténat izoláljuk éa kivént eaetban a keletkezett «zabod karboxilée/vagy aminocaoportot tartalmazó pollpeptidet aóvé vagy egy kapott eót ezabad vegyOlattó alakítjuk.

2. Az 1. igénypont ezerinti eljáró·, azzal jellemezve, hogy olyan deezulfatohlrudin autáneokat ée «óikat állítjuk elő, amelyek (X) általánoe képletében Z_e jelenté·· vei vagy Gly-Val vegy Mot-val dlpoptidll gyök, Z^ jelentése Lye, Gin, Aen vegy Arg, Z2 jelenté·· Lye, Arg, Aen, Vei vagy Gin, Z^ jelenté·· Lye vegy Arg, Z₄ jelenté·· Pro vagy Gly, Zg jelenté·· Gin vagy Met, Z_ft jelenté·· Hle vagy Aen ée Zy jelenté·· Aen vegy Met, azoknak ez (X) általánoe képlete vegyieteknek · kivételével, amelyekben Z_o jelenté·· Val, Z| jelentéee Lye vegy Gin, Z₂ jelenté·· Lya vegy Gin, Zj jelenté·· Lye, Z₄ jelenté·· Pre, Z_g jelenté·· Gin,

Z_fi jelenté·· Hie ée Z? jelentéee Aen.

3. Az 1. igénypont ezerinti eljárée, ezzel jellemezve, hogy (Aen²⁷l-doezulfetohirudint éllitunk elő.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ezzel jel- lomezve, hogy (Asn 1-doozulfotohirudint állítunk elő·

5· Az 1· igénypont ezerlntl öljéráé, ezzel jellomezve, hogy (Vei Jrdeezulfetohirudint állítunk elé.

6. Az 1. igénypont ezerlntl eljárás, ezzel jellomezve, hogy (Gly ]-doozulfatohlrudlnt állítunk old.

7. Az 1* igénypont szerinti eljárás, ezzel jel- jq lemezve, hogy (Hot ^]-doezulfetohirudint állítunk old.

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ezzel jellomezve, hogy (Hot ]-doszulfatohirudint állítunk old.

8. Az 1, igénypont szerinti eljárás, ezzel jellemezve, hogy |Aen⁵¹]-deezalfotohirudint állítunk éld.

10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ezzel jellemezve, hogy (Gln^R7,Arg⁴⁷]-deszulfatohirudint állítunk old.

11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ezzel jellemezve, hogy teln²⁷,Gln^Se,Arg⁴⁷J-deezulfatohirudint állítunk old.

12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ezzel jellemezve, hogy (Arg³⁶,Arg⁴⁷l-deezulfotohirudint állítunk éld.

13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ezzel jel-

A£f lemezve, hogy (Arg.Argj-deezulfatohirudint állítunk éld.

·· ··· • · ··

Λ1» · ί**

14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jsl<

hogy glicll-teln²⁷,Gln³⁶,Arg⁴⁷]-doezulfatohirudint elő.

'ϊ .1 ···· ···· • e _ · ··· • · « ·· ··« ···· *4 • ··· • · leaozve, állítunk

15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jel hogy motlonilíGln , Arg⁴⁷]-deezulfatohirudint éllemezve, Htunk elő·

16. Eljárás gyógyszerkészítmény előállításra, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállítható (I) óltalónoe képlet0 doezulfatohirudin auténet vagy gyógyszerészetileg alkalmas sóját gyógyszerészetileg alkalmas hordozóval és/vagy segédanyaggal összekeverjük.

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY

GTA GCG CAG GCC Val Alá Gin Alá

GCT GAA TTC CAA GCT TGG ATC CGG GTG

Alá Glu Phe Gin Alá Trp Ile Arg ...

lacpo EcoRI

GTA GCG CAG GCC Val Alá Gin Alá

GCT GAA TTC ATG GTT GTT

Alá Glu Phe Met Val Val bbDAPEST! NEMZETKÖZI

ÜGYVÉDI MUNUKÖZÖSSÉG

S Z A8 ADALÉK I ROD^⁷

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY

2.Ábra

51671-7494

„UúJVESri NEMZETKÖZI

UGYVEOI I KAKÖZÖSSÉG /

'HZ

1670-

49.839/DE

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

KIVONAT

Eljárás Modifikált proteinok előállítására

CIBA-GEIGY AG, BÁZEL, SVÁ3C

A bejölentóé napjai 1989. 07, 18.

Elsőbbség» 1988. 07. 19. (88 17181.6)

NAGY-BRITANNIA

Az uj polipeptidek a deezulfatohirudintől egyezer! vagy többszöri autódéban térnek el. Az uj polipoptidőknek értékes faraekológlal tulajdonságaik vannak-és-rekoabináne DNS-teohnlkával állíthatók elő.

I

4 * 49.939/DE	KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY '	/C /& w-z/ra
	_ . S.B.G &K. Budapest Nprnz^o;; üg7védl	WlOr
51670--	~ · V 10.	j uzutsp

Eljárás Kodifikált proteinek előállítására

CIBA-GEIGY AG, BÁZEL, SVÁDC

C/CP . ₍ Vóv'N'(GM

Feltalálók} Dr. STONE Stuart R., BÁZEL,

Dr. DENNIS Stanley. BÁZEL.

Dr. HOFSTEENGE 3an, REINACH,

Dr. MEYHACK Btrnd, MAGDEN, Dr. WALLACE Andrew, BÁZEL,

Dr. GR08SENBACHER Hugó, ÖLTEM, SVÁDC

A bejelentés napjai 1989. 07. 18.

Elsőbbség: 1988. 07. 19. (88 17191.6)

NAGY-BRITANNIA

A találeány aódoeitott proteinekre, előállité auk aódozereire, ilyen proteineket tartalmazó gyógyezerké *

·> 2 — ezltaényokro és enzlagátIáéra való haeználatukra vonatkozik·

A hirudin antikoagulóna a teraéezetben a piócában (Hirudo aediclnalla) fordul old. Hároa diezulfid Iliddel összekötött 65 aainoeavből éllő polipeptid· A pióosnyóllsl kapcsolatos első vizsgálatok aár 1884-ból és Markwardt uttörőaunkásoága óta iaaertek [Naturwisssnsohaftsn 537 (1955)/ Msthods Enzyaol· 19. 924 (1970)], napjainkig azonben nea volt Icáért a hirudin szerkezete, aaelyet Ooth éa aunkatérsa állapított aeg ÍFEB8 Lett. 165. 180 (1994)3· A legújabb felfedezések szerint a hirudin többféle variéna ban létezik· Leírták ^hlrudin 1 variánst (HV1), a hlrudin variánst (HV2), s hlrudin PA-t és további analógokat·

A hirudin a legerősebb troabin-inhibltorkánt ionért, alg a koagulációé kaezkád többi onzlnjót non befolyásolj a· azonban a heparinnal, anely a hagyoaányoe antikoagulációs terápiában ajánlott antlkoaguláns, a hirudin hatásét közvetlenül a tronbinon fejti ki éa eltérően az előbbitől az antitroabin XXX-on kérésztől nea hat. A hirudin és a troabin közti kölcsönhatás szélsőségesen aagae hatásban nyilvánul aeg. Ez a hatás több nagyságrenddel nagyobb, aint a troabinnak a fibrinogénhoz, a vérlonezkékhoz, vagy az antitroabin ZXX-hoz valé kötődéaa· Ezért a hlrudin aág alacsony koncontrációjában is képes a troabinnak éa biológiai következaényeinok öoazoe kölcsönhatását legyőzni· Továbbá a hirudin alacsony toxicitéou, non önti• 4 · ·· • ··· · 4 * «· • · ♦ · 4 «· • · · · · · * .4«

- 3 gén ό· a vesén keresztül jutva majdnem teljes kiválasztás utén le biológiailag aktív fontéban van.

Napjainkban a hlrudlnt vagy hlrudlnvarlénsokat kódoló oONS-okot és szintetikus géneket mikrobiológiai hordozókon, .Int pl. OJ&l£JdÉlit_SaiAll <· 8—choroowM cerovlsleon (Id. 158564 ée 168342 aa. európai ozmbodalml bojolentéooket) tenyésztik· Bár a kltonyéoztott termékekben es a Tyr részen hiányzik a szulfátmonoéezter csoport · éa ezért doozulfátohlrudlnoknok nevezik Ókat - úgy léteznek, hogy megközelítólog ugyanazon biológiai aktivitással rendelkeznek, mint a torműszótea hlrudin, amelyben a tlrozin gyök ozulfátmonoéeztor formájában van jelen·

A hírűdInt mind Intravénásán, mind szubkután juttathatjuk be az ember szervezetébe. Intravénásán a fó elimináció felezési Ideje 0,84 óra éa közelítőleg a bejuttatott dózis 50 >>a véltazatlan formában választódik ki a vázaiétben. szubkután bejuttatás után a hlrudin gátló szintje a plazmában még négy óra után le mérhető volt. Következésképpen a hlrudin a haparinhoz hasonló hatéoidővol rendelkezik· Tekintettel erre a hátrányra. Igen nagy ozOkeég van szelektív antitrombotikuo hatású pollpeptIdákra, amelyek hosszabb felezési idővel rendelkeznek a ezer* vozotbon· Megfelelő pollpoptldok napi egyszeri kezelés sorén előnyösek vénás és artériás trombózis elleni terápiában. A találmány Ilyen antltrombotIkusan aktív pollpoptIdőkre vonatkozik· — 4 ·*

Nagy szükség van olyan hlrudlnvogyülotakro, a«s>$»k az antltroabotlkuo hatást eeökkontik· A hlrudlnvegyülotok antltrombetlkue hatást csökkentő képessége abban nyilvánul meg, hogy meggátolják a trombin kölcsönhatását annak llgandumalvol, nevezetesen a vérlsmezke rajtórákkal. Az entltrembotikue hatású hirudln gondos szelekciója során megtartja azt a kápeaségát, hogy meggátolja a flbrinogén* alvadáot, a troablnhoz ságié alacsony ez affinltáoa. Az ilyen hirudlnvogyülotek előnye ebben áll, hogy gátolják a flbrln által irányított folyamatokat a trombózisra, ugyanakkor kicsi a hatáouk a váriemezkék által irányított haomoez táxie folyamatéra. A találmány tárgyát továbbá ilyen önti* trombotikuo hátáét caökkontő hirudlnvogyülotek képezik.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a hlrudlnek hldrofébloltéoa mognövekozlk, ha a oavaa aslnóeavgyököt (Asp, Glu), a C-tersínélen llpofll anlnosawal helyettesítjük és/vagy a c-teralnált máéképpen módosítjuk, például proteáz rezisztens amlnosavgyök, mint Pro hozzáadásával, s Így csökkentett antltrombotlkue hatás áe/vogy a szervezetben hoeozabb felezési Idő érhető el.

A találmány uj, az alábbi amlnoeav-azekvancléju deezulfatohlrudin mutánookra éo óéira vonatkozikι

H-val-Val-Tyr*Th r-Asp-Cys-Thr -Glu-Ser-G ly20 •G In-Asn-Leu-Cy s- Leu-Cy s-G lu-G ly-So r-Asn• · · * s >0

-Val-Cye-Gly-Gln-Gly-Aen-Lyo-Cye-Xlo-Leu40

-Gly-8or«Aep-Gly-Glu-Lye-Aan-Gln-Gya-Val50 -Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lye-Pro-Gln-Ser60

-Hla-Asn-Y^-Gly-Aap-Phe-Yg-Y_g-Xle-Pro-Y₄-Y_g-Y_e-Loil-Y₇- ^M (I) ahol Y| jelentése Aep vagy egy neutrálie genetikusán kódolt aalnoeevgyök, Y_g éa Y_g agyaiétól fOggetlenOl jelentenek Glu, Aon vagy lipofil, genetikusán kódolt aainoeavgyököt, Y₄ ée Y_g jelentése agyaiétól függetlenül Glu vagy egy sealégss, génetikusan kódolt aalnoeevgyök, Y_g jelentése Tyr vagy egy savas, genetikusán kódolt eainosavgyök ée Y₇ jelentése Gin vagy Gin Pro dlpeptldll gyök, azoknak az (X) általános képletü vogyüloteknek a kivételével, esélyekben Y«j jelentése Aep, Y_g jelentése Tyr, Y₇ Gin, Yg és Y_g Glu és sz Y^ és Y_g gyökök valaaolyike Gin és s sióik Glu·

A tsléleány szerinti autánsok különböznek a tor aéezotoo doezulfatohlrudlntól (Y^ jelentése Aep, Yg, Y_g, Y* és Y_# jelentése Glu, Y_g Tyr ée Y^ln) az 1-4-ot, de különösen az 1 vagy 2 aalnoeavgyököket illetően·

A sealegoo, genetikusán kódolt aalnoeavek a következő L-aalnoeavekt Alá, Sor, Thr, vei, Leu, Ile, Aon, Gin, Met, Pho, Trp ée Pro, továbbá a Gly aalneeav·

Lipofil, genetikuson ködeit aalnosavek a következő L-aalnooavakι Alá, val, Leu, Xlo, Pho ée Gly·

- 6 Sava·, genetikusán kódolt aalnotavak az Asp és Glu·

A találmány elsősorban olyan (X) káplat0 deszulfatohirudln mutánsokra ée sóikra vonatkozik, amelyekben Y^ jelentéee Aep, Alá, Leu vagy Aen, Y* és Y_g jelentése egymástól függetlenül Glu, Leu vagy Aen, Y₄ ée Y_g jelentéee egymástól függetlenül Glu, Gin, Aen vagy Leu, Y_g jelentése Tyr, Asp vagy Glu óe Y₇ Gin vagy Gin Pro dipoptldll gyük, kivéve azokat az (X) általános káplotü vegyületeket, amelyeknél a képletben Y^ Jelentése Asp, Y_g Tyr, Y? Gin, Y₂ és Yj jelentése Glu óe az Y* és Y_g gyökök egyikének jelentése Gin és a másik Glu·

Az ilyen doezulfetohirudin mutáneok példája o (Gin^{61 f62}]-doezulfetohirudin, (Leu^61,62J-deszulfatohirudln, [Aen^61,62]-deszulfatohirudln, (Leu⁵⁷*^58,61,62]-deezulfatohirudln, lAen⁶⁷'⁶⁶·^61,62]-deszulfatohirudin, [Ala⁵³]-deszulfatohirudln, ÍAsp⁶⁵]-deszulfatohirudln, tolu⁶⁵]-deezulfatohirudin ée [Pro⁶⁶]-deszulfatohirudln.

A találmány szerinti vegyületek mind szabadon, aind sóik formájában is előfordulhatnak· Mivel ezek a vegyületek néhány eminooovréozben szabad aminocsoportokát tartalmaznak, a találmány vegyületai savaddioiós sóik formájában is létezhetnek· A megfelelő oaveddioióe sók elsősorban a hagyományos gyógyászatilag alkalmas oovakkal képzett farmakológiallag alkalmazható sók· Tipikus ozorvotlon oavak a halogónhidrogén-oavak (mint pl· m sósav) kénomv, • « * Ί foszforsav és pirofoszfersav. Tipikus szerves savak elsősorban az arénszulfoneavak («int pl· benzolszulfonsav vagy p-toluolczulfoneav) vagy rövidezénláneu alkánezulfoneavak («int motánezulfonsav), vmlmmlnt a karbonsavak, «int eceteav, tejeav, peleitinsav, sztearinsav, alaaeav, borkősav, aezkorbineav de citromsav. A találmány szerinti vegyületek szabad kmrboxiloeoportokmt ia tartalmaznak néhány aminosav maradékban, amely karbexlleeoportok az egész peptidnek savas jelleget adnak. A vegyületek szerves vagy szervetlen bázisokkal is képezhetnek sókat, ilyenek pl· nátrium-, kálium-, kalcium- vagy magnéziumsók, vagy ammóniával, vagy farmakológiailag alkalmas szerves nitrogéntartalmú bázissal alkotott ammóniumaék· sőt, mivel e vegyületek egyezerre tartalmaznak szabad ksrboxilcsopsrtokat és szabad aminoosoportokát is, belső sóik formájában is létezhetnek· Előnyösek a farmakológiailag alkalmas sók·

A találmány szerinti deszulfatohirudin mutánsok előállítási módszere mikrobiológiai törzetonyéeztóoen alapozik, melynek során a tenyészetet olyan tenyésztőegységet tartalmazó hibridvektorral alakítjuk át, amely proletárból áll, ez ogy olyan jelzőpoptidet kódoló első DNS-ezokvonoiához kapcsolódik, amely peptid szerkezetleolvasóként egy második DNS-ezokvonelához kapcsolódik. Utóbbi DNS-szokvencla a deszulfatohirudln mutánst kódolja, tartalmazza az átvivő terminális jeleket. Az eljáróéhoz tartozik a deazulfatohirudin mutáns izolálása ée kívánt eset ben a szabad karboxil- és/vagy amlnocsoportokat tartalmazó kinyert polipeptid sóvá alakítása vagy, egy keletkezett só szabad vegyülettó való átalakítása.

Alkalmas mikrobiológiai törzetenyészetek pl. a Bacillus subtilis. Eacherichia coli és a Saccharomvcee carevlslaa törzsek.

A transzformált mikrobiológiai törzsek a technika álláséból Ismert módszereket alkalmazva aeezimiláIható szén-, nitrogénforráét és szervetlen eókat tartalmazó folyékony közegben tenyészthetők.

Különféle szénforrások alkalmazhatók. Előnyös szánforrások az asszimilálható szénhidrátok, ilyen a glukóz, naltóz, nannitok, fruktóz vagy laktóz, vagy acotét, például a nétriun-acetát, amelyek önmagukban vagy megfelelő keverékeik forrnájóban használhatók. Alkalmas nitrogénforrások például ez aminosavak, igy kazaninosavak, peptidek ás proteinek, ezek degradációe termékei, igy tripton, pepton vagy hús extraktumok. továbbá álesztőkivonat, maláta extraktum, gabona páclé, valamint ammóniumsók, igy ommónium-klorid, -szulfát vagy -nitrát, amelyek egyedül vagy megfelelő keverékeik formájában használhatók. Alkalmazható szervetlen sók, például a nátrium, kálium, magnézium és kálcium szulfátjai, kloridjai, foszfátjai és karbonátjai. Továbbá a tápközeg tartalmazhat növekedést elősegítő anyagokat, ilyenk a nyomelemek, pl. vas, cink, mangán és hasonlók vagy egyea aminosavak.

** 9 —

Mikrobiológiai baktóriunaojtak hibridvektörökkel alakulnak ót. Az ilyen sejtek szelektív körölményok között növekednek, pl. olyan körülmények között, amelyek szükségesek azoknak a hibrid vektoroknak a kialakítására, amelyek a növakadáai gánekat kódolják. A találmány szerinti hibrid vektorokban jelenlévő és napjainkban la alkalmazott logazelektivebb jelek az aminosav- vagy purinbioozintézie enzimjeit kódoló gének. Ez a megfelelő aminoaavban vagy purinbázlsban szegény, szintetikus minimum tápközeg alkalmazását tsszl szükségessé· Olyan gének is alkalmazhatók, amelyek a rsziszténeiét egy alkalmas biooldre viszik ét (pl. a rezisztenciát az amino-glikozid G 418-ra átvivő gén]· Az antibiotlkum-rszisztana géneket tartalmazó vektorokkal átalakított baktériumsejtek a Megfelelő antibiotikumot tartalmazó komplex közegben növekednek éa azáltal gyorsabb növekedési arányt éa nagyobb sajtsörőségét érnek sl.

A hibrid vektorokat a lényeges promoterekkel együtt tartalaazó baktórlumeejtek megtermelik az említett promotorrel irányított deazulfátohirudin őutána gént. Ha a deazulfátohirudin mutáns gén a szabályozó promoter irányítása alatt van, akkor a növekedési tápközeg kompozíciót adaptálni kall a MRNS-átvitel maximális szintjének elérése céljából, pl. élesztőben lévő PHO5 promotert alkalmazva a tápközognek tartalmaznia kell kis koncentrációban szervetlen foszfátot ennek a promotérnék a működtetésére.

*

A tenyésztéshez élteiében hegyenényoe technikát alkalaaznak. A tenyésztési körOlaényokot, Így a hőaéreékletet, a tápközeg pH-ját ée a foraontécióa időt úgy kell aegvélaoztani, hogy e deazulfétohirudin autánook aaxisélle aennyieége tarsolődjék. A kiválasztott élesztő vagy S>coli törzs kedvezően növekszik eereb kőrQlaények között, elárasztott táptalajon, rázáoeel vegy keveréssel, 25-38 C® között, előnyösen 28 C° körüli hőséreékleten,

4-7 közötti, előnyöeen 5-öe pH-értéknél ée 12 éra ée 3 nap közötti időtartaa alatt, előnyöeen olyan időtartamban, aelyben a deezulfátohlrudin eutónook kielégítő teraeléeeel nyerhetők.

A teraelödött deezulfátohlrudin autánook legtöbbje a fölhasznált baktériuatörzetől, proaotertől ée jelzÖpeptidtŐl függetlenül klvélaeztódik a tépközogbe vagy a periplazaikue térbe ée csak egy kié réeze sarad a sejt belső réezével asszociálva, A pontos erény (kiválasztott vegyületek/oojttel aeezociált vegyületek) a féraentáciée körülményektől függ.

A doezulfétohlrudin mutánsok hagyoaényoe eszközökkel izolélhatók. Például az első lépés után a sajtok tápközogtől veié elválasztása rendszerint centrifugálással történik. A keletkező feluluozót poliotilén-iminnel történő kezeléssel a doezulfétohlrudin mutánsokra dúsíthatjuk, igy eltávolítható a legtöbb nomproteinea anyag ée az oldat aasóniua-ozulféttal váló kezelésével a kicsapódó pro• * . 11 . telnek sltávolithstók· A baktériumproteinek, ha vonnak, szintén kicsaphatók ecetsavval törtónó savanyítássál (pl. 0,1 %, pH 4-5), A dsszulfátohirudin autóna további dúsítása érhető el az eootoavao fslüluszó n-butanollal való extrehálásévsl. További tisztitósi lépések például a sótalanitás, kromatográfiás eljárások, igy pl. ioncserés-, gól-, aegoszlásoskroaatográfla, HPLC, rsvsrzfézisu HPLC, stb. A proteinelogy alkotóinak elválasztása dialízissel la aogvalósitható, lontöltés alapján gélslsktroforézisssl vagy hordozóasntes elektroforézlssel, molekulámérat alapján megfelelő Sephadsx kolonnán, afflnitásos kromatográfiéval, például antitestekkel, különösen monoklonális antitestekkel vagy trombinnal, amely afflnltáooe kromatográfiára alkalmas hordozóhoz van kötve, vagy máé eljárásokkal, különösen azokkel, amelyek irodelomból lemérték.

Ha a periplazmikue térben összegyűlt deszulfatohirudln mutánsokat kívánjuk Izolálni, néhány kiegészítő tisztítási lépésre ven szükség: A doszulfétohlrudin mutánsok a sejtfal enzlmatlkus eltávolításával, vagy kémiai utón (például tiolreagoneek, vagy EOTA) történő kezelésnél, vagy a sejtfal ozmótikua sokknak való alávetéeével nyerhetők ki. Az ozmótikue eokk a sejtfal roncooláoával lehetővé teszi a termék feltárását.

Az anti-hirudin vagy anti-deezulfatohirudin antitestekkel (pl, hlbridoma sejtekből nyerhető aonoklonálls entitostekkel) veié teszt, a trombin teszt (M.U.

• · * ··

- 12 .

Bergmeyer (ed.), Mattiadé in Enzymatlo Analysis, IX.kötet, 314-316· oldal Vorlag Chsaie, Wslnhsla (FRG) 1983) vagy véralvadási taszt IF. Markwardt éa mtea, Throab. Hasmost. 47. 226 (1982)) használható a deszulfatohirudin mutáns aktivitás jelzésére a tisztítási eljárás aorén nyárt frakciókban·

Az alkalmazott módszerektől függően a találmány szerinti vegyietek szabad formában, eevaddició· sók, belső sók vagy bázisokkal képzett sók formájában nyerhetők ki. A szabad vegyületek ismert módon állíthatók elő a aavaddicióa sókból vagy bázisokkal képzett sókból. A gyógyászatilag alkalmazható savaddicióe aók a szabad vegyületakből állíthatók elő savakkal való roegáltetáoukkel,olyan savakét alkalmazva, amelyek · fentemlltett sókat képezik, továbbá a aóképzéat kővető bepárláeeel vagy lloflllzélée•al. A belső aók a pH-nsk egy alkalmas, ssaleges pontra történő beállításéval alakíthatók ki.

A transzformált mikrobiológiai baktériumeejtek a találmány ezerint a következő lépéseket tartalmazó rekombináns DN8-technlkával állíthatók élői

- egy alyan tenyésztőogységet tartalmazó hibrid vektor előállítása, amely az első DNS-szskvsnclához kapcsolódó promotsrből áll, sz a DNS szekvencia egy olyan jelzőpsptldet kódol, amely szerkezetleolvasóként kapcsolódik egy aásodik DNS szekvenciához, amely a deszulfatohirudin mutáns kódotja • 13 ás tartalmazza az átvivő terminális jeleket

- egy mikrobiológiai baktériumtörzs átalakítása az említett hibrid vektorral • és az átalakult mikrobiológiai baktérluaeejtek elválasztása az átalakulatlan baktériumsejtektől·

Előállított vektorok

A találmány szerinti hibrid vektorok olyan tenyészt őegy aéget tartalmaznak, amely az első DNS-ezekvenciához kapcsolódó promotérből áll, ez a DNS szekvencia agy olyan jelzőpeptidet kódol, amely szerkezetleolvasóként kapcsolódik egy második DNS szekvenciához, amely a deszulfatohirudin autánat kódolja és tartalmazza az átvivő terminális jeleket·.

A megfelelő vektor kiválasztását a transzformált mikrobiológiai baktériuassjtak határozzák meg· A megfelelő törzsek azok a törzsek, amelyek a fentieket kielégítik, ilyen mikrobiológiai baktériumtörzsek a S«cch«ro»vc»» caraviala·. az Ewharichla 0011 «· BaqljJjm uMIAA*·

Az E. coll törzsben végzett deazulfátohlrudin mutáns gén tenyésztésére megfelelő vektorok a baktérlofégok, például a baktérlofág származékai, vagy plazmidok, mint colEI és származékai, például pMB9, pSF2124, PBR317 _{vagy p}br322. A megfelelő vektorok tartalmazzák a ·4

- 14 telj·· replikon ée jelző gént, aeoly lehetővé teszi szöknek a transzformált mikroorganizmusoknak · kiválasztását és azonosítását, amelyeket s fenotipuoos módon tenyésztett plazmidok transzformáltak. A megfelelő jelző gének a mikroorganizmusnak rezisztenciát biztositenak nehézfémekkel, antibiotikumokkal mint pl. ampicilinnel vagy tetraciklinnel ée hasonlókkal szemben.

Az e. coli törzsben a tenyésztŐegyeég ezebályozáeára néhány promotor alkalmazható. Főként erősen kifejlesztett gének promotorjóit használják, Megfelelő promotorek a lse, tao, trp ée lpp promotorek, továbbá a λ N fég, vagy a % pl fág ée egyebek, A találmány szerint ez E. coli törzsben előnyösen alkalmazott promotorek ez lpp ée lse promotorek.

Az s. csrsvisias törzsben a replikádéhoz és tenyésztéshez ezOkeéges megfelelő vektorok tartalmazzák az éleaztő ázására az éleeztő replikációs kszdőhslyét és s szelsktiv genetikus jelet. A hibrid vektorok, amelyek az áleaző replikációs kezdőpontját tertslsazzék, például a kromoezoméliean függetlenül issétlődő szegmenset (ars), extrakroaoszosálisan az élaeztőeejt belsejében saradnak a tranezforaáció után és s sitózis során függetlenül replikáidénak. Tehát olyan hibrid vektorok használhatók, amelyek az élesztő 2/j plazmid DNS-éhez homológ szekvenciákat tartalmaznak. Az ilyen hibrid vektorok sár a sejten belül a 2yu plazmádban rekombinációval integrálódnak, • · • ·

- 15 vagy önállóan replikálódnak. Az élesztőhöz alkalmas jelző génsk főként azok, amelyok antibiotikum-rezisztenciát biztosítanak a törzsnek vagy auxotróf éloeztőmutáncok esetében olyan gének, amelyek kiegészítik a törzshiányokat. Megfelelő gének rezisztenciát biztosítanak a cikloheximid antibiotikumnak vagy auxotróf élesztömutánsban prototrófiéról gondoskodnak, pl. az URAS, LEU2, HIS3 vagy a TRPX gén.

Előnyös élesztő hibrid vektorok tartalmaznak továbbá egy replikációs kezdőhelyet ée egy jelző gént a baktériumtörzs, főként az E. coll számára, úgy, hogy a hibrid vektorok és prekurzoralk szerkezete ée klónozása E. Coli-ban megvalósítható. Élesztőben kifejlesztésre alkalmas promoterek például az ADHX, ADHII vagy PHO5 gén és a glikolizist eredményező promoterek is, pl. a PGK promotor.

A jolzőpoptldet fSigual szekvencia) kódoló DNS szekvenciát annak a polipeptldet kódoló mikrobiológiai törzsnek a génjéből származtatjuk, amelyet a azokásos módon választunk ki. Ha a törzsmikroorganizmus az E. coll, akkor ompA, lpp, maltóz kötő protein, λ receptor, louein kötő protein vagy fi-laktamáz jelző szekvenciát lehet választani. Élesztőkhöz a hirudln jelző szekvenciát a pióca genom DNS-ből nyerhetjOk. Az élesztőhöz még előnyösebb jelző szekvenciák például az élesztő invertáz ·«· «··

- 16 jelző ás prepro szekvenciái, « -faktor, faromon peptidáz (KEX1), “killer toxin* áa gátló sav foszfatáz (PHQ5) gének, áa az Aapsrcillus awamori glukoamiláz jelző azokvonoia. A hlrudin jalszakvenciéjónak részével jelző szekvencia állítható elő az alkalmazott promotarhaz (pl. PH05) természetesen kapcsolódó gén jelző szekvenciájának (ha van) lekötő részóval.

Azok a kombinációk kedvezőek, amelyek a jelző szekvencia áa a daazulfatohirudin mutáns aminosav szekvencia között pontos sejtosztódást tesznek lehetővé· Kiegészítő szekvenciák a pro- vagy apacsr-szekvenciák, amelyek szerkezetükbe beépítve hordoznak, vagy nem hordoznak specifikus szintézis jeleket, hogy lehetővé tegyék a prekuzor molekulák pontos termelését·

A terminális átvivő jeleket tartalmazó DNS ezekvencia előnyösen abból a kiválasztott mikrobiológiai törzsből származó génnek a 3* oldalszekvenciája, amely tartalmazza a lényeges jeleket a terminál átviteléhez· Megfelelő 3* oldalezekvéneiák például az alkalmazott promotarhaz természetesen kapcsolódó gének szekvenciái·

A találmány szerinti hibrid vektorok a technika álláséból lamert módon állíthatók elő, például az első DNS-szekvenciához kapcsolódó promotérből álló tenyéaztőegyaég kapcsolásával, az első DNS ezekvencia egy olyan jelzőpeptidet kódol, amely szerkezet leolvasóként kapcsolódik agy második DNS szekvenciához, amely a deezulfato• » • ··· ··· · · • · · · · · · ·· ··♦ ·« * «·

- 17 hlrudln mutánst kódolja ás tartalmazza a terminális átvivőjeleket; vagy a tenyésztöegység alkotórészének az előre kiválasztott mikrobiológiai törzs replikációs pontjait és a kiválasztott genetikai jeleket tartalmazó DNS-fragmeneekhez való kapcsolásával,

A találmány szerinti deszulfatohlrudin mutánsokat kódoló DNS a technika állásából ismert módon állítható elő, A DNS előállítási módszerei szerint az eredeti deszulfatohlrudin génjéből származó neakivénatos aminosav gyökök kodonjait tartalmazó DNS részt le kell metszeni a DNS-ről és azt olyan DNS szegmenssel helyettesíteni, amelyben az említett kodonokat olyan dezoxiribonukleotid triplettek helyettesítik, amelyek a kivánt amlnosavgyököket kódolják vagy helyzet-irényitásu műtagenezlesel megvalósítják a mutációt,

A deszulfatohlrudin mutánst kódoló DNS előállításához a deszulfatohlrudin DNS egy részének lemetSzását restlkcióe enzimekkel lehet megvalósítani,

A módszer előfeltétele, hogy a megfelelő restrikciós helyek elérhetők legyenek azoknak a kodonoknak a szomszédságában, amelyeket meg akarunk változtatni. Például egy kis restrikciós fragaens, amely a neakivénatos aminosav kodonját tartalmazza endonukleéz hasítással eltávolítható, A megfelelő kettősszálu DNS ezekvencia például kémiai szintézissel állítható elő, amelyben a kivánt amlnosavakat kódoló triplettek kerülnek felhasználásra.

• · • ··

- 18 A DNS fragmenset magfelelő irányban a megmaradt nagy fragnanahaz kötjük, és Így egy duplaazálu DNS szekvenciát kapunk, aaely a mutánst kódolja. A mutáns gén kézbentartásának megkönnyítése céljából a gént elönyöaen egy nagyobb, megfelelő kapcsolóláncokkal ellátott DNS szegmens tartalmazza, amely lehetővé teszi a klónozó vektorban lévő szegmens inszercióját és klónozását.

A találmány előnyös megvalósítása szerint a deszulfátohirudin mutánsokat kódoló DNS-ek előállítását a helyi irányítású mutagenezís váltja ki. Ez a módszar egy vítro mutagenezís eljárás, ami által a klónozott DNS régiójában egy meghatározott hely átalakulhat (ld. M.H. Zoller és M. Smíth, Methods Enzymol. 100. 468 (1983)/ D. Botstein és D. Shortle, Science 229. 1193 (1985)]. A mutagenízía megvalósítható a teljes deszulfátohirudin génen, vagy annak egy olyan funkcionális részén, amely a nemkivánt aminosav(ak) kodonja(l)t tartalmazza, Mutagenezís után, a mutált funkcionális rész a deszulfétohirudin gén másik részéhez kapcsolódik, hogy azáltal a teljes deszulfátohirudin mutáns DNS-t szolgáltassa.

A deszulfátohirudin génnek vagy funkciós részének mutélási módszerét az jellemzi, hogy az agyszálu gént vagy a deszulfátohirudin gént, vagy annak részét tartalmazó egyszálú DNS-t hibridizálják egy oligodezoxiribonukleotid primőrré, amely kiegészíti a hibrid gén régióját azért, hogy mutáljon, kivéve a hibás illesztésiek*)t.

• a · · • ··· ··♦ · · • · · · · · ·»«·· «· « ·· ami(k) irányitjá(k) a Mutációt, a hibridizéit oligodezoxiribonukleotidet használják primerként, hogy elősegít aék a komplementer-DNS szál szintézisét, a (részlegesen) keletkező kétszálu DNS-t alakítják át egy reclpiens mikroorganizmus törzzsé, a mikroorganizmus törzset tenyésztik és az átalakított terméket, amely DNS-t a módosított (mutáns) deszulfátohirudin génnel együtt tartalmazza, elválasztják.

Átalakított mikrobiológiai tenyészetek

A találmány továbbá egy olyan mikrobiológiai törzstenyészetre vonatkozik, amelyet egy egységet tartalmazó hibrid vektorral alakítanak át, ez az egység az első DNS szekvenciához kapcsolódó élesztő promoterből éli, amely DNS-szekvenica kódok egy második DNS-szekvenclához kapcsolódó, leolvasóezerkezetként működő jelzőpaptidet, az utóbbi DNS-szekvencia kódolja a deszulfátohirudin mutánst és tartalmazza az a transzkripciós terminális jeleket. A találmány vonatkozik még a gyártási módszerre, amely az említett mikrobiológiai törzetenyészetnek az emlitett hibrid vektorral való átalakítását tartalmazza,

A mikrobiológiai törzstenyészetek azok, amelyeket a fentiekben már említettünk· A találmány szerinti, hibrid vektorokkal való transzformációt az irodalomban

S. cerevisiae-re IA. Hinnen és mts-a, Proc, Natl, Acad,

Sci. USA, 75. 1929, (1978)], 8. subtilis-ra lAnagnoetopouloe és mtel, Bacteriol, fii, 741 (981)] ée • · · 1 · • ··· ·«· « · • · · · · Λ ·· ♦·· ·· · ··

Ε. col-ra ÍM. Manciéi és mtsi, □. Mól. Bioi. 53, 159 (1970)] leírt módon valósítottuk meg. Az ótalakitott baktériumsej* tek izolálásának előnyös megvalósítása szelektív tápközegből történik, amelyhez például blooidet adnak, ameSllyel szemben a kifejlesztett plazmidban lévő jelzőgén rezisztenoiát ad. Ha például a hibrid vektor az amp gént tartalmazza, akkor a tápközeghez ampicillint adunk. Ilyen közegben azok a sejtek, amelyek nem tartalmazzák a hibrid vektort, szétroncsolódnak.

Gyógyszerkészítmények

A találmány ezerlnt nyerhető uj deszulfatohirudin mutánsoknak értékes farmekológiai tulajdonságaik vannak és - a piócából extrahált hirudinhoz hasonlóan megelőzően vagy « főként - gyógyászati célra alkalmazhatók.

A találmány szerinti deazulfátohirudin mutánsok - a természetes hirudinhoz hesonlóan - hatékony trombin inhibitorok. Ki (deazulfátohirudin mutáns-trombin komplex desszociációs állandó) értékük 1θ’^δΜ - 1θ“^²Μ.

A deszulfatohirudin mutánsok trombinra teljesen specifikusak és nem mutatnék kölcsönhatást a véralvadási rendszer többi proteinázával. A toxicitás rendkívül alacsony. Hasonlóképpen túlérzékenységi vagy allergiás reakciók nem figyelhetők meg. Sőt, a találmány szerinti mutánsok in vivő hatástartama összehasonlítható vagy jobb a térné• · · · «.

* ··· ··· · s • · · · · · · ·· ··· ·· «

- 21 szét·· deszulfatohirudinénál.

A találmány szerinti uj deszulfatohirudin mutánsok ezért a természetes hirudlnnal analóg módon használ hatók trombózisok és tromboembóliák gyógyítására és megelőzésére, beleértve a műtét utáni trombózisok megelőzését is, akut sokk-gyógyításra (pl. szeptikus vagy polítraumáe sokk), az alvadással kapcsolatos betegségek gyógyításéra, hemodializisekben, hemoszeparációkban és extrakorporális vérkeringésben,

A találmány olyan gyógyszerkészítményekre is vooatkozik, amelyek legalább egy találmány szerinti vegyületet, vagy annak gyógyszerészetHeg alkalmazható sóját tartalmazzák, adott esetben egy gyógyszerészetHeg alkalmas hordozóval és/vagy adjuvánesal együtt.

Ezek a készítmények használhatók főként a fent említett indikációkban, ha ezeket bejuttatjuk, például parenterálisan, intravénásán, intrakután vagy szubkután módon, intramuszkulárlsen vagy topikálisan a szervezetbe.

A találmány vonatkozik a találmány szerinti uj vegyületek használatára és ezeket a vegyületeket tártál mazó gyógyszerkészítményekre az emberi és az állati test megelőző és gyógyító kezelése céljából, főként a fent említett klinikai szindrómák tekintetében, különösen az emberi és állati testen belül és kívül a véralvadás gátlására,

A dozirozáe főként a kezelés specifikus formájától és a gyógyítás vagy megelőzés céljától függ· Az • · — 22 — egy·· dózisok méretét és a bejuttatás módját a legjobban a betegség pontos okának egyéni elbiráláea utján lehet meghatározni, az ebből a szempontból szükséges releváns vérfaktorok meghatározási módszerei a szakember számára ismertek. Általában egy injekció esetében a találmány szerinti vegyületek gyógyászatilag hatásos mennyisége 0,005-0,1 mg/testsúly kg. Az előnyős dózis 0,01-0,05 mg/teet súly kg. A kezelés intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután injekció formájában történik. Következésképpen, a parenterális kezelésre szolgáló gyógyszerkészítmények egyedi dózisformában tartalmaznak a kezelés módjától függően, dózisonként 0,4-7,5 mg találmány szerinti vegyületet. A gyógyszerkészítmények a hatóanyag mellett rendszerint puffért ie tartalmaznak, pl. foszfát puffért, amely a pH értéket 3,5 és 7 között tartja, továbbá nátrium-kloridot, mannitolt vagy szorbitolt is az izotonicitás elérésére. Lehetnek fagyasztva-száritott vagy oldott formában, ez lehetővé teszi, hogy az oldatok előnyösen tartalmazzanak antibakteriális konzerválószert, például 0,2-0,3 % 4-hidroxi-benzoesav-metil-észtért vagy -etil-észtert.

A topikális alkalmazásra szolgáló készítmény lehet vizes oldat, loution vagy gél, olajos oldat vagy szuszpenzió vagy zsírtartalmú vagy főként emulgeált kenőcs. Vizes oldat formájú készítményt nyerünk például a találmány szerinti hatóanyagnak vagy gyógyászatilag alkalmas sójának 4-6,5 pH-ju vizes pufferoldatban való oldásával és kívánt esetben további ektiv koepenene hozzáadáséval, pél* Μ *

I

- 23 dóul gyulladásgátló szer és/vagy polimer kötőanyag, például poli(vinil-pirrolidon), és/vagy konzerválóezer· A hetóenyag koncentráció 0,1-1,5 ági előnyösen 0,25-1,0 mg oldatban vagy 10 g gélben.

Topikélis alkalmazású kezelésre olajos formájú készítmény állítható elő, például a találmány szerinti hatóanyagnak vagy gyógyászatilag alkalmazható sójának olajban való szuszpendálésével, adott esetben duzzo&tcszereknek, igy aluminium-sztearátnak és/vagy 10 alatti HLB (hydrophilic-lipophilic-balance) értékű felületaktív anyagoknak (tenzidek), igy többértékü alkoholok zsírsavval képzett monoéeztereínek, például glicerin-monoeztearátnak, ezorbítán-monolaurátnak, szorbitán-monosztearátnak vagy szorbítán-monooleátnak a hozzáadásával. Zsírtartalmú kenőcs állítható elő például a találmány szerinti hatóanyagnak vagy sójának kenhető zsiralapban való szuszpendálásával, adott esetben egy 10 alatti HLB értékű tenzid hozzáadáséval. Emulgeált kenőcs állítható elő a találmány szerinti hatóanyag vagy sója vizes oldatának lágy, kenhető vivőanyagban való triturálésával, hozzáadva egy 10 aletti HLB értékű tenzidet. Mindezek a topíkális alkalmazásra szolgáló formák konzerválószereket is tartalmazhatnak. A hatóanyagkoncentráció 0,1-1,5 mg, előnyösen 0,25-1,0 mg 10 g vivőanyagban·

Azon túl, hogy a fent leirt készítmények alkalmasak emberi vagy állati testben közvetlenül gyógyszerhasználatra, a találmány olyan gyógyszsrkésmitményskrs is • *

- 24 vonatkozik, amelyek az emberek vagy állatok élő testén kívül alkalmazhatók gyógyszeres kezelésre. Az ilyen készítményeket főként vérhez adott antikoagulána adalékként használják a keringés vagy a testen kívüli kezelés (például extrakorporális keringés vagy dialízis művesében) fenntartáséra, konzerválására vagy módosítására (pl. hemoszeparáció). Az ilyen készítmények, igy törzsoldatok vagy különféle egyszeri dózisformájú készítmények Összetételben hasonlók a fent leirt injekciós készítményekhez; azonban a hatóanyag mennyisége vagy koncentrációja előnyösen a kezelni kívánt vér térfogatétól vagy pontosabban annak trombin tartalmától függ. Ezzel kapcsolatban figyelemmel kell lenni arra, hogy a találmány szerinti hatóanyagok (szabad formában), amelyek a trombin tömegének körülbelül ötszörösét teljesen hatástalanítják, fiziológiailag még relatív nagy mennyiségekben is ártalmatlanok és a keringő vérből még magas koncentrációban la gyorsan eltávoznak, igy nincs túladagolás! kockázat, még transzfuzió alatt sem, A speciális céltól függően az alkalmas dózis 0,01-1,0 mg hatóanyag a vér 1 literére vonatkoztatva, bér a felső határ kockázat nélkül túlléphető.

A találmány főként a deszulfatohirudin mutánsokra, hibrid vektorokra, mikrobiológiai törzetenyészetek ilyen hibrid vektorokkal való átalakításéra és a példákban leirt előállítási eljárásokra vonatkozik.

- 25 Aralzok rövid ismertetése

A következő kísérleti részben a találmány különböző megvalósítási módjait ismertetjük, hivatkozva a mellékelt rajzokra, amelyekben:

1. ábra sematikusan ábrázolja a pML35O plazmid szerkeze- tét,

2. ábra sematikusan ábrázolja a p3DB207/GAPFL-HIR plaz- mid plazmidtérképét,

3. ábra sematikusan ábrázolja a p0DB207/GAPFL-HIR (Asp ) plazmid szerkezetét.

Kísérleti rész li^eélda

A pML350 plazmid szerkezete (Id. 1. ábra)

a. ) A plN-III-otnpA-2 plazmid DNS feltárása

10/ug pIN-III-ompA-2 plazmidot (□. Ghrayeb és mtse., EMBO-O. 3, 2437 (1984)] 25/ul 7,5 pH-ju 100 mM

Tris-HCl, 50 mM NaCl és 100/jg/ml zselatin elegyében oldunk és EcoRI és BemHI restrikciós endonukleáz enzimekkel érleljük. Az oldatot TNE-re beállítjuk és fenol/kloroform eleggyel extraháljuk. A DNS-t etanollal csapjuk ki. A pIN-IIZ-ompA-2/EcoRI/BamHI DNS vektort agaráton_/ gélelucióval történő elektroforézis után izoláljuk.

b. ) A pML310 plazmid DNS feltárása

20/ug pML310 plazmidot (ld. 168 342 sz. európai szabadalmi bejelentést) 50^il 10 mM 7,5 pH-ju Tris-HCl, «Μ NaCl és 100/ig/ml zselatin elegyében oldunk és EcokI és BaaHI retrikclós endonukleáz enzimekkel kezeljük. Az oldatot TNE-re beállítjuk és fenol/kloroform eléggyel extraháljuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk. Az F^-Fg-DNS (hlrudin gén) agarózon_{ gélslucióval történő elektroforézls után Izolálható.

c. ) A pML310-ből származó F^-F^-DNS (hlrudin géni lekötése plN-III-ompA-2/EcoRI/BamHI DNS vektorral /jg F₁-F₂-DNS (hlrudin gón)/EcokX/BaaHI-t és 30/Ug pIN-III-ompA-2/Ecokl/BamHI DNS vektort 50/U1 100 mM 7,5 pH-ju Trie-HCl, 50 mM NaCl és 100/jg/ml zselatin elegyében oldunk, TNE-re beállítjuk. Az oldatot fenol/kloroform eleggyel extrahóijuk és a DNS-t etanollal kicsapjuk. A DNS csapadékot 20yul 50 mM 7,8 pH-ju Trls-HCl, 10 mM MgClg, 10 mM OTT, 0,5 mM ATP és 100/ig/l zselatin elegyében feloldjuk és 25 U/Ul T4 DNS ligázzal (Biolabs) 15°C-on 3 órán ét kezeljük. Ily módon a pML350 rekombináns plazmid keletkezik, amely Inszerclóként tartalmazza az F^-Fg-DNS-t (hirudin gén).

d. ) E.Coli HB101 étalakitása pML.350 plazmiddal

A kálciummal előkezelt E.coli HB101 sejteket a Mandel által ismertetett [O.Mol. Bioi. 53. 159 (1970)] eljárással állítjuk elő. A c.) pont szerint kapott oldatot, amely a pML350 rekombináns plazmidot tartalmazza, a

- 27 a T4 DNS ligáz inaktiválása céljából 10 percig 65°C-on melegítjük, majd 37°C-ra hütjük. A kapott reakcióelegy 10/ul-át 150yul kálciummal előkezelt E.coli HB101 sejthez adjuk 10 mM MgClg-ot és 10 mM 7,5 pH-ju Tris-HCl-at tartalmazó 200 /j1 térfogatban.

Végül az igy kapott reakcióelegyet 30 percig jégben hütjük, 2 perc alatt 42°C-ra melegítjük, majd 50 percig állni hagyjuk 1 ml L-közegben (10 g/1 Bacto-trypton; 5 g/1 Bacto élesztő extraktum, 5 g/1 NaCl; 5 g/1 glukóz; 0,1 g/1 ampicillin) 37°C-on. Az elegyből 0,2-0,2 ml mennyiségeket

I

60yug/tnl ampicillint (Serva) tartalmazó 5 agairKzálkára (McConkey Agar Difco) terítjük ki. Az agai^tálkákat 37°C-on tartjuk 16-18 órán át. 185 átalakított, ampicillinrezisztens E.coli HB101 sejtkolóniát kapunk.

e. ) F^-F^-DNS-t tartalmazó selttelepek vizsgálata

Az 1. példa szerint átalakított 6 sejttelepet B85 nitrocellulóz szóróra (Schleicher ás Schull) visszük, Grunstein ás Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72. 3961 (1979)1 szerint roncsoljuk és a denaturált DNS-t a szűrőn fixáljuk. Ezután a szűrők előhibridizációját 20 ml (szűrőnként) 4xSET («30 mM Tris.HCl (pH 8); 150 mM NaCl;

mM EDTA], 0,1 tömeg/tárfogat% Ficoll 400 (Pharmacia),

0,5 % SDS, 50 /ig/ml denaturált borjucsecsemőmirigy DNS tartalmú elegyben 4 órán át 64°C-on végezzük. Ezután a nitrocellulóz szűrőket 20 ml (szűrőnként) 5xSET (tömeg/térfogat), 0,1 tőmmg/térfogat% Ficoll 400, 0,2 %

808 ót 50/ι1/·1 denaturált borjucoeooomőmlrlgy DNS tartólmi elegyben 16 órán át 64*0-on ^P radioaktív Izotóppal (közelítőleg 1Λ10* Coronov apa szórónként) jelzett szondával kezeljük, szondaként 46/64 komplementer_t 1/68, 86/67 ée 154/64 komplementer oligonukleotldokból álló elegyet (ld. 168 342 ez. európai szabadalmi bejelentést) használunk.

végől a szőröket kétezer kiadósuk 2x8ET, 0,2 %-oo 808-bon szobehöfokon, majd kétezer 2x8KT 0,5 %-oe 808-ben 60°c-en (olőezör 30 porcig, utána 60 percig). A szőröket 3 HH-oo Wathman papír között szárítjuk, majd 1-2 napig -8O°c-on röntgen filmre (Fuji) helyezzők orőeltő ernyővel (Xlford). Az eredményül kapott diagramok 5 pozitív kolóniát ábrázolnak, amelyek a további folyamatokhoz használhatók, o amelyek közöl ez egyik a pH L 350 jelzéeO.

2. példa

A OSH1QB B1MM1. Mt.rk.Mt.

Hívei e pHL350 plazmid a multi-klón láncot (EcoRX, HindXXX, BamHX telepeket) tartalmazó pXN-IXX-ompA-2 plazmidból származik, 12 kiegészítő bázispárt tartalmaz az Alá, Gin, Phe, Hat emlnoeavekat kódoló kifejlett hlrudln gón előtt. A kifejlett deszulfatohirudin gén a 12 bázis párból In vltro autegonozio során 27 mer oligonukleotidot használva hurokká formálódik.

* · * 2® «♦) atoM.....

B^u® pMLSSO plazmidot Xbal de BaaHX endonuk* leézokkal kezelünk. A két XbaX-BaoHX {rengene (SX) közöl a nagyobbat agarozon történő elektroforézia után gélelucléval Izoláljuk áe 1 mM 7,5 pH-ju Tria-HCl áe 0,1 aM EDTA elegy®» ben oldjuk· **) \PHfcMPZTyMl ÍWB) piiwiM .«muuum

5/ig pMLSSO plazaidot PvuX endinukleázzal d Igoré lünk. A lienária DNS pML350/PvuI-et ezután 3 egységnyi bélalkálifoszfatázzsl (Boehringer) 30 poráén át 37®C-on kezeljük· Az enzimet az oldat 60 porcig, 65°C-on történő me» logitóaévol inaktiváljuk· A linaárla pML3SC/PvuX 8XX) DNS agarozon történő elektroforézia után géleluoióval izolálható áa 1 mM 7,5 pH-ju Trib.HCl éa 0,1 mM MTA alagyében oldható.

c.)

A 168 342 számú európai szabadalmi bejalantómban iamartetott eljáróm szerint azintetizáljuk az alábbi DNS fragaaneat, amely a X27 jelzést kapja: 5*-ÓTA GCG CAG GCC OTT GTT TAC ACC GAC-3'

X27

Az 5* torainál foazforilazéea fy-^PJ-ATP éa T4 pollnuklootld kinéz (Boehringer) alkolmazáeável a leírtak szerint történik· (Molecular Cloning, A Laboratory Ménnél (ozork.

T. Manlatlo és mtsa.), Cold spring Harbor Lob· (1082),

125. old· J.

- 30 <*·) ά mw idawttt

0,3-0,3 /üg 8X DNS-t óo 8ΣΧ DNS-t 40 paol foszfor ilszott X27 ONS-fragmsnoCol keverünk össze 27/il 1 eH

7.5 pH-ju Tris-HCl és 0,1 mM COTA elegyében· Az ologyhez 3/íl 10x polimoréz-ligéz puffért (1 M NeCl, 65 mM

7.5 pH-ju Tris-HCl, 80 mM MgClg ée 10 mM fi-merkepto-etenel) adunk· Az így kapott keveréket a OMMragoonook denaturá* lése céljából 3 percig forró vízfürdőn melegítjük. Végül ez elegyet fokozatosan (kb 1®c/porc sebességgel) 30°c*ra hőtjök ée ezen a hőfokon tartjuk 30 porcon ét· A továbbiakban az elegyet 4®C-on 30 porcig, aajd azt kővetően jégben 10 porcig inkubáljuk·

A négy dozoxlrlbonuklootld foezfatéz (mindegyik

7.5 SM) 12/il-ét 6/11 fO mM ATP-t, 6/U1 T4 0N8 llgóxt (2,5 U^ul) ée 1,2/11 Klenow DNS polimorázt (Boobringer,

U//11) adunk hozzá és a DNS elegyet (összes térfogat 55/11) 16 érén ót 12,5°C-on inkubáljuk·

A DNS elegyet 2 egységnyi EcoRX ondonukloézzal 1 órán át 37°C-on digoréljuk, hogy a változatlan kiindulási pMLSSO plazmid szétroneeolédjen. ebbon a folyamatban képződik a PBH109 plazmid, amely 1 pp promotort és az ompA-2 jelző szekvenciához funkcionálisan kapcsolódé lac promoter/operótort tartalmazza, az ompA-2 a kifejlett deozulfétohlrudint kódoló gér&z kapcsolódik.

- 31 •·> Α» ΗΒ101 tranatfar^clóla Ρ8Η108 plAz.ldd.l

A kálolua kezelt Ε*οο11 HB101 «ejtek trenezfor«tolóját ez 1d.) példában leírtak azerint végezzük. A táljáé raakolóalegy térfogata 5B/il.

f.) A PBH109 plwnldot t»rt»l««»ó Mlttplpppk vtoaaálata

100 trenáxforaált eojttolopot tonyéoztünk, Minden kolóniából dhs pizzáidét preparálunk, aalt EeoRX-val kezelünk. Minden DNS plazuld, aaoly nea digorálható EcoRX-val, képes olyan pBH109 plezaldokat tsraslni, saslysknsk áz EcoRX részs hiányzik.

A pozitív egyforaa kelániákst színesítjük.

Közülük egyet kiválasztunk ás pBHjOG piszéidjsllsl jelöljük.

Az DN8 pontee mkvonelájét, aaoly ez eapA-2 vezető ezekvenciát követi, ezekvenoie snelizieeel bizonyltjuk.

A hlrttdin Glu 61. Cl· 62.aytk.lnak autleltl.

Sln61. cin 62-v6 eavnálu M13.p18/hlrudln h.Mntl.táv»l

58 60 61 8264 hirudin Phe Glu Glu Xle Pre Glu Glu Tyr LeuGlu kódoló ezál 5*...TTC GAA GAA ATC CCG GAA GAA TAC CTG CAG3* autogén priaor 1 3« OTT CTT TAC GGC £TT £!T ATG GAD GTC5* • ♦ * 32 utált kódalá szál 5%·.TTC GAA GAA ATC CCG GAA CAA TAC CTG CAG 3*

Ph· Glu Glu XI· Pre Gin Gin Tyar Lau Gin

A autagén priaarakat faazforaaidit aódazarral állítjuk elő ÍM.H. Caruthara, Chaaioal and Enzyaatie Synthaaia of Gana Fragaanta (H. G. Gaaaan éa A. Láng, Ed·.) Varlag Chaaia, wainhaia, Náaat szövataégi KöztáraaaágJ Applisd Biosystaaa, 380B aodall szintetizátoron.

B/il M13ap19 ksttőaazálu DNS-hez (ds-ONA; O,1/ig/al; BRL) 2/il raagsna 2-t (500 aM 8,0 pH-ju Tria-HCl; 100 aM Mgclg, 500 aM NaCl) (BRL), 1 /il XbaX-t (10 U#j1), ο,β/ιΐ BaaHX-t (10 Ujjpl) áa 12/il vizát adunk· 4,5 órán át 37®C-on történő inkubáláa után 0,5/tl BaaHX-t, 2,5/11 raagana 3-t (500 aM 8,0 pH-ju Tria-HCl; 100 aM MgGlgf 1000 aM NaCl) (BRL) éa 2/il vázat adunk házzá áa tavábbl 1 órán át kazaljök 37°C-on.

A térfogatot 100/il-ra agéazitjök ki vlnil, A da-ONS-t fanolaa axtrakeióval éa atanoloa kieaapáaaal izoláljuk, aajd 30/il TE pufferben (10 aM Tria-CHl, 1 aM 8,0 pH-ju EDTA) oldjuk.

Ötször 5/ig pBH109 plazaidot XbaX áa BaaHX anziaakkal az alőzőakban iaaartatatt aódan haaitunk, a kivo-

• 33 nstot elektroforézisnek vetjük alá 3 órán ót 150 Volt feezü&ággel 3,5 %«oe pollakrll-aald gólén 1ΧΤΒΕ pufferrel (1θχ TBE puffari 108 g Trls, 55 g bórsav. 8,3 g EDTA.2 HgO/l>. Az Xbal-BaaHI fragmene a hlrudin gént (250 bp) tartalaazza, amely UV fény alatt láthatóvá válik, alutén a gélt 400 «1 1x TBE puffarba «ártjuk, aasly 10/il etldlua-broald oldatot (10yug/al viz) tartalmaz. A restrikciós fragmenet tartalmazó gél egy részét kihasítjuk a gólból ée az 500yul o,5x TB6 tartalmú dialízis egységbe helyezzük ée a DNS-t elektr célúdénak vetjük elé BXO-RAD minlgél elektroforézia készüléken vezető pufferként 0,5x TBE-t alkalmazva 170 volt feazültaéfen 30 percen ét. A DNS-t Elutip-d tipusu kolonnára (Schlelchsr & Behull) visszük 0,5x TBE pufforral beállítjuk. A kolonnát 2 al 0,5x TBE pufforral mossuk és a DNS-t 1 M Naci-ot tartalmazó 0.5x TBE (1 al) puffarral eluáljuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 10/ul TE pufferbe visszaoldjuk·

C. Xb.I-B.mHI hlrudin infroió M1»«lo58 pUzmldb.

** MVltilM 0H8 .mnitá.»

Öt jul XbaX-BamHI hlrudin lnazorciót 2/d xbaX-BamHX által hasított M13mp18 plazmidot, 1/ul 10x ligáz puffért (50 mM 7,5 pH-ju Tris-HCl, 10 mM MgClg, 10 mM dltiotroltol), 1y«l ATP-t, 1,5/U1 T4 DNS llgózt (BEL; 1 U^Ulj összekeverünk ée éjszakán át 14^eC*on inkubáljuk. Ot/al lekötőelsgyst az E.coli DM101 kompetens sejtek transzforsó·♦·>

- 34 dójához használunk a 3. Meoaing (Methode in Enxyaolegy 101. 21-78 (1083)3 által leírt aódozar szarint. Tizenkét átlátszó leaezként veszünk ée ogyozálao DNS (SS-DNS) szekvenciákat preparálunk ki Mindegyik loaezből 3. Heesing (ld. olóbb) szerint. Az MlSaplO/hlrudln jelzésű DNS·! 50/il TE pufferben (0,1-0,5yug^ul) ujraoldjuk.

IX. s.itf l.B«k difi Irányított .ufaanfl.

A. Hutaadn arf r fea»ferll.»de.

200 paci (23/11) autogén priaor 1-ot (ld. előbb) 3/il 10x kinéz puffer (1H Trlo«tiCl, 0,1 H MgClg, 0,1 M ditiotreitcl, pH 8,3) 3/il 10 aM ATP ée 1yul T4 pollnukleotid kinéz (BEL, 10 U^ul) hozzáadásával foszforilezűnk. 37°C-on 1 órán át történő inkubálás után a reakciót 65°C-on 10 porcig tartó Melegítéssel állítjuk Meg.

B. A .ufadn Brlwr 1 hikialh. .ov.f lu HlS.pIfl/hirudln _M tPaciéttá

6/il (0,5yug) egyozálu MlSaplO/hirudint (ld. 1.0.pont) 3/11 (20 paol) foezforllezett autogén oligodezoxirlbonuklootlddal (ö,ö pacidul) ép 1 yul A pufforral (0,2 M 7,5 pH-ju TrlO-HCl, 0,1 M MgClg, 0,5 M NeCl, 0,01 M OTT) 7O°C-on 5 percig kezeljük, aajd lassan, 30 perc alatt ezobahőfokra hűtjűk.

• · ·

- 35 Fenti hőkezelt elegyhez 1 /il B puffért (0,2 M

7,5 pH-ju Tris-HCl, 0,1 M MgClg, 0,01 M OTT), 1 /il 10 aM ATP-t, 4/il 2 aN dNTP keveréket, 5/il T4 ONS pollmerózt (Boehringer, 1 U/Jöl), 5/il T4 DNS Hgázt (BRL, 1 U^ol). Az igy kopott elegyet 3 órán át 16®G-0n inkubáljuk. A reakciót 65®c-en 10 percen át tőrtánő aelogltésool állítjuk meg.

A lekötési elegyet 1i20 arányben etoril vízzel hígítjuk ás 1/11, 5/11 velealnt 1/ul hígítótlen.lekötési elegyet az 2.coli BMH 71*81 kompetens 8 aejtek transzformációjához használunk. IB. Kraaer, W. Kraaer ás H.-3. Frltz, Coll 079-887 (1984)]· A sejteket az M13 donlng and sequonclng Hendbook (kiadót Aaorehae) szerint ismertetett módon lemezoljök· Tizenkét átlátszó lemezkét veszítek és az os-ONS-t az I-C. pontban leírtak szerint preparáljuk.

b.„ igwBtAtt mim ,y.UMitm

Az egyszálú DNS mutáns vizsgálatához a 12 aeONS minta mindegyikét dldozoxlnukleetlddsl hasltjuk láncvégi módszerrel (F.Sanger, S. Nlckler ás A.R. couloon, Proc· Nati. Acad. Sd. USA 74. 5483-5467 (1977)1. Kezdetben esek a vért mutációs bázis dldezoxlnukleatid komplaaentere vesz • Μ · részt s reakcióban· Ezutén néhány pozitív mutánsból az so-DNS-ak la résztvesznek a műténe teljes DNS szekvenciájának kialakítóméban a T7 DNS poliaeréz onzin segítségével (Sequenase, USB) Tábor és Richardeon [Proc. Natl. Acad. Sci· USA M* 4767-4771 (1987)] által ismertetett sódon. A vért bázis változások, amelyek a rekombináns hirudin 61 és 62 helyén a Glu—» Gin mutáeiét kódolják a DNS szekvenciában figyelhetők meg. A kivánt szekvenciéju DNS fégot a Hl3ap19/hirudln E 61, 62 Q-val jelöljük.

F-.- A wlAMtAv PH3 (RF) .lMllltéW .gvMálu M13«l19/hlrudln E 81. 620 ONS fádból

10-20/ig egyezálu hirudin E 61, 62 Q mutáns DNS és ds-DNS segítségével transzformált kompetens E.coli DM101 sejteket az *M13 donlng and eequanaing Handbook (kiadói Amersham) előírása szerint állítunk al6. A 40-50/ug-nyi de-DNS-t 100 ml tápközegbői nyerjük ki.

ia.....Δ «μι,Μι.

A mutált hirudin xbaX-eamHZ lnszorciót 25/ug de-DNS-ből hasítjuk ki és az X-B. pontban ismertetett sódon tisztítjuk· A DNS*t 20/11 steril vízben oldjuk.

t

H. Xb.X-B.wHX .IMllitá.. oIH-III-o.dA-2 ONS v.ktorr.l történt h».ltá.»«l

1,5 /ig pXN-III-ompA-2 plazmid kivonatot 6 /11

Roogono 2 puffor (BRL), 2/il (20 egység) xbax, 1/il BaaNX (10 egység), 1/il Ecokx (10 egység) ée 37/il viz (teljes térfogat 50/il) ologyéből nyerünk 37*C*on 3 érén ét történő lnkubáláe után. 1/il (10 egység) BamHI, íjul (10 egység) EcoRX, 5/il Reagens 3 (BRL) és 12 /il víz hozzáadása után az inkubáláet aég egy órán át 37°C*on folytatjuk.

Xt,„ E-ftl*.„M, MOfoaáft ARA

Kilőne/il R 61, 62 Q XbaX-BaaHX inezorclóe 0N8 hlrudin, 2/61 pXN-XXX-oapA-2- DNS vektor által hasított ^baX-BaaHX, 3/il 10z lekötő puffor (BRL) ás 1 /il (1 U^ul) T4 0N8 ligás (BRL) elegyét 14°C-on 16*20 órán át inkubáljuk.

III. (Gln^-^l-d.wulf.tohlrudln t.nvd«tóc. 3M101 fidWtl>10tfr*MiHera,lMn

A. JM101 8. coll tórz.b.

0,3/il 3M101 E.coli kompetens sejt transzformációjához 5 /il lekötőolegyet használunk a 2. Meeeing (Id. előbb) által ieaertetott módszer szerint.

al 2xYT/Aapioillint (50 /ig ampicillin/2xYT alj adunk a mintához áe a sejteket 1 órán át szobahöfokon hagyjuk szaporodni. A tenyészetbői 1 al aintát veszünk és LB/Aaplcillin (5 /ug aapleillin/al LB-agar) loeezre öntjük, aajd éjszakán ét 37°C-on hagyjuk szaporodni* ♦ ··

B. ICln^6,’⁶²3-d.«ulf«tohlrudin tDrilik kivdUxxtáM

Az LB/Aaplolllin leaezokról tíz baktériua törzset veszünk és elkülönítve 5 érén ét 37°C-on S al LB/AapleIliinben (50/ig Aapicillin/al LB) növesztjük. Minden egyes kultúrából 1 al sintót veszünk és a sejteket contri fugéláesal tárjuk fel (300Qxg 5 parson át). A oejtaintákat külön-külön 100yul 10 aM 8,1 pH-ju Trás-HCl oldattal ozaótikusan sokkoljuk O°C-on 30 poroon ét, hogy az anyag a baktériumok periplazaikus terébe kerüljön. A sejteket contri* fugéláseal távolítjuk el, a folüluozó hirudinaktivitását az V.B. szekcióban leírtak szerint vizsgáljuk. Azokat a Mintákat, aaolyek a legmagasabb inhibitor aktivitással rendelkeznek, kódkulturába kiválasztjuk.

A legaktívabb mintóból származó sejtek vioozeaaradó aennyleégét (4 al) használjuk 1 1 LB/Aapicillln (50/ig Aapicillln/al LB) beoltására. A kultúrát éjszakén ét 37°C-on növesztjük és a sejteket centrifugálással (SOOOxg 15 percen ót) tárjuk fel. A sejtgömböket 50 al 10 aM 8,1 pH-ju Tris-HCl oldatban való ujraszuszpendálássál ozaótikus sokkolásnak vetjük aló O°C-on 1 órán át. A sejtek a periplazaikus frakcióból centrifugálissal (SOOOxg 10 porcon át) távolíthatók el.

• ♦ · · • 39 ,Οι,Λ.

A poriplazmlkus frakció pH értékét 0,1 M HC1 oldattal 6,5-re állítjuk éo 0,45 /im-ee szOrőn (Nalgono) la* ezOrjOk. A proteint FPLC rendezőre (Fsat Protein Liquid Chromátcgraphy, Pharmacia-LKB) Mono*Q kolonnára viaszok, 50 mM bio*Trie*HCl puffőrrel pH 6,5*re beállítjuk. A de* szulfatchirudin autánst az oszlopról lineáris eógradienoO 0*300 aH Nacl*tartalmu 5,5 pH*ju bia*Tria*HCl oldattal moeeuk lo_t 45 perc alatt, 0,8 ml*nyi frakciókat gyOjtOnk az oezlopeluátuaból ás a xxx-B pontban leírtak szerint hirudin aktivitást vizsgálunk. A doszulfatohirudln autánst tártál* mazó frakciókat Összegyűjtjök, ozOrjQk aint font ás Mlllipore*Watero HPLC rendszeren kromatografáltuk Bronwnlee Labe 08 rover*fázieu HPLC kolonnán, aaelyet trifluor*ecoteav 0,09 térfogat%*oe vizet oldatával állítottunk elő. A hirudin autánst az oszlopról lineáris gradienoO 7*28 tér* fogaté acetcnitrilt tartalmazó trífluor-ecetsav 0,09 térfogat%*oo vizes oldatával eluáljuk. A teln^’^l^deezulfato* hirudin tisztasága igy meghaladja a 98 %*ot, egyetlen csúcsként jelenik meg a 28. percnél.

6a,Δ.

A tisztított íGln⁶^^#62]*do8zulf*tohirudint a determináló aminooav Összetevőkkel, ez N*terminálle ezek* véneiével és a peptidfelépitéooel jellemezzük.

«·····«·· • ♦ · · · · · ·· ··· ·· · «·

2-5/jg proteint üveglombikban GN sósavgőzben 110°C-on iR.U Henrikeon óo S.C. Morodith, Anal. Biochaa. 136. 65-74 (1984)] hidrolizálunk. Az aminoeavakat vákuumban aegszárltjuk, fenilizotiooianát származékokká alakítjuk és rever-fázieu kolonnán szétválasztjuk ÍB.A. Bidlingmeysr, 8. A. Cohen és T.L. Terűin, Chromotography 336. 93-104 (1984)]·

Az aminosav Összetétel 6889 o molekulasúlynak felel mag·

Közelítőleg 50 pmol lGln⁶^*^]-deezulfatohirudlnt 5 ciklusos automatizált Edman degragéoiónak vetjük alá Applied Bioayeteme 470 A tipusu gázfáziau analizátort alkalmazva IM.W. Hunkapillar ás LE, Hood, Mstods in Enzymology 91. 486-494, (1983)], hogy meghatározzuk az H-terainális aminosav azekvenoiát· A keletkező HPLC rendszeren IR.M. Hewiok, M.W· Hunkapillar, LE. Hood éa W. □. Oreyar, 0· Bioi· Chem. 256. 7990-7997 (1981)], Applied Bloeyeteaa 120 tipusu on-line analizátort alkalmazva szétváló azt juk·

A (Gin⁶¹*⁶²]-deszulfatohirudin peptid-térképének meghatározása céljából 50yug proteint vákuum alatt megszéritunk és perhangyasavval 37^öC-on 1 órán át kezeljük te. H. W, Híre, Methods in ünzymology JX, 197-199 (1967)].

A reakcióelegyhez 45yul hideg vizet adunk, megfagyasztjuk ás vákuumban szárítjuk (kétszer). Az oxidált hirudin mutánst 50/ul 5 mM NH₄CO₃-ot tartalmazé oldatban digaréljuk 1yug termolizinnel (Boehringer) 4 érén ét « »··

37°C-on. Frakclonáláe előtt az elegyet vákuumban szárítjuk, majd 0,1 tárfogatozázalékos trifluor-ecoteav/vlz elegyben oldjuk· A peptideket rovorz-fázieu HPLC-vel tieztitjuk Vydac C 18 tipueu kolonnát használva, amelyet 0,1 térfogatezázelákoa trifluor-ecoteav/vlz eleggyel állítottunk be· A peptideket 0-28 térfogatszázalékos, lineáris gradiense ecetonitrliléi 90 percen át 1 ml/pmre átfolyó oebeeeággol eluáljuk·

A mutációkat tartalmazó peptidok aminosav szokvenoláját az előzőekben leirtak szerint határozzuk meg, bizonyítva a Glu 61, Glu 62—> Gin 61, ©In 62 aminosav •zuboztitucióket· hlrudln

Pho

Glu

G1U

He

Gin kódoló szála

5·

TTC

GAA

GAA

ATC

CAA CAA TAC

CT©

CAG

3' autogén primer : mutált kódoló szál

3·

5*

TTC

Pho

CTT

CTT

TAG

GGC

GAA Glu

GAA

Glu

ATC

Xle

CCG

Pro

GAT G£T ATG

CTA CTA TAC Lau Lou Tyr Leu Gin ©AC

GTC

CTG

CAG

3’

A helyi irányítású mutagonezlot autogén primer éa H13mp19/hirudln B 61, 62 Q használatával a 3· példában (X· ée XX· réez) leírtak szerint valóéitjuk meg. A mutáns proteint E.coli törzsben tenyésztjük és a 3« példában

(XXX. rész) ismertetett «ódon tisztítjuk· A mutáns protein azonosításét, amelyben a Gin 61, 62 Leu 61, 62-vel van helyetteáitve, amlnoeavösezetétellol áe N-terminális ezekvenoiaanaliziseel (3· példa, E rész)_rigazoljuk ée inhibitor sajátságaikat meghatározzuk (14. példa), A mutánst [Leu⁶¹'⁶²]-deszulfatohlrudln-nak jelöljük.

hirudln a hirudln Glu 61.62 övökéinek mutációié Asn 61. 62 Glu ι

Phe

Glu

Ile

Pro kódoló szála

5»

TTC

GAA

GAA

ATC

CCG

Glu Glu Tyr GM GAA TAC

Leu

Gin

CTG

CAG

3» autogén primer mutált

3*

5*

TTC

OTT

CTT

TAG

GGC

GAC

GTC

5*

GAA

GAA

ATC

CCG

CTG

CAG

3* kódoló szál

Phe

Glu

Glu

Xle

Pro

Leu

Gin

A 3. ée 4. példában megadott folyamatot outagán primer 3 használatával megismételve a kivént mutáns proteint kapjuk, amelyben e Glu 61, 62 Asn 61, 62-vel van helyettesítve. A mutánst [Asn⁶¹*⁶²]-dsezulfatohirudinnak jelöljük.

··· • · ··· ·«· • · ··· ··

- 43 A hlEMdJjn _Glu 57. 58. 61. 62 gyökeinek Mutációi*

Leu 57. 58. 61. 62 aslnoeaygyökké hlrudln kódoló szála

Betegen primer 4 kódoló szál

		56		58		60
Gly	Aap	Phe	Glu	Glu	Xls	Pro	Glu		Tyr	Leu	Gin
GTT	GAC	TTC	GAA	GAA	ATC	CCG	GAA	GAA	TAC	CTG	CAG 3*
CCA	CTG	AAG	£AT	g^T	TAG	GGC	SAT	g&T	ATG	GAC	GTC 5*
Gly	Gly	Phe		Leu	Ilo	Pro	Leu	Leu	Tyr	Leu	Gin

A 3. ás 4· példában ismertetett folyamatot muta* gén primőr 4 használatával msgisaétslvs a kívánt mutáns proteint kapjuk, amslyben a Glu 57, 58, 61, 62 Lsu 57, 58, 61, 62-vsl van helyettesítve. A mutánst iLsu⁵⁷*⁵⁸*⁶^*®²l-doszulfatohiru dlnnak jelöljük.

ZxüBálá®

A hlrudln Glu 57. 58. 61. 62 gyökeinek mutációia

Asn 57. 58. 61. 62 aslnosavovökké

hlrudln	54 Gly Asp
kódoló szála	5* GGT GAC
autogén
primer 5	3* CCA CTG
mutált	5· GGT GAC
kódoló szál	Gly Asp

58 60

Phe Glu Glu Tle Pro TTC GAA GAA ATC CCG

AAG TTA TTA TAG GGC

TTC AAT AAT ATC CCG

Phe Asn Asn Zle Pro

64

Glv Gly Tyr Leu Gin

GAA GAA TAC CTG CAG 3»

TTA TTA ATG GAC GTC 5*

AAT AAT TAC CTG CAG 3*

Asn Asn Tyr Leu Gin • · • · • ··

- 44 A 3. és 4. példában megadott eljárást autogén primer 5 használatával megismételve a kívánt mutáns proteint köpjük, amelyben a Glu 57, 58, 61, 62 Asn 57, 58, 61, 62-vel van helyettesítve· A mutánst (Asn^^^'^l-deszulfstohlrudlnnak jelöljük.

	A^j^ln_Asp. 53. avökéiMLk mutációja Alá 53 amino- «ΡΥΑ,γβ.ΚΜ 50 52 54 56
hirudln	Ser Hie Asn Ásd Gly Asp Phs Glu
kódoló szála	5' TCT CAC AAC GAC GGT GAC TTC GAA 3’

mutagén

primer 6	3· AGA 6TG TTG CGC CCA CTG AAG CTT 5*
mutált	5· TCT CAC AAC GCC GGT GAC TTC GAA 3·
kódoló szál	Ser His Asn Alá Gly Asp Ph· Glu

A 3. éo 4. példában ismsrtotott oljáráat megismételve mutagén primer 6 használatával a kivént mutáns proteint kapjuk, melyben az Asp 53 Alá 53-mal van helyettesítve. A mutánt (Ala⁵³]-deszulfatohlrudlnnak jelöljük.

Apó 63 vagy Glu 63 ao^osavavölké (lik X . Jbral

A deazulftaohirudln Tyr 63 amlnoeavgyökének mutációja Asp vagy Glu aminosavgyökké az oligonukleotld lánc • · — 45 — kódoló szekvenciájába történő inszerelóval érhető el, a lánc TAC kodoja a Tyer63 gyököt helyettesit! GAC kodonnel (Asp-t kódoló) vagy GM kodonnal (Glu-t kódoló). A keletke* ző polipeptidőket |Aep^oaJ*doszulfatohirudlnnak illetőleg (Glu⁶³J-deazulfatohirudinnak jelöljük.

Az élesztőből származó p3DB207/GAPFL-HIR plazmidot (Id. 2. ábra; 225Ö33 sz. európai szabadalmi bejelentés) Sáli és EcoRI restrikciós endonukleázok segítségével tárjuk fel. A 478 bp sajl-EcoRI fragmepeet 0,8 %*os preparativ

I aga rPg élen választjuk el TBE puffer elegyben (90 mM Tris-bézis, 90 mM bórsav, 2,5 mM EDTA, pH 8,3). Az etidiua-broaiddal festett fragmenst a gélből izoláljuk. A DNS-t 0,2x TBE pufferben 45 percen át 100 aA-en eloktroeluáljuk és DE 52 (Whetaen) ioncserélő kroeatográffal tisztítjuk. A DNS-t a DE52 kolonnáról magas sótartalmú pufferrel 1,5 M NaCl, 10 mM 8,0 pH-ju Tris-HCl, 1mM EDTA) sluáljuk, etanollal történő kiosapáa után vízben 0.1 pmol/űl koncentrációban ujraoldjuk. A 478 bpSall-BamHI fragmene a BgUI-Eeokl GAPFL promotor fragmenshez kapcsolódó pBR322 S»11-BamHI szekvenciáját tartalmazza.

A p3DB207/GAPFL-HIR plazmidot BamHI és S»1I felhasználáséval digeráljuk. A nagy, 8,7 kb vektor fragmenset az előzőek szerint izoláljuk. A kicsi, 740 bp Sajl-BamHI fragmenset le izoláljuk, ez tartalmazza a 478 bp Sall-EooRI fragmene (Id. előbb) szekvenciát áa a PHQ5 jelezekvenciát, • · ·· ···· ·« • a · v « «· ··· . » « · ·

- 45α* amely a deszulfatohirudin kódoló szekvenciájával egyesül.

A 740 bp fragmenet AsuIZ piszéiddel kezeljük. A DNS-t fenol/hlorofora eleggyel extraháljuk, etanollel kicsapjuk és vízben issét feloldjuk.

Az alábbi képletű szintetikus oligodezoxinukleoti dák (1) 5·-CGAAGAAATCCCGGAAGAAGACCTGCAOTAG-3· (2) 3·- TTCTTTAGGGCCTTCTTCTGGACGTCATCCTAG-5» (3) 5*-CGMGAAATCCGGAAGAAGAACTGCAGTAG-3· (4) 3·- TTCTTTAGGGCCTTCTTCTTGACGTCATCCTAG-5* mindegyikét 40/il 60 mM 7,5 pH-ju Tris-HCl, 10 mM MgClg, mM OTT, 0,5 bM ATP ée 27 U T4 polinukleotid kinéz (Boehringer) elegyében 37°C-on 45 percig érleljük. Az (1) és (2) oligonukleotldokból álló reakcióelegyeket egyesítjük, ugyanúgy a (3) és 4) elegyeketjie· Mindkét keveréket 10 percig 75°C-on melegítjük, majd hagyjuk ezobahófokra lehűlni.

A hókezelt oligonukleotid láncokét (1*2) ée (3*4) -20°c-on tároljuk.

0,85yug (3,8 pmol) AeuZX-vel kezelt DNS-t 16 órán ét 15°C-on a DNS-re számitott 100-ezoroe feleelegben vett enzim- ée hőkezelt, DNS léncvégekhez kapcsolódó oligonukleotid láncokkal inkubáljuk 150/il 60 mM 7,5 pH-ju Tris-HCl, mM MgClg, 5 mM OTT, 3,5 mM ATP és 1200 U T4 DNS ligáz (Biolebs) elegyében. A T4 DNS ligáz 10 percig 85°C-on tör- 46 — ténő inaktiválása után az oligonukleotid láncok feleslegét a DNS kicsapásával eltávolítjuk. A DNS kiesapásét 10 mM EDTA, 300 mM 6,0-os pH-ju nátrium-aoetét és a térfogat 0,54 százalékában jelenlévő lzopropanol segítségével végezzük. A DNS-t EcoRI és BamHX enziaekkel digeráljuk. A képződő fragaeneoket 2 %-oe preparatív agai^élen TBB ppffarban elválasztjuk. A 262 bp fregaenset a gélből elektróddaléval és etanoloe kloeapésssl tárjuk fel. A DNS-t 0,1 paol^ul koncentrációban újra ezuezpendéljuk. Az EcoRI-BaaHI frageens tartalaazza a deszulfatohirudin kódoló szekvenciáját GAC vagy GAA triplsttel, amelyek az Aep 63 vagy Glu 63 aminosav* gyököt kódolják.

A fenti aédon izolált héroa DNS fregaenset a következő reakcióban kötjük le. 0,2 paol 478 pb Sa1I-EeoRX frsgmenset, 0,2 paol 262 bp EcoRI-BamHl fregmenset (tartalmazza a GAC vagy GM szekvenciát) és 0,1 paol 6,7 kb vektor fragmenset 10 /il 60 mM 7,5 pH-ju Tris-HCl, 10 mM MgClg, 5f BM OTT, 1 mM ATP és 200 U T4 DNS ligáz elegyében 6 órán át 15°C-on kezelünk. Mindegyik kötődegyből 1 /11 mennyiséget veszünk ki és 100/j1 kélciuakezelt transzformációé E.coli HB101 kompetens sejtekhez adjuk.

transzformált aapioillin-rezisztens törzset tenyésztünk 100 mg/1 ampicillin tartalmú LB tápközegben· A DNS plazmidot preparáljuk és iHolmee és mtea-a Anal. Biochem. 114 (1981), 193] BaaHX, EcoRI kettőt digerálással analizáljuk.

• **

- 47 A DNS-ben a Mutációk jelenlétét DNS azakventáláétól bizonyltjuk [Sangar ée mte-a, Proc. Heti. Acad, scl. USA (1977), 5463]· A hirudln szerkezetű génben a GAC kodon nal rendelkező kiónt a p3DB207/GAPFL-HIR (Asp 63) jellel azm· neeitjuk. A GAA triplettel rendelkező kiónt, amely a hirudin 63 helyzetében e Glu aminoeavgyököt kódolja, p3DB207//GAPFL-HIR (Glu 63) jellel azonosítjuk,

1Q., Példa

A [Pro ]-deazulfatohirudint kódoló élesztőből szárászé plazmid szerkezete

A deszulfatohirudint kódoló DNS szekvenciát kibővíthetjük prolint kódoló CCA oligonukleotlddel, A keletkező uj deszulfátohirudln éleeztőben tenyésztjük, és a C-terminálon prolint tértalmozó 66 aminoeavgyökből áll. Ezt • polipeptidet [Pro ]-deezulfatohirudlnnak jelöljük.

A p3DB207/GAPFL-HIR (Pro 66) piszéid ugyanúgy építjük fel, mint azt a 9. példában ismertettük, azzal a különbséggel, hogy a következő óligodezoxinukleotidőt használjuk:

Pro (5) 5· -CGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGCCATAG -3‘ (6) 3* - TTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCGGTATCCTAG -5*

Az egyedülálló DNS kiónt, amely a hirudln kódoló szökvénalájóban a CCA triplettel rendelkezik a p0DB207/GAPFL-HXR (PrO 66) elnevezd···! jelöljük.

11. példa £RE13_Áa HT246.SaccharoitY.cas caravielas törzsek transzformációia

GFR18 (DSM 3665 ;Ó«, ^3-11, hJj.3-15, leu2-3.

ÍUJ2-112, can^R) éa HT246 (a, leu2-3. Ieu2-112. prb) (DSM

4084) Saccharomyces cerevlala· törzseket az alábbi plazoldokkal transzformáljuk

p3DB207/GAPFL-HIR	(Asp 63)
p3DB207/GAPFL-HIR	(Glu 63)
P3DB207/GAPF L-HIR	(Pro 66)
o Hinnen és mts-a	iProc. Natl. Acad. Sci. USA 75. 1929

(1978)] által leírt transzformációval· A transzéormált élesz tőssjtek minimális élesztőt tartslmszó lsmszhlányos közegben leuclnban választjuk el.

Egyszer transzformált élosztőtelepek·t Izolálunk é» az alábbiak szerint jelöljük:

dccharomve·· cs r·vlslas GRF18/p3DB207/GAPFL-HIR (Asp 63), saccha.romvcaa cersvlslae

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae

GRF18/p3DB207/GAPFL-HI R

GRF18/p3DB207/GAPFL-HIR

HT246/pDDB207/GAPFL-HXR (Glu 63), (Pro 66) (Asp

63),

HT246/p3DB207/GAPF L-HIR (Glu

HT246/p3DB207/GAPF L-HIR (Pro

63),

66).

— 49 A deozulfatohlrudln mutánsok feltárása S.

cerevlslae törzsekből

a. ) ^A transzforwánsok tenyésztáss

A GRF18 és HT246 trsnszformáns törzseket (11. példa) kétszer előtenyésztjük 10 ml élesztős minimál tápközegben (Oifco Yeaet Nitrogén alap, aminooav nélkül, 2 % glukóz, 10 mg/1 L-aszparagln és 10 mg/1 L-hisztidin hozzáadásával) 28°C-on és 3 χ 10⁷ sejt/al sejtsűrűségűre szaporítjuk. Ezeket a sejteket azután 50 ml-eo teljes közegbe oltjuk. A teljes közeg Összetételei 10 g/1 Dlfco Yeaet Extráét, 5,0 g/1 Bacto-Pepton, 20 g/1 glukóz, 40 g/1 D(«·) szacharóz, 3,0 g/1 (NH₄)₂S0₄, 2,0 g/1 KH₂P0₄, 0,5 g/1 MgS0₄, 0,1 g/1 NaCl ás 0,1 g/1 CaCl₂ x M 2H₂0. A kultúrákat beoltjuk a teljes tápközegbe és 4 χ 10⁶ sejt/al sejttűrŐségŐre szaporítjuk ás 28°C-on 48 órán át 250 fordulat/pere sebességgel kevertétjük.

b. ) A deezulfatohirudin mutánsok izolálása a tápközeoből

A fermentáció és oentrifugálás (1000 x g, 30 pero) után a sejteknek a felűluezóból való kinyerése céljából a tápközeget (1 1) feldolgozzuk. A felűluszóhoz 5 térfogat százalékos acotonltrilt adunk éa a keletkező oldatot C 18 RP-HPLC tipusu ozeai-preparativ kolonnára viszszűk 24 ml/perc sebességgel. A kolonnát 90 % A aosópuffőrből és 10 % B mosópuffőrből álló eleggyel mossuk 10 percig, eig a gradiens elindul (1. ez, feltételek).

A gradiens 30 ée 65 percek közötti frakcióit öszszegyűjtjűk. Azt a frakciót liofllizáljuk, amely a kivént hirudln mutánet tartalmazza, s amelyet írombin inhiblcióe vize gáláttál (Grlessbach, U. és mte-a, Thromb, Rés. 24. 221-224 (1984)], FPLC analízissel (2. sz. feltételek) és HPLC analitikai módszerrel (3. sz. feltételek) azonosítottunk.

A keletkező szilárd anyagot vízben oldjuk ée szűrjük (0,2/im), mielőtt szemi-preparativ FPLC alkalmazásával szétválasztjuk Mono-Q tipusu nagyteljesítményű amlnocserélőn pH-gradienssel eluálva (2. sz. feltételek). A protein többségét tartalmazó frakciókat összegyűjtjük ée egyetlen frakcióként vízből kétszer liofilizáljuk.

Az utolsó tisztitási és sónentesitési lépésben a liofilizált anyagot vízben oldhatóvá tesszük. Cl8 RP-HPLC tipusu szemi-preparativ kolonnára injektáljuk ée eluáljuk (1. ez. feltételek).

A tiszta deazulfátohirudin mutánst összegyűjtjük, liofilizáljuk, igy fehér szilárd terméket kapunk.

·

1. Számú kísérleti körülmények

Módszer:

Oszlop típusa:

Részecske méret:

Méretek:

Minta térfogata:

Protein bevitel / injekció:

Nyomás:

Detektálás:

A eluens:

B eluens:

Szemi-preparativ reverzfáziau nagynyomású folyadék kromatográfia (RP-HPLC) gradiens elucióval.

LiChrosorb RP-18 (E. MERK, Darmatadt, NSzK) /is x 250 mm

1000 ml

5-50 mg

100-120 bar

215 nm-nél viz (Analyzed HPLC Reagant, BAKER Cheeicals, Devontar, (Hollandia) 0,1 térfogati t rifluor-ecetsavval (TFA) acetonitril (HPLC-hez, Fluka Chemie AG, Buchs, Svájc)

0,07 térfogat% trifluor-ecetsavval

Eluciós körülményekι Idő

(porc)
0	10
io	10
20	18
30	18
45	35
65	35
66	100
70	100
75	10

b. MrMatora

Módszer:

Oszlop típusa:

Méntok:

Minta térfogata:

Protein bevitol/lnjokoló:

Nagysebességű protein folyadék kromatográfla (FPLC) ioncserélő kromatogréflét alkalmaz nagyteljesítményű állandó fázisú anlonceorélőn ρΗ-gradiens oluclóval Mono Q (Pharmacia, Uppaala, Svédország) x 50 mm ml (szeml-preparatÍv) 200/jI (analitikai)

2-3 mg (fél-preparativ)

500-600 /ug/ml

25-200/ug (analitikai)

125-100 Atg/ml

Folyadék sebességi	2,0 ml/pero
Nyesést	30-35 bar
Detektálás:	280 na-nél
A oluensi	50 mM HC00NH4 pH » 4,5
B eluene:	50 mM HC00NH4 pH · 3,5
Elucióe körülményekι	idő (perc) B (térf.%) 0 0 5,0 0 19,5 100 22,0 100 22,1 0 25,0 0

3. SsÁ»». K^,érKotl.karüJff.én.Y.eX:

Módezer:	Analitikai rever-fázlsu nagynyomású folyadék krosatogréfia (RP-HPLC) gradiens tinóiéval.
Oszlop tipusax	Nucleosil 100-5 (Macherey-Nagel, Düren, NSzK)
Részecske aéret:	5 yua
Méretek:	4 x 120 mm
Minta térfogata:	50 /ül
Protein bevitsl/lnja^cf6:	2,5 - 10yug (50-200/ig/ml)
Folyadék sebesség:	1,5 ml/psrc
Nyomás:	120-150 bar
Detektálás:	215 nm-en

* 54 -

A eluenst	viz (Anelyzed HPLC Reagant, Saker Chemicale, Ooventer, Hollandia) 0,1 térfegát% trifluor-ecetsavval (TFA)
B eluensι	acetonitril (HPLC-he, Fluka Chemie AG, Buche, Svájc) 0,07 térfogat % trifluor-ecetsavval.

Eluciós körülmények: idő (perc) B (térf.%)

010

120

820

1831

2095

21,6100

2310

13. példa jaUmfías

A rekoeblndne deszulfatohirudin (cpd. 1), iPra®®!· -deszulfatohirudin (cpd. 2) és (Glu ⁶³]-deszulfatohirudin mintákat trombin inhibiciós tesztnek (kroeogén szubeztrétként Chroeozyae-TH alkalmazásával; Griessbach, U. éa mts-a, Thromb. Rés. 24, 221-224 (1984), valamint egy vagy több

- 55 analitikai Módszernek (ld. kísérleti körülményeket a 12. példában) vetjük alá. Az eredményeket összehasonlítás céljából az alábbi táblázat tartalmazza*

Kísérleti körülmények Retenciós idő (perc) száma ....... > —— ......................

cpd. 1 cpd. 2 cpd. 3

2. FPLC	16,0	14,7	17,5
3. RP-HPLC	15,6	16,4	10,7
·»ΒΒ···ΒΒ>·α·ΜΗΒ···Κ·> t rombin		·Μ·8ΒΜ···«αη·Μ	ΒΒΒΒΒΒΒΒΙΜΒΒΜΜΒ
inhibició (%)	100	60	35

a.) Az aminosav összetétel meghatározása

Közelítőleg 2,5/ig tiszta deszulfatohirudlnt

110 C°-on 6 N aósav gőzével hidrollzálunk és Knecht és Chang lAnal. Chem. 58. 2375 (1886)] módszere szerint analizáljuk.

A hidrolizátumok az alábbi összetételnek felelnek megj [Pro⁶⁶]-deszulfatohlrudin

Asx	8,95	(9)	Ile	2,1	(2)
Glx	12,77	(13)	Leu	4,49	(4)
Ser	4,14	(4)	Phe	1,23	(D
Thr	4,20	(4)	Lys	3,31	(3)
Gly	9,11	(9)	Hls	1,09	(1)
Pro	4,46	(4)	Tyr	2,29	(2)
val	2,44	(4)	Cys	4,7	(6)

Összes (66) • ·· · ·

- 56 Az analízis aegfslsl s rekombináns dsszulfato* hirudinnek (Groeeenbacher, H. és mte*a, Thromb. Re·· Suppl. 7, 33 (1987)1 agy prolin gyök kivételével.

[Glu⁶³] -deszulfat oh irud in

Asx	8,79	(9)	Ile	1,95	(a)
Glx	13,31	(14)	Leu	4,26	(4)
Ser	3,86	(4)	Phe	1,17	(1)
Thr	4,19	(4)	Lys	3,36	(3)
Gly	8,42	(9)	His	1,32	(1)
Pro	3,11	(3)	Tyr	1.29	(1)
Val	2,73	(4)	Cys	5,82	(6)
			Összes		(65)

Az analízis megfelel a rekombináns deszulfstohirudinnek azzal a különbséggel, hogy egy plusz glutaaát gyököt tartalmaz, ugyanakkor egy tirozin gyök hiányzik az összetételből.

Az N-terminalis aminosav szekvencia meghatározása céljából a tiszta deszulfátohirudin mutánst automata rendszeren hagyományos Edman degragációnak vetjük alá és az N-terminalis feniltiohidantoin aminosavakat reverz-fázisú HPLC alkalmazásával szétválasztjuk.

* 57 Aminosav

Aminosav

Eredményekt

Val-Val-Tyr-Thr-Asp-n.d.-Thr-Glu-Ser-Gly 1115

Gln-Asn-Leu-n. d.-Leu-n.d.

lGlu⁶³l-deezulfatohlrudin

I 510

Aminosav Val-Val-Tyr-Thr-Asp-n.d.-Thr-Glu-Ser-Gly

II15

Aminosav Gln-Aen-Leu-n.d.-Leu-n.d.

n.d. - nem meghatározott

A dsszulfatohirudin mutánsok N-terminális aminosav szekvenciái, mint látható, a valódi deezulfatohirudin N-terminális aminosav szekvenciáival azonosak.

c.) C-Terminél analízis

A tiszta deszulfatohirudin mutánsokat karboxipeptidáz Y enzimmel szobahőfokon digeráljuk. A feltárt Minosavakat 0ABS-C1 származékaik aminosav analízisével határozzuk meg.

[Chang, Y.I. és mts-a, Biochem. □. 203. 803-806 (1982)].

Eredmények:

βΑ (Pro 1-deezulfatohirudin

C-terminálie aminosavak:

— Glu-lle-Pro-Glu-Glu- (Tyr-Leu-Gln-ProJ • · . 58 tGlu^MI-d«»zulf«tohlrudln

C-termtnálle amlnoeavak :

— Glu-Glu-tlle-Pro]-Glu-Glu-Glu-ÍLau-Glnl

A zárójelben lévő aminosav szekvenciák pontos sorrendjét nem lehetett meghatározni·

Nagysebességű atomokkal bombázott pozitív ion tömegspektrometriás meghatározás (FAB-MS). Készülék: ZAB-HF tömegspektrométer (VG-Analytlcal Ltd., Manchester); mátrix; tioglicerol; xenon bombázás; ion energia 10 KoV· Sí^áffiőnygkj.

..lElXjffj o^ruclin.

öeezegképlet: C_2Q2 «_44? Νθθ s₆ molekulasúly (szám.): 7060, 64 molekulasúly (talált): 7064, 2

Meghatározás Cf plazma deszorpbiós spektromét r iá val (*^²CfPD TOF-MS) (Sungquiet, B. és Maefarltne, R. D. (1985) Mass Spektrom, Rév. 4, 421). Készülék: Bio-Ion (Nordic AG, Uppsala, Svédország); mátrix: viz; gyorsító potenciál 10 KeV.

tera^S6l-doszulfatohirudln összegképlet 5 ^292 ^447 ^80 θ111 molekulasúly (szám·)} 7060, 64 molekulasúly (talált): 7060, 7 (Glu 1-deszulfatohlrudln

e..z.gk«pi.t: c₂₈₃ H₄₃₈ n₈₀ O_1V S₆ molekulasúly (szám.): 6929, 46 molekulasúly (talált): 6929, 8

A 3-9. példában leirt deszulfátohirudln mutánsokat hasonló módon jellemezzük.

14. Példa

Kinetikai 1ellenzés

A. A trombln előállítása és jellemzése:

A trorabint S.R. Stone ée 3. Hofeteenge (Biochemistry 25. 4622-4628 (1986)] módszerével tisztítjuk és jellemezzük. Az aktív trombln koncentrációt 4-metil-umbelliferil-p.quanidino-benzoáttal történő titrálássml határozzuk meg (Oameson, G.w., Roborte, D.V., Adamm, R. W., Kyle, W. S. A. és Elmore, 0. T., Biochem. 3. 131. 101-117 (1983)1.

B. Enzimelemzésι

A peptidil-p-nitro-anilid szubsztrátok trombinnal végzett hidrolízise során keletkező p-nitro-anilin feltárását a 405 nm-nél bekövetkező elnyelésnövekedés mérése követi. A mérést Shimadzu UV 240 tipusu spekrofotóméterről végezzük. Az elemzés polisztírói kűvettékban 37°C-on 0,05 M Tris-HCl pufferelegyben (pH 7,8) történik. A puffér .0,1 % polietilénglikol 6000-et, 0,1 M NaCl-ot és p-nitro-anilid szubsztrátot tartalmaz.

A D-Val-Leu-Arg«p-nitro-anilid szubsztrátot (S-2266; Kabi Vitrum) 300 yuM koncentrációban alkalmazzuk a szovos kötésű titrélási kísérletekhez, amelyek során a mutáns hlrudinsk koncentrációját határozzuk meg. Ilyen elemzés során a trombint 1,0 nM koncentrációban használjuk. A o-Phe-pipecolyl-Arg-p-nitro-anilid szubsztrátot (S-2238; Kabi Vitrum) 100 yuM éa a trombint 20-50 pH koncentrációban alkalmazzuk a lassított kötésű inhibiciós kísérletekben a mutáns hlrudinsk kinetikai jellemzőinek meghatározása céljából (ld. alább).

Az elemzéseket a troabln adagolásával kezdjük. A képződő termék mennyiségét a p-nitro-anilin 405 nm-nél vett 9,920 m“¹ cm^ értékű abszorpciós koefficiensének segítségével számítjuk ki, a szubsztrát koncentrációját

-1 -1 pedig e 342 nm-nél spektrofotometriásán mért 8,270 M ’cm értékű abszorpciós koefficiens alkalmazásával határozzuk meg. (Lottenberg, R. Oaokson C. M., Biochim. Biophya.

Acta 742. 558-564 (1983)].

• · · · • · ·· · · · · · • · »·· ·· · ··

C. Kinetikai elmélet ás adatanalízis

Szoros-kötésű t itrálás ι Az enzim gátlását a szubeztrát jelenlétében e következő mechanizmus segítségével ábrázolhatjuk (1. mechanlzausvázlat)j

E ♦ S ^Kw —- ES-----—E ♦ P

kg

El

1, mechanlzauevázlat

Az inhibitor disszociációja (Kj) megegyezik • kg/kj értékével. Ha az inhibitor enzimhez való kötődése a szabad inhibitor koncentrációjának jelentős csökkenését okozza, az állandó állapotban vett sebesség (Ve) értékének változása, amely a teljes inhibitor koncentrációval (I*) áll Összefüggésben, az (1) egyenlettel Írható le. iMorrieon, H.F., Biochla. Biophys. Acta 185. 269-286 (1969);

Hendarson, P.3. F., Biochem. □. 127. 321-333 (1972111

v. - » í.qr((K_If * x_t-e_t)² *4 1^, Ep-ÍKj. * (1) ahol Vo az inhibitor jelenléte nélkül mért sebesség, E₍ a teljes enzimkoncentráció, Kj, a látszólagos inhibiciós állandó. Ha az inhibitor és a szubeztrát versenyeznek az aktív helyekért, a Kj, az inhibitor disszociációs állandójára • · ·

- 62 (Kj) van vonatkoztatva a (2) egyenlet szerinti

Kj, - K_x (1 - S/K*) (2) ahol S a szubsztrát koncentrációt, K_g pedig a szubsztrát Michaslis állandóját jelenti· Ha az enzie vagy az inhibitor koncentrációja nem pontoean ionért, akkor egy kiegészítő faktort viszünk be az (1) egyenletbe. ÍWllllame, □. W. éa Morrison, O.F., Methoda Enzymol. 63, 437-467 (1979)1. A hirudin által okozott tronbin inhibicióhoz a trombin koncentrációja az aktív részek titráláeával meghatározható, a hirudin koncentrációja azonban csak méréssel és az adatok (3) egyenlet ezerinti analízisével:

Ve- leqríCKj, ♦ xI_x«E_t)² ♦ 4 Kj.EtJ-CKj,^ - E_t)l (3) ahol Χ_χ az inhibitor koncentrációja suly/térfogat egységben és x egy olyan faktor, amelllyel Ι_χ értékét azorozzuk, igy az inhibitor moláris koncentrációját kapjuk meg.

A szoros-kötésű titráláei kieérletekben a hirudin koncentrációja éa a hirudin disszociációé állandója a trombin koncentráció állandó értéken való tartásával éa a hirudin koncentráció olyan érték fölötti változtatásával határozható meg, amely néhány esetben magosabb, néhány esetben alacsonyabb, mint a trombin koncentrációja. Az adatok száma általában 7 és 10 között van. A stacionárius állapotban vett sebesség értékek, amelyek a hirudin koncentrációkhoz tartoznak a (3) egyenlet alapján nemlineáris • · * 63 regresszióval meghatározhatók, A regresszióhoz a V* értókeket a reciprok értékeihez súlyozzuk, A súlyozásnak ezt a típusát találták empirikusan legmegfelelőbbnek, amely alapján a legjobb eredmények kaphatók, [Stone, S.R, és Hofsteenge, Biochamistry 2£, 4622-4628 (1886)].

Lassú, szoros-kötéeü inhibiciót Ha az inhibitor és enzim közötti kölcsönhatás sebessége lassú, a gátolt stacionárius állapothoz tartozó sebesség csak lassan áll be, a termékképződés folyamatát az 1, aachanizausvézlat mutatja, éa a (4) egyenlet írja le ÍCha, 8«, Biochem. Pharmacol, 25. 2695-2702 (1976)/ Williáras, I.W., Morrison, 3.F., és Duggleby, R.G., Biochemistry 2567-2573 (1979)]ι

P - v..f loc .l-.-PÍ-fc-.t) • dk· ' 1-d ) ahol P a t idő alatt képződő termék s sin mennyisége, d az 6*, l_t ée Κ_χ, függvénye és k* ezeknek a paramétereknek a függvénye, és k^ az inhibitor és enzim közötti kölcsönhatóé másodrendű asszociációs sebességi állandója (Cha ás ate-a, Id, előbb), A hirudin mutánsok kinetikai paramétereinek meghatározása céljából a folyamatábra kapott adatait legalább hat különböző hirudin koncentrációnál a (4) egyenletbe helyezzük nemlineáris regresszióval. Ez az analízis eredményezi a Kj, k^, értékeket és a kg disszociációé ee* beeségi állandót. Korábban kimutatták, hogy a k^, független a • β · * · • · ·♦ ··· » » • · ♦ · · · · • · ♦·· ·« · ·· szubsztráthoz az aktív halyen való kötődéstöl, de a kg, ét Kj, értékeit osztani kell (1+(SJ/K^J-vsl, hogy a valódi értékeket kapjuk meg lk₂ és Κ_χ; S.R. stone és □. Hofsteenge, Biochemistrv 25. 4622-4628 (1986); Stone, S.R., Braun, P.3. és Hofsteenge, □·, Biochemistrv 26. 4617-4624 (1987)]. Ehhez a számításhoz D-Phe-pipekolil-Arg-p-nitro-anilid K_ értéM két korábban 3,6yuM-ban határozták meg és alkalmazták (Hofsteenge, , Taguchi, H·, és Stone, S.R,, Biochem. □. 2^7, 243-251 (1906)].

Ezeket a kinetikai módszereket alkalmazva, és értékeit a következő táblázat tartalmazza:

a deszulfatohirudin (»H)	-1 -1	KT
formája
	M \s 1	(pM)
rekombináns deszulfatohirudin	1,37 ♦ 0,03	0,231	♦	0,006
lGln61'62]-H	0,45 + 0,01	0,907	♦	0,042
ÍAla53]-H	n.d.	0,810	+	0,160
(Pro66]-H	1,09 + 0,13	0,252	♦	0,013

n.d. » nem meghatározott • » • · • ·· « ······ • · · · · ·· ··· · 9·

- 65 1^·

Deszulfatohirudin mutánst tartalmazó gyógyszerkészítmény parenterális adagolásra

Az előző példák bármelyike szerinti deezulfatohirudin mutánst tartalmazó oldatot 0,9 %-os NaCl oldattal dializáljuk. Az oldat koncentrációját azután hígítással 0,2 mg/ml vagy 2 mg/ml-re állítjuk ugyanazzal a NaCl oldattal. Az igy kapott oldatokat aztán ultraszüréesel sterilizáljuk (0,22/jm pórusu membránon).

A sterilizált oldatok közvetlenül felhasználhatók pl. intravénás adagolásra.

A mikroorganizmusok deponálása

Az alábbi mikroorganizmusokat helyezték el a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (OSM), Mascherorder Weg 16, 0-3300 Braunschwelg (NSzK) mikroorganizmus letét ideje katalógus szám

Saccharomyces cerevisiae GRF18 1986. 03. 04. OSM 3665 Saccharomyces cerevisiae HT246 1987. 04. 15. DSM 4084

Claims (9)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás (I) áltolénos képletű amlnosav-szekvenciáju deszulfátohirudin mutánsok áe sóik előállítására 10

   H-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cy»-Thr-Glu-eer-Gly *0 In-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-sor-Asn30 -Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lya-Cys-Ile-Leu40

   -Gly-Sor«Aep-Gly-Glu-Lyo-Aen-Gln-Cyo-Val50 -Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Sar60 •His*Aon-Y^*Gly-Aap-Pho»Yg*Yj-Ile*Pro·

   -Y₄-Y₉-Y₆*Leu-Y₇-OH (X) ahol Y^ jelentése Asp vagy egy OMlogeo, genetikusán kódolt aalnoMvgyök, Y₂ és Y₉ ogyaáetól függőtlanöl Glu, Asn vagy lipofil, genetikusán kódolt aainoeavgyök, Y₄ éo Y₉ egyaéotói függetlenül Glu vagy ogy ooalogoe» genetikusán kódolt aninOMvgyök, Y$ Tyr vagy egy savas, genetikusán kódolt aninosavgyök ée Y₇ jelentése Gin vagy Gin Pro dipoptidil gyök, azoknak az (I) általános képletű vegyületeknok a kivételével, Melyekben Y^ jelentése Asp, Y₆ jelentése Tyr, Y₇ Gin éo a nácik Gin, azzal jellenezve, hogy * 67 — mikrobiológiai törzatenyészetet alyan tenyésztőogyeéget tartalmazó hibrid vaktorral alakítunk ót, amely agyéig a jolzőpoptidet kódoló első DNS-exskvonclához kapcsolódó pronotérből óll, a jelzőpeptid szarkazatlaolvaaókónt agy második DNS-szskvsnciához kapcsolódik, utóbbi DNS-azekvoncia s dsszulfatohirudin mutánst kódolja óa tartalmazza az átvivő terminális jsiskát, az eljárás következő lópósekónt a deezulfatohirudln muténat izoláljuk és kívánt esetben a keletkezett szabad karboxil- óe/vagy aminoceoportot tartalmazó pelipeptidot sóvó vagy egy kapott sót szabad vegyfilottó alakítjuk.

   8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan deszulfatohirudin mutánsokat és sóikat állítjuk alő, amelyek (X) általános képletében Y| jelentéee Asp, Alá, Leu vagy Asn, Y₂ ée Y_g egyaáetól főggetlenől Glu, Gin, Aen vagy Leu, Y_g Tyr, Asp vegy Glu óe Y₇ Gin vagy Gin Pro dlpeptidil gyököt jelont, azoknak az (X) általánoe képlet ö vogyöletoknek e kivételével, amelyekben Y^ jelentése Aap, Yg jelentéee Tyr, Y₇ Gin, Y_# ós Yj Gin és ez Y₄ ée Y₉ gyökök valamelyike Gin óe a másik Glu.
2. 3. Az % igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy toln⁶^^,ö2)-deeaulfatohirldunt állítunk elő.
3. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lLsu⁶^^,62]-deszulfatohirudint állítunk elő.

   ·· sose • · • ··· ··· • · · • ess se * 68

   δ. Az 1. igénypont szerinti eljéráó, azzal jolloszvs, hogy ÍAsn⁶^'^l-dsszulfatohirudint állítunk old·
4. 6. Az 1. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy iLou^'^'^'^jrdoszulfatohlrudlnt állítunk old·
5. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (Aon⁵⁷*^S8*^^,62]-doszulfatohlrudlnt állítunk old.
6. 8· Az 1. Igénypont szerinti eljárás, azzal jollomezve, hogy (Alá l-deszulfatohirudint állítunk old.
7. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jelloaszva, hogy (Asp^ÖS]-dsszulfatohlrudlnt állítunk old.
8. 10. Az 1« igénypont szerinti eljárás, azzál jelleúszva, hogy (Glu *J-doozulfatohlrudlnt állítunk old, ti. Az 1. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (Pro^l-doszulfatohlrudlnt állítunk old,
9. 12. Eljárás gyógyszerkészítmény oldállltáeára, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással eldállltható (X) általános képlete deezulfatohirudin mutánst vagy gyógyszerészetlleg alkalmas sóját gyógyszerészetileg alkalmas hordozóval Ós/vpgy segédanyaggal óeszekeverjOk.