NO177065B - Framgangsmåte for framstilling av enzymatisk aktivt humant lysozym - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en framgangsmåte for framstilling av enzymatisk aktivt humanlysozym.

Bakgrunn

Lysozym er det vanlige navnet for naturlig forekommende enzymer som er kjent for å katalysere hydrolysen av peptidoglycan som er den essensielle komponent i bakteriens cellevegg. Som et resultat av denne prosess, har lysozymer antibakterielle egenskaper, og er av denne grunn antatt å delta i de forskjellige barrierer mot bakterielle infeksjoner påvist i de fleste levende organismer. I denne sammenheng,

for insekter som mangler lymfocytter og immunoglobuliner, er immunsystemets respons mot bakterielle infeksjoner sikret ved et multifunksjonelt enzymsystem der lysozym er en viktig komponent (se f.eks. D.HULTMARK et al., Eur. J. Biochem. 106, 7, 1980). I høyerestående dyr, selv om den fysiologiske rolle for lysozym ennå ikke er kjent (se R.RAGHUNATHAN, IRCS Med. Sei. 13, 480, 1985), underbygger dens store utbredelse at lysozym spiller en viktig rolle. Det har vært foreslått at lysozym kan ha en stimulerende effekt på immunsystemet (se P.JOLLES, Biomedicine 25, 276, 1976). Humanlysozym i fysiologiske doser har vist stimulerende effekt på in vitro fagocytose av gjærceller ved polymorfonukleære leukocytter (se M. KLOCKARS & P.ROBERTS, Acta haemat. 58, 289, 1976). Det har også blitt foreslått at lysozym kan spille en generell rolle ved overvåkningen av membraner og i anti-tumor funksjoner i makrofager (E.F.OSSERMAN et al., Nature 243. 331, 1973). I den senere tid har det kommet fram at lysozym i seg selv har en viss anti-tumor effekt (se R. RAGHNATHAN, Cancer Detection and Prevention 5, 78, 1982). Allerede i dag blir lysozym fra kylling anvendt i flere farmasøytiske anvendelser, spesielt i Japan.

Lysozym fra kylling tilhører en gruppe av nært beslektede lysozymer, deriblant lysozym fra mennesker, som blir benevnt som c (chicken) lysozymer. De er karakterisert ved felles fysiokjemiske egenskaper som: en molekylvekt rundt 15 000, beslektet homologi i aminosyresekvensen og tertiær struktur, lik enzymatisk aktivitet, f.eks. noe chitinase-aktivitet, i kontrast til g (gås)- lysozymer som har en molekylvekt rundt 20 000 og ingen chitinase-aktivitet. (Se P.JOLLES & J.JOLLLES, Mol. & Cell. Biochem. 63, 165, 1984).

Likevel, på tross at disse strukturelle og fysiokjemiske likheter, kan lysozymer innenfor samme gruppe framvise ganske forskjellige immunologiske egenskaper. For eksempel kyllinglysozym og humanlysozym kryssreagerer ikke med deres respektive antistoffer (se A.FAURE & P.JOLLES, FEBS Lett. 10, 237, 1970). Derfor er humanlysozym spesielt utpekt til farmasøytisk bruk, og til og med for næringsmidler. Til forskjell fra kyllinglysozym som har rike kilder og faktisk blir anvendt, f.eks. fra eggehvite, kan imidlertid ikke humanlysozym framskaffes i store mengder til kommersielt bruk, bortsett fra cellekulturer der DNA-strukturen er manipulert for å uttrykke enzymet.

Det er nå vanlig praksis å klone og produsere genkode for et heterologt protein, f.eks. et protein av menneskelig opprinnelse, i en mikrobisk vert. Flere eksempler kan finnes med utførende detaljer i patentlitteraturen, derav flere allerede har funnet en kommersiell anvendelse. Dette er tilfelle for f.eks. humaninsulin, veksthormoner og alfa-interferon produsert i den gram-negative bakterien Escherichia coli. I denne verten kan det med letthet oppnås høye utbytter. Proteiner produsert på denne måten er imidlertid ofte konsentrert som store aggregater hvor de er i en uløselig og inaktiv tilstand. For å oppnå det fysiologiske aktive protein i slike tilfeller, er det nødvendig å ta i bruk kostbare og tidkrevende metoder for renaturering, og utbyttet kan bli såpass lavt som 20% som tilfellet er for prochymosin (se F.A.O.MARSTON et al., Biotechnology 2, 800, 1984). Det samme fenomen finner sted når en DNA segmentkode for humanlysozym er uttrykt i E.Coli. Etter nedbryting av cellene med ultralyd, er humanlysozym hovedsakelig funnet assosiert med cellefragmentene. Proteinet er ikke aktivt, og er forskjellig fra det opprinnelige humanlysozymet ved en ekstra N-terminal metioninrest (se M. MURAKI et al., Agric. Biol. Chem. 49, 2829, 1985).

For å overvinne disse vanskelighetene ble det gjort forsøk på å uttrykke humanlysozym i den gram-positive bakterie Bacillus subtilis. som er kjent for aktivt å frigjøre en viss mengde av hydrolytiske enzymer ut i det omgivende medium, og som ofte er anvendt som vert for uttrykking og frigjøring av heterologe proteiner. I tilfellet med humanlysozym var det imidlertid nylig vist at det frigjorte proteinet er enzymatisk inaktivt, sannsynligvis på grunn av ukorrekt bindingsdannelse (se K.YOSHIMURA et al., Biochem. & Biophys. Res. Comm. 145, 712, 1987).

Andre verter enn bakterier kan også anvendes til produksjon av heterologe proteiner som f.eks.: eukaryotiske mikroorganismer (f.eks. gjær), spesielt Saccharomyces cerevisiae. eller selv filamentous fungi. Et typisk eksempel på produksjon av humanprotein i gjær med høyt utbytte er den intracellulære uttrykking av aktiv superoksid dismutase (se Internasjonal patentsøknad WO 85/01503). Når DNA-kode for høyverdig humanlysozym er uttrykt i gjær, skjer imidlertid det samme fenomen som tilfellet med E. coli. dvs at lysozym er funnet assosiert med cellefragmenter hvor lysozymet må ekstraheres med oppløsende middel som f.eks. konsentrert urea (se EP 0181634, s.47). I etterhånd er det kommet fram mere data som viser at høyverdig protein uttrykt i gjær, virkelig er framstilt i en uløselig og inaktiv form, sannsynligvis som et resultat av ukorrekt dannelse av disulfid-bindinger (se T.HAYAKAWA et al., Gene 56_, 53, 1987).

Som beskrevet i Belgisk patent BE 901,223, kan enzymatisk aktivt lysozym framstilles fra genetisk manipulert gjær forutsatt at DNA-koden for det endelige protein blir fusjonert med en ledersekvens-kode for et signalpeptid gjenkjent ved utskillelses-maskineriet i vertscellen. I dette tilfellet blir det endelige protein frigjort gjennom plasmamembranen, og avhengig av betingelsene til en viss grad videre ut i kultiveringsmediet. I det ovennevnte belgiske patentet er det på denne måten vist at uttrykking av en komplett cDNA-kode for kylling prelysozym i gjær, resulterer i produksjon av enzymatisk aktivt lysozym, der en stor del (73%) finnes løst i kultiveringsmediet. Senere ble det vist at N-terminal sekvensen av kyllinglysozymet produsert på denne måten er identisk med det opprinnelige enzym, dvs Lys-Val-Phe-Gly-Arg-Cys-Glu-Leu-Ala-Ala (se J.OBERTO et al., llth Int. Symph. Special. Yeast Mol. Biol. & Genetics, Varna, Nov. 4-9, 1985; se også Belgisk patent BE 903,626). Disse resultatene demonstrerer at signalsekvensen av kyllinglysozym er korrekt splittet ved gjærens frigjøringsmekanisme, noe som gjør det mulig å anvende den nevnte signalsekvens til å sikre frigjøring av lysozymer fra ulike kilder som krevet i BE 901,223, krav 3 f.eks. Fordelen med dette ble nylig anvendt i tilfellet med humanlysozym (se Y.JIGAMI et al., Gene 43, 273, 1986 og K.YOSHIMURA et al., ref. eit.). Likevel er de rapporterte utbytter forholdsvis lave.

Muligheten for å frigjøre lysozym fra gjærcellene har en vesentlig praktisk fordel. Ikke bare er det dannede enzym aktivt og identisk med det opprinnelige protein, men også lett isolert og konsentrert med kjente metoder slik som beskrevet i det ovennevnte BE 903,626, uten å være nødt til å knuse cellene og anvende komplekse og kostbare fraksjonerings- og raffineringsprosesser. En annen fordel ved å frigjøre det ønskede protein fra cellene er muligheten for å gjenvinne sistnevnte til sekundær bruk som f.eks. en kilde for proteiner og vitaminer i mat. Faktisk så gjør det høye proteininnholdet i gjæren, den gode aminosyrebalansen og mangelen på cellulose, at gjæren blir et verdifullt fortilskudd for unge forsøksdyr slik som kalver og unge kastrerte råner.

Nedenfor følger andre eksempler fra patentlitteraturen innen framstilling av humanlysozym.

EP-A3-120551 anviser nye promotorer for gjær-ekspresjonssystemer og framgangsmåter for uttrykking av et DNA-kodende segment i gjær, hvorved det kodende segment innføres i en gjær-ekspresjonsvektor og gjærcellene transformeres med den resulterende ekspresjonsvektor.

EP-A3-164556 beskriver en ny hybridpromotorregion for bruk i forbindelse med konstruksjoner med strukturelt gen under transkripsjonskontroll av hybridpromotorregionen og en terminalregion.

NO-A-864495 beskriver en framgangsmåte for framstilling av humanlysozym hvorved det syntetiseres et cDNA med et minimum av informasjon for aminosyresekvensen for HLZ, transformeres vertsceller med en ekspresjonsvektor som inneholder nevnte cDNA, for å kultivere cellene og isolere det biologisk aktive HLZ-protein framstilt på denne måten.

EP-A1-208472 angår et rekombinant ekspresjonsplasmid for gjør omfattende et syntetisk humanlysozym.

EP-A3-181634 beskriver kun et DNA omfattende syntetisk gen for uttrykking av humanlysozym.

I de tre sistnevnte kjente framgangsmåtene blir cellene dyrket og humanlysozym framstilt samtidig.

For å gjøre produksjonen av et mellomklasse-enzym som lysozym ved fermentering i et relativt stort volum økonomisk mulig, er det ikke nok at man sikrer selve utskillelsen fra cellen. Det er også nødvendig å produsere det med et høyt utbytte.

Formål

Formålet med oppfinnelsen er å anvise en forbedret framgangsmåte for framstilling av enzymatisk aktivt lysozym med høyt utbytte. En annet formål er å oppnå en forbedret framgangsmåte under slike betingelser at denaturering av enzymet blir minimalisert og at det blir frambragt i en konsentrert form som med letthet kan brukes under videre foredling.

Oppfinnelsen

Disse formål oppnås med en framgangsmåte ifølge den karakteriserende del av patentkrav 1. Ytterligere fordelaktige trekk framgår av de uselvstendige krav 2 til 13.

Ifølge oppfinnelsen kontaktes voksende gjærceller, hvis DNA er genetisk manipulert til å omfatte et segment som koder for humant lysozym, med et kultiveringsmedium under vekstbegrensende betingelser, og gjærcellene induseres for å syntetisere og utskille enzymatisk aktivt humant lysozym, idet lysozym-syntesen sikres med en regulerbar promoter, eller induseres ved aktivering av promotoren.

Et syntetisk gen for humanlysozym oppviser følgende sekvens:

samt mutantene fra denne med kode for et protein som er forskjellig fra naturlig humanlysozym og som opprettholder en muramidase-aktivitet. Figur 1 illustrerer en sekvens for en syntetisk genkode for humanlysozym, som ble syntetisert med gjærfavoriserende codoner (J.L.BENNETZEN og B.D.HALL, J. Biol. Chem. 257, 3026, 1982) under anvendelse av fosforamid-kjemi på en Applied Biosystems DNA Synthesizer. Figur 2 illustrerer plasmid pAB24AGScLysH, som kan anvendes til uttrykking av humanlysozym i gjær, og som framkom ved tilsats til gjæren E. coli's skyttelvektor pAB24 av en humanlysozym-uttrykks-streng bestående av den regulerbare ADH2-GAP-promotor, kyllinglysozym-signalsekvens, humanlysozym-gen vist i Figur 1 samt GAP-terminator. Figur 3 illustrerer en sekvens av et mutant humanlysozym-gen med Gly-4, som ble konstruert ved bruk av et syntetisk fragment fra Spel-posisjonen i kylling-signal til Nhel-posisjonen i humangenet der codonet i posisjon 4 i det endelige protein ble forandret fra GAA (glutaminsyre) til GGA (glysin). Figur 4 illustrerer plasmid pAB24AGScLysHGly4, som er identisk med det som er vist i Figur 2 bortsett fra at det mutante genet i Figur 3 er byttet ut istedet for genet for humanlysozymet i Figur 1. Figur 5 illustrerer plasmid pAB24AGScLysC, som er identisk med det som er vist i Figur 2, bortsett fra at uttrykks-strengen består av promotoren ADH2-GAP, et komplett kyllinglysozym cDNA og terminatoren ADH1. Figur 6, som illustrerer plasmid pAB24GScLysC, er identisk med det som er vist i Figur 2 bortsett fra at uttrykks-strengen består av den grunnleggende promotoren GAP, det samme kyllinglysozym cDNA som vist i Figur 5 samt GAP-terminatoren. Figur 7 viser plasmid pAB24AGalfaFLysH, som i hovedsak er identisk med det som er vist i Figur 2, bortsett fra at alfa-faktor-ledersekvensen er substituert med signalsekvensen for kyllinglysozym. Figur 8 viser plasmid YIP5AGScLysH, som ble framstilt ved tilsats av den samme humanlysozym-uttrykks-streng som ble brukt til konstruksjon av plasmid pAB24AGScLysH vist i Figur 2, til integrasjons-plasmid YIP5. Figur 9 illustrerer et flytskjema for en realisering av en bestemt måte å praktisere

oppfinnelsen på, der det utskilte lysozymet er isolert ved ekstraksjon fra veskefasen.

Figur 10 illustrerer et flytskjema av en annen metode av prosessen der lysozymproduksjonen er utført under slike betingelser at den utskilte delen av denne forblir assosiert i celleveggen i gjæren.

Som framhevet ovenfor, var den første demonstrasjon av muligheten til å lage gjær gjennom genetiske manipuleringsteknikker - istand til å produsere og utskille enzymatisk aktivt lysozym, utført med kyllinglysozym som modellforbindelse. Mer spesifikt, i eksempel 2.2 i BE 901,223 er det beskrevet transformasjonen av en leu2 generasjon av Saccharomyces cerevisiae (GRF18) med et plasmid (plys50) bestående av den komplette sekvens av det endogene 2-mikron-plasmid, det svekkede leu2-genet i plasmid pJDB219 (se J.D.BEGGS, Nature 275, 104, 1978) for utvelgelse i gjær, bakterielle sekvenser for reproduksjon og utvelgelse i E. coli og en uttrykks-streng der det komplette kyllinglysozym cDNA er satt under transkripsjons-kontroll av gjær-promotoren p415. I dette eksemplet ble uttrykking og utskillelse av lysozym verifisert ved både celleblandingens- og det cellefrie kultiveringsmediets evne til å desintegrere celler av Micrococcus lysodeikticus. Total aktivitet ble målt til 162 enheter/ml fordelt på 118 enheter i mediet og 44 enheter assosiert i cellene. De samme type resultater er oppnådd ved bruk av et annet 2-mikron basert uttrykks-plasmid der transkripsjon av kyllinglysozym cDNA er sikret ved den sterkt grunnleggende promotor for GAP-genkode for glyseraldehyd-fosfat-dehydrogenase. I et første forsøk på å uttrykke humanlysozym, har vi i denne senere konstruksjon byttet ut DNA-koden for det endelige kyllinglysozym med en syntetisk DNA-segmentkode for det endelige humanlysozym. Den anvendte sekvensen, vist i Figur 1, ble primært utledet med hensikt på å framheve codoner foretrukket av S. cerevisiae for høyverdig uttrykking av dets egne gener. I tillegg ble stille mutasjoner anvendt for å introdusere unike restriktive enzymposisjoner for å muliggjøre etterfølgende manipulering av sekvensen. Ved bruk av denne konstruksjonen ble, uventet nok, ingen leu<+->transformanter oppnådd med konvensjonelle metoder og utvelgelse på leucin-manglende medium. Således vil tilsynelatende humanlysozym redusere cellens levedyktighet, muligens ved interferens med syntesen av chitin som er en naturlig bestanddel av gjærens cellevegg, når lysozymet er aktivt syntetisert i gjærens protoplasma (se E.CABIB & R.ROBERTS, Ann. Rev. Biochem. 51, 763, 1982).

Uansett har vi funnet at når transkripsjon av det samme humanlysozym-kode DNA-segment er satt under kontroll av en regulerbar promotor, og forutsatt at nedtrykkingen av denne er brakt fram under vekstbegrensede betingelser, vil aktiv

i lysozymsyntese skje uten tilsynelatende skadelig effekt på cellens fysiologi. I kontrast, når lysozymsyntese skjer under betingelser som tillater vekst, vil ikke bare biomasseproduksjonen svekkes, men enda mere slående vil lysozymsyntesen være for begrenset til å være av praktisk interesse. En slik avhengighet av vekstbegrensende betingelser for syntese av humanlysozym er ikke observert med kyllinglysozym. I Dette er overraskende sett i betraktning av likheten i de enzymatiske egenskaper mellom begge enzymene. Ved første øyekast kan forskjellen tilskrives det faktum at humanlysozym har en spesifikk tetthet omlag 2.5 ganger høyere enn kyllinglysozym (se R.E.CANFIELD et al. i "Lysozyme", Ed. E.F.OSSERMAN, R.E.CANFIELD og S.BEYCHOK, Academic Press, 1974, s.63). Når primærstrukturen av forløperen i er forandret ved posisjonsorientert mutagenase slik at Glu-resten i posisjon 4 er substituert med en Gly-rest som i kyllinglysozym, er imidlertid den samme hemmingen av lysozymsyntese under vekstbetingelser blitt observert, mens derimot den spesifikke aktiviteten av det muterte protein med M. lysodeikticus som substrat ikke er nevneverdig høyere enn tilfellet er for kyllinglysozym.

I Følgelig så er et viktig aspekt i denne oppfinnelsen å sørge for en prosess der vekst og lysozymsyntese i hovedsak er etterfølgende istedet for simultane prosesser. Dette kan med letthet oppnås ved å bruke en inhiberende gjærpromotor ved transkripsjon av det lysozymkodende DNA-segment. Ulike promotorer av denne type er kjent. For eksempel kan promotoren av genkoden for syrefosfatase anvendes, som i vist i EP 100,561. Som nylig publisert i EP 213,593 er denne egenskap relatert til nærværet av, oppstrøms for PH05-genet, to aktiveringssekvenser som kan brukes til konstruksjon av regulerbare hybridpromotorer, f.eks. ved fusjon med promotoren av GAP-genet. Faktisk, som beskrevet i EP 164,556, kan et utvalg av slike hybridpromotorer konstrueres ved kombinasjon av forskjellige gjærpromotorer, spesielt sterke promotorer fra genkoder for glykolytiske enzymer som GAP, med en regulatorregion i samsvar med ulike inhiberende gener, f.eks. GALI. GAL10. PHQ5. SUC2, MAL6S. MAL6T. CYC1. ADH2 eller gener under generell aminosyrekontroll slik som HiSl. HiS3. HiS4. TRP5 eller LEU3. For eksempel er ADH2-genet inhibert med glukose og aktivert i nærvær av en ikke-fermenterbar karbonkilde slik som etanol. Følgelig så er det mulig å la uttrykking av lysozym være av eller på, uavhengig av vekst, ved bruk av slike regulerbare promotorer under nøye kontroll av sammensetningen av kultiveringsmediet. Andre gjærpromotorer regulert ved temperaturendringer kan også anvendes.

Et annet viktig aspekt, som også er nevnt ovenfor, er at lysozym uttrykt i gjær under vekstbegrensede betingelser blir utskilt fra denne. Dette er også et overraskende faktum når tatt i betraktning at de fleste tilgjengelige eksperimentelle beviser peker mot det faktum at proteinutskillelse i gjær har sammenheng med cellevekst (se R.SCHEKMAN, TffiS, Juli 1982, s.243). I kontrast til dette, mens gjærcellene er holdt vedlike i den stasjonære fasen, øker mengden av utskilt lysozym funnet på utsiden av plasmamembranen på bekostning av mengden funnet intracellulært.

Ikke desto mindre, som de som har innsikt i bransjen vet, at for å sikre utskillelse av lysozym gjennom plasmamembranen er det nødvendig at det lysozymkodende DNA-segmentet er passende utstyrt med en ledersekvens-kode for et signalpeptid som tillater det translaterte protein å bli flyttet til lumenet i det endoplasmatiske retikulum og prosessert til det endelige enzym. Denne ledersekvensen kan være ulike sekvenskoder for ulike signalpeptider, homologe eller heterologe, som er gjenkjent og riktig spaltet av gjærens utskillelsesmekanisme. Som allerede diskutert i det foregående, skjer effektiv utskillelse fra bruken av sekvensen som koder signalpeptidet for kyllinglysozym, men sekvenser som koder andre heterologe signalpeptider kan også anvendes. På den annen side kan homologe signalsekvenser også anvendes. For eksempel, en effektiv og godt dokumentert utskillende uttrykksmetode består i bruken av leder-regionen av forløperne til de gjær-parede ferormoner alfa- og a-faktorer (se f.eks. EP 116,201 og EP 123,289).

Det lysozymkodende DNA-segment som blir uttrykt i forbindelse med den foreliggende framgangsmåten kan være hvilken som helst DNA-sekvenskode for humanlysozym, dvs for et protein med muramidase-aktivitet og i hovedsak den samme aminosyresekvens som naturlig forekommende humanlysozym. Det kan være et cDNA oppnådd ved omvendt transkripsjon av mRNA transkribert fra det opprinnelige humangenet. Alternativt kan det være et hvilken som helst syntetisk DNA-segment som koder humanlysozym som beskrevet i det foregående. En vesentlig forskjell ved den sistnevnte metoden er at nukleotidsekvensen i DNA-segmentet syntetisert på denne måten kan modelleres for å utgjøre codonene som er mest brukt i gjær, med den hensikt å forbedre effektiviteten av translasjon. I henhold til den ovennevnte definisjon er, en hvilken som helst DNA-segmentkode for et protein derav visse modifikasjoner referert til det opprinnelige humanlysozym kunne vært utført av praktiske årsaker, f.eks. forbedret termisk stabilitet og/eller spesifikk aktivitet, å betrakte som anvendbar i den foreliggende framgangsmåten.

i For å uttrykke og utskille lysozym i gjær må det konstrueres og innlemmes passende i en gjær-uttrykksvektor: en uttrykks-streng bestående av disse ulike elementene, dvs fra 5' til 3', den hemmende promotor, DNA-sekvenskoden for et passende signalpeptid, det lysozymkodende DNA-segment og, fortrinnsvis, en gjær-transkripsjons-terminator. En mulighet er å gjøre bruk av et plasmid med evne til å reprodusere selvregulert i gjær i et stort antall kopier, slik som de som blir anvendt som markør av det defektive LEU2 genet. En foretrukket versjon av slike uttrykks-plasmider, er de som er avledet fra det endogene 2-micron-plasmid i gjær og, enda bedre, de som består av den komplette sekvensen av denne. I dette tilfellet er det mulig å anvende cir°-generasjoner av gjær til transformasjon, dvs generasjoner

i preparert fra deres 2-micron-plasmider. Transformanter som er dannet på denne måten, inneholder kun det chimeriske plasmid konstruert med lysozym-genet. Antall koper fra denne er derfor maksimert, og plasmidets ustabilitet forårsaket av rekombinasjons-reaksjoner er minimert. Ikke desto mindre kan det være en fordel å integrere uttrykks-strengen inn i gjærens genome for å oppnå maksimal uttrykks-stabilitet. Et stort antall av uttrykks-systemer kan på denne måten tenkes ved en overveid kombinasjon av ulike konstruksjons-elementer, der et stort antall allerede er tilgjengelige innen bransjen.

Gjæren som kan anvendes i overensstemmelse med denne oppfinnelsen, vil fortrinnsvis være av slekten Saccharomyces og enda bedre av arten Saccharomyces

i cerevisiae. dvs brødgjær. En grunn til dette er at de biologiske egenskaper hos denne gjæren er forholdsvis godt kjent. En annen viktig årsak er at S. cerevisiae er typisk en GRAS (eng.: generelt gjenkjent som sikker) mikroorganisme, spesielt anvendbar

til "God Industriell Storskala-Bruk" som definert nylig i organisasjonen for økonomisk samarbeid og utvikling (OECD). Prosessen i denne oppfinnelsen kan imidlertid også med fordel anvendes på andre arter av gjær, f.eks. Kluyveromyces lactis. Pichia pastoris. Saccharomycopsis lipolytica. Schwannomyces alluvius. Schizosaccharomyces pombe. og tilsvarende.

Som innsett av de dyktige innen bransjen, er det mulig å dyrke vertsorganismen uten produksjon av enzymet når en DNA-segmentkode for humanlysozym er satt under kontroll av en hemmende promotor som beskrevet i det foregående. For å oppnå dette, må vekstbetingelsene opprettholdes slik at promotoren forblir hemmende. For eksempel, ved bruk av promotoren PHQ5 må det uorganiske fosfatet i kultiveringsmediet registreres i en tilstrekkelig høy verdi, f.eks. ved kontrollert tilsats av uorganisk fosfat til mediet, inntil den ønskede cellekonsentrasjon er oppnådd. Deretter, ved avbrudd av tilsatsen, forutsatt at de andre næringsstoffene ikke er i begrensede mengder, vil konsentrasjonen av det uorganiske fosfatet i mediet avta, som resultat av fortsatt vekst, til å nå et nivå som er lavt nok til å indusere lysozymsyntese, dog uten å forårsake aktiv vekst.

Tilsvarende, ved bruk av en promotor, hemmet av glukose og aktivert av etanol som f.eks ADH2-promotoren. bør konsentrasjonen av glukose vedlikeholdes ved et nivå høyt nok til å sikre vekst men ikke lysozymsyntese. Slike betingelser resulterer i produksjon av etanol, som et resultat av den såkalte Crabtree-effekt (se f.eks. O.KAEPPELI et al., CRC Critical Reviews in Biotechnology 4 (3), 299, 1986). Deretter, ved å avbryte glukoseføden vil lysozymsyntesen sette i gang på bekostning av etanolen.

I henhold til en foretrukket måte å praktisere oppfinnelsen på, er kultivering av gjær og lysozymproduksjon utført som separate operasjoner. I et første medium skjer dyrking av gjær i fravær av lysozymsyntese opp til den ønskede celletetthet. Cellene blir deretter overført til et medium valgt for å sikre lysozymsyntese men med begrenset vekst. Den største fordelen med denne metoden er at optimale betingelser for begge operasjoner kan anvendes uavhengig. Disse operasjonene kan utføres satsvis, halvkontinuerlig som i en føde-sats operasjon, eller helkontinuerlig.

For å gi et bedre bilde av prosessbeskrivelsen vises det til figur 9, som illustrerer en spesiell måte å praktisere oppfinnelsen på. I den illustrerte prosessen blir kultivering av gjær utført i en fermenteringstank 1 der luft kan tilføres fra strøm 2 og passende næringsstoffer fra strøm 3. Disse nutrientene bør tilføres i mengder som er tilstrekkelig til å sikre aktiv vekst, men dempe lysozymsyntese som forklart ovenfor. De består av karbonkilder som kan være ren glukose, sukrose eller industriavfall som f.eks. melasse. De andre næringsstoffene, som er påkrevd for å sikre vekst, kan være i form av mineralsalter slik som f.eks. (NH^SQ», og KH2P04, som kan suppleres med vekstfaktorer som f.eks. aminosyrer, vitaminer og metallsalter, som er vanlig ved produksjon av brødgjær. Alternativt kan de skaffes i form av mer komplekse naturlige produkter slik som gjærekstrakt, pepton, maltekstrakt og tilsvarende.

Gjærkultiveringen vil bli ledet fram til den høyest mulige cellekonsentrasjon som er forenelig med ordinære prosessoperasjoner. I de fleste tilfeller vil konsentrasjonen av gjær i tank 1 utgjøre mellom 0.5 og 10% tørrstoff, fortrinnsvis mellom 3 og 6%. Under 0.5% vil volumet som skal håndteres komme i misforhold til mengden av anvendbare produkter som skal utvinnes, og over 10% vil praktiske problemer oppstå, f.eks. p.g.a. høy viskositet av cellesuspensjonen.

Biomassen produsert i tank 1 blir sendt via strøm 4 til sentrifuge 5 hvor den blir oppkonsentrert. Det klarnede mediet blir i det minste delvis resirkulert til tank 1 via strøm 6, og det resterende fjernet. Den oppkonsentrerte cellesuspensjonen blir deretter sendt i strøm 7 til tank 8. Deler av denne suspensjonen kan også resirkuleres til tank 1 gjennom strøm 9; dette er spesielt interessant i kontinuerlige prosesser for å oppnå høy celletetthet og høy produktivitet av biomassen.

I tank 8 blir det lagt til rette for tilsats av næringsstoffer fra strøm 10 og for luft via strøm 11. Disse betingelsene vil være av en slik art at man sikrer fullstendig depresjon av lysozym-uttrykks-systemet, og de vil derfor være avhengig av den valgte promotor for kontroll av genetranskripsjon. På grunn av de ovennevnte årsakene, er det også viktig at disse betingelsene blir justert slik at veksten blir begrenset, f.eks. ved begrensning av konsentrasjonen av visse faktorer som er påkrevd for vekst men ikke for proteinsyntese.

Suspensjonen med den lysozym-produserende gjær blir tappet fra tank 8 gjennom strøm 12. Cellene blir separert fra mediet i sentrifuge 13, der mediet i det minste delvis blir resirkulert til tank 8 via strøm 14 etter behandling for lysozym-ekstraksjon i modul 15. Den sistnevnte operasjon kan med letthet oppnås ved adsorpsjon på en ionebytter eller andre materialer med affinitet der enzymet kan isoleres på en enkel måte ved vasking, f.eks. med vandig NaCl fra strøm 16. Vaskevannet blir deretter sendt i strøm 17 til renseenhet 18 der det blir utsatt for en behandling som kan bestå i en kombinasjon av andre klassiske metoder som f.eks. ultrafUtrering, krystallisasjon og tilsvarende. Til slutt kan et tørt kommersielt produkt frambringes ved spraytørking eller frysetørking (ikke vist).

Ved utøvelse av oppfinnelsen kan det være fordelaktig, av i det minste to årsaker, å anvende slike betingelser i tank 8 at en hoveddel av lysozymet utskilt fra gjærcellene forblir assosiert i celleveggen. Den første årsaken er at celle-assosiert lysozym er beskyttet mot deaktivering, som kan være framtredende hvis enzymet blir frigjort til mediet. Den andre årsaken, som vist i BE 903,626, er at en stor del av det nevnte celle-assosierte lysozym kan gjenvinnes i konsentrert form ved enkel vasking med en vandig løsning av et mineralsalt. Figur 10 viser en utførelsesform der slike betingelser er anvendt i tank 8. Gjærsuspensjonen blir tappet fra tank 8 via strøm 12.1 sentrifuge 13 blir cellene separert fra mediet som i det minste delvis blir resirkulert til tank 8 via strøm 14, og det resterende fjernet. Cellene fra sentrifuge 13 blir i strøm 19 blandet med en vandig løsning av et mineralsalt fra strøm 20 hvoretter lysozym som er assosiert i celleveggen blir frigjort fra dette. Det nevnte saltet bør være vannløselig, forholdsvis nøytralt og fortrinnsvis ugiftig for gjærceller. Spesifikke eksempler er: NaCl,KCl, NaN03, KN03, NaS04, (NH4)2S04 og tilsvarende. Av økonomiske grunner vil generelt NaCl være foretrukket. Konsentrasjonen av saltene for effektiv gjenvinning av det celle-assosierte lysozym er ikke kritisk, og kan f.eks. varieres mellom 0.2 og 2.0 M. I praksis er en løsning av NaCl i konsentrasjon mellom 0.5 og 1.0 M anvendt med hell. Konsentrasjoner under 0.5 M vil generelt resultere i begrenset gjenvinning, med den konsekvens at en stor del av det produserte lysozym går tapt med cellerestene. På den annen side vil generelt konsentrasjoner over 1.0 M ikke føre til noen forbedring. Det frigjorte lysozym blir deretter separert fra cellerestene i sentrifuge 24, og kan foredles videre i modul 18 med de samme teknikker som nevnt i det foregående. På denne måten kan gjærens cellevegg selv tjene som adsorberende materiale for gjenvinning av enzymet.

Ved anvendelse av den sistnevnte produksjonsmetoden er det viktig å begrense konsentrasjonen av mineralsalter i tank 8. Omvendt, hvis man ønsker å gjenvinne hoveddelen av enzymet fra mediet ved ekstraksjon i modul 15, som i den førstnevnte metoden, er det bedre å øke konsentrasjonen av mineralsalter i tank 8. For denne anvendelse kan de samme saltene med tilsvarende konsentrasjonsverdier anvendes, som definert i det foregående for gjenvinning av celleassosiert lysozym. Som de etterfølgende eksemplene vil vise, kan tilstedeværelsen av salt i høye konsentrasjoner være skadelig for dyrking av gjær, men ikke for lysozymproduserende gjær under vekstbegrensede betingelser. Det er derfor en ytterligere fordel ved denne to-trinns prosessen å sørge for assistanse til dyrking av gjær under betingelser som er optimale for biomasse-produksjon og deretter indusere lysozymsyntese under betingelser som sikrer optimal utskilling av enzymet til mediet.

Den resterende gjæren, uansett hvilken metode den er kommet fra, kan gjenvinnes og brukes, eventuelt etter videre behandling som f.eks. pressing og tørking. Slike rester kan også delvis resirkuleres til tank 8 for videre lysozymproduksjon eller resirkuleres til fermenteringskjel 1 som en kilde for næringsstoffer og vekstfaktorer, eventuelt etter passende mekanisk bearbeiding.

Eksempler

i

1. Plasmid- mediert uttrykking av ( 1) humanlysozym, ( 2) en Gty4- mutant av humanlysozym og ( 3) kyllinglysozym i gjær ved bruk av kyllinglysozym-signalsekvens for utskilling.

1. 1 Konstruksjon av skyttelvektorene

1. 1. 1 Humanlysozym

Oligonukleotider korresponderende med sekvensen av humanlysozym-genet med gjærfavoriserte codoner, ble syntetisert ved bruk av fosforamidit-kjemi på en Applied Biosystems DNA Syntesizer. De individuelle oliginukleotider ble konstruert med et datamaskinprogram som maksimerer overlappinger og minimerer ukorrekt binding. Alle molekylene hadde et 5'-fosfat bortsett fra det i 5'-terminus. Hele genet ble sydd sammen, og hele lengden av ligasjons-produktet (se figur 1) ble isolert fra en agarosegel. Det ble deretter fosforylert på den 5'-terminus med T4 polynukleotid-kinase og bundet inn i plasmid p AG API som var behandlet med Ncol og Sali og alkalisk fosfatase. pAGAPl er et derivat av pPGAP (se J.TRAVIS et al., J.Biol. Chem. 26J), 4384, 1985) derav GAP-promotoren (glyseraldehyd-3 fosfat-dehydrogenase-gen 491 promotor) hadde blitt skiftet ut med hybrid-promotoren ADH2-GAP (se L.S.COUSENS et al., Gene 61, 265, 1987). Lysozym-genet ble deretter underlagt dideoksy-sekvensanalyse, og den konstruerte sekvensen ble verifisert. Uttrykks-strengen, bestående av promotoren ADH2-GAP, kyllinglysozym-signalsekvens, humanlysozym gen og GAP-terminatoren ble fjernet med BamHl og plassert inn i gjæren E. coli's skyttelvektor pAB24 (se P.J.BARR et al., J. Exp. Med. 165. 1160, 1987). Det resulterende plasmid pAB24AGScLysH er vist i figur 2.

1. 1. 2 Gly- 4 mutant humanlysozym

For å lage det analoge plasmid inneholdende en mutasjon i genet for humanlysozym av Glu-4 til glysin (se figur 3), ble det anvendt standardmetoder for å syntetisere deler av genet fra Spel-posisjonen i kyllingsignal til Nhel-posisjonen i humangenet deri codonet ved posisjon 4 av det endelige protein ble forandret fra GAA (glutaminsyre) til GGA (glysin). Rekonstruksjon av uttrykks-vektoren resulterte i plasmidet pAB24AGScLysHGly4, som er vist i figur 4.

1. 1. 3 Kyllinglysozym

Liknende metoder kan brukes for å lage et plasmid med kyllinglysozym-genet drevet av promotoren ADH2-GAP. Dette plasmidet, pAB24AGScLysC, er vist i figur 5.

1. 2 Uttrykking og utskillelse av lysozymer i gjær

Disse tre plasmider ble transformert til S. cerevisiase-generasjonen GRF180, et derivat av GRF18 (E.ERHART & C.P.HOLLENBERG, J.Bact. 156, 625, 1983) derav den endogene 2-mikron-sirkel var preparert, og leucin-prototroper utvalgt. Transformanter ble dyrket i 2 dager ved 28 °C i et minimalt medium med lite leucin og inneholdende 8% glukose. De ble deretter brukt til å innpode kulturer av komplekst medium (YEP:1% gjærekstrakt + 2% pepton) inneholdende 8% glukose i et forhold på 1:150, og disse kulturene ble dyrket ved 28°C og 180 opm. Etter 5 dagers dyrking, ble fraksjoner på 10 ml fjernet, sentrifugert ved 2500 g i 10 minutter og undersøkt m.h.p. lysozym-aktivitet i veskefasen (S0-fraksjonen). Prøvene ble tatt i henhold til D.SHUGAR's metode (se Biochem. Biophys Acta 8, 302, 1952) ved bruk av Micrococcus lysodeikticus som substrat. En enhet aktivitet er definert som den mengde enzymer som forårsaker en reduksjon i absorbans med 0.001 per minutt ved 450 nm ved bruk av en suspensjon av M. lysodeikticus i 66 raM kaliumfosfat, pH 6.24, ved 25°C i en 1 ml reaksjonsblanding.

Celler fra transformantene ble suspendert i 1 ml 0.1 M natriumfosfat-buffer, pH 6.5 inneholdende 0.5 M NaCl, og inkubert i 5 minutter ved 4°C. Cellene ble fjernet ved sentrifugering, og lysozymaktiviteten i saltvasken (fraksjon Sj) ble bestemt. For å bestemme mengde intracellulært lysozym, ble cellepelletsen blandet i 5 minutter med glass-staver i 0.1 M natriumfosfat-buffer, pH 6.5, inneholdende 0.5 M NaCl og 0.05% Triton X-100 i en Braun homogenisator. Etter separasjon av cellefragmentene ved sentrifugering ved 12500 g, ble lysozymaktiviteten i den løselige intracellulære fraksjonen (fraksjon Sj) bestemt. Resultatene er vist i tabell 1.

Total lysozymaktivitet var 433 E/OD (enheter aktivitet per enhet optisk densitet) for human og henholdsvis 167 og 170 E/OD for human mutant og kyllinglysozym, når dyrket i glukose. I alle tre tilfellene ble mellom 14 og 32% av den totale aktivitet utskilt: det er funnet i mediet ( SJ og/eller assosiert med cellene der den kan frigjøres, -uten å ødelegge cellene med NaCl-vaskingen (SO, den sistnevnte aktivitet i samsvar med fraksjonen av lysozym som er utskilt men fremdeles adsorbert i gjærens cellevegg.

1. 3 Isolering, foredling og karakterisering av de utskilte lysozymer

For å kunne rense de gjærderiverte rekombinante lysozymer, ble kulturene av de tre plasmid-transformantene i generasjonen GRF180 dyrket i 5 dager i YEP-medium inneholdende 8% glukose som beskrevet ovenfor. Cellene ble oppkonsentrert ved sentrifugering i 15 minutter ved 2500 g, og deretter resuspendert i et tilsvarende volum av 0.1 M natriumfosfat-buffer, pH 6.5, inneholdende 0.5 M NaCl. Etter en 60 minutters inkubasjon ved 4°C, ble supernatantene samlet ved sentrifugering, fortynnet 10 ganger med 0.1 M natriumfosfat-buffer pH 6.5, og injisert på en CM-Sepharose hurtig-flyt (Pharmacia) kolonne. Etter injeksjonen var utført, ble kolonnen vasket med den samme buffer inneholdende 0.5 M NaCl. Fraksjoner med lysozymaktivitet, bestemt som beskrevet ovenfor, ble akkumulert, konsentrert ved ultrafiltrering på en Amicon Diaflow-membran, avsaltet på en Sephadex G-25-kolonne og frysetørret.

De spesifikke aktiviteter av lysozympreparatene ble bestemt først ved måling av lysozym-aktiviteten som beskrevet ovenfor, og ved bruk av Biorad-proteinanalysen med kyllinglysozym som standard for måling av proteinkonsentrasjonene. Resultatene er vist i tabell 2.

Basert på de angitte verdier, er den totale syntese av de tre lysozymer i glykosemedium som vist i tabell 1, lik 17, 19 og 19 mg/l for henholdsvis human, human mutant og kyllinglysozym. SDS-polyakrylamidgel-analyse viste at alle tre prøvene migrerte som enkeltband med de samme mobiliteter som de passende referansene: humant melkelysozym for humanproteiner og eggehvitelysozym for kyllinglysozymet. Når de ble underlagt automatisk Edman- degradering, hadde alle tre proteiner en singel N-terminus av ly sin, og videre sekvensanalyse ga sekvensene forventet fra DNA-sekvensene. På denne måten er det vist at kylling-signalsekvensen er syntetisert korrekt fra alle tre proteiner.

Sammenlignende eksempel 1

Vekstprotokollen beskrevet i eksempel 1.2 ble gjentatt for alle tre proteiner, bortsett fra at 1% etanol ble brukt som karbonkilde istedet for 8% glukose. Dette mediet er slik at cellevekst og lysozymsyntese skjer simultant. Når lysozymaktiviteten i de tre kulturene var bestemt, ble resultatene som vist i tabell 1. For både human- og human mutant-proteinene ble lysozymproduksjonen i etanol redusert drastisk til mindre enn 5% av nivåene observert når cellene ble dyrket i 8% glukose. I kontrast ble kyllinglysozym-utskillelse kun redusert til 50% av nivået

observert i kulturen med 8% glukose.

Disse resultatene demonstrerer tydelig at for å oppnå en syntese av humanlysozym i gjær (autentisk eller mutant, ikke kylling), aktiv nok til å være av praktisk interesse, er det nødvendig å arbeide under slike betingelser at, i henhold til denne oppfinnelsen, veksten ikke skjer simultant.

Ytterligere tester ble utført for å estimere plasmidstabilitet under kultiverings-betingelsene anvendt i de ovennevnte eksempler. Disse testene består i å bestemme fraksjonen av gjærceller, som fremdeles framviser leucin-prototropi ved slutten av eksperimentet, på en Petri-plate, d.v.s. celler som har beholdt lysozym-uttrykks-plasmidet. Resultatene fra disse testene er også vist i tabell 1. De viser at for tilfellet med humanlysozym (autentisk eller mutant, ikke kylling) har cellene praktisk talt mistet plasmidet ved dyrking i nærvær av etanol. På denne måten synes det å være tilfelle at vekst er så svekket av humanlysozym-syntese, at celler som har mistet plasmidet som resultat av mitotisk segregering, raskt vil overvinne de som fremdeles bærer plasmidet.

Sammenlignende eksempel 2

Ved bruk av standardmetoder ble de tre lysozymgener, hvis uttrykking i gjær er illustrert i eksempel 1, tilsatt til uttrykks-strenger ved bruk av den sterkt konstitutive GAP-promotor. Kyllinglysozymet er vist i figur 6; humane og humane mutant-plasmider er identiske bortsett fra lysozym-genene. Når disse plasmider ble transformert inn i generasjonen GRF180 og leucin-prototroper valgt, kunne ingen transformanter oppnås med human- og human-mutant-plasmidene, men derimot ble transformanter lett framskaffet med kyllinglysozym-uttrykks-plasmidet. Disse transformanter ble dyrket som beskrevet i eksempel 1, og lysozym-aktivitet ble bestemt. Total aktivitet av kyllinglysozym var 110 E/OD sammenlignet med 173 E/OD for det regulerte uttrykks-plasmid med promotoren ADH2-GAP .

Dette bekrefter konklusjonen trukket i det sammenlignende eksempel 1, at syntesen av humanlysozym er skadelig for dyrking av gjærceller. For å bekrefte at denne effekten ikke er begrenset til den spesifikke gjærgenerasjon anvendt i de ovennevnte eksempler, er transformasjons-protokollen i dette referanse-eksemplet gjentatt med generasjonen AH22 (A.HINNEN et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929, 1978), generasjon S150-2B (C.HADFIELD et al., Gene 52, 59, 1987), generasjon Y-294 (G.S.BRUGGE et al., Mol. Cell. Biol. 7, 2180, 1987) og generasjon MC16 eir<0> (A.B.FUTCHER & B.S.COX, J. Bact. 157, 283, 1984). De samme resultater ble i hovedsak oppnådd som med generasjon GRF180. 2. Plasmid- mediert uttrykking av humanlysozym i gjær ved bruk av alfa-faktorleder for utskilling.

2. 1 Konstruksjon av uttrykks- vektoren

Plasmid pAB24AGalfaFLysH (se figur 7) ble laget ved isolering av Nhel-BamHl-fragmentet inneholdende det meste av humanlysozym-genet, unntatt kyllingsignal-sekvensen og GAP-terminatoren fra plasmid pAB24AGScLysH (figur 2). Et syntetisk Xba-Nhe-adapter ble anvendt til å knytte dette fragmentet til et BamHl-Xba-fragment inneholdende promotoren ADH2-GAP fusjonert med alfafaktor-lederen (se AJ.BRAKE et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 4642, 1984). Den resulterende BamHl uttrykks-streng bestående av promotor, alfafaktor-leder, humanlysozym-gen, og terminator ble inkorporert i plasmid pAB24, med pAB24AGalfaFLysH som resultat og vist i figur 7.

2. 2 Uttrykking og utskillelse av humanlysozym

Dette plasmidet ble transformert inn i generasjonen GRF180, et cir°-derivat av GRF18, og leucinprototroper valgt. Transformanter ble dyrket i leucin-selektivt medium inneholdende 8% glukose i 2 dager og deretter fortynnet 20 ganger i et YEP-medium inneholdende 2% glukose. Etter 3 dagers dyrking ved 30°C, ble celler høstet og lysozymaktivitet bestemt som beskrevet ovenfor. Resultatene er vist i tabell 3.

Det er klart at lysozym er uttrykt og utskilt ved alfafaktor-leder-lysozym-fusjonsprodukter, selv om nivåene er lavere enn med kylling-signal.

3. Integrasjons- mediert uttrykking av humanlysozym i gjær

3. 1 Konstruksjon av integrasjonsvektoren

Humanlysozym uttrykks-streng, hvis utforming er beskrevet i eksempel 1.1, ble trukket ut fra plasmid pAB24AGScLysH (se figur 2) ved fordøyelse med restriksjonsenzym BamHl og tilsatt til integrasjons-plasmid YIP5 (se K.STRUHL et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA 76, 1035, 1979) resulterende i plasmid YIP5AGScLysH vist i figur 8.

3. 2 Uttrykking og utskillelse av humanlysozym

Dette plasmid ble linearisert med Sac2 i GAP-terminatoren, og deretter transformert inn i generasjonen GRF181, et ura2-slettet derivat av GRF180. Uracil-prototrophs ble utvalgt på uracil-selektive plater inneholdende 8% glukose. Transformanter ble deretter dyrket i uracil-selektivt medium inneholdende 8% glukose, og fortynnet 20 ganger i YEP-medium inneholdende 8% glukose for uttrykking. Etter 5 dager ble kulturene høstet, og lysozymaktivitet bestemt som beskrevet ovenfor. Resultatene er vist i tabell 4. Lysozymaktivitet ble klart demonstrert for disse integranter men nivåene var lavere enn observert for plasmid-mediert uttrykking under de samme betingelser.

4. Innflytelse av natriumklorid på distribusjonen av humant Gly- 4 mutant lysozym i kulturer av transformert gjær

Gjærgenerasjonen GRF180, transformert med plasmid pAB24AGScLysHGly4 (se figur 4), ble dyrket i et minimalt medium med lite leucin og inneholdende 8% glukose i 3 dager ved 28°C. Den resulterende kultur ble deretter anvendt til å innpode et komplekst YEP-medium inneholdende 8% glukose i et forhold på 1:150. Den samme protokoll for lysozymbestemmelse som beskrevet i eksempel 1 ble anvendt på kulturene oppnådd etter 89 og 209 timers inkubasjon ved 28°C. For å bestemme effekten av mineralsaltet på lysozym-fordelingen, ble en fraksjon av kulturen supplert med NaCl til 0.5 M NaCl etter 89 timer og inkubasjon ble fortsatt som i referansekulturen. I et annet eksperiment, ved bruk av det samme inokulat, var 0.5 M NaCl tilstede fra starten av kultiveringen. Resultatene er vist i tabell 5. Verdiene i tabell 5 viser at i konvensjonelt YEP-medium er det meste av lysozymet funnet intracellulært (S2 fraksjon), i økende grad når inkubasjons- tiden er lavere. Når NaCl er tilsatt systemet er derimot lysozym i hovedsak funnet i Sq+Sj-fraksjonen, det vil si i det vesentligste utskilt. Den samme lysozymfordelingen er i hovedsak framkommet når NaCl er tilstede fra starten av kultiveringen; uansett, i dette tilfelle er veksten noe hemmet.

De samme type resultater er framkommet med gjær transformert til å produsere autentisk humanlysozym.

5. Effekt av et syntetisk gjærkultur- medium på syntesen og utskillelsen av humanlysozym

Gjærgenerasjonen GRF180 transformert med plasmid pAB24AGScLysH (se figur 2), ble dyrket i et minimalt medium med lite leucin og inneholdende 8% glukose i 3 dager ved 28°C, og den resulterende kultur ble deretter brukt til å innpode i et forhold på 1:6 et komplekst YEP-medium inneholdende 8% glukose. Etter 48 timer ved 28 °C ble cellene høstet ved sentrifugering og resuspendert i det samme volum i et syntetisk medium hvis sammensetning er gitt i tabell 6.

For sammenlikningens skyld ble en fraksjon av cellene resuspendert i et friskt YEP-medium. Begge media ble supplert med 8% glukose. De resulterende suspensjoner ble deretter videre inkubert ved 28°C i 90 timer og lysozymfordelingen i kulturene ble bestemt som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er vist i tabell 7.

Verdiene i tabell 7 bekrefter resultatene i det foregående eksempel at YEP-medium, selv om det favoriserer vekst, ikke framhever utskillelse av betydning: omlag 3/4 av det produserte lysozym forblir intracellulært. På den annen side er omlag 3/4 av det produserte lysozym utskilt ved bruk av det syntetiske medium, derav 93% er frigjort i løsningen, dvs at det er i en form som lett kan gjenvinnes med konvensjonelle metoder, f.eks. ultrafiltrering.

Andre eksperimenter har imidlertid vist at dette syntetiske medium ikke sikrer spesielt aktiv vekst. På denne måten kommer det fram at det i henhold til denne oppfinnelsen er viktig at man skiller produksjonen av biomasse fra lysozym-syntesen og velger separat de betingelser som framhever optimal produksjon av humanlysozym.

Claims (13)

1. Framgangsmåte for framstilling av enzymatisk aktivt humant lysozym, karakterisert ved at voksende gjærceller, hvis DNA er genetisk manipulert til å omfatte et segment som koder for humant lysozym, kontaktes med et kultiveringsmedium under vekstbegrensende betingelser, og gjærcellene induseres for å syntetisere og utskille enzymatisk aktivt humant lysozym, idet lysozym-syntesen sikres med en regulerbar promotor, eller induseres ved aktivering av promotoren.

2. Framgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det dyrkes gjærceller, hvis DNA er manipulert til å omfatte et segment som koder for humant lysozym i et kultiveringsmedium som undertrykker syntese av enzymatisk aktivt lysozym.

3. Framgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det framstilles lysozym som er giftig overfor gjærcellene.

4. Framgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 3, karakterisert ved at det som promotor anvendes PH05, ADH2, GALI, GAL10, SUC2, MAL6S, MAL6T, CYC1, promotorer av gener involvert i den generelle aminosyrekontroll, varmefølsomme promotorer, og/eller hybridpromoter framstilt fra disse.

5. Framgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 4, karakterisert ved at promotoren velges blant gruppen bestående av PH05 og hybridpromotorer konstruert med oppstrøms aktiveringssekvenser fra denne.

6. Framgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 5, karakterisert ved at det som promotor anvendes ADH2-GAp.

7. Framgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 7, karakterisert ved at hoveddelen av lysozymet utskilles til kultiveringsmediet.

8. Framgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 7, karakterisert ved at det i kultiveringsmediet anvendes en definert mengde mineralsalt som effektivt kan frigjøre lysozym fra gjærcellenes cellevegger til kultiveringsmediet.

9. Framgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at det anvendes et vannuløselig og et overfor gjærcellene ugiftig mineralsalt.

10. Framgangsmåte ifølge krav 8 eller 9, karakterisert ved at mineralsaltet velges blant gruppen bestående av NaCl, KC1, NaN03, NaS04 og (NH4)2 S04, fortrinnsvis NaCl.

11. Framgangsmåte ifølge et av kravene 8 til 10, karakterisert ved at mineralsaltet anvendes i en konsentrasjon fra 0.2 M til 2M, særlig 0.5 M til 1 M.

12. Framgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 11, karakterisert ved at minst 50% av det utskilte lysozym forblir assosiert med gjærens cellevegger.

13. Framgangsmåte ifølge et av kravene 8 til 10, karakterisert ved at mineralsaltet anvendes i en konsentrasjon på inntil 0.2 M.