JPH02156885A - ヒトリゾチームを産生する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子操作された酵母細胞の培養により、活
性なヒトリゾチームを産生する方法に関する。さらに詳
しくは、本発明は、活性ヒトリゾチームを高い収率で産
生しかつ酵母細胞により分泌し、活性ヒトリゾチームを
酵母細胞から容易に回収および精製することができる方
法に関する。

本発明は、要約すれば、次の通りである：調節可能なプ
ロモーターの制御下にリゾチームを産生および分泌する
ように適当に操作されているＤＮＡを有する酵母細胞を
、リゾチーム合成の実質的不存在下に成長させ、次いで
成長制限条件下に誘発してリゾチームを産生および分泌
させる。この方法は、とくに、ヒトリゾチームまたはそ
の突然変異体の産生に適当する。

リゾチームは、自然に広く広がって分布する酵素に与え
られた普通化であり、そしてバクテリアの細胞壁の主要
成分であるペプチドグリカンの加水分解を触媒すること
が知られている。この活性の結果、リゾチームは抗バク
テリア作用を有し、そして、この理由のため、はとんど
の生きている有機体が有するバクテリア感染に対する、
種々のバリアーにおいて参加すると信じられる。こうし
て、リンパ球および免疫グロブリンを欠く昆虫において
、バクテリアの感染に対する免疫応答は、そのリゾチー
ムが重要な成分である、ポリジーンの酵素系により保証
される［参照、例えば、Ｄ。

ハルトマーク（ＨＵＬＴＭＡＲＫ）ら、ヨーロピアン・
ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ−Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１０６．７．１９８０］。高等動
物において、リゾチームの生理学的役割はまだ知られて
いない［Ｒ−ラグマタン（ＲＡＧＨＵＮＡＴＨＡＮ）、
ＩＲＣ５Ｓｃｉ、上３，４８０．１９８５］が、その偏
在する分布はこの役割が重要であろうことを示唆してい
る。それは免疫系へ刺激作用を有しうろことが示唆され
た［参照、ｐ、ジョレス（ＪＯＬＬＥＳ）、バイオメデ
イシン（Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２５．２７６．１
９７６］。ヒトリゾチームは、生理学的投与量において
、多形核白血球により酵母細胞の生体外食作用を刺激す
ることが示された［参照、Ｍ、クロカカルス（ＫＬＯＣ
ＫＡＲ３）およびＰ、ロバーツ（ＲＯＢＥＲＴＳ）　、
アクタ・ヘマトロジ力（Ａｃｔａ　　Ｈａｅｍａｔ、）
、５８．２８９．１９７６］。また、リゾチームは幕の
監視およびマクロファージの抗腫瘍機能において一般の
役割を有しうろことが示唆された［参照、Ｅ、Ｆ、オツ
セルマン（○ＳＳＥＲＭＡＮ）ら、ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、２４３．３３１．１９７３］。より最近、リ
ゾチームそれ自体は多少抗腫瘍作用を有することが示さ
れた［参照、Ｒ，ラグナタン（ＲＡＧＨＮＡＴＩ（ＡＮ
）　、癌の検出および予防（Ｃａｎｃｅｒ　　Ｄｅｔｅ
ｃｔｉｏｎ　　　ａｎｃｌ　　　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ
）、　５．７８．１９８２］。すでに、ニワトリリゾチ
ームが、ことに日本において、種々の製剤学の応用にお
いて使用されている。

ニワトリリゾチームは、ヒトリゾチームをまた包含しか
つｃ　（ｃｈ　ｉ　ｃｋｅｎ）リゾチームと呼ばれる、
密接に関連する酵素のクラスに属する。

それらは次の性質を包含する同様な物理化学的性質によ
り特徴づけられる：約１５，０００の分子量、アミノ酸
配列および第３構造における密接な相同性、同一の酵素
活性、例えば、多少のキチナーゼ活性１これはｇ（ｇｏ
ｏｓｅ、ガチョウ）リゾチームと対照的であり、後者の
リゾチームは約２０．０００の分子量をもちそしてキチ
ナーゼ活性をもたない［参照、Ｐ、ジョレス（ＪＯＬＬ
ＥＳ）およびＪ、ジョレス（ＪＯＬＬＥｓ）、モレキュ
ラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．ｃｅ
ｌｌ、Ｂｉｏｌ、）、６３．１６５、＋９８４１゜ しかしながら、これらの構造的および物理化学的な類似
性にかかわらず、同一のクラス内のりゾ・チームは非常
に異なる免疫学的性質を有する。例えば、ニワトリリゾ
チームおよびヒトリゾチームはそれらのそれぞれの抗体
と交差反応性しない［参照、Ａ、フアツジ（ＦＡＵＲＥ
）およびＰ。

ジョレス（ＪＯＬＬＥＳ）　、ＦＥＢＳ　　Ｌｅ　ｔ　
ｔ。

ｌ０１２３７．１９７０］　。したがって、ヒトリゾチ
ームは製剤学的使用およびさらに食物の使用にことに応
用される。しかしながら、源が豊富でありかつ実際に利
用されている、すなわち、卵白からのニワトリリゾチー
ムと異なり、ヒトリゾチームは、ＤＮＡが前記酵素を発
現するように特別に操作されている細胞を培養する以外
、商業的目的で大量に提供されえない。

微生物の宿主において、異種のタンパク質、例えば、ヒ
ト由来のタンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子をクロ
ーニングおよび発現することが現在実施されている。多
数の例は、特許文献に非常に詳しく記載されており、そ
れらのいくつかは既に商業的に実現されている。これは
、例えば、グラム陰性バクテリアＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃ０１１において発現されるヒトインスリン、成長ホ
ルモンおよびアルファーインターフェロンについての場
合である。この宿主において、高い発現レベルは容易に
得ることができる；しかしながら、こうして産生された
タンパク質は大きい封入体としてしばしば濃縮させ、こ
こでそれは不溶性および不活性の形態で存在する。この
ような場合において、経費のかかる面倒な復元の手順を
適用することが必要であり、その収率はプロキモシンの
場合におけるように、約２０％程度に低いことがある［
参照、Ｆ、Ａ、Ｏ，マルストン（ＭＡＲ５ＴＯＮ）ら、
バイオテクノロジー（Ｂ　ｉ　ｏ　ｔ　ｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ）、２．８００、ｌ　９８４］。

ヒトリゾチームの遺伝情報を指定するＤＮＡセグメント
をＥ、ｃｏｌｉにおいて発現するとき、同一のタイプの
現象が明らかに起こる。細胞の超音波処理後、合成した
ヒトリゾチームは主として細胞破片と会合して見いださ
れる。そのうえ、タンパク質は活性でなく、そして追加
のＮ末端メチオニン残基の存在により自然ヒトリゾチー
ムと異なる［参照、ムラキ（ＭＵＲＡＫＩ）ら、Ａｔｒ
ｉｃ　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、４９．２８２９．１９８
５］。

これらの困難を軽減するために、グラム陰性バクテリア
のバクテリウム・スブチリス（Ｂａｃｔｒｉｕｍ　　５
ｕｂｔｉｌｉｓ）においてヒトリゾチームを発現するこ
とが試みられた。バクテリウム−スブチリス（Ｂａｃｔ
ｒｉｕｍ　　５ｕｂｔｉ１ｉｓ）は、ある数の加水分解
酵素を外部の媒質中に活動的に分泌することが知られて
おり、そして異種のタンパク質の発現および分泌のため
の宿主として広く使用されている。しかしながら、ヒト
リゾチームの場合において、最近、分泌されたタンパク
質は、多分正しくない結合の形成のために、酵素的に不
活性であることが示された［参照、Ｋ、　ヨシムラ（Ｙ
Ｏ３ＨＩＭＵＬＡ）　ら、／＜イーＡ−ケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ　ｓ、Ｒｅ　ｓ、Ｃｏ
ｍｍ、）、１４５．７１２、１９８７］　　。

バクテリア以外の宿主は、また、異種のタンパク質の産
生に使用することができ、例えば、真核生物の微生物、
例えば、酵母、ことにサツカロミセス拳セレヒ゛シアｘ
　（Ｓ　ａ　ｃ　ｃ　ｈ　ａ　ｒ　ｏ　ｍ　ｙ　ｃ　ｅ
ｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、またはさらに線状真菌
類である。酵母においてヒトタンパク質の高い収率の産
生の典型的な例は、活性なスーパーオキシドジスムター
ゼの細胞内発現である（参照、国際特許出願ｗ０８５１
０１５０３号）。しかしながら、成熟ヒトリゾチームの
遺伝情報を指定するＤＮＡを酵母において発現するとき
、Ｅ、ｃ。

１１において観察されるのと同一の現象が起こる、すな
わち、リゾチームは細胞破片と会合して見いだされ、そ
れから可溶化剤、例えば、濃泳素によりそれを抽出しな
くてはならない（参照、欧州特許出願ＥＰＯ１８１６３
４号、ｐ、４７）。より最近、酵母において発現された
成熟リゾチームは事実不溶性の不活性の形態で、多分ジ
サルファイド結合の不正確な形成の結果として、得られ
るという、それ以上のデータが提供された［参照、Ｔ。

ハヤカワ（ＨＡＹＡＫＡＷＡ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）
、５６−１５３、ｌ　９８７］。

ベルギー国特許ＢＥ９０１，２２３号に開示されている
ように、酵素的に活性なリゾチームは、成熟タンパク質
の遺伝情報を指定するＤＮＡを酵母細胞の分泌機構によ
り認識されるシグナルペプチドの遺伝情報を指定するリ
ーダー配列と融合する場合、遺伝子操作された酵母から
得ることができる。この場合において、成熟タンパク質
は原形質膜を通して分泌され、次いで、条件に依存する
程度に、培地中に分泌される。前記ベルギー国特許にお
いて、こうして、ニワトリプレリゾチームの遺伝情報を
指定する完全なｃＤＮＡを酵母において発現すると、酵
素的に活性なリゾチームが産生し、その大きい比率、す
なわち、約７３％は培地中の可溶化されることが発見さ
れたことが示される。後に、こうして産生されたニワト
リリゾチームのＮ末端配列は、自然酵素のそれ、すなわ
ち、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ
−Ｌｅｕ　−Ａ　Ｉ　ａ−Ａ　Ｉ　ａと同一であるＣ参
照、Ｊ、オベルト（ＯＢＥＬＴＯ）ら、特別の酵母分子
生物学および遺伝学の第１回国際シンポジウム、バルナ
、１１月４〜９日、１９８５年：また参照、ベルギー国
特許ＢＥ９０３，６２６号］。これらの結果が実証する
ように、ニワトリリゾチームのシグナル配列は酵母分泌
系により正しく切断され、これにより前記シグナル配列
を使用して、例えば、ベルギー国特許ＢＥ９０１，２２
３号、特許請求の範囲３において特許請求されている種
々の源からリゾチームを分泌させることができる。この
利点は、最近、ヒトリゾチームの場合において得られた
［参照、Ｙ、ジガミ（ＪＩＧＡＭＩ）ら、遺伝子（Ｇｅ
ｎｅ）、土３，２７３．１９８６およびに、ヨシムラ（
ＹＯ３ＨＩＭＵＲＡ）ら、ｒｅｆ、ｃｉｔ、］。しかし
ながら、報告されている収率は比較的小さい。

酵母細胞から分泌されたリゾチームを得る可能性は、大
きい実際的な利点をもつ。こうして得られる酵素は活性
でありかつ自然タンパク質と同一であるばかりでなく、
かつまた既知の方法、例えば、前記ベルギー国特許ＢＥ
９０３，６２６号に記載されている方法により容易に回
収および精製することができ、ここで細胞を粉砕し、そ
して複雑な経費を要する分画および復元の手順を必要と
しない。細胞から分泌される所望のタンパク質を得ると
いうなお他の利点は、ある二次的使用、例えば、タンパ
ク質飼料配合物においてタンパク質およびビタミンの源
としての使用のために細胞を回収する可能性である。実
際に、酵母の高いタンパク質含量、それらのすぐれたア
ミノ酸バランスおよびそれからのセルロースの不存在は
、それらを若い家畜、例えば、仔ウシおよび子豚のため
の価値ある飼料補給物質とする。

比較的高い体積の、中程度の価値の酵素、例えば、リゾ
チームの発酵により産生を経済的に可能とするために、
それ細胞から分泌させる手段をえることは十分ではない
。また、それを高い収率で産生することが必要である。

したがって、本発明の目的は、酵素的に活性なリゾチー
ムを高い収率で産生ずる改良された方法を提供すること
である。

本発明の他の目的は、この産生を酵素の変性が最小にさ
れかつそれがそれ以上の精製のために容易に処理される
の形態で得られるような条件下に、達成することである
。本発明は、産生されるリゾチームが酵母細胞に比較的
毒性であるとき、とくにヒトリゾチームを産生すべきと
き、とくに興味がある。本発明の他の目的および利点は
、以下の説明および実施例から明らかとなるであろう。

これらの目的は、ＤＮＡが適当に操作された酵母細胞を
、成長制限条件下に、誘発させて、ヒトリゾチームを産
生および分泌させる、発酵方法の適用により達成される
。

１つの面において、本発明は、工程： ＤＮＡが遺伝子操作されている成長する酵母細胞を成長
制限条件下に培地と接触させ、そして前記酵母細胞を誘
発して酵素的に活性なリゾチームを合成および分泌させ
る、 からなることを特徴とする、酵素的に活性なリゾチーム
を産生ずる方法に関する。

他の面において、本発明は、工程： 酵素的に活性なリゾチームの合成を抑制する培地中で、
ＤＮＡが遺伝子操作されている酵母細胞を成長させ、そ
して 前記成長する酵母細胞を成長制限条件下に培地と接触さ
せ、そして前記酵母細胞を誘発して酵素的に活性なリゾ
チームを合成および分泌させる、からなることを特徴と
する、酵素的に活性なリゾチームを産生ずる方法に関す
る。

他の面において、次ぎの配列 ＡＡＧＧＴＴＴＴＣＧＡＡＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＴＴＣ
ＣＡＡＡＡＧＣＴＴＴＣＴＡＣＡＣＴＣＧＴＡＧＣＴＡ
ＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＡＴＴＡＴＣＧＡＴＣＴＴ
ＧＡＡＡＣＴＴＣＴＣＴＡＡＧＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＧ
ＴＴＡＣＡＧＡＧＧＴＣＣＣＡＴＡＣＣＴＧＣＣＡＡＴ
ＧＴＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＡＡＣＴＧＧ
ＡＴＧＴＴＡＧＡＧＧＡＡＣＣＧＡＴＴＧＡＣＣＴＡＣ
ＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＡ
ＡＡＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＡＧＡＣＣＴＴＡＣＡ
ＡＣＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＡＣＡＡＴＧＴＴＧＴ
ＧＧＴＣＴＣＧＡＴＧＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＣＧＡＣＣ
ＡＣＴＧＴＣＴＡＧＡＴＧＣＴＴＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧ
ＡＴＧＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＣＴＣＴＴＴＧＴＣＴＡＣ
ＡＧＴＴＴＡＣＡＧＡＧＡＣＧＴＴＡＧＡＣＡＡＴＡＣ
ＧＴＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＧＴＴＡＴＧＣＡＧ
ＧＣＴＧＡＴＧＣＣＡＴＡＧＡＡＧＧＴＴＴＡＧＴＴＧ
ＡＧＧＴＣＴＡＴＧＡＣＣＡＣＡＴＴＧＣＴＧＣＣＡＴ
ＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＣＧＡＣＡＡＴＴＧＣＧＡＡＣ
ＡＧＴＧＡＡＣＡＧＧＡＣＡＡＧＡＣＧＡＡＡＣＡＡＣ
ＧＴＴＣＴＧＴＴＧＴＡＧＣＧＡＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣ
ＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＴＣＴＣＡＡＣＡＡＴＣＴＣＴ
ＧＧＧＡＣＡＡＧＧＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧＴＴ
ＴＧＴＴＣＣＡＴＡＧＴＣＴＣＧＡＡＣＣＣＡＡおよび
自然ヒトリゾチームと異なりかつムラミダーゼ（ｍｕｒ
ａｍｉｄａｓｅ）活性を保持するタンパク質の遺伝情報
を指定する、その突然変異体からなる群から選択される
、ことを特徴とする、ヒトリゾチームのための合成遺伝
子に関する。

上で強調したように、遺伝子工学の技術により、酵母に
、酵素的に活性なリゾチームを産生じかつ分泌させるこ
とができる可能性の第１の実証は、モデル化合物として
ニワトリリゾチームを使用してなされた。さらに詳しく
は、ベルギー国特許第９０１．２２３号の実施例２．２
において、サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の１ｅｕ
２菌株（ＧＲＦ１８）のプラスミド（ｐｌｙｓ５０）を
使用する形質転換が記載されており、このプラスミドは
内因性２−ミクロンプラスミドの全体の配列、酵母にお
ける分泌のためのプラスミドｐＪＤＢ２１９の欠陥ＬＥ
Ｕ２遺伝子［参照、Ｊ、Ｄ。

ベッグス（ＢＥＧＧＳ）、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）
、２７５．１０４．１９７８］　、Ｅ、ｃ。

１１における複製のためのバクテリア配列および完全な
ニワトリリゾチームｃＤＮＡが酵母プロモーターｐ４１
５の転写制御下にある発現カセットからなる。この実施
例において、リゾチームの発現および分泌は、細胞ホモ
ジネートおよび細胞不合培地それ自体の両者のミクロコ
ツカス・リソデイクチクス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　
　ｌｙｓ。

ｄｅ　ｉｋｔ　１ｃｕｓ）の細胞を溶菌する能力により
証明された。合計の活性は、１６２単位／　ｍ　（１、
すなわち、培地において１１８単位および細胞と会合し
た４４単位であった。

同一タイプの結果は、ニワトリリゾチームｃＤＮＡの転
写がグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ
の遺伝情報を指定するＧＡＰ遺伝子の強い構成的プロモ
ーターにより保証される、他の２−ミクロンに基づく発
現プラスミドを使用するとき、達成される。ヒトリゾチ
ームを発現する最初の寛みにおいて、われわれは、この
後者の構成において、成熟ニワトリリゾチームの遺伝情
報を指定する合成りＮＡ上セグメント成熟ヒトリゾチー
ムの遺伝情報を指定する合成りＮＡ上セグメント置換し
た。第１図に示す、使用した配列は、それ自身の遺伝子
の高い発現のためにＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにより好
まれるコドンを利用するために、予備的に誘導した。さ
らに、サイレント突然変異を使用して、配列の可能な引
き続く操作のための独特制限酵素を導入した。予期せざ
ることには、この構成を使用すると、ｌｅｕ＋形質転換
体は普通の方法により形質転換し、モしてロイシン欠乏
上の選択のときさえ得ることができなかった。こうして
、明らかなように、ヒトリゾチームは、酵母厚形質体中
の活性的に合成したとき、細胞の生存能力を、多分、酵
母細胞壁の正常の構成成分であるキチンノ合成を妨害す
ることにより、減少する［参照、Ｅ、カビス（ＣＡＢ　
Ｉ　Ｓ）およびロバーツ（ＲＯＢＥＲＴＳ）　、Ａｎｎ
、Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、５１．７６３、ｌ　９８２］。

しかしながら、われわれは、同一のヒトリゾチーム解読
ＤＮＡセグメントの転写を調節可能なプロモーターの制
御下に置いたとき、かつその抑制を成長制限条件下に実
施することを条件として、活性なリゾチームの合成が、
細胞生理学に明らかな悪影響を及ぼさないで、起こるこ
とを発見した。

対照的に、リゾチームの合成が成長を許容する条件下に
起こるとき、バイオマスの産生は障害されるばかりでな
く、かつまた、なおより衝撃なことには、リゾチームの
合成は実際的な興味をもつには制限され過ぎる。成長制
限条件へのヒトリゾチーム合成の依存性はニワトリリゾ
チームでは観察されない。これは両者の酵素の性質の間
の類似性にかんがみて驚くべきことである。−普して、
この差はヒトリゾチームがニワトリリゾチームのそれよ
り２．５倍高い比活性を有するという事実に帰すること
ができる［参照、Ｒ，Ｅ、カンフイールド（ＣＡＮＦ　
Ｉ　ＥＬＤ）ら、［リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）Ｊ
、Ｅ、Ｆ、オツセルマン（Ｏ３ＳＥＲＭＡＮ）　、Ｒ，
Ｅ、カンフイールド（ＣＡＮＦ　ＩＥＬＤ）およびＳ、
ベイチョク（ＢＥＹＣＨＯＫ）、アカデミツク・プレス
（Ａｃａｄｅｍ　ｉ　ｃ　　Ｐ　ｒ　ｅ　ｓ　ｓ　）、
１９７４、ｐ、６３］。

しかしながら、前者の一次構造が部位特異的突然変異に
より変更され、こうして位置４においてＧＩｕ残基はニ
ワトリリゾチームにおけるようにＧｌｙ残基で置換され
、成長条件下のリゾチームの合成の同一の阻害が観察さ
れ、これに対して基質としてＭ、Ｉｙｓｏｄｅ　ｉｋｅ
　１ｃｕｓで突然変異したタンパク質の比活性はニワト
リリゾチームのそれより有意に高くない。

したがって、本発明の１つの重要な面は、成長およびリ
ゾチームの合成が同時の事象の代わりに突貫的に保存さ
れる方法を提供することである。

これは、リゾチームをエンコードするＤＮＡセグメント
の転写のために調節可能な酵母プロモータ−を使用する
ことにより容易に達成することができる。このタイプの
種々のプロモーターは既知である。例えば、酸性ホスフ
ァターゼの遺伝情報を指定する遺伝子のプロモーターは
欧州特許（Ｅ　Ｐ）１００．５６１号において教示され
るように使用することができる。欧州特許（ＥＰ）２１
３．５９３号に最近開示されているように、この性質は
、例えば、ＧＡＰ遺伝子のプロモーターとの融合により
、調節可能な雑種プロモーターを構成するために使用す
ることができる、２つの活性配列の、ＰＨ０５遺伝子よ
り上流の、存在に関係する。実際に、欧州特許（ＥＰ）
１６４．５５６号に記載されているように、種々のこの
ような雑種プロモーターは、異なる酵母プロモーター、
ことにＧＡＰのようなグルコース分解酵素の遺伝情報を
指定する遺伝子からの強いプロモーターを、異なる調節
可能な遺伝子、例えば、ＧＡＬ　１．ＧＡＬ　ｌ　Ｏ１
御下の遺伝子、例えば、ＨｉＳｌ、ＨｉＳ３、ＨｉＳ４
、ＴＲＰ５またはＬＥＵ３と結合することによって構成
することができる。例えば、ＡＤＨ２遺伝子はグルコー
スにより発現され、そして非発酵性炭素源、例えば、エ
タノールの存在下に抑制される。このような調節可能な
プロモーターを使用することにより、培地の組成を注意
して制御することによって、成長に独立に、リゾチーム
の発現をオンまたはオフに切り替えることが可能である
。温度の変化により調節される他の酵母プロモーターを
、また、使用することができる。

上に強調したように、本発明の他の重要な面は、成長制
限条件下に発現されたリゾチームはそれから分泌される
ことである。はとんどの実験が、酵母において、タンパ
ク質の分泌が細胞の成長に相関関係をもつという、現在
通用する点を証明することを考慮するとき、これは、ま
た、驚くべき事実である［参照、Ｒ，シェフマン（ＳＨ
ＥＫＭＡＮ）、ＴｌＢ５．Ｊｕｌｙ　　１９８２、ｐ、
２４３］０これと対照的に、酵母細胞が定常期に維持さ
れているとき、原形質膜の外側に見いだされる分泌され
たリゾチームの量は細胞内に見いだされる量を犠牲にし
て増加する。

それにもかかわらず、当業者に知られているように、原
形質膜を通るリゾチームの分泌を保証するために、リゾ
チームをエンコードするＤ　Ｎ　Ａセグメントはシグナ
ルペプチドの遺伝情報を指定するリーダー配列を適当に
装備して、翻訳されたタンパク質を小胞体のルーメン中
に転移させかつ成熟酵素に処理できるようにすることは
必要である。

このリーダー配列は、シグナルペプチドの遺伝情報を指
定し、酵母の分泌の機構により認識されかつ正しく切断
される、相同性または異種の任意の配列であることがで
きる。上に既に論じたように、効率よい分泌はニワトリ
リゾチームのシグナルペプチドをエンコードする配列の
使用から生ずるが、他の異種のシグナルペプチドの遺伝
情報を指定する配列を、また、使用することができる。

他方において、相同性のシグナル配列を使用することが
できる。例えば、効率よいかつより文献に記載された分
泌の発現の方法は、フェロモンのアルファーおよびａ−
因子と交配する（ｍａｔｉｎｇ）酵母の前駆体のリーダ
ー領域を使用するから成る［参照、例えば、欧州特許（
ＥＰ）１１６．２ＯＩ号および欧州特許（ＥＰ）１２３
．２８９号］。

本発明により発現すべきリゾチームをエンコードするＤ
ＮＡセグメントは、ヒトリゾチームの遺伝情報を指定す
る、例えば、ムラミダーゼ活性を有しかつ自然ヒトリゾ
チームと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝
情報を指定する、任意のＤＮＡ配列であることができる
。それは、自然ヒト遺伝子から転写されるｍＲＮＡの逆
転写により得られるｃＤＮＡであることができる。ある
いは、それは、上に定義したヒトリゾチームをエンコー
ドする、任意の合成りＮＡ上セグメントあることができ
る。後者の方法の１つの有意の利点は、こうして合成さ
れたＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列は、翻訳効率
を改良するために、酵母において最も頻繁に使用される
コドンからなるように設計することができるということ
である。

上の定義に従い、自然ヒトリゾチームに関して多少の修
飾が実際の目的でなされている、例えば、改良された熱
安定性および／または比活性を有する、タンパク質の遺
伝情報を指定する、任意のＤＮＡセグメントは、本発明
の範囲内に包含されると考えなくてはならない。

リゾチームを酵母において発現させかつそれから分泌さ
せるために、それらの異なる要素、すなわち、５′〜３
″調節可能なプロモーター、適当なシグナルペプチドの
遺伝情報を指定するＤＮＡ配列、リゾチームをエンコー
ドするＤＮＡセグメントおよび、好ましくは、酵母転写
ターミネータ−からなる発現カセットは、酵母の発現ベ
クターに構成しかつその中に適当に挿入されなくてはな
らない。１つの可能性は、欠損ＬＥＵ２遺伝子のマーカ
ーとして使用されるものとして、多数のコピーで酵母中
で複製することができるプラスミドを使用することであ
る。このような発現プラスミドの好ましくは異型は、酵
母の内因性の２−ミクロンのプラスミドから誘導された
ものおよび、なお好ましくは、その完全な配列からなる
ものである。この場合において、形質転換のためにｃ　
ｉ　ｒ’菌株、すなわち、それらの２−ミクロンのプラ
スミドからキュアーした菌株を使用することができる。

こうして得られた形質転換体は、リゾチーム遺伝子で構
成されたキメラのプラスミドのみを含有する。したがっ
て、それらのコピ、−の数は最大となり、そして組み換
え反応から得られるプラスミドの不安定性は最小とされ
る。それにもかかわらず、最大の発現安定性のために、
発現カセットを酵母ゲノム中に組み込むことが好ましい
。こうして、非常に多数の発現系を、種々の構成要素を
賢明に組み合わせることにより考案することができ、そ
れらの多数のものはすでにこの分野において入手可能で
ある。

本発明に従い使用することができる酵母は、好ましくは
、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の
もの、より好ましくはす・７カロミセス・セレビシアエ
（Ｓａｃｃｈａ　ｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）種のもの、すなわち、パン酵母である。この理由
の１つは、その生物学的性質が比較的より知られている
ことである。他の重要な理由は、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅは、最近オーガニゼイション・フォー・エコノミツ
ク・アンド・デヴエロップメント（Ｏｒｇａｎｉｚａｔ
ｉｏｎ　　ｆｏｒ　　Ｅｃｏｎｏｍｉｃ　　ａｎｄＤｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（ＯＥＣＤ）により定義されたよ
うな「すぐれた工業的に大規模な実施（Ｇｏｏｄ　　Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　ＬａｒｇｅＳｃａｌｅ　　Ｐｒ
ａｃｔｉｃｅ）Ｊにことに適当する、典型的にはＧＲＡ
Ｓ　（一般に安全と認識されている）微生物であること
にある。しかしながら、本発明の方法は、また、有利に
、酵母の他の種、例えば、タルイペロミセス・ラクチス
（ＫＩｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　　１ａｃｔｉｓ）、ピ
チア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉ　
ｓ）　、サッカロムコブシス・リポリチカ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ　　ｌ１ｐｏｌｙｔｉ　ｃ　ａ
　）　、シュワンツムセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎ
ｎｏｍｙｃｅｓ　　ａｌｌｕｖｉｕｓ）。

シゾサッ力ロムセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｐｏｍｂｅ）などに適用すること
ができる。

当業者は理解するように、ヒトリゾチームの遺伝情報を
指定するＤＮＡセグメントを前述したように調節可能な
プロモーターの制御下に置くとき、宿主有機体を成長さ
せると同時に酵素の合成を回避することができる。その
ために、プロモーターが抑制されたままであるような成
長条件を維持しなくてはならない。例えば、ＰＨ０５プ
ロモーターを使用するとき、培地中の無機ホスフェート
は、所望の細胞濃度が得られるまで、十分に高い値で、
例えば、培地への無機ホスフェートの添加により、監視
しなくてはならない。次いで、添加を中断したときかつ
他の栄養が制限量でない場合、培地中の無機ホスフェー
トの濃度は連続する成長の結果減少して、リゾチームの
合成を誘発するが活性な成長を保証しないために十分に
低い値に到達する。

同様に、グルコースにより抑制され、そしてエタノール
により脱抑制されるプロモーター、例えば、ＡＤＨ２プ
ロモーターを使用するとき、グルコースの濃度は成長を
保証するがリゾチームの合成を保証しないために十分に
高いレベルに維持スべきである。このような条件は、い
わゆるクラブトリ効果の結果、エタノールの産生を生ず
る［参照、例えば、○、ケッパリ（Ｋ（１）ＰＰＥＬＩ
）ら、ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　　Ｒｅｖｉｅｗｓｉｎ
　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４．２９９．１９
８６］。次いで、グルコースの供給を中断すると、リゾ
チームの合成はこうして産生されたエタノールの犠牲で
起こるであろう。

本発明を実施する好ましい方法に従い、酵母の培養およ
びリゾチームの産生を別の作業として実施する。第１培
地において、酵母の成長はリゾチームの不存在下に所望
の細胞密度まで起こる。次いで、細胞をリゾチームの合
成を保証するが、成長を制限するために選択した培地中
に移す。この方法の主要な利点は、両者の作業に最適な
条件を独立に適用できるということである。これらの作
業は、バッチ式で、供給バッチ作業におけるような半連
続的に、あるいは完全に連続的に実施することができる
。

本発明をなおいっそう詳細に説明するために、第９図を
参照する、この図面は、本発明を実施する特定のモード
が説明し、したがって本発明を限定するものと考慮すべ
きでない。こうして図解される方法において、酵母の培
養は発酵槽１において実施し、ここで空気をライン２か
らおよび適当な栄養をライン３から供給する設備が設け
られている。これらの栄養は、前に説明したように、活
性な成長を保証するが、リゾチームの合成を抑制するた
めに十分な量で供給すべきである。それらは炭素源から
なり、炭素源は純粋なグルコースまたはスクロースまた
は工業的廃液、例えば、糖蜜であることができる。成長
に要求される他の栄養は、無機塩、例えば、（ＮＨ＋　
）２３０４およびに、ＨＰ○、の形態であることができ
、これらは、パン酵母の産生において一般に使用される
ような、成長因子、例えば、アミノ酸、ビタミン、およ
び金属塩類とともに補充することができる。あるいは、
それらはより複雑な自然産生物、例えば、酵母エキス、
ペプトン、麦芽エキスなどの形態で供給することができ
る。

酵母の培養は、正常の作業と適合しうる、最高の可能な
細胞濃度で実施されるであろう。たいていの場合におい
て、槽１において到達される酵母の濃度は乾燥重量の０
．５〜ｌＯ％、好ましくは３〜６％であろう。０．５％
より低いと、取り扱うべき体積は回収すべき有用な産生
物の量と不釣合いになり、そして１０％より高いと、実
際的問題が、例えば、細胞懸濁液の高い粘度から生ずる
。

槽ｌにおいて産生されるバイオマスは、ライン４を通し
て遠心装置５に送られ、ここでそれは濃縮される。正常
にされた培地はライン６を経て槽１少なくとも部分的に
再循環させ、残りは廃棄される。濃縮された細胞懸濁液
はライン７を通して槽８へ移される。この懸濁液の一部
は、また、ライン９を通して１ｌｉｌへ再循環すること
ができる；これは高い細胞密度およびバイオマスの高い
産生を達成するために、連続的作業においてことに興味
あることである。

槽８において、栄養をライン１０からおよび空気をライ
ン１１かも供給する。そこにおける条件はリゾチームの
発現系の完全な脱抑制するようなものであり、したがっ
て、それらは遺伝子の転写を制御するために選択したプ
ロモーターに依存する。上に強調した理由で、また、こ
れらの条件は、例えば、成長に要求されるがタンパク質
の合成に要求されない、ある因子の濃度を制限すること
によって、成長を制限するように調節することが重要で
ある。

リゾチーム産生酵母の懸濁液は、槽８からライン１２を
通して抜き出される。細胞を遠心装置１３から分離し、
この培地は、抽出ユニット１５においてリゾチームの抽
出のために処理した後、少なくとも部分的にライン１４
を経て槽８少なくとも部分的に再循環する。この後者の
作業は、イオン交換または親和性物質への吸着により容
易に活性化され、次いでこれから酵素を、例えば、ライ
ン１６からの水性ＮａＣｌで、溶離することにより容易
に回収することができる。溶離液は引き統いてライン１
７を経て精製ユニットＩ８へ送り、ここでそれを処理し
、この処理は他の古典的な方法、例えば、限外濾過、結
晶化などの組み合わせからなることができる。最後に、
商業化のために準備された一乾燥産生物は、凍結乾燥ま
たは噴霧合成（図示せず）により得ることができる。

本発明の実施において、少なくとも２つの理由で、酵母
細胞から選択されたリゾチームの主要部分が細胞壁に会
合したままであるような条件を、槽８において適用する
ことが有利であることがある。第１の理由は、細胞に会
合したリゾチームは脱活性化に対して保護されるからで
ある。脱活性化は、酵素が培地中に′遊離されるとき、
徐々に起こる。第２の理由は、ベルギー国特許ＢＥ第９
０３．６２６号に教示されているように、前記細胞Ｉこ
会合したリゾチームの実質的な分画は、無機塩の水溶液
により簡単な洗浄で濃縮した形態で回収することができ
ることにある。第１０図は、このような条件を槽８に適
用する、本発明の方法の実施態様を示す。酵母の懸濁液
をライン１２を通して槽８から抜き出す。遠心装置Ｉ３
において、細胞を培地から分離し、この培地を少なくと
も部分的にライン１４を通して槽８に再循環し、残りを
廃棄する。遠心装置１３からの細胞をライン１９におい
てライン２０からの無機塩の水溶液を接触させ、これに
より細胞壁に会合したリゾチームをそれから遊離する。

前記塩は水溶性であり、比較的中性であり、そして好ま
しくは酵母細胞に対して無毒である。特定の例は、次の
とおりである：ＮａＣｌ、ＫＣＩ、ＮａＮｏ３、ＫＮＯ
，、Ｎａ。

ＳＯ，、（ＮＨ４）２Ｓ○、など。経済性の理由で、Ｎ
ａＣｌは一般に好ましいであろう。細胞に会合したリゾ
チームの効率よい回収のために使用すべきその濃度は、
臨界的でなく、例えば、０゜２〜２，０モルの範囲内で
変化することができる。

実際に、０．５〜１．０モルのＮａＣ］の濃度は有利に
使用される。０．５モルより低い濃度は、一般に、回収
を制限し、その結果、産生されたリゾチームの実質的な
部分は残留する細胞とともに失われる。他方において、
１．０モルより高い濃度は一般に改良をもたらさないで
あろう。次いで、こうして遊離されたリゾチームは遠心
装置２４において残留細胞から分離し、そして前述と同
一の技術によりユニット１８においてさらに精製するこ
とができる。こうして、酵母の細胞壁事態は、酵素を回
収するための吸着物質として、作用しかつ利用すること
ができる。

作業のこの後者のモードを適用するために、槽８におけ
る無機塩の濃度を制限することが重要である。逆に、作
業の最初に述べたモードにおけるように、ユニット１５
における抽出により培地から酵素の主要部分を回収する
ことが好ましい場合、槽８における無機塩の濃度を増加
ことかよりよい。

この目的に対して、同一塩類を細胞に会合したリゾチー
ムの回収について上に定義したのと同一の濃度で使用す
ることができる。以下の実施例において示すように、高
い濃度の塩の存在は、成長制限条件下に、成長する酵母
に対して悪影響を及ぼすが、酵母を産生するリゾチーム
にとってそうではない。したがって、本発明の２工程の
方法のそれ以上の利点は、バイオマスの産生に最適な条
件下に酵母を成長させ、次いで培地中にへの酵素の最適
な分泌を保証する条件下ににリゾチームの合成を誘発す
る手段を提供することである。

作業のどのモードから得られた残留酵母も、回収し、そ
してそれ以上の処理、例えば、プレスまたは乾燥後、究
極的にそのまま使用することができる。このような残留
物は、また、部分的に槽８へ再循環してさらにリゾチー
ムの産生を実施するか、あるいは、究極的に適当な崩壊
処理後、栄養および成長因子の源として発酵装置ｌへ再
循環することができる。

以上の説明ならびに本発明の他の実施態様は、以下の実
施例から明らかとなるであろう。これらの実施例は、例
示を目的とし、本発明の範囲を限定することを意図しな
い。

実施例 １、　　スクリーニングにニワトリリノチームシグナル
配列を使用する酵母における（１）ヒトリゾチーム、（
２）ヒトリゾチームのＧ１ｙ−４突然変異体および（３
）ニワトリリゾチームのプラスミド仲介発現 １．１、　発現ベクターの構成 １．１．１．　　　ヒトリゾチーム 酵母の好ましいコドンをもつヒトリゾチーム遺伝子の配
列に対応するオリゴヌクレオチドを、アプライド・バイ
オシステムス（ＡＩ）ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）ＤＮＡ合成装置でホスホルアミダイトの化学を使用し
て合成した。個々のオリゴヌクレオチドは、オーバーラ
ンプを最大にしかつ不正確なアニーリングを最小にする
コンピュータープログラムを使用して設計した。分子の
すべては５′末端を除外して５′ホスフエートを有した
。全体の遺伝子をアニーリングし、−緒に結合し、そし
て全長の結合生成物（参照、第１図）をアガロースゲル
から分離した。次いで、それを５′末端においてＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、そしてＮｃｏｌ
および５ａｌＩおよびアルカリ性ホスファターゼで処置
したプラスミドｐＧＡＰｌ中に結合した。ｐＧＡＰｌは
ｐＧＡＰの誘導体（参照、Ｊ、）ラビス（ＴＲＡＶＩＳ
）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ　ス　
ト　リ　−（Ｊ、　　　Ｂ　　ｉ　　ｏ　　１．　　　
Ｃｈｅｍ、　　）　　、　　２６０．４３８４．１９８
５）であり、ここでＧＡＰプロモーター（グリセルアル
デヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子４９
１プロモーター）は雑種ＡＤＨ２−ＧＡＰプロモーター
で置換されている［参照、Ｌ、Ｓ、コラセンス（ＣＯＵ
ＳＥＮＳ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、６１，２６５．１
９８７］。次いで、リゾチーム遺伝子をジデオキシ配列
分析にかけ、そして設計した配列を表かした。ＡＤＨ２
−ＧＡＰプロモーター、ニワトリリゾチームングナル配
列、ヒトリゾチーム遺伝子、およびＧＡＰターミネータ
−から成る発現カセットを、ＢａｍＨＩで切除し、そし
て酵母−Ｅ、ｃｏｌｉシャトルベクターｐＡＢ２４にお
いて挿入した［参照、Ｐ、Ｊ、バール（ＢＡＲＲ）ら、
ジャーナル・才ブ・イクスペリメンタル・メディンン（
Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）、１６５．１１６０、ｌ　９８
７］　。生ずるプラスミド、Ｉ）ＡＢ２４ＡＧＳｃＬｙ
ｓＨは第２図に示されている。

１．１．２、　　Ｇｌｙ−４ヒトリゾチームＧｌｕ−４
のヒトリゾチーム遺伝子におけるグルコースへの突然変
異体を含有する類似プラスミドを作るために、標準の方
法を使用して、ニワトリのシグナルにおいて５ｐｅ１部
位から、成熟タンパク質の位置４におけるコドンがＧＡ
Ａ　（グルタミン酸）からＧＧＡ　（グルコース）に変
化してヒト遺伝子におけるＮｈｅ１部位までの遺伝子の
部分を合成した。発現ベクターの再構成は、第４図に示
すプラスミドｐ２４４を生じた。

１．１．３、　　ニワトリリゾチーム 同様な方法を使用して、ＡＤＨ２−ＧＡＰプロモーター
により推進されたニワトリリゾチーム遺伝子をもつプラ
スミドを作ることができた。このプラスミドは、第５図
に示すｐＡＢ２４ＡＧｓｃＬｙｓＣである。

■、２、　酵母におけるリゾチームの発現および分泌 ３つのプラスミドをＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株中に
形質転換し、そしてロイシンプロトドローフを選択した
。このＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはＧＲＦ　Ｉ　８の誘
導体［Ｅ、エルハルト（ＥＲＨＡＲＴ）およびＣ，Ｐ、
、ホレンベルグ（ＨＯＬＬＥＮＢＥＲＧ）、ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃ　ｔ　ｒ　ｉ
　ｏ　Ｉ　ｏｇｙ）、１５６．６２５．１９８３］であ
り、これから内因性２ミクロンのサークル（ｃｉｒｃｌ
ｅ）がキュアされていた。形質転換体をロイシンを欠き
、そして８％のグルコースを含有する最小培地中で２８
°Ｃにおいて２日間成長させた。次いで、それらを使用
して８％のグルコースを含有する複合培地（ＹＥＰ：１
％の酵母エキス＋２％のペグトン）の培養物に１：１５
０の比で接種し、そしてこれらの培養物を２８°Ｃにお
いて１８０ｒｐｍで成長させた。５日間培養した後、１
０ｍＱのアリコートを取り出し、２５００ｇで１０分間
遠心し、そしてリゾデームの活性を培養上澄み液におい
て決定した（Ｓ、分画）。アッセイはり、ンユガー（Ｓ
　ＨＵ　Ｇ　Ａ　Ｒ）の方法［参照、バイオヒミカ・エ
ト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、８．３０２、１９５２］
に従い基質としてミクロコツカス・リソデイクチクス（
Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　　Ｉｙｓ。

ｄｅ　ｉｋｔ　１ｃｕｓ）を使用して実施した。活性の
１単位は、１ｍ＋２の反応混合物中で６６ミリモルのリ
ン酸カリウム、ｐＨ６，２４、中のＭ。

１ｙｓｏｄｅ　ｉｋｔ　１ｃｕｓの懸濁液を使用して、
０．００１／分の４５０ｎｍにおける吸収の減少を引き
起こす酵素の量として定義する。

形質転換体からの細胞を、０．５モルのＮａＣ１を含有
する０、１モルリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，５、
の１ｍｆｆ中に懸濁させ、そして４°Ｃにおいて５分間
インキュベーションした。細胞を遠心により除去し、そ
して塩洗浄液（分画Ｓ＋）中のリゾチーム活性を決定し
た。細胞内であったリゾチームの量を決定するために、
細胞の沈澱物を５分間ガラスピーズとともに、０．５モ
ルのＮａｃｌおよび０．０５％のトリトンＸ−１００を
含有する０、１モルのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６
，５、中でブラウン（Ｂ　ｒ　ａ　ｕ　ｎ）ホモジナイ
ザー内で撹拌した。細胞破片を１２５００ｇにおける遠
心により分離した後、可溶性細胞内分画（分画ｓｉ）中
に存在するリゾチーム活性を決定した。

得られた結果を表１に記載する。

合計のリゾチーム活性は、グルコース中で成長させたと
きヒトについて４３３Ｕ１０Ｄ（活性単位／光学密度の
単位）および、それぞれ、ヒト突然変異体およびニワト
リリゾチームについて１６７および１７０Ｕ１０Ｄであ
った。すべての３つの場合において、合計の活性の１４
および３２％が分泌された：それは培地（Ｓ、）中に存
在しおよび／または細胞に会合しており、不活性前記細
胞からＮａＣｌの洗浄により細胞を破壊せずに解放する
ことができ（Ｓｌ）、後者の活性は、分泌されるが酵母
細胞壁にまだ吸着しているリゾチームの分画に相当する
。

１．３、　分泌されたリゾチームの分離、精製および特
徴づけ 酵母誘導組み換え体を精製するために、菌株ＧＲＦ１８
０中の３つのプラスミド形質転換体の培養物を、前述し
たように、８％のグルコースを含有するＹＥＰ培地中で
５日間成長させた。細胞を２５００ｇにおいて１５分間
遠心により濃縮し、゛次いでそれらを等しい体積の、０
．５モルのＮａＣＩを含有するＯ、１モルのリン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ６，５、中に再懸濁させた。４°Ｃ
において６０分間インキュベーション後、上澄み液を遠
心により集め、０．１モルのリン酸ナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ６，５で１０倍に希釈し、そしてＣＭ−セファローズ
（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）７ｙストア０−［ファーマシア
（Ｐｈａ　ｒｍａｃ　ｉ　ａ）］カラム上に装入した。

装入の完結後、カラムを同一緩衝液で洗浄し、次いでリ
ゾチームを０．５モルのＮａＣＩを含有する同一緩衝液
で溶離した。

前述したように決定したリゾチーム活性を含有する分画
をプールし、アミコン・ダイヤフロー（Ａｍｉｃｏｎ　
　Ｄｉａｆ　ｌｏｗ）膜を使用する限外濾過により濃縮
し、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラ
ムで脱塩し、そして凍結乾燥した。

リゾチーム調製物の比活性は、まずリゾチーム活性を前
述のように測定し、そしてバイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）
タンパク質アッセイを使用し、ニワトリリゾチームを標
準として用いて、タンパク質濃度を測定することによっ
て決定した。結果を表２に示す。

（単位／μｇタンパク質） ヒト １ｙ−４ 酵母 ニワトリ　　　　卵白酵母　　　　　　２６３ここに記
載する値に基づいて、表１に示すグルコース培地中の３
つのリゾチームの合計の合成は、ヒト、ヒト突然変異体
およびニワトリリゾチームについて、それぞれ、１７．
１９および１９ｍｇ／ａである。ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルの分析により、すべての３つの試料は、適当な
対照（ヒトタンパク質についてヒト乳リゾチームおよび
ニワトリリゾチームについて卵白リゾチーム）と同一の
移動度を有する単一のバンドとして移動することが示さ
れた。自動化されたエドマン（Ｅｄ　ｍ　ａ　ｎ　）分
解にかけたとき、すべての３つのタンパク質はリジンの
単一のＮ末端を有し、そしてそれ以上の配列の分析はＤ
ＮＡ配列から期待される配列を与えた。こうして、ニワ
トリのシグナル配列はすべての３つのタンパク質から正
しく処理される。

比較例１ 実施例１．２に記載する成長のプロトコルをすべての３
つのタンパク質について反復したが、ただし１％のエタ
ノールを炭素源として８％のグルコース化わりに使用し
た。この培地は、細胞の成長およびリゾチームの合成が
同時に起こるようなものである。３つの培養物における
リゾチーム活性を決定したとき、表１に示す結果が得ら
れた。

ヒトタンパク質およびヒト突然変異体タンパク質の両者
について、エタノール中の成長はリゾチームの産生を、
細胞を８％のグルコース中で成長させたときのレベルの
５％より下に劇的に減少させた。対照的に、ニワトリリ
ゾチームの発現は８％のグルコース培養物において観察
されるレベルの５０％に減少しただけでであった。

これらの結果が明瞭に実証するように、酵中で実際的に
重要性をもつために十分に活性なヒトリゾチーム（真性
または突然変異体、ニワトリではない）の合成を達成す
るために、本発明に従い、成長が同時に起こらないよう
な条件下に作業することが必要である。

上の実施例において使用した培養条件下におけるプラス
ミドの安定性を推定するために、それ以上の試験をまた
実施した。これらの試験は、ペトリ皿上で、実験の終わ
りにおいてロイシンのプロトトロフィーをなお表す酵母
細胞、すなわち、リゾチーム発現プラスミドを保持する
細胞、の分画を決定することから成る。こうして得られ
た結果を、また、表１に示す。それらが示すように、ヒ
トリゾチーム（真性または突然変異体、ニワトリではな
い）の場合において、細胞はプラスミドを実質的失った
エタノールの存在下に成長した。こうして、成長はヒト
リゾチームの合成により非常に障害されるので、有糸分
裂の分離の結果プラスミドを失った細胞の数はプラスミ
ドをなお有するもののそれを急速に越えるように思われ
る。

比較例２ 標準の方法を使用して、酵母におけるその発現が第１図
に示されている３つのリゾチーム遺伝子を、強い構成的
ＧＡＰプロモーターを使用して、発現力セント中に挿入
した。ニワトリリゾチームの構成体は第６図に示す；ヒ
トおよびヒト突然変異体のプラスミドは、リゾチーム遺
伝子を除外して同一である。これらのプラスミドをＧＲ
Ｆ　１８０中に形質転換しそしてロイシンプロトドロー
フを選択したとき、ヒトおよびヒト突然変異体のプラス
ミドを使用して形質転換体はえることができなかったが
、ニワトリリゾチーム発現プラスミドを使用して形質転
換体は容易に得られた。これらの形質転換体は実施例１
に記載するように成長させ、そしてリゾチーム活性を決
定した。合計のニワトリリゾチーム活性はｌｌ０Ｕ１０
ｄであり、これに対してＡＤＨ２−ＧＡＰプラスミドを
有する調節された発現プラスミドについて１７３Ｕ１０
Ｄであった。

これは、ヒトリゾチームの合成は成長する酵母細胞に悪
影響を及ぼすという比較例１から誘導された結論を確証
する。この効果が上の特定の実験において使用した特定
の酵母菌株に限定されないことを確認するために、この
比較例の形質転換プロトコルを次の菌株を使用して反復
した：菌株ＡＨ２２ＣＡ、ヒン不ン（ＨｒＮＮＥＮ）ら
、プロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、７５．１９２９．１９
７８］、菌株５１５０−２８　［Ｃ，ハトフィールド（
ＨＡＤＦ　Ｉ　ＥＬＤ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、５２
．５９．１９８７１、菌株Ｙ−２９４［Ｇ、Ｓ、ブルッ
ゲ（ＢＲＵＧＧＥ）も、モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジー（Ｍ。

１、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、７．２１８０．２９８７
）および菌株ＭＣ１６ｃｉｒ　　　ＥＡ、Ｂ、７チヤー
　（ＦＵＴＣＨＥＲ）およびＢ、Ｓ。

コックス（ＣＯＸ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、１５７．２８
３．１９８４］　。ＧＲＦ１８０を使用しときと実質的
に同一の結果が得られた。

２、　分泌のためにアルファ因子のリーダーを使用して
酵母におけるヒトリゾチームのプラスミド仲介発現 ２．１１　発現ベクターの構成 プラスミドｐＡＢ２４ＡＧａ　ｌ　ｐｈａＦＬｙｓＨ（
参照、第７図）を、ニワトリシグナル配列をもたないヒ
トリゾチーム遺伝子のほとんどを含有するＮｈｅｌ−Ｂ
ａｍＨｒ断片およびＧＡＰターミネータ−をプラスミド
ｐＡＢ２４ＡＧＳｃＬｙｓＨ（第２図）から分離するこ
とによって作った。

合成ｘ　ｂ　ａ−Ｎ　ｈ　ｅアダプターを使用して、こ
の断片を、アルファー因子リーダーに融合したＡＤＨ２
−ＧＡＰプロモーターを含有するＢ　ａ　ｍ　Ｈ１−Ｘ
ｂａ断片に結合した［参照、Ａ、Ｊ、ペイク（ＢＡＫＥ
）ら、プロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．
Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ。

８１．７１６４２．１９８４］。得られるプロモーター
、アルファ因子リーダー　ヒトリゾチーム遺伝子、およ
びターミネータ−から成るＢａｍＨＩ発現カセットを、
プラスミドｐＡＢ２４中に挿入して、第７図に示すｐＡ
Ｂ２４ＡＧａ　Ｉ　ｐｈａＦＬｙ　ｓＨを産生じた。

２．２、　　ヒトリゾチームの発現および分泌このプラ
スミドを酵母菌株ＧＲＦ１８０、ＧＲＦ１８のｃｉｒ’
誘導体、中に形質転換し、そしてロイシンプロトドロー
フを選択した。形質転換体を８％のグルコースを含有す
るロイシン選択的培地中で２日間成長させ、次いで２％
のグルコースを含有するＹＥＰ培地中に１；２０で希釈
した。

３０°Ｃにおいて２日間培養した後、細胞を収穫し、そ
して前述のようにリゾチーム活性を決定した。

結果を表３に示す。

て５ａｃ２で直線化し、次いで菌株ＧＲＦ１８１ＧＲＦ
　ｌ　８０のｕｒａ３欠失誘導体、中に形質騙換した。

ウラシルプロトドローフを８％のダルースを含有するウ
ラシル選択的平板上で選択しｆ−次いで、形質転換体を
８％のグルコースを含有するウラシル選択的培地中で成
長させ、そして発がのため８％のグルコースを含有する
ＹＥＰ培地［１にＩ：２０に希釈した。５日後、培養物
を収穫そして前述のようにリゾチーム活性を測定した。

結果を表４に示す。リゾチーム活性はこれらの末み込み
体について明瞭に実証されたが、レベル（同一条件下に
プラスミド仲介発現について見らｔたレベルより低かっ
た。

明らかなように、リゾチームはアルファ因子リーダー融
合構成体により発現および分泌されるが、レベルはニワ
トリシグナルを使用するときより低い。

３、　酵母におけるヒトリゾチームの組み込み仲介発現 ３．１１　組み込みベクターの構成 その構成を実施例１．１に記載するヒトリゾチーム発現
カセットを、プラスミドｐＡＢ２４ＡＧＳｃＬｙｓＨ（
参照、第２図）から、制限酵素ＢａｍＨＩを使用する消
化により切除し、そして組み込みプラスミドＹＩＰ５　
［参照、Ｋ、ストルヒル（ＳＴＲＵＨＬ）ら、プロシー
デインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、）ＵＳＡ、７６．１０３５．１９７９］中に挿入して
、第８図に示すＹＩＰ５ＡＧＳｃＬｙｓＨを産生した。

３．２、　　ヒトリゾチームの発現および分泌このプラ
スミドをＧＡＰターミネータ−におい４、　形質転換し
た酵母の培養におけるヒトＧｌプラスミドｐＡＢ２４Ａ
ＧｓｃＬｙｓＨＧｌｙ４（参照、第４図）で形質転換し
た酵母菌株ＧＲＦ１８０を、ロイシンを欠きかつ８％の
グルコースを含有する最小培地中で２８℃において３日
間成長させた。次いで、得られる培養物を使用して、８
％の複合ＹＥＰ培地を１：１５０比で接種した。

実施例１に記載するのと同一のリゾチームの決定のため
のプロトコルを、２８℃において８９および２０９時間
後に得られた培養物に適用した。リゾチームの分布への
無機塩の効果を決定するために、培養物のアリコートの
部分にＮａＣｌを８９時間接０．５モルのＮａＣ］に補
充し、そしてインキュベーションを対照の培養における
ように続けた。同一の接種物を使用する他の実験におい
て、０．５モルのＮａＣＩを培養の開始から存在させｔ
こ。

得られた結果を表５に記載する。

表５のデータが示すように、普通のＹＥＰ培地において
、リゾチームのほとんどは細胞内（ＳＺ分画）に見いだ
され、インキュベーション時間が少なくなると、より多
くなる。対照的に、ＮａＣ１を系に添加すると、リゾチ
ームは主としてＳ０＋５１分画中に見いだされる、すな
わち、主に分泌される。実質的に、ＮａＣｌが培養の開
始時に存在するとき、同一のリゾチームの分布が得られ
る；しかしながら１、この場合において、成長は多少阻
害される。

同一のタイプの結果は、真性のヒトリゾチームを産生ず
るように形質転換した酵母を使用して得られる。

する複合ＹＥＰ培地をｌ：６の比で接種した。２８°Ｃ
において４８時間後、細胞を遠心により収穫し、そして
同一体積の合成培地中に再懸濁した。

この合成培地の組成を表６に記載する。

プラスミドｐＡＢ２４ＡＧＳｃＬｙｓＨ（第２図）を使
用する酵母菌株ＧＲＦ１８０を、ロイシンを欠きかつ８
％のグルコースを含をする最小培地を２８°Ｃにおいて
３日間成長させ、次いで得られる培養物を使用して、８
％のグルコースを含有表　６＝ヒトリゾチームの合成お
よび分泌Ｋ　Ｈｚ　Ｐ　０４ Ｍｇ５Ｏ＋−７ＨｚＯ ＣａＣＩｚ、２Ｈ２Ｏ ａＣ１ （Ｎ　Ｈ４）　！　Ｓ　Ｏ４ カゼイン加水分解物 ビタミン混合物 ビオチン 葉酸 カルシウムパントチネート ニコチン酸 ピリドキシン−ＨＣｌ チアミン−ＨＣＩ ｐ−アミン安息香酸 リボフラビン ミオイノシトール ６ｇ ６ｇ ０．１　ｇ ０．１　ｇ ０ｇ ０ｇ ０ｍ１２ ０．００２％ ０．００２％ ０．４％ ０．４％ ０．４％ ０．４％ ０．２％ ０．２％ ２．０％ 微量元素溶液 Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ４ ｎ５Ｏａ ｅＣＩ２ モリブデン酸ナトリウム ホウ酸 硫酸第二銅 Ｉ ヌクレオチドおよびアミノ酸補充物質 アデニン ウリジン トリプトファン メチオニン システィン スレオニン ヒスチジン 水 ０ｍＱ ００４％ ０．４％ ０．２％ ０．２％ ０．５％ ０．４％ ０．１％ ０ｍＱ とする量 比較のため、細胞のアリコートの部分を新鮮な・ＹＥＰ
培地中に再懸濁した。両者の培地に８％のグルコースを
補充した。次いで、得られる懸濁液を２８°Ｃにおいて
９０時間さらにインキュベーションし、そして培養物中
のリゾチームの分布を実施例１に説明するように決定し
た。

得られる結果を表７に示す。

表７におけるデータが前の実施例のデータ、すなわち、
ＹＥＰ目は、成長に好ましいが、広範な分泌を促進しな
い、を確証する：産生されたリゾチームの約３／４は細
胞内に止まる。対照的に、使）シた合成培地において、
リゾチームの約３／４は分泌され、その９３％は溶液中
に放出される、すなわち、普通の手段、例えば、限外濾
過により容易に回収可能である形態である。

しかしながら、他の実験は、この合成培地はことに活性
な成長を保証しないことを示した。こうして、明らかな
ように、本発明に従い、リゾチームからバイオマスの産
生を分離し、そしてヒトリゾチームの最適な産生を達成
するために、両者の工程の条件を別々に選択することが
重要である。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１１工程： ＤＮＡが遺伝子操作されている成長する酵母細胞を成長
制限条件下に培地と接触させ、そして前記酵母細胞を誘
発して酵素的に活性なリゾチームを合成および分泌させ
る、 からなることを特徴とする、酵素的に活性なリゾチーム
を産生ずる方法。

２、酵母細胞により産生および分泌されたリゾチームは
酵母細胞に対して毒性である、上記第１項記載の方法。

３、酵母細胞により産生および分泌されたリゾチームは
、ヒトリゾチームまたはその突然変異体である、上記第
２項記載の方法。

４、リゾチームの合成の誘発は調節可能なプロモーター
により保証される、上記第１項記載の方法。

５、前記プロモーターはりプレッシブル（ｒｅｐｒｅｓ
ｓｉｂｌｅ）プロモーターであり、そしてリゾチームの
合成はプロモーターを活動的にする（ｄｅｒｅｐｒｅｓ
ｓ）ことによって誘発する、上記第４項記載の方法。

６、前記プロモーターは、ＰＨ０５、ＡＤＨ２、ＧＡＬ
Ｉ、ＧＡＬ　Ｉ　０１ＳＵＣ２、ＭＡＬ６Ｓ。

ＭＡＬ６Ｔ、ＣＹＣＩ、一般のアミノ酸制御において含
まれる遺伝子のプロモーター、温度感受性プロモーター
、およびそれらから構成された雑種プロモーターからな
る群から選択される、上記第４項記載の方法。

７、前記プロモーターはＰＨ０５およびその上流の活性
化配列で構成された雑種プロモーターからなる群から選
択される、上記８ｇ６項記載の方法。

８、プロモーターはＡＤＨ２−ＧＡＰ雑種プロモーター
である、上記第６項記載の方法。

９、リゾチームの主要部分は培地中に分泌される、上記
第１項記載の方法。

ＩＯ１前記培地は、前記酵母細胞の壁から前記培地中に
リゾチームを遊離するためにを効な量の無機塩を含有す
る、上記第９項記載の方法。

１１、前記無機塩は水溶性であり、そして前記酵母細胞
に対して無毒である、上記第１０項記載の方法。

１２、前記無機塩はＮａＣｌ、ＫＣ１１ＮａＮ○ｓ　、
Ｎ　ａ　２　Ｓ　０４および（ＮＨ，）ｚｓｏｔからな
る群から選択される、上記第１０項記載り方法。　　１
３、前記無機塩はＮａＣＩである、上記第１２項記載の
方法。

１４、前記無機塩の濃度は０．２〜２モルである、上記
第１Ｏ項記載の方法。

１５、前記無機塩の濃度は０．５〜１モルである、上記
第１４項記載の方法。

１６、分泌されたリゾチームの少なくとも５０％は酵母
細胞の壁と会合して（ａｓｓｏｃｉａｔｅ　　ｗｉｔｈ
）止まる、上記第１項記載の方法。

Ｉ７、無機塩の濃度は０．２モル以下である、上記第１
６項記載の方法。

１８、工程： 酵素的に活性なリゾチームの合成を抑制する培地中で、
ＤＮＡが遺伝子操作されている酵母細胞を成長させ、そ
して 前記成長する酵母細胞を成長制限条件下に培地と接触さ
せ、そして前記酵母細胞を誘発して酵素的に活性なリゾ
チームを合成および分泌させる、からなることを特徴と
する、酵素的に活性なリゾチームを産生する方法。

ｌ９、酵母細胞により産生および分泌されたリゾチーム
は酵母細胞に対して毒性である、上記第１８項記載の方
法。

２０、酵母細胞により産生および分泌されたリゾチーム
は、ヒトリゾチームまたはその突然変異体である、上記
第１９項記載の方法。

２１、　　リゾチームの合成の誘発は調節可能なプロモ
ーターにより保証される、上記第１８項記載の方法。

２２、前記プロモーターはりプレツシブルプロモーター
であり、そしてリゾチームの合成はプロモーターを活動
的にすることによって誘発する、上記第２１項記載の方
法。

２３、前記プロモーターは、ＰＨ０５、ＡＤＨ２、ＧＡ
ＬＬ、ＧＡＬＩＯ，５ＵＣ２、ＭＡＬ６Ｓ、ＭＡＬ６Ｔ
、ＣＹＣｌ、一般のアミノ酸制御において含まれる遺伝
子のプロモーター、温度感受性プロモーター、およびそ
れらから構成された雑種プロモーターからなる群から選
択される、上記第４項記載の方法。

２４、前記プロモーターはＰＨ０５およびその上流の活
性化配列で構成された雑種プロモーターからなる群から
選択される、上記第２３項記載の方法。

２５、プロモーターはＡＤＨ２−ＧＡＰ雑種プロモータ
ーである、上記第２３項記載の方法。

２６、リゾチームの少なくとも５０％は培地中に分泌さ
れる、上記第１８項記載の方法。

２７、前記培地は、前記酵母細胞の壁から前記培地中に
リゾチームを遊離するために有効な量の無機塩を含有す
る、上記第２６項記載の方法。

２８、前記無機塩は水溶性であり、そして前記酵母細胞
に対して無毒である、上記第２７項記載の方法。

２９、前記無機塩はＮａＣ：Ｉ、ＫＣＩ、ＮａＮＯ３、
Ｎａ２５０４および（ＮＨ４）２５０．からなる群から
選択される、上記第２７項記載の方法。

３０、前記無機塩はＮａＣＩである、上記第２９項記載
の方法。

３１、前記無機塩の濃度は０．２〜２モルである、上記
第２７項記載の方法。

３２、前記無機塩の濃度は０．５〜１モルである、上記
第３１項記載の方法。

３３、分泌されたリゾチームの少なくとも５０％は酵母
細胞の壁と会合して止まる、上記第１８項記載の方法。

３４、無機塩の濃度は０．２モル以下である、上記第３
３項記載の方法。

３５、次ぎの配列 ＡＡＧＧＴＴＴＴＣＧＡＡＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＴＴＣ
ＣＡＡＡＡＧＣＴＴＴＣＴＡＣＡＣＴＣＧＴＡＧＣＴＡ
ＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＡＴＴＡＴＣＧＡＴＣＴＴ
ＧＡＡＡＣＴＴＣＴＣＴＡＡＧＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＧ
ＴＴＡＣＡＧＡＧＧＴＣＣＣＡＴＡＣＣＴＧＣＣＡＡＴ
ＧＴＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＡＡＣＴＧＧ
ＡＴＧＴＴＡＧＡＧＧＡＡＣＣＧＡＴＴＧＡＣＣＴＡＣ
ＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＡ
ＡＡＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＡＧＡＣＣＴＴＡＣＡ
ＡＣＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＡＣＡＡＴＧＴＴＧＴ
ＧＧＴＣＴＣＧＡＴＧＧＴＴＧＴＡＣＡＡＣＧＣＴＧＧ
ＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＴＴＧＣＧＡＣＣＡＣＴ
ＧＴＣＴＡＧＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＣＴＴＣ
ＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＴＧＣＣＡＴＡＧＡＡＧＧＴＴ
ＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＴＧＴＡＡＣＧ
ＴＴＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＡＣＣＡＣＡＴＴＧＧＡＣＧ
ＧＴＡＡＧＡＣＣＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴ
ＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＣＧＡＣＴＴＡＡＣＧＣＴＴＧ
ＴＣＡＣＴＴＧＴＣＣＴＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＣＡＧＴ
ＧＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡ
ＧＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＧＡＡＡＣＡＡＣＧＴＴＣＴＧ
ＴＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＴＣＧＣＣＴＧＴＧ
ＴＡＧＣＧＡＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＧＧＡＣＡＣＣＴＡ
ＡＧＡＧＡＧＴＴＧＴＴＡＧＡＧＡＣＣＣＧＡＴＴＣＴ
ＣＴＣＡＡＣＡＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＣＡＡＧＧＴＡＴ
ＣＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧＴＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＧＴＣ
ＴＣＧＡＡＣＣＣＡＡおよび自然ヒトリゾチームと異な
りかつムラミダーゼ活性を保持するタンパク質の遺伝情
報を指定する、その突然変異体からなる群から選択され
る、ことを特徴とする、ヒトリゾチームのための合成遺
伝子。

３６、上記第３５項記載の合成遺伝子を発現することが
できるように遺伝子操作されていることを特徴とする、
酵母細胞。

３７、前記合成遺伝子の５′末端は、酵母分泌の機構に
より認識されかつ正しく切断されているシグナルペプチ
ドの遺伝情報を指定する、リーダー配列と同調して融合
されている、上記第３６項記載の酵母細胞。

３８、リーダー配列はニワトリリゾチームのシグナルペ
プチドをエンコードする、上記第３７項記載の酵母細胞
。

３９、合成遺伝子の発現は調節可能なプロモーターによ
り制御される、上記第３７項記載の酵母細胞。

４０、前記プロモーターはりプレッシプルプロモーター
であり、そしてリゾチームの産生はプロモーターを活動
的にすることによって誘発する、上記第３９項記載の酵
母細胞。

４１、前記プロモーターは、ＰＨ０５、ＡＤＨ２、ＧＡ
ＬＩ、ＧＡＬＩＯ，５ＵＣ２、ＭＡＬ６Ｓ、ＭＡＬ６Ｔ
、ＣＹＣｌ、一般のアミノ酸制御において含まれる遺伝
子のプロモーター、温度感受性プロモーター、およびそ
れらから構成された雑種プロモーターからなる群から選
択される、上記第３９記載の酵母細胞。

４２、前記プロモーターはＰＨ０５およびその上流の活
性化配列で構成された雑種プロモーターからなる群から
選択される、上記第４１項記載の酵母細胞。

４３、プロモーターはＡＤ）１２−ＧＡＰ雑種プロモー
ターである、上記第４１項記載の酵母細胞。

４４、宿主菌株はサツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）属
に属する、上記第３６項記載の酵母細胞。

４５、宿主菌株は菌株ＧＲＦ　１８、ＧＲＦ１８０、Ａ
Ｈ２２、ＭＣｌ６　　ａｉｒ　　、５１５０−２Ｂおよ
びＹ−２９４からなる群から選択される、上記第４４項
記載の酵母細胞。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトリゾチームの遺伝情報を指定する合成遺
伝子の配列を示し、ここでヒトリゾチームは酵母の好ま
しいコドン［Ｊ、Ｌ、ペンネツゼン（ＢＥＮＮＥＴＺＥ
Ｎ）およびＢ、Ｄ、ハルＣＨＡＬＬ）、ジャーナル・才
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂ　ｉｏ　１
．Ｃｈｅｍ、）、２５７．３０２６．１９８２］　を使
用してアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ
　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｒｒｉｓ）ＤＮＡ合成装置でホス
ホルアミダイトの化学に従い合成された。 第２図は、プラスミドｐＡＢ２４ＡＧＳｃＬｙｓＨを示
し、これはヒトリゾチームの酵母における発現のために
使用することができ、そして調節可能なＡＤＨ２−ＧＡ
Ｐプロモーター、ニワトリリゾチームのシグナル配列、
第１図に示すヒトリゾチーム遺伝子およびＧＡＰターミ
ネータ−からなるヒトリゾチーム発現カセットの酵母−
Ｅ。 ｃｏｌｉシャトルベクターｐＡＢ２４中に挿入すること
によって得られた。 第３図は、ｃｙ＋ｙ−４をもつ突然変異体ヒトリゾチー
ム遺伝子の配列を示し、これはニワトリシグナルにおけ
るＳｐｅ　１部位からヒト遺伝子においてＮｈｅ１部位
への合成断片を使用して合成され、ここで成熟タンパク
質の位置４におけるコドンはＧＡＡ　（グルタミン酸）
からＧＧＡ　（グリシン）に変化された。 第４図は、プラスミドｐＡＢ２４ＡＧＳｃＬｙｓＨＧｌ
ｙ４を示し、これは第３図の突然変異体遺伝子が第１図
に示すヒトリゾチーム遺伝子と置換されている以外、第
２図に示すものと同一である。 第５図は、プラスミドｐＡＢ２４ＡＧｓｃＬｙｓＣを示
し、これは発現カセットがＡＤＨ２−ＧＡＰ７’ロモー
ター、完全なリゾチームｃＤＮＡおよびＡＤＨｌターミ
ネータ−から成る以外、第２図に示すものと同一である
。 第６図は、プラスミドｐＡＢ２４ＧＳｃＬｙｓＣを示し
、これは発現カセットが構成的ＧＡＰプロモーター、第
５図に示すのと同一の細胞ｃＤＮＡおよびＧＡＰプロモ
ーターから成る以外、第２図に示すものと同一である。 第７図は、プラスミドｐＡＢ２４ＡＧａ　ＩｐｈａＦＬ
ｙ　ｓＨを示し、これはアルファ因子のリーダー配列が
ニワトリリゾチームのシグナル配列と置換されている以
外、第２図に示すものと同一である。 第８図は、プラスミドＹＩＰ５ＡＧＳｃＬｙｓＨを示し
、これは第２図に示すプラスミドｐＡＢ２４ＡＧＳｃＬ
ｙｓＨの構成のために使用したのと同一のヒトリゾチー
ム発現カセットの組み込みプラスミドＹＩＰＳ中の挿入
により得られた。 第９図は、本発明を実施するための１つの特定のモード
の実施態様のフローシートを示し、ここで分泌されたリ
ゾチームは液状培地から抽出により回収される。 第１Ｏ図は、この方法の他の実施態様のフローシートを
示し、ここでリゾチームの産生はその分泌された部分が
酵母細胞の壁と会合して止まるような条件下に実施され
る。 ■、　　発酵槽 ２　　　ライン ３　　　ライン ４　　　ライン ５　　　遠心装置 ６　　　ライン ７　　　ライン ８槽 ｌＯライン １１　　　ライン １２　　　ライン １３　　　遠心装置 １４　　　ライン １５　　　抽出ユニット １６　　　ライン １７　　　ライン １８　　　精製ユニット ２０　　　ライン ２４　　　遠心装置 第２図 ｂａｌ 第４図 第６図 第５図 第７図 ｂａＩ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： ＤＮＡが遺伝子操作されている成長する酵母細胞を成長
   制限条件下に培地と接触させ、そして前記酵母細胞を誘
   発して酵素的に活性なリゾチームを合成および分泌させ
   る、 からなることを特徴とする、酵素的に活性なリゾチーム
   を産生する方法。 ２、工程： 酵素的に活性なリゾチームの合成を抑制する培地中で、
   ＤＮＡが遺伝子操作されている酵母細胞を成長させ、そ
   して 前記成長する酵母細胞を成長制限条件下に培地と接触さ
   せ、そして前記酵母細胞を誘発して酵素的に活性なリゾ
   チームを合成および分泌させる、からなることを特徴と
   する、酵素的に活性なリゾチームを産生する方法。 ３、次ぎの配列 【遺伝子配列があります】 および自然ヒトリゾチームと異なりかつムラミダーゼ活
   性を保持するタンパク質の遺伝情報を指定する、その突
   然変異体からなる群から選択される、ことを特徴とする
   、ヒトリゾチームのための合成遺伝子。 ４、特許請求の範囲第３項記載の合成遺伝子を発現する
   ことができるように遺伝子操作されていることを特徴と
   する酵母細胞。