KR970005584B1 - 폴리 펩타이드의 개선된 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

폴리 펩타이드의 개선된 제조방법
제1도는 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 형질 전환된 KEX1 및 kex1 균주로부터 회수된 데설파토 히루딘의 크로마토그래피 분석도이다.
제2도는 바람직한 효모 코돈을 갖는 PH05시그날 서열을 함유하는 히루딘 HV1 유전자의 시험관내 합성을 나타내는 도식이다. 사용된 21개의 올리고데옥시 뉴클레오티드는 번호매김된 선과 점선으로 각각 표시하였다.
제3도는 플라스미드 pDP33의 도식적인 작제도이다.
제4도는 플라스미드 pDP34 및 pDP38의 도식적인 작제도이다.
제5도는 발현 플라스미드 pDP34/GAPFL-YHIR의 도식적인 작제도이다.
제6도는 발현 플라스미드 pDP34/PH05(-173)-YHIR의 도식적인 작제도이다.
제7도는 플라스미드 pDP92의 도식적인 작제도이다.
제8도는 삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1 및 BYSkex1을 배양하여 수득한 야생형 히루딘 및 히루딘 돌연변이체 HV1-KR, HV1-WQLR 및 HV1-SFRY의 크로마토그래피 분석도이다.
본 발명은 재조합 DNA 기술 분야에 관한 것으로써, 유전 공학적으로 조작된 효모 세포를 사용하여 폴리펩타이드를 제조하는 개선된 방법, 유전공학적으로 조작된 효모 세포, 및 상기 효모 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근, 많이 이종(heterologous)단백질을 α-인터페론(IFNα)[참조 : Hitzeman et al.(1981) Nature 294, 717-722]. 리소자임[참조 : Oberto al. (1985) Gene 40, 57-65]. α-아밀라제[참조 : Sato et al.(1986)Gene 50, 247-257], 조직-형플라스미노겐 활성제(t-PA)[참조 : 유럽 특허원 제143,081호]또는 데설파토 히루딘[참조 : 유럽 특허원 제225633호]와 같은 상기 단백질을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 적합한 발현벡터로 효모 세포를 형질전환시킨 후, 많은 효모내에서 발현시켰다. 그러나, 많은 경우에서, 이종 단백질은 순수한 형태로 합성되지 못하고, 부분적으로 분해된, 단백질 예를 들어, C-말단이 단축된 단백질을 함유한 혼합물로서 합성된다. 예를 들어, 효모내에서 사람의 심방성 나트륨배출성(atrial natriuretic)펩타이드(hANP)의 발현으로 C-말단이 상이한 2가지 형태의 성숙한 HANp를 분비가 초래된[참조 : Vlasuk et al. (1986), J. Biol, Chem. 261, 4798-4796]. 주(major) 형태는 상기 단백질의 마지막 2개의 아미노산(Arg 150 및 Tyr 151)이 결여된 물질인 반면, 전-길이의 물질이 부(minor)형태이다. 이와 유사한 결과가 효모에서 표피성장인자(EGF)를 발현시킨 후 수득되었는데[참조 : George-Nascimento et al(1988) Biochemistry 27, 797-802], 여기에서 분비된 발현 생성물은 마지막 1개의 아미노산 (Arg 53)또는 마지막 2개의 아미노산(Leu 52 및 Arg 53)이 결싱되고 전-길이의 EGF가 생성되지 않는다는 점에서 이종이다.
최근 분자 생물학자들에게 관심이 되는 폴리 펩타이드는 거머리(Hirudo medicinalis)에서 자연-발생하는 항응고제인 히루딘(hirudin)이다. 히루딘은 단일 폴리펩타이드 종이 아니며, 히루딘 변이체 1(HV1), 히루딘 변이체2(HV2)[참조 : 유럽 특허원 제158564호], 히루딘 변이체 PA[참조 : PCT 특허원 제86/03493호 데스-(Val)2-히루딘[참조 : 유럽 특허원 제158986호]으로 지정된 4가지 이상의 전형으로 구성된 동등하게 작용하는 폴리 펩타이드 부류이다. 변이체들은 아미노산 수에 있어서 구조가 서로 상이하나(특히, HV1의 N-단말 서열은 Val-Val-Tyr이고, HV2 및 PA의 N-말단 서열은 Ile-Thr-Tyr이며, 데스-(Val)2-히루딘의 N-말단 서열은 Thr-Tyr이다), N-말단에는 소수성 아미노산이 축척되고 C-말단에는 극성 아미노산이 축척되며, 설페이트 모노에스테르로서 존재하는 타이로신 잔기(Tyr63), 3개의 디설파이드 결합 및 통상의 항응고 활성을 갖는다.
최근, 히루딘 변이체를 암호화하는 cDNA 및 합성 유전자가 클로닝되고 미생물 숙주내에서 발현되었다. 발현생성물은 Tyr63에서 설페이트 모노에스테르 그룹이 결여되어 데설파토히루딘으로 지정되지만, 천연의 설페이트화된 히루딘과 거의 동일한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 판명되었다. 데서파토히루딘 변이체 HV1은 에스케리키아 콜라이(Escherichiacoli)[참조 : 유럽 특허원 제158564호 및 제168342호]및 삭카로 마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)[참조 : 유럽 특허원 제168342호, 제200655호, 제225633호 및 제252854호]내에서 발현되었다. 이와 유사하게, 데설파토히루딘 HV2가 에스케리키아 콜라이[참조 : 유럽 특허원 제158564호] 및 삭카로마이 세스 세레비지애[참조 : 유럽 특허원 제200655호, PCT-특허원 제86/01224호]내에서 발현되었으며, 데스-(Val)2-데설파토 히루딘도 에스케리키아 콜라이[참조 : 유럽 특허원 제158986호]내에서 발현되었다.
일반적으로, 에스.세레비지애를 숙주 미생물로서 선택하는 경우, 히루딘 화합물의 발현 효율 및 수율이 보다 높다. 그러나 사용된 특징 효모 숙주 균주에 상관없이, 발현 생성물은 C-말단 서열이 서로 상이한 데설파토히루딘종의 이종 혼합물로 판명되었다. 예를 들어, 히루딘 변치에 HV1 유전자를 함유하는 배양된 효모 균주로부터 수득된 배양물 브로쓰는 C-말단 마이노산 Gln64또는 C-말단 아미노산 Leu64및 Gln65가 결여된 상당량의 유사체로 오염된 데설파토히루딘 HV1을 함유하는 것이 밝혀졌다.
데설파토히루딘, HANP 또는 EGF와 같은 전-길이의 단백질 및 이의 C-말단이 단축된 유도체를 함유하는 혼합물을 개개의 성분으로 분리시키고 이들 성분들은 균질하게 정재하는 방법은 힘들고 많은 시간이 소요된다. 분수 비용을 고려시, 데설파토 히루딘과 같은 균질한 단백질을 효모내에서 경제적으로 생성할 수 있는 개선된 방법이 필요하다. 본 발명의 목적은 균질한 이종 단백질을 효모내에서 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
이종 단백질을 암호화하는 상응하는 DNA서열을 갖는 형질전환된 효모 균주의 배양 브로쓰로부터의 이종 단백질의 C-말단이 단축된 유도체의 분리는 1차 발현 생성물(예 : 통합된 데설파토히루딘)에 대한 내인성 효모 프로테아제의 해독후 작용에 의하는 것이 확실하나, C-말단 분해에 관련된 특정 프로테아제는 아직도 동정되지 않았다. 일반적으로 단백질 분해에 수반되는 가장 중요한 효모 프로테아제는 엔도펩티다제 yscA 및 yscB 및 카복시엑소펩티다제 yecY 및 yecS이다. 프로테아제 A, B, Y 및/또는 S활성이 결핍된 효모 균주의 사용으로 데설파토 히루딘과 같은 외래 유전자 생성물의 랜덤(random)한 단백질 분해를 부분적으로 감소시킬 수 있다. 그러나, 여전히 C-말단에 1개 또는 2개의 아미노산이 결여된 단백질이 상당량 관찰된다.
놀랍게도, 카복시펩티다제 yscα활성이 결여된 효모 돌연변이체 균주는 이종 단백질의 C-말단으로부터 아미노산을 제거시킬 수 없으므로 통합된(진정한 : authentic)단백질을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 카복시 펩티다제 yscα는 막-결합된 엑소펩티다제이며, 공지되어 있는 바와 같이 킬러(killer)인자 및 메이팅(mating)인자 α의 성숙에서 중요한 역할을 한다[참조 : J. C. Wagner and D. H. Wolf(1987) FEBS Letters 221, 423]. 이것은 KEX1 유전자의 발현 생성물이다. 발표된 자료에 따르면[참조 : P. S. Rendueles and D. H. Wolf (1988) FEMS Microbial. Rev 54, 17], yscα의 작용은 C-말단의 염기성 아미노산 잔기(Arg,Lys)로 강력하게 제한된다. 이들 자료 및 제설파토히루딘의 C-말단 아미노산이 염기성이 아니라는 사실(예를 들어, 데설파토 히루딘 변이체 HV1에서 Gln 및 Leu이다)에 비추어, 카복시펩티다제 yesα활성이 결여된 효모 돌연변이체 균주의 이용으로, C-말단이 단축된 데설파토히루딘 유사체에 대한 지루한 분리를 하지 않고도 균질한 데설파토히루딘을 생성할 수 있다는 것은 매우 놀랍고도 예상하지 못한 결과이다.
카복시펩티다제 yesα 활성이 결여된 효모 돌연변이체 균주를 적합한 벡터로 형질전환되는데 사용하는 경우, 예를 들어 전-길이 형태로 생성될 수 있는 hANP, EGF 또는 결합 조직 활성화 펩타이드-Ⅲ(CTAP-Ⅲ)[참조 : Mullenbach et al. (1986) J. Biol. Chem. 261, 719-772]와 같은 다른 이종 단백질에 대하여도 동일하게 적용된다.
따라서, 본 발명은 이종 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 효모 프로모터를 함유한 하이브리드 벡터로 형질전환되고 카복시펩티다제 yscα활성이 결여된 호모 균주를 배양하고, 이종 단백질을 분리시킴을 특징으로 하여, 효모에 대한 이종 단백질을 균질한 형태로 생성하는 개선된 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 이종 단백질을 암호화하는 제2DNA 서열에 적절한 판독프레임으로 연결된 시그날펩타이드를 암호화하는 제1DNA서열에 작동적으로 연결된 효모 프로모터 및 효모 전사 종결 시그날을 갖는 DNA서열을 함유하는 하이브리드 벡터로 형질전환된 효모 균주를 배양하고, 이종 단백질을 분리시킴을 특징으로 하여, 효모에 대한 이종 단백질을 균질한 형태로 생성하는 개선된 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 개선된 방법으로 생성될 수 있는 이종단백질은 효모내에서 발현된 후 카복시펩티다제 yscα에 의해 해독후 C-말단 분해되기 쉬운 단백질이다. 이러한 이종 단백질은 Lys, Arg, Tyr, Ala, Leu, Gln, Asp, Asn 및 Ser로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 2개의 C-말단 아미노산에 의해 특징지워 진다. 바람직한 이종 단백질은 상술한 단백질, 특히 데설파토 히루딘이다.
가장 바람직한 국면에서, 본 발명은 데설파토히루딘을 암호화하는 제2DNA서열에 적절한 판독 프레임으로 연결된 시그날 펩타이드를 암호화하는 제1DNA서열에 작동적으로 연결된 효모 프로모터로 이루어진 데설파토히루된 발현 카세트(cassette) 및 효모 전사 종결 시그날을 갖는 DNA서열을 함유하는 하이브리드 벡터로 형질전환되고 카복시펩티다제 yscα활성이 결여된 효모 균주를 배양하고, 데설파토히루딘을 분리시킴을 특징으로 하여, 데설파토히루딘을 생성하는 개선된 방법에 관한 것이다.
용어 데설파토히루딘은 문헌에 기술된 데설파토히루딘 화합물 또는 데설파토히루딘을 암호화하는 DNA를 함유하는 형질 전환된 미생물 균주로부터 수득될 수 있는 데설파토히루딘 화합물을 포함한다. 이러한 데설파토히루딘은, 예를 들어, 데설파토히루딘 변이체 HV1,HV1(변형 a,b), HV2, HV2(변형 a, b, c), PA, PA의 변이체 및 데스(Val2)-데설파토히루딘이다.
바람직한 데설파토히루딘은 서열식(Ⅰ), (Ⅱ)또는 (Ⅲ)의 데설파토히루딘이다.
X1Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Asn X2Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu X3Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro X4Pro Gln Ser X5Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu X6
(Ⅰ)
Y1Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Y2Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Y3Leu Gln
(Ⅱ)
Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Gln Gly Lys Asp Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu
(Ⅲ)
상기식에서,
(a) X1은 디펩타이드 잔기 Val-Val이고, X2, X3및 X4는 각각 Lys이며, X5는 His이고, X6은 펩타이드 잔기 Glu-Tyr-Leu-Gln(HV1)이거나,
(b) X2는 Ile 또는 Glu이고, X3내지 X6은 (a)에서 정의된 바와 같거나(HV1 변형 a),
(c) X3는 Ile 또는 Glu이고, X1, X2및 X4내지 X6은 (a)에서 정의한 바와 같거나(HV1 변형 a),
(d) X4는 Ile 또는 Glu이고, X1내지 X3, X5및 X6은 (a)에서 정의한 바와 같거나(HV1 변형 a),
(e) X5는 Leu 또는 Asp이고, X1내지 X4및 X6은 (a)에서 정의한 바와 같거나(HV1 변형 a),
(f) X6은 Glu-Tyr, Glu-Tyr-Leu, Glu-Asp-Leu-Gln, Glu-Glu-Leu-Gln, Glu-Tyr-Lys-Arg, Glu-Asp-Lys-Arg, Glu-Lys-Leu-Gln, Ser-Phe-Arg-Tyr, Trp-Glu-Leu-Arg, Glu-Tyr-Leu-Gln-Pro 및 Glu-Tyr-Leu-Gln-Arg로 이루어진 그룹중에서 선택되며, X1내지 X5는 (a)에서 정의한 바와 같거나 (HV1 변형 b),
(g) X1은 Thr이고, X2내지 X6는 (a)에서 정의한 바와 같으며(데스 (Val)2-데설파토히루딘),
(h) Y1및 N-말단 디펩타이드 잔기 Ile-Thr이고, Y2는 Asn이며, Y3는 Tyr(HV2)이거나,
(i) Y2는 Lys, Arg 또는 His이고, Y1및 Y3는 (a)에서 정의한 바와 같거나(HV2 변형 a),
(j) Y3는 Glu 또는 Asp이고, Y1및 Y2는 (a)에서 정의한 바와 같거나(HV2 변형 b),
(k) Y1은 N-말단 디펩타이드 잔기 Val-Val이고, Y2및 Y3는 (a)에서 정의한 바와 같다(HV2 변형 c).
(PA) 및 상기 PA의 변이체는 N-말단에서 1내지 2개의 아미노산에 의해 1차 구조가 단축되거나 C-말단에서 18, 10, 9, 6, 4 또는 2개 아미노산에 의해 1차 구조가 단축됨으로써 특정지워진다.
가장 바람직한 데설파토히루딘 화합물은 X1내지 X6이 (a)에서 정의한 바와 같은 일반식(Ⅰ)의 화합물이다.
효모 숙주 균주 및 하이브리드 벡터의 구성은 하기에 기술된다.
형질전환된 효모 균주를 당해 분야의 공지 방법으로 배양한다.
따라서, 본 발명에 따른 형질전환된 효모 균주는 탄소, 질소 및 무기염의 동화성 공급원을 함유하는 액체 배지 중에서 배양한다.
다양한 탄소원이 이용가능하다. 바람직한 탄소원은 동화성 탄수화물(예 : 글로코즈, 말코즈, 만니톨, 프럭토즈 또는 락토즈), 또는 아세테이트(예 : 나트륨 아세테이트)이며, 이들은 단독으로 또는 적합한 혼합물로써 사용된다. 적합한 질소원에는, 예를 들어 아미노산(카사미노산), 펩타이드 및 단백질 및 이들의 분해 생성물(예 : 트립톤, 펩톤 또는 육류 추출물), 또한 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 담금액, 및 암모늄염(예 : 염화 암모늄, 황산암노늄 또는 질산암모늄)이 포함되며, 이들은 단독으로 또는 적합한 혼합물로 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 무기염에는, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 황산염, 클로라이드, 인산염 및 탄산염이 포함된다. 또한, 영양 배지에는 성장 촉진 물질이 함유될 수 있다. 성장을 촉진시키는 물질에는, 예를 들어, 미량원소(예 : 철, 아연, 망간 등), 또는 개개의 아미노산이 포함된다.
내인성 2-미크론 DNA 및 레플리콘을 수반하는 하이브리드 벡터 사이의 부적합성 때문에, 이러한 하이브리드 벡터로 형질전환된 효모세포는 레플리콘을 상실하는 경향이 있다. 이러한 효모세포는 선택조건, 즉 성장을 위해 플라스미드-암호화된 유전자의 발현이 필요한 조건하에 배양해야 한다. 본 발명에 따라 통상 사용되고 하이브리드 백터내에 존재하는 대부분의 선별 마커(하기)는 아미노산 또는 퓨린생합성의 효소를 암호화하는 유전자이다. 따라서 상응하는 아미노산 또는 퓨린 염기가 결핍된 합성 최소 배지의 사용이 필요하다. 그러나, 적합한 생물독(biocide)에 대한 내성을 부여하는 유전자[예 : 아미노-글리코사이드 G418에 대한 내성을 부여하는 유전자]도 사용할 수 있다. 항생제 내성 유전자를 갖는 벡터로 형질전환된 효모 세포를 상응하는 항생제를 함유하는 복합 배지 중에서 배양하여 보다 빠른 성장 속도 및 보다 높은 세포 밀도를 수득한다.
완전한 2-미크론 DNA(복제의 작용성 기원을 함유)을 함유한 하이브리드 벡터는 내인성 2-미크론 플라스미드가 없는 삭카로마이세스 세레비지애 균주(소위 cir°균주)내에서 안정하게 유지되므로 비-선택적 성장 조건, 즉 복합 배지하에 배양할 수 있다.
구조 프로모터(예 : ADHI, GAPDH)를 갖는 하이브리드 벡터를 함유한 효모 세포는 유도없이 상기 프로코너에 의해 조절되는 이종 단백질을 암호화하는 DNA를 발현한다. 그러나, 상기 DNA가 조절된 프로모터(예 : PGK 또는 PH05)의 조절하에 있는 경우, 성장 배지의 조성은 최대수준의 mRNA전사물이 수득되도록 조절되어야 한다(즉, PHO5 프로머터를 사용하는 경우, 성장 배지는 이 프로모터의 활성화를 위하여 저농도가 무기 인산염을 함유해야 한다).
배양은 통상의 기술을 사용하여 수행한다. 온도, 배지의 pH 및 발효시간과 같은 배양조건은 최대 수준의 이종 단백질을 생성하도록 선택한다. 선택된 효모 균주는 바람직하게 약 25°내지 35℃, 바람직하게는 약 28℃, pH4 내지 7, 예를 들어, 약 pH 5에서, 최소 1 내지 3일, 바람직하게는 단백질의 만족한 수율이 수득되는 기간 동안, 진탕 또는 교반시키면서 심부 배양으로 호기성 조건하에 성장시킨다.
효모내에서 발현된 이종 단백질은 세포 내부에 축적되거나 배양 배지중으로 분비될 수 있다. 사용된 효모 균주, 프로모터 및 시그날 펩타이드에 상관없이 데설파토히루딘의 경우, 생성된 단백질의 대부분이 배양 배지중에 분비되며 단지 소량만이 세포 결합상태로 남는다.(분비된 화합물/세포 결합된 화합물)의 정확한 비는 적용된 발효 조건 및 회수 공정에 따라 다르다. 일반적으로, 약 8 : 1이거나 그 이상이다. 따라서, 분비되는 데설파토히루딘이 항상 우세하다.
이종 단백질은 통상의 방법으로 배양 배지로부터 분리시킬 수 있다. 예를 들어, 제1단계는 통상적으로 원심분리로 배양물로부터 세포를 분리시키는 것이다. 생성된 상등액을 폴리에틸렌이민으로 처리하여 대부분의 비단백질성 물질을 제거하고, 황산 암모늄으로 용액을 포화시켜 단백질을 침전시켜, 이종 단백질을 노축시킬 수 있다. 숙주 단백질이 존재하는 경우, 이는 또한 아세트산(예 : 0.1%, pH 4 내지 5)으로 산성화시켜 침전시킬 수 있다. n-부탄올을 사용하여 아세트산 상등액을 추출하여 이종 단백질을 더욱 농축시킬 수 있다. 기타의 정제 방법에는, 예를 들어, 탈염법, 크로마토그래피법(예 : 이온 교환크로마토그래피법, 겔 여과 크로마토그래피법, 분배 크로마토그래피법, HPLC, 역상 HPLC 등)이 포함된다. 또한 단백질 혼합물로부터 구성물의 분리는 투석법, 전하에 따른 겔-전기영동 또는 담체-유리 전기 영동법, 분자크기에 따른 적당한 세파덱스 칼럼법, 친화성 크로마토그래피법(예를 들어, 항체, 특히 모노클로날 항체, 또는 친화성 크로마토그래피용 적합한 담체에 결합된 트롬빈을 사용한 친화성 크로마토그래피법), 또는 기타 방법, 특히 문헌에 공지된 방법으로 수행한다.
이종 단백질이 분비되지 않거나, 세포 결합된, 즉 세포내 또는 페리플라스믹 공간(periplasmic space)내에 축척된 추가의 이종 단백질의 분리를 목적으로 하는 경우, 몇몇 보충적인 정제 단계가 필요하다. 따라서, 이종 단백질이 세포내에 축척되는 경우, 이의 회수의 제1단계는 이를 세포내부로부터 유리시키는 것이다. 대부분의 공정에서, 세포벽을 먼저 글루코시다제(하기)로 효소 분해시켜 제거시킨다. 이어서, 생성된 스페로플라스트(spheroplast)를 트리톤(Triton)과 같은 청정제로 처리한다. 달리는 전단력(shearing force)(예 : X-프레스, 프렌치-프레스) 및 글래스 비이드(glass bead)를 사용한 진창과 같은 기계적 힘이 세포를 부수기에 적합하다. 이종 단백질이 숙주 세포에 의해 페리클라스믹 공간내로 분비되는 경우, 다음의 단순화된 프로토콜을 사용할 수 있다 : 세포벽의 효소적 제거 또는 화학적 제제(예 : 티올 시약 또는 EDTA)를 사용한 처리로 생성물이 방출되도록 세포벽에 손상을 주어 세포를 분해시키지 않고 이종 단백질을 회수한다.
데설파토히루딘의 경우, 항-히루딘 또는 항-데설파토 히루딘 항체(dul : 하이브리도마 세포로부터 수득될 수 있는 모노클로날 항체)를 사용한 시험, 트롬빈 시험[참조 : M. U. Bergmeyer(ed.), Methods in Enzymatic Analysis, Vol, Ⅱ, . 314-316, Verlag Chemie, Weinheim(FRG) 1983]또는 혈액 응도 시험[참조 : F. Markwardt et al.(1982) Thromb. Haemost. 47, 226]을 사용하여 정제 공정동안 수득되는 분획에서 히루딘의 활성을 탐지할 수 있다. 문헌에 공지된 유사한 탐지법을 사용하여 다른 이종 단백질을 검정할 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환된 효모 숙주 세포는 이종 단백질을 암호화하는 DNA서열에 작동적으로 연결된 효모 프로모터를 함유하는 하이브리드 벡터, 특히 이종 단백질을 암호화하는 제2DNA서열에 적절한 판독프레임으로 연결된 시그날 펩타이드를 암호화하는 제1DNA 서열에 작동적으로 연결된 효모 프로모터 및 효모 전사 종결 시그날을 갖는 DNA서열을 함유하는 하이브리드 벡터를 제조하고, 필요한 경우, 카복시 펩티다제 yscα활성이 결여된 돌연변이체 효모 균주를 수득하여, 수득된 돌연변이체 효모 균주를 상기 하이브리드벡터로 형질전환시키고, 형질전환된 효모 세포를 비형질전환된 효모 세포로부터 선별하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 제조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다.
발현 벡터
본 발명에 따른 효모 하이브리드 벡터는 이종 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 효모 프로모터를 함유한다. 바람직한 하이브리드 벡터는 이종 단백질(예 : 데설파노히루딘)을 암호화하는 제2DNA 서열에 적절한 판독 프레임으로 연결된 시그날 펩타이드를 암호화하는 제1DNA 서열에 작동적으로 연결된 효모 프로코너 및 효모 전사 종결 시그날을 갖는 DNA 서열을 함유한다.
효모 프로모터는 조절 프로모터(예 : PH05, MFα1 또는 GAL1 프로모터), 또는 구조 프로모터이다.
데설파토히루딘 발현의 경우, 구조 프로모터가 바람직하다. 구조 효모 프로모터는 바람직하게는, 당 분해 효소를 암호화하는 유전자와 같은 고도로 발현되는 효모 유전자로부터 유도되며, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), 3-포스포글리세레이트 기나제(PGK), 헥소ㅋ나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프락토키나제, 글루코스-6-포스페이즈 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스이소머라제 및 글루코키나제 유전자의 프로모터, 또한 ADHI 또는 TRPI 프로모터, 및 업스트림 활성화부위를 제거시킨 단축된 산 포스파타제 PH05 프로모터를 들 수 있다. GAPDH 유전자의 뉴클레오티드-550 내지-180, 특히 뉴클레오티드-540, -263 또는 -198에서 시작하여 뉴클레오티드 -5에서 종결되는 GAPDH프로모터 및 이의 작용성 단편, 및 PH05 유전자의 뉴클레오티드 -200내지 -150, 특히 -173에서 시작하여 뉴클레오티드 -9에서 종결되는 단축된 구조 PH05프로모터가 특히 바람직하다.
시그날 펩타이드를 암호화하는 DNA서열(시그날 서열)은 바람직하게는 통상 분비되는 폴리펩타이드를 암호화하는 효모 유전자로부터 유도된다. 통상 분비되는 거머리로부터 수득될 수 있는 히루딘 시그날 서열 또는 이종 단백질의 다른 시그날 서열도 또한 선택될 수 있다. 효모 시그날 서열은, 예를 들어 효모 인버타제, α-인자, 페로몬 펩티다제(KED1), 킬러 독소(killer toxin) 및 억제서 산 포스파타제(PH05) 유전자의 시그날 및 프리프로(prepro) 서열 및 아스퍼질러서 아와모리(Aspergillus awamori)로부터의 글로코아밀라제 시그날 서열이다. 달리는, 융합된 시그날 서열을, 사용되는 프로모터(예 : PH05)에 천연적으로 연결된 유전자의 시그날 서열(존재하는 경우)일부를 히루딘 또는 또다른 이종 단백질의 시그날 서열 일부와 결합시켜 작제할 수 있다. 이들 결합은 시그날 서열과 예를 들어 데설파토히루딘 아미노산 서열 사이를 정확히 절단시키기에 유리하다. 특정한 프로세싱(processing)시그날을 수반하거나 수반하지 않을 수 있는 프로-또는 스페이서-서열과 같은 추가의 서열을 작제물내에 포함시켜 전구체 분자의 정확한 프로세싱을 용이하게 할 수 있다. 달리는, 생체내 또는 시험관내에서 적절한 성숙을 허용하는 내부적 프로세싱 시그날을 함유하는 융합된 단백질을 생성할 수 있다. 예를 들어, 프로세싱 시그날은 Lys-Arg잔기를 함유하며, 이는 골지체막내에 위치하는 효모 엔토펩티다제에 의해 인지된다. 본 발명에 따른 바람직한 시그날 서열식 Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala의 시그날 펩타이드를 암호화하는 효모 PH05유전자 및 서열식 Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys Ile Ser Ala의 시그날 펩타이드를 암호화 하는 효모 인버타제 유전자의 시그날 서열이다.
이종 단백질을 암호화하는 게놈성 DNA서열을 천연공급원으로부터 분리하거나 복제DNA(cDNA)를 상응하는 상보적 mRNA로부터 화학적 및 효소적 방법으로 그 자체 공지된 방법에 따라 생성할 수 있다.
예를 들어, 데서파토히루딘을 암호화하는 DNA 서열은 공지되어 있거나 게놈성 거머리 DNA로부터 분리할 수 있거나, 상보적 이본쇄 데설파토히루딘 DNA(데설파토히루딘 ds cDNA)를 데설파토히루딘 mRNA로부터 생성하거나, 데설파토히루딘의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 화학적 및 효소적 방법으로 생성한다.
효모 전사 종결 시그날을 함유하는 DNA서열은 바람직하게는 전사 종결 및 폴리아데닐화에 적절한 시그날을 갖는 효모 유전자의 3` 플랭킹(flanking)서열이다. 적합한 3`플랭킹 서열은 예를 들어 사용될 프로모터에 천연적으로 연결된 효모듀전자의 서열이다. 바람직한 플랭킹 서열은 효모 PH05 유전자의 서열이다.
효모 프로모터, 시그날 펩타이드를 암호화하는 임의의 DNA서열, 이종 단백질을 암호화하는 DNA 서열 및 효모 전사 종결 시그날을 갖는 DNA 서열을 서로 작동적으로 연결시킨다(즉, 정상적 작용이 유지되도록 하는 방식으로 병렬 시킨다). 프로모터가 이종 유전자(임의로 시그날 서열이 선택함)의 적합한 발현을 수행하고, 전사 종결 시그날이 전사 및 폴리아데닐화의 적합한 종결을 수행하며, 시그날 서열의 마지막 코돈이 이종 단백질을 암호화하는 유전자의 첫 번째 코돈에 직접적으로 연결되어 단백질이 분비되는 방식으로 임의의 시그날 서열이 이종유전자에 적절한 판독 프레임으로 연결되는 배열을 한다. 프로모터 및 시그날 서열이 상이한 유전자로부터 유도되는 경우, 프로모터는 바람직하게는 주요 출발 mRNA와 프로모터에 천연적으로 연결된 유전자의 ATG 사이의 시그날 서열에 결합시킨다. 시그날 서열은 해독 개시를 위해 고유의 ATG를 함유해야 한다. 이들 서열의 연결은 엔도뉴클레아제의 인지 서열을 수반하는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드 링커를 사용하여 수행할 수 있다.
발현 카세트이외에, 본 발명에 따른 하이브리드 벡터는 효모 복제 기원을 함유한다. 따라서, 하이브리드 벡터는 복제 기원을 함유하는 2-미크론 DNA로부터 기원하는 DNA 절편(segment)을 함유하거나, 호모의 2-미크론 DNA 유리 균주가 사용되는 경우, 총 2-미크론 DNA를 함유하는 타입의 벡터가 바람직하다. 본 발명에 따른 바람직한 하이브리드 벡터는 방해되지 않은 형태의 완전한 2-미크론 DNA를 함유한다(즉, 2-미크론 DNA는 제한 엔조 뉴클레아제로 1회 절단되어, 선형화된 DNA가 재환형화전에 벡터의 다른 성분에 연결된다). REP1, REP2 및 FLP 유전자의 정상적 작용 및 2-미크론 DNA의 ORI, STB, IR1 및 IR2 부위의 정상적 작용이 유지되도록 제한부위를 선택한다. 임의로, 2-미크론 DNA의 D유전자가 온전하게 유지되도록 제한부위를 선택한다. 바람직한 제한부위는 D유전자내에 위치한 유일한 PstI 부위 및 상기 모든 유전자 및 부위의 외부에 위치한 유일한 HpaI 및 SnaBI이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 하이브리드 벡터는 효모에 대한 하나 이상, 특히 하나 또는 2개의 선택적 유전자 마커 및 박테리아 숙주, 특히 에스케리키아 콜라이에 대한 마커 및 복제 기원을 함유한다.
효모에 대한 선택적 유전자 마커에 있어서, 마커 유전자의 표현형 발현에 의해 형질전환체의 선별을 용이하게 하는 모든 마커 유전자를 사용할 수 있다. 효모에 대해 적합한 마커는, 예를 들어 항생제 내성을 나타내는 마커, 영양요구성 효모 돌연변이체의 경우 숙주의 상해를 보충하는 것들이다. 상응하는 유전자는, 예를 들어 항생제 G418, 하이그로마이신 또는 블레오마이신에 대한 내성을 부여하거나 영양요구성 효모 돌연변이체에서 독립 영양을 위한, 예를들어 URA4, LEU2, LYS2 또는 TRP1유전자를 제공한다.
하이브리드 벡터의 증폭은 이.콜라이 내에서 편리하게 수행되므로, 유리하게는 이.콜라이 유전자 마커 및 이.콜라이 복제 기원이 표함된다. 이들은 이. 콜라이 플라스키드, 예를 들어 pBR32 또는 pUC플라스미드(예 : pUC18 또는 pUC19)로부터 수득할 수 있는데, 이러한 플라스키드들은 이.콜라이 북제 기원 및 항생제(예 : 암피실린)에 대한 내성을 부여하는 이.콜라이 유전자 마커를 함유한다.
본 발명에 따른 하이브리드 벡터는 당해 분야의 공지된 방법, 예를 들어 이종 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 효모 프로모터를 갖는 발현 카세트, 효모 및 박테리아성 숙주에 대한 선별 유전자 마커를 함유한 DNA 단편, 및 효모 및 박테리아성 숙주에 대한 복제 기원을 예정된 순서로 연결시켜 제조한다.
카복시펩티다제 yscα 활성이 결여된 효모 균주
본 발명에 따른 효모 균준는 카복시펩티다제 yscα 활성이 결여되어 있다. 바람직하게는, 효모 균주는 이중, 삼중 또는 4중 돌연변이체로, 즉 추가로 효모 펩티아제 활성이 결여되어 있다.
상술한 바와 같은 다양한 프로테이나제가 삭카로마이세스 세레비지애에서 특징지워졌다[참조 : T. Achstetter and D. H. Wolf(1985) Yeast 1, 139-157]. 대부분의 이들 프로테아제의 활성이 결여된 돌연변이체가 분리되어 생화학적으로 연구되었다. 특정한 프로테아제의 부재에 의한 결과가 밝혀졌으며, 몇몇 특성은 프로테아제-결손된 돌연변이체의 드 노보(de novo)분리에 유용한 것으로 판명되었다. 자연발생적 돌연변이의 빈도는 낮으므로, 통상적으로 효모를 돌연변이 유발물질(예 : X-선 또는 U. V. 방사선) 또는 현저하게 효과적이며 상당한 죽음을 초래하지 않으면서 유전자 1개당 1×10-4내지 1×10-3의 비로 돌연변이를 유도할 수 있는 화학적 돌연변이 유발물질로 처리한다. 본 발명에 따른 효모 균주에서 결여된 프로테아제는 세포의 대사에서 필수 불가결의 기능을 수행하지는 않으므로 이들 단백질의 활성을 완전히 파괴시키는 돌연변이가 치명적이지 않다. 돌연변이 유발 후 상술한 프로테아제(yscα, yscB, yscY 및 yscS)에 대한 각각의 돌연변이체형을 독립적으로 분리할 수 있다. 분리 및 선별 방법은 당해분야에 널리-공지된 콜로니-스크리닝 검정법에 기초한다.
효모 게놈내에 목적하는 단일 또는 다수의 프로테아제를 결손시키는 제2의 보다 효과적인 방법은 부위-지시된 돌연변이 유발 또는 유전자-파괴 또는 유전자 대체이다[참조 : H. Rudolph et al., Gene, 36(1985) 87-95]. 유전자 서열이 공지되어 있는 경우, 예를 들어 프로테아제 yscB, 카복시펩티다제 yscY 및 카복시펩티다제 yscα의 경우에서와 같이, 게놈성 프로테아제 유전자를 적합하게 고완된 돌연변이 유발성 올리고데옥시리보 뉴클레오티드 프라이머의 제조물이 수반되는 널리 공지된 부위-지시된 돌연변이 유발 공정[참조 : M. J. Zoller and M. Smith(1983) Methods Enzymol. 100, 468]을 사용한 삽입, 치환 또는 결실에 의해 결손시킬 수 있다. 달리는, 게놈성 프로테아제 유전자를 외인성 DNA로 대체시키거나 상기 외인성 DNA를 프로테아제 유전자의 적합한 제한 부위내에 삽입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티다제 yscα 활성이 결여된 효모 돌연변이체(kex-돌연변이체)를 제조하기 위하여 외인성 DNA를 게놈성 KEX1 유전자 내에 나타나는 적합한 제한부이내에 삽입시킨다. 사용된 효모 균주가 아미노산 또는 퓨린 생합성의 효소를 암호화하는 염색체성 유전자에 결함이 있는 경우, 상응하는 온전한 유전자를 염색체성 KEX1 유전자내에 삽입시켜, 영영요구성 효모 균주를 독립 영양 주로 만들고 동시에 KEX1으로부터 kex1으로 유전자형을 변화시킨다. 유전자 대체 또는 지시된 돌연변이유발 공정이 당해 분야에서 통상 적용되며 완전하게 반복될 수 있다.
yscα 및 yscβ 활성이 결여된 균주와 같은 다수의 프로테아제-결손 균주를 작제하기 위한 최근의 방법은 감수 분열성 교배 및 후속의 4배체 분석에 있다. 2배체 세포로부터 유도된 4배체를 표준 유전학적 기술에 따라 절개한다. 4배체의 4개의 포자간의 랜덤 조합은 후속의 교배를 통해 2중 및 다수의 돌연변이체를 작제할 수 있게 한다. 랜덤 포자분석을 다른 시스템으로서도 사용될 수 있다.
개별적인 프로테아제가 결손된 돌연변치에 및 심지어 2중 돌연변이치에도 효모 유전자 보존 센터로부터 입수할 수 있으므로, 공지의 연속적인 감수분열성 교배 기술에 의해 3중 및 4중 돌연변이체가 반복적으로 합성될 수 있다.
삭카로마이세스 세레비지애의 적합한 출발균주에는 예를들어, kex1 균주 96(Yeast Genetic Stock Center, Berkeley), 효모 펩티다제A(ysc A)음성 균주 AB103(ATCC 20673) 및 AB110(ATCC 20796), 효모 펩티다제 B(yscB) 음성 균주 HT246, H426 및 H449(H449는 추가로 cir°이다)(Deutch Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, 독일연방공화국에 기탁; 기탁번호 각각 제4084호, 제4231호, 제4413호), 효모 펩티다제 B, Y S(yscB, yscY 및 yscS)음성 균주 BYS232-31-42 및 효모 펩티다제 A, B, Y 및(yscA, yscB, yscS) 음성균주 ABYS가 포함된다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 바람직한 효모 균주는 내인성의 2-미크론 DNA가 결손되어 있다. 2-미크론 플라스미드는 대부분의 삭카로마이세스 세레비지애 균주에 함유된 높은 카피수(cojpy number), 자기-복제성의 비염색체성 DNA 성분이다. 2-미크론 플라스미드의 가장 현저한 구조적 특징은 상이한 길이의 두 DNA 영역으로 플라스미드를 각각 양분하여 2개의 559bp이 역위리피트(repeat)(IR1 및 IR2)이다. 이들 2개의 동일한 IR 서열간의 상동성 재조합으로 인하여 2분자성 이성체(A형 및 B형)가 형성된다. 2-미크론 플라스미드이 안정성은 3개의 플라스미드 함호화된 기능에 의해 부여된다. REP1 및 REP2 유전자 생성물은 2-미크론 플라스미드를 안정하게 분할하는데 요구되는 트랜스-작용성 단백질이다. 이들 두 단백질중, REP1은 분할효율이 REP1 유전자 생성물의 유전자 용량에 좌우된다는 점에서 더욱 중요하다[참조문헌 : A. Cashmore et al.(1986) Mo1. Gen. Genet. 203, 154]. 이들 두 단백질은 플라스미드 상의 중요한 시스-작용성 성분인 STB (REP3) 부위를 통하여 및 이 부위상에 작용한다[참조문헌 : M. Jayaram et al. (1985) Mol, Cell. Biol. 5, 2466-2475; B. Viet et al.(1985) Mol. Cell. Biol. 5, 2190-2196].
삭카로마이세스 세레비지애의 이러한 cir°균주는 당해 분야에 공지되었거나 문헌[참조 : C. P. Hollenberg (1982) Curr. Top. Microbiol, Immun, 96, 119]에 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 하기의 cir°균주의 다른 제조 방법은, 두 번째 플라스미드에 의한 2-미크론 플라스미드의 처리가 REP1 및 REP2 단백질을 적정하기 위한 STB 부위 용량의 증가를 수반한드는 가정에 기초한다. REP1 및 REP2 단백질의 이러한 상대적인 감소는 내인성의 2-미크론플라스미드의 불안전성을 초래한다.
바람직하게는, 사용된 두 번째 플라스미드는 REP1 유전자가 결손 또는 결여되어 있다. 이러한 플라스미드의 예는 REP1 유전자 이외에 역위된 리피드(IR2)가 결손된 pDP38이다. 이 플라스미드는 톺은 카피수 발현이 내인성 2-미크론 플라스미드에 의한 REP1 단백질의 상보화에 좌우되게 한다. 이 플라스미드는 두 개의 효모 선별마커, 즉 높은 카피수 환경 및 낮은 카피수 환경 모두에서 사용되는 URA3, 및 높은 카피수 환경에만 적용될 수 있는 dLEU2[참조 : E. Erhart et al.(1986) J. Bacteriol. 625]를 함유한다.
Ura-및 Leu-인 효모 균주를 플라스미드 pDP38로 형질전환시키고 Ura+콜로니에 대하여 선별한다. 우라실이 없는 평판상에서 선별한 결과(Ura 선별)는, URA3 유전자가 결손성 dLEU2 유전자 보다 훨씬 더 양호하게 발현된 바와 같이, 루이신이 없는 평판상에서의 선별(Leu 선별)보다 훨씬 더 양호한 형질전환 빈도를 나타낸다. 단일 콜로니를 선별하고 Leu 선별 평판선에 스트리킹하여 다양한 크기 및 형태의 콜로니를 형성시킨다. 가장 작은 콜로니중 일부를 Ura 선별 평판 상에 재스트리킹하고 Leu선별평판상에 레플리카-플레이팅한다. Ura선별하에 생장할 수 있지만 Leu 선별하에서는 단지 매우 느리게 생장할 수 있는 콜로니를 선별한다. Ura선별 평판에서의 생장은 플라스미드 pDP38이 여전히 존재하며, Leu 선별하에 단지 서서히 생장하는 이유가 이 플라스미드의 상실에 기인하는 것이 아님을 나타내며 Leu 선별하에 생장하지 못한다는 사실은 pDP38이 이 마커를 보충할 수 없음을 보여준다. pDP38이 Leu를 보충할 수 없다는 사실을 두가지로 설명될 수 있다 : A. pDP38상의 LEU2 유전자가 돌연변이 되었거나, B : 플라스미드가 자신의 카피수를 상승시킬 수 없기 때문에 leu2를 보충할 수 없다는 것인데, 이러한 사실은 2-미크론 플라스미드가 REP1유전자 생성물을 보충하는데 이용될 수 없음을(즉, 상실되었음) 암시한다.
이 두가지 가능성은 매우 용이하게 구별될 수 있다. 첫 번째로, 상기 콜로니로 나타난 최소 생장(pDP38이 없는 경우의 세포의 절대 0 생장에 대한 것으로서)은 LEU2가 일부 발현 되었음을 나타낸다. 두 번째 관점은 2-미크론 플라스미드의 부재하에 pDP38이 단지 ARS 유형 플라스미드로서만 작용하게 됨으로써, 즉, pDP38이 매우 불안정하게 되어 수세대후에 대부분의 콜로니가 pDP38을 상실하게 될 것이므로 직접 시험될 수 있다. 따라서, 단일 콜로니르루 YPD 평판상에 스트리킹하고, 단일 콜로니를 취하여 우라실이 없는 평판상에 레플리카-플레이팅 한 경우, 소수의 콜로니만이 Ura선별하에 성장할 것이다. pUC 및 2-미크론 서열에 대하여 하이브리드화함으로써 비정상 콜로니를 점검한다. 하이브리드화 시그날을 나타내지 않는 콜로니는 플라스미드 pDP38 및 내인성 2-미크론 플라스미드(cir°균주)를 함유하지 않는다. 수득된 cir°균주를 상술한 바와 같이 처리하여 펩티다제, 특히 yscα 활성이 결여되고 또한 2-미크론 DNA가 없는 효모 돌연변이체 균주를 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 효모 균주는 yscα 활성의 결여외에, 추가로 yscA, yscB, yscY 및 yscS로 구성된 그룹중에서 선택된 펩티다제가 결핍되어 있고 2-미크론 DNA도 결핍되어 있다. 가장 바람직한 효모균주는 yscα 및 yscY 활성이 결여되고 yscB 및 yscS 또는 yscA 및 yscB가 임의로 결여될 수 있으며, 2-미크론 DNA가 결여되어 있다.
본 발명에 따른 효모 균주는 이종 단백질 생성에 유리하게 사용될 수 있다. 놀랍게도, 효모에 대하여 이종성인 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 하이브리드 벡터를 함유하는 본 발명에 따른 kex1균주가 상기의 단백질을 동종형으로, 즉, C-말단이 단축된 부산물이 결핍된 단백질을 생성한다.
형질전환된 효모 균주
본 발명의 추가로 카복시펩티다제 yscα 활성이 결여되고 이종 단백질을 암호화하는 DNA서열에 작동적으로 연결된 효모 프로모터를 함유하는 하이브리드 벡터로 형질전환시킨 효모균주, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
적합한 효모 숙주 균주에는 카복시펩티다제 yscα 활성 및 임의로 추가로 펩티다제 활성이 결여된 삭카로마이세스 세레비지애 균주가 포함되며 이들은 임의로 내인성 2-미크론 플라스미드로 차유된다(상기 참조).
형질전환된 효모 균주를 생성하는 방법은 카복시펩티다제 yscα 활성이 결여된 효모 균주를 상기 하이브리드 벡터로 형질전환시킴을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 하이브리드 벡터로의 효모의 형질전환은 문헌[참조 : Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75. 1929(1978)]에 기술된 방법에 따라 수행할 수 있다. 이 방법은 3가지 단계로 구분될 수 있다 :
(1) 다양한 당분해효소 제제, 예를들어 달팽이장의 즉(snail gut juice)(예 : Glusulsase
Figure kpo00001
또는 Helicase
Figure kpo00002
)또는 삼투적으로 안정화된 용액(예 : 1M 솔비톨)중의 미생물로부터 수득된 효소 혼합물을 사용한 효모 세포벽 또는 이의 일부의 제거.
(2) PEG(폴리에틸렌글리콜) 및 Ca2+이온의 존재하에 DNA벡터로 네이키드(naked)효모 세포(스페로 플라스트)의 처리.
(3) 한천의 고체층에서 세포벽의 재생 및 형질 전환된 세포의 선별. 이러한 재생은 스페로플라스트를 한천내에 끼워 넣어 편리하게 수행한다. 예를들어, 용융된 한천(약 50℃)을 스페로플라스트와 혼합한다. 용액을 효모 생장 온도(약 30℃)로 냉각하는 동안, 고체층이 수득된다. 이 고체층은 빠른 확산 및 스페로플라스트로부터의 필수 거대 분자의 손실을 방지하므로 세포벽의 재생을 용이하게 한다. 그러나, 세포벽의 재생은 또한 수행된 한천 층의 표면상에 스페로플라스트를 플레이팅함으로써 수득할 (효율은 낮지만)수 있다.
바람직하게는, 재생 한천을 형질전환된 세포가 동시에 재생되고 선별되도록 하는 방식으로 준비한다. 일반적으로 아미노산 또는 뉴클레오티드 생합성 경로의 효소를 암호화하는 효모유전자가 선별 마커(상기 참조)로서 이용되므로, 재생은 효모 최소 배지 한천내에 수행함이 바람직하다. 매우 높은 효율의 재생이 필요한 경우, 하기 2단계 공정이 유리하다 : (1) 영양분이 풍부한 복합 배지에서 세포벽의 재생 및 (2) 세포층을 선별적 한천 평판상에 레플리카 플레이팅하여 형질전환된 세포의 선별.
본 발명에 또다른 태양은 서열식(Ⅳ)의 데설파토히루딘이다.
X1Tyr Thr Asp Cys Thr Clu Ser Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn X3Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu X3Asn Gln Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro X4Pro Gln Ser X5Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu X6
(Ⅳ)
상기식에서,
X1은 디펩타이드 잔기 Val-Val 이고,
X2, X3및 X4은 Lys이며,
X5는 His이고,
X6은 Glu-Tyr-Lys-Arg, Ser-Phe-Arg-Tyr 및 Trp-Glu-Leu-Arg로 이루어진 그룹 중에서 선택된 그룹이다.
본 발명에 따른 방법으로 수득될 수 있는 공지된 이종 단백질은 공지된 방법 그 자체로, 예를 들어 사람 및 동물 질환의 치료 및 예방에 사용할 수 있다. 예를들어, 사람 ANP는 나트륨 배출제, 이뇨제 및 혈관이완제 활성을 나타내며 심장혈관 항상성의 조절에 사용할 수 있다.
데설파토히루딘 화합물은 천연 히루딘과 유사하게, 혈전병의 치료 및 예방, 급성 쇼크 치료, 소모성 응혈 이상증의 치료를 위해서 그리고 유럽 특허원 제168342호에 기술된 바와 같이 사용할 수 있다.
본 발명은 특히, 실시예에 기술되어 있는 바와 같이 형질전환된 효모 균주, 이의 생성방법, 및 이종단백질의 생성방법에 관한 것이다.
[실시예 1]
삭카로마이세스 세레비지애 kex1 돌연변이체 균주 96과 삭카로 마이세스 세레비지애 균주 BYS와의 교배 및 α-인자 분비능 및 카복시펩티다제 yscα KEX1 유전자) 활성에 대한 포자 분석
yeast Genetic Stock Center(Berkeley, USA)로부터 입수한 삭카로마이세스 세레비지애 kex1 돌연변이체 균주 96(a, kex1, ade2, thr1)을 야생형 KEX1 대립 유전자를 함유하는 삭카로마이세스 세레비지애 균주 BYS232-31-42(α, prb1-1, prc1-1, cpa1-3, lys2, leu2, his7)[참조 : Achstetter, T. and Wolf, D. H.(1985) EMBO J. 4, 173-177; Wolf, D. H. and Ehmann, C. (1981) J. Bacteriol. 147, 418-426]와 교배시킨다. 이렇게 교배하여 유전자형이 kex1/KEX1인 2배체 이형접합성 세포를 분리한다. 2배체 세포로부터 유도된 4배체를 표준 유전학적 기술[참조 : Hawthorne, D.C.and Mortimer, R.K.(1960) Genetics 45, 1085-1110; Methods in Yeast Genetics 1986(Sherman, F. et al., eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.]에 따라 절개한다.
각 4배체의 4개의 포자를 이들의 α-인자 분비능에 대하여 시험한다. KEX1 야생형과 kex1 돌연변이체 콜로니를 구별하기 위하여, 페로몬-초민감성 시험체 균주 삭카로마이세스 세레비지애 RC629(a, sstw, ade 2-1, ural, his6, met1, can1, cyh2, rem)를 사용한다[참조문헌 : Chan, R.K. and Otte, C.K.(1982)] Mol. Cell, Biol. 2,11-20; Chan, R.K. and Otte, C.K.(1982) Mol. Cell. Biol. 2, 21-29]. 단일의 핵 유전자에 의해 암호화된 형질로부터 예상된 바와 같이, 분석된 모든 4배체에서 각 4배체중 2개의 포자는 a-인자를 분비하는 반면, 다른 두 포자는 α-인자를 분비했다. α-메이팅(mating)형의 야생형 KEX1 콜로니는 α-인자 전구체를 완전히 가공하여 하나의 전구체 분자로부터 4개의 활성 α-인자 분자를 생성할 수 있으므로, 시험체 균주의 생장을 광범위하게 억제시켜 이들 둘레에 거대한 할로(halo)를 형성한다. 이와 반대로, kex1돌연변이체 콜로니는 하나의 전구체 분자로부터 하나의 성숙 α-인자 분자만을 생성할 수 있으므로, 시험체 균주의 생장을 덜 억제하여 이들 둘레에 작은 할로를 형성한다.
상기의 페로몬 분석으로 kex1 유전자가 결손된 것으로 동정된 몇몇의 완전한 4배체의 포자를 카복시펩티다제 yscα의 특이활성에 대하여 최종적으로 시험한다. 세포를 생장시켜 이들의 막을 생성시키고 문헌[참조 : Wagner, J.C. and Wolf, D.H.(1987)FEBS Lett. 221, 2, 423-426]에 기술된 물질로서 Cbz-Tyr-Lys-Arg를 사용하여 카복시펩티다제 yscα의 활성을 시험한다. kex1 돌연변이체 세포에서 카복시 펩티다제 yscα활성이 결여되었다는 사실은 KEX1이 이 효소의 구조 유전자임을 나타낸다. 이러한 사실은 결국 카복시펩티다제 yscα가 사실상 α-인자의 카복시-말단 프로세씽에 관여함을 암시한다.
[실시예 2]
프로테아제 yscB, yscY 및 yscS의 추가 결손에 대한 확인된 kex1 돌연변이체의 분류
삭카로마이세스 세레비지애 kex1 돌연변이체는 다른 프로테아제(프로테이나제 yscB, 카복시펩티다제 yscY 및 카복시펩티다제 yscS)의 결손 및 추가의 생장인자 요구성에 따라 분류된다.
YPD(Difco)배지에서 정체기로부터 제조된 kex1 돌연변이체의 세포물질을 엡펜도르프 마이크로퓨지(Eppendorf microfuge)중의 200μ120mM트리스-HCl 완충액(pH 7.2)에 현탁시키고 글라스 비이드(직영 0,4mm)를 용적의 2/3가 되도록 첨가한다. 현탁액을 간헐적으로 빙냉시키면서 볼텍스 혼합기상에서 1분간 3회 격렬하게 진탕시킨다.
5분간 원심분리하여 상등액 조 추출물을 회수한다. 프로테아제를 활성화시키고 추출물로부터 유리 아미노산을 제거하기 위하여 상기 추출물을 0.1mM ZnCl2을 함유하는 0.1M 이미다졸-HCl완충액(pH 5.2)에 대하여 투석한다.
아조콜 시험(Azocoll-test)[참조문헌 : R. E. Ulane et al.(1976) J. Biol. Chem. 251, 3367; E. Cabib et al.(1973) Biochem. Biophys. Res. Commun. 50, 186; T. Saheki et al.(1974) Eur. J. Biochem. 42, 621]에 따라 프로테이나제 yscB 활성을 측정한다. 단백질 농도를 측정한 후에, 각 샘플의 분취량을 0.1M인산나트륨(NaPi) 완충액(pH 7.0)으로 채워 100㎕가 되게하여 요구되는 단백질량과 등량이 되도록 조절한다. 단백질 용액에 500㎕의 아조콜 현탁액(0.1M NaPi 완충액(pH 7.0)중 240mg)을 가한다. 이들 혼합물을 교반시키면서 30℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 500μ1의 10%트리클로로아세트산을 가하여 반응을 정지시킨 후에, 혼합물을 2회 원심분리하고 520nm에서 상등액의 흡광 스펙트럼을 측정한다.
색소원성 기질 Cbz-Gln-Leu[참조문헌 : D.H. Wolf et al.(1978)FEBS Lett. 91, 59; D.H. Wolf et al,(1977) Eur. J. Biochem. 73, 553]을 사용하여 카복시펩티다제 yscY 및 yscB의 촬성을 측정한다. 투석된 추출물을 3등분하고 이들중 2개에 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 최종농도 1mM 또는 EDTA를 최종농도 5mM로 가하여 두 프로테아제 활성을 선택적으로 차단시킨다. 즉 PMSF는 카복시펩티다제 yscY 활성을, EDTA는 카복시펩티다제 yscS의 활성을 억제한다. 혼합물을 억제제와 함께 25℃에서 1시간 동안 항온처리하여 완전히 억제시킨다. 단백질 농도를 측정한 후에, 각 샘플의 대조용으로서 억제제를 함유한 두 개의 분취량 및 억제제를 함유하지 않는 하나의 분취량을 0.1M NaPi 완충액(pH 7.4)으로 50μ 1가 되게 충전시켜 등량의 단백질을 수득한다. 이 단백질 용액에 하기의 시험용액을 가한다.
500μ1 시험용액 Ⅰ:
0.1M NaPi 완충액(pH 7.4)중의
L-아미노산 옥시다제 0.2mg/m1
서양매운탱이 퍼옥시다제 0.40mg/m1
(horseradish peroxidase)
0.01mM MnCl2
50μ1시험용액 Ⅱ
물중의 o-다이니시딘 2mg/m1
50μ1 시험용액 Ⅲ
0.2M 인산칼륨 완충액(pH 7.4)중의 20mM Cbz-Gly-Leu
혼합물을 28℃에서 1시간 동안 항온처리하여 100μ1의 20% 트리톤 X-100을 가하여 반응을 중단시킨후, 405nm에서 흡광도를 측정한다.
이어서 형질전환시키기 위하여, 루이신에 대한 아미노산 영양 요구성 마커를 아데닌, 트레오닌, 리신 및 히스티딘이 보충되고, 루이신이 보충되거나 보충되지않는 최소 평판상에서 레플리카-기술을 사용하여 평가한다.
상기의 분석법을 사용하여, 삭카로마이세스 세레비지애 BYS kex1로 망명된 돌연변치에를 분리하며, 돌연 변이체는 4중 프로테아제-결손(α, prb-1, prc-1, cps-3, kex1) 및 루이신에 대한 추가 요구성을 나타낸다.
[실시예 3]
삭카로마이세스 세레비지애 4중 프로테아제 결손 돌연변이체의 형질전환
문헌[참조 : Hinnen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929(1978)]에 기술된 형질전환 프로토콜을 사용하여 플라스미드 pJDB207/PH05-HIR[참조문헌 : 유럽 특허원 제225633호]을 4중 프로테아제 결손 돌연변이체 BYSkex1(α, prb-1, prc-1, cps-3, kex-1, leu-2)에 및 대조용으로서 KEX1 야생형 균주 BYS232-31-42(α, prb-1, prc-1, cps-3, lys2, leu2, his7)에 도입시킨다.
100ml YPD 배지 (OD600=0.2)중 초기 대수기로부터 상이한 두 효모 균주를 회수하여 25ml의 0.8M 소르비톨로 세척하고 5ml의 동일 솔비톨 용액중에 재현탁시킨다. 이 5ml 세포 현탁액에, 30μ1지모리아제(Arthro-bacter luteus로부터의 ZYMOLSE-100 T, Seikagaku Kogyo Co., LTD; 0.8M 솔비톨중 10mg/m1)를 가한다. 이들 혼합물을 30℃에서 약 30분간 진탕기(100회전/분)상 100ml 들이 플라스크 중에서 각각 온화하게 진탕시킨다. 5분 간격으로 100μ1의 분취량을 취하고 10ml 증류수 중에 희석시킨 후 600nm에서 희석액의 흡광도를 측정하여 스페로 플라스팅(spheroplasting) 진행과정을 조절한다. 양호한 스페로 플라스트를 형성시키기 위하여, 지모리아제 처리 전후의 흡광도차가 10배 이상이어야 한다. 스페로플라스팅 세포를 0.8M 솔비톨로 2회 세척하고, 25ml의 배지 HE30(YPD 배지중 2M 솔비톨)중에 재현탁시키고 진탕기(110회전/분)상에서 온화하게 진탕시키면서 100ml들이 진탕 플라스크중에 30℃에서 1시간 동안 배양한다. 세포를 원심분리(3000rpm, 5분)하고, 조심스럽게 1ml HE 31용액(10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10mM CaCl2, 0.9M 솔비톨)중에 재현탁시킨다. 이 100μ1 세포 현탁액에 4μ1의 플라스미드 DNA를 가한다. 혼합물을 실온에서 15분간 항온처리한다. 각각의 튜브에 1ml의 20% 폴리에틸렌글리콜(PEG) 4000을 가하고 실온에서 30분간 추가 항온처리하고, 원심분리(3000rpm, 3분)한 후 500μ10.8M 솔비톨중에 재현탁시킨다. DNA를 함유한 스페로플라스트를 10ml 재생 한천(1M 만니톨, 6.8g/1 효모 질소 염기 w/o AA(디프코), 10g/1 L-아스파라진, 1.0g/1 L-히스티딘, 1.0g/1 트레오닌, 1.0g/1리신 및 3% 한천)과 혼합하고 동일조성의 염기성 한천 층을 함유하는 평판에 상층으로서 붓는다. 형질전환체 콜로니가 나타날 때까지 평판을 30℃에서 96시간 동안 항온처리한다.
단일의 형질전환된 효모 콜로니를 선택하여 루이신을 제외한 아데닌, 트레오닌, 리신 및 히스티딘으로 보충된 효모 합성 최소배지(8.4g/1 효모 질소 염기 w/o AA, 10g/1 L-아스파라진 및 1.0g/1 L-히스티딘)중에 생장시킨다. 4중 프로테아제 결손 돌연변치에 BYSkex1 및 3중 프로테아제 결손 대조 균주 BYSKEX1로부터 형성된 콜로니를 삭카로마이세스 세레비지애 BYSkex1/pJDB 207/PH05-HIR 및 삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB 207/PH05-HIR로 각각 언급한다.
[실시예 4]
pJDB207/PH05-HIR을 갖는 삭카로마이세스 세레비지애 형질전환체의 배양
삭카로마이세스 세레비지애 형질전환체 BYSkex1/pJDB207/PHO-HIR 및 BYSKEX1/pJDB207/PH05-HIR의 세포를 28℃에서 10ml의 효모 완전 배지 HE41[4.5g/1 카사미노산, 4g/1 효모 추출액, 20g/1 삭카로즈, 20g/1 클로코즈, 3.6g/1(NH4)2So4, 0.2g/MgS04, 7H2O, 0.013g/1 CaCl.H2O 및 1ml/1 미량원소 혼합물(10g/1 FeSO4, 7H2O, 50g/1 ZnSO4, 7H2O, 3.3g/1 CuSO4, 5H2O, 3g/1 MnSO4, H2O, 2g/1 CoCl2, 6H2O 및 1g/1(NH4)6Mo7O24. 4H2O)]중에 예비 배양물로서 진탕시키고 정체기에 도달할 때까지 약 48시간동안 배양한다. 회수된 세포를 0.9% NaCl 중에 세척한다. 50ml의 상기 효모 합성배지를 5% 접종물로 접종한다. 배양물을 OD600=0.3의 세포밀도로 접종하고 28℃에서 250회전/분의 속도록 72시간 동안까지 교반시킨다.
HPLC 분석시 자연 흡수를 제거하기 위하여 효모 완전배지 HE 41을 사용한다.
[실시예 5]
삭카로마이세스 세레비지애 형질전환체 BYSkex1/pJDB207/PH05-HIR 및 KYSKEX1/pJDB207/PH05-HIR의 발효 배양물로부터 생성된 히루딘-65 및 이의 카복시-말단 분해 생성물 히루딘-64 및 히루딘-63의 역성 HPLC분석
액체 효모 배양물로부터의 샘플을 원심분리하여 청정용액을 생성시켜 아세트산(1M)으로 1 : 10(v/v)로 희석시키고 하기의 조건하에서 HPLC 분석한다.
HIBAR(MERCK) 칼럼(4×125mm)을 입자직경이 5㎛이고 공극이 300Å인 구형 정지상(넓은 다공성실리카 물질, 유형 71252, 300-5-C18, MACHEREY-NAGEL)을 역상으로 충전한다. 0.1%(v/v)트리플루오로아세트산을 함유하는 물(Nanoper
Figure kpo00003
, BARNSTEAD)로부터 이동상 A를 만든다. 이동산 A 20% 및 0.08%(v/v)트리플리루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴(HPL-grade, FLUKA) 80%(v/v)로부터 이동상 B를 만든다.
유동속도 1.5ml/분에서 하기의 구배로 진행시켜 크로마토 그래피 분리를 수행하고 216nm에서의 흡광도로 용출물을 모니터링 한다.
Figure kpo00004
1mg의 순수한 데설파토히루딘을 1ml 물중에 용해시켜 시스템 측정용의 표준용액을 만든다. 50μ1의 상기 표준용액을 칼럼에 주사하여 상기한 바와 같이 시스템을 특정하기 위하여 크로마토그래피한다.
삭카로마이세스 세레비지애 BYSkex1/pJDB207/PH05-HIR 및 삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pHDB207/pH05-HIR 배양물로부터 회수한 히루딘의 역상 액체 크로마토그래픽 분석결과를 제1도에 나타냈다. 크로마토그래피 조건은 상기한 조건과 동일하다. 균주 BYSKEX1/pJDB207/ph05-HIR는 달리, 펩티다제 yscα 음성 균주 BYSkex'/pJDB207/PH05-HIR은 필수적으로 C-말단이 단축된 부산물, 득 C-말단 아미노산 Gln이 결핍된 데설파토히루딘 HIR-64 및 C-말단 아미노산 Leu 및 Gln이 결핍된 HIR-63이 없는 데설파토히루딘 생성물(HIR-65)를 생성한다.
[실시예 6]
바람직한 효모 코돈을 갖는 히루딘 HV1 유전자의 시험관내 합성
바람직한 효모 코돈[참조 : B. Hall (1982) J. Biol. Chem. 257, 3026]으로 히루딘 발현 카세트의 암호와 서열을 고안하여 히루딘 mRNA의 최적 해독을 보장한다. 암호화 서열은 데설파토히루딘 HV1의 암호화 서열에 프레임상으로 융합된 PH05시그날 서열을 함유한다. 합성 DNA 5' 말단은 EcoRI 제한 부위의 점성 말단을 함유한다.
3' 말단에서 정지 코돈 TAG 다음에 바로 BamHI 부위의 점성 말단이 있다. 257 bp EcoRI-BamHI DNA 단편의 서열을 제2도에 나타냈다.
제2도는 2본쇄 DNA 단편의 시험관내 합성에 대한 전략도를 나타낸다. Applied Biosystems Model 380B 합성기상에서 포스포르-아미다이트 방법[참조문헌 : M. H. Caruthers, in; Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Framents(H. G. Gassen and A. Lang. Eds.), Verlag Chemie, Weinheim, FRG(1982)]을 사용하여 21개의 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 각 올리고뉴클레오티드의 서열을 제2도에 나타냈다. 중첩부위는 고유하다. 동결건조된 올리고뉴클레오티드를 10pmol/μ1 농도로 50mM Tris-HCl(pH 8.0)중에 재용해시킨다. 21개의 올리고뉴클레오티드를 두 그룹으로 나눈다; [A] 제1번 내지 11번은 DNA 단편의 5' 절반을 나타내며, [B] 제12내지 21번은 DNA 단편 3' 절반을 나타낸다. 2 그룹을 개별적으로 처리한다. 한 그룹의 올리고 뉴클레오티드 각각 10pmol을 혼합한다. 올리고를 37℃에서 1시간 동안 20μ1의 25mM 트리스 -HCI(pH 8.0), 10mM MgCl. 10mM NaCl, 3mM DTT, 0.4mM ATP 및 8단위의 폴리뉴클레오티드키나제(Boehringer)중에서 포스포릴화한다. 실온에서 30분 경과후 양쪽 혼합물(A 및 B)을 각각 95℃에서 5분간 수욕 중에서 가열한다. 샘플을 수욕중에서 밤새 실온으로 서서히 냉각한다. 이어서 어닐링된 올리고뉴클레오티드 혼합물 A 및 BFMF 빙상에 저장한다.
플라스미드 pBR 322를 EcoRI 및 BamHI으로 완전히 절단한다. 4kb의 대단편을 0.6%예비 아가로스 겔상에 분리한다. 실시예 7에 기술된 바와 같이 전기용출하여 DNA를 회수하고, DE52이온교환 크로마토그래피 및 에탄올 참전시켜 정제한다. DNA를 0.4jpmol/μ농도로 HO중에 재용해시킨다.
10μ1의 어닐링된 올리고뉴클레오티드 혼합물 A(올리고 1 내지 11번 각각 5pmol), 9.5μ1의 혼합물 B(올리고 12내지 21번 각각 5pmcl), 0.4pmol의 pBU 322의 4kb EcoRI-BamHI 단편 및 400단위의 T4 DNA리가제(Biolabs)를 15℃에서 16시간 동안 항온처리한다.
10μ1분취량을 사용하여 컴피던트 이.콜라이 HB101 Ca 세포를 형질전환시킨다. 12개의 형질전환된, 암피실린 내성 콜로니를 100㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 배지중에 개별적으로 생장시킨다. 문헌[참조 : Holmes et al., Anal. Biochem. 114, 193(1981)]의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 제조하고 EcoRI 및 BamHI 제한 분해로 분석한다. 257 bp EcoRI 및 BamHI 삽입물을 갖는 플라스미드 DNA를 두 본쇄에 대하여 DNA를 서열분석하여 추가분석한다. 올리고뉴클레오티드 3, 11, 12, 14 및 20(제2도 참조)을 서열분석용 프라이머로서 사용한다. 양쪽 DNA 본쇄상에 정확한 서열을 갖는 하나의 클론을 선택하여 pBR 322/YHIR 명명한다.
[실시예 7]
플라스미드 pJDB207/GAPEL-YHIR의 작제
pJDB207/GAPFL-YHIR은 효모 글리세르 알데하이드-3-포스 페이트 데하이드로게나제(GAPDH) 유전자의 짧은, 구조 프로모터의 조절하의 데설파토히루딘 변이체 HV1 발현을 위한 효모 플라스미드이다. 데설파토히루딘의 암호화 서열은 바람직한 효모코돈으로 이루어져있다.
10㎍의 플라스미드 pBR 322/YHIR을 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 및 EcoRI으로 분해한다. 1.2% 예비아가로스 겔상에서 다른 DNA단편으로부터 257bp EcoRI-BamHI 단편을 분리한다. DNA 밴드를 에티듐브로마이드로 염색하고 UV 하 360nm에서 가시화 한다. 겔로부터 257bp DNA 밴드를 절단하고 0.2×TBE 완충액(TBE : 90mM 트리스-염기, 90mM 붕산, 2.5mM EDTA, pH 8.3)중에 45분간 100mA에서 전기용출시킨다. 45초 동안 극성을 변화시킨 후, DNA 용액을 수집하고 0.15M NaCl 이 되게 조절한다. DNA를 DE52이온 교환기(Whatman)의 100μ1베드(bed)에 흡착시키고 400μ1의 고염 완충액 (10mM 트리스-HCl pH 8.0, 1mM EDTA, 1.5M NaCl)중에 용출시킨다. DNA를 에탄올 침전시키고 hO중에 0.1pmol/μ1농도로 재현탁시킨다.
플라스미드 pJDB207/GAPFL-HIR[참조 : 유럽 특허원 제225633호]은 효모 산 포스파타제의 시그날 서열(PH05)에 프레임으로 융합된 데설파토히루딘에 대한 합성 유전자(이. 콜라이 코돈 사용을 기초로함)을 함유한다. 유전자는 셔틀(shuttle)벡터 pJDB207상에서 효모의 짧은, 구조 글리세르알데하이드-3-포스 페이트 데하이드로게나제(GAPFL) 프로모터의 조절하에 발현된다.
20㎍의 플라스미드 pJBD207/GAPFL-HIR를 SalI 및 EcorI으로 분해한다. 478bp Sall-EcoRI 단편은 Sal-Bam pBR322 부분 및 GAPFS 프로모터를 함유한다. DNA 단편을 0.8% 예비 아가로스 겔상에 분리하고, 전기용출시키고 DE52 크로마토그래피 및 에탄옥 침전시켜 정제한다. DNA를 HO중에 0.1pmol/μ의 농도로 재현탁시킨다. 5㎍의 pJDB207/GAPFL-HIR를 Sall 및 BamH로 분해한다. 6.7kb의 벡터 대 단편을 상술한 바와 같이 분리한다.
0.2pmol의 478bp SalI-EcoRI 프로모터 단편, PH05 시그날 서열을 함유하는 0.2pmol의 257bp EcoRI-BamHI 단편, 합성 히루딘 유전자(효모 코돈) 및 0.1pmol의 6.7kb 벡터 단편을 15℃에서 6시간 동안 10μ1의 60mM 트리스-HCl pH7.5, 10mM MgCl, 5mM DTT, 1mM ATP 및 200단위의 TDNA 리가제(Biolabs)중에서 연결한다. 연결 혼합물 1μ1분취량을 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 HB101 세포를 형질 전환시킨다.
12개의 형질전환된, 암피실린 내성 콜로니를 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지중에 개별적으로 생장시킨다.
홀롬스(holmes) 등의 방법[상기참조]으로 플라스미드 DNA를 제조하고 Sall/HindⅢ 2중 분해로 분석한다. 예상된 제한 패턴을 갖는 단일 클론을 pJDB207/GAPFL-YHIR로서 언급한다.
이와 유사한 방법으로 플라스미드 pJDB207/GAPEL-HIR[참조문헌 : 유럽 특허원 제225633호]의 543bp Sall-EcoRI 프로모터 단편을 사용하여 작제할 수 있다. 신생 플라스미드를 pJDB207/GAPEL-YHIR로서 언급한다.
[실시예 8]
플라스미드 pHDB207/PH05(-173)-HIR의 작제
pJDB207/PH05(-173)-HIR은 짧은 PH05 프로모터의 조절하에 데설파토히루딘 변치에 HV1을 발현시키기 위한 효모 플라스미드이다. PH05(-173) 프로모터 성분은 위치 -9 내지 -173의 효모 PH05 프로코너의 뉴클레오디트 서열(BesEII 제한부위)을 함유하지만, 업스트림 조절 서열(UAS)은 함유하지 않는다. 그러므로 PH05(-173) 프로모터는 구조 프로모터와 유사하게 작용한다.
플라스미드 PFDB207/PH05(Eco)-HIR(유럽 특허원 제225633호)은 PH05 시그날 서열의 ATG에 대하여 -8 위치에 도입된 EcoRI 부위를 갖는 완전한 길이의, 조절된 PH05 프로모터 및 PH05 전사 종결단편의 앞에 존재하는 데설파토히루딘의 암호화 서열을 함유한다. 이러한 예는 조절된 PH05 프로모터가 짧은 PH05(-173)프로모터 성분에 의해 대체되었음을 설명한다.
20㎍의 플라스미드 pJDB207/PH)5(Eco)-HIR를 BstEII로 분해한다. 제한 단편의 점성 말단을 실온에서 30분간 200μ1의 60mM 트리스 -HCI(pH 7.5), 10mM MgCl, 각각 0.1mM의 dATP, dCTP, dGTP, TTP 중의 클레노우 DNA 폴리머라제(1단위/㎍DAN)와 반응 시킨다. 페놀 추출후 DNA를 에탄올 침전시킨다. 4.16㎍의 BamHI링커(5'-CGGATCCG-3, Biolabs)를 37℃에서 45분간 60mM 트리스-HCI pH7.5, 10mM MgCl, 5mM DTT, 0.5mM ATP 및 18단위의 T폴리뉴클레오티드 키나제(Boehringer)의 100μ1중에서 포스포릴화 시킨다. 75℃에서 10분 경과한 후, 반응 혼합물을 실온으로 서서히 냉각시킨다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드 링커를 -20℃에서 저장한다.
플라스미드 pJDB207/PH05(Eco)-HIR의 [BstEII]평활말단 단편 4pmol을 60mM 트리스-HIC pH 7.5, 10mM MgCl, 5mM DTT, 3.5mM ATP 및 800 단위의 TDNA리카제(Biolabs)의 208μ1 중의 100배 과량의 포스포릴화되고 어닐링된 BaMHI 링커와 15℃에서 16시간 동안 항온처리한다. 리가제를 85℃에서 10분간 불활성화 시킨 후 10mM EDTA, 300mM, 아세트산 나트륨(pH 6.0) 및 0.54배 용적의 이소프로판올의 존재하에 DNA를 BamHI 및 EcoRI으로 분해한다. DNA 단편을 0.8%예비 아가로스 겔상에 분리한다. 전기용출 및 에탄올 침전에 의해 겔로부터 172bp BamHI-EcoRI 프로모터 단편을 회수한다. DNA를 0.1pmol/μ1의 농도로 제현탁시킨다.
플라스미드 pJDB207/PH05(Eco)-HIR을 EcoRI 및 Hind Ⅲ로 분해한다. 643bp EcoRI-Hind Ⅲ 단편을 상술한 바와 같이 분리한다. DNA 단편은 데설파토히루딘의 암호화 서열에 프레임으로 융합된 PH05 시그날 서열 및 PH05 전사 종결 단편을 함유한다. 플라스미드를 HingⅢ 및 BamHI으로도 절단한다. 6.6kb벡터 단편을 분리한다.
0.2pmol의 각각의 172pb BamHi-EcoRI 단편 및 643bp EcoRI-Hind Ⅲ 단편 및 0.1pmol의 6.6kb 벡터 단편을 15℃에서 6시간 동안 60mM 트리스-HCl pH 7.5, 10mM MgCl, 5mM DTT, 1mM ATP 및 400 단위의 TDNA 리가제(Biolabs)의 10μ1 중에서 연결시킨다. 연결 혼합물의 1μ1의 분취량을 100μ1의 칼슘-처리된 형질전환-컴피턴트 이.콜라이 HB101 세포에 가한다.
12개의 형질전화된, 암피실린 내성 콜로니를 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지중에서 생장 시킨다. 플라스미드 DNA를 제조하여 BamHI 및 SalI/Hind Ⅲ 분해로 분석한다.
예상된 제한 단편을 갖는 하나의 클론을 선택하여 pJDB207/PH05(-173)-HIR로 언급한다.
[실시예 9]
플라스미드 pDP34의 작제
효모의 2미크론의 공유적으로 폐환된 환형 DNA를 삭카로 마이세스 세레비지애 균주 S288C로부터 분리한다. 세포를 37℃에서 20분간 5㎍/ml의 지모리아제(100,000단위/ug)과 항온처리하여 세포벽을 분해한다. 스페로플라스트를 2% SDS로 용해시킨다. 이어서 EDTA를 25mM 에티듐 브로마이드에 가하여 1mg/m1가 되게 하고 세슘 클로라이드의 최종밀도가 1.55g/m1가 되게한다. 15℃에서 42시간 동안 42,000rpm으로 한외원심분리하여 염색체성 DNA로부터 플라스미드 DNA를 분리한다. 주사기를 사용하여 구배물로부터 2미크론의 플라스미드 DNA를 절단한다. NaCl-포화된 이소프로판올로 추출하여 에티듐 브로마이드를 제거하고 플라스미드 DNA를 최종적으로 에탄올 침전시킨다. 이어서 정제된 2미크론의 플라스미드 DNA를 PstI으로 선형화하고 pUC10[참조 : J. Morrander et al., Gene 26(1983), 101]의 PstI 부위에 클로닝하여 플라스미드 pDP31을 수득한다.
플라스미드 pJDB207을 제한효소 KpnI 및 HpaI으로 분해한다. 생성된 0.55kb HpaI-KpnI 단편은 dLEU2유전자의 2미크론 서열 및 결손 프로모터간의 연접부위를 함유한다.
플라스미드 pUC7/LEU2는 플라스미드 pUC7[참조 : J. Vieira et al.(1982) Gene 19, 259]의 SalI 부위에 클로닝된 LEU2 유전자[참조 : A. Andreadis et al.(1982) Cell 31, 319]의 효모 게놈성 2.2kb XhoI-SalI 단편을 함유한다.
플라스미드 pUC7/LEU2는 KpnI 및 HpaI으로 절단한다. 4.2kb KpnI-HpaI 단편을 pJDB207의 0.55kb HpaI-KpnI 단편에 연결시킨다. 그 결과 플라스미드 pJDB207에서와 같이 원래의 2미크론/DLEU2 융합이 완전한 터미네이터를 갖는 LEU2 유전자의 전방에 위치하는 플라스미드 pDP30이 생성된다. pDP 30을 HpaI 및 SalI로 분해하고 완전한 LEU2 유전자를 함유하는 1.85kb 단편을 정제하여 플라스미드 pDO31의 8.7kb Sall-HpaI 단편에 클로닝시킨다. 생성된 플라스미드, pDP33(제3도 참조)를 50㎍/ml에 에티듐 브로마이드 존재하에 HindⅢ로 부분 분해하여 선형화하고[참조 : M. Oesterlund et al. (1982) Gene 20, 121] URA 3 유전자[참조 : M. Rose et al. (1984) Gene 29, 113]를 함유하는 1.17kb HindⅢ단편과 연결한다. URA3 유전자는 형질전환에 의하여, 이.콜라이 균주 pyrF[참조문헌 : M Rose et al., 상기참조]에 삽입하기 위하여 선택되었다. 양성 클론을 플라스미드 pDP34(제4도 참조)로서 언급한다.
pDP34는 이.콜라이에 대한 암피실린 내성 마커 및 URA3 및 dLEU2 효모 선별 마커를 갖는 효모-이.콜라이 셔틀 벡터이다. pDP34는 A 형태로 완전한 2미크론 서열을 함유하며 REP1, REP2 및 FLP가 풍부하다.
[실시예 10]
pDP34로의 히루딘 발현 카세트의 클로닝
플라스미드 pDP 34를 BamHI 분해한다. 제한 부위의 점성말단을 클레노우 DNA 폴리머라제[참조문헌 : T. Maniatis et al., in: Molecular Cloning. Alaboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982]와 반응시킨다. DNA는 추가로 SalI으로 절단하고 11.8kb 벡터 단편을 예비 0.6% 아가로스 겔 상에서 분리한다. 전기용출 및 에탄올 침전하여 DNA를 회수한다. 상이한 발현 카세트를 SalI 및 [BamHI]/평활 말단 부위간의 pSP34 벡터 단편에 클로닝시킨다.
플라스미드 pJDB207/GAPEL-YHIR을 HindⅢ로 분해한다. 클레노우 DNA 폴리모라제로 점성 말단을 평활 말단으로 전환시킨다. DNA를 에탄올 참전시키고 SalI로 추가 분해한다. 1.1kb SalI-[HindⅢ]/평활 말단 단편은 pBR322 서열을 갖는 완전한 발현 카세트, GAPFL 프로모터, 데설파토히루딘의 암호와 서열(바람직하게는 효모 코돈)에 프레임으로 융합된 PH05 시그날 서열 및 PH05 전사 종결 단편을 함유한다. 1.1kb 단편을 예비 0.8% 아가로스 겔상에서 분리하고 전기용출하여 겔로부터 회수하고 DE52이온교환 크로마토그래피 및 에탄올 침전시켜 정제한다. 0.2pmol의 1.1kb 단편 및 0.1pmol의 11.8kb 벡터 단편을 15℃에서 16시간 동안 60mM 트리스-HCI(pH 7.5), 10mM MgCl, 5mM DTT, 3.5mM ATP 및 400단위 T4 DNA 리가제(Biolabs)의 1μ1분취량을 사용하여 이.콜라이 HB101 Ca 세포를 형질전환시킨다. 5개의 형질전환된, 암피실린 내성 갖는 하나의 클론을 선택하여 pDP34/GAPFLYHIR(제5도 참조)로서 언급한다.
이와 유사한 방법으로, pJDB207/GAPEL-YHIR(실시예 7 참조)의 1.2kb SalI-[HindⅢ]/평활 말단 단편을 pD34 벡터에 클로닝하여 플라스미드 pDP 34/GAPEL-YHIR을 생성시킨다.
플라스미드 pJDB207/PH05(-173)-HIR을 SalI 및 EcoRI으로 분해한다. 기술된 바와 같이 448bp SalI-EcoRI 단편을 분리한다. DNA 단편은 PBR322의 SalI-BamHI 부분 및 짧은 구조 PH05(-173)-프로모터를 함유한다(실시예 8 참조). 플라스미드 pJDB207/GAPFS-YHIR을 HindⅢ로 분해한다. 클레노우 DNA 폴리머라제로 점성 말단을 평활 말단으로 전환시킨다. DNA를 EcoRI으로 추가 분해한다. 642bp EcoRI-[HindⅢ]/평활 말단 단편을 분리한다. 이 단편은 PH05 시그날 서열, 데설파토히루딘의 암호화서열(바람직하게는 효모 코돈) 및 PH05 전사 종결 단편을 함유한다. 0.2pmol의 각각 448bp SalI-[BamHI]/평활말단 벡터 단편을 연결한다. 연결 혼합물의 분취량을 사용하여 이. 콜라이 HB101 Ca 세포를 형질전환시킨다. 12개 형질전환체의 플라스미드 DNA를 BamHI 및 SalI/BamHI 분해로 분석한다. 정확한 플라스미드르 갖는 하나의 클론을 선별하여 pDP34/PH05(-173)-YHIR로 없습한다(제6도참조).
[실시예 11]
이. 콜라이 코돈을 갖는 히루딘 유전자에 대한 추가의 발현벡터
이. 콜라이 코돈에 기초하여 데설파토히루딘 변이체 HV1에 대한 합성 유전자를 함유하는 발현 플라스미드를 실시예 10에 기술된 방법과 유사한 방법으로 작제한다. pJDB207/GAPFL-HIR[참조문헌 : 유럽 특허원 제225 633호]의 1.1kb SalI-[Hind Ⅲ]/평활 말단 단편을 분리하여 벡터 pDP34에 클로닝시킨다. 생성 발현 벡터는 구조 GAPFL 프로모터 조절하에 발현된 바람직한 이. 콜라이 코돈을 기초한 데설파토히루딘에 대한 합성 유전자를 함유하는 pDP34/GAFL-HIR이다.
유사한 작제를 위하여, pHDB207/PH05(-173)-HIR(실시예 8 참조)의 1.1kb SalI][HindⅢ]/평활말단 단편을 pDP34에 클로닝한다. 생성 플라스미드 pD34/PH05(-173)-HIR은 짧은 구조 PH05(-173) 프로머터 조절하에 데설파토 히루딘(이. 콜라이 코돈)에 대한 합성 유전자를 함유한다.
[실시예 12]
플라스미드 DP92에 클로닝된 히루딘 발현 카세트
완전한 2-미크론 서열을 함유하는 벡터는 반드시 순수한 효모 2-미크론 환의 모든 기능을 발현할 필요는 없다. 개방 판독 프레임은 클로닝에 의해 파괴된 수 있다. D 판독 프레임의 유전자 생성물에 대하여 현재까지 아무런 기능도 알려지지 않았으므로 플라스미드 pDP31에서와 같이 이 유전자가 가진 유일한 pSt1 부위를 사용하여 dLEU2 유전자[참조문헌 : Beggs, J. D.(1978) Nature 275, 104-109]를 클로닝하거나 pUC 19 벡터 부분을 삽입한다(실시예 9 참조). 단지 최근에 와서야 D 유전자 생성물이 FLP 유전자 생성물의 발현을 조절한다고 제안되었다[참조문헌 : J.A.H. Hurray et al.(1987) EMBO J. 6, 4205]. 2-미크론 환의 완전한 이점을 얻기 위하여 D 유전자 생성물을 포함한 모든 공지의 2-미크론 기능이 완전한 벡터를 작제한다.
a) 플라스미드 pDP92의 작제(제7도 참조)
플라스미드 pDP 31(실시예 9)를 PatI 및 HpaI로 분해하여 3개의 단편을 생성시킨다. 플라스미드 pk19[카나마이신 내성부여; Pridmore, R.D. (1987) Gene 56, 309-312]를 Sma I로 선형화한다. 양쪽 분해물의 DNA 단편을 페톨 추출하고 에탄올 침전시킨다. DNA단편을 혼합하여 연결한다. 연결 혼합물을 LB배지중 37℃에서 2시간 동안 발현시킨 컴피턴트 이. 콜라이 JN109 세포[참조문헌 : Yanisch-perron, C. et al. (1985) Gene 33, 103-119]으로 형질전환 시키고 이어서 50㎍/ml의 카나마이신, 30㎍/ml의 XGal 및 7㎍/ml의 IPTG로 보충된 LB 한천 평판상에 플레이팅한다.
12개의 백색, 카나마이신 내성 콜로니가 생장한다. 플라스미드 DNA를 XbaI 및 BamHI/KpnI 분해로 분석한다. pDP31의 pUC19벡터 부분을 상실하고, PstI 부위의 재연결에 의하여 2-미크론 D 판독 프레임이 복구되었으며, HpaI 부위에 삽입된 pK19플라스미드 평활말단을 함유하는 단일 클론을 pDP91로 언급한다. 이 플라스미드는 pK19의 SmaI 부위에 클로닝된 2-미크론 플라스미드의 hPaI-PstI 대단편 및 PstI-HpnI 소단편을 함유한다. PstI 부위를 재연결하여 D판독 프레임을 재구성한다.
URA3 유전자를 플라스미드 pDP34(실시예 9)로 부터의 1.17kb HindⅢ 단편상에서 분리하고 플라스미드 pUC12의 유일한 HindⅢ 부위에 클로닝시킨다. 암피실린 내성 유전자로서 동일 배향으로 삽입된 URA3 유전자를 갖는 클론을 pUC12/URA3으로서 언급한다. 플라스미드 pDP91 및 jpUC12/URA3을 SacI 및 BamHI로 둘다 처리하여 두 개의 단편을 각각 생성시킨다. DNA 단편을 혼합-연결하고 이를 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 JM 109 세포를 형질선환 시킨다. 세포를 100㎍/ml의 암피실린, 30㎍/ml의 XGal 및 7㎍/ml의 IPTG로 보충한 LB 한천 평판에 플레이팅한다.
12개의 백색, 암피실린 내성 콜로니가 생장한다. 플라스미드 DNA를 HindⅢ 및 pvuII 분해로 분석한다. 단일 클론을 pDP92로서 언급하며, 모든 공지된 기능이 완전한 2-미크론 서열 및 oUC백터에 클로닝된 URA3 유전자를 함유한다.
b) pDP 92로의 히루딘 발현 카세트의 클로닝
실시예 10과 유사하게 pDP 92 BamHI으로 분해한다. 점성 말단을 클레노우 DNA를 SalI로 추가로 절단한다. 10.2kb 벡터 단편을 분리한다. 플라스미드 pJDB207/GAPFJL-YHIR의 1.1kb SalI-[Hind Ⅲ]/평활 말단을 분리하여 백터 단편에 연결한다.
6개의 형질전환된, 암피실린 내성 콜로니를 분석한다. 플라스미드 DNA를 BamHI, PstI 및 SalI/BamHI으로 분해한다. 예상된 제한 단편을 갖는 하나의 클론을 선별하여 pDP92/GAPFL-YHIR로 언급한다. 이와 유사한 방법으로, pJDB207/GAPEL-YHIR의 1.2kb SalI-[Hind Ⅲ]/평활말단 단편을 사용하여 플라스미드 pDP92/GAPEL-YHIR을 수득한다(실시예 7 참조).
실시예 10에 기술된 바와 같이 10.2kb SalI-[BamHi]/평활말단 pDP92 벡터 단편(상기 참조)을 사용하여 플라스미드 pDP92/PH05(-173)-YHIR을 작제한다.
[실시예 13]
2-미크론 DNA가 없는 삭카로마이세스 세레비지애 숙주균주의 작제
내인성 2-미크론 플라스미드를 제거하기 위하여 제1단계로 균주 HT 246(DSM 4084; α, leu 2-3, leu2-112, prb)의 URA 3 유전자에 결실을 유도하여 우라실에 대한 영양요구성 균주를 만든다. HT 246을 힌넨(Hinnen)등이 기술한 형질전환 방법[참조문헌 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929(1978)]을 사용하여 플라스미드 YeP13[참조문헌 : Broach, J. R., Strathern, J. N., Hicks, J. B.(1979) Gene 8, 121-123]㎍으로 형질전환시킨다. URA3 유전자가 결실된 플라스미드 pUC12ura3△[참조문헌 : Sengstag, Ch., Hinnen, A. (1987) Nucleic Acids Ressarch 15, 233-246]10㎍을 플라스미드 YEP13과 함께 가한다. 대략 3000개의 루이신 독립영양성 형질전환체를 소형 진탕 플라스크중의 5ml 최소배지(2% 글로쿠즈, 0.1%루이신, 0.1% 우라실 및 0.25% 플로오로아세트산을 가한 아미노산 비함유 디프코 효모 질소 염기)중에 재현탁시키고 30℃, 180r.p.m.에서 60시간 동안 항온처리한다. 생장하는 형질전환체는 독성 동족체 플루오르오로트산에 내성이므로 염색체성 URA3 유전자가 ura 3△로 대체된다. 생장 세포를 펩톤 20g/1, 효모 충출물 10g/1 및 글로코즈 20g/1로 구성된 완전배지상에 플레이팅하고, 30℃에서 48시간 동안 생장시킨후 아미노산 비함유 최소 배지(디프코)효모 질소 염기상에 레플리카 플레이팅한다. 2% 글루코즈 및 0.1% 루이신으로 보충시켜 우라실 영양 요구체를 탐지한다. 수개의 영양 요구체를 선택하여 루이신 영양 요구성을 부여하는 플라스미드 YEP13의 상실에 대하여 시험한다. 루이신 및 우라실을 요구하는 콜로니(Tr 889로 나타냄)각각 하나를 선택하여 추가의 실험에 사용한다.
Tr889를 두 마커 유전자 LEU2 및 URA3을 함유하는 플라스미드 pDP 38(플라스미드 pDP34를 SphI으로 분해하고 생성된 8.4kb 단편을 재연결시킴으로써 수득됨. 제4도 참조)로 형질전환시킨다(형질전환 방법, 상기 문헌). 먼저 형질전환된 효모 세포를 우라실이 결손되고, 루이신으로 보충된 효모 최소배지 평판성에서 선별하고 이어서 루이신이 결손되고 우라실로 보충된 최소 배지상에 레플리카 플레이팅한다. 10개의 빈약한 생장을 하는 콜로니를 선택하고 액체 완전배지(상기)중에 개별적으로 약 100세대에 걸쳐 생장시킨다. 이렇게 함으로써, 세포는 pDP38 플라스미드를 상실하며-일정%까지-동시에 내인성 2-미크론 플라스미드로 상실한다.
10개의 우라실 및 루이신 요구성 콜로니를 선택하여 DNA를 제조하고, DNA를 PstI로 완전히 분해하여 서던 블롯상에서 P-표지도니 효모 2-미크론 DNA로 탐침한다. 어떠한 하이브리드화 시그날도 갖지 않는 하나의 분리물을 효모 균주 HT246의 동인자형의 2-미크론이 없는(cir°)유도체, H449(a, leu 2-3, leu 2-112, ura3△, prb, cir°)로서 언급한다.
[실시예 14]
게놈성 KEX1 유전자의 파괴에 의한 삭카로마이세스 세레비지애 H449의 Kex1변이체의 제조
게놈성 KEX1 유전자의 파괴함으로써 삭카로마이세스 세레비지애 균주 H449(prb, leu 2, ura 3, cir°)로부터 카복시펩티다제 yscα활성을 제거한다. 상기의 목적을 위하여, KEX1 유전자를 효모 게놈성 라이브러리중에서 동정하고 적합한 벡터중에 클로닝한다. 선별마카로서의 역할을 하는 URA3 유전자를 KEX1의 구조 유전자중에 삽입하여 이의 판독 프레임을 파괴한다. KEX1 서열에 의해 양쪽중 한쪽 측면에 연결된 URA3 유전자를 함유하는 하이브리드 플라스미드 DNA를 Ura-효모 균주 H449에 도입한다. 플라스미드 및 염색체상의 KEX1 유전자의 서열 상동성으로 인하여 생체제 재조합과정이 일어나며 효모세포를 Ura-에서 Ura+로 및 동시에 KEX1에서 kex1으로 형질 전환된다. 파괴된 kex1 유전자를 가진 균주는 작용성 yscα 단백질을 합성하지 않는다.
KEX1 암호화 유전자는 KEX1 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침으로 콜로니-하이브리드화함으로써 효모 게놈성 라이브러리[동원체 셔틀 벡터 pCS19중의; Sengstag, C. et al.(1987) Nucl. Acids Res. 15, 233]로부터 클로닝된다. 올리고 뉴클레오티드 서열 5'-GTCGAATCCGGCCCTTTTAGGGTGAATTCA-3'는 공개된 KEX1 서열[참조문헌 : Dmochowska, A., et al.(1987)Cell 50, 573]로부터 유도되고 YscY의 서열에 대한 이의 특히 낮은 상동성에 의해 전체 서열로부터 선택된다. 이 서열은 URA3 유전자의 삽입에 사용되는 EcoRV제한 부위의 업스트림에 있는 KEX1 DNA와 하이브리드화한다. URA3 단편의 삽입을 확인하기 위한 서열분석용 프라이머로서 동일한 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 이 합성올리고뉴클레오티드를 방사능 표지하여 유전자 라이브러리를 선별하는데 사용한다.
콜로니하이브리드화[참조문헌 : Woods, D. E., et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79, 5661 alc A. S., et al.(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5387]하여 약 10,000개의 클론[5×2000개 클론/평판(ψ=140mm)]을 선별한다. 스크리닝 과정을 2회 반복하여 5개의 독립적인 양성 클론을 분리한다. 이들중 하나를 pKEX1으로 명명한다. KEX1 특이적 HindⅢ-BamHI 단편(1380bp)을 절단하기 위하여, pKEX1 플라스미드 DNA를 상응하는 두 엔도뉴클레아제로 분해한다. 각각의 단편을 SK 폴리링커와 함께 블루스크립트(Bluescript) 벡터 M13+에 옮기고 M13 벡터용의 일반적인 프라이머를 사용하여 이 클론을 서열 분석하여 KEX1 단편을 확인하고 pKEX1 M13으로 명명한다.
HindⅢ 단편으로서 클로닝된 URA3 유전자를 함유하는 플라스미드 pUC12/URA3(실시예 12a 참조)을 HindⅢ로 분해하여 1170bp HindⅢ 단편[참조문헌 : Rose, M. et al. (1984) Gene 29, 115]를 분리한다. 단편의 점성 말단을 클레노우 폴리머라제로 충전시켜 평활말단을 만든다. 한편, 플라스미드 pKEX1 M13을 엔조뉴클레아제 EcoRV 분해하여 선형화함으로써, KEX1 HindⅢ-BamHI 단편을 절단하여 알칼리성 포스파타제로 데포스포릴화하여 지기-연결을 방지한다. 이어서 이들 두 개의 DNA 단편을 혼합하여 연결하고 이. 콜라이 균주 JM103중에 형질감염 시킨다. 형질전환체를 HindⅢ 및 BamHI으로 2중 분해하여 분석하고, 고려된 HindⅢ-BamHI 단편의 크기는 1380bp에서 2550bp로 증가한다. 서열분석용 프라이머로서 상기의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 하나의 정확한 클론의 DNA를 서열 분석하여 EcoRV 절단부위 위치에서 KEX1 유전자중에 URA3 단편이 삽입되었음을 확인한다. 이 플라스미드를 pKEX1M13-URA3으로 명명한다.
PKEX1M13-URA3 DNA를 HindⅢ 및 BamHI으로 분해하여 KEX1-URA3 하이브리드 단편을 절단하고 벡터로부터 분리시키지 않은채 상기한 방법(실시예 3 참조)에 따라 삭카로마이세스 세레비지애 균주 H449에 도입시킨다. Ura 형질 전환체로부터 막 분획을 분리한 후에, 섹소원성 기질을 사용하여 yscα의 활성을 측정한다(실시예 1 참조). yscα의 프로테아제 활성을 보이지 않는 단일 형질 전환체를 삭카로마이세스 세레비지애 H449 kex1로 명명한다.
[실시예 15]
삭카로마이세스 세레비지애 균주 H449 kex1의 형질전환
사카로마이세스 세레비지애 균주 H449 kex1을 힌넨등을 형질 전환 방법(상기 문헌)을 사용하여 하기의 플라스미드로 형질전환시킨다.
pDP34/PH05(-173)-HIR
pDP34/GAPFL-HIR
pDP34/GAPEL-HIR
pDP34/PH05(-173)-YHIR
pDP34/GAPFL-YHIR
pDP34/GAPFS-YHIR
pDP34/PH05(-173)-YHIR
pDP34/GAPFL-YHIR
pDP34/GAPFL-YHIR
형질 전환된 효모세포를 루이신으로 보충되고 우라실이 결핍된 효모 최소 배지 평판상에서 선별한다. 단일의 형질전환된 효모세포를 분리하여 하기의 명칭으로 언급한다.
삭카로마이세스 세레비지애 H449kex1/pDP34/PH05(-173)-HIR
삭카로마이세스 세레비지애 H449kex1/pDP34/GAPFL-HIR
삭카로마이세스 세레비지애 H449kex1/pDP34/GAPFL-HIR
삭카로마이세스 세레비지애 H449kex1/pDP34/PH05(-173)-YHIR
삭카로마이세스 세레비지애 H449kex1/pDP34/GAPFL-YHIR
삭카로마이세스 세레비지애 H449kex1/pDP34/GAPFL-YHIR
삭카로마이세스 세레비지애 H449kex1/pDP34/PH05(173)-YHIR
삭카로마이세스 세레비지애 H449kex1/pDP34/GAPFL-YHIR
삭카로마이세스 세레비지애 H449kex1/pDP34/GAPFL-YHIR
[실시예 16]
실험실 규모로서의 형질 전환된 효모 균주의 발효
삭카로마이세스 세레비지애 H449 kex1/pDP 34/PH05(-173)0YHIR의 세포 및 삭카로마이세스 세레비지애 H449 kex1/pDP 34/GAPFL-YHIR의 세포를 각각
디프코 효모 질소 염기 6.7g/1
아스파라진 10g/1
루이신 1g/1, 및
글루코즈 20g/1로
구성된 10ml 최소 배지의 2개의 연속 예비 배양물 중에 생장시킨다.
첫 번째 예비배양물을 28℃ 및 180 r.p.m.에서 60시간 동안 생장시킨다. 두 번째 예비배양물을 2% 첫 번째 예비배양물을 28℃ 및 180r.p.m에서 24시간동안 배양한다.
주배양배지는
효모 추출물 49g/1,
글로코즈 5g/1,
프럭토즈 57g/1,
NHNO0.5/1,
MgSo×7HO 1.0g/1,
CaCo5.0g/1, 및
Ca(PO)2.0g/1로 이루어진다.
주 배양물을 약 2×10 개 세포/ml로 접종하고 28℃ 및 180r.p.m.에서 72시간동안 항온처리한다. 발효종결시 약 1×10 개 세포/ml를 수득한다. 배양물의 발효 분취물을 취하는 동안 수회의 시간대에서, 원심분리하여 세포를 제거하고 배양 상등액을 데설파토히루딘에 대하여 HPLC(하기 참조) 분석한다.
[실시예 17]
501 규모로서의 데설파토히루딘 변이체 HVl의 생성
2-미크론이 없는 균중 삭카로마이세스 세레비지애 H449 kex1/pDP34/GAPFL-YHIR의 워킹 셀 뱅크(working cell bank)를 501 규모의 데설파토히루딘을 생성하기 위한 접종원으로 사용하였다.
워킹 셀 뱅크의 앰풀을 액체 질소 용기중의 수증기상으로 보존한다. 앰풀 1개의 용량을 사용하여 효모 질소염기 8.4g/l, L-아스파라진 일수화물 11.4g/l, L-히스티딘 1.0g/l, L-루이신 0.1g/l 및 D-글루코즈 일수화물 20.0g/l로 구성된 선별배지를 함유하는 진탕 플라스크 배양물을 접종한다.
500ml들이 플라스크에 100ml의 배지를 함유시키고 180회전/분의 속도로 궤도 진탕기 상에서 28℃에서 48시간 동안 항온처리한다.
두 번재 진탕 플라스크 예비 배양물은 4개의 배플을 가진 21플라스크에 함유된 동일 배지 600ml에 함유시킨다. 첫 번째 예비 배양물로부터의 접종 수준은 5%(30ml)이고, 플라스크를 궤도 진탕기에서 120회전/분의 속도로 28℃에서 48시간 동안 항온처리한다.
세 번째 예비 배양물을 4개의 배플 및 직경이 115mm인 단일 디스크 터빈 교반기가 장치된 501등의 스테인레스강 바이오리액터중에서 발효시킨다. 상기의 배진느 이러한 배양에도 사용되며, 출발용적은 301이다. 600ml 배앙물을 함유하는 단일의 21들이 플라스크를 사용하여 501들이 반응기를 접종한다(2%). 발효는 28℃에서 약 42시간동안 지속한다. 교반기 속도는 600회전/분이고 통기율은 1vvm이며 반응기는 0.3bar의 초과압력으로 작동시킨다.
공급-뱃치 과정을 위하여 추가로 장치된 유사한 501들이 바이오리액터를 데설파토히루딘 생성 단계에 사용한다. 육류 펩톤(Merck) 5.0g/l, 효모추출물 30.3g/l, 황산 암모늄 6.0/l, 황산 마그네숨 6수화물 1.0g/l, 염화나트륨 0.1g/l, 칼륨 디하이드로겐포스페이트 1.0g/l 및 D-글로코즈 일수화물 10.0g/l로 이루어진 배지를 이 단계(301)에 사용한다. 세 번째 예비배양 단계로부터의 접종 수준은 임의로 2%이다. 발효를 28℃에서 40시간 동안 지속하고 교반기 속도는 750회전/분에 맞춘다. 초과 압력은 초기에 0.3bar에 맞추지만, 20% 포화도이상의 용존 산소 장력을 유지하기 위하여 발효 과정동안 1.0bar로 상승시킬 수 있다.
초기의 통기율은 0.25vvm이지만 적당한 산소공급을 보장하기 위하여 9시간 경과후 1vvm으로 증가시킬 수 있다.
발효의 초기동안 pH 값은 5.0으로 떨어지며 수산화암모늄을 자동공급하여 유지한다.
단순 뱃치 배양에서 생체량 수준이 달성되고, 결과적으로 데설파토히루딘 역가는 초기에 발효기 중에 뱃칭되는 탄소원의 양에 좌우된다. 이어서 바이오리액터의 상소 전이능을 조절하고 생장하는 효모에 의한 과중한 에탄올 생성을 피하도록 한다. 이러한 제한 조건들은 공급-뱃치 기술로 극복될 수 있다. 즉 매우 소량의 글로코즈가 출발배주중에 포함되지만 글루코즈의 공급은 상당히 높은 최종 생체량 농도 및 뱃치 배양에서 도달되는 데설파토히루딘 역가의 약 3배가 되게 지지한다. 실시에 있어서 단계적인 방법에서 공급량은 간헐적으로 증가하여 글로코즈 일수화물의 최종 공급 속도는 175g/h가 증가된다.
실리콘-계 소포제를 소량 가하여 필요한 경우 거품 생성을 조절한다. 발효기로부터의 배기 가스의 일부를 분석하여 산소 흡수 및 이산화탄소 방출률에 대한 자료를 수득한다. 멸균 전극을 사용하여 용존 산소장력을 직결 측정한다.
과정 전반에 걸쳐서 6시간 간격으로 샘플을 회수하여 생물학적 분석 및 HPLC에 의하여 글로코즈 및 에탄올 농도, 데설파토히루딘 역가를 모니터링하고, 멸균도도 점검한다. HPLC로 증명된 바와 같이 생성된 데설파토히루딘은 필수적으로 C-말단이 단축된 동족체가 없다. 발효과정의 말기에서 배양 상등액으로부터 데설파토히루딘을 회수할 수 있다.
[실시예 18]
501규모로 배양한 삭카로마이세스 세레비지애로부터 데설파토히루딘의 회수
배양 브로쓰(실시예 17)을 앰버라이트(Amberlite)XAD-7과 혼합하여 25℃에서 약 4시간동안 흡착시킨다. 칼럼중의 수지로부터 세포를 분리한다. 1M NaCl로 세척한 후 수지를 트리스 완충액(50mM, pH 7.0 내지 8.5)으로 용출시킨다. 주분획(301)의 pH를 2.9로 조절하고 21의 베드 용적을 갖는 S-세파로스컬럼(Amicon PA, 암모늄 포미에이트 완충액 25mM(pH 2.9)로 평형시킴)에 적용한다. 암모늄 포미에이트 완충액(40mM, pH 3.6)으로 세척한 후, 암모늄 포이메이트 완충액(50mM, pH 3.8)으로 용충시킨다.
Ω 3K 막이 장치된 Filtron Minisette 환외여과 시스템을 사용하여 주용출물 분획(101)을 농축한다. 생성 단백질 청정용액의 0.5l분취량을 1.5l의 베드 용적을 갖는 Bio-GelP-6 미세컬럼(0.5% 아세트산으로 평형시킨 Amicon GF)에 적용한다. 0.5%아세트산을 사용하여 용출을 수행한다. 주용출물 분획(1l)을 한외여과하여 농축하고 이어서 2l의 베드 용적을 갖는 Q-세파로즈 고속 유동 칼럼(Amicon PA, 암모늄 포미에이트 완충액 25mM(pH 2.9)로 평행시킴)에 적용한다. 암모늄 포미에이트 완충액(50mM pH 4.2)으로 용출시킨다. 한외여과하여 주용출물 분획을 농축하고 이어서 물에 대하여 투석여과한다. 생성된 청정 수용액을 동결건조한다. 고체는 검출할만한 양의 C-말단이 단축된 동족체가 없는 단순한 데설파토히루딘으로 구성된다.
[실시예 19]
삭카로마이세스 세레비지애 H449중의 PRA1 유전자의 파괴
삭카로마이세스 세레비지애 균주 H449(DSM 4413; prb, leu2, ura3, cir°)을 유전자 파괴에 의하여 다중-프로테아제 결손 균주로 만든다. 감수분열성 교배에 비해 유전자 파괴는 주어진 균주의 유전자학 배경을 동일하게 유지하면서 돌연변이를 안정하게 유도할 수 있다는 이점이 있다.
제1단계로, PRA1 유전자[참조문헌 : Ammerer, G. et al. (1983) Mol, Cell. Biol. 6, 2490]의 파괴를 통하여 프로테이나제 yscA 활성을 제거한다. 완전한 게놈성 효모 DNA로부터 PRA1을 분리하여 SocI 및 PstI로 분해한다. 예비 0.6%가 아가로스 겔로부터 2kb 단편을 분리하여 전기용출하고 pUC19의 폴리링커 영역의 PstI-ScaI부위에 연결한다. 백터를 이. 콜라이 JM 109에 형질전환시키고 280개의 개별적인 콜로니를 선택한다. 콜로니를 LB amp 배지를 함유하는 미세역가 평판의 웰중에 개별적으로 생장시킨다. 필수적인 문헌[참조 : Woods, D.E. et al.(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5651]에 기술된 바와 같이 공개된 PRA1 서열(Ammerer et al. 상기 참조)로부터 유도된 P-표지판 올리고뉴클레오티드 탐침 5`-AAGCCTAGTGACCTAGT-3'와 콜로니를 하이브리드화 시킨다. 3개의 양성 클론을 선택하고, 하나의 -pUC19/PRA1-의 DNA를 ScaI 및 XhoI로 절단하고 전체 PRA1 유전자를 하유하는 1.9kb 단편을 블루스크립트 백터 M13+(Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA)의 KS 폴리링커 영역에 아클로닝시킨다. 전체 URA3 유전자[참조문헌 : Rose, M. et al. (1984) Gene 29, 113]를 함유하는 1.2kb HㅇⅢ 단편을 PRA1-삽입물의 암호화영역내의 유일한 HindⅢ부위 내에 삽입시킨다. 생성 플라스미드를 M13+/pral: :URA3으로 명명한다. M13+/pral: :URA3을 SacI/XhoI로 분해하고 백터로부터 3.1kb 단편을 분리시키지 않은채로 전술한 바와 같이(실시예 3 참조) 삭카로마이세스 세레비지애 H449를 형질전환시킨다. 우라실 독립성 형질전화체를 선택하여 DNA를 제조하고 SacI/XhoI 분해한후 서던 블롯팅에 의해 PRA1 유전자가 정확하게 파과되었는지 점검한다. PRA1과 하이브리드화된 SacI/XhoI 단편이 1.9kb에서 3.1kb로 정확하게 쉬프링(Shift)된 형질전환체를 Tr 1186으로 명명한다.
다음 단계로, pral: :URA3에 의해 PRA1 유전자가 파괴된 Tr1186을 다시 pral: :URA3 유전자 삽입물 내에 결실을 유도하여 우라실 종속 균주로 만든다. Tr 1186을 URA3 유전자내 200bp 결실된 플라스미드 pUC 12 ura 3delta[참조문헌 : Sengstag, C. et al.(1987) Byckeuc Acids Research 15, 233] 10㎍와 함께 플라스미드 YEp[참조문헌 : Broach, J.R. et al.(1979) Gene 8 121]1㎍으로 형질전환시킨다. 3000개의 루이신 독립 영양성 효모 형질전환체를 소형진탕 플라스크 중의 5ml최소배지(2% 글루코즈, 0.1%루이신, 0.1% 우라실 및 0.25% 플루오로오로트산을 가한, 아미노산이 없는 디프코 효모 질소염기)중에 재현탁시키고 30℃ 및 180rpm에서 60시간 동안 배양한다. 생장하는 형질전환체는 독성 동족체 플로오로오로트산에 내성이며 따라서 pral:URA 3 영역이 ura3delta로 치환된다. 생장 세포를 펩톤 20g/1, 효모 추출물 10g/l 및 글로코즈 20g/l로 구성된 완전한 배지상에 플레이팅하고 30℃에서 48시간 동안 생장시킨 후에 최소 배지(2% 글루코즈 및 0.1% 루이신으로 보충된, 아미노산이 없는 디프코 효모 질소염기)상에 레플리카-플레이팅하여 우라실 영양 요구체를 탐지한다. 수개의 우라실 영양요구체를 선택하여 루이신 영양 요구성을 부여하는 플라스미드 YEp13이 상실되었는지를 시험한다. 루이신 및 우라실을 요구하는 콜로니(Tr 1195로 명명) 각각 하나를 선택하여 추가의 시험에 사용한다.
[실시예 20]
Tr1195중의 PRC1의 파괴
다음 단계로, Tr1195중의 카복시펩티다제 yscY 활성을 제거한다. yscY를 암호화하는 PRC1[참조문헌 : Rothman, J.H. et al. (1986) Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 83, 3248]을 동원체 벡터 pUC19[참조문헌 : Sengstag, C. et al. (1978) Nucleic Acids Research 15, 23]중의 효모 게놈성 라이브러리로부터 PRC1 암호화서열 5' 및 3'말단에 상응하는 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 5'-GAAAGCATTCACCAGTTTA-CTATGTGG-3' 및 5'-CGAATGGATCCCAACGGGTTTCTCC-3'와 콜로니 하이브리드함으로써 분리한다. 하나의 양성 클론을 pCs19/cpy 8로 명명한다. pCS19/cpy8 DNA를 ClaI/PvuII로 분해하고 0.6% 예비 아가로스겔 상에 부하하고 2.6kb 단편을 분리한 후 전기용출시킨다. 완전한 PRCI 유전자를 함유하는 상기의 ClaI/PvuII 단편을 pUC 19의 NarI/SmaI 부위에 추가로 아클로닝시킨다. 생성 플라스미드 pUC19/PRC1을 1.2kb URA3 단편(실시예 19참조)이 연결되는 유일한 StuI 부위에서 절단한다. 이러한 목적을 위하여, 단편을 함유하는 URA3의 HindⅢ 점성말단을 클레노우DNA 폴리머라제와 반응시켜 충전하여 pUC/PRC1의 평활 말단 StuI-부위로 맞춘다.
생성 플라스미드 pUC19/prc: :URA3를 AatII로 분해하고 벡터로부터 AatII 단편을 분리시키지 않은채로 상술한 바와 같이 삭카로마이세스 세레비지애 Tr1195를 형질 전환시키는데 사용한다. 하나의 우라실 독립성 형질전환체-Tr1206-올 서던 블롯팅에 의하여 PRC1 유전자가 정확하게 파괴되었는지를 시험한 후에 상술한 바와 같이(실시예 19 참조) 다시 우라실 의존성 균주로 만든다. 생성된 삭카로마이세스 세레비지애 균주를 Tr1210(pra1, prb1, ura3, leu2, cir°)으로 명명한다.
[실시예 21]
삭카로마이세스 세레비지애 Tr1210의 kex1 변이체의 제조
상술한 바와 같이(실시예 14 참조)게놈성 KEX1유전자를 파괴하여 삭카로마이세스 세레비지애 균주Tr1210으로부터 카복시펩티다제 yscα 활성을 제거한다. 생성된 삭카로마이세스 세레비지애 균주는 yscα의 프로테아제 활성을 나타내지 않으며 Tr1302(pra1,prb1,prc1,ura3,leu2,cir°,kex1)로 명명한다.
[실시예 22]
히루딘 돌연변이체 HV1-KR, HV1-SFRY, HV1-WQLR의 작제
상이한 C-말단 아미노산을 갖는 이종단백질의 yscα-중재된 C-말단성 분해를 더 자세히 평가하기 위하여, C-말단 아미노산 조성이 상이한 히루딘 돌연변이치에를 만든다. 일반적인 방법으로서, 문헌[참조 : Bio-Rad Muta-Gene M 13 Kit, Bio-Rad, Richmind, Ca. USA]에 기술된 바와 같은 원리로 부위-지시된 시험관내 돌연변이유발방법을 사용한다.
하기의 돌연변이체가 작제된다.
1. [Lys -Arg ]히루딘 변형제 1에 상응하는 HV1-KR
2. [Ser -Phe -Arg Try ]HV1-SFRY
3. [Trp -Glu -Leu -Arg ] HV1에 상응하는 HV1-WQLR.
모든 히루딘 돌연변이체의 아미노산 서열은 아미노산 61 또는 63까지는 각각 히루딘 변이체 1의 서열과 일치한다.
HV1-SFRY에 C-말단은 심방의 나트륨 배출성 펩타이드[참조문헌 : Vlasuk et al. (1986) J. Biol. Chem. 261, 4789-4796]와 일치하며 HV1-WQRL에서 C-말단은 표피 생성인자 [참조문헌 : George-Nascimento, C. et al.(1988) Biochemistry 27, 797-802]와 일치하며, 이들은 둘다 프로테아제-하뮤 야생형 효모 균주에 의해 C-말단이 분해되는 것으로 알려져 있다.
제1단계로, 플라스미드 pJDB207/GAPFL-HIR(유럽특허원 제225633호)을 SalI-HindⅢ로 분해하여 완전한 길이의 히루딘 발현 카세트를 함유하는 1.2kb 단편을 수득한다. 1.2kb SalI-HindⅢ 단편을 SK폴리링커와 함께 SalI-HindⅢ 절단 블루스크립트 M.13+에 아클로닝시킨다. 생성플라스미드 M13+/HV1룰 성가에소 가슐헌 벙허 겉아(Bio-Red Mute-Gene M 13 kit) 우라실을 호입시키기 위하여 이.콜라이 CJ 236에 형질감염시킨다. M13헬퍼 파이지(stratagene, 상기 참조)를 사용하여 형질 감영된 이.콜라이 C 236으로부터 일본쇄 DNA 분리한다.
HV1-KR을 작제하기 위하여, 돌연변이원성 프라이머 5'-CCGGAAGAATACAAGAGGTAGG-ATCCT-3'을 사용한다.
HV1-SFRY을 작제하기 위하여, 돌연변이원성 프라이머 5'-GAAGAAATCCCGGAATCTTTCAG-ATACTAGGATCCAGGTACG-3'을 사용한다.
HV1-WQLR을 작제하기 위하여, 돌연변이원성 프라이머 5'-GAAGAAATCCCGGAATGGGAACT-GAGATACGATCCTGGTACG-3'을 사용한다.
200pmol의 각각의 프라이머를 3μ1 1M 트리스-HC1(pH 8.0), 0.3μ1 1M 1MgCl, 0.75μ1 0.2M DTT 및 0.6μ1 20mM ATP를 함유하는 총 용적 30μ1중에서 먼저 포스포릴화한다. 4.5단위의 T폴리뉴클레오티드키나제를 가하고 혼합물을 37℃에서 45분간 및 65℃에서 10분간 항온처리한다.
이어서, M13+/HV1으로부터 유도된 DNA를 함유하는 0.1pmol의 우라실을 2pmol의 포스포릴화된 프라이머 각각 총 용적 10μ1의 어닐링 완충액(20mM트리스-HC1(pH 7.4), 2mM MgCl, 50mM NaCl)중에서 항온처리하는 조건하에 포스포릴화된 올리고뉴클레오티드를 주형 DNA와 어닐링시킨다. 혼합물을 수욕중에서 80℃로 가열하고 이어서 주위온도에 도달할 때까지 서서히 냉각한다.
이어서, 10yscα의 각각의 어닐링 혼합물을 4μ1 2mM dNTP, 0.75μ1 120mM ATP, 0.75μ 1 0.5M 트리스-HCl pH 7.4, 0.75μ 1 0.1M MgCl, 2.15μ 1. 0.2M DTT, 1단위 DNA 폴리모라제 및 2단위 TDNA 리가제와 함께 항온처리하는 조건하에서 상보적본쇄가 형성된다. 반응 혼합물을 먼저 빙상에서 5분간, 이어서 25℃에서 5분간 및 최종적으로 37℃에서 90분간 홍온처리한다. 생성된 2본쇄 DNA를 우라실-함유주형을 효율적으로 제거하고, 돌연변이원화된 상보적본쇄가 복제되게 하는(Bio-Rad, 상기 참조)균주 이.콜라이 JM 101에 형질 전환시킨다. 플라스미드를 제조하여 돌연변이 유발성화 되지 않은 야생형HV1 DNA의 마지막 2코돈에만 존재하는 PstI 부위가 존재하지 않음을 점검한다.
돌연변이원성 프라이머의 약 20bp업스트림의 히루딘 암호화 서열에 상응하는 프라이며 5'-GAAGGTACCCCGAAACCGAC-3'을 사용하여 새로운 히루딘 돌연변이체를 서열화 분석함으로써 정확한 돌연변이 유발이 이루어졌는지 추가로 확인한다.
최종적으로 3개의 돌연변이유발성화된 SalI-HindIII 단편을 블루스크립트 M13+으로부터 절단하고 pJDB207상의 SalI-HindIII 부위 내에 재연결한다.
3개의 신생 플라스미드를 하기와 같이 명명한다.
1. pJDB207/GAPFL-HV1-KR
2. pJDB207/GAPFL-HV1-SFRY
3. pJDB207/GAPFL-HV1-WQLR
다른 방법으로, Tr1302(실시예 21, 상기 참조)와 같은 Cir°균주를 형질 전환시킬 수 있도록, 히루딘 돌연변이체를 완전한 2 미크론 벡터 pDP34(실시예 9 참조, 상기)에 아클로닝시킨다. pDP34를 유일한 BamHI 부위에서 절단하고 점성 말단을 클레노우 DNA폴리머라제로 충전시켜 평활말단을 만든다. 돌연변이된 히루딘 서열(상기)을 암호화하는 블루스크립트 M13+로부터의 SalI-HindIII단편도 평활말단으로 만들고 pDP34의 평활말단(BamHI)부위에 연결시킨다. 생성 플라스미드는 하기와 같이 명명한다.
1. pDP34/GAPFL-HV1-KR
2. pDP34/GAPFL-HV1-SFRY
3. pDP34/GAPFL-HV1-WQLR
[실시예 23]
pJDB 207/GAPFL-HIR, pJDB 207/GAPFL-HV1KR, pJDB 207/GAPFL-HV1-SFRY 및 pJDB 207/GAPFS-HV1-WQLR을 사용한 삭카로마이세스 세레비지애 균주 BYSKEX1 및 BYSkex1의 형질전환 및 pDP 34/GAPFL-HV1-KR, pDP34/GAPFL-HV1-SFRY 및 pDP 34/GAPFL-HV1-WQLR을 사용한 삭카로마이세스
세레비지애 균주 Tr 1210 및 Tr 1302의 형질 전환
표준방법 및 루이신 선별(실시예 3참조)을 사용하여 pJDB207/GAPFL-HV1- KR, pJDB207/GAPFL-HV1-SFRY, pJDB207/GAPFL-HV1-WQLR, pJDB20
7/GAPFL-HV1-HIR을 삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1(=DSM 4583) 및 BYSkex1에 형질전환시킨다. 동일한 방법으로 pDP34/GAPFL-HV1-KR, pDP34/G
APFL-HV1-SFRY 및 pDP34/GAPFL-HV1-WQLR을 삭카로마이세스 세레비지애 균주 Tr1210 및 Tr 1302에 형질 전환시킨다.
생성 균주는 하기와 같이 명명한다.
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HIR
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HB1-KR
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HB1-SFRY
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HV1-WQLR
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HIR
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HV1-KR
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HB1-SFRY
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HV1-WQLR
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HV1-KR
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HV1-SFRY
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HV1-WQLR
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HV1-KR
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HV1-SFRY
삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HV1-WQLR
삭카로마이세스 세레비지애 균주의 발효는 상술한바와 같이 (실시예 17 참조) 최소배지(예비 배양 및 주배양)중에서 수행한다.
[실시예 24]
삭카로마이세스 세레비지애 형질전환체 BYSkex1 및 BYSKEX1의 발효 배양으로부터 수득한 히루딘 변이체 HV1 및 이의 돌연변이체의 역상 HPLC 분석
72시간 동안 발효시킨후 효모 액체 배양물로부터의 샘플을 원심분리에 의해 제조하여 청정용액을 생성시켜서 아세트산으로 1 : 10(v/v)으로 희삭시키고 하기의 조건하에서 HPLC 분석한다.
HIBAR(MERCK) 칼럼(4×125mm)을 입자 직경이 5㎛이고 공극이 100A인 구형 정지상(구형 실리카 물질 MACHEREYNAGEL) 역상으로 채운다. 칼럼 말단에 스테인레스 강프릿을 장치한다. 0.1%(v/v)트리플루오로아세트산을 함유하는 물(Nanopure
Figure kpo00005
, BARNSTEAD)로부터 이동상 A를 만든다. 20%의 이동상 A 및 0.75%(v/v)의 트리플루오로 아세트산을 함유하는 80%(v/v)의 아세토니트릴(HPLC-grade, FLUKA)로부터 이동상 B를 만든다.
유동속도 1.5ml/분에서 하기의 구배로 수행하여 크로마토그래피하고 216nm에서의 흡광도에 의해 용출을 모니터링한다.
Figure kpo00006
1mg의 순수한 데설파토히루딘을 1ml의 물에 용해시켜 시스템 측정용 표준 용액을 만든다. 50μ1의 상기 표준 용액을 칼럼에 주사하고 시스템을 측정하기 위하여 기술된 바와 같이 크로마토그래피한다.
제8도는 삭카로마이세스 세레비지애 BYSkex1이 삭카로마이세스 세레비지애 BYSKEX1에 의해 생성되는 히루딘 분해 생성물과는 다른 잔류 시간을 갖는 전-길이의 히루딘(히루딘 HV1 야생형 또는 돌연변이체 HV1-KR, HV1-SFRY, HB1-WQLR)을 생성함을 나타내는 결과이다. 야생형 히루딘 HN-1은 BYSKEX1에서 전-길이의 HV-1(잔류시간 17.05분) 및 2개의 분해 생성물 HIR-64(잔류시간 17.05분)을 생성한다. 돌연변이체 HV1-KR의 경우, BYSkex1은 전-길이의 HV-1KR(잔류 시간 14.4분)을 생성하나, BYSKEX1은 2개의 C-말단 아미노산이 결여된 분해 생성물(=HIR-63, 잔류시간 15.9분)을 전적으로 생성한다. 돌연변이체 HV1-WQLR의 경우, BYSKEX1은 잔류시간 18.6분의 분해 생성물을 나타내며, BYSkex1은 주로 전-길이의 HV1-WQLR(잔류시간 17.3분) 및 단지 소량의 분해 생성물을 생성한다. BYSkex1에서 전-길이의 HV1-SFRY는 단지 소량(잔류시간 17.1분)이며 단지 온전한 HV1-SFRY는 단지 소량(잔류시간 17.1분)이며 단지 온전한 HV1-SFRY(잔류시간 17.1분)을 나타낸다. 커다란 피이크(peak)(잔류시간 15.7분)은 HV1-SFRY와 관계되지 않는다.
KEX1 삭카로마이세스 세레비지애 균주 Tr1210/pDP34/GAPFL-HV1-KR, Tr1210/pDP34/GAPFL-HV1-SFRY 및 Tr1210/pDP34/GAPFL-HV1-WQLR를 상응하는 kex1 균주 Tr1302/pDP34/GAPFL-HV1-KR, Tr1302/pDP34/GAPFL-HV1-SFRY 및 Tr1302/pDP34/GAPFL-HV1-WQLR와 비교시, 유사한 결과를 수득한다.
미생물 기탁
하기 미생물 균주를 DSM(Deutsche sammlung von Mikroorganismen; Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig)에 기탁하였다(기탁 날짜 및 기탁 번호를 깆함) : 삭카로마이세스 세레비지애 H449 : 1988년 2원 18일 기탁, DSM 4413 : 에스케리 키아 콜라이 JM109/pDP38 : 1988년 2월 19일 기탁, DSM 4414; 에스케리아 콜라이 JM109/pDP34 : 1988년 3월 14일 기탁, DSM 4473; 삭카로마이세스 세레비지애 BYS232-31-42: 1988년 5월 6일 기탁 DSSM 4583.

Claims (19)

  1. 이종(heterologous)단백질을 암호화하는 DNA서열에 작동적으로 연결된 효모 프로모터를 함유한 하이브리드 벡터로 형질전환되고 카복시펩티다제 ysc α 활성이 결여된 효모 균주.
  2. 제1항에 있어서, 하이브리드 벡터가, 이종 단백질을 암호화하는 제2DNA 서열에 적절한 판독 프레임으로 연결된 시그날 펩타이드를 암호화하는 제1DNA 서열에 작동적으로 연결된 효모 프로모터 및 효모 전사 종결 시그날을 갖는 DNA 서열을 함유하는 효모 균주.
  3. 제2항에 있어서, 이종 단백질이 데설파토히루딘인 효모 균주.
  4. 제1항에 있어서, yscA, yscB, yscY 및 yscS 활성으로 이루어진 그룹중에서 선택된 펩타다제 활성이 추가로 결여된 효모 균주.
  5. 제1항에 있어서, 본래의 REP1,REP2 및 FLP 유전자와 본래의 ORI, STB, IR1 및 IR2부위가 포함된 완전한 2-미크론 DNA를 함유한 하이브리드 벡터로 형질전환되고 내인성 2-미크론 DNA가 없는 효모 균주.
  6. 제5항에 있어서, yscA, yscB, yscY 및 yscS 활성으로 이루어진 그룹중에서 선택된 펩티다제 활성이 추가로 결여된 효모 균주.
  7. 제1항에 있어서, 하이브리드 벡터가, MFα1프로모터, GAL1프로모터, 당분해 효소를 암호화하는 유전자의 프로모터, ADHI 프로모터, TRPI 프로모터 및 업스트림 활성화 부위(upstream activation site)를 임의로 제거시킨 PH05 프로모터로 이루어진 그룹중에서 선택된 효모 프로모터를 함유하는 효모 균주.
  8. 제2항에 있어서 하이브리드 벡터가 히루딘 시그날 서열, 효모 인버타제(invertase)의 시그날 및 프리프로(prepro) 서열, α-인자, 페로몬 펩티다제(KEX1), 킬러 독소(killer toxin) 및 억제성 산 포스파타제(PH05) 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택된 제1DNA서열 및 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)의 글리코아밀라제 시그날 서열을 함유하는 효모 균주.
  9. 제2항에 있어서, 하이브리드 벡터가 데설파토히루딘 변이체 HV1, HV1(변형 a, b), HV2, HV2(변형 a, b, c), PA, PA의 변치에 및 데스(Val2)-데셀파토히루딘으로 이루어진 그룹중에서 선택된 데설파토히루딘 화합물을 암호화하는 제2DNA서열을 함유하는 효모 균주.
  10. 제1항에 따른 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)균주.
  11. 카복시펩티다제 yscα 활성이 결여된 효모 균주를 하이브리드 벡터로 형질전환시킴을 특징으로 하여, 제1항에 따른 형질전환된 효모 균주를 생성하는 방법.
  12. 이종 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 효모 프로모터를 함유하는 하이브리드 벡터로 형질전환되고 카복시펩티다제 yscα 활성이 결여된 효모균주를 배양하고, 이로부터 이종 단백질을 분리시킴을 특징으로 하여, 효모에 대한 이종 단백질을 생성하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 하이브리드 벡터가, 이종 단백질을 암호화하는 제2DNA서열에 적절한 판독프레임으로 연결된 시그날 펩타이드를 암호화하는 제1DNA서열에 작동적으로 연결된 효모 프로모터 및 효모 전사 종결 시그날을 암호화하는 DNA 서열로 이루어진 방법.
  14. 제12항에 있어서, 이종 단백질이 카복시펩티다제 yscα에 의해 해독후 C-말단 분해에 쉽게 작용을 받게 되는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 이종 단백질의 2개의 C-말단 아미노산이 Lys, Arg, Tyr, Ala, Leu, Gln, Glu, Asp, Asn 및 Ser로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 이종 단백질이 데설파토히루딘인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 데설파토히루딘 화합물이 데설파토히루딘 변이체 HV1, HV1(변형 a, b), HV2, HV2(변형 a, b, c), pA, PA의 변이체 및 데스(val2)-데설파토히루딘으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 데설파토히루딘 화합물이 데설파토히루딘 변이체 HV1인 방법.
  19. 서열식(4)의 데설파토히루딘.
    X1Tty Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Ley Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn X3Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly X3Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro X4Pro Gln Ser X5Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu X6
    (Ⅳ)
    상기식에서, X1은 디펩타이드 잔기 Val-Val이고, X2, X3및 X4는 Lys이며, X5는 HIs이고, X6은 Glu-Tyr-Lys-Arg, Ser-Phe Arg-Tyr 및 Trp-Glu-Leu-Arg로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
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