JP2905230B2 - ヒトリゾチームを産生する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子操作された酵母細胞の培養により、
活性なヒトリゾチームを産生する方法に関する。さらに
詳しくは、本発明は、活性ヒトリゾチームを高い収率で
産生しかつ酵母細胞により分泌し、活性ヒトリゾチーム
を酵母細胞から容易に回収および精製することができる
方法に関する。

本発明は、要約すれば、次の通りである：調節可能な
プロモーターの制御下にリゾチームを産生および分泌す
るように適当に操作されているDNAを有する酵母細胞
を、リゾチーム合成の実質的不存在下に成長させ、次い
で成長制限条件下に誘発してリゾチームを産生および分
泌させる。この方法は、とくに、ヒトリゾチームまたは
その突然変異体の産生に適当する。

リゾチームは、自然に広く広がって分布する酵素に与
えられた普通名であり、そしてバクテリアの細胞壁の主
要成分であるペプチドグリカンの加水分解を触媒するこ
とが知られている。この活性の結果、リゾチームは抗バ
クテリア作用を有し、そして、この理由のため、ほとん
どの生きている有機体が有するバクテリア感染に対す
る、種々のバリアーにおいて参加すると信じられる。こ
うして、リンパ球および免疫グロブリンを欠く昆虫にお
いて、バクテリアの感染に対する免疫応答は、そのリゾ
チームが重要な成分である、ポリジーンの酵素系により
保証される［参照、例えば、D.ハルトマーク（HULTMAR
K）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（Eur.J.Biochem.）、106、７、1980］。高等
動物において、リゾチームの生理学的役割はまだ知られ
ていない［R.ラグマタン（RAGHUNATHAN）、IRCS Sci.1
3、480、1985］が、その偏在する分布はこの役割が重要
であろうことを示唆している。それは免疫系へ刺激作用
を有しうることが示唆された［参照、p.ジョレス（JOLL
ES）、バイオメディシン（Biomedicine）、25、276、19
76］。ヒトリゾチームは、生理学的投与量において、多
形核白血球により酵母細胞の生体外食作用を刺激するこ
とが示された［参照、M.クロカカルス（KLOCKARS）およ
びP.ロバーツ（ROBERTS）、アクタ・ヘマトロジカ（Act
a Haemat.）、58、289、1976］。また、リゾチームは膜
の監視およびマクロファージの抗腫瘍機能において一般
の役割を有しうることが示唆された［参照、E.F.オッセ
ルマン（OSSERMAN）ら、ネイチャー（Nature）、243、3
31、1973］。より最近、リゾチームそれ自体は多少抗腫
瘍作用を有することが示された［参照、R.ラグナタン
（RAGHNATHAN）、癌の検出および予防（Cancer Detecti
on and Prevention）、5、78、1982］。すでに、ニワト
リリゾチームが、ことに日本において、種々の製剤学の
応用において使用されている。

ニワトリリゾチームは、ヒトリゾチームをまた包含し
かつｃ（chicken）リゾチームと呼ばれる、密接に関連
する酵素のクラスに属する。それらは次の性質を包含す
る同様な物理化学的性質により特徴づけられる：約15,0
00の分子量、アミノ酸配列および第３構造における密接
な相同性、同一の酵素活性、例えば、多少のキチナーゼ
活性、これはｇ（goose、ガチョウ）リゾチームと対照
的であり、後者のリゾチームは約20,000の分子量をもち
そしてキチナーゼ活性をもたない［参照、P.ジョレス
（JOLLES）およびJ.ジョレス（JOLLES）、モレキュラー
・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Bio
l.）、63、165、1984］。

しかしながら、これらの構造的および物理化学的な類
似生にかかわらず、同一のクラス内のリゾチームは非常
に異なる免疫学的性質を有する。例えば、ニワトリリゾ
チームおよびヒトリゾチームはそれらのそれぞれの抗体
と交差反応性しない［参照、A.ファウレ（FAURE）およ
びP.ジョレス（JOLLES）、FEBS Lett.10、237、197
0］。したがって、ヒトリゾチームは製剤学的使用およ
びさらに食物の使用にことに応用される。しかしなが
ら、源が豊富でありかつ実際に利用されている、すなわ
ち、卵白からのニワトリリゾチームと異なり、ヒトリゾ
チームは、DNAが前記酵素を発現するように特別に操作
されている細胞を培養する以外、商業的目的で大量に提
供されえない。

微生物の宿主において、異種にタンパク質、例えば、
ヒト由来のタンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子をク
ローニングおよび発現することが現在実施されている。
多数の例は、特許文献に非常に詳しく記載されており、
それらのいくつかは既に商業的に実現されている。これ
は、例えば、グラム陰性バクテリアEscherichiacoliに
おいて発現されるヒトインスリン、成長ホルモンおよび
アルファ−インターフェロンについての場合である。こ
の宿主において、高い発現レベルは容易に得ることがで
きる；しかしながら、こうして産生されたタンパク質は
大きい封入体としてしばしば濃縮させ、ここでそれは不
溶性および不活性の形態で存在する。このような場合に
おいて、経費のかかる面倒な復元の手順を適用すること
が必要であり、その収率はプロキモシンの場合における
ように、約20％程度に低いことがある［参照、F.A.O.マ
ルストン（MARSTON）ら、バイオテクノロジー（Biotech
nology）、2、800、1984］。ヒトリゾチームの遺伝情報
を指定するDNAセグメントをE.coliにおいて発現すると
き、同一のタイプの現象が明らかに起こる。細胞の超音
波処理後、合成したヒトリゾチームは主として細胞破片
と会合して見いだされる。そのうえ、タンパク質は活性
でなく、そして追加のＮ末端メチオニン残基の存在によ
り自然ヒトリゾチームと異なる［参照、ムラキ（MURAK
I）ら、Atric Biol.Chem.49、2829、1985］。

これらの困難を軽減するために、グラム陽性バクテリ
アのバクテリア・スブチリス（Bactrium subtilis）に
おいてヒトリゾチームを発現することが試みられた。バ
クテリウム・スブチリス（Bactrium subtilis）は、あ
る数の加水分解酵素を外部の媒質中に活動的に分泌する
ことが知られており、そして異種のタンパク質の発現お
よび分泌のための宿主として広く使用されている。しか
しながら、ヒトリゾチームの場合において、最近、分泌
されたタンパク質は、多分正しくない結合の形成のため
に、酵素的に不活性であることが示された［参照、K.ヨ
シムラ（YOSHIMULA）ら、バイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Bioc
hem.Biophys.Rse.Comm.）、145、712、1987］。

バクテリア以外の宿主は、また、異種のタンパク質の
産生に使用することができ、例えば、真核生物の微生
物、例えば、酵母、ことにサッカロミセス・セレビシア
エ（Saccharomyces cerevisiae）、またはさらに線状真
菌類である。酵母においてヒトタンパク質の高い収率の
産生の典型的な例は、活性なスーパーオキシドジスムタ
ーゼの細胞内発現である（参照、国際特許出願WO85/015
03号）。しかしながら、成熟ヒトリゾチームの遺伝情報
を指定するDNAを酵母において発現するとき、E.coliに
おいて観察されるのと同一の現像が起こる、すなわち、
リゾチームは細胞破片と会合して見いだされ、それから
可溶化剤、例えば、濃尿素によりそれを抽出しなくては
ならない（参照、欧州特許出願EP0181634号、p.47）。
より最近、酵母において発現された成熟リゾチームは事
実不溶性の不活性の形態で、多分ジサルファイド結合の
不正確な形成の結果として、得られるという、それ以上
のデータが提供された［参照、T.ハヤカワ（HAYAKAWA）
ら、遺伝子（Gene）、56、53、1987］。

ベルギー国特許BE901,223号に開示されているよう
に、酵素的に活性なリゾチームは、成熟タンパク質の遺
伝情報を指定するDNAを酵母細胞の分泌機構により認識
されるシグナルペプチドの遺伝情報を指定するリーダー
配列と融合する場合、遺伝子操作された酵母から得るこ
とができる。この場合において、成熟タンパク質は原形
質膜を通して分泌され、次いで、条件に依存する程度
に、培地中に分泌される。前記ベルギー国特許におい
て、こうして、ニワトリプレリゾチームの遺伝情報を指
定する完全なcDNAを酵母において発現すると、酵素的に
活性なリゾチームが産生し、その大きい比率、すなわ
ち、約73％は培地中の可溶化されることが発見されたこ
とが示される。後に、こうして産生されたニワトリリゾ
チームのＮ末端配列は、自然酵素のそれ、すなわち、Ly
s−Val−Phe−Gly−Arg−Cys−Leu−Ala−Alaと同一で
ある［参照、J.オベルト（OBELTO）ら、特別の酵母分子
生物学および遺伝学の第１回国際シンポジウム、バル
ナ、11月４〜９日、1985年；また参照、ベルギー国特許
BE903,626号］。これらの結果が実証するように、ニワ
トリリゾチームのシグナル配列は酵母分泌系により正し
く切断され、これにより前記シグナル配列を使用して、
例えば、ベルギー国特許BE901,223号、特許請求の範囲
３において特許請求されている種々の源からリゾチーム
を分泌させることができる。この利点は、最近、ヒトリ
ゾチームの場合において得られた［参照、Y.ジガミ（JI
GAMI）ら、遺伝子（Gene）、43、273、1986およびK.ヨ
シムラ（YOSHIMURA）ら、ref.cit.］。しかしながら、
報告されている収率は比較的小さい。

酵母細胞から分泌されたリゾチームを得る可能性は、
大きい実際的な利点をもつ。こうして得られる酸素は活
性でありかつ自然タンパク質と同一であるばかりでな
く、かつまた既知の方法、例えば、前記ベルギー国特許
BE903,626号に記載されている方法により容易に回収お
よび精製することができ、ここで細胞を粉砕し、そして
複雑な経費を要する分画および復元の手順を必要としな
い。細胞から分泌される所望のタンパク質を得るという
なお他の利点は、ある二次的使用、例えば、タンパク質
飼料配合物においてタンパク質およびビタミンの源とし
ての使用のために細胞を回収する可能性である。実際
に、酵母の高いタンパク質含量、それらのすぐれたアミ
ノ酸バランスおよびそれからのセルロースの不存在は、
それらを若い家畜、例えば、仔ウシおよび子豚のための
価値ある飼料補給物質とする。

比較的高い体積の、中程度の価値の酵素、例えば、リ
ゾチームの発酵により産生を経済的に可能とするため
に、それを細胞から分泌させる手段をえることは十分で
はない。また、それを高い収率で産生することが必要で
ある。したがって、本発明の目的は、酵素的に活性なリ
ゾチームを高い収率で産生する改良された方法を提供す
ることである。本発明の他の目的は、この産生を酵素の
変性が最小にされかつそれがそれ以上の精製のために容
易に処理される形態で得られるような条件下に、達成す
ることである。本発明は、産生されるリゾチームが酵母
細胞に比較的毒性であるとき、とくにヒトリゾチームを
産生すべきとき、とくに興味がある。本発明の他の目的
および利点は、以下の説明および実施例から明らかとな
るであろう。

これらの目的は、DNAが適当に操作された酵母細胞
を、成長制限条件下に、誘発させて、ヒトリゾチームを
産生および分泌させる、発酵方法の適用により達成され
る。

１つの面において、本発明は、工程： DNAが遺伝子操作されている成長する酵母細胞を成長
制限条件下に培地と接触させ、そして、前記酵母細胞を
誘発して酵素的に活性なリゾチームを合成および分泌さ
せる、 からなることを特徴とする、酵素的に活性なリゾチー
ムを産生する方法に関する。

他の面において、本発明は、工程： 酵素的に活性なリゾチームの合成を抑制する培地中
で、DNAが遺伝子操作されている酵母細胞を成長させ、
そして 前記成長する酵母細胞を成長制限条件下に培地と接触
させ、そして前記酵母細胞を誘発して酵素的に活性なリ
ゾチームを合成および分泌させる、からなることを特徴
とする、酵素的に活性なリゾチームを産生する方法に関
する。

他の面において、次の配列 および自然ヒトリゾチームと異なるがムラミダーゼ
（muramidase）活性を保持するタンパク質をコードする
その突然変異体からなる群から選択される、ことを特徴
とする、ヒトリゾチームのための合成遺伝子に関する。

上で強調したように、遺伝子工学の技術により、酵母
に、酵素的に活性なリゾチームを産生しかつ分泌させる
ことができる可能性の第１の実証は、モデル化合物とし
てニワトリリゾチームを使用してなされた。さらに詳し
くは、ベルギー国特許第901,223号の実施例2.2におい
て、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces ce
revisiae）の1eu2菌株（GRF18）のプラスミド（plys5
0）を使用する形質転換、記載されており、このプラス
ミドは内因性２−ミクロンプラスミドの全体の配列、酵
母における分泌のためのプラスミドpJDB219の欠陥LEU2
遺伝子［参照、J.D.ベッグス（BEGGS）、ネイチャー（N
ature）、275、104、1978］、E.coliにおける複製のた
めのバクテリア配列および完全なニワトリリゾチームcD
NAが酵母プロモーターp415の転写制御下にある発現カセ
ットからなる。この実施例において、リゾチームの発現
および分泌は、細胞ホモジネートおよび細胞不含培地そ
れ自体の両者のミクロコッカス・リソデイクチクス（Mi
crococcus lysodeikticus）の細胞を溶菌する能力によ
り証明された。合計の活性は、162単位/ml、すなわち、
培地において118単位および細胞と会合した44単位であ
った。

同一タイプの結果は、ニワトリリゾチームcDNAの転写
がグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼの
遺伝情報を指定するGAP遺伝子の強い構成的プロモータ
ーにより保証される、他の２−ミクロンに基づく発現プ
ラスミドを使用するとき、達成される。ヒトリゾチーム
を発現する最初の試みにおいて、われわれは、この後者
の構成において、成熟ニワトリリゾチームの遺伝情報を
指定する合成DNAセグメントを成熟ヒトリゾチームの遺
伝情報を指定する合成DNAセグメントで置換した。第１
図に示す、使用した配列は、それ自身の遺伝子の高い発
現のためにS.cerevisiaeにより好まれるコドンを利用す
るために、予備的に誘導した。さらに、サイレント突然
変異を使用して、配列の可能な引き続く操作のための独
特制限酵素を導入した。予期せざることには、この構成
を使用すると、1eu⁺形質転換体は普通の方法により形質
転換し、そしてロイシン欠乏上の選択のときさえ得るこ
とができなかった。こうして、明らかなように、ヒトリ
ゾチームは、酵母原形質体中の活性的に合成したとき、
細胞の生存能力を、多分、酵母細胞壁の正常の構成成分
であるキチンノ合成を妨害することにより、減少する
［参照、E.カビス（CABIS）およびロバーツ（ROBERT
S）,Ann.Rev.Biochem.51、763、1982］。

しかしながら、われわれは、同一のヒトリゾチーム解
読DNAセグメントの転写を調節可能なプロモーターの制
御下に置いたとき、かつその抑制を成長制限条件下に実
施することを条件として、活性なリゾチームの合成が、
細胞生理学に明らかな悪影響を及ぼさないで、起こるこ
とを発見した。対照的に、リゾチームの合成が成長を許
容する条件下に起こるとき、バイオマスの産生は障害さ
れるばかりでなく、かつまた、なおより衝撃なことに
は、リゾチームの合成は実際的な興味をもつには制限さ
れ過ぎる。成長制限条件へのヒトリゾチーム合成の依存
性はニワトリリゾチームでは観察されない。これは両者
の酵素の性質の間の類似性にかんがみて驚くべきことで
ある。一瞥して、この差はヒトリゾチームがニワトリリ
ゾチームのそれより2.5倍高い比活性を有するという事
実に帰することができる［参照、R.E.カンフィールド
（CANFIELD）ら、「リゾチーム（Lysozyme）」、E.F.オ
ッセルマン（OSSERMAN）、R.E.カンフィールド（CANFIE
LD）およびS.ベイチョク（BEYCHOK）、アカデミック・
プレス（Academic Press）、1974、p.63］。しかしなが
ら、前者の一次構造が部位特異的突然変異により変更さ
れ、こうして位置４においてGLlu残基はニワトリリゾチ
ームにおけるようにGly残基で置換され、成長条件下の
リゾチームの合成の同一の阻害が観察され、これに対し
て基質としてM.lysodeikticusで突然変異したタンパク
質の比活性はニワトリリゾチームのそれより有意に高く
ない。

したがって、本発明の１つの重要な面は、成長および
リゾチームの合成が同時の事象の代わりに実質的に保存
される方法を提供することである。これは、リゾチーム
をエンコードするDNAセグメントの転写のために調節可
能な酵母プロモーターを使用することにより容易に達成
することができる。このタイプの種々のプロモーターが
既知である。例えば、酸性ホスファターゼの遺伝情報を
指定する遺伝子のプロモーターは欧州特許（EP）100,56
1号において教示されるように使用することができる。
欧州特許（EP）213,593号に最近開示されているよう
に、この性質は、例えば、GAP遺伝子のプロモーターと
の融合により、調節可能な雑種プロモーターを構成する
ために使用することができる、２つの活性配列の、PHO
５遺伝子より上流の、存在に関係する。実際に、欧州特
許（EP）164,556号に記載されているように、種々のこ
のような雑種プロモーターは、異なる酵母プロモータ
ー、ことにGAPのようなグルコース分解酵素の遺伝情報
を指定する遺伝子からの強いプリモモーターを、異なる
調節可能な遺伝子、例えば、GAL1、GAL10、PHO5、SUC
2、MAL6S、MAL6T、CYC1、ADH2あるいは一般のアミノ酸
の制御下の遺伝子、例えば、HiS1、HiS3、HiS4、HiS5ま
たはLEU3と結合することによって構成することができ
る。例えば、ADH2遺伝子がグルコースにより発現され、
そして非発酵性炭素源、例えば、エタノールの存在下に
抑制される。このような調節可能なプロモーターを使用
することにより、培地の組成を注意して制御することに
よって、成長に独立に、リゾチームの発現をオンまたは
オフに切り替えることが可能である。温度の変化により
調節される他の酵母プロモーターを、また、使用するこ
とができる。

上に強調したように、本発明の他の重要な面は、成長
制限条件下に発現されたリゾチームはそれから分泌され
ることである。ほとんどの実験が、酵母において、タン
パク質の分泌が細胞の成長に相関関係をもつという、現
在通用する点を証明することを考慮するとき、これは、
また、驚くべき事実である。［参照、R.シェクマン（SH
EKMAN）、TIBS、July 1982、p.243］。これと対照的
に、酵母細胞が定常期に維持されているとき、原形質膜
の外側に見いだされる分泌されたリゾチームの量は細胞
内に見いだされる量を犠牲にして増加する。

それにもかかわらず、当業者に知られているように、
原形質膜を通るリゾチームの分泌を保証するために、リ
ゾチームをエンコードするDNAセグメントはシグナルペ
プチドの遺伝情報を指定するリーダー配列を適当に装備
して、翻訳されたタンパク質を小胞体のルーメン中に転
移させかつ成熟酵素に処理できるようにすることは必要
である。このリーダー配列は、シグナルペプチドの遺伝
情報を指定し、酵母の分泌の機構により認識されかつ正
しく切断される、相同性または異種の任意の配列である
ことができる。上に既に論じたように、効率のよい分泌
はニワトリリゾチームのシグナルペプチドをエンコード
する配列の使用から生ずるが、他の異種のシグナルペプ
チドの遺伝情報を指定する配列を、また、使用すること
ができる。他方において、相同性のシグナル配列を使用
することができる。例えば、効率よいかつより文献に記
載された分泌の発現の方法は、フェロモンのアルファ−
およびａ−因子と交配する（mating）酵母の前駆体のリ
ーダー領域を使用するから成る［参照、例えば、欧州特
許（EP）116,201号および欧州特許（EP）123,289号］。

本発明により発現すべきリゾチームをエンコードする
DNAセグメントは、ヒトリゾチームの遺伝情報を指定す
る、例えば、ムラミダーゼ活性を有しかつ自然ヒトリゾ
チームと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝
情報を指定する、任意のDNA配列であることができる。
それは、自然ヒト遺伝子から転写されるmRNAの逆転写に
より得られるcDNAであることができる。あるいは、それ
は、上に定義したヒトリゾチームをエンコードする、任
意の合成DNAセグメントであることができる。後者の方
法の１つの有意の利点は、こうして合成されたDNAセグ
メントのヌクレオチド配列は、翻訳効率を改良するため
に、酵母において最も頻繁に使用されるコドンからなる
ように設計することができるということである。上の定
義に従い、自然ヒトリゾチームに関して多少の修飾が実
際の目的でなされている。例えば、改良された熱安定性
および／または比活性を有する、タンパク質の遺伝情報
を指定する、任意のDNAセグメントは、本発明の範囲内
に包含されると考えなくてはならない。

リゾチームを酵母において発現させかつそれから分泌
させるために、それらの異なる要素、すなわち、５′〜
３′調節可能なプロモーター、適当なシグナルペプチド
の遺伝子情報を指定するDNA配列、リゾチームをエンコ
ードするDNAセグメントおよび、好ましくは、酵母転写
ターミネーターからなる発現カセットは、酵母の発現ベ
クターに構成しかつその中に適当に挿入されなくてはな
らない。１つの可能性は、欠損LEU2遺伝子のマーカーと
して使用されるものとして、多数のコピーで酵母中で複
製することができるプラスミドを使用することである。
このような発現プラスミドの好ましくは異型は、酵母の
内因性の２−ミクロンのプラスミドから誘導されたもの
および、なお好ましくは、その完全な配列からなるもの
である。この場合において、形質転換のためにcir°菌
株、すなわち、それらの２−ミクロンのプラスミドから
キュアーした菌株を使用することができる。こうして得
られた形質転換体は、リゾチーム遺伝子で構成されたキ
メラのプラスミドのみを含有する。したがって、それら
のコピーの数は最大となり、そして組み換え反応から得
られるプラスミドの不安定性は最小とされる。それにも
かかわらず、最大の発現安定性のために。発現カセット
を酵母ゲノム中に組み込むことが好ましい。こうして、
非常に多数の発現系を、種々の構成要素を賢明に組み合
わせることにより考案することができ、それらの多数の
ものはすでにこの分野において入手可能である。

本発明に従い使用することができる酵母は、好ましく
は、サッカロミセス（Saccharomyces）属のもの、より
好ましくはサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomy
ces cerevisiae）種のもの、すなわち、パン酵母であ
る。この理由の１つは、その生物学的性質が比較的より
知られていることである。他の重要な理由は、S.cerevi
siaeは、最近オーガニゼイション・フォー・エコノミッ
ク・アンド・デヴェロップメント（Organization for E
conomic and Development） （OECD）により定義され
たような「すぐれた工業的に大規模な実施（Good Indus
trial Large Scale Practice）」にことに適当する、典
型的にはGRAS（一般に安全と認識されている）微生物で
あることにある。しかしながら、本発明の方法は、ま
た、有利に、酵母の他の種、例えば、クルイベロミセス
・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ピチア・パスト
リス（Pichia pastoris）、サッカロムコプシス・リポ
リチカ（Saccharomycopsis lipolytica）、シュワンノ
ムセス・アルビウス（Schwannomyces alluvius）、シゾ
サッカロムセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pomb
e）などに適用することができる。

当業者は理解するように、ヒトリゾチームの遺伝情報
を指定するDNAセグメントを前述したように調節可能な
プロモーターの制御下に置くとき、宿主有機体を成長さ
せると同時に酵素の合成を回避することができる。その
ために、プロモーターが抑制されたままであるような成
長条件を維持しなくてはならない。例えば、PHO5プロモ
ーターを使用するとき、培地中の無機ホスフェートは、
所望の細胞濃度が得られるまで、十分に高い値で、例え
ば、培地への無機ホスフェートの添加により、監視しな
くてはならない。次いで、添加を中断したときかつ他の
栄養が制限量でない場合、培地中の無機ホスフェートの
濃度は連続する成長の結果減少して、リゾチームの合成
を誘発するが活性な成長を保証しないために十分に低い
値に到達する。

同様に、グルコースにより抑制され、そしてエタノー
ルにより脱抑制されるプロモーター、例えば、ADH2プロ
モーターを使用するとき、グルコースの濃度は成長を保
証するがリゾチームの合成を保証しないために十分に高
いレベルに維持すべきである。このような条件は、いわ
ゆるクラブトリ効果の結果、エタノールの産生を生ずる
［参照、例えば、O.ケッパリ（KOPPELI）ら、CRC Criti
cal Reviews in Biotechonology）、4、299、1986］。
次いで、グルコースの供給を中断すると、リゾチームの
合成はこうして産生されたエタノールの犠牲で起こるで
あろう。

本発明を実施する好ましい方法に従い、酵母の培養お
よびリゾチームの産生を別の作業として実施する。第１
培地において、酵母の成長はリゾチームの不存在下に所
望の細胞密度まで起こる。次いで、細胞をリゾチームの
合成を保証するが、成長を制限するために選択した培地
中に移す。この方法の主要な利点は、両者の作業に最適
な条件を独立に適用できるということである。これらの
作業は、バッチ式で、供給バッチ作業におけるような半
連続的に、あるいは完全に連続的に実施することができ
る。

本発明をなおいっそう詳細に説明するために、第９図
を参照する、この図面は、本発明を実施する特定のモー
ドが説明し、したがって本発明を限定するものと考慮す
べきでない。こうして図解される方法において、酵母の
培養は発酵槽１において実施し、ここで空気をライン２
からおよび適当な栄養をライン３から供給する設備が設
けられている。これらの栄養は、前に説明したように、
活性な成長を保証するが、リゾチームの合成を抑制する
ために十分な量で供給すべきである。それらは炭素源か
らなり、炭素源は純粋なグルコースまたはスクロースま
たは工業的廃液、例えば、糖蜜であることができる。成
長に要求される他の栄養は、無機塩、例えば、(NH₄)₂SO
₄およびK₂HPO₄の形態であることができ、これらは、パ
ン酵母の産生において一般に使用されるような、成長因
子、例えば、アミノ酸、ビタミン、および金属塩類とと
もに補充することができる。あるいは、それらはより複
雑な自然産生物、例えば、酵母エキス、ペプトン、麦芽
エキスなどの形態で供給することができる。

酵母の培養は、正常の作業と適合しうる、最高な可能
な細胞濃度で実施されるであろう。たいていの場合にお
いて、槽１において到達される酵母の濃度は乾燥重量の
0.5〜10％、好ましくは３〜６％であろう。0.5％より低
いと、取り扱うべき体積は回収すべき有用な産生物の量
と不釣合いになり、そして10％より高いと、実際的問題
が、例えば、細胞懸濁液の高い粘度から生ずる。

槽１において産生されるバイオマスは、ライン４を通
して遠心装置５に送られ、ここでそれは濃縮される。正
常にされた培地はライン６を経て槽１少なくとも部分的
に再循環させ、残りは廃棄される。濃縮された細胞懸濁
液はライン７を通して槽８へ移される。この懸濁液の一
部は、また、ライン９を通して槽１へ再循環することが
できる；これは高い細胞密度およびバイオマスの高い産
生を達成するために、連続的作業においてことに興味あ
ることである。

槽８において、栄養をライン10からおよび空気をライ
ン11から供給する。そこにおける条件はリゾチームの発
現系の完全な脱抑制するようなものであり、したがっ
て、それらは遺伝子の転写を制御するために選択したプ
ロモーターに依存する。上に強調した理由で、また、こ
れらの条件は、例えば、成長に要求されるがタンパク質
の合成に要求されない、ある因子の濃度を制限すること
によって、成長を制限するように調節することが重要で
ある。

リゾチーム産生酵母の懸濁液は、槽８からライン12を
通して抜き出される。細胞を遠心装置13から分離し、こ
の培地は、抽出ユニット15においてリゾチームの抽出の
ために処理した後、少なくとも部分的にライン14を経て
槽８少なくとも部分的に再循環する。この後者の作業
は、イオン交換または親和性物質への吸着により容易に
活性化され、次いでこれから酵素を、例えば、ライン16
からの水性NaC1で、溶離することにより容易に回収する
ことができる。溶離液は引き続いてライン17を経て精製
ユニット18へ送り、ここでそれを処理し、この処理は他
の古典的な方法、例えば、限外濾過、結晶化などの組み
合わせからなることができる。最後に、商業化のために
準備された乾燥産生物は、凍結乾燥または噴霧合成（図
示せず）により得ることができる。

本発明の実施において、少なくとも２つの理由で、酵
母細胞から選択されたリゾチームの主要部分が細胞壁に
会合したままであるような条件を、槽８において適用す
ることが有利であることがある。第１の理由は、細胞に
会合したリゾチームは脱活性化に対して保護されるから
である。脱活性化は、酵素が培地中に遊離されるとき、
徐々に起こる。第２の理由は、ベルギー国特許BE第903,
626号に教示されているように、前記細胞に会合したリ
ゾチームの実質的な分画は、無機塩の水溶液により簡単
な線状で濃縮した形態で回収することができることにあ
る。第10図は、このような条件を槽８に適用する、本発
明の方法の実施態様を示す。酵母の懸濁液をライン12を
通して槽８から抜き出す。遠心装置13において、細胞を
培地から分離し、この培地を少なくとも部分的にライン
14を通して槽８に再循環し、残りを廃棄する。遠心装置
13からの細胞をライン19においてライン20からの無機塩
の水溶液を接触させ、これにより細胞壁に会合したリゾ
チームをそれから遊離する。前記塩は水溶性であり、比
較的中性であり、そして好ましくは酵母細胞に対して無
毒である。特定の例は、次のとおりである:NaCl、KCl、
NaNO₃、KNO₃、Na₂SO₄、(NH₄)₂SO₄など。経済性の理由
で、NaClは一般に好ましいであろう。細胞に会合したリ
ゾチームの効率よい回収のために使用すべきその濃度
は、臨界的でなく、例えば、0.2〜2.0モルの範囲内で変
化することができる。実際に、0.5〜1.0モルのNaClの濃
度は有利に使用される。0.5モルより低い濃度は、一般
に、回収を制限し、その結果、産生されたリゾチームの
実質的な部分は残留する細胞とともに失われる。他方に
おいて、1.0モルより高い濃度は一般に改良をもたらさ
ないであろう。次いで、こうして遊離されたリゾチーム
は遠心装置24において残留細胞から分離し、そして前述
と同一の技術によりユニット18においてさらに精製する
ことができる。こうして、酵母の細胞壁事態は、酵素を
回収するための吸着物質として、作用しかつ利用するこ
とができる。

作業のこの後者のモードを適用するために、槽８にお
ける無機塩の濃度を制限することが重要である。逆に、
作業の最初に述べたモードにおけるように、ユニット15
における抽出により培地から酵素の主要部分を回収する
ことが好ましい場合、槽８における無機塩の濃度を増加
ことがよりよい。この目的に対して、同一塩類を細胞に
会合したリゾチームの回収について上に定義したのと同
一の濃度で使用することができる。以下の実施例におい
て示すように、高い濃度の塩の存在は、成長制限条件下
に、成長する酵母に対して悪影響を及ぼすが、酵母を産
生するリゾチームにとってそうではない。したがって、
本発明の２工程の方法のそれ以上の利点は、バイオマス
の産生に最適な条件下に酵母を成長させ、次いで培地中
にへの酵素の最適な分泌を保証する条件下ににリゾチー
ムの合成を誘発する手段を提供することである。

作業のどのモードから得られた残留酵母も、回収し、
そしてそれ以上の処理、例えば、プレスまたは乾燥後、
究極的にそのまま使用することができる。このような残
留物は、また、部分的に槽８へ再循環してさらにリゾチ
ームの産生を実施するか、あるいは、究極的に適当な崩
壊処理後、栄養および成長因子の源として発酵装置１へ
再循環することができる。

以上の説明ならびに本発明の他の実施態様は、以下の
実施例から明らかとなるであろう。これらの実施例は、
例示を目的とし、本発明の範囲を限定することを意図し
ない。

実施例 １、スクリーニングにニワトリリゾチームシグナル配列
を使用する酵母における（１）ヒトリゾチーム、（２）
ヒトリゾチームのGly−４突然変異体および（３）ニワ
トリリゾチームのプラスミド仲介発現 1.1、発現ベクターの構成 1.1.1、ヒトリゾチーム 酵母の好ましいコドンをもつヒトリゾチーム遺伝子の
配列に対応するオリゴヌクレオチドを、アプライド・バ
イオシステムス（Applied Biosystems）DNA合成装置で
ホスホルアミダイトの化学を使用して合成した。個々の
オリゴヌクレオチドは、オーバーラップを最大にしかつ
不正確なアニーリングを最小にするコンピュータープロ
グラムを使用して設計した。分子のすべては５′末端を
除外して５′ホスフェートを有した。全体の遺伝子をア
ニーリングし、一緒に結合し、そして全長の結合生成物
（参照、第１図）をアガロースゲルから分離した。次い
で、それを５′末端においてT4ポリヌクレオチドキナー
ゼでリン酸化し、そしてNcoIおよびSalIおよびアルカリ
性ホスファターゼで処置したプラスミドpGAPl中に結合
した。pGAPlはpGAPの誘導体（参照、J.トラビス（TRAVI
S）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J.Biol.Chem.）、260、4384、1985）であり、こ
こでGAPプロモーター（グリセルアルデヒド−３−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ遺伝子491プロモーター）は
雑種ADH2−GAPプロモーターで置換されている［参照、
L.S.コウセンス（COUSENS）ら、遺伝子（Gene）、61、2
65、1987］。次いで、リゾチーム遺伝子をジデオキシ配
列分析にかけ、そして設計した配列を表かした。ADH2−
GAPプロモーター、ニワトリリゾチームシグナル配列、
ヒトリゾチーム遺伝子、およびGAPターミネーターから
成る発現カセットを、BamHIで切除し、そして酵母−E.c
oliシャトルベクターpAB24において挿入した［参照、P.
J.バール（BARR）ら、ジャーナル・オブ・イクスペリメ
ンタル・メディシン（J.Exp.Med.）、165、1160、198
7］。生ずるプラスミド、pAB24AGScLysHは第２図に示さ
れている。

1.1.2、Gly−４ヒトリゾチーム Glu−４のヒトリゾチーム遺伝子におけるグルコース
への突然変異体を含有する類似プラスミドを作るため
に、標準の方法を使用して、ニワトリのシグナルにおい
てSpel部位から、成熟タンパク質の位置４におけるコド
ンがGAA（グルタミン酸）からGGA（グルコース）に変化
してヒト遺伝子におけるNhel部位までの遺伝子の部分を
合成した。発現ベクターの再構成は、第４図に示すプラ
スミドp244を生じた。

1.1.3、ニワトリリゾチーム 同様な方法を使用して、ADH2−GAPプロモーターによ
り推進されたニワトリリゾチーム遺伝子をもつプラスミ
ドを作ることができた。このプラスミドは、第５図に示
すpAB24AGScLysCである。

1.2、酵母におけるリゾチームの発現および分泌 ３つのプラスミドをS.cerevisiae菌株中に形質転換
し、そしてロイシンプロトトローフを選択した。このS.
cerevisiaeはGRF18の誘導体［E.エルハルト（ERHART
（およびC.P.ホレンベルグ（HOLLENBERG）、ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー（J.Bactriology）、156、62
5、1983］であり、これから内因性２−ミクロンのサー
クル（circle）がキュアーされていた。形質転換体をロ
イシンを欠き、そして８％のグルコースを含有する最小
培地中で28℃において２日間成長させた。次いで、それ
らを使用して８％のグルコースを含有する複合培地（YE
P:1％の酵母エキス＋２％のペプトン）の培養物に1:150
の比で接種し、そしてこれらの培養物を28℃において18
0rpmで成長させた。５日間培養した後、10mlのアリコー
トを取り出し、2500gで10分間遠心し、そしてリゾチー
ムの活性を培養上澄み液において決定した（S_o分画）。
アッセイはD.シュガー（SHUGAR）の方法［参照、バイオ
ヒミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochim.Biop
hys.Acta）、8、302、1952］に従い基質としてミクロコ
ッカス・リソデイクチクス（Micrococcus lysodeikticu
s）を使用して実施した。活性の１単位は、1mlの反応混
合物中で66ミリモルのリン酸カリウム、pH6.24、中のM.
lysodeikticusの懸濁液を使用して、0.001/分の450nmに
おける吸収の減少を引き起こす酵素の量として定義す
る。

形質転換体からの細胞を、0.5モルのNaClを含有する
0.1モルリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5の1ml中に懸濁
させ、そして４℃において５分間インキュベーションし
た。細胞を遠心により除去し、そして塩洗浄液（分画
S₁）中のリゾチーム活性を決定した。細胞内であったリ
ゾチームの量を決定するために、細胞の沈澱物を５分間
ガラスビーズとともに、0.5モルのNaClおよび0.05％の
トリトンＸ−100を含有する0.1モルのリン酸ナトリウム
緩衝液、pH6.5、中でブラウン（Braun）ホモジナイザー
内で攪拌した。細胞破片を12500gにおける遠心により分
離した後、可溶性細胞内分画（分画S₂）中に存在するリ
ゾチーム活性を決定した。

得られた結果を表１に記載する。

合計のリゾチーム活性は、グルコース中で成長させた
ときヒトについて433U/OD（活性単位／光学密度の単
位）および、それぞれ、ヒト突然変異体およびニワトリ
リゾチームについて167および170U/ODであった。すべて
の３つの場合において、合計の活性の14および32％が分
泌された：それは培地（S₀）中に存在しおよび／または
細胞に会合しており、不活性前記細胞からNaClの洗浄に
より細胞を破壊せずに解放することができ（S₁）、後者
の活性は、分泌されるが酵母細胞壁にまだ吸着している
リゾチームの分画に相当する。

1.3、分泌されたリゾチームの分離、精製および特徴づ
け 酵母誘導組み換え体を精製するために、菌株GRF180中
の３つのプラスミド形質転換体の培養物を、前述したよ
うに、８％のグルコースを含有するYEP培地中で５日間
成長させた。細胞を2500gにおいて15分間遠心により濃
縮し、次いでそれらを等しい体積の、0.5モルのNaClを
含有する0.1モルのリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5、中
に再懸濁させた。４℃において60分間インキュベーショ
ン後、上澄み液を遠心により集め、0.1モルのリン酸ナ
トリウム緩衝液pH6.5で10倍に希釈し、そしてCM−セフ
ァローズ（Sepharose）ファストフロー［ファーマシア
（Pharmacia）］カラム上に装入した。装入の完結後、
カラムを同一緩衝液で洗浄し、次いでリゾチームを0.5
モルのNaClを含有する同一緩衝液で溶離した。前述した
ように決定したリゾチーム活性を含有する分画をプール
し、アミコン・ダイヤフロー（Amicon Diaflow）膜を使
用する限外濾過により濃縮し、セファデックス（Sephad
ex）Ｇ−25カラムで脱塩し、そして凍結乾燥した。

リゾチーム調製物の比活性は、まずリゾチーム活性を
前述のように測定し、そしてバイオラド（Biorad）タン
パク質アッセイを使用し、ニワトリリゾチームを標準と
して用いて、タンパク質濃度を測定することによって決
定した。結果を表２に示す。

ここに記載する値に基づいて、表１に示すグルコース
培地中の３つのリゾチームの合計の合成は、ヒト、ヒト
突然変異体およびニワトリリゾチームについて、それぞ
れ、17、19および19mg/lである。SDSポリアクリルアミ
ドゲルの分析により、すべての３つの試料は、適当な対
照（ヒトタンパク質についてヒト乳リゾチームおよびニ
ワトリリゾチームについて卵白リゾチーム）と同一の移
動度を有する単一のバンドとして移動することが示され
た。自動化されたエドマン（Edman）分解にかけたと
き、すべての３つのタンパク質はリジンの単一のＮ末端
を有し、そしてそれ以上の配列の分析はDNA配列から期
待される配列を与えた。こうして、ニワトリのシグナル
配列はすべての３つのタンパク質から正しく処理され
る。

比較例１ 実施例1.2に記載する成長のプロトコルをすべての３
つのタンパク質について反復したが、ただし１％のエタ
ノールを炭素源として８％のグルコース代わりに使用し
た。この培地は、細胞の成長およびリゾチームの合成が
同時に起こるようなものである。３つの培養物における
リゾチーム活性を決定したとき、表１に示す結果が得ら
れた。ヒトタンパク質およびヒト突然変異体タンパク質
の両者について、エタノール中の成長はリゾチームの産
生を、細胞を８％のグルコース中で成長させたときのレ
ベルの５％より下に劇的に減少させた。対照的に、ニワ
トリリゾチームの発現は８％のグルコース培養物におい
て観察されるレベルの50％に減少しただけでであった。

これらの結果が明瞭に実証するように、酵中で実際的
に重要性をもつために十分に活性なヒトリゾチーム（真
性または突然変異体、ニワトリではない）の合成を達成
するために、本発明に従い、成長が同時に起こらないよ
うな条件下に作業することが必要である。

上の実施例において使用した培養条件下におけるプラ
スミドの安定性を推定するために、それ以上の試験をま
た実施した。これらの試験は、ペトリ皿上で、実験の終
わりにおいてロイシンのプロトトロフィーをなす表す酵
母細胞、すなわち、リゾチーム発現プラスミドを保持す
る細胞、、の分画を決定することから成る。こうして得
られた結果を、また、表１に示す。それらが示すよう
に、ヒトリゾチーム（真性または突然変異体、ニワトリ
ではない）の場合において、細胞はプラスミドを実質的
失ったエタノールの存在下に成長した。こうして、成長
はヒトリゾチームの合成により非常に障害されるので、
有系分裂の分離の結果プラスミドを失った細胞の数はプ
ラスミドをなお有するもののそれを急速に越えるように
思われる。

比較例２ 標準の方法を使用して、酵母におけるその発現が第１
図に示されている３つのリゾチーム遺伝子を強い構成的
GAPプロモーターを使用して、発現カセット中に挿入し
た。ニワトリリゾチームの構成体は第６図に示す；ヒト
およびヒト突然変異体のプラスミドは、リゾチーム遺伝
子を除外して同一である。これらのプラスミドをGRF180
中に形質転換しそしてロイシンプロトトローフを選択し
たとき、ヒトおよびヒト突然変異体のプラスミドを使用
して形質転換体はえることができなかったが、ニワトリ
リゾチーム発現プラスミドを使用して形質転換体は容易
に得られた。これらの形質転換体は実施例１に記載する
ように成長させ、そしてリゾチーム活性を決定した。合
計のニワトリリゾチーム活性は110U/Odであり、これに
対してADH2−GAPプラスミドを有する調節された発現プ
ラスミドについて173U/ODであった。

これは、ヒトリゾチームの合成は成長する酵母細胞に
悪影響を及ぼすという比較例１から誘導された結論を確
証する。この効果が上の特定の実験において使用した特
定の酵母菌株に限定されないことを確認するために、こ
の比較例の形質転換プロトコルを次の菌株を使用して反
復した：菌株AH22［A.ヒンネン（HANNEN）ら、プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、75、1929、19
78］、菌株S150−2B［C.ハドフィールド（HADFIELD）
ら、遺伝子（Gene）、52、59、1987］、菌株Ｙ−294
［G.S.ブルッゲ（BRUGGE）ら、モレキュラー・アンド・
セルラーバイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、7、2180、1
987］および菌株MC16 cir°［A.B.フチャー（FUTCHER）
およびB.S.コックス（COX）ら、ジャーナル・オブ・バ
クテリオロジー（J.Bactriology）、157、283、198
4］。GRF180を使用しときと実質的に同一の結果が得ら
れた。

２、分泌のためにアルファ因子のリーダーを使用して酵
母におけるヒトリゾチームのプラスミド仲介発現 2.1、発現ベクターの構成 プラスミドpAB24AGalphaFLysH（参照、第７図）を、
ニワトリシグナル配列をもたないヒトリゾチーム遺伝子
のほとんどを含有するNhel−BamHI断片およびGAPターミ
ネーターをプラスミドpAB24AGScLysH（第２図）から分
離することによって作った。合成Xba−Nheアダプターを
使用して、この断片を、アルファー因子リーダーに融合
したADH2−GAPプロモーターを含有するBamHI−Xba断片
に結合した［参照、A.J.ベイク（BAKE）ら、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、81、4642、198
4］。得られるプロモーター、アルファ因子リーダー、
ヒトリゾチーム遺伝子、およびターミネーターから成る
BamHI発現カセットを、プラスミドpAB24中に挿入して、
第７図に示すpAB24AGalphaFLysHを産生した。

2.2、ヒトリゾチームの発現および分泌 このプラスミドを酵母菌株GRF180、GRF18のcir°誘導
体、中に形質転換し、そしてロイシンプロトトローフを
選択した。形質転換体を８％のグルコースを含有するロ
イシン選択的培地中で２日間成長させ、次いで２％のグ
ルコースを含有するYEP培地中に1:20で希釈した。30℃
において２日間培養した後、細胞を収穫し、そして前述
のようにリゾチーム活性を決定した。結果を表３に示
す。

明らかなように、リゾチームはアルファ因子リーダー
融合構成体により発現および分泌されるが、レベルはニ
ワトリシグナルを使用するときより低い。

３、酵母におけるヒトリゾチームの組み込み仲介発現 3.1、組み込みベクターの構成 その構成を実施例1.1に記載するヒトリゾチーム発現
カセットを、プラスミドpAB24AGScLysH（参照、第２
図）から、制限酵素BamHIを使用する消化により切除
し、そして組み込みプラスミドYIP5［参照、K.ストルヒ
ル（STRUHL）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Aca
d.Sci.）USA、76、1035、1979］中に挿入して、第８図
に示すYIP5AGScLysHを産生した。

３。２、ヒトリゾチームの発現および分泌 このプラスミドをGAPターミネーターにおいてSac2で
直線化し、次いで菌株GRF181、GRF180のura3欠失誘導
体、中に形質転換した。ウラシルプロトトローフを８％
のグルコースを含有するウラシル選択的平板上で選択し
た。次いで、形質転換体を８％のグルコースを含有する
ウラシル選択培地中で成長させ、そして発現のため８％
のグルコースを含有するYEP培地中に1:20に希釈した。
５日後。培養物を収穫し、そして前述のようにリゾチー
ム活性を測定した。結果を表４に示す。リゾチーム活性
はこれらの組み込み体について明瞭に実証されたが、レ
ベルは同一条件下にプラスミド仲介発現について見られ
たレベルより低かった。

４、形質転換した酵母の培養におけるヒトGly−４突然
変異体リゾチームの分布への塩化ナトリウムの影響 プラスミドpAB24AGScysHGly4（参照、第４図）で形質
転換した酵母菌株GRF180を、ロイシンを欠きかつ８％の
グルコースを含有する最小培地中で28℃において３日間
成長させた。次いで、得られる培養物を使用して、８％
の複合YEP培地を1:150比で接種した。実施例１に記載す
るのと同一のリゾチームの決定のためのプロトコルを、
28℃において89および209時間後に得られた培養物に適
用した。リゾチームの分布への無機塩の効果を決定する
ために、培養物のアリコートの部分にNaClを89時間後0.
5モルのNaClに補充し、そしてインキュベーションを対
照の培養におけるように続けた。同一の接種物を使用す
る他の実験において、0.5モルのNaClを培養の開始から
存在させた。

得られた結果を表５に記載する。

表５のデータが示すように、普通のYEP培地におい
て、リゾチームのほとんどは細胞内（S₂分画）に見いだ
され、インキュベーション時間が少なくなると、より多
くなる。対照的に、NaClを系に添加すると、リゾチーム
は主としてS₀＋S₁分画中に見いだされる、すなわち、主
に分泌される。実質的に、NaClが培養の開始時に存在す
るとき、同一のリゾチームの分布が得られる；しかしな
がら、、この場合において、成長は多少阻害される。

同一のタイプの結果は、真性のヒトリゾチームを産生
するように形質転換した酵母を使用して得られる。

５、ヒトリゾチームの合成および分泌への合成酵母培地
の影響 プラスミドpAB24AGSLcysH（第２図）を使用する酵母
菌株GRF180を、ロイシンを欠きかつ８％のグルコースを
含有する最小培地を28℃において３日間成長させ、次い
で得られる培養物を使用して、８％のグルコースを含有
する複合YEP培地を1:6の比で接種した。28℃において48
時間後、細胞を遠心により収穫し、そして同一体積の合
成培地中に再懸濁した。この合成培地の組成を表６に記
載する。

表6:ヒトリゾチームの合成および分泌のための合成培地 KH₂PO₄ 6g MgSO₄．7H₂O 3g CaCl₂．2H₂O 0.1g NaCl 0.1g (NH₄）₂SO₄ 40g カゼイン加水分解物 20g ビタミン混合物 10ml ビオチン 0.002％ 葉酸 0.002％ カルシウムパントテネート 0.4％ ニコチン酸 0.4％ ピリドキシン−HCl 0.4％ チアミン−HCl 0.4％ ｐ−アミノ安息香酸 0.2％ リボフラビン 0.2％ ミオイノシトール 2.0％ 微量元素溶液 10ml MnSO₄ 0.4％ ZnSO₄ 0.4％ FeCl₂ 0.2％ モリブデン酸ナトリウム 0.2％ ホウ酸 0.5％ 硫酸第二銅 0.4％ KI 0.1％ ヌクレオチドおよびアミノ酸補充物質 40ml アデニン １％ ウリジン １％ トリプトファン １％ メチオニン １％ システイン １％ スレオニン １％ ヒスチジン 0.05％ 水 １とする量 比較のため、細胞のアリコートの部分を新鮮なYEP培
地中に再懸濁した。両者の培地に８％のグルコースを補
充した。次いで得られる懸濁液を28℃において90時間さ
らにインキュベーションし、そして、培養物中のリゾチ
ームの分布を実施例１に説明するように決定した。

得られる結果を表７に示す。

表７におけるデータが前の実施例のデータ、すなわ
ち、YEP目は、成長に好ましいが、広範な分泌を促進し
ない、を確証する：産生されたリゾチームの約3/4は細
胞内に止まる。対照的に、使用した合成培地において、
リゾチームの約3/4は分泌され、その93％は溶液中に放
出される、すなわち、普通の手段、例えば、限外濾過に
より容易に回収可能である形態である。

しかしながら、他の実験は、この合成培地はことに活
性な成長を保証しないことを示した。こうして、明らか
なように、本発明に従い、リゾチームからバイオマスの
産生を分離し、そしてヒトリゾチームの最適な産生を達
成するために、両者の工程の条件を別々に選択すること
が重要である。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１、工程： DNAが遺伝子操作されている成長する酵母細胞を成長
制限条件下に培地と接触させ、そして前記酵母細胞を誘
発して酵素的に活性なリゾチームを合成および分泌させ
る、 からなることを特徴とする、酵素的に活性なリゾチー
ムを産生する方法。

２、酵母細胞により産生および分泌されたリゾチームは
酵母細胞に対して毒性である、上記第１項記載の方法。

３、酵母細胞により産生および分泌されたリゾチーム
は、ヒトリゾチームまたはその突然変異体である、上記
第２項記載の方法。

４、リゾチームの合成の誘発は調節可能なプロモーター
により保証される、上記第１項記載の方法。

５、前記プロモーターはリプレッシブル（repressibl
e）プロモーターであり、そしてリゾチームの合成はプ
ロモーターを活動的にする（derepress）ことによって
誘発する、上記第４項記載の方法。

６、前記プロモーターは、PH05、ADH2、GAL1、GAL10、S
UC2、MAL6S、MAL6T、CYC1、一般のアミノ酸制御におい
て含まれる遺伝子のプロモーター、温度感受性プロモー
ター、およびそれらから構成された雑種プロモーターか
らなる群から選択される、上記第４記載の方法。

７、前記プロモーターはPH05およびその上流の活性化配
列で構成された雑種プロモーターからなる群から選択さ
れる、上記第６項記載の方法。

８、プロモーターはADH2−GAP雑種プロモーターであ
る、上記第６項記載の方法。

９、リゾチームの主要部分は培地中に分泌される、上記
第１項記載の方法。

10、前記培地は、前記酵母細胞の壁から前記培地中にリ
ゾチームを遊離するために有効な量の無機塩を含有す
る、上記第９項記載の方法。

11、前記無機塩は水溶性であり、そして前記酵母細胞に
対して無毒である、上記第10項記載の方法。

12、前記無機塩はNaCl、KCl、NaNO₃、Na₂SO₄および(N
H₄)₂SO₄からなる群から選択される、上記第10項記載の
方法。13、前記無機塩はNaClである、上記第12項記載の
方法。

14、前記無機塩の濃度は0.2〜２モルである、上記第10
項記載の方法。

15、前記無機塩の濃度は0.5〜１モルである、上記第14
項記載の方法。

16、分泌されたリゾチームの少なくとも50％は酵母細胞
の壁と会合して（associate with）止まる、上記第１項
記載の方法。

17、無機塩の濃度は0.2モル以下である、上記第16項記
載の方法。

18、工程： 酵素的に活性なリゾチームの合成を抑制する培地中
で、DNAが遺伝子操作されている酵母細胞を成長させ、
そして 前記成長する酵母細胞を成長制限条件下に培地と接触
させ、そして前記酵母細胞を誘発して酵素的に活性なリ
ゾチームを合成および分泌させる、からなることを特徴
とする、酵素的に活性なリゾチームを産生する方法。

19、酵母細胞により産生および分泌されたリゾチームは
酵母細胞に対して毒性である、上記第18項記載の方法。

20、酵母細胞により産生および分泌されたリゾチーム
は、ヒトリゾチームまたはその突然変異体である、上記
第19項記載の方法。

21、リゾチームの合成の誘発は調節可能なプロモーター
により保証される、上記第18項記載の方法。

22、前記プロモーターはリプレッシブルプロモーターで
あり、そしてリゾチームの合成はプロモーターを活動的
にすることによって誘発する、上記第21項記載の方法。

23、前記プロモーターは、PH05、ADH2、GAL1、GAL10、S
UC2、MAL6S、MAL6T、CYC1、一般のアミノ酸制御におい
て含まれる遺伝子のプロモーター、温度感受性プロモー
ター、およびそれらから構成された雑種プロモーターか
らなる群から選択される、上記第４項記載の方法。

24、前記プロモーターはPH05およびその上流の活性化配
列で構成された雑種プロモーターからなる群から選択さ
れる、上記第23項記載の方法。

25、プロモーターはADH2−GAP雑種プロモーターであ
る、上記第23項記載の方法。

26、リゾチームの少なくとも50％は培地中に分泌され
る、上記第18項記載の方法。

27、前記培地は、前記酵母細胞の壁から前記培地中にリ
ゾチームを遊離するために有効な量の無機塩を含有す
る、上記第26項記載の方法。

28、前記無機塩は水溶性であり、そして前記酵母細胞に
対して無毒である、上記第27項記載の方法。

29、前記無機塩はNaCl、KCl、NaNO₃、Na₂SO₄および(N
H₄)₂SO₄からなる群から選択される、上記第27項記載の
方法。

30、前記無機塩はNaClである、上記第29項記載の方法。

31、前記無機塩の濃度は0.2〜２モルである、上記第27
項記載の方法。

32、前記無機塩の濃度は0.5〜１モルである、上記第31
項記載の方法。

33、分泌されたリゾチームの少なくとも50％は酵母細胞
の壁と会合して止まる、上記第18項記載の方法。

34、無機塩の濃度は0.2モル以下である、上記第33項記
載の方法。

35、次ぎの配列 および自然ヒトリゾチームと異なりかつムラミダーゼ
活性を保持するタンパク質の遺伝情報を指定する、その
突然変異体からなる群から選択される、ことを特徴とす
る、ヒトリゾチームのための合成遺伝子。

36、上記第35項記載の合成遺伝子を発現することができ
るように遺伝子操作されていることを特徴とする、酵母
細胞。

37、前記合成遺伝子の５′末端は、酵母分泌の機構によ
り認識されかつ正しく切断されているシグナルペプチド
の遺伝情報を指定する、リーダー配列と同調して融合さ
れている、上記第36項記載の酵母細胞。

38、リーダー配列はニワトリリゾチームのシグナルペプ
チドをエンコードする、上記第37項記載の酵母細胞。

39、合成遺伝子の発現は調節可能なプロモーターにより
制御される、上記第37項記載の酵母細胞。

40、前記プロモーターはリプレッシブルプロモーターで
あり、そしてリゾチームの産生はプロモーターを活動的
にすることによって誘発する、上記第39項記載の酵母細
胞。

41、前記プロモーターは、PH05、ADH2、GAL1、GAL10、S
UC2、MAL6S、MAL6T、CYC1、一般のアミノ酸制御におい
て含まれる遺伝子のプロモーター、温度感受性プロモー
ター、およびそれらから構成された雑種プロモーターか
らなる群から選択される、上記第39記載の酵母細胞。

42、前記プロモーターはPH05およびその上流の活性化配
列で構成された雑種プロモーターからなる群から選択さ
れる、上記第41項記載の酵母細胞。

43、プロモーターはADH2−GAP雑種プロモーターであ
る、上記第41項記載の酵母細胞。

44、宿主菌株はサッカロミセス・セレビシアエ（Saccha
romyces cerevisiae）属に属する、上記第36項記載の酵
母細胞。

45、宿主菌株は菌株GRF18、GRF180、AH22、MC16 cir
°、S150−2BおよびＹ−294からなる群から選択され
る、上記第44項記載の酵母細胞。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトリゾチームの遺伝情報を指定する合成遺
伝子の配列を示し、ここでヒトリゾチームは酵母の好ま
しいコドン［J.L.ベンネツゼン（BENNETZEN）およびB.
D.ハル（HALL）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J.Biol.Chem.）、257、3026、1982］を
使用してアプライド・バイオシステムス（Applied Bios
ystems）DNA合成装置でホスホルアミダイトの化学に従
い合成された。 第２図は、プラスミドpAB24AGScLysHを示し、これはヒ
トリゾチームの酵母における発現のために使用すること
ができ、そして調節可能なADH2−GAPプロモーター、ニ
ワトリリゾチームのシグナル配列、第１図に示すヒトリ
ゾチーム遺伝子およびGAPターミネーターからなるヒト
リゾチーム発現カセットの酵母−E.coliシャトルベクタ
ーpAB24中に挿入することによって得られた。 第３図は、Gly−４をもつ突然変異体ヒトリゾチーム遺
伝子の配列を示し、これはニワトリシグナルにおけるSp
el部位からヒト遺伝子においてNhel部位への合成断片を
使用して合成され、ここで成熟タンパク質の位置４にお
けるコドンはGAA（グルタミン酸）からGGA（グリシン）
に変化された。 第４図は、プラスミドpAB24AGScLysHGly4を示し、こ
れは第３図の突然変異体遺伝子が第１図に示すヒトリゾ
チーム遺伝子と置換されている以外、第２図に示すもの
と同一である。 第５図は、プラスミドpAB24GScLysCを示し、これは発現
カセットがADH2−GAPプロモーター、完全なリゾチームc
DNAおよびADHlターミネーターから成る以外、第２図に
示すものと同一である。 第６図は、プラスミドpAB24AGScLysCを示し、これは発
現カセットが構成的GAPプロモーター、第５図に示すの
と同一の細胞cDNAおよびGAPプロモーターから成る以
外、第２図に示すものと同一である。 第７図は、プラスミドpAB24AGalphaFLysHを示し、これ
はアルファ因子のリーダー配列がニワトリリゾチームの
シグナル配列と置換されている以外、第２図に示すもの
と同一である。 第８図は、プラスミドYIP5AGScLysHを示し、これは第２
図に示すプラスミドpAB24AGScLysHの構成のために使用
したのと同一のヒトリゾチーム発現カセットの組み込み
プラスミドYIP5中の挿入により得られた。 第９図は、本発明を実施するための１つの特定のモード
の実施態様のフローシートを示し、ここで分泌されたリ
ゾチームは液状培地から抽出により回収される。 第10図は、この方法の他の実施態様のフローシートを示
し、ここでリゾチームの産生はその分泌された部分が酵
母細胞の壁と会合して止まるような条件下に実施され
る。 １……発酵槽 ２……ライン ３……ライン ４……ライン ５……遠心装置 ６……ライン ７……ライン ８……槽 10……ライン 11……ライン 12……ライン 13……遠心装置 14……ライン 15……抽出ユニット 16……ライン 17……ライン 18……精製ユニット 20……ライン 24……遠心装置

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/36 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 スチーブン・ローゼンバーグ アメリカ合衆国カリフオルニア州94602 オークランド・バイウツドドライブ 2323 (56)参考文献 特開 昭62−6679（ＪＰ，Ａ) Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃ ｌｅｏｔｉｄｅｓ，６（182）（1987）, ｐ．335−340 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/36 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】DNAが遺伝子操作されている成長する酵母
   細胞を成長制限条件下に培地と接触させ、そして該酵母
   細胞を誘発して酵素的に活性なリゾチームを合成および
   分泌させることを特徴とする、酵素的に活性なリゾチー
   ムの産生方法。
2. 【請求項２】酵素的に活性なリゾチームの合成を抑制す
   る培地中で、DNAが遺伝子操作されている酵母細胞を成
   長させ、 該成長する酵母細胞を成長制限条件下に培地と接触さ
   せ、そして該酵母細胞を誘発して酵素的に活性なリゾチ
   ームを合成および分泌させる、 ことを特徴とする、酵素的に活性なリゾチームの産生方
   法。