DE19839567A1 - Organismen zur extrazellulären Herstellung von Riboflavin - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen ein- oder mehrzelligen Organismus, insbesondere einen Mikroorganismus, zur biotechnischen Herstellung von Riboflavin. Dieser zeichnet sich dadurch aus, daß dessen intrazelluläre Stofftransportvorgänge derart verändert sind, daß der überwiegende Teil an Riboflavin extrazellulär anfällt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen ein- oder mehrzelligen Organismus zur Herstellung von Riboflavin mittels Mikroorganismen.

Das Vitamin B₂, auch Riboflavin genannt, ist für Mensch und Tier essentiell. Bei Vitamin-B₂-Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhäute, Risse in den Mundwinkeln, Juckreiz und Entzündungen in den Hautfalten u. a. Hautschäden, Bindehautentzündungen, verminderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Gewichtsabnahme eintreten. Das Vitamin B₂ hat daher wirtschaftliche Bedeutung insbesondere als Vitaminpräparat bei Vitaminmangel sowie als Futtermittelzusatz. Daneben wird es auch als Lebensmittelfarbstoff, beispielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding, etc., eingesetzt.

Die Herstellung von Riboflavin erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell. Bei den chemischen Herstellungsverfahren wird das Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines Endprodukt gewonnen, wobei allerdings auch relativ kostspielige Ausgangsprodukte - wie beispielsweise D-Ribose - eingesetzt werden müssen. Daher kommt die chemische Synthese des Riboflavins nur für solche Anwendungszwecke in Betracht, für die reines Riboflavin notwendig ist, wie z. B. in der Humanmedizin.

Eine Alternative zur chemischen Herstellung des Riboflavins bietet die Herstellung dieses Stoffes durch Mikroorganismen. Die mikrobielle Herstellung des Riboflavins eignet sich insbesondere für solche Fälle, in denen eine hohe Reinheit dieser Substanz nicht erforderlich ist. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn das Riboflavin als Zusatz zu Futtermittelprodukten eingesetzt werden soll. In solchen Fällen hat die mikrobielle Herstellung des Riboflavins den Vorteil, daß diese Substanz in einem einstufigen Prozeß gewinnbar ist. Auch können als Ausgangsprodukte für die mikrobielle Synthese nachwachsende Rohstoffe, wie beispielsweise pflanzliche Öle, eingesetzt werden.

Die Herstellung von Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Ashbya gossypii oder Eremothecium ashbyi ist bekannt (The Merck Index, Windholz et al., eds. Merck & Co., Seite 1183, 1983; A. Bacher, F. Lingens, Angew. Chemie 1969, 393); aber auch Hefen, wie z. B. Candida oder Saccharomyces, und Bakterien wie Clostridium, sind zur Riboflavinproduktion geeignet.

Zudem sind Verfahren mit der Hefe Candida famata beispielsweise in der US 05231007 beschrieben.

Riboflavin-überproduzierende Bakterienstämme sind beispielsweise in der EP 405370 beschrieben, wobei die Stämme durch Transformation der Riboflavin- Biosynthese-Gene aus Bacillus subtilis erhalten wurden. Die fermentative Herstellung von Riboflavin mittels spezieller Mutanten von Bacillus subtilis wird auch in der GB 1434299, in der deutschen Offenlegungsschrift 34 20 310 und der EP 0821063 beschrieben.

Diese Prokaryonten-Gene waren aber für ein rekombinantes Riboflavin- Herstellungsverfahren mit Eukaryonten wie Saccharomyces cerevisiae oder Ashbya gossypii ungeeignet. Daher wurden gemäß der WO 93/03183 für die Riboflavin-Biosynthese spezifische Gene aus einem Eukaryonten, nämlich aus Saccharomyces cerevisiae, isoliert, um damit ein rekombinantes Herstellungsverfahren für Riboflavin in einem eukaryontischen Produktionsorganismus bereitzustellen. Derartige rekombinante Herstellungsverfahren haben für die Riboflavin-Produktion jedoch dann keinen oder nur begrenzten Erfolg, wenn die Bereitstellung von Substrat für die an der Riboflavin-Biosynthese spezifisch beteiligten Enzyme unzureichend ist.

Aus der deutschen Patentschrift 195 25 281 ist ein Verfahren zur Herstellung von Riboflavin bekannt, bei dem Mikroorganismen kultiviert werden, die resistent gegenüber auf Isocitratlyase hemmend wirkenden Substanzen sind.

Aus der deutschen Offenlegungsschrift 195 45 468.5-41 ist ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin bekannt, bei dem die Isocitratlyase- Aktivität oder die Isocitratlyase-Genexpression eines Riboflavin produzierenden Mikroorganismus erhöht ist.

Allen bisher bekannten Verfahren haftet jedoch der Nachteil an, daß ein großer Teil des Riboflavins intrazellulär anfällt. Zu dessen Gewinnung muß demgemäß die Zelle aufgeschlossen werden. Eine kontinuierliche Produktion des Riboflavins ist demgemäß auf biotechnischem Weg bisher nicht möglich.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es demgemäß, einen ein- oder mehrzelligen Organismus, vorzugsweise einen Mikroorganismus, für die biotechnische Herstellung von Riboflavin zur Verfügung zu stellen, der eine Gewinnung des Riboflavins ohne Aufschluß der Zellen und damit eine u. a. kontinuierliche Produktion des Riboflavins ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch einen ein- oder mehrzelligen Organismus gelöst, dessen intrazelluläre Stofffransportvorgänge derart verändert sind, daß der überwiegende Teil an Riboflavin extrazellulär anfällt.

Vorzugsweise wird erfindungsgemäß der Transport bzw. die Transportgeschwindigkeit des Riboflavins in die Vakuole vermindert, so daß der überwiegende Teil des Riboflavins durch die Cytoplasmamembran in das Fermentationsmedium abgegeben wird. Besonders bevorzugt ist, daß der Transport des Riboflavins in die Vakuole wenigstens teilweise blockiert ist.

Höchst bevorzugt ist die vollständige Blockierung des Transports des Riboflavins in die Vakuolenmembran.

Das Ziel dieser angestrebten Veränderung des intrazellulären Stofftransports kann mit den bekannten Methoden der Stammverbesserung von Organismen erreicht werden. D. h. im einfachsten Falle lassen sich entsprechende Stämme nach der in der Mikrobiologie üblichen Selektion mittels Screening herstellen. Ebenso ist die Mutation mit anschließender Selektion einsetzbar. Die Mutation kann hierbei sowohl mittels chemischer als auch mittels physikalischer Mutagenese ausgeführt werden. Eine weitere Methode ist die Selektion und Mutation mit anschließender Rekombination. Schließlich lassen sich die erfindungsgemäßen Organismen mittels Genmanipulation herstellen.

Erfindungsgemäß wird vorzugsweise der Organismus derart verändert, daß er Riboflavin nahezu ausschließlich extrazellulär erzeugt. Diese Erhöhung der extrazellulären Erzeugung von Riboflavin läßt sich erfindungsgemäß beispielsweise dadurch erreichen, daß ein Organismus hergestellt wird, bei dem die Enzymaktivität der vakuolären H⁺-ATPase (V-ATPase) vermindert oder vollständig blockiert ist. Die Folge hiervon ist, daß der Transport des Riboflavins durch die Vakuolenmembran teilweise oder ganz gehemmt ist.

Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß durch Veränderung des katalytischen Zentrums ein verminderter Substratumsatz erfolgt oder indem die Wirkung von Enzyminhibitoren erhöht wird. Auch kann eine verringerte Enzymaktivität der V-ATPase durch Verminderung der Enzymsynthese, beispielsweise durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzym-Biosynthese aktivieren, hervorgerufen werden.

Die ATPase-Aktivität kann erfindungsgemäß vorzugsweise durch Mutation, Inaktivierung oder Entfernung des ATPase-Gens vermindert oder vollständig gehemmt werden. Derartige Mutationen können entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie beispielsweise durch UV-Bestrahlung oder mutationsauslösende Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden, wie Deletion, Insertion, Nukleotid-Austausch oder Substitutionen im Strukturgen oder den damit verbundenen regulatorischen Elementen, Promotoren und Transkriptionsfaktoren.

Die ATPase-Genexpression kann demgemäß z. B. durch Entfernung oder Inaktivierung des ATPase-Gens und/oder durch Veränderung regulatorischer Faktoren, die die Genexpression beeinflussen, vermindert oder vollständig blockiert werden. So kann eine Verminderung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf Transkriptionsebene erfolgen, indem insbesondere die Transkriptionssignale verändert werden. Daneben ist aber auch eine Verminderung der Translation möglich, indem beispielsweise die m-RNA verändert wird.

Erfindungsgemäß kann das in der beschriebenen Weise veränderte ATPase-Gen in ein Genkonstrukt bzw. in einen Vektor eingebaut werden. Anschließend wird ein Riboflavin-produzierender Mikroorganismus mit diesem Genkonstrukt bzw. Vektor transformiert.

Erfindungsgemäß kann die Genexpression der V-ATPase auch durch Austausch des Promotors vermindert oder vollständig gehemmt werden. Hierbei ist es möglich, die verminderte enzymatische Aktivität alternativ durch Einbau von Genkopien oder durch Austausch des Promotors zu erzielen. Gleichermaßen ist es jedoch auch möglich, durch gleichzeitigen Austausch des Promotors und Einbau von Genkopien die gewünschte Änderung der Enzymaktivität zu erzielen.

Für die Isolierung des erfindungsgemäßen Gens kommen beliebige Organismen, deren Zellen die Sequenz zur Bildung der V-ATPase enthalten, also auch pflanzliche und tierische Zellen, in Betracht. Das veränderte Gen wird vorzugsweise aus Mikroorganismen, besonders bevorzugt aus Pilzen, isoliert. Besonders bevorzugt sind Pilze der Gattung Ashbya. Höchst bevorzugt ist die Spezies Ashbya gossypii.

Die Isolierung des Gens kann durch homologe oder heterologe Komplementation einer ATPase-Defektmutante oder einer ATPase-Deletionsmutante erfolgen. Die Isolierung des Gens kann auch über einen PCR-Ansatz mit degenerierten Primern über Aminosäurehomologie zu bereits bekannten Vma-Proteinen und anschließendes Screening einer Genbank erfolgen. Das Gen kann durch Subklonieren (Schneiden mit geeigneten Restriktionsenzymen und Einklonieren der erhaltenen Fragmente in geeignete Vektoren) des komplementierenden Klons oder des positiven Klons der gescreenten Genbank anschließend vollständig sequenziert werden. Disruptionskonstrukte (Deletions-/Substitutionsallele) können durch Ausschneiden eines Teils der Sequens des Gens mit Restriktionsenzymen und Ersetzen dieses Fragmentes durch eine Antibiotikum- Resistenzkassette plus einem Promotor auf einem Plasmid angefertigt werden. Solche Disruptionskonstrukte können dann zur Transformation eines Riboflavinproduzenten eingesetzt werden.

Nach Isolierung und Sequenzierung sind die erfindungsgemäßen Gene mit Nukleotidsequenzen erhältlich, die vorzugsweise für die Aminosäuresequenz gem. Fig. 1 oder deren Allelvariation kodieren. Allelvariationen umfassen insbesondere Derivate, die durch Deletion, Insertion und Substitution von Nukleotiden aus entsprechenden Sequenzen erhältlich sind, wobei die V-ATPase- Aktivität erhalten bleibt. Eine entsprechende Sequenz ist in der oben angegebenen Aminosäuresequenz der Bereich von Nukleotid 1 bis 3881, wobei AGVMA1 selbst im sequenzierten Bereich den Nukleotiden 910-2763 gem. Fig. 2 entspricht.

Den erfindungsgemäßen Genen kann insbesondere ein Promotor der Nukleotidsequenz von Nukleotid 1 bis 3881 gem. oben angegebenen Aminosäuresequenz oder eine im wesentlichen gleich wirkende DNA-Sequenz vorgeschaltet sein. So kann beispielsweise dem Gen ein Promotor vorgeschaltet sein, der sich von dem Promotor mit der angegebenen Nukleotidsequenz durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion und/oder Deletion unterscheidet. Des weiteren kann der Promotor durch Veränderung seiner Sequenz in seiner Wirksamkeit verändert oder komplett durch andere Promotoren ersetzt werden.

Dem V-ATPase-Gen können des weiteren regulatorische Gen-Sequenzen bzw. Regulatorgene zugeordnet sein, die insbesondere die V-ATPase-Gen-Aktivität vermindern. So können z. B. über eine veränderte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine verminderte V-ATPase-Gen-Expression bewirkt werden.

Dem erfindungsgemäß veränderten oder inaktivierten V-ATPase-Gen mit oder ohne vorgeschaltetem Promotor bzw. mit oder ohne Regulator-Gen können ein oder mehrere DNA-Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet sein, so daß das Gen in einer Gen-Struktur enthalten ist. Durch Klonierung des erfindungsgemäßen Gens sind Plasmide bzw. Vektoren erhältlich, die das veränderte oder inaktivierte V-ATPase-Gen oder kein V-ATPase-Gen enthalten und zur Transformation eines Riboflavin-Produzenten geeignet sind. Die durch Transformation erhältlichen Zellen enthalten das Gen in replizierbarer Form, d. h. in zusätzlichen Kopien auf dem Chromosom, wobei die Genkopien durch homologe Rekombination an beliebigen Stellen des Genoms integriert werden und/oder auf einem Plasmid bzw. Vektor.

Eine andere Möglichkeit zur Erhöhung des extrazellulär anfallenden Riboflavins besteht darin, die Transportgeschwindigkeit des Riboflavins durch die Cytoplasmamembran in das Fermentationsmedium zu erhöhen. Dadurch wird das Gleichgewicht zwischen dem Transport durch die Vakuolenmembran und durch die Cytoplasmamembran derart verschoben, daß der überwiegende Teil des Riboflavins extrazellulär anfällt.

Dies läßt sich z. B. dadurch erreichen, daß eine stärkere Expression des für den Transport codierenden Gens oder eine Erhöhung seiner Aktivität bewirkt wird.

Bei den erfindungsgemäß veränderten ein- oder mehrzelligen Organismen kann es sich um beliebige für biotechnische Verfahren einsetzbare Zellen handeln. Hierzu zählen beispielsweise Pilze, Hefen, Bakterien sowie pflanzliche und tierische Zellen. Erfindungsgemäß handelt es sich vorzugsweise um transformierte Zellen von Pilzen, besonders bevorzugt solche aus der Ordnung der Endomycetales. Insbesondere ist die Familie der Saccharomycetaceae bevorzugt. Ganz besonders bevorzugt sind Pilze der Gattung Ashbya und Eremothecium. Hierbei sind die Spezies Ashbya gossipii und Eremothecium ashbyii höchst bevorzugt.

Grundsätzlich können die beschriebenen Veränderungen in den Transportvorgängen auch durch Veränderung der Fermentationsbedingungen erreicht werden. Insbesondere kann durch Zusatz von chemischen Stoffen zum Fermentationsmedium eine wenigstens teilweise Blockierung der intrazellulären Akkumulation von Riboflavin erreicht werden. Beispielsweise kann erfindungsgemäß dem Fermentationsmedium ein Inhibitor zugesetzt werden, der eine Inaktivierung der V-ATPase bewirkt.

Beispiele für solche Stoffe sind Concanamycine, Bafilomycine, N-Ethylmaleimid, Nitrat.

Im folgenden wird die Erfindung näher anhand von Beispielen erläutert, ohne daß damit eine Begrenzung auf den Gegenstand der Beispiele verbunden sein soll:

1. Kompartimentierung von Riboflavin in A. gossypii unter Produktionsbedingungen 1.1. Permeabilisierungstechnik

Mit Hilfe der selektiven Permebilisierungstechnik wurde die Produktion und Kompartimentierung der stärker produzierenden Mutante ItaGS01 mit/ohne Zusatz von Concanamycin A in 4 unabhängigen Experimenten bestimmt. Hierfür wurden die Zellen auf Produktionsmedium angezogen (Hefeextrakt: 10 g/l; Sojaöl: 10 g/l; Glycin: 6 g/l) und zu definierten Zeitpunkten im Produktionsverlauf geerntet. Zur Kompartimentierungsanalyse wurde die Technik der selektiven Permeabilisierung der Plasmamembran von A. gossypii angewendet.

Ziel der selektiven Permeabilisierung der Plasmamembran ist die getrennte Analyse von cytosolischem und vakuolärem Kompartiment. Hierfür wurde das Myzel zum gwünschten Zeitpunkt durch Filtration geerntet (Glasfaser- Rundfilter, Ø 4,5 cm) und mit NaP_i-Puffer gewaschen. Die Pilzzellen (0,5 g Feuchtmasse) wurden in 10 ml Permeabilisierungslösung 0,003% (w/v) Digitonin in 50 mM NaP_i-Puffer resuspendiert und in dieser Fermeabilisierungslösung 10 min bei 30°C, 120 rpm im Laborschüttler zur Permeabilisierung der Plasmamembran inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wurden die Zellen durch Filtration aus der Lösung abgetrennt und das Filtrat zur Analyse cytosolischer Zellbestandteile eingesetzt. Die Zellsuspension wurde weitere 10 min mit 0,02% (w/v) Digitonin zur Zerstörung aller zellulären Membranen inkubiert. Durch Filtration konnte dann der vakuoläre Inhalt der Zellen für Analysen (Riboflavinbestimmung) gewonnen werden. Die auf dem Filter verbleibenden Zellreste wurden verworfen.

1.2. Quantitative Bestimmung von Biotrockenmasse und Riboflavin

Der Riboflavingehalt der Permeabiiisierungsfiltrate wird über HPLC unter den nachfolgend beschriebenen Trennbedingungen ermittelt

Säule: LiCrospher®100RP-18 (5 µm) (Merck, Darmstadt)
Laufmittel: 50 mM NaH₂PO₄
1 mM Tramethylammoniumchlorid
12% Acetonitril
Fluß: 1 ml/min
Elution: isokratisch
Detektion: 270 nm

Der Riboflavingehalt der einzelnen Kompartimente wurde dann zur Berechnung der Kompartimentierung zwischen Medium, Cytosol und Vakuole auf die eingesetzte Biotrockenmasse bezogen. Zur Bestimmung der Pilztrockenmasse wurden 20-50 ml Sojöl-Kultur zunächst in 50 ml-Falcon Tubes überführt, 10 min. bei 1500 × g zentrifugiert und die dann oben befindliche Ölschicht vorsichtig mit einer Pipette abgenommen. Die ölfreie Suspension wurde danach über tarierte Glasfaser- Rundfilter abfiltriert und mit 10fachem Volumen NaP_i-Puffer gewaschen. Das Myzel auf dem Filter wurde bis zur Gewichtskonstanz bei 60°C in einem Trockenschrank getrocknet und anschließend gewogen.

1.3. Kompartimentierung von Riboflavin unter Produktionsbedingungen

Es wurden jeweils für Kontrolle und Concanamycin-behandelte Zellen (5 µM) zu den 3 Zeitpunkten 24 h, 43 h und 67 h die cytosolischen und vakuolären Riboflavingehalte sowie die ins Medium sezernierte Riboflavinmenge determiniert:
Die Diagramme zeigen deutlich (auch optisch/ lichtmikroskopisch gut zu sehen), daß die Zellen der Mutante ItaGS01 in ihren Vakuolen kein Riboflavin mehr speichern können, wenn der V-ATPase-Inhibitor Concanamycin A dem Medium zu Beginn der Produktionsphase zugesetzt wird. Die Gesamtproduktion ist bei Kontrolle und Concanamycin A-Ansätzen gleich, wobei unter Concanamycin A-Zusatz die sonst intravakuolär gespeicherte Riboflavinmenge (30-60% der Gesamtproduktion) ins Medium sezerniert wird.

2. Klonierung, Sequenzierung und Disruption des VMA1-Gens von A. gossypii

Es wurde der Versuch unternommen, die mit Hilfe des Inhibitors Concanamycin A erzielte Riboflavinfluss-Umlenkung molekularbiologisch durch Konstruktion eines Stammes mit dysfunktionaler V-ATPase umzusetzen. Es wurde hierfür die katalytische Untereinheit A des V-ATPase-Komplexes kloniert und disruptiert.

Die katalytische Untereinheit A wird durch das VMA1-Gen kodiert (vacuolar membrane ATPase protein 1).

2.1. Klonierung und Sequenzierung

Über PCR (Design von degenerierten Oligonukleotid-Primern aus hochkonservierten Sequenzen im VMA1p-Alignment) konnte ein Fragment des AgVMA1-Gens (evolutiv stark konserviert) amplifiziert werden: für die PCR wurden degenerierte Oligonukleotid-Primer aus hochkonservierten Aminosäure-Abschnitten verschiedener VMA1-Proteine entwickelt: CF1a (5'-ATYCARGTBTAYGARAC-3') und CF1b (5-ATVACRGTYTTRCCRCA-3') wurden bei MWG Biotech (Ebersberg) bestellt. Die PCR (30 s 94°C, 60 s 52°C, 60 s 72°C, 35 Zyklen) wurde im Gene Amp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) mit Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim, Germany) durchgeführt, Puffer wie vom Hersteller empfohlen, 8 µM Primer CF1a, 4 µM Primer CF1b. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde dann genutzt, um eine Cosmid-Genbibliothek (cosmid vector SuperCos1, Stratagene) von A. gossypii zu screenen. Um positive Cosmid-Klone, die homologe Regionen von DNA enthielten, zu identifizieren, wurde das PCR-Fragment mit [a-³²P]dCTP mit Hilfe von T7-Polymerase radioaktiv markiert.

Die Cosmid-DNA der positiven Klone wurde mit BamI verdaut und wieder mit dem radioaktiven PCR-Fragment gescreent. Das Gen wurde dann nach Subklonieren in den Plasmid-Vektor Bluescript, Stratagene, sequenziert.

Die Nukleotid-Sequenz ist nach Einreichen des Patents und der dazugehörigen Publikation unter der Accession-Nummer AJ009881 in der EMBL-Datenbank zu erhalten. Das Proteinalignment für AgVMA1p mit den V-ATPase-A-Untereinheiten versch. anderer Organismen zeigte, daß auch in Ashbya eine stark konservierte Proteinsequenz vorliegt. Der phyiogenetische Stammbaum der VMA1-Proteine zeigte ausserdem, daß mit AgVMA1p das zum entsprechenden Protein der Hefe S. cerevisiae am nächsten verwandte VMA1-Protein, das bisher bekannt ist, gefunden wurde. Genomische Southern-Analyse bestätigte, daß es sich um ein single-copy-Gen handelt (wie im übrigen auch bei der Hefe).

2.1 Disruption des vma1 Gens

Zur Disruption wurde ein vma1-Deletions/Substitutions-Allel, genannt vma1::G418 konstruiert. Hierfür wurde das 0,25 kb BamHI-PstI-Fragment im VMA1-PCR- Fragment welches einen Teil des VMA1-ORF enthält mit der Geneticin- Resistenz-Kassette TEF-G418 ersetzt. Zunächst wurde das VMA1-PCR-Fragment in einen modifizierten pGEM®T-Vektor (Promega) ohne PstI- Schnittstelle kloniert, wodurch das Plasmid pJR1767 erzeugt wurde. Die codierende Sequenz für VMA1 wurde schließlich auf dem Plasmid disruptiert, indem die 0,25 kb- BamHI-PstI-Region mit dem TEF-G418-Marker ersetzt, wodurch das Plasmid pJR1773 erzeugt wurde. Das lineare 2,5-kb-Fragment Ncol-Spel dieses Plasmids wurde schließlich zur Transformation gekeimter Sporen von A. gossypii (Ausgangsstämme Wildtyp, stärker produzierende Mutante ItaGS01) eingesetzt. Geneticin-resistente Klone wurden selektioniert und die Disruption des vma1-Gens durch Southern-Blot bestätigt (Abb. 2).

2.3. Stoffflußumlenkung von Riboflavin durch die Disruption von VMA1

Die Disruptanten zeigen auf Platte charakteristische, dicht/kraterartig wachsende Kolonien im Gegensatz zum flächigen Wachstum der Ausgangsstämme. Die Zelten sezernieren Riboflavin (gelb gefärbte Agarplatten), die Hyphen selbst sind aber komplett weiss, speichern in ihren Vakuolen kein Riboflavin mehr (erster Nachweis über Fluoreszenzmikroskopie). Dagegen sind die Hyphen der Ausgangsstämme gelb gefärbt vom intravakuolär gespeicherten Riboflavin (oft sogar in Kristallen).

Die Riboflavinkompartimentierung wurde wiederum mit Hilfe der selektiven Membran-permeabilisierungstechnik (s. 1.1.) quantitativ untersucht:

Über die Disruption der V-ATPase-Untereinheit A konnte (wie oben unter Zusatz des V-ATPase-Inhibitors Goncanamycin) eine Umlenkung der Riboflavinflüsse erzielt werden. Es stehen also 3 neue Stämme ohne vakuoläre Riboflavinakkumulation (Produkt-Retention) zur Verfügung.

Erläuterungen zu den Zeichnungen

Abb. 1: Kompartimentierung von Riboflavin in Ashbya unter Standard- Produktionsbedingungen (linke Säule) und bei der Produktion unter Zusatz des V-ATPase-Inhibitors Concanamycin A

Abb. 2: Disruption von AgVMA1 mit dem TEF-G418-Marker, (A) Konstruktion, (B) Southern-Analyse
T1: Disruptante vom Wildstamm
T2: Disruptante von ItaGS01

Abb. 3: Riboflavinkompartimentierung in Ausgangsstamm und Disruptante der Mutante ItaGS01

Claims (26)

1. Ein- oder mehrzelliger Organismus, insbesondere Mikroorganismus, zur biotechnischen Herstellung von Riboflavin, dadurch gekennzeichnet, daß dessen intrazelluläre Stofftransportvorgänge derart verändert sind, daß der überwiegende Teil an Riboflavin extrazellulär anfällt.

2. Ein- oder mehrzelliger Organismus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei ihm der Transport des Riboflavins in die Vakuole vermindert ist.

3. Ein- oder mehrzelliger Organismus nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Transport des Riboflavins in der Vakuole wenigstens teilweise gehemmt ist.

4. Ein- oder mehrzelliger Organismus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei ihm die V- ATPase-Aktivität wenigstens teilweise blockiert ist.

5. Ein- oder mehrzelliger Organismus nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei ihm die Transportgeschwindigkeit des Riboflavins durch die Cytoplasmamembran höher ist, als diejenige durch die Vakuolenmembran ist.

6. Ein- oder mehrzelliger Organismus nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Pilz ist.

7. Ein- oder mehrzelliger Organismus nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er ein filamentöser Pilz ist.

8. Ein- oder mehrzelliger Organismus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Pilz aus der Familie der Saccharomycetaceae ist.

9. Ein- oder mehrzelliger Organismus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Pilz aus der Gattung der Spezies Ashbya, vorzugsweise Ashbya gossypii ist.

10. V-ATPase-Genedadurch gekennzeichnet, daß sie durch Mutation wenigstens teilweise inaktiviert sind.

11. V-ATPase-Gene nach Anspruch 10 mit einer für die Aminosäuresequenz gem. Fig. 1 und deren Allelvariation kodierenden Nukleotidsequenz.

12. V-ATPase-Gene nach einem der Ansprüche 10 oder 11 mit der Nukleotidsequenz von Nukleotid 1 bis 3881 gem. der in Fig. 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder einer im wesentlichen gleich wirkenden DNA-Sequenz.

13. V-ATPase-Gene nach einem der Ansprüche 10 bis 12 mit diesem zugeordneten regulatorischen Gensequenzen.

14. Gen zur Herstellung eines Riboflavin produzierden ein- oder mehrzelligen Organismus, dadurch gekennzeichnet, daß es kein V-ATPase-Gen enthält.

15. Vektor enthaltend ein Gen nach einem der Ansprüche 10 bis 14.

16. Transformierter Organismus zur Herstellung von Riboflavin enthaltend in replizierbarer Form ein Gen nach einem der Ansprüche 10 bis 14.

17. Transformierter Organismus enthaltend einen Vektor nach Anspruch 15.

18. Verfahren zur Herstellung von Riboflavin, dadurch gekennzeichnet, daß ein Organismus gem. einem der Ansprüche 1 bis 9 eingesetzt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß dem Fermentationsmedium ein chemischer Inhibitor zugesetzt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß dem Fermentationsmedium Concanamycine, Bafilomycine, N-Ethylmaleimid, Nitrat als Inhibitoren zugesetzt werden.

21. Verfahren zur Herstellung eines Riboflavin produzierenden ein- oder mehrzelligen Organismus, dadurch gekennzeichnet, daß er so verändert wird, daß die überwiegende Menge des entstehenden Riboflavins extrazellulär anfällt.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung des Organismus mittels gentechnischer Methoden erfolgt.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß durch Veränderung oder Entfernung des V-ATPase-Gens die Aktivität der ATPase wenigstens teilweise oder vollständig blockiert wird.

24. Verwendung des Organimus nach einem der Ansprüche 1 bis 9 sowie 16 und 17 zur Herstellung von Riboflavin.

25. Verwendung des ATPase-Gens nach einem der Ansprüche 10 bis 13 zur Herstellung eines Organismus nach einem der Ansprüche 1 bis 9 sowie 16 und 17.

26. Verwendung des Vektors nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Organismus nach einem der Ansprüche 1 bis 9 sowie 15 und 16.