KR19990063278A - 리보플라빈 제조를 위한 단세포 또는 다세포 유기체 - Google Patents

리보플라빈 제조를 위한 단세포 또는 다세포 유기체 Download PDF

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KR19990063278A
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포르슝스첸트룸 율리히 게엠베하
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Abstract

본 발명은 생물공학적으로 리보플라빈을 제조하기 위한 단세포 또는 다세포 유기체, 특히 미생물에 관한 것이다. 상기 유기체의 특징은 이 유기체에 있어서 글리신을 외부에서 전혀 공급하지 않은 리보플라빈의 합성 배출량이 6 g/ℓ의 글리신이 외부에서 첨가된 표준 조건 하에서 배양한 야생형의 아쉬비아 고씨피이 종, 즉 ATCC10895의 배출량과 적어도 동일하도록 글리신 대사 작용이 변경되어 있다는 사실이다.

Description

리보플라빈 제조를 위한 단세포 또는 다세포 유기체
본 발명은 미생물을 사용한 리보플라빈의 제조를 위한 단세포 또는 다세포 유기체에 관한 것이다.
리보플라빈으로도 불리는 비타민 B2는 사람 및 동물에게 필수적이다. 구강 및 인두 점막의 염증, 구강 모서리의 균열 및 피부에 대한 다른 손상 중에서 피부 주름에서의 소양증 및 염증, 결막염, 시력 감퇴 및 각막 흐림이 비타민 B2의 결핍과 관련하여 나타난다. 유아 및 아동에 있어서 성장 정지 및 체중의 감소가 일어날 수 있다. 따라서 비타민 B2는 특히 비타민 결핍증과 관련된 비타민 제제로서, 그리고 사료 첨가제로서 경제적으로 중요하다. 상기 외에도, 비타민 B2는 예를 들어 마요네즈, 아이스크림, 블러만지 등에서 식료품 색소로서 또한 사용된다.
리보플라빈은 화학적으로 또는 미생물에 의해 제조된다. 화학적인 제조 방법에 있어서 리보플라빈은 일반적으로 다단계 방법으로 순수 최종 생성물로서 단리되지만, D-리보스와 같은 비교적 고가의 출발 화합물을 사용하여야 한다. 상기 이유 때문에 리보플라빈의 화학적 합성은 단지 순수 리보플라빈이 필요한 경우, 예를 들어 단지 사람 의약에 있어서 적당할 뿐이다.
리보플라빈을 화학적으로 제조하는 것에 대한 별법으로 상기 물질의 제조에 미생물을 사용한다. 미생물에 의한 리보플라빈 제조는 상기 물질이 고순도이지 않아도 되는 경우 특히 적당하다. 이것은 예를 들어 리보플라빈이 사료 제품에 첨가제로서 사용되는 경우이다. 상기와 같은 경우 리보플라빈의 미생물에 의한 제조의 잇점은 리보플라빈을 일단계 방법으로 얻을 수 있다는 것이다. 또한 식물유와 같은 재생가능한 원료를 미생물에 의한 합성을 위한 출발 화합물로서 사용할 수 있다.
아쉬비아 고씨피이 (Ashbya gossypii) 또는 에레모테시움 아쉬비이 (Eremothecium ashbyi)와 같은 진균류를 발효시킴으로써 리보플라빈을 제조하는 것이 공지되어 있지만 (Merck Co.의 [The Merck Index, 1183페이지, 1983년], 윈드홀츠 (Windholz) 등 편찬; 배쳐 (A. Bacher), 린겐스 (F. Lingens)의 문헌 [Augen. Chem. 1969, 393페이지] 참조), 칸디다 (Candida) 또는 사카로마이세스 (Saccharomyces)와 같은 효모, 및 클로스트리듐 (Clostridium)과 같은 박테리아도 또한 리보플라빈의 제조에 적당하다.
효모인 칸디다 파마타 (Candida famata)를 사용하는 방법도 또한 미국 특허 제05231007호에 기술되어 있다.
리보플라빈을 과다생산하는 박테리아 균주는 예를 들어 유럽 특허 제405370호, 영국 특허 제1434299호, 독일 특허 제3420310호 및 유럽 특허 제0821063호에 기술되어 있는데, 이 균주는 바실러스 서틸리스 (Bacillus subtilis)의 리보플라빈 생합성 유전자로 형질전환시킴으로써 얻어졌다. 그러나 상기 원핵생물 유전자는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 아쉬비아 고씨피이와 같은 진핵생물을 사용하는 리보플라빈의 재조합적 제조 방법에는 부적당하였다. 상기와 같은 이유 때문에 국제 특허 출원 공개 공보 제WO 93/03183호에 기술되어 있는 바와 같이 리보플라빈 생합성을 위한 특정 유전자는 진핵생물, 즉 사카로마이세스 세레비지애로부터 단리함으로써 진핵생물인 생산 유기체에서의 리보플라빈의 제조를 위한 재조합적 방법을 제공하였다. 그러나 상기 성질의 재조합적 제조 방법에서는 리보플라빈 생합성에 구체적으로 관련된 효소의 기질이 불충분하게 공급될 경우 리보플라빈을 생산하는데 있어서 성공적이지 못하거나 또는 단지 제한적으로 성공적일 뿐이다.
1967년에 한슨 (Hanson AM, 1967년, [Microbial Technology, Peppler, HJ, 222 내지 250 페이지, 미국 뉴욕])은 아쉬비아 고씨피이에서 아미노산인 글리신을 첨가하면 리보플라빈의 형성이 증가된다는 것을 알아내었다. 그러나 상기와 같은 방법은 글리신이 매우 고가의 원료이기 때문에 불리하다. 상기 이유 때문에 돌연변이체를 제조하여 리보플라빈 생산을 최적화하려는 노력이 있어왔다.
독일 특허 제19525281호에는 이소시트레이트 리아제에 대해 억제 효과를 갖는 물질에 대해 내성을 갖는 미생물을 배양하는 것을 포함하는 리보플라빈의 제조 방법이 공개되어 있다.
독일 특허 공개 공보 제19545468.5-41호에는 이소시트레이트 리아제 활성 또는 리보플라빈 생산 미생물의 이소시트레이트 리아제 유전자의 발현이 증가된 미생물에 의한 리보플라빈의 다른 제조 방법이 공개되어 있다. 그러나 심지어 상기 방법들과 비교해 볼 때도 리보플라빈 제법을 더 최적화할 필요성이 여전히 존재한다.
따라서 본 발명의 목적은 리보플라빈의 생물공학적 제조에 이용할 수 있는 단세포 또는 다세포 유기체, 바람직하게는 리보플라빈의 형성을 더 최적화시킬 수 있는 미생물을 제조하는 것이다. 특히, 리보플라빈을 제조하는데 적당하고 동시에 원료가 절약되고 그 결과로서 당 업계의 종래 기술보다 더 경제적인 생산을 가능하게 하는 유기체가 입수가능하여야 한다. 특히 이 유기체는 이전의 유기체와 비교하여 글리신을 전혀 첨가하지 않고도 리보플라빈의 형성이 증가되게 해야 한다.
도 1은 탄소원으로서 10 g/ℓ의 대두유를 함유하는 완전배지 상에서 배양한 후 6 g/ℓ의 글리신의 존재하에 또는 부재하에서의 아쉬비아 고씨피이 균주인 ATCC 10895 (야생형, WT) 및 AMPS-내성 돌연변이체인 AMPS-MN-01에 의한 리보플라빈의 형성률을 나타낸다. 측정치는 3회의 독립적인 실험으로부터 얻어졌다.
도 2a는 아쉬비아 고씨피이 게놈에서의 Gly1 유전자좌를 나타낸다. GB 7-1 및 GB 26-9 클론과, 또한 3.7 kb의 Hind III 서브클론인 GB-26-9-6는 에스. 세레비지애 돌연변이체를 상보한다. GB-26-9-6은 완전히 서열결정한 반면 GB-7-1은 GLY1의 C 말단을 완성하기 위하여 서열결정하였다.
도 2ba 및 2bb는 에이. 고씨피이의 GLY1 유전자의 뉴클레오티드 서열, 및 추정 아미노산 서열을 플랭킹 뉴클레오티드 서열과 함께 나타낸다.
도 3은 에이. 고씨피이에서 GLY1 유전자를 과다발현시키기 위한 pAG203GLY1 벡터 작제물의 개략도이다.
도 4는 10 g/ℓ의 대두유를 함유하는 완전 배지에서 배양할 경우 성장률, 리보플라빈 형성량 및 트레오닌 알돌라제의 비활성의 면에서 아쉬비아 고씨피이 야생형 (폐쇄 기호)과 A.g.pAG203GLY1 (개봉 기호)를 비교한 것이다.
도 5는 탄소원으로서 10 g/ℓ의 글루코스를 함유하는 YE 완전 배지에서 배양할 경우 아쉬비아 고씨피이 균주인 ATCC 10895 (야생형), pAG203 및 pAG203GLY1의 글리신 또는 트레오닌 보충과 관련한 성장률 및 리보플라빈 형성률을 나타낸다. 표는 배양 전과 배양 후 각각의 경우에 있어서 배지 중의 글리신 및 트레오닌 농도를 나타낸다. 나타낸 평균값 및 표준 편차는 3회의 독립적인 실험으로부터의 결과를 나타낸다.
도 6은 탄소원으로서 10 g/ℓ의 글루코스를 함유하는 완전 배지에서 배양할 경우 아쉬비아 고씨피이 균주인 ATCC 10895 (야생형), pAG203 및 pAG203GLY1의 글리신 또는 트레오닌 보충과 관련한 성장률 및 리보플라빈 형성률을 나타낸다. 표는 배양 전과 배양 후 각각의 경우에 있어서 배지 중의 글리신 및 트레오닌 농도를 나타낸다. 나타낸 평균값 및 표준 편차는 3회의 독립적인 실험으로부터의 결과를 나타낸다.
도 7은 10 g/ℓ의 대두유를 함유하는 완전 배지 상에서 배양할 경우 성장률, 리보플라빈 형성률 및 트레오닌 알돌라제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 및 글루타메이트 글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제의 비활성 면에서 아쉬비아 고씨피이 야생형 (폐쇄 기호) 및 AMPS-내성 돌연변이체 AMPS-NM-01을 비교한 것이다. 측정치는 3회의 독립적인 실험으로부터 얻어졌다.
도 8은 2.5 g/ℓ의 글루코스 및 2.5 mM의 β-히드록시노르발린을 함유하는 최소 배지로 충전된 아가 플레이트 상에서의 아쉬비아 고씨피이; 야생형 (W) 및 HNV-TB-25 (H)의 성장에 대한 β-히드록시노르발린의 효과를 나타낸다.
상기 목적은 글리신이 외부에서 전혀 공급되지 않고 합성된 리보플라빈의 배출량이 외부 글리신을 6 g/ℓ로 첨가한 표준 조건 하에서 배양된 야생형 아쉬비아 고씨피이 종인 ATCC10895와 적어도 동일하도록 변경시킨 글리신 대사 작용을 나타내는 단세포 또는 다세포 유기체에 의해 성취된다.
표준 조건 하에서 배양한다는 것은 2개의 격벽을 포함하는 500 ml의 진탕 플라스크에서 30℃ 및 120 rpm에서 배양하는 것을 의미한다. 배지로서 플라스크 당 10 g/ℓ의 글루코스 또는 10 g/ℓ의 대두유를 함유하는 10 g/ℓ의 효모 추출물의 용액 50 ml를 사용한다. 이 배지에 동일 조건 하에서 16시간 동안 배양한 배양물 1%를 접종한다. 글리신의 세포내 대사 작용을 변경시키려는 상기 목적은 유기체 균주를 개선하기 위한 공지된 방법을 사용하여 성취될 수 있다. 이것은 가장 간단한 경우에 미생물학에서 일반적인 선발 후의 스크리닝 방법으로 적절한 균주를 제조할 수 있다는 것을 의미한다. 상기의 경우 돌연변이는 화학적 돌연변이 유발 또는 물리적 돌연변이 유발 방법으로 수행될 수 있다. 다른 방법은 선발 및 돌연변이와 함께 그 이후의 재조합에 의한 것이다. 마지막으로 본 발명에 따른 유기체는 유전자 조작법으로 제조될 수 있다.
본 발명에 따라 유기체는 그의 대사 작용을 유지하는데 필요한 것 이상의 양으로 글리신을 세포내에서 생산하도록 변경된다. 본 발명에 따라 세포내 글리신 생성에 있어서의 상기 증가는 트레오닌 알돌라제 효소의 활성이 증가된 유기체를 제조함으로서 성취될 수 있다. 이것은 예를 들어 촉매 중심을 변경시킴으로써 기질 턴오버 (turnover)를 증가시키거나 효소 억제제의 효과를 없앰으로써 성취될 수 있다. 트레오닌 알돌라제 효소의 활성의 증가는 또한 효소의 합성을 증가시킴으로써, 예를 들어 유전자 증폭 방법에 의해 또는 효소의 생합성을 억제하는 인자들을 제거함으로써 유도될 수 있다.
본 발명에 따라 내생 트레오닌 알돌라제 활성은 바람직하게는 내생 트레오닌 알돌라제 유전자를 돌연변이시킴으로써 증가시킬 수 있다. 상기와 같은 돌연변이는 UV 조사 또는 돌연변이 유발 화학 물질을 사용하는 것과 같은 전통적인 방법으로 랜덤하게 일어나게 하거나, 또는 결실, 삽입 및(또는) 뉴클레오티드 교환과 같은 유전공학적 방법을 사용하여 표적화된 방식으로 일어나게 할 수 있다.
트레오닌 알돌라제 유전자의 발현의 증가는 트레오닌 알돌라제 유전자의 카피들을 결합시키고(시키거나) 트레오닌 알돌라제 유전자의 발현에 긍정적인 효과를 미치는 조절 인자들을 증강시킴으로써 성취될 수 있다. 예를 들어 조절 요소는 특히 전사 신호를 증가시킴으로써 전사 수준에서 우선적으로 증강시킬 수 있다. 그러나 상기 외에도 예를 들어 mRNA의 안정성을 향상시킴으로써 번역을 증강시킬 수도 있다.
유전자 카피 수를 증가시키기 위하여 트레오닌 알돌라제 유전자를 예를 들어 유전자 작제물 또는 바람직하게는 트레오닌 알돌라제 유전자에 할당된 조절 유전자 서열, 특히 유전자 발현을 증강시키는 서열을 포함하는 벡터 내로 결합시킬 수 있다. 이어서 리보플라빈 생산 미생물은 트레오닌 알돌라제 유전자를 포함하는 유전자 작제물로 형질전환시킨다.
본 발명에 따라 트레오닌 알돌라제는 프로모터를 교환함으로써 또한 과다발현시킬 수 있다. 이 경우 별법으로 유전자 카피를 결합시키거나 또는 프로모터를 교환함으로써 효소 활성을 더 증가시킬 수도 있다. 그러나 그와 동시에 프로모터를 교환하는 동시에 유전자 카피를 결합시킴으로써 효소 활성을 원하는 만큼 변경시킬 수도 있다.
상기 방식으로 변경된 유기체에 있어서 트레오닌이 제한되기 때문에, 본 발명에 따른 세포를 사용할 경우 트레오닌을 공급할 필요가 있다. 트레오닌의 흡수 향상 및 그의 실질적인 글리신으로의 양적 전환 때문에 리보플라빈 형성이 놀랍게도 크게 증가하였는데, 이는 글리신의 공급에 의해서는 이전에 성취할 수 없었다. 별법으로 유기체에서의 내생 트레오닌 형성은 예를 들어 아스파르테이트 키나제의 피드백 (feedback) 내성을 제거함으로써 증가시킬 수 있다.
트레오닌 알돌라제 유전자는 바람직하게는 미생물, 특히 바람직하게는 진균류로부터 단리된다. 아쉬비아 속의 진균류가 상기 관점에 있어서 또한 바람직하다. 아쉬비아 고씨피이 종이 매우 바람직하다.
그러나 그의 세포 (동물 세포 및 식물 세포)가 트레오닌 알돌라제를 형성하기 위한 서열을 포함하는 모든 다른 유기체가 또한 이 유전자를 단리시키는데 적당하다. 이 유전자는 트레오닌 알돌라제 유전자에 결함이 있는 돌연변이체의 동종 또는 이종 상보에 의해, 또는 이종성 프라이머를 사용한 이종 프로빙에 의해 또는 PCR에 의해 단리될 수 있다. 서브클로닝을 위하여 상보 플라스미드의 인서트의 크기는 이후 적당한 제한효소 단계에 의해 최소로 감소시킬 수 있다. 추정 유전자를 서열결정 및 동정한 후 정확한 피트를 부여하는 서브클로닝은 융합 PCR 방법으로 달성된다. 생성된 프래그먼트를 인서트로서 포함하는 플라스미드를 트레오닌 알돌라제 유전자 결함 돌연변이체에 도입하고 이어서 트레오닌 알돌라제 유전자의 기능에 대하여 시험한다. 최종적으로 기능적 작제물을 사용하여 리보플라빈 생산자를 형질전환시킨다.
트레오닌 알돌라제 유전자는 단리 및 서열결정 후에 주어진 아미노산 서열 또는 그의 대립유전자 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 얻어질 수 있다. 대립유전자 변이체는 특히 적절한 서열로부터 뉴클레오티드가 결실, 삽입 또는 치환되어 얻어졌지만 그와 동시에 트레오닌 알돌라제 활성은 유지하는 유도체를 포함한다. 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 1149에 해당하는 서열을 도 2ba 및 2bb에 나타낸다.
상기 서열에 나타낸 뉴클레오티드 -1231 내지 뉴클레오티드 -1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터, 또는 본질적으로 동일한 효과를 갖는 DNA 서열은 특히 트레오닌 알돌라제 유전자의 상향에 위치한다. 따라서 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로모터에 있어서 1개 이상의 뉴클레오티드 치환, 삽입 및(또는) 결실에 의해 다르지만 프로모터의 기능 또는 활성은 손상되지 않은 프로모터는 예를 들어 유전자의 상향에 위치할 수 있다. 또한 프로모터의 활성은 그의 서열을 변경시킴으로써 증가시킬 수 있거나, 또는 프로모터를 활성 프로모터로 완전히 대체시킬 수 있다.
또한 특히 트레오닌 알돌라제 유전자의 활성을 증가시키는 조절 유전자 서열 또는 조절 유전자가 트레오닌 알돌라제 유전자에 할당될 수 있다. 따라서 RNA 폴리머라제와 DNA 사이의 상호작용을 향상시킴으로써 트레오닌 알돌라제 유전자의 발현을 증가시키는 인핸서를 예를 들어 트레오닌 알돌라제 유전자에 할당할 수 있다.
상향 프로모터를 포함하거나 포함하지 않거나 또는 조절 유전자를 포함하거나 포함하지 않는 트레오닌 알돌라제 유전자가 유전자 구조물 내에 포함되도록 트레오닌 알돌라제 유전자의 상향 및(또는) 하향에는 하나 이상의 DNA 서열이 위치할 수 있다. 트레오닌 알돌라제 유전자를 포함하고 리보플라빈 생산자를 형질전환시키는데 적당한 플라스미드 또는 벡터는 트레오닌 알돌라제 유전자를 클로닝함으로써 얻어질 수 있다. 형질전환에 의해 얻어질 수 있는 세포는 복제가능한 형태의 유전자, 즉 동종 재조합 방법에 의해 게놈 내의 임의의 부위에 통합되는 추가의 유전자 카피를 염색체 내에 포함한다.
본 발명에 따라 글리신의 부분적 또는 완전한 세포내 형성의 목적은 또한 글리신의 세포내 분해가 적어도 부분적으로 차단된 유기체를 제조함으로써 성취될 수 있다. 상기 성질의 돌연변이는 이미 상기한 바와 같이 물리적 또는 화학적 돌연변이유발, 예를 들어 UV 조사 또는 돌연변이 유발 화학물질을 사용하는 전통적인 방법에 의해 랜덤한 방식으로, 또는 유전 공학적 방법에 의한 표적화된 방식으로 만들어질 수 있다.
본 발명에 따라 글리신의 세포내 형성 증가의 목적은 바람직하게는 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 유전자를 변경시킴으로써 성취될 수 있다. 상기와 같은 변경은 예를 들어 구조 유전자 또는 상기 유전자와 결합된 조절 요소, 예를 들어 프로모터 및 전사 인자에서 삽입, 결실 또는 치환과 같은 돌연변이에 의해 성취될 수 있다.
본 발명에 따라 놀랍게도 상기 돌연변이체가 글리신 대사길항 물질에 내성을 갖는 돌연변이체를 포함한다는 것이 관찰되었다. 바람직한 글리신 대사길항 물질 내성 돌연변이체는 알파-아미노메틸포스폰산 및(또는) 알파-아미노술폰산에 대해 내성을 갖는 단세포 또는 다세포 유기체이다.
이것은 예를 들어 트레오닌의 구조적 유사체인 β-히드록시노르발린에 의해 대체되고(되거나) 트레오닌에서 치환되고(되거나) 리신 유사체에 의해 치환된 돌연변이체를 선발함으로써 정확하게 동일한 방법으로 성취될 수 있다.
따라서 본 발명에 따라 사용될 수 있는 돌연변이체는 적절한 선발에 의해 또한 제조될 수 있다. 따라서 상기와 같은 내성 단세포 또는 다세포 유기체는 미생물학에서 일반적으로 사용되는 전통적인 스크리닝 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
상기 유기체에 있어서 리보플라빈 생산량은 세포내에서 형성된 글리신이 배지 내로 배출되는 것이 적어도 부분적으로 차단된다면 더 증가될 수 있다. 가장 간단한 경우 이것을 성취하기 위하여 글리신을 보충하면 충분하다. 별법으로 배출을 담당하는 캐리어는 이 유전자를 파괴시킴으로써 작동하지 않게 할 수 있다.
또한 세포내 글리신 농도는 글리옥실레이트 대사 작용을 변경시킴으로써, 예를 들어 글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제의 활성을 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다. 다른 방법은 이산화탄소 및 암모니아로부터의 세포내 글리신의 합성을 최적화하는 것이다.
요약하면 본 발명에 따른 목적은 바람직하게는 글리신의 세포내 합성을 증가시키고, 적어도 부분적으로 글리신의 분해를 차단하고, 적어도 부분적으로 글리신의 세포 외부로의 수송을 억제하고, 글리옥실레이트 대사 작용을 변경시키고 암모니아 및 이산화탄소로부터의 글리신 합성을 최적화함으로써 해결될 수 있다. 상기 해법들은 별법으로, 또는 점증적으로 또는 임의로 조합되어 사용될 수 있다.
리보플라빈 형성은 글리신을 영양 배지에 첨가함으로써 추가로 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따라 얻어지는 단세포 또는 다세포 유기체는 생물공학적 방법에 사용될 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 상기 세포의 예로는 진균류, 효모류, 박테리아류 및 식물 세포와 동물 세포가 있다. 본 발명에 따라 이 세포는 바람직하게는 형질전환된 진균류 세포이고 특히 바람직하게는 아쉬비아 속의 진균류 세포이다. 아쉬비아 고씨피이 종이 상기 관점에 있어서 특히 바람직하다.
이하에서 본 발명은 실시예에 의해 더 상세하게 설명될 것이지만 실시예의 사항들에 의해 제한받는 것은 전혀 아니다.
실시예 1
알파-아미노메틸포스폰산 (AMPS)에 대해 내성을 갖는 돌연변이체의 선발
아쉬비아 고씨피이의 포자에 UV 광을 사용하여 돌연변이를 유발하였다. 이어서 이 포자를 70 mM의 알파-아미노메틸포스핀산으로 처리한 플레이트에 첨가하였다. 리보플라빈 형성의 억제는 억제되지 않을 경우 황색 콜로니를 형성하고 억제될 경우 백색 콜로니를 형성하는 진균류에 의해 인지될 수 있다. 따라서 황색 유기체, 즉 억제제에 대해 내성을 갖는 유기체를 단리하였다. 상기 방법을 사용하여 그 중에서도 내성 균주인 AMPS-NM-01을 수득하였다.
200 mM의 AMPS를 함유하는 플레이트 상에서 수행된 실험에 의해 완전히 백색으로 남아있는 출발 균주와는 대조적으로 상기 균주가 여전히 황색의 콜로니를 나타낸다는 것이 증명되었다. 함침 배양에 있어서, 돌연변이체는 글리신의 존재하에 야생형이 리보플라빈을 형성하는 것과 마찬가지로 글리신의 부재 하에 리보플라빈을 형성하였다 (도 1 참조). 야생형 및 돌연변이체의 효소의 비활성을 조사해 보았더니 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성이 50% 감소되었음이 나타났다 (도 7).13C-표지 트레오닌을 공급함으로써 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제에 의해 아마도 촉매되는 세린의 형성이 글리신으로부터 일어난다는 것을 증명할 수 있기 때문에 (표 1) 리보플라빈 형성에서의 증가가 세린을 형성하는데 소모된 글리신 양의 감소에 의해 설명될 수 있다.
표 1에서 사용된 최소 배지의 조성은 하기와 같다.
용액 A (100배) KH2PO4(KOH로 pH를 6.7로 맞춤) 200 g/ℓ
용액 B (10배) NH4Cl 15 g/ℓ
아스파라긴 5 g/ℓ
NaCl 2 g/ℓ
MgSO4x 7H2O 4 g/ℓ
MnSO4x H2O 0.5 g/ℓ
ClCl2x 2H2O 0.4 g/ℓ
미오이노시톨 1.0 g/ℓ
니코틴아미드 2.5 g/ℓ
효모 추출물 2 g/ℓ
탄소원 글루코스 또는 대두유 2.5 g/ℓ
배지를 제조하기 위하여 탄소원을 1배 농축된 용액 B에 첨가하였고 이 혼합물을 오토클레이브 (autoclave)하여 살균시켰다. 배지를 냉각시킨 후 1/100 부피의 별도로 오토클레이브한 용액 A를 첨가하였다.
실시예 2
아쉬비아 고씨피이의 GLY1 유전자의 단리
트레오닌 알돌라제 유전자를 단리하기 위하여 글리신 영양요구성의 사카로마이세스 세레비지애 돌연변이체인 YM 13F (SHM1 : : HIS3 shm2 : : LEU2 gly1 : : URA3)을 플루오로오로틴산에 대한 내성에 대하여 선발한 후 아쉬비아 고씨피이의 유전자 라이브러리로 형질전환시켰다. 이 유전자 라이브러리는 Sau3A로 부분 절단되고 밀도 구배 원심분리로 크기가 8 내지 16 kb인 프래그먼트를 단리시키고 BamHI 절단 벡터 Yep352 내로 라이게이션시킨 게놈 DNA로 이루어졌다. 형질전환체는 무엇보다도 우선 우라실 야생영양체에 대하여 선발하였다. 글리신 야생영양체에 대한 선발은 평판 반복법 (replica plating) 후 제2 단계에서 수행하였다. 25개의 글리신 야생영양성 클론을 약 70,000개의 우라실 야생영양성 클론으로부터 단리하였다. 형질전환체의 큐어링 (curing) 및 단리된 플라스미드를 사용한 재형질전환에서 상보성이 플라스미드에 코딩되어 있다는 것이 증명되었다. 글리신 영양요구성의 사카로마이세스 균주에서는 측정가능한 트레오닌 알돌라제 활성이 없었던 반면 (단백질 mg 당 0.1 mU) 단리된 유전자 라이브러리 플라스미드로 형질전환시킨 균주에서는 상당한 효소 활성을 측정할 수 있었다 (단백질 mg 당 25 mU). 상보성을 나타내는 서브클로닝된 3.7 kb의 HindIII 프래그먼트를 서열결정하였다 (도 2). 사카로마이세스 세레비지애 GLY1과 상동성인 트레오닌 알돌라제 코딩 유전자를 찾아내었다.
실시예 3
아쉬비아 고씨피이에서의 GLY1 유전자의 과다발현
GLY1 유전자를 과다발현시키기 위하여 이 유전자를 발현 벡터인 pAG203 (국제 특허 출원 공개 공보 제WO9200379호 참조) 내로 클로닝하였다. 상기 플라스미드에 있어서, 유전자는 TEF 프로모터 및 TEF 터미네이터의 조절 하에 있다 (도 3). G418에 대한 내성 유전자는 아쉬비아 고씨피이에서 선별 마커로서 작용한다. 아쉬비아 고씨피이는 포자가 단핵 반수체이기 때문에 상기 플라스미드로 형질전환시키고 그 후 단일 포자 클론을 단리시킨 후에, 이어서 조추출물에서 트레오닌 알돌라제 활성을 측정하였다. 글루코스 상에서 배양할 경우와 대두유 상에서 배양할 경우 모두에서 결여 (empty) 플라스미드인 pAG203으로 형질전환시킨 균주와 비교하여 A.g.p.AG203GLY1에서 10배 이상의 과다 발현량이 측정되었다 (도 4).
실시예 4
GLY1의 과다발현 및 트레오닌의 공급에 의한 리보플라빈 형성량의 증가
과다발현되는 트레오닌 알돌라제에 의해 세포 내에 형성된 트레오닌이 글리신의 형성을 제한하는지의 여부를 체크하기 위하여 트레오닌을 배지에 첨가하였다. 탄소원으로서의 글루코스 상에서 A.g.pAG203GLY1을 배양할 때 리터 당 6그램의 트레오닌을 첨가할 경우 이 균주는 리터 당 6그램의 글리신을 첨가했을 때보다 약 2배의 리보플라빈을 형성하였다 (도 5). 상기 효과는 야생형 및 결여 플라스미드로 형질전환시킨 대조 균주를 시험하였을 경우에는 관찰되지 않았다. 배지 중의 아미노산의 분석에서 GLY1 과다발현의 경우 공급된 52 mM의 트레오닌 중 단지 약 6 mM만이 남아있고 놀랍게도 글리신의 농도가 2 mM 내지 42 mM 증가하였음이 나타났다. 상기 결과에서 글리신 형성이 트레오닌에 의해 제한되었고 과다발현되는 트레오닌 알돌라제가 작용을 할 수 있고 세포내에서 형성된 글리신이 세포외에서 공급된 글리신보다 더 효과적이고 진균류 세포가 글리신을 대량 배출한다는 것을 증명되었다.
실시예 5
글리신 배출의 억제
실시예 4에서와 같이 트레오닌 알돌라제 과다발현 균주인 A.g.pAG203GLY1을 글루코스 대신 대두유 상에서 배양했을 경우 트레오닌 공급시에 얻어지는 리보플라빈 형성에 있어서의 증가치가 글리신 공급시의 증가치를 초과하지 않았다 (도 6). 그러나 배지의 분석에서는 트레오닌이 약 13 mM까지 분해되었음이 나타났다. 따라서 트레오닌에 있어서의 어떤 제한도 있을 수 없다. 동시에 세포외 글리신은 2 mM 내지 약 44 mM 증가하였다는 것이 밝혀졌다. 따라서 진균류에 의해 형성된 모든 글리신은 배지 내로 배출되었다. 글리신을 배지 내로 도입함으로써 상기 배출을 억제시킬 수 있었는데, 이후의 측정에서 리보플라빈 형성량이 실질적으로 트레오닌의 흡수량과 동일하게 증가하였다 (표 2). 생성량 증가를 초래하는 것이 단지 도입된 글리신이라는 가능성을 배제하기 위하여 글리신 및 트레오닌을 사용하는 실험에 있어서, 대조로서 글리신으로서 최후에 형성되는 양만큼의 글리신을 도입하였다. 상기 발견은 세포내에서 형성되는 글리신이 세포외에서 첨가되는 글리신보다 훨씬 효과적이라는 사실을 강조한다.
실시예 6
β-히드록시노르발린 내성 돌연변이체의 선발에 의한 리보플라빈 형성량의 증가
우선 첫째로 글리신 형성을 제한하는 것이 트레오닌의 글리신으로의 전환이 아니라 트레오닌의 합성이기 때문에, 트레오닌 유사체인 β-히드록시노르발린을 사용하여 내성 돌연변이체에 대하여 조사하였다. 2.5 mM의 β-히드록시노르발린을 함유하는 최소 배지로 충전된 아가 플레이트 상에서 방사상의 성장이 현저히 억제되었다. 더 활발하게 성장하는 돌연변이체는 자발적으로 콜로니의 가장자리에서 형성되었다. 어버이 균주보다 β-히드록시노르발린 최소 배지 상에서 현저하게 더 활발하게 성장하는 안정한 돌연변이체는 포자를 단리시키고 다시 한번 선발함으로써 제조하였다. 리보플라빈 형성량을 조사하였더니 생산성이 현저히 증가하였음이 나타났다. 첫째, 대두유를 함유하는 최소 배지에서 HNV-TB-25 균주는 리터 당 41 ± 11 mg의 리보플라빈을 형성한 반면 그의 어버이 균주는 단지 리터 당 18 ± 3 mg만을 생산하였다. 자손 균주인 HNV-TB-29도 또한 단지 리터 당 62 ± 10 mg만을 형성한 그의 원 균주, 즉 Ita-GS-01과 비교하여 리터 당 116 ±4 mg를 형성함으로써 현저한 증가치를 나타내었다.
주어진 배지 상에서의 에이. 고씨피이 ATCC10895의 배양 및 그 이후의 생성 생물량의 전체 가수분해 후의 세린, 트레오닌 및 글리신의 탄소 원자에서의13C 강화도 (enrichment) (MM: 최소 배지; YE: 효모 추출물; YNB: 효모 질소 기재; n.d.: 측정되지 않음)
배지 MM+YE(0.2g/ℓ)+에탄올 (1g/ℓ)+13C2-세린(2.7mg/ℓ) MM+YNB(0.2g/ℓ)+에탄올(1g/ℓ)+13C1-세린(2.6mg/ℓ)
세린 C1 1.1 4.9
C2 5.9 1.1
C3 1.1 1.1
트레오닌 C1 n.d. 39.0
C2 1.1
C3 1.1
C4 1.1
글리신 C1 1.1 7.1
C2 4.3 1.1
GLY1이 동시에 과다발현될 때 리보플라빈 형성에 대한 트레오닌 및 글리신 보충의 효과
균주 탄소원 t=0 t=72시간 t=72시간 t=72시간
보충 리보플라빈(mg/ℓ) Gly (mM) Thr (mM)
야생형 대두유 80 mM Gly 80 ± 2
50 mM Thr 22 ± 1 42 ± 0
130 mM Gly 18 ± 3 129 ± 2 n.d.
글루코스 80 mM Gly 80 ± 0
50 mM Thr 5 ± 1 35 ± 0
130 mM Gly 7 ± 1 126 ± 2 n.d.
Ag pAG 203 GLY1 대두유 80 mM Gly 117 ± 2
50 mM Thr 31 ± 0 11 ± 1
130 mM Gly 20 ± 3 129 ± 1 n.d.
글루코스 80 mM Gly 113 ± 2
50 mM Thr 40 ± 1 12 ± 0.7
130 mM Gly 9 ± 1 129 ± 3 n.d.
n.d.=검출 불가
본 발명의 단세포 또는 다세포 유기체, 특히 미생물에서는 글리신의 대사 작용이 변경되어 고가의 글리신을 외부에서 전혀 공급하지 않아도 리보플라빈의 합성 배출물이 6 g/ℓ의 글리신이 외부에서 첨가된 표준 조건 하에서 배양한 야생형의 아쉬비아 고씨피이 종, 즉 ATCC10895의 배출량과 적어도 동일하다. 미생물에 의한 리보플라빈 제조는 상기 물질이 고순도이지 않아도 되는 경우 특히 적당하다. 이것은 예를 들어 리보플라빈이 사료 제품에 첨가제로서 사용되는 경우이다. 상기와 같은 경우 리보플라빈의 미생물에 의한 제조의 잇점은 리보플라빈을 일단계 방법으로 얻을 수 있다는 것이다. 또한 식물유와 같은 재생가능한 원료를 미생물에 의한 합성을 위한 출발 화합물로서 사용할 수 있다.

Claims (26)

  1. 글리신을 외부에서 전혀 공급하지 않은 리보플라빈의 합성 배출량이 6 g/ℓ의 글리신이 외부에서 첨가된 표준 조건 하에서 배양한 야생형의 아쉬비아 고씨피이 종, 즉 ATCC10895의 배출량과 적어도 동일하도록 글리신 대사 작용이 변경된, 리보플라빈의 생물공학적 제조를 위한 단세포 또는 다세포 유기체, 특히 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 글리신의 세포내 합성이 증가되고(되거나) 글리신의 세포내 분해 및(또는) 글리신의 세포 외부로의 수송이 적어도 부분적으로 억제된 단세포 또는 다세포 유기체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 트레오닌 알돌라제 활성이 증가된 단세포 또는 다세포 유기체.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 글리신으로부터의 세린의 세포내 형성이 적어도 부분적으로 차단된 단세포 또는 다세포 유기체.
  5. 제4항에 있어서, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제의 활성이 적어도 부분적으로 차단된 단세포 또는 다세포 유기체.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 글리신 대사길항 물질에 대하여 내성을 갖는 단세포 또는 다세포 유기체.
  7. 제6항에 있어서, 알파-아미노메틸포스핀산 또는 알파-아미노술폰산, β-히드록시노르발린 및(또는) 다른 트레오닌 및(또는) 리신 유사체에 대해 내성을 갖는 단세포 또는 다세포 유기체.
  8. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 진균류, 바람직하게는 아쉬비아 속의 단세포 또는 다세포 유기체.
  9. 제1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 아쉬비아 고씨피이 종의 진균류인 단세포 또는 다세포 유기체.
  10. 도 2ba 및 2bb에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 그의 대립유전자 변이체를 갖는 트레오닌 알돌라제 유전자.
  11. 제10항에 있어서, 도 2ba 및 2bb에 나타낸 뉴클레오티드 1 내지 1149의 뉴클레오티드 서열 또는 본질적으로 동일한 효과를 갖는 DNA 서열을 갖는 트레오닌 알돌라제 유전자.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 도 2ba 및 2bb에 나타낸 뉴클레오티드 -1231 내지 -1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 상향 프로모터 또는 본질적으로 동일한 효과를 갖는 DNA 서열을 포함하는 트레오닌 알돌라제 유전자.
  13. 제10항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 조절 유전자 서열이 함께 할당된 트레오닌 알돌라제 유전자.
  14. 제10항 내지 13항 중 어느 한 항에 청구된 트레오닌 알돌라제 유전자를 포함하는 유전자 구조물.
  15. 제10항 내지 13항 중 어느 한 항에 청구된 트레오닌 알돌라제 유전자 또는 제14항에 청구된 유전자 구조물을 포함하는 벡터.
  16. 제10항 내지 13항 중 어느 한 항에 청구된 트레오닌 알돌라제 유전자 또는 제14항에 청구된 유전자 구조물을 포함하는, 리보플라빈의 제조를 위한 복제가능한 형태의 형질전환된 유기체.
  17. 제16항에 있어서, 제15항에 청구된 벡터를 포함하는 형질전환된 유기체.
  18. 제1항 내지 9항 중 어느 한 항에 청구된 유기체를 사용하는 것을 포함하는 리보플라빈의 제조 방법.
  19. 외부에서 글리신을 전혀 공급하지 않은 리보플라빈의 합성 배출량이 6 g/ℓ의 글리신을 외부에서 첨가한 표준 조건 하에서 배양한 야생형의 아쉬비아 고씨피이 종, 즉 ATCC10895의 배출량과 적어도 동일하도록 변경된 글리신 대사 작용을 나타내도록 유기체를 변경시키는 것을 포함하는 리보플라빈 생산 단세포 또는 다세포 유기체의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 유전공학적 방법을 사용하여 유기체를 변경시키는 것인 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 프로모터를 교환하고(하거나) 유전자 카피수를 증가시킴으로써 유기체를 변경시키는 것인 방법.
  22. 제19항 내지 21항 중 어느 한 항에 있어서, 활성이 증가된 효소를 내생 트레오닌 알돌라제 유전자를 변경시킴으로써 제조하는 것인 방법.
  23. 제19항 내지 22항 중 어느 한 항에 있어서, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제의 활성을 내생 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 유전자를 변경시킴으로써 적어도 부분적으로 차단시키는 것인 방법.
  24. 리보플라빈을 제조하기 위한 제1항 내지 9항, 16항 및 17항 중 어느 한 항에서 청구된 유기체의 용도.
  25. 제1항 내지 9항, 16항 및 17항 중 어느 한 항에 청구된 유기체의 제조를 위한 제10항 내지 13항 중 어느 한 항에 청구된 트레오닌 알돌라제 유전자 및 제14항에 청구된 유전자 구조물의 용도.
  26. 제1항 내지 9항, 16항 및 17항 중 어느 한 항에 청구된 유기체의 제조를 위한 제15항에 청구된 벡터의 용도.
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