JPH05184353A - 高トレハロース含量の新しいイースト株、該イーストの製造法および該イーストの使用法 - Google Patents

高トレハロース含量の新しいイースト株、該イーストの製造法および該イーストの使用法

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JPH05184353A
JPH05184353A JP3216706A JP21670691A JPH05184353A JP H05184353 A JPH05184353 A JP H05184353A JP 3216706 A JP3216706 A JP 3216706A JP 21670691 A JP21670691 A JP 21670691A JP H05184353 A JPH05184353 A JP H05184353A
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ドリーエッセン マリアンヌ
Klaas A Osinga
アンヌ オッシンハー クラース
Margareta A Herweijer
アドリアナ ヘルヴェイェール マルガレータ
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Abstract

(57)【要約】 ［目的］ トレハロース含量が高いイースト株、該イー
スト株の調製法および使用法を提供することを目的とす
る。 ［構成］ 中性トレハラーゼまたはトレハロース−６−
ホスフェートシンテースをコードする野生型遺伝子とは
異なるように修正した中性トレハラーゼまたはトレハロ
ース−６−ホスフェートシンテースをコードする遺伝子
を少なくとも１つ含む形質転換イーストで非形質転換親
イーストとは異なるトレハロース含量を有することを特
徴とするイーストを提供する。非形質転換株と比べて該
イーストは糖耐性および乾燥耐性が高いことを特徴とす
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連分野】本発明はイースト、特に製パン用イースト
に関する。
【０００２】
【関連技術】サッカロミセス属に属するイースト株が嫌
気的条件下で糖をほぼ等量の二酸化炭素とエタノールに
発酵し得ることはよく知られている。生パン中のイース
トの発酵活性はこの活性による。生パン中の二酸化炭素
およびエタノールの発生速度は含有されているイースト
の活性の他に生パン中に存在する糖の量に対するそのイ
ーストの感受性に依存する。糖の多い生パンでは低栄養
（無糖）生パンに比べイーストの発酵活性が低く、これ
は糖の存在による高い浸透圧による。
【０００３】市販の製パンイーストは新鮮なイースト、
乾燥イースト、および凍結イーストを含むいくつかの調
合法で作られている。新鮮なイーストは圧縮イースト
（乾燥物含量２７〜３３％）およびクリームイースト
（乾燥物含量１７〜２３％）として入手可能である。乾
燥イーストは各々湿度６〜８％および３〜６％の活性乾
燥イースト（ＡＤＹ）および急速乾燥イースト（ＩＤ
Ｙ）として入手可能である。イーストの発酵力の改善は
現在盛力的に研究されている。乾燥イーストおよび湿潤
イーストのいずれも改良され、貧栄養（糖無添加）同様
富栄養（糖添加）生パン中での二酸化炭素生成能が増加
すれば発酵時間が短縮され、および、またはイースト量
を少量化が可能となり製パンにおけるかなりのコスト因
子を低く押さえることが可能である。 （イースト細胞におけるトレハロースの役割）トレハロ
ース（アルファ−Ｄ−グルコピラノシル−アルファ−Ｄ
−グルコピラノシド）は植物細胞および菌類およびイー
ストの胞子における重要な貯蔵化合物である。トレハロ
ースは非増殖期において、主に貯蔵炭水化物として働い
ていると考えられている。このことは飢餓など増殖が停
止するライフサイクル、細胞サイクルおよびその他の条
件に当てはまる（セベレイン (Thevelein), J. M. （１
９８４）Microbiol. Rev. ４８，４２〜５９）。
【０００４】トレハロースは再生産期の終りに蓄積さ
れ、休止細胞の生存に重要であると考えられている（セ
ベレイン (Thevelein)、上述）。菌類胞子中に高レベル
のトレハロースが存在することも高レベルまたは低レベ
ルの温度および湿度など極端な条件下での胞子の耐性を
高めていると考えられている。胞子の生存力におけるト
レハロースの役割りとは別に数人の研究者によってトレ
ハロースの細胞内または細胞外含量とストレス耐性の間
の相関が発見された。すなわちトレハロースレベルは乾
燥イーストの発泡力と正の相関がある（ポロック (Poll
ock), G. E. , ホルストロム (Holstrom), C. D.（１９
５１）Cereal Chem.２８，４９８−５０５）。またトレ
ハロースレベルの浸透圧耐性に対する（マッケンジー
(Mckenzie),K. F.,シング (Sing), K. K., ブラウン(Br
own), A. D.（１９８８）, J. Gen.Microbiol.１３４，
１６６１−１６６６）および熱耐性に対する（ホティガ
ー (Hottiger), T. ボラー (Boller), T., ウィームケ
ン (Wiemken), A.（１９８７），ＦＥＢＳ Lett.２２
０，１１３−１１５）正の相関が見いだされている。別
の研究で外から添加したトレハロースレベルは対数期で
はなく停止期の細胞における脱水耐性と相関することが
発見された（ガッド (Gadd), G. M., チャルマース (Ch
almers), K.,リード (Reed), R. H. (１９８７），ＦＥ
ＭＳ Microbiol.Lett.,４８，２４９−２５４）。 （細胞性トレハロースレベルの増加）高発泡性イースト
などの高品質のイーストを生産する必要性がある。この
ようなイーストはイーストの細胞性トレハロース含量を
増加することにより入手可能である。このことはイース
トへのいくつかのストレスの有害な影響を減少する。細
胞性トレハロースレベルの増加は、たとえば飢餓、昇温
および一般的には乾燥は凍結などのストレス形態により
達成し得る増殖速度を低下する条件下で起こる。イース
ト製造において低増殖速度は発酵の最後において糖密投
与を低くめることにより達成し得る。また高トレハロー
スレベルは先に述べたように厳しいストレスを与えるこ
とにより得られる。しかしこれらの条件では性質が変わ
った低品質のイーストが生成する（ジメンス (Jimene
z), J., ベニテス (Benitez), T.,ウィンターズ (Winte
rs), L., コントソン (Contson) G. E., クラーク (Cla
rke), K. J., （１９８３), J. Gen. Microbiol. １２
９，２０２３−２０３４）。
【０００５】トレハロースレベルの遺伝子修正はＰＡＳ
２遺伝子が変異したイースト株を用いて行なわれた。イ
ーストＲＡＳたんぱく質はグアニンヌクレオチド検出た
んぱく質であり、ｃＡＭＰ生成に関係し、またおそらく
イノシトールリン脂質のターンオーバーに関係してい
る。ＲＡＳ１およびＲＡＳ２は両方ともグアニンヌクレ
オチドに結合し、ＧＴＰを加水分解する活性を示すがこ
の後者の活性は１９番目のアミノ酸（グリシン）がバリ
ンに変化したＲＡＳval19 変異体では無くなる。
【０００６】ＲＡＳval19 変異体は以下に示す（１）グ
リコーゲンおよびトレハロースなどの貯蔵炭水化物の蓄
積不能、（２）不十分な胞子化、（３）栄養飢餓感受
性、および熱ショック感受性などを含む優性の発現型を
示す。ＲＡＳ２遺伝子を欠く株は事実上以下に示す
（１）貯蔵炭水化物の蓄積、および（２）富栄養培地に
おける胞子化などを含む反対の発現型を示す。これらの
変異体は非発酵性炭素源では十分に増殖できず、またＲ
ＡＳ２分裂に対してホモ接合性の細胞は富栄養培地中で
胞子化する（タッチェル (Tatchell), K. 上述) 。これ
らの発現型はｃＡＭＰ経路で影響を受けるイーストの発
現型と同じである（タマノイ (Tamanoi), F.(１９８
８）Biochem. Biophys. Acta.,９４８，１−１５）。細
胞中のトレハロースレベルおよびトレハラーゼ活性の間
の関係に関して報告された矛盾するデータがある。
【０００７】特にＲＡＳ２遺伝子の変異はｒａｓ2-変異
の場合初期静止期細胞において低レベルの中性トレハラ
ーゼ、トレハロース移動酵素および高レベルの貯蔵トレ
ハロースを生成する（タッチェル (Tatchell), K., ロ
ビンソン (Robinson), L.C., ブレイテンバック (Breit
enback), M.（１９８５），Proc. Natl. Acad. Sci.,
８２，３７８５−３７８９）。静止期イースト細胞にお
ける高レベル中性トレハラーゼおよびトレハロース貯蔵
の不在はＲＡＳ２val19 変異体で見られる（トダ (Tod
a), T., ウノ (Uno), I., イシカワ (Ishikawa), T.,
パワーズ (Powers), S., カタオカ (Kataoka), T., ブ
ローク (Broek), D., カメロン (Cameron), S., ブロー
チ (Broach), J., マツモト (Matumoto), K., ウィグ
ラー(Wigler), M., （１９８５），Cell, ４０，２７−
３６）。種々のストレスに対する耐性は上述の変異体で
はテストしなかった。
【０００８】また別の実験ではｃＡＭＰ依存プロテイン
キナーゼカスケードに欠損を有する変異体を用いた。ｂ
ｃｙ１変異（ｃＡＭＰ非依存プロテインキナーゼ）は高
レベルの中性トレハラーゼおよび低レベルのトレハロー
スを生じ、一方ｃｙｒ１−２（ｔｓ）変異（熱不安定ア
デニレートシクラーゼおよび低レベルのｃＡＭＰ）はｒ
ａｓ２変異体の結果とは反対の低レベルの中性トレハラ
ーゼおよび正常レベルのトレハロースを生成する（ウノ
(Uno), I., マツモト (Matumoto), K.,アダチ(Adach
i), K., イシカワ (Ishikawa), T. ( １９８３）J. Bio
l. Chem., ２５８，１０８６７−１０８７２）。
【０００９】高温または飢餓条件下での増殖のようにイ
ーストのトレハロース含量の生理学的または環境的に誘
導される変化と同様に、上述の遺伝学的に誘導された変
化はトレハロース含量の増加とは別にネガティブな副作
用を起こす。それゆえ上記変異を介する遺伝学的トレハ
ロース含量の変化は工業的には有用なものではない。イ
ーストにおける中性トレハラーゼレベルとトレハロース
レベルの間の直接的関係とは逆の結果が例えばより低い
中性トレハラーゼとより高いトレハロース含量のｒａｓ
２- 変異体とより低い中性トレハラーゼとより高くない
トレハロース含量のｃｙｒ１−２（ｔｓ）との比較を行
った種々の研究グループにより報告されている。 （イーストにおけるトレハロース代謝の調節）トレハロ
ースはトレハロース−６−ホスフェートシンテースによ
る触媒作用でグルコース−６−ホスフェートおよびＵＤ
Ｐ−グルコースからトレハロース−６−ホスフェートが
合成され、これがトレハロース−６−ホスフェートホス
ファターゼにより処理を受ける経路で合成される。パネ
ク (Panek)および共同研究者(パネク (Panek), A. C.,
デアラウジョ(De Araujo), P.S.,モーラネト(Moura-Net
o) V. およびパネク (Panek), A. D.,（１９８７），Cu
rr. Genet., １１，４５９−４６５）はトレハロース−
６−ホスフェートシンテースがｃＡＭＰ依存プロテイン
キナーゼによる影響を受けないことを主張した（バンデ
ルカメン (Vandercammen), A.,フランコイス (Francoi
s), J. およびハース (Hers) H.（１９８９）Eur. J. B
iochem., １８２, ６１３−６２０）。トレハロース−
６−ホスフェートシンテース活性は静止期細胞で測定
し、それはＡＴＰ，ｃＡＭＰおよびｃＡＭＰ依存プロテ
インキナーゼとは独立であると考えられた。
【００１０】トレハロース分解はｃＡＭＰ依存プロテイ
ンキナーゼによるリン酸化で活性化される中性細胞質ト
レハラーゼによって行なわれる。その非リン酸化型は不
活性である（ウノ(Uno), I.,マツモト (Matsumoto), K.
アダチ(Adachi), K., イシカワ (Ishikawa), T. （１９
８３）,J. Biol. Chem.,２５８，１０８６７−１０８７
２）。さらに液胞はまだ機能が分らないいわゆる酸トレ
ハラーゼを含んでいる（ハリス (Harris), S. D., コッ
ター (Kotter), D. A.（１９８８）Can. J. Microbiol.
３４，８３５−８３８）。
【００１１】グルコースパルス後、サイクリック−ＡＭ
Ｐの細胞内濃度の実質的増加は増殖前の誘導期の最初の
５分間に観測される。これにつづいて急速なトレハロー
スの分解と一致した中性トレハラーゼ活性の６〜８倍の
増加が見られる。およそ１時間後トレハラーゼ活性は活
性化以前の低い活性レベルにまで減少する。（ヴァンデ
ルプラート (Van der Plaat), J. B.,ヴァンソリンゲン
(Van Solingen), P.（１９７４）Biochem. Biophys. R
es. Comm., ５６，５８０−５８７）。増殖の低下はト
レハロース蓄積と関係するが休止期における増殖の誘導
はトレハラーゼの活性化によるトレハロースの急速な移
動と関係している。窒素源の添加はトレハロース分解を
促進し、かつ再合成を妨害する（セベレイン (Thevelei
n)（１９８４）Microbiol. Rev. ４８，４２−５９）。
【００１２】文献データはトレハロース合成が必要な時
期にトレハロース−６−ホスフェートシンテースが活性
であるが中性トレハラーゼは不活性であり、それゆえト
レハロースの合成と分解が同時に起こることはないこと
を強く支持している。 （本発明の概要）本発明は中性トレハラーゼまたはトレ
ハロース−６−ホスフェートシンテースをコードする少
なくとも１つをコードする遺伝子で中性トレハラーゼま
たはトレハロース−６−ホスフェートシンテースをコー
ドする野生型の遺伝子とは異なるよう修正された遺伝子
を含む形質転換イーストで非形質転換イーストとはトレ
ハロース含量が異なるイーストを提供する。本発明の形
質転換イーストは先に述べたネガティブな副作用が発生
すること以外非形質転換イーストに比べて優れたストレ
ス耐性を有している。さらに本発明は効率のよいトレハ
ロース産生法を提供している。 （詳細な説明）‘ストレス耐性’とは本出願を通じてた
とえば高浸透圧、高温または乾燥などストレス条件に対
するより高い耐性を意味している。
【００１３】‘発酵収率’とは消費した糖１グラム当り
の形成された乾燥物質のグラム重量を意味している。
‘中性トレハラーゼ’とはトレハロース分解に関与する
細胞質性トレハラーゼを意味している。‘ストリンジェ
ントハイブリダイゼーション’とはマニアチス (Maniat
is) 等によって示されたハイブリダイゼーション条件を
意味している(T. マニアチス (Maniatis), E.E. フリッ
シュ (Fritsch), J.サンブルーク (Sanbrook),（１９８
２）Molecular Cloning,ラボラトリーマニュアル, pp.
３８７−３８９）。
【００１４】驚くべきことに現在製パンイースト製造時
にトレハロースが合成されるとき中性トレハラーゼおよ
びトレハロース−６−ホスフェートシンテースの両方が
活性であることが分っている。このことはトレハロース
合成の際、中性トレハラーゼは活性ではないと考えられ
ていることから予想外のことであった。この発見は細胞
性トレハロースレベルの変えることによりイーストのト
レハロースの増加に応用される。
【００１５】本発明の１つの特徴としてイースト細胞中
の中性トレハラーゼ活性は中性トレハラーゼ遺伝子の操
作により低下させ、これにより細胞内トレハロース含量
を増加させる。このようにして生成したイーストはより
高いストレス耐性を有している。この方法は別の遺伝学
的、または生理学的修正の結果としてトレハロースの増
加と同時に発生する副作用が細胞性中性トレハラーゼ含
量を修正したイーストでは起こらないという利点を有し
ている。それゆえ、トレハラーゼ含量の修正によるトレ
ハロースレベルの増加したイーストは工業的用途に適し
ている。
【００１６】本発明に従い、生産および応用条件下の性
質が改善されたイーストが提供される。本発明の修正し
たイースト株と合せて本明細書で使用している改善され
た性質とはより高い製パン性能、特に対応する非形質転
換（野生型）株に比べてより秀れた乾燥耐性および、ま
たは高含有糖耐性を意味している。それゆえ親株と比べ
より高い、トレハロース含量を有するイースト株の構築
法が提供される。これらの方法にはトレハロース−６−
ホスフェートシンテース、トレハロース−６−ホスフェ
ートホスファターゼおよびトレハロースなどトレハロー
ス代謝に関する酵素をコードする遺伝子の使用が含まれ
る。このようにして他の代謝プロセス（先に述べた）を
妨害することなく細胞のトレハロース含量を調節するこ
とが可能である。
【００１７】本発明の好ましい態様において中性トレハ
ラーゼをコードする遺伝子が単離された。この遺伝子を
入手できたことで各遺伝子の遺伝子破壊（ロスシタイン
(Rothstein),R. J. （１９８３）Methods in Enzymolog
y １０１，２０２）という従来技術により細胞内トレハ
ラーゼ活性を減少させ得る。たとえば二倍体イースト株
においてトレハラーゼ遺伝子の１つまたは２つの対立遺
伝子を不活性化し得る（半数体ゲノム中１個のトレハラ
ーゼ遺伝子が存在すると仮定して）。
【００１８】別の態様においては中性トレハラーゼ遺伝
子を修正してトレハラーゼのリン酸化部位を変化させ、
リン酸化が起こり得ないようにする。中性トレハラーゼ
はリン酸化を介して活性化され、その活性化はｃＡＭＰ
依存プロテインキナーゼによって触媒されることが文献
で知られている。非リン酸化トレハラーゼは非常に低い
活性しか持っていない。サイクリックＡＭＰ依存プロテ
インキナーゼのコンセンサス認識部位を修正し、リン酸
化がもはや起こらないようにすることができる。これは
リン酸化を介して活性化されることはない修正された中
性トレハラーゼをコードする遺伝子により行なわれる。
細胞の生理にとってこの非リン酸化トレハラーゼの残存
活性が重要であるかもしれない。それゆえこれの代替法
はバイオマス形成時または製パンイーストの生パンにお
ける活動の初期のどちらの時期にトレハロースの移動が
重要であるかを選択する方法である。
【００１９】本発明の別の態様において、中性トレハラ
ーゼをコードする遺伝子をランダムに変異させた。より
低い活性のトレハラーゼをコードする遺伝子を単離し、
イースト株の未修正遺伝子の遺伝子置換に使用した。こ
の方法でも低活性のトレハラーゼ、つまりより高いトレ
ハロースレベルが誘導された。本発明に別の態様におい
て、中性トレハラーゼをコードする遺伝子を誘導可能な
プロモーターのコントロール下に置き、それによりこの
遺伝子の発現をコントロールを可能にした。このことは
トレハラーゼ活性が細胞にとって有利である条件下でそ
の遺伝子を活性化し、かつたとえばイーストのバイオマ
ス生産期の終りなど安定で高いトレハロースレベルを必
要とする条件下ではその遺伝子発現をたち切ることが可
能である。
【００２０】本発明の別の態様において、中性トレハラ
ーゼをコードする遺伝子をこの特定の遺伝子のプロモー
ターよりも弱いプロモーターのコントロール下に置い
た。また本発明の別の態様において、中性トレハラーゼ
の発現はアンチセンスＲＮＡ法により調節し得る。この
場合中性トレハラーゼ遺伝子（の一部）のアンチセンス
ＲＮＡはそのコード領域をプロモーターの後に逆向きに
クローニングすることで細胞中で作ることができる。こ
の遺伝子から合成したＲＮＡは正常な中性トレハラーゼ
ＲＮＡと塩基対を作ることができ、それによりその翻訳
を妨害し得る。二本鎖ＲＮＡが形成する効率は最終的に
中性トレハラーゼ合成レベルを決定する。それゆえこの
方法は遺伝子発現を調節する代替法となりまたゲノムが
一群のトレハラーゼ遺伝子を含む場合特に興味深い。ア
ンチセンスＲＮＡはイントランスに作用するのでこれら
の遺伝子群は簡単に調節し得る。
【００２１】本発明の別の態様において、液胞酸トレハ
ラーゼをコードする遺伝子を単離した。道具としてこの
遺伝子を用い、このタイプのトレハラーゼ活性をたとえ
ば遺伝子破壊技術、たんぱく質工学、またはプロモータ
ーの交換（誘導可能、より弱い）などにより修正し得
る。この方法はいかなる中性トレハラーゼ活性も無く実
質的トレハロースの移動が酸トレハラーゼを介して行な
われている場合に有効である。それゆえこの方法を用い
て細胞における至適トレハロースレベルを達成できる。
【００２２】また本発明の別の態様において、トレハロ
ース−６−ホスフェートシンテースおよびトレハロース
−６−ホスフェートホスファターゼなどのトレハロース
合成に直接関与する酵素をコードする遺伝子をクローン
化した。トレハロース生合成速度の促進はトレハロース
レベルを増加するもう１つの直接的方法である。このよ
うな増加はこれらのトレハロース生合成遺伝子に適用す
る遺伝子工学技術（遺伝子コピー数の増加、比活性を変
えるたんぱく質工学、他のプロモーターの使用など）に
より達成し得る。以上に述べたすべての態様は共通して
トレハロース代謝に直接関与し細胞中のトレハロースレ
ベルを高める酵素をコードする遺伝子の使用を含んでい
る。このようなレベルの増加は熱、浸透圧、乾燥、凍結
などのストレス条件下で有利である。
【００２３】上述の方法で得られたイーストをＤＮＡ介
在トランスホーメーション技術などの方法およびプロト
プラスト融合、交配または変異などの方法を用いた株改
良計画で使用し得る。またこれらの方法を組合せること
も可能である。たとえば形質転換イーストを別の（産
生）株と交配することもできる。このような改良計画に
もとづいて得られたイーストも本発明の範囲に含まれ
る。
【００２４】本発明に従がい、サッカロミセス(Sacckar
omyces) 属またはクルイベロミセス(Kluyveromyces) 属
に属するイースト株が用いられ、特に、S.セルビシエ
(S. cerevisiae) に属する株にうまく適用される。また
本発明は二酸化炭素を生成するために本発明のイースト
を使用した生パン( 通常および凍結生パン) 、製パンお
よび同様の産物の製造法を提供する。
【００２５】また本発明は高含量の細胞内トレハロース
を有し、それによりトレハロースの効率的生産が可能な
イーストを提供する。 (クローニング技術)一般的クローニング技術については
マニアチス(Maniatis)等のハンドブックで参照できる
(T.マニアチス（Maniatis),E. F. フリッシュ(Fritsc
h), J. サンブルーク(Sambrook)（１９８２）Molecular
Cloning,ラボラトリーマニュアル) 。制限酵素はニュ
ーイングランドバイオラブス( バイオラブス) 社、ベセ
スダリサーチラボラトリーズ（ＢＲＬ）社、またはベー
リンガーマンハイム（ベーリンガー）社から購入し、業
者の指示に従って使用した。一般に１μｇのＤＮＡを切
断するのに１〜５ユニットの酵素を必要とする。
【００２６】大腸菌のトランスホーメーションはCaCl2
法を用いて行った(T. マニアチス（Maniatis) 等、上
述) 。さらに本発明の特徴として天然のトレハラーゼ遺
伝子の少なくとも一部を含み、かつ場合によっては中性
トレハラーゼ遺伝子を対応する野生型中性トレハロース
よりも活性の低いトレハラーゼをコードするように修正
した遺伝子を含む組換えプラスミドまたはベクターを提
供する。また本発明はトレハロース−６−ホスフェート
シンテース遺伝子の少なくとも一部を有し、かつ場合に
よってはそのトレハロース−６−ホスフェートシンテー
ス遺伝子が対応する野生型遺伝子よりも活性が高くなる
ように該遺伝子を修正したものを含む組換えプラスミド
またはベクター提供する。
【００２７】本明細書で引用している全ての出版物およ
び特許出願は各出版物または特許出願が特定してかつ個
々に参考として組込まれていると示されているのと同様
に参考として組込まれている。これまで明確化と理解を
目的として図や例を使って本発明を説明してきたが本発
明の教えに従がい特許請求の範囲を逸脱することなしに
特定の変化および修正が可能なことは当業者にとって明
白であろう。
【００２８】以下の実験データは本発明を説明するため
に示された。その方法に精通している当業者は本発明の
目的のため等しく使用し得る他のイースト株およびベク
ターを使用できると理解すべきである。これらの修正も
本発明の範囲に含まれる。 （登録リスト）（クローン、株およびハイブリドーマ細
胞系列） 以下に示すファージクローン、株および細胞系列はＣＢ
Ｓ（セントラルビューローボアシメルカルチャースオー
スターストラート (Centraal bureau voor Schimmelcul
ture Oosterstraat)１，３７４２ＳＡバーン、オラン
ダ）およびＥＣＡＣＣ（ヨーロッピアンコレクションオ
ブアニマルセルカルチャー (European Collection of A
nimal Cell Cultures （ＥＣＡＣＣ），ＰＨＬＦ−セン
ターフォーアプライドマイクロバイオロジーアンドリサ
ーチ（ＰＨＬＳ−Centre for Applied Microbiology an
d Research),ポートンダウン、サリスバリー、ウィルト
シャイアＳＰ４，ＯＪＧ，ＵＫ）に寄託されている。 ────────────────────────────────── ラムダgt 11 クローン 受理番号 登録期日 ────────────────────────────────── ラムダTRE 16.1.1. CBS 512.90 1990, 11, 22 ────────────────────────────────── 株 受理番号 登録期日 ────────────────────────────────── サッカロミセスセレビシエ CBS 514.91 1991, 3, 5 GRD 11 −21 (Ｇ株） サッカロミセスセレビシエ CBS 155.91 1991, 3, 5 ２２７Ｎg サッカロミセスセレビシエ CBS 158.86 1986, 3, 25 ２３７Ｎg （Ａ株） 大腸菌 CBS 115.91 1991, 2, 19 プラスミド pTRE 16.1.1 大腸菌 CBS 405.87 1987, 9, 3 プラスミド pTZ 19R ────────────────────────────────── モノクローナル抗体41-2F10 ECACC 90121901 1990, 12, 14 産生ハイブリーマ ──────────────────────────────────
【００２９】
【実施例】
製パン用イーストのトレハラーゼ活性およびトレハロー
ス含量 （好気性添加発酵）サッカロミセスセレビシェ (Saccha
romyces cerevisiae) イースト株２２７Ｎｇを用いてイ
ーストクリームを調製した。
【００３０】凍結乾燥培養サンプルを望ましい量の種イ
ーストになるまで通常の方法で培養した。イーストの培
養のために容量１０リットルで糖密と同化可能な窒素源
を連続的に供給する装置を備えた実験用ファーメンター
（正味の容積６リットル）を用いた。またこのファーメ
ンターには pＨ調節および温度制御のための装置が備え
られている。発酵は基本的にG.リード(Reed)およびH.
J. ペプラー (Peppler)（イーストテクノロジー、ＡＶ
Ｉ出版、ウェストカットコネクチカット、ＵＳＡ１９７
３）の方法に従った。培養条件としては特に − ５０％砂糖に基づいて計算して８０重量パーセント
のビート糖密および２０重量パーセントのサトウキビ糖
密を含む糖密混合物。 − 第１表に従がう糖密供給（リード(Reed)およびペプ
ラー(Peppler),ページ７８／７９） − 接種前モノアンモニウムリン酸の形でのリン酸必要
量の添加、 − 第１表に従がい１０％ NH3水溶液としての窒素必要
量の添加、 − 全発酵中温度３０℃の維持、 − 全発酵中 pＨ5.０の維持（リード(Reed)およびペプ
ラー(Peppler),ページ６７／６８）、 − 発酵初期における５０％砂糖を含む糖密kg当り６mg
のビタミンＢ1 添加があげられる。
【００３１】このような発酵で得られたイーストを濃縮
し、ラボラトリーノズル遠心機を用いて水道水で洗浄し
た。目的の流加発酵の際に採取したサンプルの酵素レベ
ルを測定した。濾過後ペレットを抽出バッファに懸濁し
た（ＭＥＳ，２５ mＭ，CaCl2 ，2.５ mＭ；ＰＭＳＦ，
１mＭ； pＨ７）。 第 １ 表 ─────────────────────────────── 時 間 ５０％砂糖の糖密(g) １０％のアンモニア(g) （計） (計） ─────────────────────────────── 0.00 49 20 1.00 49 20 2.00 49 20 3.00 69 23 4.00 108 32 5.00 168 52 6.00 246 77 7.00 325 102 8.00 404 132 9.00 503 166 10.00 601 200 11.00 700 228 12.00 798 228 13.00 897 228 14.00 976 228 ─────────────────────────────── バロチニビーズ（３ｇ／ｍl ）を加え、３分回に３回の
割合でビブラックスＶＸＲチューブシェーカーで攪拌
し、攪拌の間は冷却する（０℃）方法で細胞の抽出を行
った。この抽出物を１２０００×ｇで１０分間遠心し、
バッファに対して（ＭＥＳ５ mＭ；CaCl2 ，2.５ mＭ，
pＨ＝７）１晩透析した。
【００３２】無細胞抽出物中のトレハラーゼ活性の測定
にはセベレイン(Thevelein), J.M.,ヴァンレアー(Van L
aere), A.J.,ビューレンス(Beullens), M., ヴァンアシ
ェ(Van Assche), J.A., カーリア(Carlier), A.R.
（（１９８３）J. Gen. Microbiol., １２９，７１６−
７２６）の方法をグルコース試薬としてｏ−ジアニンジ
ンの代りにテトラメチルベンジジンを使うように修正し
て使用した。トレハラーゼ活性１ユニットは１分当りに
１μmoleのグルコースを生成する量と定義した。
【００３３】細胞のトレハロース含量は以下のようにＨ
ＰＬＣを用いて測定した。発酵サンプルを濾過し、洗浄
後煮沸した。大きい細胞断片を除くための遠心後その上
清をアセトニトリルおよび水で希釈し最終アセトニトリ
ル濃度が５０％（ｖ／ｖ）となるよう調節した。このサ
ンプルを濾過し（0.４５μｍ）、それをＲＣＳＳプレカ
ラムを装着した炭水化物カラムにのせアセトニトリル／
水、４：１で溶出した。トレハロース含量は屈折率計お
よびインテグレーターを用いて定量した。
【００３４】無細胞抽出物のたんぱく質はＢＣＡ法（ピ
アス(Pierce)で測定した。ＢＳＡを標準物質として用い
た。中性トレハラーゼは添加発酵の間、トレハロース蓄
積が発酵９時間後に起ったときでさえ活性を一定に保っ
ていると考えられる（第２表）。この結果はトレハラー
ゼガトレハロース合成の際不活性になると考えられるこ
とから予想外であった。
【００３５】細胞の中性トレハラーゼ活性を低下させる
とアイデアは流加発酵を通してトレハラーゼが活性であ
るという予想外の知見に基づいている。 第 ２ 表 ────────────────────── 時間 トレハロース トレハラーゼ ％(w/w) (mU/g−乾燥重量） ──────────────────── 2 0.3 5.1 3 0.3 6.2 4 − 6.0 5 0.4 5.4 6 0.1 6.8 7 0.1 6.2 8 0.1 5.9 9 0.3 6.1 10 0.6 7.0 11 1.8 6.3 12 2.7 7.2 13 3.6 7.5 14 4.1 7.8 14.5 5.2 7.7 15 5.1 7.3 ──────────────────────
【００３６】
【実施例２】 中性トレハラーゼをコードする遺伝子の一部を含むファ
ージラムダクローンの単離 中性トレハラーゼをコードするＤＮＡをラムダgt１１ｃ
ＤＮＡ発現ライブラリーの免疫スクリーニングにより単
離した。中性トレハラーゼの８０kdサブユニットに対す
るモノクローナル抗体（省略４１−２Ｆ１０）を利用し
た。このモノクローナル抗体は受理番号９０１２１９０
１で１９９０年１２月１４日ヨーロッピアンコレクショ
ンオブマニアルセルカルチャー（ＥＣＡＣＣ）、ＰＨＬ
Ｓ−センターフォーアプライドマイクロバイオロジーア
ンドリサーチ（PHLS-Centre forApplied Microbiology
and Re-search）（ポートンダウン、サリスバリー、ウ
ィルトシャイアＳＰ４、ＯＪＧ、ＵＫ）に登録した。こ
のモノクローナル抗体はサッカロミセスセレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae) の無細胞抽出物を流したＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルから調製したウェスタンブロット上の
８０kdの１つのバンドと反応した。またアガロースビー
ズに結合させたこのモノクローナル抗体を（アフチゲル
（Afti-Gel Hz ヒドラジド、バイオラドラボラトリー
ズ、リッチモンド、Ca, ＵＳＡ）サッカロミセスセレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae) の無細胞抽出物とイ
ンキュベーション後中性トレハラーゼ活性がゲル物質に
特異的に結合する。ビーズを遠心で落とした後上清中中
性トレハラーゼ活性の１％以下が検出可能である。
【００３７】ラムダgt１１イーストｃＤＮＡライブラリ
ーをクロンテクラボラトリーズ社（４０３０ファビアン
ウェイ(Fabian way), パロアルト、カリホルニア９４９
０３ＵＳＡ）から入手した。このライブラリー（カタロ
グ番号ＹＬ１００５ｂ、ロット番号３４１１）をプロメ
ガ社のプロトブロットR イムノスクリーニングシステム
（カタログ番号Ｓ３７１０）。説明書に従がいモノクロ
ーナル抗体４１−２Ｆ１０を用いてスクリーニングし
た。スクリーニング操作についてはハイン(Huyhn), T.
V.,ヤング(Young), R.A. およびデービス(Davis), R.W.
（１９８５）ＤＮＡクローニング、プラクチカルアプ
ローチ、１巻（D.M.グローバー(Glover)編），pp. ４９
−７８′ＩＲＬプレス版、オックスフォード）参照。
【００３８】数個の陽性クローンを単離した。ラムダＴ
ＲＥ16.1.1をさらに分析した（以下参照）。このファー
ジクローンを受理番号ＣＢＳ５１2.９０としてセントラ
ルブリューボアジメルカルチャー(Centraalbureau voor
Schimmelcultures （ＣＢＳ））（オースタストラート
(Oosterstraat)1,３７４２ＳＡ、バーン、オランダ）に
１９９０年１１月２２日登録した。
【００３９】登録したファージクローンを増殖する適当
な操作はハイン（Huynh)等により報告されている（上
述）。大腸菌Ｙ１０９０株（ＡＴＣＣ no.３７１９７）
をファージクローンの増殖用の宿主として用いた（ハイ
ン(Huynh), T.V. 上述参照）。
【００４０】
【実施例３】 組換えプラスミドの構築 ａ）ｐＴＲＥ16.1.1 ラムダＴＲＥ16.1.1のイースト挿入物を市販されている
ベクターｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシア）にクローニング
した。このベクターは受理番号４０5.８７としてセント
ラルブリューボアシメルカルチャーズ（Centraalbureau
voor Schimmelcultures) （バーン，オランダ）に登録
してある。クローニング操作を以下に示す。
【００４１】始めにイースト挿入物を増巾する。これは
基本的に“ＰＣＲプロトコールス、方法と応用へのガイ
ド（M.A.イニス(lnnis), D.H. ゲルファンド(Gelfand),
J.J. スニンスキー(Sninsky) およびT.J.ホワイト(Whi
te）編、１９９０），pp. ２５３−２５８”に従った。
修正した個所を以下に示す。ファージ懸濁液の代りにプ
ラークを用いた。１０ｘＴaqポリメラーゼバッファは２
０mMgCl2を含めた。温度サイクルは９４℃、２分、５５
℃２分、７２℃３分で行った。この反応で使用したオリ
ゴヌクレオチドプライマーはラムダgt１１ベクターのＥ
coＲＩクローニング部位周辺のＤＮＡ配列と相補的であ
る。それらの配列は５′−GGCGACGATCCTGGAGCCCG-3′お
よび 5′-CACCAGACCAACTGGTAATGG-3′である。インキュ
ベーション後この反応混合物をＢ１０−ＲＡＤ ＲＤＰ
ミニカラムに通しＤＮＡを精製した（ヌクレオチドの除
去）。
【００４２】第２にこのＰＣＲ産物をＥcoＲＩで消化し
ｐＴＺ１９ＲｘＥcoＲＩにクローン化してプラスミドｐ
ＴＲＥ16.1.1を作製した。このクローンは受理番号１１
5.９１としてｃＢＳに登録した（１９９１，２，１
９）。 ｂ）ｐＴＲＥ１６Ｇ４１８−２の構築 強力な選択マーカーを含むｐＴＲＥ16.1.1を得るため以
下に示すライゲーションを行った。ＡＤＨＩプロモータ
ーのコントロール下にＧ４１８res 遺伝子を含む1.９kb
Ｂgl II フラグメントをプラスミドｐＲＢＮ３のＢg1 I
I による消化により単離した。ｐＲＢＮ３についてはヨ
ーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−３０６１０７に詳しく述べ
られている。この1.９kbＢgl II フラグメントをｐＴＲ
Ｅ16.1.1のＢamＨＩ部位にクローニングした。このこと
によりｐＴＲＥ１６Ｇ４１８−２が生成する（第１図参
照）。
【００４３】
【実施例４】 中性トレハラーゼ遺伝子が破壊し、そのため中性トレハ
ラーゼ活性が低下したイースト株の構築 発現ベクター中に存在する場合、ｐＴＲＥ16.1.1中のイ
ースト挿入物は中性トレハラーゼに対して作製したモノ
クローナル抗体に対して免疫学的に活性なポリペプチド
の合成を行う。この挿入物は約１１００bpの大きさでｃ
ＤＮＡバンクに由来するものである（実施例２および３
参照）。第１図に示したようないくつかの制限酵素に対
する特性を有している。この段階ではこの挿入物がその
遺伝子のどの部分に由来するのかまだ分らない。変性ゲ
ルでの中性トレハラーゼたんぱく質の分子量の見積り
（約８０kd) から考えて（H.アプ(App) およびH.ホルザ
ー(Holzer), J. Biol. Chem.２６４，１７５８３，１９
８９），１１００bpのイースト挿入物はおそらくその遺
伝子全てを含んではいないであろう。
【００４４】本発明の１つの態様に従がい中性トレハラ
ーゼ活性が減少しているイースト株が提供される。この
ようなイーストを得る１つの方法は中性トレハラーゼを
コードする遺伝子の破壊である。一般に１つの遺伝子ま
たはその一部をクローン化し、ゲノム内で特定の遺伝子
を破壊する方法がいくつかある（Methods in Enzymolog
y,１８５，２３章：プラスミドベクターを用いるイース
トゲノムの操作、T.スターンス(Stearns), H. マ(Ma)お
よびD.ボトスタイン(Botstein), １９９０，アカデミッ
クプレス）。
【００４５】１つの方法ではプラスミド中の遺伝子コピ
ー（すなわち中性トレハラーゼ遺伝子）を切断してい
き、その両端を欠くものを作る（アミノ末端とカルボキ
シ末端領域を欠く）。この構築物を染色体内の中性トレ
ハラーゼ部位に組込むと２つの機能を失った遺伝子コピ
ー、１つは５′端を欠き、もう１つは３′端を欠くもの
ができる。我々もこの方法を行った。その１１００bp挿
入物は正規の５′および３′端を含んでおらず遺伝子の
内部領域のみを含んでいると推測した。それゆえ我々は
プラスミドｐＴＲＥ１６Ｇ４１８−２を作製し、これを
ＮsiＩで消化した。ＮsiＩはプラスミドｐＴＲＥ１６Ｇ
４１８−２を２ケ所で切断するがそれらの両方共中性ト
レハラーゼ遺伝子の一部分の中に含まれている（第１図
参照）。この消化で組換え末端が生じ、ゲノム内の対応
する部位への組込みが可能となる。
【００４６】得られたトランスホーマントの分析を以下
に詳しく説明するがこの段階でこのトランスホーマント
は中性トレハラーゼ活性が減少していると云うことがで
きる。このことは、１）イースト挿入物は中性トレハラ
ーゼ遺伝子の一部である、２）事実ｐＴＲＥ16.1.1（お
よびｐＴＲＥ１６Ｇ４１８−２）中に存在するイースト
挿入物は中性トレハラーゼの両端を欠いており、かつそ
れは遺伝子中央領域を含んでいることを証明している。
ここで我々はｃＤＮＡバンクからこのイースト挿入物を
単離したことを確認しておく。サッカロミセスセレビシ
エ(Saccharomyces cerevisiae)で知られているほとんど
全ての遺伝子はイントロンを含んでおらず、したがって
我々は中性トレハラーゼ遺伝子も分断されていないと考
えた。この場合単離したｃＤＮＡクローンは対応するゲ
ノム遺伝子と対応している。中性トレハラーゼ遺伝子が
イントロンを有していると考えられる場合もトレハラー
ゼ遺伝子を破壊するために従った方法が適用されよう。
【００４７】トランスホーメーション操作自体はヨーロ
ッパ特許出願ＥＰ−Ａ−３０６１０７に報告されている
ように行った。宿主としては２種類のサッカロミセスセ
レビシエ(Saccharomyces cerevisiae), サッカロミセス
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae), ２３７Ｎｇ株
（受理番号１５8.８６でＣＢＳに登録された）およびサ
ッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)Ｇ
ＲＤ１１−２１二倍体株（受理番号１５4.９１でＣＢＳ
に登録された）を用いた。トランスホーマントの選択に
はアミノグリコシドＧ４１８を利用した。
【００４８】これら２種のサッカロミセスセレビシエ(S
accharomyces cerevisiae)株をｐＴＲＥ１６Ｇ４１８−
２ｘＮsiＩでトランスホームした。各トランスホーメー
ションから１つのトランスホーマントを詳しく分析し
た。２３７ＮｇのトランスホーマントをＡp ＴＲＥ−di
s と略し、ＧＲＤ１１−２１株のトランスホーマントを
ＧｐＴＲＥ−dis と略した。
【００４９】これらのトランスホーマントのゲノムＤＮ
Ａのサウザンブロット分析で組込みが実際に中性トレハ
ラーゼ遺伝子で起こていることが確認された。両トラン
スホーマントにおいて１つの対立遺伝子がこのように破
壊された。両親は少なくとも二倍体なのでトランスホー
マントの少なくとも１つの対立遺伝子は未修正のままで
あることに注意せよ。
【００５０】いくつかの実験でトランスホーマント中の
中性トレハラーゼ遺伝子が実際に破壊されているという
結論を支持している（実施例５参照）。一連の実験で親
株ＡおよびそのトランスホーマントＡｐＴＲＥ−dis の
中性トレハラーゼ活性を測定した。これは次のように行
った。イーストを振盪フラスコ中ＹＥＰ−2.５％グルコ
ースまたはＹＥＰ−2.５％グリセロール、0.２％グルコ
ースで一晩増殖させた。中性トレハラーゼ活性は実施例
１で示したように測定した。活性測定値を第３表にまと
めた。中性トレハラーゼ活性は破壊した中性トレハラー
ゼ遺伝子を含むＡp ＴＲＥ−dis では有意に低下してい
ると結論し得る。またクローンラムダＴＲＥ16.1.1に単
離したイースト挿入物は中性トレハラーゼをコードする
遺伝子の一部を含むと結論した。
【００５１】 第 ３ 表 ─────────────────────────────────── Ａ株およびそのトランスホーマント ApTRE-dis の中性トレハラーゼ活性 （mU/mg 無細胞たんぱく質） ─────────────────────────────────── 株 Ｃ源 グルコース グリセリン＋グルコース ─────────────────────────────────── Ａ ２6.１ ２7.７ ＡｐＴＲＥ−dis １2.２ １4.７ ─────────────────────────────────── 上述の実施例は中性トレハラーゼのレベルを修正し得る
可能性を示している。別の方法も使用できる。いくつか
の方法を以下に示す。
【００５２】単離したファージクローンのイースト挿入
物は遺伝子破壊実験を用うのに適している。これは以下
のように行った。そのようなイースト配列の中にイース
トのトランスホーメーションにおける選択マーカーとし
て機能し得る遺伝子を含むＤＮＡセグメントをクローン
化した。例としてはＵra３遺伝子（受容イースト宿主株
が ura３- 栄養要求性の場合）およびいわゆる優性選択
マーカーがある。後者はゲンタマイシン、ハイグロマイ
シンＢおよびフレオマイシンなどの抗生物質またはスル
オメツロンメチルなどの除草剤に対する耐性を与える。
例としてはゲンタマイシンに対する耐性を与え、かつS.
セレビシエ(cerevisiae)プロモーターのコントロール下
で発現するＧ４１８遺伝子（例としてＥＰ０３０６１０
７参照）およびスルホメツロンメチル耐性を与えるS.セ
レビシエ(cerevisiae)のＳＭＲ１−４１０（カセイ(Cas
ey)G.,キシャオ(Xiao) W. およびランク(Rank)G.H., J.
Inst. Brew. １９８８，９４，９３−９７）がある。こ
のようにして選択マーカーＤＮＡにより妨害を受けた破
壊トレハラーゼ遺伝子を含むプラスミドが構築できる
（上記参照）。このようなカセットをベクターバックボ
ーンから解放し、イーストについて詳しく報告されてい
る遺伝子トランスプレースメント実験で使用できる（ロ
スシュタイン(Rothstein), R.J. 上述）。このようにし
てトレハラーゼ遺伝子を破壊でき、より低いトレハラー
ゼ活性とそれによるより高いトレハロース含量が達成で
きる。宿主株がいくつかのトレハラーゼ遺伝子を含む場
合遺伝子トランスプレースメント操作を数回反復し得る
と理解できよう（たとえば種々の選択マーカーを用い
て）。このような修正遺伝子は遺伝子トランスプレース
メント技術を用いてイーストゲノムに組込み得る。プロ
ーブとしてイースト挿入物16.1.1を用いサッカロミセス
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のゲノムライブ
ラリーをスクリーニングできる。最終的にこのことは全
中性トレハラーゼ遺伝子およびその隣接配列（プロモー
ター／ターミネーター領域）を含むクローンの単離を可
能にする。それから標準的方法を用い中性トレハラーゼ
プロモーターを種々のプロモーター好ましくは相同的プ
ロモーターと置換し得る。このように修正した遺伝子は
遺伝子置換技術を用いてゲノムに組込み得る（ロスシュ
タイン(Rothstein) R.J.上述）。このことで最終的にト
レハラーゼレベルが低くなるように中性トレハラーゼの
発現を変化させることができる。標準的方法を用いてこ
の遺伝子を変異させ、それがリン酸化を受けないような
中性トレハラーゼをコードするようにできる。
【００５３】以上にリストした方法が全てではないこと
は理解されよう。
【００５４】
【実施例５】 連続培養で測定したＡ株およびＡｐＴＲＥ−dis 株のト
レハラーゼ活性レベル 中性トレハラーゼ活性は細胞の増殖速度によって調節さ
れていると考えられるので中性トレハラーゼ遺伝子の破
壊の効果を２種の増殖速度について測定した。同一条件
で親株および破壊変異体を比較するため連続培養中定常
状態で増殖する細胞の中性トレハラーゼ活性を測定し
た。
【００５５】Ａ株およびＡｐＴＲＥ−dis 株を２リット
ルスケールでアプリコンファーメンター（アプリコンデ
ィペンダブルインスツルメント、シーダム、オランダ）
中２４時間バッチ培養した。培地および培養条件は基本
的にE.ポストマ (Postma), W.A. シェファーズ（Scheff
ers), J.P.ヴァンジケン（Van Dijken) （（１９８９）
イースト５，１５９−１６５）によって報告されている
ものを使用した。
【００５６】0.０６ｈ-1の希釈率で培地供給し始めてか
ら６５時間で培養が定常状態に到達し、さらに１日間定
常状態が維持された。その日にサンプルを採取した。そ
れから培地供給を0.１５ｈ-1の希釈率となるよう増加し
た。４８時間後定常状態に到達しそこでサンプルを採取
した。第４表に示されているように中性トレハラーゼ活
性は明らかに増殖速度に依存している。親株および破壊
変異体の両方ともＤ＝0.０６ｈ-1ではより高い活性を示
した。両希釈率で破壊変異体の中性トレハラーゼ活性は
親株の活性の約半分であった。これは増殖速度とは独立
に中性トレハラーゼ活性の減少がおおむね遺伝子コピー
数に対応していることを示している。
【００５７】 第 ４ 表 ──────────────────────── Ｄ（ｈ-1) トレハラーゼ活性(U/g−乾燥重量） ──────────────────────── Ａ ApTRE-dis ──────────────────────── 0.06 11.6 4.8 0.15 7.9 3.3 ────────────────────────
【００５８】
【実施例６】 製パン用イーストのトレハラーゼ破壊変異体のトレハロ
ース含量 定常期における細胞のトレハロース含量に関する中性ト
レハラーゼをコードする遺伝子のコピーの破壊の効果を
測定するため以下の実験を行った。Ａ，Ｇ，ＡｐＴＲＥ
−dis およびＧｐＴＲＥ−dis 株を５％グルコースを含
むＹＥＰ培地を入れた５００ｍl 振盪フラスコ（各２
本）で一晩増殖させた。定常期の細胞を収穫し、集菌し
てからｔ＝０分として0.５％グルコースを含む新鮮なＹ
ＥＰ培地７０ｍl に懸濁した。７時間半が経過するまで
９０分毎にサンプルを採取した。
【００５９】細胞のトレハロース含量は以下のようにＨ
ＰＬＣで測定した。発酵サンプルを濾過し、洗浄後煮沸
した。大きい細胞断片を除去するための遠心後上清を直
接バイオラドアミネックスＨＰＸ８７−Ｈカラムに注入
した。カラム温度は６５℃とし、溶出は0.０１Ｎ H2SO4
で行った。トレハロース含量は屈折率計およひインテグ
レーターを用いて定量した。
【００６０】無細胞抽出物を透析しないこと以外は実施
例１に従がい無細胞抽出物を調製した。無細胞抽出物中
のトレハラーゼレベルは実施例１に従って測定した。第
５表は全ての時点で親株および破壊株のトレハロースレ
ベルに明確な差があることを示している。Ａ株は最初よ
り高いトレハロース含量を有しているがこれはこの実験
条件下でＧ株の初期のより低いトレハロースレベルより
も安定性が低い。
【００６１】Ｇ株の中性トレハラーゼ活性はＡ株の活性
に比べて明らかに低い（第５表）。さらにＡｐＴＲＥ−
dis およびＧｐＴＲＥ−dis 両株ではそのトレハラーゼ
活性は親株よりも低かった（第５表）。中性トレハラー
ゼコードする構造遺伝子を破壊することで中性トレハラ
ーゼ活性を低下させることにより高いトレハロース含量
のイーストを入手し得る。このイーストは工業的用途に
非常に有用であると考える。
【００６２】 第 ５ 表 ─────────────────────────────────── 時間 トレハロース(%,w/w) トレハラーゼ(U/g乾燥重量） ────────────────────────────────── A ApTRE-dis G GpTRE-dis A ApTRE-dis G GpTRE-dis ────────────────────────────────── ０ 5.7 7.9 2.6 3.5 4.4 3.0 1.3 0.2 11/2 3.7 6.0 2.7 3.6 5.5 3.2 1.3 0.9 3 2.1 5.3 2.7 3.3 3.9 3.8 1.5 1.4 41/2 1.2 3.1 2.6 3.5 5.3 4.8 2.1 1.6 6 0.6 2.8 3.1 4.0 5.0 5.0 2.0 1.6 71/2 0.1 2.5 3.2 4.3 5.4 4.6 2.7 2.0 ─────────────────────────────────── （データは２回の実験の平均値である。）
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＴＲＥ１６Ｇ４１８−２の構造を
示す図である。矢印は転写の方向を示している。16.1.1
セグメントの方向は未だ分っていない。図中、Ｇ４１８
−res 、Ｇ４１８に対する耐性を提供するＴn ５；ＡＤ
Ｈプロモーター、Ｇ４１８−res に結合するＡＤＨＩ遺
伝子のサッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cere
visiae) プロモーター；ｆ１ori 、ファージｆ１の複製
オリジン；amp Ｒアンピシリン耐性遺伝子；16.1.1、中
性トレハラーゼ遺伝子の一部を含むラムダＴＲＥ16.1.1
に存在するようなイースト挿入物；さらに関連する制限
酵素が示されている。16.1.1の境界にある２つのＥcoＲ
Ｉ部位はサッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae) ゲノム中の対応する位置に必ずしも存在して
いない。これらの部位の少なくとも１つはラムダgt１１
ｃＤＮＡの構築に由来している。内側の円における長さ
は塩基対で示されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/56 15/81 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/18 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 クラース アンヌ オッシンハー オランダ国 2253テーセー フォールショ ッテン ファン デル レインプラントス ーン ３ (72)発明者 マルガレータ アドリアナ ヘルヴェイェ ール オランダ国 1018ヴェーヘー アムステル ダムニウ ケイゼルスグラヒト 464

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 中性トレハラーゼまたはトレハロース−
    ６−ホスフェートシンテースをコードする野生型遺伝子
    とは異なるように修正した中性トレハラーゼまたはトレ
    ハロース−６−ホスフェートシンテースをコードする遺
    伝子を少なくとも１個を含む形質転換イーストであっ
    て、非形質転換親株イーストとはトレハロース含量が異
    なるイースト。
  2. 【請求項２】 非形質転換親株イーストと比べてトレハ
    ロース含量が高い請求項１記載の形質転換イースト。
  3. 【請求項３】 前記中性トレハラーゼをコードする少な
    くとも１個の遺伝子を遺伝子の破壊により修正した請求
    項１または２記載の形質転換イースト。
  4. 【請求項４】 中性トレハラーゼをコードする遺伝子の
    発現を誘導可能なプロモーターにより修正した請求項１
    または２記載の形質転換イースト。
  5. 【請求項５】 前記中性トレハラーゼをコードする少な
    くとも１個の遺伝子をトレハラーゼのリン酸化部位で変
    化するように修正した請求項１または２記載の形質転換
    イースト。
  6. 【請求項６】 トレハロース合成の際、トレハロース分
    解に関し前記修正した少なくとも１個の遺伝子が対応す
    る野生型遺伝子より活性の低い請求項１乃至５のいずれ
    か１項記載の形質転換イースト。
  7. 【請求項７】 ＤＮＡ仲介トランスホーメーション以外
    の請求項１乃至６のいずれか１項記載のイーストを用い
    る株改良操作で入手可能なイースト。
  8. 【請求項８】 前記イーストがサッカロミセス属に属す
    る請求項１乃至７のいずれか１項記載のイースト。
  9. 【請求項９】 請求項１乃至８のいずれか１項記載のイ
    ーストから入手可能なクリーム状、圧縮化、凍結化、活
    性乾燥または急速乾燥イースト。
  10. 【請求項１０】 請求項１乃至９のいずれか１項記載の
    イーストを含む生パンまたは同様の産物。
  11. 【請求項１１】 非形質転換イーストとはトレハロース
    含量が異なる形質転換イーストの製造法で、中性トレハ
    ラーゼおよび、またはトレハロース−６−ホスフェート
    シンテースをコードする野生型遺伝子とは異なるように
    中性トレハラーゼおよび、またはトレハロース−６−ホ
    スフェートシンテースをコードする少なくとも１個の遺
    伝子を修正することを含む方法。
  12. 【請求項１２】 前記イーストがサッカロミセス属に属
    する請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記イーストがサッカロミセスセレビ
    シエに属する請求項８記載のイーストまたは請求項１２
    記載の方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１乃至９のいずれか１項記載の
    形質転換イーストを用いることを含む生パンまたは同様
    の産物の製造法。
  15. 【請求項１５】 請求項１乃至８のいずれか１項記載の
    イーストを用いることを含むトレハロースの製造法。
  16. 【請求項１６】 中性トレハラーゼまたはトレハロース
    −６−ホスフェートシンテースをコードする精製単離し
    た遺伝子。
  17. 【請求項１７】 中性トレハラーゼをコードする遺伝子
    または該遺伝子の一部で、 i) プラスミドｐＴＲＥ１6.1.１（ＣＢＳ１１5.９１）
    中のＤＮＡ挿入物１6.1.１、 ii) ストリンジェント条件下ｉ）のＤＮＡにハイブリ
    ダイズし得るＤＮＡ、 iii) 遺伝子コード縮退によりコドン配列がi)およびi
    i) のＤＮＡとは異なるＤＮＡ 以上、i)、ii) およびiii)を含む精製単離した遺伝子部
    分。
  18. 【請求項１８】 中性トレハラーゼ遺伝子を含み、また
    場合によっては該遺伝子が対応する野生型遺伝子のもの
    より活性の低いトレハラーゼをコードするよう該中性ト
    レハラーゼ遺伝子を修正したものを含む組換えプラスミ
    ドまたはベクター。
  19. 【請求項１９】 トレハロース−６−ホスフェートシン
    テース遺伝子を含み、また場合によっては該遺伝子が対
    応する野生型遺伝子のものより活性の高いトレハロース
    −６−ホスフェートシンテースをコードするよう該トレ
    ハロース−６−ホスフェートシンテース遺伝子を修正し
    たものを含む組換えプラスミドまたはベクター。
  20. 【請求項２０】 請求項１８または１９記載のベクター
    でトランスホームした微生物。
  21. 【請求項２１】 イーストである請求項２０記載の微生
    物。
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