KR100414490B1 - 이소시트레이트리아제활성이변성된미생물에의한리보플라빈의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물에 의한 리보플라빈 제조 방법을 개시한다. 배양용 배지에 리보플라빈 생산 미생물을 배양하고 이어서 상기와 같이 생산된 리보플라빈을 단리시킨다. 상기 방법의 특징은 사용하는 미생물의 내생적인 이소시트레이트 리아제 (ICL) 활성을 변성시켰다는 것이다.

Description

이소시트레이트 리아제 활성이 변성된 미생물에 의한 리보플라빈의 제조 방법

본 발명은 이소시트레이트 리아제 활성을 변성시킨 미생물을 사용하는 리보플라빈의 제조 방법에 관한 것이다.

리보플라빈이라고도 불리는 비타민 B₂는 사람 및 동물에 필수적이다. 비타민 B₂가 부족하면 입 점막 및 인후 점막의 염증, 입 모서리에서의 균열, 피부 주름에서의 가려움증과 염증 및 유사한 피부 손상, 결막염, 시력 감소 및 각막 흐림으로 귀결된다. 유아 및 소아에서 성장 정지 및 체중 감소가 일어날 수 있다. 따라서 비타민 B₂는 비타민 결핍증에 사용하기 위한 비타민 제제로서 그리고 사료 첨가제로서 경제적으로 특히 중요하다. 또한, 비타민 B₂는 예를 들어 마요네즈, 아이스크림, 블라만지 (blancmange)와 같은 디저트에서 식품용 염료로 또한 사용된다.

리보플라빈은 화학적인 방법 또는 미생물에 의한 방법 중 어느 하나로 제조된다. 화학적 제조 방법에서는, 일반적으로 다단계 공정으로 순수한 최종 생성물로서의 리보플라빈을 수득하지만, D-리보스와 같은 비교적 값비싼 출발 물질을 사용할 필요가 있다.

미생물을 사용하는 리보플라빈의 제법은 이 화합물을 화학적으로 제조하는 것에 대한 별법으로서 제공된다. 미생물에 의한 합성용 출발 화합물로 식물성유와같은 재생가능한 원료를 사용할 수 있다.

아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii) 또는 에레모테시움 아쉬비이(Eremothecium ashbyii)와 같은 진균류를 발효시킴으로써 리보플라빈을 제조하는 것이 문헌 [The Merck Index, Windholz 등, eds. Merck & Co., 1183 페이지, 1983]에 공개되어 있지만, 칸디다 (Candida) 또는 사카로마이세스 (Saccharomyces)와 같은 효모 및 클로스트리듐 (Clostridium)과 같은 세균류가 리보플라빈 생산에 또한 적당하다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 리보플라빈 생합성 유전자로 세균 균주를 형질변환시킴으로써 리보플라빈을 과생산하는 균주가 수득되었음이 유럽 특허 출원 제405370호 문서에 기술되어 있다. 그러나, 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii)와 같은 진핵 생물을 사용하는 재조합 리보플라빈 제조 방법에 있어서는 이들 원핵 생물 유전자는 적당하지 않다.

진핵 생물 유기체인 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) 리보플라빈 생합성 특이 유전자 클로닝이 국제 특허 출원 공개 제WO 93/03183호에 기술되어 있다. 상기 유전자를 사용하여 효율적인 리보플라빈 생산을 가능하게 하는 진핵 생물 재조합 미생물을 작제할 수 있다.

그러나, 종종 미생물에는 리보플라빈 생합성 효소의 출발 물질 및 기질이 단지 한정된 양으로 존재하기 때문에, 리보플라빈 생합성 활성을 증가시킨다 해도 리보플라빈 생산은 증가하지 않는다.

따라서 본 발명의 목적은 기질 한정이 없거나 또는 단지 비교적 약간의 기질한정만이 있으며, 따라서 증가된 비율로 리보플라빈이 생산될 수 있게 하는 미생물을 사용하는, 미생물에 의한 개선된 리보플라빈 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 사용되는 미생물의 내생적인 이소시트레이트 리아제 활성을 변성시킴으로써 본 발명에 따른 상기 목적이 성취됨을 알아내었다. 변성시키지 않은 출발 균주와 관련하여 변성율을 측정할 수 있다. 변성된 ICL 활성을 갖는 그와 같은 미생물을 수득하기 위한 많은 선택권이 있다.

한 가지 선택권은 출발 효소와 관련하여 ICL 활성이 증가된 효소를 코딩하는 방식으로 내생적인 ICL 유전자를 변성시키는 것이다. 예를 들어, 촉매 중심을 변성시킴으로써 기질 턴오버 (turnover)를 증가시키거나, 또는 효소 억제제의 효과를 없앰으로써 효소 활성을 증가시킬 수 있다. 또한, 예를 들어 유전자를 증폭시키거나 또는 효소 생합성을 억제하는 인자를 제거하여 효소 합성을 증가시킴으로써 효소 활성을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는 내생적인 ICL 유전자를 돌연변이시킴으로써 내생적인 ICL 활성을 증가시킨다. UV 조사 또는 돌연변이를 유도하는 화학 약품을 사용하는 것과 같은 표준 방법을 사용한 무작위 방식, 또는 삭제, 삽입 또는 치환과 같은 유전공학적 방법을 사용하는 특이적 방식 중 어느 하나로 상기와 같은 돌연변이를 일으킬 수 있다.

ICL 유전자의 카피수를 증가시키고(증가시키거나) ICL 유전자 발현에 양성 효과를 갖는 조절 인자를 강화시키면 ICL 유전자의 발현이 증가된다. 따라서, 바람직하게는 프로모터 및 인핸서와 같은 강력한 전사 신호를 사용하여 전사 수준에서 조절 요소를 강화시킬 수 있다. 그러나, 또한 예를 들어, mRNA의 안정성을 향상시킴으로써 번역을 또한 강화시킬 수도 있다. 바람직하게는 ICL 유전자에 할당된 유전자 조절 서열, 특히 유전자 발현을 강화시키는 유전자 조절 서열을 포함하는 유전자 작제물 또는 벡터 내로 ICL 유전자를 삽입시켜 유전자 카피수를 증가시킨다. 이어서 ICL 유전자를 포함하는 유전자 작제물로 리보플라빈 생산 미생물을 형질변환시킨다.

바람직하게는 ICL 유전자를 미생물, 특히 진균류인 아쉬비아 고씨피이(Ashbya gossypii)로부터 단리시킨다. 그러나, 글리옥실레이트 사이클의 보전 순서를 갖는, 따라서 이소시트레이트 리아제를 갖는 다른 모든 유기체 세포 및 식물 세포가 ICL 유전자를 단리시키는 데 또한 적당하다. ICL 유전자에 결함이 있는 돌연변이체를 동종 또는 이종 컴플리멘테이션시킴으로써, 또는 이종 프로브함으로써, 또는 이종 프라이머를 사용하는 PCR로 ICL 유전자를 단리시킬 수 있다. 이어서 컴플리멘팅 플라스미드의 인서트를 제한 효소로 적당히 절단함으로써 그 크기를 최소로 감소시켜 서브클로닝할 수 있다. 추정 유전자를 서열 결정하고 동정한 후, 융합 PCR 방법으로 정확하게 피팅시키는 방식으로 서브클로닝한다. 그 결과물인 프래그먼트를 인서트로서 갖는 플라스미드를 ICL 유전자 결함 돌연변이체 내로 도입하고, 이어서 ICL 유전자의 작용 능력을 시험한다. 최종적으로, 기능성 작제물을 사용하여 리보플라빈 생산자를 형질변환시킨다.

서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 대립유전자 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 이소시트레이트 리아제 유전자를 단리시키고 서열 결정한 후 수득할 수 있다. 특히, 대립유전자 변이체는 뉴클레오티드를 삭제,삽입 또는 치환시킴에도 불구하고 ICL 활성을 보유하는, 서열 번호 1에 나타낸 서열로부터 수득가능한 기능성 유도체를 포함한다.

특히 서열 번호 1의 176 내지 550번째 뉴클레오티드의 서열 또는 본질적으로 동일한 효과를 갖는 DNA 서열을 갖는 프로모터를 이소시트레이트 리아제 유전자의 상향에 위치하게 한다. 따라서, 이소시트레이트 리아제 유전자의 상향에 위치하는 프로모터는 예를 들어 프로모터의 작용력 또는 유효성이 손상되어 있지 않지만 하나 이상의 뉴클레오티드 교환, 또는 삽입(들) 및(또는) 삭제(들)에 의해 부여된 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터와는 상이할 수 있다. 또한, 프로모터를 그 서열을 변성시킴으로써 유효성을 증가시킬 수 있거나, 또는 더 효과적인 프로모터로 완전히 대체시킬 수 있다.

또한, 특히 ICL 유전자 활성을 증가시키는 조절 유전자 서열 또는 조절 유전자를 ICL 유전자에 할당할 수 있다. 따라서, RNA 폴리머라제와 DNA 사이의 상호작용을 향상시킴으로써 ICL 유전자의 발현을 증가시키는 인핸서를 ICL 유전자에 할당할 수 있다.

상향에 프로모터가 존재하거나 또는 존재하지 않고(않거나) 조절 유전자가 존재하거나 또는 존재하지 않는 이소시트레이트 리아제 유전자의 상향 및(또는) 하향에 하나 이상의 DNA 서열이 위치하게 하여 이소시트레이트 리아제 유전자가 유전자 구조에 포함되게 할 수 있다.

ICL 유전자를 클로닝함으로써 상기에서 이미 기술하였듯이 리보플라빈 생산자를 형질변환시키기에 적당한, ICL 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터를 수득할 수 있다. 형질변환시킴으로써 수득될 수 있는, 바람직하게는 형질변환된 아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii) 세포는 복제가능한 형태의 유전자, 즉 염색체 및(또는) 플라스미드 또는 벡터 상에 동종 조환으로 게놈의 모든 원하는 위치에 유전자 추가 카피가 삽입된 형태의 유전자를 갖는다.

변성된 ICL 활성을 갖는 미생물을 만드는 다른 방법은 ICL에 대해 억제 효과를 갖는 물질에 내성을 나타내는 미생물을 만들고 이 미생물을 선발하는 것이다. 이소시트레이트 리아제 (ICL)의 억제제는 숙련자들에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Handbook of Enzyme Inhibitors, 편집자: Hellmut Zollner, Verlag Chemie, Weinheim, 1993]의 291페이지에 기술되어 있다. 특히 적당한 억제제는 포스포엔을 피루베이트 (PEP), 6-P-글루코네이트 및 말레에이트와, 특히 이타코네이트 및 옥살레이트이다.

이어서 상기 억제제의 존재하에 리보플라빈 생산 미생물 균주를 배양하면, 놀랍게도 리보플라빈 형성이 억제됨이 밝혀졌다. 배양 플레이트상에서 황색으로 되지 않고 대신 백색으로 남아있는 콜로니의 형성이 이를 뒷받침한다. 따라서, 이 시스템을 사용하는 경우 이소시트레이트 리아제 억제에 대해 내성이 있는 균주는 이들 균주가 심지어 억제제의 존재하에서도 리보플라빈을 생산하고 따라서 황색 콜로니를 형성하기 때문에 쉽게 인지될 수 있다. 이와 같은 성질의 균주는 자발적인 돌연변이에 의해 생겨날 수 있거나 또는 화학적 방법 또는 UV 조사와 같은 통상적인 방법을 사용하여 적당한 돌연변이를 유도함으로써 만들어질 수 있다. 상기와 같은 방법으로 증가된 양의 리보플라빈을 배양 배지 내로 분비하는 미생물 균주를 수득할 수 있다. 특히 수득된, 리보플라빈 형성이 증가된 내성 균주는 제 10067번 하에 DSM (독일 미생물 콜렉션)에 기탁된 아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii) 균주였다.

신규한 방법에서 바람직하게는 진균류를 미생물로서 사용한다. 적당한 진균류의 예는 문헌 [Indian Chem Engr. Section B. Vol. 37, Nos. 1, 2 (1995)] 15페이지의 표 6에 기술되어 있다.

피키아 (Pichia)속, 에레모테시움 (Eremothetium)속 및 아쉬비아 (Ashbya)속, 특히 아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii)가 특히 적당하다.

그러나, 진균류 외의 미생물, 예를 들어 세균류, 특히 문헌 [Indian Chem Engr. Section B. Vol. 37, Nos. 1, 2 (1995)] 15페이지의 표 6에 기술되어 있는 세균류를 또한 사용할 수 있다.

실시예 1. 아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii) 게놈 라이브러리의 작제

문헌 [Gene 109: 99-105, 1991]의 라이트 (Wright) 및 필립센 (Philippsen) 방법을 사용하여 게놈 DNA 라이브러리를 작제하기 위한 염색체 DNA를 단리시켰다. Sau 3A로 DNA를 부분적으로 절단하였으며 이어서 수크로스 농도 구배로 분류하였다. BamHI으로 절단시킨 대장균 (E, coli)/사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) 셔틀 벡터 YEp 352 [J.E. Hill 등, 1993, Yeast 2: 163-167 참조]에 가장 큰 프래그먼트 (도 4)를 라이게이션시켰다. 이 라이게이션 혼합물로 대장균 (E. coli) DH5를 형질변환시켰다. 인서트를 포함하는 플라스미드를 갖는 클론인 백색으로 인지될 수 있는 3600개의 콜로니를 암피실린 및 X-Gal을함유하는 플레이트로부터 단리시켰다. 무작위로 선택한 30개의 상기 클론을 조사했을때, 이들 모두는 정말로 플라스미드를 가지며, 이들 플라스미드들이 7 kb와 18 kb 범위 사이의 크기인 인서트를 가지고, 제한 효소 패턴에서 명백하듯이 모든 인서트들이 상이함이 밝혀졌다. 7 x 10³kb 크기를 갖는 아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii) 게놈을 기초로, 모든 유전자가 이 유전자 라이브러리에 존재할 확률이 97% 내지 99.99%이다. 100개의 모든 클론을 아가 플레이트 상에서 큰 줄로 배양하였으며 그 후 플라스미드를 풀로 제조하였다. 결과적으로 유전자 라이브러리는 36개의 플라스미드 풀로 이루어졌다.

실시예 2: icl1을 포함하는 유전자 라이브러리 프래그먼트의 선발

유전자 라이브러리 플라스미드 제조물을 사용하여 효모균인 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) ICL1d ura3(fs)을 형질변환시켰다 [E. Fernandez 등, 1992, Eur. J. Biochem. 204: 983-990 참조]. 상기 돌연변이체의 ICL1 유전자는 파괴되어 있으며 돌연변이체의 ura3 유전자에서는 리딩 프레임에 돌연변이가 존재한다. 상기 유전자형 때문에, 상기 균주는 탄소원으로서의 에탄올 상에서 성장할 수 없으며 우라실 영양요구를 나타낸다. 첫번째 단계에서, 유일한 탄소원으로 글루코스를 함유하는 최소 배지 상에서 유전자 라이브러리로 형질변환시킨 효모 세포를 선발하였다. 플라스미드 상에 ura3 유전자가 존재하고, 최소 배지는 우라실을 전혀 함유하지 않기 때문에 단지 플라스미드를 흡수한 세포만이 성장할 수 있다. 이 단계에서 1900개의 클론을 수득하였다. 유일한 탄소원으로 메탄올을 함유하는 최소 배지에 상기 클론을 복제 도말 (replica plating)하여 이전시켰다. 에탄올 상에서의 성장에 보전 효소로서의 이소시트레이트 리아제가 무조건적으로 요구되기 때문에, 플라스미드 상에 ICL 유전자를 포함하는 클론만이 성장할 수 있다. 에탄올 상에서 성장하는 두 개의 클론을 단리시킬 수 있었다.

실시예 3: 단리시킨 유전자 라이브러리 프래그먼트의 작용력 조사

염색체 ICL 결함을 컴플리멘테이션하는 것이 플라스미드에 코딩되어 있는지를 조사하기 위하여, 선발된 사카로마이세스 (Saccharomyces) 클론을 우라실을 함유하는 완전 배지 상에서 2회 배양하였으며 그 결과물인 세포를 플레이트 상에서 단일 콜로니로 성장시켰다. 각각 16개 및 13개의 콜로니로부터 무작위로 선택한 각각 7개 및 5개의 클론들은 글루코스를 함유하는 최소 배지 상에서 더이상 성장하지 않았으며, 이들 동일 클론은 에탄올을 함유하는 최소 배지 상에서도 또한 성장하지 않았다. 따라서 플라스미드 큐어링 (curing)은 ICL1d 컴플리멘테이션 상실과 서로 관련이 있었다.

두 클론 중 한 클론으로부터 플라스미드를 다시 단리시켰다. 이 플라스미드는 대략 8 kb의 인서트를 포함하였다. 사카로마이세스 (Saccharomyces) 돌연변이체를 다시 형질변환시키면 발견된 모든 클론이 컴플리멘테이션되었다. SphI을 사용하여 8 kb 프래그먼트를 완전한 기능을 갖는 2.9 kb 프래그먼트로 단축시킬 수 있었다. 에탄올 상에서 성장시킨 돌연변이체의 조추출물에서 이소시트레이트 리아제의 비활성은 단백질 1 mg당 0.3 U으로 밝혀졌다. 또한, 아쉬비아 (Ashbya) ICL에 대한 폴리클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯 (Western blot)에서 명확한 신호가 획득되었다.

트립신 작용에 의해 생긴 ICL 펩티드로부터 추론된 프라이머를 사용한 PCR에서 기대되는 크기의 강력한 신호가 나타났다. 2차원 전기영동 겔을 사용하여 단백질을 단리시켰는데, 트립신으로 이 단백질을 처리하여 펩티드로 분해시켜 에드만(Edman) 분해로 이들 펩티드의 말단을 서열결정하였다. 데이타베이스로 펩티드 서열을 비교해 보면 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) 이소시트레이트 리아제와 70% 이상의 상동성을 나타내었다. 상기 서열로부터 추론된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 대략 8 kb 크기의 컴플리멘팅 유전자 라이브러리 프래그먼트 중 3.3 kb를 서열결정하였다 [Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467 참조]. 데이타베이스와 비교했을 때 결정된 서열에서 두개의 코딩 부위가 밝혀졌다. 1680 염기의 한 리딩 프레임 (서열 번호 1)은 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) ICL1 유전자와 65% 상동성을 나타낸다. ICL 유전자는 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) Ser-tRNA와 84% 상동성을 나타내는 서열의 상향 375 염기이다 (서열 번호 1).

실시예 4: 대장균 (E. coli)/효모/아쉬비아 (Ashbya) 셔틀 벡터에 서브클로닝된 ICL의 작용력

스타이너 (Steiner) 및 필립센에 의해 작제된 pAG 100 플라스미드 ([Mol. Gen. Genet 242: 263-271, 1994] 참조, 도 6) 내로 제한 효소 절단으로 수득된 두 개의 프래그먼트와 단리시킨 유전자 라이브러리 프래그먼트의 PCR 생성물 (도 5)을 클로닝하였다. 상기 프래그먼트는 2.9 kb Sph I 프래그먼트 (pAG 100 icl.4) 및2.2 kb Bgl I/Eco RV 프래그먼트 (pAG 100 icl.6)였다. 두 프래그먼트 모두 Ser-tRNA를 포함하였다. 이런 이유 때문에 추정 유전자와 Bam HI 절단 위치가 융합된 것(pAG 100 icl.8)을 함께 동시에 PCR로 증폭시켰다. pAG 100 플라스미드의 Bam HI 위치 내로 세 가지 DNA 모두를 클로닝하였다. 그 결과물인 플라스미드로 효모 돌연변이체 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) ICL1d ura3(fs)을 형질변환시켰다. 세 가지 작제물 모두 ICL1d 파괴를 완전히 컴플리맨팅하였는데, 즉 상기 세 가지 작제물 모두 기능성 유전자를 포함하였다.

실시예 5: 아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii)에 의한 리보플라빈 형성에 대한 ICL 포함 플라스미드의 효과

상기에 기술된 플라스미드로 아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii)를 형질변환시키면 (방법: 문헌 [라이트 및 필립센, 1991, Gene 109: 99-105] 참조) 리보플라빈 형성이 현저히 증가하였다. 두 개의 격벽이 갖추어져 있고 각각 10 g/ℓ의 대두유, 10 g/ℓ의 효모 추출물 및 200 μg/㎖의 제네티신을 함유하는 50 ㎖의 배지를 포함하는 500 ㎖ 진탕 플라스크에 상기 균주를 배양하였다. 인서트가 포함되지 않은 플라스미드를 갖는 대조 균주인 아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii) pAG 100은 2일후에 18.7±0.1 mg/ℓ의 리보플라빈을 생산하였다. 아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gosspii) pAG 100.4 균주 및 아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii) pAG 100.6 균주는 각각 31.2±6.1 mg/ℓ와 31.0±2.0 mg/ℓ의 리보플라빈을 생산하였다 (도 7). 변화성의 정도가 높기 때문에 이소시트레이트 리아제의 비활성에서의 현저한 변화를 전혀 측정할 수 없었다. 3 g/ℓ의 글리신이 또한 보충된 배지에서 균주아쉬비아 고씨피이 (Aahbya gossypii) pAG 100.8은 3일에 걸친 기간에 65±5.6 mg/ℓ의 리보플라빈을 생산하였다. 반대로, 직접적으로 비교시 대조 균주 아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii) pAG 100은 단지 29.9±1.8 mg/ℓ의 리보플라빈을 형성하였다(도 8). 이소시트레이트 리아제 비활성 또는 균사체의 건조 중량 중 어느 하나에서 현저한 차이를 측정할 수 없었다.

실시예 6: 이소시트레이트 리아제 (ICL)의 정제

ICL에 대한 억제 효과를 나타내는 물질을 동정하기 위하여, 무엇보다도 아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii) ICL을 정제하였다. 식물성유 상에서 진균류 균사체를 성장시킨 후, ICL을 단리 및 정제하였다. 개개의 정제 단계를 하기 표 1에 요약하였는데, 이 표에서 알 수 있듯이, 대략 25 g의 균사체로부터 제조되고 프렌치 프레스 (French Press)를 사용하여 세포를 파괴시켜 수득된 전형적인 조추출물은 220 단위의 ICL 활성을 포함한다. 40,000 g에서 원심분리시킨 후 상청액에 용해된 형태로 상기 활성의 대략 78%를 회수한다. 그 후 황산 암모늄 침전법으로 분획시키면 3배 농축된 효소가 수득된다. ICL을 세파크릴 (Sephacryl) S-300 컬럼을 통하여 겔 여과시킨 후, 양이온 교환 물질인 모노 에스-세파로스 (Mono S-Sepharose)에 결합시키고 NaCl로 용출시킨다. 그 결과물인 제조물은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 동종으로 나타나며 18.4 U/mg의 비활성을 갖는다.

실시예 7: ICL 억제제의 동정

정제된 효소를 사용하여 그의 활성에 대한 물질의 효과를 비색 시험으로 측정할 수 있다 [Dixon, H. 및 Kornberg, H.L. (1959), Biochem. J. 72, 3: Assay methods for key enzymes of the glyoxylate cycle 참조]. 시험한 물질들의 효소에 대한 효과를 각각 하기 표 2 및 도 1에 요약하고 나타낸다. 조사되는 물질은 진균류 세포에서 대사 산물로서 본 발명의 효소에 억제 효과를 가질 수 있는 것들을 포함한다. 이 중 6-P-글루코네이트 및 포스포엔올피루베이트는 10 mM의 농도에서 50% 이상의 억제율을 나타내어 가장 현저한 억제 효과를 나타내었다. 그러나, 진균류의 대사 작용에 아마도 참여하지 않는 이타코네이트 및 옥살레이트는 실질적으로 더 큰 효과를 나타내었다. 단지 1 mM의 농도로 각각 78% 억제율 및 95% 억제율을 나타내었다.

실시예 8: 이타코네이트 선발 돌연변이체의 특성화

진균류의 포자를 UV 광선으로 조사함으로써 단리된 진균 포자의 유전성 물질에서의 돌연변이를 야기할 수 있다. 10% 내지 20% 포자 생존율의 조사량을 사용하면, 이타코네이트에 의한 리보플라빈 형성의 억제에 내성을 갖는 돌연변이체가 수득된다. 상기 방식으로 단리시킨 돌연변이체를 대두유 상에서 성장시키면, 상기 돌연변이체는 출발 균주보다 25배 더 많은 리보플라빈을 형성시킨다 (도 2). 리보플라빈 형성 단계 동안 ICL 비활성이 15%까지 증가한다 (도 2). 항체를 사용하여 단백질 양이 증가됨을 증명할 수 있다. 이타코네이트에 의한 ICL 억제에서 돌연변이체의 ICL은 출발 균주의 ICL과 동일한 반응을 나타낸다.

실시예 9: 리보플라빈 형성과 ICL 비활성과의 상호 관계

글루코스를 기질로 제공할 때, 진균류는 단지 글루코스가 소모된 후에만 리보플라빈을 생산하기 시작한다는 것이 관찰됨으로써 ICL과 리보플라빈 형성 사이에 뜻밖의 관계과 있음이 놀랍게도 밝혀졌다. 그렇다면 진균류를 오일 상에서 성장시킬 때 나타나는 것과 같이 이전에 글루코스에 의해 억제된 ICL은 조추출물에서 또한 측정가능해지고 활성까지 증가된다는 것이 명확하다 (도 3).

Claims (11)

1. 리보플라빈 생산 미생물을 영양 배지에서 배양하고 이어서 생산된 리보플라빈을 단리시키는 미생물에 의한 리보플라빈의 제조 방법에 있어서, 내생적인 이소시트레이트 리아제 (ICL) 활성이 변성된 미생물을 사용하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 변성된 미생물이 내생적인 ICL 유전자의 돌연변이에 기인하는, 유전자가 변성되지 않은 미생물의 ICL 효소보다 높은 활성의 ICL 효소를 갖는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 변성된 미생물이 ICL 유전자 카피수 증가에 기인하는, 유전자가 변성되지 않은 미생물보다 높은 발현율의 ICL 유전자를 갖는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, ICL 유전자의 발현이 강화될 수 있게 하는 DNA 조절 서열에 ICL 유전자를 기능적으로 결합시킨 방법.
5. 제1항에 있어서, ICL에 대해 억제 효과를 갖는 물질에 내성을 나타내는 미생물을 사용하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 미생물이 이타코네이트 및 옥살레이트 물질에 내성인 방법.
7. 제1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 진균류를 미생물로 사용하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 아쉬비아 (Ashbya)속 진균류를 사용하는 방법.
9. 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 ICL 유전자.
10. 제9항에 청구된 ICL 유전자를 포함하는 유전자 작제물.
11. 제10항에 있어서, ICL 유전자의 발현을 증가시킬 목적으로 하나 이상의 조절 신호에 ICL 유전자를 기능적으로 결합시킨 유전자 작제물.