FI90352B - Menetelmä heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmä Yarrowia lipolytica -transformanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi sekä menetelmä transformanttien valmistamiseen käyttökelpoisten plasmidien valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmä Yarrowia lipolytica -transformanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi sekä menetelmä transformanttien valmistamiseen käyttökelpoisten plasmidien valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI90352B
FI90352B FI864206A FI864206A FI90352B FI 90352 B FI90352 B FI 90352B FI 864206 A FI864206 A FI 864206A FI 864206 A FI864206 A FI 864206A FI 90352 B FI90352 B FI 90352B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
fragment
lipolytica
gene
plasmid
dna
Prior art date
Application number
FI864206A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI90352C (fi
FI864206A (fi
FI864206A0 (fi
Inventor
Lance Steven Davidow
John Robert Dezeeuw
Arthur Ernest Franke
Original Assignee
Pfizer
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer filed Critical Pfizer
Publication of FI864206A0 publication Critical patent/FI864206A0/fi
Publication of FI864206A publication Critical patent/FI864206A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI90352B publication Critical patent/FI90352B/fi
Publication of FI90352C publication Critical patent/FI90352C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Description

90352
Menetelmä heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmä Yarrowia lipolytica -transformanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi sekä menetelmä transformanttien valmistami-5 seen käyttökelpoisten plasmidien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmää Yarrowia lipolytica -transit) formanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi sekä menetelmä transformanttien valmistamiseen käyttökelpoisten plasmidien valmistamiseksi. Kuvataan siis hiivojen prote-linieritykseen liittyvää tekniikkaa. Tarkemmin määriteltynä keksintö koskee Yarrowia lipolytica -yhdistelmäkloo-15 nausvektoreita, jotka sisältävät heterologista DNA:ta, joka koodaa nisäkäsproteiinin (esimerkiksi prokymosiinin) ja muiden polypeptidien tuotantoa ja erittymistä; ja il-mentymisvektoreita, jotka sisältävät Y. lipolytica -gee-nipromoottorin (esimerkiksi XPR2:n tai LEU2:n), alkalisen 20 proteaasin signaali-(eli pre-)sekvenssin, pro-alueen ja XPR2-terminaattorialueen ja niiden variantteja ja funktionaalisia ekvivalentteja, jotka syntyvät geneettisen koodin degeneratiivisyyden tai muun Y. lipolytica -geeni-komponentin käytöstä. Lisäksi se koskee hiivatransfor-25 mänttejä, jotka sisältävät mainittuja ilmentymis- ja erittymisvektoreita, niiden käyttöä luonnollisessa, funktionaalisessa tilassaan olevien heterologisten proteiinien tuotantoon; ja menetelmiä edellä mainittujen aikaansaamiseksi .
30 Erilaisten teollisuudelle (esimerkiksi prorenniini ja naudan kasvuhormoni) tai lääketieteellisiin tarkoituksiin (esimerkiksi urogastroni, kudosplasminogeeniakti-vaattori ja ihmisen anafylatoksiini C5a) arvokkaiden proteiinien tai polypeptidien pysyvän ja riittävän lähteen 35 ja erityisesti korkealaatuista tuotetta helposti talteen-otettavassa, funktionaalisessa muodossa tarjoavan lähteen 2 90352 taloudellinen houkuttelevuus on Johtanut monet tutkijat soveltamaan yhdistelmä-DNA-tekniikkaa mikro-organismeihin niiden muuttamiseksi heterologisia proteiineja tuottaviksi "tehtaiksi".
5 Paljon tutkimustyötä on suunnattu proteiinien eri tykseen mahdollisena ratkaisuna vaikeuksiin, joita kohdataan eksogeenisen tai heterologisen (vieraan) proteiinin talteenotossa biologisesti aktiivisessa muodossa yhdis-telmäisäntäsoluissa olevista intrasellulaarisista kerään-10 tyrnistä, erityisesti Escherichia colista. E. colissa he-terologinen proteiini tuotetaan usein solun sisällä vaikeasti käsiteltävien inkluusiokappaleiden muodossa. Mainitun proteiinin vesiliukoisuus on yleensä alhainen ja sen biologinen aktiivisuus on pieni tai olematon. Maini-15 tun proteiinin eristäminen vaikeasti käsiteltävistä in-kluusiokappaleista tapahtuu yleensä voimakkaalla kemiallisella käsittelyllä, joka voi olla kallista ja saattaa johtaa siihen, että saadaan vain vähän tai ei ollenkaan halutussa, luontaisessa, biologisesti aktiivisessa muodo-20 ssa olevaa proteiinia. Lisäksi tarve rikkoa solut vaikeasti käsiteltävien kappaleiden vapauttamiseksi lisää usein mainitun proteiinin mahdollisuuksia kontaminoitua E. colin tuottamilla epätoivotuilla aineilla. E. colin lisäksi muutkin organismit tuottavat liukenemattomassa 25 intrasellulaarisessa muodossa olevaa heterologista proteiinia. GB-patenttijulkaisu 2 091 271, julkaistu 28. kesäkuuta 1982, esimerkiksi käsittelee S. cerevisiaen muuntamista yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla vasikan renniiniä eli kymosiiniä (näitä termejä käytetään tässä toistensa 30 vastineina) tuottavaksi. Näiden vaikeuksien valossa on toiveet suunnattu mainitun proteiinin erittämiseen isän-täorganismista yritettäessä tuottaa luontaisessa, aktiivisessa muodossa olevaa proteiinia.
Se, erittääkö tietty organismi jotakin määrättyä 35 proteiinia, mukaan luettuna heterologinen proteiini tai polypeptidi, näyttää riippuvan tästä proteiinista. Useim- 3 90352 missä eukaryoottisoluissa osa proteiinisynteesilaitteis-tossa liittyy endoplasman retikulumiin ja syntyvän poly-peptidiketjun aminopään lähellä oleva aminohapposekvenssi (jota kutsutaan "signaalisekvenssiksi") ohjaa proteiinin 5 kulkua kalvon läpi. Signaalisekvenssi poistetaan myöhemmin proteolyyttisesti erittymisen aikana, jolloin syntyy aktiivinen valmis proteiini. On tehty lukuisia yrityksiä kehittää menetelmiä heterologisten proteiinien erittämi-seksi signaalisekvenssien avulla mikro-organismeissa, mu-10 kaan luettuina Bacillus subtilis ja Saccharomyces cerevi-siae, ja nisäkässoluviljelmissä. Mainitut organismit eivät kuitenkaan ole osoittautuneet ideaalisiksi.
B. subtilisin luontaiset ominaisuudet, esimerkiksi se, että se erittää monia proteiineja, mukaan lukien lu-15 kuisat proteaasit, joilla on taipumus hajottaa erittynyttä heterologista proteiinia, sekä heterologisen DNA:n häviämisestä johtuva transformoitujen kantojen pysymättö-myys ovat estäneet tämän organismin käytön kehittämisen.
Nisäkässoluja on menestyksellisesti käsitelty ge-20 neettisesti tuottamaan ja erittämään heterologisia proteiineja, mutta nämä järjestelmät ovat teknisesti vaativia ja kalliita käyttää ja ne ovat edelleen epäkäytännöllisiä useimpien proteiinien kaupalliseen tuotantoon.
Vaikka proteiinieritystutkimukset ovat olleet me-25 nestyksellisempiä S. cerevisiaen kuin B. subtilisin yhteydessä, näyttää jopa S. cerevisialle olevan joitakin luontaisia rajoituksia proteiinien erityssysteeminä. EP-hakemusjulkaisussa 123 544, 31. lokakuuta 1984, kuvataan S. cerevisiaen α-tekijägeenien eristämistä ja niiden pro-30 moottori- ja/tai signaalipeptidiosien käyttöä yhdessä hiivalle heterologista proteiinia koodaavan DNA:n kanssa plasmidissa, jolla transformoidaan hiivasolut kykeneviksi tuottamaan erillistä valmista proteiinia soluja viljel-täessä. EP-hakemusjulkaisussa 88 532, 14. syyskuuta 1983, 35 kuvataan menetelmää heterologisen proteiinin tuottamiseksi ja erittämiseksi S. cerevisiaessa. Proteiinien, joita 4 90352 S. cerevisiae erittää tehokkaasti näiden ja muiden eri-tyssysteemien avulla, koko näyttää kuitenkin rajoittuvan noin 20 000 daltoniin. Jotta voitettaisiin tämä S. cere-visiaen yleinen tehottomuus erittämisorganismina, on tar-5 vittu useita mutatiivisia muuntamisia, kuten Smith et ai. [Science 229 (1985) 1219-1224] kuvaavat. Eräs poikkeus tästä suuntauksesta on se havainto, että S. cerevisiae ilmeisesti pystyy erittämään 20 000 daltonia suurempia Aspergillus-entsyymejä, mutta S. cerevisiae glykosyloi 10 voimakkaasti näitä entsyymejä ja tämä saattaa vaikuttaa eritystehoon.
Erityisen kiintoisa on Yarrowia lipolytica, teollisuudessa tärkeä hiivalaji, jota käytetään sitruunahapon ja yksisoluproteiinin tuotantoon. Sitä voidaan käyttää 15 myös erytritolin, mannitolin ja isopropyyliomenahapon tuottamiseen. S. cerevisiaeen verrattuna Y. lipolytica on erityisen kiintoisa ja arvokas, koska sillä on kyky tehokkaasti erittää suurimolekyylisiä proteiineja (alkalista fosfataasia, hapanta proteaasia ja RNA:aasia) kasvu-20 alustaansa ja se saattaa siten mahdollistaa luonnollisessa tilassa olevien heterologisten proteiinien talteenoton ilman tarvetta rikkoa tuottavia soluja. Lisäksi Y. lipolytica erittää hyvin harvoja proteiineja merkittävinä määrinä ja antaa siten mahdollisuuden tuottaa haluttua 25 heterologista proteiinia kasvualustaan vallitsevana pro- teiinilajina ja yksinkertaistaa mainitun heterologisen proteiinituotteen talteenottoa.
Y. lipolytica tuottaa suuria määriä solun ulkopuolista proteaasia. Tämä on pääasiallinen Y. lipolytican 30 erittämä proteiini. Kulloinkin kyseessä oleva proteaasi (alkalinen, hapan tai neutraali) riippuu käytettävästä Y. lipolytica -kannasta [Ogrydziak et ai., J. Gen. Microbiol. 128 (1982) 1225-1234]. Ogrydziak et ai. (loc. cit.) kuvaavat alkalisen ekstrasellulaarisen proteaasin N-ter-35 minaalisen aminohapposekvenssin osittaista sekvenssiana lyysiä.
5 90352
Vireillä olevassa rinnakkaisessa US-hakemuksessa nro 634 505, joka on jätetty 25. kesäkuuta 1984, kuvataan menetelmiä Y. lipolytican transformoimiseksi ja Y. lipo-lytica -geenien kloonaamiseksi mutaatioiden komplemen-5 toinnin kautta. Siinä kuvataan erittynyttä alkalista pro-teaasia koodaavan XPR2-geenin kloonaamista komplementoi-malla Y. lipolytican xpr2-mutaatio. Menetelmään sisältyy Y. lipolytica -isäntäkannan transformointi Y. lipolyti-ca -geenikirjaston osittaisella Bgllll-pilkkomistuotteel-10 la, joka on vektorissa pLD40, jota kuvataan EP-hakemus-julkaisussa 138 508, joka on julkaistu 24. huhtikuuta 1985 ja on edellä mainittua US-hakemusta vastaava hakemus .
Tämä keksintö ei ole tunnettu tekniikan tason pe-15 rusteella. Tekniikan tason kuuluvissa julkaisuissa ei ole kuvattu, miten voidaan muodostaa Y. lipolytican transfor-mointiin soveltuvia ilmentymisvektoreita niin, että saadut transformantit voivat ilmentää ja erittää heterolo-gista proteiinia. Lisäksi, koska XPR-ilmentymisrakenteita 20 ei tunnettu, ei myöskään ole voitu kuvata menetelmiä Y. lipolytica -transformanttien muodostamiseksi, jotka transformantit eivät tuota alkalista proteaasia. Todettakoon vielä, että alan kirjallisuudessa ei myöskään ole kuvattu menetelmiä Y. lipoltica -transformanttien muodos-25 tamiseksi integroimalla ilmentymisvektori Y. lipolytica -transformanttiin, jolla on heterologista DNA:ta vastaanottava kohta, eikä tällaisten transformanttien käyttöä heterologisen proteiinin tuottamiseksi.
Kuten edellä todettiin, EP julkaisussa 138 508 ku-30 vataan menetelmää Y. lipolytican transformoimiseksi, tähän tarkoitukseen sopivia vektoreita ja alaklooneja, E. coli- ja Y. lipolytica -transformantteja, jotka sisältävät em. vektoreita, ja niiden käyttöä proteiinien tuottamiseen. Julkaisussa ei kuitenkaan kuvata eikä ehdoteta 35 ilmentymisvektoreita, jotka sisältävät XPR2-geenin signaali-, prol- tai pro2-sekvenssiä ja joita voidaan käyt- 6 90352 tää Y. lipolytican transformointiin. Siten julkaisussa ei myöskään lainkaan mainita, että tällä tavalla voidaan muodostaa transformantteja, jotka ilmentävät ja erittävät heterologista proteiinia.
5 Ep-julkaisussa 57 350 ei myöskään kuvata, ehdote ta tai mainita XPR2-geenin osaa sisältäviä ilmentymisvek-toreita, joita voitaisiin käyttää Y. lipolytican transformointiin ja näin saada transformantteja, jotka ilmentävät ja erittävät heterologista proteiinia.
10 EP-julkaisussa 88 632 kuvataan tiettyjä menetelmiä hiivalle heterologisten proteiinien ilmentämistä, käsittelemistä ja erittämistä varten. Menetelmät kuitenkin eroavat huomattavasti tässä julkaisussa kuvatuista menetelmistä. Esimerkkinä todettakoon, että menetelmän mukai-15 sesti heterologinen esisekvenssi tai heterologinen sig-naalipolypeptidi täytyy fuusioda heterologiseen proteiiniin kun taas tämän keksinnön mukaisesti homologinen XPR2-geeni tai ainakin sen signaali- prol- tai pro2-sek-venssi lisätään vektoriin. Em. julkaisun mukaisesti siten 20 toimitaan päinvastoin kuin tässä keksinnössä.
Myöskään US-patentissa 4 546 082 ei kuvata miten Y. lipolytican XPR2-geenin osaa sisältävää iImentyrnisvektoria voitaisiin muodostaa tai mihin sitä voitaisiin käyttää. Näin ollen ei myöskään kuvata Y. lipolytican 25 transformointia tällaisella vektorilla tarkoituksena muodostaa transformantteja, jotka ilmentävät ja erittävät heterologista proteiinia. US-julkaisussa 4 546 082 sen sijaan kuvataan Saccharomyces cerevisiaen a-tekijän geeniä ja sen käyttöä.
30 Tämä keksintö tarjoaa menetelmät vektorien valmis tamiseksi, jotka vietyinä Y. lipolytica -isäntään antavat isännälle kyvyn tuottaa ja erittää alustaan spesifisiä proteiineja, joita voi koodata mistä tahansa lähteestä saatu heterologinen DNA, mutta erityisesti eukaryoottinen 35 ja synteettinen DNA; Y. lipolytica -yhdistelmäkloonaus-vektoreita, jotka sisältävät nisäkäsproteiinia ja muita 7 90352 polypeptidejä koodaavaa heterologista DNA:ta, mukaan luettuina Y. lipolytica-isäntien transformointiin soveltuvat plasmidit ja erityisesti integratiiviset ilmenty-misvektorit, jotka sisältävät LEU2-geenipromoottorin, 5 XPR2-geenipromoottorin, alkalisen proteaasin prepro- alueen ja XPR2-terminaattorialueen; ja ilmentymisplasmi-deja, joissa on heterologinen koodausjakso ja XPR2-eri-tyssignaalit LEU2-promoottorin jäljessä ja joilla on kyky saada aikaan heterologisen proteiinin tuotanto ja eritty-10 minen niillä transformoiduissa Y. lipolytica -isännissä.
Keksintö valaisee siten valmiin heterologisen proteiinin ja erityisesti prorenniinin ja ihmisen anafyla-toksiini C5a:n tuottamista ja erittämistä geneettisesti muutettujen Y. lipolytica -solujen viljelmistä. Y. lipo-15 lytican eksosellulaarisen alkalisen proteaasin aminohap posekvenssin samoin kuin sitä vastaavan DNA-sekvenssin tarkka selvittäminen on tehnyt mahdolliseksi päätelmän, että heterologista proteiinia voidaan tuottaa ja erittää soluviljelmä tuotantoon soveltuvilla yhdistelmä-DNA-mene-20 telmillä. Prorenniinin ollessa kyseessä syntyvä ja erittyvä tuote on tsymogeenin (renniinin esiasteen) valmis muoto.
Nyt on havaittu, että Y. lipolyticaa voidaan yh-distelmä-DNA-tekniikan avulla muuntaa geneettisesti sillä 25 tavalla, että saadaan transformantteja, joilla on kyky tuottaa ja erittää luontaisessa muodossaan olevia hetero-logisia proteiineja. Tämä tehdään muodostamalla vektoreita, joissa on XPR2-geenin signaalisekvenssi tai sen sig-naalisekvenssi ja ensimmäinen esisekvenssi (prol) tai mo-30 lemmat esisekvenssit (prol - pro2) kytkettyinä erittyväksi halutun heterologisen proteiinin rakennegeenisekvens-siin.
Transformantit, joita tuotetaan sijoittamalla XPR2-lokukseen vektori-DNA, joka sisältää XPR2-fragmen-35 tin, josta puuttuu geenin molempien päiden alueelta säätely- tai rakennekomponentteja, eivät enää tuota alkalis- β 90352 ta proteaasia, mikä ei ainoastaan ole toivottavaa hetero-logisen proteiinin erityksen kannalta, vaan myös hyödyksi oletettujen transformanttien etsimisessä.
Vektorit, joissa on XPR2-promoottori ja alkalisen 5 proteaasin erityssignaalisekvenssiä vastaavat sekvenssit, pystyvät lisäksi saamaan transformoidussa Y. lipolytica -solussa aikaan valmiin heterologisen proteiinin erittymisen. Jotkut tämäntyyppiset DNA-vektorit pystyvät saamaan aikaan ilmentymisen/erittymisen riippumatta siitä, 10 mihin kohtaan hiivagenomia ne on sijoitettu. Yleensä vektorit, jotka sisältävät riittävästi reuna-DNA:ta 5'- ja 3'-päissä, mahdollistavat tuotteen syntymisen riippumatta integraatiokohdasta.
Lisäksi on yllättävästi ja odottamattomasti ha-15 vaittu, että pBR322-peräisen plasmidin sisällyttäminen Y. lipolytican kromosomi-DNA:hän saa aikaan homologia-alueen, jolla on kyky edistää muuta paikkaohjattua inte-gratiivista transformaatiota. Integroitunut pBR322-kopio toimii siten "telakoitumiskohtana" soluun tulevalle 20 transformoivalle DNA:lie. pBR322-kopion integroituminen Y. lipolytican kromosomi-DNA:han saa siten aikaan tunnetun integroitumiskohteen huolimatta siitä, ettei pBR322 ole luontaista Y. lipolytica -DNA:ta. Y. lipolytica -transformaatiovastaanottajilla, joissa on tällainen koh-25 ta, on kaksi tärkeää etua verrattuna vastaanottajiin, joista tällainen kohta puuttuu; läsnä on paikkaohjatun integraation kohteeksi sopiva alue, jonka sekvenssi ja restriktiokartta tunnetaan; ja käyttämällä pBR322 inte-graatiokohteena on mahdollista määrittää, sisältääkö so-30 luun sijoitettu plasmidi täydellisen funktionaalisen yksikön eli geenin vai vain osan halutusta geenistä. Esimerkiksi plasmidilla, joka sisältää vain 3'-fragmentin XPR2-geenistä, voitaisiin transformoida XPR2-1002-vas-taanottaja, jos se sisältää villiä tyyppiä olevan kodonin 35 ja integroituu XPR2-lokukseen. Samalla plasmidilla ei kuitenkaan voitaisi transformoida XPR2-1002-isäntää pro- 9 90352 teaasipositiiviseksi fenotyypiksi, jos se integroituu pBR322:een, koska siitä puuttuu kokonainen toiminnallinen yksikkö.
Siten Y. lipolytica -transformanteissa, jotka 5 sisältävät homologia-alueen heterologiselle vektori- DNA:lie, toimii mainittu, eksogeenista DNA:ta sisältävä alue vastaanottokohtana mainitun Y. lipolytican integra-tiivisen transformoinnin aikana. pBR322:n ja sen johdosten lisäksi kosmideja, bakteriofageja, kuten M13 ja lamb-10 da-fagia, synteettisesti valmistettua DNA:ta ja tavallisia plasmideja, kuten pUC13, voidaan käyttää telakoitu-miskohdan sisältävien Y. lipolytica -transformanttien tuottamiseen.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle plasmidin pXX-15 33 valmistamiseksi on tunnusomaista, että pilkotaan plas- midi pXHP-24 HindIII:lla ja Aval:llä, jolloin saadaan 1 150 emäsparin fragmentti, eristetään mainittu fragmentti, ligatoidaan mainittu fragmentti synteettisen DNA-fragmen-tin 20 5'CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG 3' 3 * CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTAG 5 ’ kanssa T4-ligaasin läsnä ollessa, pilkotaan siten saatu ligaatiotuote Hindlllrlla ja BamHI:llä, jolloin saadaan 1 25 196 emäsparin fragmentti, eristetään mainittu 1 196 emäs- parin fragmentti, ligatoidaan mainittu 1 196 emäsparin fragmentti 440 emäsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 BamHI:llä ja Xmalillä ja noin 8,0 emäsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla 30 plasmidi pLS3 HindIII:llä ja Xmalrllä, T4-ligaasin läsnä ollessa, transformoidaan E. coli siten saadulla ligaatio-tuotteella, valikoidaan ampisilliiniresistentit transfor-mantit ja eristetään plasmidi pXX-33 mainituista trans-formanteista.
35 Keksinnön mukaiselle menetelmälle plasmidin pXX- 22 valmistamiseksi on tunnusomaista, että pilkotaan plas- >0 352 ίο midi pXHP-24 HindIII:lla ja Bglllrlla, jolloin saadaan 890 emäsparin fragmentti, eristetään mainittu fragmentti, ligatoidaan mainittu fragmentti synteettisen DNA-fragmen-tin 5 5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3 ' 3' AACGACTCTAGTGATCCTAG 5' kanssa T4-ligaasin läsnä ollessa, pilkotaan siten saatu ligaatiotuote Hindlllrlla ja BamHI:llä, jolloin saadaan 10 920 emäsparin fragmentti, eristetään mainittu 920 emäspa rin fragmentti, ligatoidaan mainittu 920 emäsparin fragmentti 440 emäsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 BamHI:llä ja Xmalrllä ja noin 8,0 kiloemäsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla 15 plasmidi pLS3 Hindlllrlla ja Xmalrllä, T4-ligaasin läsnä ollessa, transformoidaan E. coli siten saadulla ligaatio-tuotteella, valikoidaan ampisilliiniresistentit transfor-mantit ja eristetään plasmidi pXX-22 mainituista trans-formanteista.
20 Keksinnön mukaiselle menetelmälle plasmidin pXX- 11 valmistamiseksi on tunnusomaista että pilkotaan plasmidi pXHP-24 Hindlllrlla ja Bglllrlla, jolloin saadaan 750 emäsparin fragmentti, eristetään mainittu fragmentti, ligatoidaan mainittu fragmentti synteettisen fragmentin 25 5’ TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3' 3’AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5' kanssa T4-ligaasin läsnä ollessa, pilkotaan siten saatu 30 ligaatiotuote Hindlllrlla ja BamHIrllä, jolloin saadaan 790 emäsparin fragmentti, eristetään mainittu 790 emäsparin fragmentti, ligatoidaan mainittu 790 emäsparin fragmentti 440 emäsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 BamHIrllä ja Xmalrllä ja noin 8,0 35 kiloemäsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 Hindlllrlla ja Xmalrllä, T4-ligaasin läsnä 11 90352 ollessa, transformoidaan E. coli siten saadulla ligaatio-tuotteella, valikoidaan ampisilliiniresistentit transfor-mantit ja eristetään plasmidi pXX-11 mainituista trans-formanteista.
5 Keksinnön mukaiselle menetelmälle Y. lipolytica- transformantin valmistamiseksi on tunnusomaista, että integroidaan ilmentymisvektori Y. lipolytica -transformant-tiin, joka sisältää heterologisen vektori-DNA:n kanssa homologisen alueen, joka sisältää eksogeenista DNA:ta, 10 joka toimii vastaanottokohtana Y. lipolytican integratii- visen transformoinnin aikana.
Alkalista proteaasia tuottamaton Y. lipolytica-transformantti valmistetaan keksinnön mukaisesti transformoimalla Y. lipolytican XPR*-kanta XPR-ilmentymis-15 rakenteella.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle sellaisten Y. lipolytica-transformanttien toteamiseksi, joissa vek-tori-DNA on integroituneena XPR2-geenin, on tunnusomaista että 20 (i) transformoidaan Y. lipolytican XPR*-kanta XPR- ilmentymisrakenteella; ja (ii) tutkitaan kohdan (i) mukaisesti tuotetuista transformanteista alkalinen proteaasi-aktiivisuuden häviäminen.
25 Keksinnön mukaiselle menetelmälle heterologisen proteiinin tuottamiseksi Y. lipolytica-viljelmän avulla on tunnusomaista, että (i) Y. lipolyticaan viedään ilmentymisvektori, joka sisältää Y. lipolyticalle heterologista proteiinia 30 koodaavan DNA-sekvenssin ja siihen toiminnallisesti liit tyneenä (a) Y. lipolytican XPR2-geenin, tai (b) vähintään yhden seuraavista: Y. lipolytican XPR2-geenin signaali-sekvenssi, prol- tai pro2-sekvenssi ja vähintään yhden seuraavista: LEU2-geeni tai sen promoottorisekvenssi tai 35 XPR2-geenin promoottorisekvenssi; (ii) viljellään siten saatua kohdan (i) mukaista 90352 12 Y. lipolytica-transformanttia sopivassa ravintoalustassa, ja (iii) otetaan talteen heterologinen proteiini.
Heterologista proteiinia voidaan tuottaa keksinnön 5 mukaisesti myös viljelemällä Y. lipolytica -transformant-tia, joka sisältää ilmentymisvektorin, joka sisältää Y-lipolyticalle heterologista proteiinia koodaavan DNA-sek-venssin ja siihen toiminnallisesti liittyneenä (a) Y. li-polytican XPR2-geenin, tai (b) vähintään yhden seuraavis-10 ta: Y. lipolytican XPR2-geenin signaalisekvenssi, prol- tai pro2-sekvenssi, ja vähintään yhden seuraavista: LEU2-geeni tai sen promoottorisekvenssi tai XPR2-geenin pro-moottorisekvenssi ja heterologisen vektori-DNA:n kanssa homologisen alueen, joka sisältää eksogeenistä DNA:ta, 15 joka toimii vastaanottokohtana Y. lipolytican integratii-visen transformoinnin aikana, ja joka homologia-alue on peräisin pBR322:sta tai sen johdannaisesta.
Promoottorisekvenssillä "LEU2" tarkoitetaan ATG:n edellä olevaa transloitumatonta aluetta, joka sisältää 20 pääosan, ellei kaikkea, ilmentymisen vaatimista piirteistä.
Promoottorisekvenssillä "XPR2" tarkoitetaan signaali- (tai pre-)sekvenssin edellä olevaa transloitumatonta aluetta, joka on välttämätön ilmentymiselle. Lisäksi 25 XPR2-geenin signaalisekvenssiä voidaan käyttää yhdessä prosekvenssin kanssa tai ilman sitä proteiinien erittä-miseen muiden Y. lipolytica -promoottorien kuin XPR2-geenipromoottorin ilmentymissäätelyn alaisena. Siten vektorit, joissa on LEU2-promoottori ja alkalisen proteaasin 30 erityssignaalijaksoa vastaavat sekvenssit, pystyvät transformoidussa Y. lipolytica -solussa saamaan aikaan valmiin heterologisen proteiinin erittymisen.
Ihmisen anafylatoksiini C5a, joka tunnetaan myös nimellä ihmisen komplementtiproteiini C5a (ihmis-C5a), on 35 biologisesti aktiivinen polypeptidifragmentti, jota muodostuu in vivo komplementin aktivoitumisen seurauksena.
Se toimii immunomodulaattorina ja säätelee humoraalisen 90352 13 ja sellulaarisen immuunireaktion tiettyjä puolia. Sen ja muiden anafylatoksiinien primaarirakenne on kartoitettu. Yhteenvedon kemiallisesta, fysikaalisesta ja biologisesta karakterisoinnista esittää Hugli teoksessa "Complement".
5 toim. H.J. Muller-Eberhard ja P.A. Miescher, Springer-Verlag, New York, 1985, s. 73-99.
Alan asiantuntijoille lienee selvää, että tämän keksinnön yhteydessä voidaan tarpeellisin muutoksin käyttää lähes mitä tahansa tunnettua aminohapposekvenssiä koo-10 daavaa heterologista DNA:ta. Tässä esitettyjä menetelmiä voidaan tarpeellisin muutoksin käyttää minkä tahansa hete-rologisen proteiinin, joista annetaan tyypillisiä esimerkkejä US-patenttijulkaisussa 4 532 207, 30. kesäkuuta 1985, tuottamiseen ja erittämiseen. Lisäksi mitä tahansa muuta 15 Y. lipolytican erittämää proteiinia vastaavaa geeniä, kuten ribonukleaasigeeniä ja hapanta proteaasia koodaavaa geeniä, voidaan käyttää XPR2-geenin sijasta, samoin kuin hybridi-geenejä, joita muodostetaan yhdistämällä fragmentteja kahdesta tai useammasta edellä mainitusta geenistä, esimer-20 kiksi XPR2-geenin signaalisekvenssi ja ribonukleaasigeenin promoottorisekvenssi.
Keksinnön piiriin sisältyvät myös tässä kuvattuja DNA- tai nukleotidisekvenssejä funktionaalisesti vastaavat sekvenssit. Geneettisen koodin degeneratiivisuus tekee mah-25 dolliseksi korvata tiettyjä kodoneja toisilla kodoneilla, jotka koodaavat samaa aminohappoa ja johtaisivat siten samaan proteiiniin. DNA- tai nukleotidisekvenssi voi vaihdella huomattavasti, sillä metioniinia ja tryptofaania lukuun ottamatta tunnettuja aminohappoja voi koodata useampi kuin 30 yksi kodoni. Siten XPR2-geeni tai osia siitä voitaisiin syntetisoida ja saada DNA-sekvenssi, joka on merkittävästi erilainen kuin kuviossa 3 esitetty. Sen koodaama aminohapposekvenssi olisi kuitenkin ennallaan. Tietyn DNA- tai nukleotidisekvenssin tällaiset funktionaaliset muuttamiset 35 tarjoavat mahdollisuuden edistää siihen liitettyjen vieraiden DNA-sekvenssien koodaamien heterologisten proteiinien 14 90352 eritystä ja/tai käsittelyä. Kaikki geneettisen koodin sallimat XPR2-geenin ja sen fragmenttien nukleotidisekvenssin variaatiot kuuluvat siten tämän keksinnön piiriin. Lisäksi on mahdollista jättää pois kodoneja tai korvata yksi tai 5 useampi kodoni muilla kuin degeneratiivisilla kodoneilla, jolloin saadaan rakenteellisesti muunnettu polypeptidi, joka on kuitenkin suurin piirtein yhtä aktiivinen ja käyttökelpoinen kuin muuntamattoman DNA-molekyylin tuottama polypeptidi. Mainitut kaksi polypeptidiä ovat funktionaali) lisesti ekvivalenttisia, samoin kuin niiden muodostumisen aikaansaavat kaksi DNA-molekyyliä, vaikka mainittujen DNA-molekyylien väliset erot eivät liity geneettisen koodin degeneratiivisyyteen. Yksinkertaisin esimerkki tästä ilmiöstä on prorenniini A ja prorenniini B, prorenniinin kak-15 si alleelista muotoa, jotka eroavat toisistaan vain siinä suhteessa, että prorenniini A:n asemassa 286 on aspartaat-tiryhmä ja prorenniini B:n vastaavassa asemassa glysiini-ryhmä.
Käyttämällä hyväksi näitä menetelmiä, on saatu ai-20 kaan heterologisten nisäkäsproteiinien prorenniinin ja ihmisen anafylatoksiini C5a:n muodostuminen ja erittyminen Y. lipolyticassa käyttäen Y. lipolytican XPR2- ja/tai LEU2-geenien ilmentymis- ja erittymissignaaleja. Prorenniiniä ja ihmisen anafylatoksiini C5a:ta koodaavat DNA-sekvenssit 25 kytkettiin synteettisten oligonukleotidien avulla XRP2- geenisekvenssiin kohtiin, joiden otaksuttiin koodaavan alka-lisen proteaasin signaalipeptidiä tai proteaasiesiasteen käsittelykohtia, joista käytetään tässä merkintöjä prol ja pro2 ja muodostettiin geenirakenteita, jotka sitten sijoi-30 tettiin Y. lipolyticaan integratiivisella transformoinnil-la. Yhdistelmäviljelmät tuottivat ja kuljettivat kasvualustaan heterologisia proteiineja, joilla oli prorenniinin ja ihmisen anafylatoksiini C5a:n molekyylipaino ja im-muunireaktiivuus. Täten tuotetun prorenniin uskotaan ole-35 van asettuneena luontaiseen konfiguraatioon, koska se on 15 90352 propeptidin poistamisen jälkeen entsymaattisesti täysin aktiivista.
Termin "yhdistelmä-DNA-materiaali" piiriin sisältyy tässä yhteydessä mikä tahansa materiaali, joka sisältää 5 vähintään yhden seuraavista osista: Y. lipolytican XPR2-geeni, sen signaali-(eli pre-), prol-, pro2- (jotka kaksi yhdessä muodostavat pro-alueen), promoottori- tai ter-minaattorisekvenssi; LEU2-promoottori; ja edellä mainittujen kanssa funktionaalisesti ekvivalenttiset sekvenssit, 10 jotka ovat mahdollisia geneettisen koodin degeneratiivi-syyden perusteella. Tyypillisiä esimerkkejä mainitusta yh-distelmä-DNA-materiaalista ovat DNA-fragmentit, plasmidit tai vektorit tai transformantit, jotka sisältävät kaikki edellä mainitut sekvenssit tai minkä tahansa niistä.
15 Materiaalit: Restriktioendonukleaasit ja T4-ligaa- sin toimitti New England Biolabs, bakteriaalisen alkalisen fosfataasin Bethesda Research Laboratories, T4-polynukleo- 32 tidikinaasin PL-Biochemicals ja /gamma- P/ATP:n New England Nuclear. Kaikkia entsyymejä käytettiin valmistajan 20 suosittelemissa olosuhteissa.
Alustat: GPP-alusta (glyseroli/proteoosi-peptoni-alusta) sisälsi (litraa kohden) 6,7 g glyserolia, 1,6 g Difco Proteose-peptonia, 1,7 g aminohappoja ja ammonium-sulfaattia sisältämätöntä Difco Yeast Nitrogen Basea, 25 30 mg urasiilia ja 0,5 ml/1 polypropyleeniglykolia (mole- kyylipaino 2 000, Polysciences) 40 mM fosfaattipuskurissa (pH 6,8). (Polypropyleeniglykoli jätettiin pois alustoista, joita käytettiin renniinientsyymikokeisiin kasvatettaviin viljelmiin.) Proteoosi-peptoni autoklavoitiin erik-30 seen fosfaattipuskurissa.
YEPD-alusta (hiivauute/peptoni/dekstroosi-alusta) sisälsi (litraa kohden) 5 g hiivauutetta, 10 g Bacto-hiivauutetta, 10 g natriumkloridia; pH säädettiin arvoon 7,5 natrium-hydroksidilla.
35 DNA-sekvenssianalyysit: Tässä kuvatuista eri plas- mideista peräisin olevat DNA-fragmentit eristettiin 90352 16 polyakryyliamidigeeleillä ja sekventoitiin Maxamin et ai. menetelmällä /Methods in Enzymology, 65 (1980) 499,/.
Ligaatiomenettelyt: DNA-fragmentit, mukaan luettuina pilkotut vektoriplasmidit, ligatoitiin sekoittamalla ha-5 lutut komponentit (DNA-fragmenttien päät sellaisessa muodossa, että saadaan aikaan yhteensopivuus) ja T4-ligaasi. Ligaasia lisättiin noin 10 yksikköä ^ug-määriä kohden vektoria ja inserttifragmentteja. Tuloksena olevalla ligaa-tioreaktioseoksella transformoitiin komponentit E. coli 10 K12 -kannan MM294 (ATCC-33625) tai HB101 (ATCC-33694) solut.
Kemiallisesti syntetisoidun DNA:n valmistus; Hybri-digeenien muodostamiseksi prorenniinin tuotantoa ja eritystä varten syntetisoitiin kahdeksan oligonukleotidia muunnetulla fosforiamidiittimenettelyllä /sinha et ai., Tetra-15 hedron Letters 24 (1983) 58437 automaattisella DNA-synte-tisoijalla Genetic Design 6500 (Watertown, MA) ja puhdistettiin ne 6 M urea - 20 % polyakryyliamidigeeleillä. Yhtä suuret määrät komplementaarisia oligonukleotideja sekoitettiin keskenään ja saatettiin pariutumaan lämpötilassa 20 4°C pitämällä seosta yön yli TE-liuoksessa (10 mmol/1
Tris-HCl, pH 8,01; 1 mmol/1 NaEDTA). Kaksisäikeiset oligo-nukleotidit fosforyloitiin noin 2 ^ug:n annoksina 20 ^,ul:ssa reaktioseosta, joka sisälsi 70 mmol/1 Tris (pH 7,6), 10 mmol/1 MgC^, 5 mmol/1 ditiotreitolia ja 5 mmol/1 25 ATP:tä, lämpötilassa 37°C T4-polynukleotidikinaasia käyttäen .
Ilmentymis/erittymisvektorien muodostaminen proren-niiniä varten: Tehtiin sarja erilaisia rakenteita lopullisten ilmentymisvektoreiden aikaansaamiseksi. Kaikista vai-30 heistä esitetään kaaviot liitteenä olevissa kuvioissa.
Yleisesti ilmaistuna DNA-fragmentit eristettiin geelielek-troforeesilla ja ligatoitiin muihin fragmentteihin tai pilkottuun plasmidi-DNArhan 20 ^ulrssa liuosta, joka sisälsi 50 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,5), 10 mmol/1 MgC^, 20 mmol/1 35 ditiotreitolia, 1 mmol/1 ATP:tä ja 200 yksikköä T4-ligaa, siä, lämpötilassa 4°C. Jos tarvittiin DNA:n osittaista i7 90352 pilkkomista restriktioendonukleaasilla, optimaaliset pilk-komisajat määritettiin kokeellisesti.
Prorenniinin identifiointi viljelmänesteestä: II-mentymisvektoreita sisältäviä hiivatransformantteja kasva-5 tettiin yön yli GPP-alustassa (ks. edellä). Kun hiivasolut oli poistettu sentrifugoimalla, lisättiin 1 ml 50-%:ista TCA:ta/5 ml viljelmänestettä ja annettiin seoksen seistä 60 minuuttia lämpötilassa 4°C. Sentrifugoimalla saadut pelletit pestiin kahdesti 2 ml :11a kylmää asetonia. Saostunut 10 proteiini liuotettiin SDS-näytepuskuriin (100 ^ul) ja käsiteltiin annoksittain elektroforeettisesti 10-%:isillä SDS-polyakryyliamidigeeleillä /Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680/. Geelillä erottuneet proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosaan (Schleicher and 15 Schuell, 0,22 ^um) ja prorenniini identifioitiin levygee-lien immuunitäpläanalyysillä /Hawkes, R., et ai., Anal. Biochem. 1 19 (1982) 1427· Suodatin peitettiin kaniinin an-tiprorenniini-vasta-aineella ja inkuboitiin sitten peroksi-daasiin liitetyn vuohen anti-kaniini-IgG-vasta-aineen 20 kanssa (Cappel, Malvern, Pa). Sitoutuneet vasta-aineet de-tektoitiin värjäämällä 4-kloori-1-naftolilla ja vetyperoksidilla .
Viljelmänesteessä olevan prorenniinin maidon juok-setusaktiivisuus: Erilaisten Y. lipolytica -transformanttien 25 viljelmänesteistä tutkittiin niiden kyky juoksettaa maitoa käyttämällä muunnosta Ernstromin menetelmästä /J. Dairy Sei. 41 (1958) 16647. Lyhyesti sanottuna kokeessa mitataan aika, joka aktivoiduissa viljelmäsupernatanteissa olevalta renniiniltä kuluu puskuroidun rasvattoman maidon juokset-30 tamiseen ja verrataan näitä arvoja puhdistetulla renniini-standardilla saatuihin tuloksiin. Hiivaviljelmiä (25 ml) kasvatettiin yön yli GPP-alustassa. Kun solut oli poistettu sentrifugoimalla, kylmäkuivattiin viljelmäsupernatantit 5 ml:n annoksina alipaineessa. Kukin kylmäkuivattu super-35 natanttinäyte suspendoitiin 300 ^ul:aan tislattua vettä. Valmistettiin myös laimennussarja puhdistetusta vasikan 18 90352 prorenniinistä vertailusarjaksi. Alustakonsentraateissa ja vertailunäytteissä oleva prorenniini aktivoitiin lisäämällä 5-10 ^,ul väkevää suolahappoa, jolloin pH laski suunnilleen arvoon 2 ja inkuboimalla yksi tunti lämpötilassa 22°C.
5 Rasvaton maito valmistettiin lisäämällä 60 g rasvatonta kuivamaitoa (Difco) 500 ml:aan 41,5 mM natriumasetaatti-liuosta (pH 6,3), joka sisälsi 13,6 mmol/1 CaCl2 ja sekoittamalla 20 minuuttia 4°C:ssa. Substraatti käytettiin kokeisiin heti valmistamisen jälkeen. 60 ^ul:n annos (vas-10 taa 1 ml viljelmäsupernatanttia) kutakin entsyymiprepa- raattia lisättiin 1 ml:n annokseen rasvatonta maitoa lämpötilassa 37°C ja rekisteröitiin juoksettumisaika.
Synteettisten oligonukleotidien valmistaminen C5a-geeniä varten: C5a-rakennegeenin synteesissä käytetyt oli-15 godeoksinukleotidit valmistettiin kemiallisesti muunnetulla fosforiamidiittimenetelmällä (Sinha et ai., loc. cit.) käyttämällä kontrolloitua huokoslasialustaa automaattisessa DNA-syntetisoijassa Genetic Design 6 500 (Watertown, MA). Ohjelmassa käytettiin detritylaatioon liuosta, joka 20 sisälsi 3 % (paino/tilavuus) dikloorietikkahappoa dikloori-metaanissa, fosforiamidiittien in line -aktivointia kylläisellä tetratsoliliuoksella asetonitriilissä, cap-rakenteen muodostusta dietoksifosfiinitetratsolidillä ja hapetusta vesipitoisella jodin THF-liuoksella /Matteucci et ai., J.
25 Amer. Chem. Soc. 105 (1981) 3183_7· Additiosyklin kokonaiskesto oli 14 minuuttia. Kymmentä 47-meeriä, kuvion 9 segmentit A-J, saatiin keskimäärin 98,8 %:n saannolla vaihetta kohden (trityylianalyysin mukaan), niistä poistettiin suo-jausryhmät Matteuccin et ai. (loc. cit.) menetelmällä, 30 saostettiin etanolilla 0,3 M natriumasetaatista ja eristettiin tuotteet preparatiivisella geelielektroforeesilla denaturoivilla 10-%:isillä polyakryyliamidi-ureageeleillä ennen vastinsäikeiden yhdistämistä.
Ihmisen C5a-geenin kokoaminen, kloonaus ja sekven-35 tointi: Kuviossa 9 esitetään halutun proteiinin aminohapposekvenssi ja ihmisen C5a-proteiinia koodaavan geenin 19 90352 aikaansaantiin tarvittava synteettisten oligonukleotidien yhdistelmä. Kaikki oligometrit Aita ja F:ää lukuun ottamatta fosforyloitiin 5'-päistään T4-polynukleotidikinaasilla. Geenin rakentamiseen liittyi kaksi pääasiallista pariutu-5 mis/ligaatio-reaktiota, joissa liitettiin yhteen oligomee-rit A, B, I ja J; ja oligomeerit C, D, E, G ja H. Tuloksena olevat 94 emäsparin (ep) ja 141 ep:n kaksisäikeiset DNA-fragmentit eristettiin 10-%:isella polyakryyliamidigeelillä tehdyn elektroforeesin jälkeen, ligatoitiin toisiinsa ja 10 eristettiin 235 ep:n pituinen tuote geelielektroforeesilla. 235 epin DNA-fragmentti, joka sisälsi C5a:ta koodaavan ra-kennegeenin, sijoitettiin pBR322-vektori-DNA:n EcoRI- ja Hindlll-kohtien väliin ja transformoitiin tuotteella kompetentit E. coli K12 -kannan HB101 solut. Kuudesta trans-15 formantista eristetyn plasmidi-DNAin restriktioanalyysi osoitti, että viisi kloonia kuudesta sisälsi oikean kokoisen EcoRI-HindiII-fragmentin. Kun tällaisen plasmidin C5a-geenialueen nukleotidisekvenssi määritettiin Maxamin et ai. menetelmällä /Methods Enzymol. 65 (1980) 499.7.
20 E. colille sopivan C5a-ilmentymisplasmidin muodosta minen ja karakterisointi: DNA-fragmenttien eristysmenette-lyt ja ligaatioreaktioiden olosuhteet olivat Maniatisin et ai. kuvaamat (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982). E. colin trp-promoottori-ope-25 raattori saatiin alunperin ptrpLicstä /Edman et ai.,
Nature, 291 (1981) 503/. 360 ep:n EcoRI-fragmentti, joka sisälsi C5a-ilmentymisplasmidissa (pC5a-48) käytetyn trp-promoottori-operaattorisekvenssin, eristettiin prorenniini-ilmentymisplasmidista pPFZ-R2, jota kuvataan EP-hakemusjul-30 kaisussa 147 178, 3. kesäkuuta 1985.
C5a:n identifiointi Y. lipolytica -viljelmänestees-tä: Menettely oli muuten sama kuin edellä prorenniinin yhteydessä kuvattu, mutta immuunitäplätestissä käytettiin vuohen anti-C5a:ta ja kaniinin anti-vuohi-IgG:tä (Cappel). 35 Vuohen anti(humaani c5a)-vasta-aine valmistettiin 20 90352
Manderinon et ai. menetelmällä /j. Immunol. Methods, 53 (1982) 41-50J.
Vektorit: pLD40 - kuvattu EP-hakemusjulkaisussa 138 508, 24.
5 huhtikuuta 1985.
Mikro-organismit: ATCC 20744 Yarrowia lipolytica PC-30869 ATCC 20781 XPR2:lla transformoitu Yarrowia lipolytica DL112, PC-30869 10 ATCC 20776 Yarrowia lipolytica DL-148. SnaBI-pilkotulla pLS-3;lla transformoitu Y. lipolytica ATCC 20688 ATCC 20775 Yarrowia lipolytica DL-144, prikkomattomalla pLS-3:lla transformoitu Y. lipolytica ATCC 15 20688 ATCC 20777 SnaBI:llä pilkotulla pC5a-3:lla transformoitu Y. lipolytica PC-30869 ATCC 20778 SnaBI-pilkotulla pXX-11:llä transformoitu Y. lipolytica PC-30869 20 ATCC 20779 SnaBI-pilkotulla pXX-22:lla transformoitu Y. lipolytica PC-30869 ATCC 20780 SnaBI-pilkotulla pXX-33:lla transformoitu Y. lipolytica PC-30869 ATCC 20794 pLD56:lla transformoitu Y. lipolytica PC-30869 25 ATCC 20795 Nrul-pilkotulla pLX-34:llä transformoitu Y. lipolytica ATCC 20794
Kannat on talletettu Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti the American Type Culture Collectioniin, Maryland, joka on tunnustettu talletuslaitos, joka säilyttää talle-30 tetut kannat pysyvästi ja luovuttaa ne julkiseen käyttöön, jos tämän hakemuksen perusteella myönnetään patentti. Tämän hakemuksen avoinnaoloaikana talletteet ovat niiden saatavilla, jotka Yhdysvaltain patentti- ja tavaramerkkivirasto määrää siihen oikeutetuiksi lakien 35 CFR 1.14 ja 35 US 122 35 perusteella sekä muissa maissa, joihin tämän hakemuksen vastineet tai sen jatkohakemukset jätetään, vallitsevien 21 90352 patenttilakien mukaisesti. Kaikki talletettujen mikro-organismien julkista saatavuutta koskevat rajoitukset purkautuvat peruuttamattomasti, kun patentti myönnetään.
Y. lipolytica ATCC 20774:n (Pfizer Inc:n kokoelmas-5 sa numero PC-30869) taksonomisen tutkimuksen teki tri J.R. DeZeeuw, joka antoi seuraavan kuvauksen. Käytetyt menetelmät ovat J.L. Lodderin suosittelemia (The Yeasts, 2. p.
N. Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970).
Vertailun vuoksi tutkittiin CBS 599, lajin Candida 10 lipolytica tyyppiviljelmä (The Yeasts, 2. p. N. Holland
Publishing Co., Amsterdam, 1970) ja CBS 6124, Saccharomyces lipolytica -tyyppiviljelmä (The Yeasts, 2. p.). Tästä lajista käytettiin myös nimeä Endomycopsis lipolytica. Sen epätäydellinen tila on Candida lipolytica. Lajin taksono-15 misen sijainnin vakiinnuttivat van der Walt ja von Arx /Äntonie van Leeuwenhoek, 46 (1980) 517-521_7. Nykyisin suositeltu nimi on Yarrowia lipolytica.
Kannan PC-30869 viljelylliset, morfologiset ja fysiologiset luonteenpiirteet sopivat yhteen standardikuvauk-20 sen kanssa, joka on annettu lajille Saccharomyces lipolytica teoksessa The Yeasts, 3. p., toim. Kreger-van Rij,,
Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1984, s. 406-408.
Taulukko 1 25 Yarrowia lipolytica -kantojen vertailu
Pfizer, nro Lähde Genotyyppi PC-30265 NRRL YB-423 (myös CBS 6124), tyvp- Villin tyy- piviljelmä teoksessa The Yeasts, pin diploidi 3. p.
30 PC-30286 CBS, tyyppiviljelmä teoksessa MATA, villin
The Yeasts, 2. p. haploidi PC-30869 Katso alla olevaa tekstiä MATB bio-6 leu2-40 xpr2-100 35 PC-30869 muodostettiin yhdistämällä geneettisesti Y. lipo lytica PC-22208:n (Pfizer, maasta eristetty kanta) ja 22 90352 Y. lipolytica PC-30026:n (NRRL Y-1094:n alaviljelmä) sopivat mutantit. PC-30869 eroaa fenotyyppisesti villin tyypin vanhemmistaan siinä suhteessa, että (1) se ei tuota aktiivista solun ulkopuolista alkalista proteaasia, (2) se vaa-5 tii biotiinia kasvaakseen ja (3) se vaatii L-leusiiniläh-teen.
Viljeltäessä PC-30869 hiivauute-peptoni-glukoosi-liemessä (YEPD-liemessä) ovat silmukoituvat solut kasvun logaritmisessa vaiheessa munan muotoisia ja kooltaan kes-10 kimäärin 2,6 x 5,5 y.um. YEPD-agarilla pseudomyseelit ja aidot myseelit ovat vallitsevia. Blastosporeja esiintyy, etupäässä yksittäisinä reuna-asemissa. Karotenoidipigment-tejä ei ole havaittavissa. Viljelmä käyttäytyy "B"-pariu-tuvana haploidina risteytyksissä tämän lajin autenttisten 15 testauskantojen kanssa (taulukko 5). Tyypillistä askospo-rulaatiota havaitaan V8-agarilla. Hiilen assimilointiomi-naisuudet esitetään taulukossa 2. Fermentaatiota ei esiinny. Kanta käyttää ammoniumionia ja ureaa, mutta ei nitraattia, ainoana typpilähteenään (taulukko 3). Kannan PC-20 30869 tarvitsemat vitamiinit ovat tiamiini ja D-biotiini (taulukko 4). Viljelmät villin tyypin vanhemmat vaativat vain tiamiinia. Lämpötilassa 37°C ei havaita kasvua.
- Taulukko 2
Hiilen assimilaatio^ 25
Referenssi- Viljelmä Lähde_kuvaus (b)_30265 30286 30869 1. L-arabinoosi - - - - 2. Sellobioosi - - - - 30 3. Erytritoli + +++ +++ +++ 4. D-galaktoosi - - - - 5. D-glukoosi + +++ +++ +++ 6. Inositoli - - 35 7. Laktoosi — _ - - 23 90352
Referenssi- Viljelmä Lähde_kuvaus *30265 30286 30~8t>9 8. Maltoosi - - - - 5 g. D-mannitoli + +++ +++ +++ 10. Raffinoosi - - - - 11. Ribitoli - - - - 12. D--riboosi -(+) ++ 10 13. L -ramnoosi - - - - 14. Liukoinen tärkkelys- - - - 15. Sakkaroosi - - - - 16 Trehaloosi - - - - 15 17. D-ksyloosi - - - - ig. Meripihkahappo + +++ +++ +++ 19. Sitruunahappo + +++ +++ +++ 20 (a) Perusalusta oli Bacto-hiivatyppialusta, joka täydennettiin lisäämällä 10 jUg/1 D-biotiinia ja 149 mg/1 L-leusiinietyyliesterihydrokloridia (vastaa 100 mg/1 L-leusiinia) .
25 (b) Kreger-van Rij. (loc. cit.).
24 90352
Taulukko 3 (ä )
Typpiassimilaatio
Referenssi- Viineinä Lähde_kuvaus _30265 30286 30869 5 1. (NH4) 2S04 + +++ +++ +++ 2. KN03 - - 3. Urea + +++ +++ +++ 10 (a) Perusalusta oli Bacto-hiivahiilialusta, joka täydennet tiin 116 mg/1:11a natriumketoisokaproaattia (vastaa 100 mg/1 L-leusiinia) ja 10 /Ug/lilla D-biotiinia.
(b) Kreger-van Rij. (loc. cit.).
Taulukko 4 15 Vitamiinivaatimukset^
Perusalustan Referenssi- Viljelmä täydennys (c) tulos (b)_30265 30286 30869 1. Ei mitään - tr tr - 2q 2. Tiamiini‘HCl + +++ +++ 3. D-biotiini - tr tr tr 4, Tiamiini + biotiini + +++ +++ +++ 25 (a) Perusalusta oli vitamiiniton Bacto-hiiva-alusta + 149 mg/1 L-leusiinietyyliesteri-HCl (vastaa 100 mg/1 L-leusiinia).
(b) Kreger-van Rij. (loc. cit.).
(c) 200 yUg/1 tiamiini-HCl ja/tai 10 /ug/1 D-biotiinia 30 merkityissä kohdissa.
„ 90352
Zd
Taulukko 5 Askosporulaatio
Pariutettu viljelmä
Testauskanta 30265 30286 30869 5 Ei mitään (pariutettu viljelmä yksinään) ++ 30264 (A-pariutuva tyyppi) ++ - +++ 30267 (B-pariutuva tyyppi) ++ +++ (a) Viljelmät 30264 ja 30267 ovat vastakkaista pariutumis- 10 tyyppiä olevia haploidikantoja, jotka tri. L.J.
Wickerham ystävällisesti antoi käyttöön. Niitä kuvataan julkaisussa Science 167 (1970) 1141.
(b) 30264 on Wickerhamin C. lipolytica YB-341 (c) 30267 on Wickerhamin C. lipolytica YB-432-12 15 Taulukko 6
Muut ominaisuudet
Referenssi- Viljelmä arvo(a) 30265 30286 30869
Solun muoto Ovoidi Ovoidi Ovoidi Ovoidi 20 solun keskimääräinen (2-4,5) x 3,3x 3,0x 2,6x koko (yum) (4-22) 9,1 8,2 5,5
Vegetatiivinen lisään- Silmukointi Silmu- Silmu- Silmu- tyminen kointi kointi kointi
Fermentaatio Ei Ei Ei Ei 25 Pesäkkeiden kasvu Nämä kolme viljelmää kasvoivat samalla tavalla ja sopivat yhteen kirjallisuuden kuvauksen kanssa Pseudomyseelit ja aidot myseelit vallitsevia. Blastosporeja esiintyy, etupäässä yksittäisinä reunoilla.
30 Karotenoidipigmenttiä ei havaittavissa.
(a) Kreger-van Rij. (loc. cit.).
PC-30869 eroaa muista patenttikirjallisuudessa kuvatuista Y. lipolytica -kannoista, kuten käy ilmi fenotyyppien vertailusta (taulukot 7 ja 8).
35 ATCC 20228:11a (Nubel et ai., US-patenttijulkaisu 4 155 811) on villin tyypin ravintokäyttäytyminen samoin 26 90352 kuin lajin tyyppiviljelmillä CBS 599 ja CBS 6124. Tarkemmin määriteltynä se ei tarvitse urasiilia, leusiinia eikä biotiinia kasvaakseen ja se nesteyttää gelatiinia.
ATCC 2062S (DeZeeuw et ai., US-patenttijulkaisu 5 4 407 953) vaatii, toisin kuin ATCC 20228, leusiinitäyden- nystä kasvaakseen. Samoin kuin ATCC 20228 se ei vaadi urasiilia eikä biotiiniä. Myös se nesteyttää gelatiinia.
ATCC 20688 (EP-hakemusjulkaisu 138 508) kasvaa vain, jos alustaa täydennetään sekä urasiilillä että leu-10 siinilla. Tämä urasiilin tarve erottaa ATCC 20688:n sekä ATCC 20228:sta että ATCC 20628:sta. ATCC 20688 ei vaadi biotiiniä ja nesteyttää gelatiinia.
Viljelmä PC-30869 eroaa kaikista edellä mainituista. Se vaatii biotiinia ja leusiinia, mutta ei urasiiliä, 15 kasvaakseen. Se ei nesteytä gelatiinia.
Taulukko 7
Ravintovaatimukset
Alustasta poistettu ravintoaine
Ei mi- Leu- Ura- Bio- 20 Viljelmä tään siini siili tiini CBS 599 +++ +++ +++ +++ CBS 6124 +++ +++ +++ +++ ATCC 20228 +++ +++ +++ +++ ATCC 20628 +++ - +++ +++ 25 ATCC 20688 +++ - - +++ PC-30869 +++ - +++
Muuttamaton alusta sisälsi 16,7 g/1 vitamiinitonta Bacto- hiiva-alustaa, johon oli lisätty 199 mg/1 urasiiliä, 100 mg/1 L-leusiinia, 10 mg/1 B-tioniiniä ja 200 ^ug/1 tia- 30 miinihydrokloridia.
27 90352
Taulukko 8
Gelatiinin nesteytys
Viljelmä Nestevtvs CBS 599 + 5 CBS 6124 + ATCC 20228 + ATCC 20628 + ATCC 20688 + PC-30869 10
Alusta sisälsi 120 g/1 gelatiinia, 16,7 g/1 vitamiinitonta Bacto-hiiva-alustaa, 100 mg/1 urasiiliä, 100 mg/1 L-leu-siinia, 10 ^ug/1 D-biotiinia ja 200 ^-ug/1 tiamiinihydroklo-ridia.
15
Kuvio 1 - Y. lipolytica -kannasta DL112 eristettyjen toistensa kanssa limittyvien plasmidien pLD 57, pLD 58 ja pLD 62 linearisoitu osittaisrestriktiokartta.
Kuvio 2 - Synteettiset oligonukleotidikoettimet 20 XPR2-geenille. Julkaistusta sekvenssistä, joka kattaa suurimman osan valmiin proteaasin 25 ensimmäisestä aminohappo-ryhmästä (Ogrydziak et ai., loc. cit.), kaksi aluetta (I ja II) tarjoavat mahdollisuuden muodostaa 14-meerisiä oli-gonukleotidikoettimia, joiden degeneratiivisyys on korkein-25 taan 32-kertainen. Nämä kaksi aluetta alkavat aminohappojen 7 ja vastaavasti 18 kohdalta. Valmistettiin neljä erilaista 8-kertaisesti degeneratiivista seoskoetinta kummallekin alueelle ja merkittiin ne numeroilla 170-186 kuvan mukaisesti. Esitetyissä ennustetuissa nukleiinihapposekvensseis-30 sä "X" tarkoittaa kaikkia neljää emästä, "U" kumpaakin pu-riiniemästä ja "Y" kumpaakin pyrimidiiniemästä.
Kuvio 3 - XPR2-geenin nukleotidisekvenssi, jossa ovat mukana promoottori, pre-jakso (-157 - -136), prol-jakso (-135 - -98), pro2-jakso (-97- -1), alkalisen ekstra-35 sellulaarisen proteaasin jakso ja terminaattorijakso.
28 90 352
Kuvio 4 - Terminaattorivektorin pterm 5 muodostaminen.
Kuvio 5 - Plasmidin pLS-3 muodostaminen ja restrik-tiokartta.
Kuvio 6 - Plasmidin pXX-33 muodostaminen ja restrik-5 tiokartta.
Kuvio 7 - Plasmidin pXX-22 muodostaminen ja restrik-tiokartta.
Kuvio 8 - Plasmidin pXX-22 muodostaminen ja restrik-tiokartta.
10 Kuvio 9 - Ihmisen anafylatoksiini C5a:n aminohappo- sekvenssi .
Kuvio 10 - Plasmidin pC5a-48 restriktiokartta.
Kuvio 11 - Plasmidin pC5aX-3:n muodostaminen ja restriktiokartta.
15 Kuvio 12 - LEU2-geenin nukleotidisekvenssi.
Kuvio 13 - Plasmidin pLX-34 muodostaminen ja restriktiokartta , XPR2-geenin sekvenssianalyysi: Kloonatun XPR2-geenin DNA-sekvenssianalyysi tehtiin kemiallisella hajotus-20 menetelmällä /Maxam et ai., Methods Enzymol., 65 (1980) 499'J plasmideista pLD57, pLD58 ja pLD62 (kuvio 1) ja pLD84 ja pLD86 (katso jäljempänä) valmistetuista limittäi-sistä restriktiofragmenteista. Tulokset osoittivat, että kloonatun hiivan genomi-DNA:t todella sisälsivät eksosel-25 lulaarista alkalista proteaasia koodaavan geenin. XPR2-geenin nukleotidisekvenssi ja nukleotidisekvenssistä päätelty alkalisen proteaasin esiasteen ja sen signaalisek-venssin aminohapposekvenssi esitetään kuviossa 3. Suuri osa eksosellulaarisen proteaasin aminohapposekvenssistä 30 oli tuntematon (Ogrydziak et ai., loc. cit.) ja esitetään tässä ensimmäisen kerran. Lisäksi eksosellulaarisen proteaasin tuotannon ja erittymisen vaatimia sekvenssejä kuvataan tässä ensimmäisen kerran. DNA-sekvenssi, joka koodaa alkalista proteaasia, sen esiastetta ja signaalisekvenssejä, 35 koostuu 1 362 emäsparista (kuvio 3). Tämän polypeptidiket-jun primaarirakenteen pääteltiin nukleotidisekvenssin 29 90352 perusteella olevan 454 aminohapporyhmän kokoinen. Alkali-nen proteaasi syntetisoidaan solussa esiastemuotoon, joka käsitellään proteolyyttisesti erittyneeseen eli valmiiseen muotoon. Nukleotidisekvenssistä päätellyn N-terminaalisen 5 aminohapposekvenssin analyysi antoi viitteen oletetun sig-naalipeptidin läsnäolosta esiastemolekyyIissä. Mainittu signaalipeptidi sisältää 22 aminohapporyhmää ja sen rakenne-piirteet ovat samanlaiset kuin korkeammilla eukarioottisil-la ja prokarioottisilla signaalipeptideillä /Perlman et 10 ai., J. Mol. Biol., 167 (1983) 391_7. Ennustetun aminohapposekvenssin sitä aluetta, joka sopii yleisesti yhteen valmiin alkalisen proteaasin 25 tunnetun N-terminaalisen aminohapon kanssa /Ögrydziak et ai., J. Gen. Microbiol.
128 (1982) 1225,/, edelsi 157 aminohapporyhmää, joihin si-15 sältyy signaalipeptidi ja kaksi trypsiinityyppistä pilkkou-tumiskohtaa (Lys-Arg). Mainittuja pilkkoutumiskohtia käytettiin pro-alueen jakamiseen prol:ksi (-135 - -98) ja pro2:ksi (-97 - -1) (ks. kuvio 3). Valmis alkalinen proteaasi sisältää nukleotidisekvenssin perusteella 297 ami-20 nohappoa. Aminohapposekvenssit, jotka ennustettiin proteaasin erilaisille muodoille nukleotidisekvenssin perusteella, sopivat yhteen entsyymin puhdistettujen muotojen kokojen kanssa. Alkalisen proteaasin esiasteen rakennesekvens-sin lisäksi määritettiin noin 700 emäsparin verran 5'-pään 25 reunasekvenssiä ja 600 emäsparia 3'-pään reunasekvenssiä. Näiden alueiden analysointi osoitti, että ne sisältävät muiden eukarioottisten promoottorien ja terminaattorien kanssa analogisia sekvenssejä ja ovat todennäköisesti välttämättömiä alkalisen proteaasin tuotannolle.
30 Kuten edellä mainittiin, menetelmiä Y. lipolytican transformoimiseksi ja Y. lipolytica -geenien kloonaamiseksi mutaatioiden komplementoinnin kautta, mukaan luettuna erittynyttä alkalista proteaasia koodaavan XPR2-geenin kloonaus xpr2-mutaation komplementoinnin kautta, kuvataan 35 EP-hakemusjulkaisussa 138 508. Siinä kuvattuun menettelyyn sisältyy Y. lipolytica -isäntäkannan transformointi 3o 90352 Y- lipolytica -geenikirjaston Bglll-osittaispilkkomistuot-teella sijoitettuna vektoriin pLD40, jolle on tunnusmerkillistä se, että se sisältää pienen, Y. lipolytican LEU2-alueen sisältävän segmentin ja 3 EcoRI-, 4 EcoRV-, 5 Aval-, 5 Bglli-, 1 Ncol-, 1 Apal-, 2 XhoI- ja 1 BstXI-endonukleaa-sirestriktiokohtaa. Erästä Y. lipolytica -transformanttia käytettiin villin tyypin geenin (pLD84 ja pLD86) talteen-ottamiseen Y. lipolytica NRRL Y-1094:stä käytettäväksi ilmentymis/erittymisvektorin muodostamiseen esimerkissä 1 10 kuvatulla tavalla.
LEU2-geenin sekvenssianalyysi: pLD25:ssa (EP-hake-musjulkaisu 138 508) olevan kloonatun LEU2-geenin DNA-sekvenssi määritettiin limittäisten restriktiofragmenttien kemiallisella hajotuksella /Maxam et ai.. Methods Enzymol., 15 65 (1980) 499J. Beeta-isopropyylimalaatti(IPM-)dehydroge- naasia koodaavan alueen ja oikean lukukehyksen paikallistamiseksi käytettiin hyväksi ennustettua aminohapposekvenssiä, joka oli aiemmin määritetty S. cerevisiaen LEU2-gee-nille /Andreadis et ai., J. Biol. Chem., 259 (1984) 8059_7. 20 identifioitiin se Y. lipolytica -genomisekvenssin alue, joka koodaa aminohapposekvenssiä, joka on homologinen S. cerevisiaen proteiinisekvenssin alueelle. 2,8 ke:n pituisen LEU2-geenin nukleotidisekvenssi ja sen perusteella päätelty beeta-IPM-dehydrogenaasin aminohapposekvenssi esite-25 tään kuviossa 12. Lisäksi sekvenssiä, joka vaaditaan Y.
lipolytican beeta-IPM-dehydrogenaasin tuotantoon, kuvataan tässä ensimmäistä kertaa. Tätä 405 aminohaposta koostuvaa proteiinia koodaava DNA-sekvenssi koostuu 1 215 emäsparis-ta (kuvio 12). Beeta-IPM-dehydrogenaasia koodaavan sekvens-30 sin lisäksi määritettiin noin 798 emäsparin verran 5’-pään reunasekvenssiä ja 797 emäsparin verran 3'-pään reunasek-venssiä (translaation lopetuskodoni TAA mukaan luettuna). Näiden alueiden analysointi osoitti, että ne sisältävät muiden eukarioottisten promoottorien ja terminaattorien 35 kanssa analogisia sekvenssejä ja ovat oleellisia ilmentymiselle .
31 90352 Y. lipolytican LEU2-geenin 5'-pään edellä oleva alue sisältää TATATATA-sekvenssin 78 emäsparia luennan aloituskohdan edellä ja 30 emäsparia ehdotetun mRNA-aloi-tuskohdan edellä. Toinen sekvenssi, joka on tärkeä tran-5 skription aloitukselle eukariooteissa, ovat CAAT-"laatikko", joka LEU2-geenissä sijaitsee 74 emäsparia oletetun transkription aloituskohdan edellä, joka on asemassa -48 ep. ATG:hen nähden (kuvio 12).
3'-pään jälkeisellä alueella on lopetuskodonin 10 (TAA) jälkeisten nukleotidien 72-120 välissä sekvenssi, joka on homologinen sekvenssille 5'-TAG....TA(T)GT....TTT-3', jota Zaret et ai. /Cell, 28 (1982) 563/ pitävät tärkeänä S. cerevisiaessa transkription lopetukselle.
Esimerkki 1 15 Käytetty isäntäkanta oli ATCC 20774 (MATB leu2-40 bio-6 xpr2-1002) XPR2-transformantti, Y. lipolytica ATCC 20781, löydettiin pesäkkeenä, joka muodosti vyöhykkeen rasvatonta maitoa sisältävillä indikaattorilevyillä leusiinit-tomilta levyiltä tehdyn replika-siirrostuksen jälkeen.
20 Transformantista eristettiin kromosomi-DNA EP-hakemusjulkaisun 138 508 mukaisesti ja käytettiin siitä erittynyttä proteaasia vastaavan geenin talteenottoon. Kromosomi-DNA pilkottiin osittain Bglll-entsyymillä, ligatoitiin renkaan muodostavalla tavalla fragmenttiin, joka sisälsi vektoris-25 ta sekä E. coli -replikonin että ampisilliiniresistenssi-geenin ja transformoitiin ligaatiotuotteella E. coli. Kromosomi-DNA pilkottiin myös Sali-entsyymillä ja tehtiin Southern-koe, joka osoitti, että transformantin normaali LEU2-alue oli säilynyt vahingoittumattomana. (Koettimena 30 käytettiin LEU2-alueen 520 emäsparia Sall-EcoRI-segment-tiä, joka sijaitsee välittömästi pLD40:ssä olevan LEU2-segmentin 5'-puolella.) Koska homologia on välttämätön kirjastoplasmidin integroimiseksi Y. lipolyticaan, on XPR2-alueen täytynyt olla integroitumiskohtana. Kolme li-35 mittäistä, mutta erilaista plasroidia pLD57, pLD58 ja pLD62 otettiin alunperin talteen Y. lipolytica ATCC 20781:stä.
32 90352
Ne esitetään kuviossa 1. Hybridisaatiot, jotka tehtiin käyttämällä synteettisesti XPR2-geenille valmistettuja oli-gonukleotidi-koettimia, jotka perustuivat valmiin erittyneen proteiinin tunnettuun, 25 ensimmäisestä aminohaposta 5 koostuvaan sekvenssiin (kuviot 2 ja 3), osoittivat, että erittynyttä proteaasia koodaava geeni on kloonautunut. Sen määrittämiseksi, oliko talteen otettu geeni villiä tyyppiä oleva kopio vai mutanttikopio, Y. lipolytica -vastaanot-tajakanta transformoitiin pLD58:lla. Koska yhdestäkään 10 leusiinistä riippumattomasta transformantista ei syntynyt proteaasipositiivisia transformantteja, pääteltiin, että pLD58 sisälsi geenin mutanttialleelin.
Villin tyypin kannassa NRRL-1094 esiintyvä XPR2-geenin muoto saatiin E. coli -pesäkehybridisaatiokokeella. 15 Koettimena käytettiin 2 ke:n PvuI-EcoRI-fragmenttia, jonka otaksuttiin sekventointitietojen perusteella sisältävän koko rakennegeenin. Alkuperäisestä kirjastosta, joka koostui pLD40:n sisältämän NRRL Y-1094 -DNA:n Sau3A-osit-taispilkkomisfragmenteista ja jota kuvataan EP-hakemusjul-20 kaisussa 138 508, löydettiin muutama pesäke, jotka hybri-disoituivat koettimen kanssa. Kaksi näistä pesäkkeistä sisälsivät keskenään hyvin samanlaiset plasmidit, pLD84 ja pLD86, joita käytettiin ilmentymisvektoreiden kehittämiseen. Kumpikin plasmidi sisältää samanlaisen sekvenssin 25 XPR2-alueen 51-päästä Sau3A-kohtaan (joka liittyi vektorin BamHI-kohtaan ja regeneroi sen), josta sekvenssi alkaa kuviossa 3. Kumpikin sisältää proteaasirakennegeenin kokonaan ja otaksutun transkription terminaattorin ja kaikkiaan 4-5 ke:n verran kannan NRRL Y-1094 XPR2-alueelta 30 peräisin olevaa inserttiä. pLD86:ssa oleva insertti sisältää muutaman sadan emäsparin lisäjakson 3'-päässä. Koska käytettiin 3'-pään jatketta Bglll-kohtaan asti (emäspari 2655) ilmentymisvektorin muodostamiseen, kumpikin plasmidi sisälsi saman DNA:n, joka oli sekvenssiltään funktio-35 naalisesti identtinen kuvion 3 sekvenssin kanssa.
33 90352
Ilmentymis/erittymisvektorien muodostaminen: Suunnitelmassa, joka tehtiin prorenniinin tuotannon ja erittymisen aikaansaamiseksi Y. lipolyticassa, käytetään erilaisten hybridigeenien sisällyttämistä integratiiviseen 5 kloonausvektoriin. Täten saadaan useita erilaisia plasmi-deja, joissa on laajoja yhteisistä DNA-sekvensseistä koostuvia alueita. Itse asiassa käytettiin modulirakennesuun-nitelmaa vektorien rakentamiseksi, joissa prorenniinigeeni on sijoitettuna ennustetun XPR2-signaalipeptidin käsitteli) lykohdan, otaksutun Prol-käsittelykohdan ja pilkkoutumis-kohdan, jonka tiedetään muodostavan valmista alkalista proteaasia, 3'-puolelle. Yleensä on toivottavaa sijoittaa heterologinen geeni ilmentymisen aikaansaamiseksi hiivan promoottori- ja terminaattorisekvenssien väliin. Tiedet-15 tiin, että hybridigeenisekvenssien N-terminaalinen osa vaihtelee erilaisissa plasmidirakenteissa, mutta proren-niinirakennegeenisekvenssi, XPR2-terminaattorisekvenssi ja sukkulavektori-DNA olisivat samoja kussakin ilmentymisplas-midivektorissa. Suunnitelman mukaan samaa prorenniinira-20 kennegeenifragmenttia ja terminaattori/vektori-plasmidia käytettäisiin kussakin ilmentymisplasmidirakenteessa, kuten jäljempänä kuvataan. Erilaiset prorenniini-ilmentymis/ erittymisplasmidirakenteet vaihtelevat XPR2-geenipromoot-torisekvenssiä välittömästi seuraavalla alueella prorennii-25 nigeenisekvenssiä edeltävän N-terminaalisen alkalisen pro-teaasin esiastetta vastaavan sekvenssin pituuden suhteen. Siksi kunkin ilmentymisplasmidin promoottorifragmenttikom-ponentti suunniteltiin vaihtelevaksi sekvenssiksi XPR2-prorenniinisekvenssin liittymiskohdan alueella. Kaikki il-30 mentyinis/erittymisvektorit muodostettiin samanlaisella ligaatioreaktiolla, jossa käytettiin kolmea komponentti-fragmenttia.
Terminaattorivektorin pterm4 muodostamisessa käytetyt vaiheet esitetään kuviossa 4. Ensin ligatoitiin syn-35 teettinen kytkijä fragmenttiin, joka sisälsi XPR2-geenin 3'-pään transkription lopetus- ja polyadenylaatiosignaalit 90352 34 mukaan luettuina. Lyhyesti ilmaistuna plasmidi pLD84 pilkottiin endonukleaasilla Kpnl ja ligatoitiin synteettisen kaksisäikeisen, kuviossa 4 olevan kytkijä-DNA:n kanssa. Li-gaatiotuote pilkottiin endonukleaaseilla Hindlll ja Bglll, 5 ja sijoitettiin 760 emäsparin fragmentti samoilla kahdella endonukleaasilla linearisoituun plasmidiin pLD41, jolloin saatiin pterm 4, Plasmidi pterm 4 restriktiokartoitet-tiin. Sarja tuotteita, jotka saatiin pilkkomalla restrik-tioendonukleaaseilla EcoRV, EcoRI, Kpnl, Bglll-Hindlll ja 10 Bglll-Bcll, analysoitiin. Pilkkomisilla saadaan sopivia fragmentteja, jotka vahvistavat synteettisen kytkijän ja XPR2-geenin "täydellisen" 3'-pään läsnäolon sukkulaplasmi-dissa pLD41, jota kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 138 508. Tämän 7,3 ke:n terminaattorivektorin osittainen kartta 15 esitetään kuviossa 4.
Ilmentymis/erittyroisplasmidin pLS-3 muodostaminen: Kuviossa 5 esitetään pääpiirteittäin ensimmäisen plasmi-din, jota käytettiin prorenniinin erittymisen aikaansaantiin Y. lipolyticassa, muodostaminen. Sen restriktiokartta 20 esitetään kuviossa 5. Prorenniinierittymisplasmidin muodostaminen aloitettiin valmistamalla fragmentti, joka sisälsi suurimman osan prorenniinirakennegeenin sekvenssistä.
1 080 emäsparin BclI-BamHl-DNA fragmentti (osittainen pilkkominen) , joka sisälsi prorenniiniryhmiä 6-365 koodaavan 25 sekvenssin, eristettiin E. coli -prorenniini-ilmentymisplas-midista pPFZ-84A. (Plasmidi pPFZ-84A on johdos prorenniini-ilmentymisplasmidista pPFZ-R2, jonka muodostamista kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 147 178, 3. kesäkuuta 1985 ja joka muodostettiin synteettisillä oligonukleotideillä ohjatulla 30 mutageneesillä, jossa käytettiin restriktiofragmenttien vaihtoa. Tarkemmin ilmaistuna pPFZ-84A eroaa pPFZ-R2:sta vain kahdella emäsparilla, jotka ovat prorenniiniaminohap-pojen 214 (Asn-Asp) ja 286 (Asp-Gly) kohdalla, niin että se koodaa nk. prorenniini A -alleelia, molemmat plasmidit 35 sisältävät kuitenkin halutun prorenniinisekvenssin ja ovat toiminnallisesti ekvivalenttisia tämän esimerkin 35 90 352 yhteydessä.) XPR2-promoottorikomponenttifragmentti, joka sisältää alkalisen proteaasin esiastetta (1-157) ja pro-renniiniä (1-5) koodaavat jaksot, valmistettiin seuraavasti. 870 emäsparin HindIII-AvaI-DNA-fragmentti, joka si-5 sältää promoottorialueen ja alkalista proteaasia vastaavan geenin 5'pään, eristettiin XPR2-aliklooniplasmidista pLD90. Tämä fragmentti ligatoitiin synteettisen fragmentin kanssa, jonka rakenne oli: 5'CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG 3' 10 3' C TAAGGACGAAGAAGATTAC GGTTCGCTC GAC TC TAGTGATCC TAG 5' luentasuunta -> Tämä sekvenssi sisältää tarttuvan Aval-pään, sen jälkeen alkalisen proteaasin propeptidin viimeisiä yhdeksää kodo-15 nia vastaavan jakson, sen jälkeen prorenniinin neljää ensimmäistä aminohappoa koodaavan jakson ja päättyy BamHI-kohtaan. Promoottorikomponenttifragmentti muodostettiin tavanomaisella ligaatioreaktiolla, jossa käytettiin synteettistä fragmenttia ja 870 emäsparin HindiII-Aval-fragment-20 tia sekä T4-ligaasia ja tehtiin sen jälkeen pilkkominen HindIII:lla ja BamHI:llä. Saadut ligatoidut sekvenssit puhdistettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja valikoitiin sopiva 916 emäsparin HindiII-BamHI-DNA-fragmentti. Hybridigeenin 3'-pää saatiin terminaattori/vektori-25 plasmidista pterm 4, jota kuvattiin edellä. Plasmidi pterm 4 pilkottiin HindIII:lla ja Bcllcllä ja eristettiin agaroosi-geelillä noin 7,3 ke:n Hindlll-BclI-terminaattori/vektori-DNA-fragmentti, joka sisälsi XPR2-terminaattorin, valikoitavissa olevan LEU2-markkerin ja pBR322:n.
30 Prorenniini-ilmentymis/erittymisplasmidi pLS-3 muo dostettiin inkuboimalla kolmea rakenneosina toimivaa DNA-fragmenttia (Hindlll-BamHl-pilkottu plasmidi pterm 4, 916 emäsparin Hindlll-BamHI-promoottorifragmentti ja 1 080 ep:n prorenniinigeenin sisältävä BamHI-BclI-fragmentti), jotka 35 muodostettiin edellä kuvatulla tavalla, T4-ligaasia läsnä ollessa (ks. kuvio 5). Ligaatioseoksella transformoitiin 36 90352 E. coli K12 -kanta MM294 käyttämällä Dagertin et ai.
/Gene, 6 (1979) 23-28/ CaCl2-menetelmää. Plasmidit eristettiin ampisilliiniresistenssin perusteella valikoiduista transformanteista ja plasmidi pLS-3 identifioitiin 5 restriktiokarttansa perusteella (kuvio 6A). Tämä plasmidin XPR2-prorenniinialue sekventoitiin synteettisen DNA:n oikean sekvenssin ja haluttujen fragmenttien oikean liittymisen varmistamiseksi.
pLD90:n muodostaminen: Tämä plasmidi sisältää pLD84-10 alikloonin. DNA-alue, joka ulottuu XPR2:n promoottorialueella olevasta PvuI-kohdasta terminaattorialueella olevaan EcoRI-kohtaan, alikloonattiin pBR322:n HindiII-kohtaan. Muutamia mikrogrammoja pLD84:ää pilkottiin edellä mainituilla kahdella restriktioentsyymillä. Pilkottujen DNA-mo-15 lekyylien "tarttuvat" päät täydennettiin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla. Kinaasikäsitellyt Hindlll-kytki-jät (CAAGCTTG, New England Biolags) lisättiin sitten päihin T4-DNA-ligaasilla. Ylimääräiset kytkijät poistettiin, muodostettiin tarttuvat Hindlll-päät pilkkomalla sitten 20 Hindlll-entsyymillä. DNA-molekyyliseos käsiteltiin prepa-ratiivisella agaroosigeelillä, leikattiin irti haluttu 2 ke:n vyöhyke, puhdistettiin se ja lisättiin ligaatio-reaktioseokseen yhdessä Hindlll-pilkotulla, bakteriaali-sella alkalisella fosfataasilla käsitellyn vektorin pBR322 25 kanssa. Ligaatioseoksella transformoitiin kompetentti E.
coli. Orientaatiomuodolle, jossa XPR2-terminaattorin EcoRI-kohta oli lähempänä pBR322:n EcoRI-kohtaan, annettiin nimeksi pLD90 ja vastakkaiselle orientaatiomuodolle pLD91. pLS-3:n sisältämän XPR2-promoottorialueen 5'-pää 30 on Pvul-kohta, joka on noin 280 emäsparin päässä kuviossa 3 sekventoituna esitetyn alueen alusta. Havaittiin, etteivät plasmidit, jotka sisälsivät villin tyypin proteaasigeenin vain tämän promoottorimäärän ohjauksessa, integroituina genomiin siinä olevasta xpr2-lokuksesta kaukana olevaan 35 kohtaan pystyneet antamaan transformantille kykyä valmistaa 3v 90352 suuria määriä proteaasia (pääteltynä kuorittua maitoa sisältävillä levyillä olevista kirkastumisvyöhykkeistä).
Havaittiin, että jos pLD-3 sisälsi lyhentyneen ja siten "vajavaisen" promoottorin, integraatiotuote, joka 5 seuraa plasmidin ja villin tyypin XPR2-geenin rekombinaa-tiosta, muodostaisi täydellisen promoottorin, joka ohjaa prokymosiinifuusiotuotteen muodostusta, mutta vajavaisen proteaasituotantoa ohjaavan promoottorin. Vastaavan geenin rikkominen -tyyppisen kokeen tekivät Shortle et ai.
10 /Science 217 (1982) 371-3737· S. cerevisiaen aktiinigee-nillä. Odotusten mukaisesti olivat jotkut pLS-3:n sisältävät leusiinista riippumattomat transformantit proteaasin suhteen vajavaisia. Nämä proteaasin suhteen vajavaiset transformantit olivat todennäköisemmin haluttuja tuottei-15 ta, joissa integraatio on tapahtunut XPR2-lokukseen kuin epätoivottavat sivutuotteet, kuten sellaiset, joissa geenimuutos on tapahtunut leu2:n kohdalla. Vastaanottajakan-nan ATCC 20688 ollessa kyseessä havaittiin, että pilkko-maton pLS-3 muodosti 6,5 % proteaasin suhteen vajavaisia 20 transformantteja, kun taas SnaBI-pilkottu plasmidi tuotti noin 70 % proteaasin suhteen vajavaisia transformantteja. Tähän transformointiin liittyvän geenin katkaisun avulla vältettiin tarve tehdä suuria määriä Southern-täpläkokei-ta oikean integraatiotuotteen löytämiseksi kaikkien trans-25 formanttien joukosta.
Plasmidit, jotka sisältävät villin tyypin proteaasi-rakennegeenin XPR2-promoottorin säätelyn alaisena (alku esitetään sekventoituna kuviossa 3), mahdollistavat suurten proteaasimäärien tuotannon integroituina Y. lipolytica 30 -soluihin muuhun kohtaan kuin xpr2-lokukseen. Heterologis-ten geenien tehokas ilmentyminen tämän kaltaisissa inte-granteissa saattaa kuitenkin vaatia tämän kaltaisissa in-tegranteissa saattaa kuitenkin vaatia tämän säätelyalue-DNA:n lisämuuntamista.
35 Prorenniinin eritys: Y. lipolytica -kanta ATCC
20688 transformoitiin pilkkomattomalla pLS-3-DNA:11a ja 38 90352
SnaBI-pilkotulla pLS-3-DNA;11a, jolloin saatiin xpr Leu+-transformantit ATCC 20775 (DL144) ja vastaavasti ATCC 20776 (DL148). Näillä transformanteilla inokuloitiin YEPD-alustaa sisältävä koeputki. Soluja kasvatettiin yön yli 5 28°C:ssa. Osa näistä viljelmistä (250 yul) laimennettiin suhteessa 1:100 (25 ml:ksi) GPP-alustalla. Soluja kasvatettiin ravistuspullossa 28°C:ssa 16-18 tuntia eli kunnes absorbanssi aallonpituudella 600 nm oli 5,0 - 7,0 ja kerättiin sentrifugoimalla. Tuloksena olevasta viljelmänestees-10 tä eli supernatantista tutkittiin prorenniinin läsnäolo konsentroimalla supernatantti ja tekemällä konsentraatille SDS-PAGE. Levygeeli siirrettiin elektroforeettisesti nitro-selluloosapaperille 20 mM Tris-emäksen, joka sisälsi 150 mmol/1 glysiiniä ja 20 % metanolia, läsnä ollessa kä-15 sittelemällä 500 mA:n virralla kaksi tuntia 4°C:ssa. Proteiinin poistuminen levygeeliltä varmistettiin värjäämällä Coomassie-sinisellä.
Nitroselluloosapaperi kuivattiin lämpötilassa 37°C ja pidettiin sitten yksi tunti lämpötilassa 65°C, minkä 20 jälkeen se pestiin TBS-liuoksessa (200 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 Tris-GCl, pH 7,5). Sitten paperia inkuboitiin yksi tunti huoneen lämpötilassa TBS:ssä, joka sisälsi 10 % hevosen seerumin (Gibco, Chagrin Falls. Ohio) ja sen jälkeen TBSrssä, joka sisälsi 10 % hevosen seerumia ja sopiva-25 na pitoisuutena prorenniinivasta-ainetta, 16 tuntia huoneen lämpötilassa. Sitten paperia pestiin kolmesti 10 minuuttia TBS:ssä, inkuboitiin 10 % hevosen seerumia sisältävässä TBSrssä ja sitten kaksi tuntia TBS:ssä, joka sisälsi 10 % hevosen seerumia ja sopivana pitoisuutena piparjuuri-30 peroksidaasiin sidottua vuohen anti-kaniini-IgG-vasta-ai-netta. Sitten paperi pestiin kolmesti 10 minuuttia TBS:ssä ja kehitettiin 4-kloori-1-naftolin (3 mg/ml metanolissa) läsnä ollessa, jota lisättiin pitoisuudeksi 0,5 mg/ml, TBS:ssä, joka sisälsi 0,01 % vetyperoksidia. Prorenniinin, 35 jonka molekyylipaino oli 40 000, läsnäolo kummassakin su-pernatantissa varmistettiin.
39 90352
Konsentroitujen viljelmäsupernatanttien (ks. edellä) happoaktivoinnin jälkeen havaittiin pLS-3 sisältävistä transformanttiviljelmistä ATCC 20775 ja 20776 valmistetuilla näytteillä olevan merkittävä maidonjuoksetusaktiivi-5 suus. Kuten oli odotettavissa, vastaanottajakannasta Y. li-polytica ATCC 20688 valmistetulla vertailuviljelmäsuperna-tantilla ei ollut maidonjuoksetusvaikutusta.
Ilmentymis/erittymisplasmidin pXX-33 muodostaminen: Muuntamiset, jotka tehtiin pLS-3:n muuttamiseksi paranne-10 tuksi ilmentymisplasmidiksi pXX-33, esitetään pääpiirteittäin kuviossa 6. Tämä muuntaminen suurensi XPR2-promootto-rialuetta 280 emäsparilla. Samoin kuin pLS-3, ilmentymis-plasmidi pXX-33 sisältää hybridigeenin, joka koodaa koko alkalisen proteaasin prepro-peptidiä (157 aminohapporyh-15 mää), liittyneenä koko prorenniinirakennegeenisekvenssiin.
Ennen kuin voitiin muodostaa prorenniini-ilmentymis/ erittymisplasmideja, joissa on 280 emäsparin verran enemmän XPR2-promoottorisekvenssiä kuin pLS-3:ssa, oli välttämätöntä alikloonata koko alkalista proteaasia vastaavan gee-20 nin sisältävä restriktiofragmentti Hindlll-kohtaan. Tämä aliklooni muodostettiin lisäämällä synteettiset kytkijät XPR2-genomikirjastokloonista pLD86 eristettyyn restriktio-fragmenttiin. Tämän XPR2-alikloonin, jossa on edellä Hindlll-kohta, muodostaminen aloitettiin valmistamalla 25 DNA-fragmentti, joka sisälsi koko alkalista proteaasia vastaavan geenin. XPR2-kloonin pLD-86 genomialueelta eristetty 2,3 ke:n EcoRI-BamHI-(osittais)fragmentti puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja ligatoitiin synteettisen fragmentin kanssa, jonka sekvenssi oli 30 5' GATCGAAGCTTG 3' 3' TTCGAACTTAA 5' Tämä kytkijäsekvenssi sisältää tarttuvan BamHI-pään (mutta ei regeneroi BamHI-kohtaa), sen jälkeen Hindll-kohdan ja sen jälkeen tarttuvan EcoRI-pään. Ligaatiotuote pilkot-35 tiin HindlII:lla ja sijoitettiin pBR322:n HindiII-kohtaan. Plasmidi pXHP--24 identifioitiin restriktiokarttansa 40 90352 avulla ja siitä tuli XPR2-promoottorifragmenttien lähde myöhempiin ilmentymisrakenteisiin.
Plasmidissa pXHP-24 alikloonattu XPR2-geeni sisältää noin 280 emäsparia enemmän 5'-XPR2-promoottorisekvens-5 siä kuin pLS-3:n sisältämä XPR2-promoottorisekvenssi. Ensin muodostettiin promoottorikomponenttifragmentti tavanomaisella ligaatioreaktiolla, jossa käytettiin synteettistä DNA-fragmenttia (kuvattu edellä pLS-3:n yhteydessä) ja pXHP-24:stä eristettyä 1 150 emäsparin Hindlll-Aval-frag-10 menttia yhdessä T4-ligaasin kanssa, minkä jälkeen tehtiin pilkkominen HindIII:lla ja BamHI:llä. Tuloksena olevat li-gatoituneet sekvenssit puhdistettiin geelielektroforeesil-la ja valikoitiin noin 1 196 emäsparin pituinen Hindlll-BamH-fragmentti. Toinen fragmentti, joka sisälsi proren-15 niiniaminohapporyhmiä 6-151 koodaavat sekvenssit, valmistettiin pLS-3:sta pilkkomalla BamHI:llä ja Xmal:llä ja puhdistamalla geelillä tuloksena oleva 440 emäsparin BamHI-Xmal-DNA-fragmentti. Kolmas fragmentti, joka sisälsi loppuosan prorenniinigeenistä, XPR2-terminaattorin ja vektori-20 sekvenssit, valmistettiin pLS-3:sta pilkkomalla HindIII:lla ja Xmal:llä ja puhdistamalla geelillä noin 8,0 ke:n Hindlll-Xmal-vektorifragmentti. Nämä kolme fragmenttia ligatoitiin sitten edellä kuvatulla tavanomaisella menettelyllä. Ligaa-tiotuotteella transformoitiin sitten E. coli K12 -kanta 25 MM294. Ampisilliiniresistenssin perusteella valikoiduista transformanteista eristettiin plasmidit ja plasmidi pXX-33 identifioitiin restriktiokarttansa perusteella (kuvio 6). Tämän plasmidin proteaasi-prorenniinialue sekven-toitiin haluttujen fragmenttien oikean liittymisen varmis-30 tamiseksi.
Sitten transformoitiin Y. lipolytica ATCC 20744 Snal-pilkotulla pXX-33;11a, jolloin saatiin Y. lipolytica ATCC 20780 ja tutkittiin transformoitujen viljelmien ela-tusliemeen erittämä prorenniini edellä pLS-3:n yhteydessä 35 kuvatulla tavalla. Täten vahvistettiin prorenniinin läsnäolo viljelmän supernatantissa.
41 90352
Konsentroitujen viljelmäsupernatanttien (ks. edellä) happoaktivoinnin jälkeen havaittiin merkittävä maidonjuok-setusaktiivisuus näytteillä, jotka oli valmistettu transformoidun Y. lipolytica ATCC 20780:n viljelmästä.
5 Ilmentymis/erittymisplasmidin pXX-22 muodostaminen:
Vaiheet, jotka liittivät ilmentymis/erittymisplasmidin pXX-22 muodostukseen, esitetään kuviossa 7. Tämä ilmenty-misvektori eroaa pLS-3:sta kahdessa suhteessa. Samoin kuin pXX-33 se sisältää 280 emäsparin lisäsegmentin XPR2-pro-10 moottorisekvenssiä. Lisäksi se sisältää alkalisen proteaa-sin signaalipeptidiä ja vain 38 pro-peptidin (prol) amino-happoryhmää koodaavan sekvenssin.
pXX-22:n muodostaminen tapahtui samalla tavalla kuin pXX-33:n. Ensin muodostettiin promoottorikomponenttifrag-15 mentti tavanomaisella ligaatioreaktiolla, jossa käytettiin pXHP-24:stä eristettyä 890 emäsparin HindIII-BglII-frag-menttia ja synteettistä fragmenttia 5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3' 3' AAC GACTCTAGTGATCCTAG 5' 20 yhdessä T4-ligaasin kanssa, minkä jälkeen tehtiin pilkkominen HindIII:lla ja BamHI:llä. Saadut ligatoidut sekvenssit puhdistettiin eristämällä geelielektroforeesin avulla 920 emäsparin HindIII-BamHI-DNA-fragmentti. Toinen fragmentti, joka koodaa prorenniiniryhmiä 6-151 eristettiin pLS-3:sta 25 pilkkomella BamHI:llä ja Xmal:llä ja puhdistamalla geelillä tuloksena oleva 440 ep:n BamHI-Xmal-DNA-fragmentti. Kolmas fragmentti, joka sisältää loppuosan prorenniinigeenistä, XPR2-terminaattorin ja vektorisekvenssit, valmistettiin pilkkomalla pLS-3 HindIII:lla ja Xmalillä ja puhdistamalla 30 geelillä noin 8,0 ke:n vektorifragmentti. Sitten nämä kolme DNA-fragmenttia ligatoitiin edellä kuvattua tavanomaista menettelyä käyttäen. Ligaatiotuotteella transformoitiin E. coli K12 -kanta MM294. Valikoiduista transformanteista eristettiin plasmidit ja plasmidi pXX-22 identifioitiin 35 restriktiokarttansa perusteella (kuvio 7).
42 90352
Sitten transformoitiin Y. lipolytica ATCC 20774 SnaBI-pilkotulla pXX-22:lla, jolloin saatiin Y. lipolytica ATCC 20779, ja tutkittiin transformoitujen viljelmien ela-tusliemeen erittämä prorenniini edellä pLS-3:n yhteydessä 5 kuvatulla tavalla. Prorenniinin läsnäolo viljelmän superna-tantissa vahvistettiin edellä kuvatulla menettelyllä. Kun konsentroidut viljelmäsupernatantit oli aktivoitu hapolla (ks. edellä), havaittiin merkittävä maidonjuoksetusaktii-visuus näytteillä, jotka oli valmistettu transformoidun 10 Y. lipolytica 20779:n viljelmästä.
Ilmentymis/erittymisplasmidin pXX-11 muodostaminen: Vaiheet, jotka toteutettiin prorenniini-ilmentymis/eritty-misplasmidia pXX-11 muodostettaessa, esitetään pääpiirteittäin kuviossa 8. Tämä plasmidi sisältää XPR2-promoottoria 15 ja 22 aminohapporyhmän signaalipeptidiä vastaavan sekvenssin liittyneenä prorenniiniä koodaavaan sekvenssiin. pXX-11:n muodostamisohjelma oli samanlainen kuin pXX-22:n ja pXX-33:n. Lyhyesti ilmeistuna promoottorikomponentti-fragmentti muodostettiin tavanomaisella ligaatioreaktiol-20 la, jossa käytettiin pXHP-24:stä eristettyä noin 750 ep:n HindIII-BglII-DNA-fragmenttia ja synteettistä fragmenttia 5' TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3 ’ 3 ' AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5'-> 25 yhdessä T4-ligaasin kanssa, minkä jälkeen tehtiin pilkkominen HindIII:lla ja BamHI:llä. Tuloksena olevat ligatoi-tuneet sekvenssit puhdistettiin geelielektroforeesilla ja valikoitiin 790 ep:n Hindlll-BamHI-fragmentti. Toinen fragmentti, joka koodaa prorenniiniryhmiä 6-151, eristet-30 tiin pLS-3:sta pilkkomalla BamHI:llä ja Xmal:llä ja puhdistamalla geelillä tuloksena oleva 440 ep:n BamHI-Xmal-DNA-fragmentti. Kolmas fragmentti, joka sisältää loppuosan prorenniinirakennegeenistä, XPR2-terminaattorin ja sukku-lavektorisekvenssit, valmistettiin pilkkomalla pLS-3 35 Hindlll:11a ja Xmal:llä ja puhdistamalla geelillä noin 8,0 ke:n vektorifragmentti. Sitten nämä kolme DNA- 43 90352 fragmenttia ligatoitiin käyttämällä edellä kuvattua tavanomaista menettelyä. Ligaatiotuotteella transformoitiin E. coli K12 -kanta MM294. Valikoiduista transformanteista eristettiin plasmidit ja plasmidit pXX-11 identifioitiin 5 restriktiokarttansa perusteella (kuvio 8). Tämä plasmidin XPR2-prorenniiniosa sekventoitiin synteettisen DNA:n oikean sekvenssin ja haluttujen fragmenttien oikean liittymisen varmistamiseksi.
Y. lipolytica ATCC 20774 transformoitiin sitten 10 SnaBI-pilkotulla pXX-11:llä, jolloin saatiin Y. lipolytica 20778 ja tutkittiin transformoitujen viljelmien elatus-liuokseen erittämä prorenniini edellä pLS-3:n yhteydessä kuvatulla tavalla. Prorenniinin läsnäolo viljelmän superna-tantissa vahvistettiin edellä kuvatulla tavalla.
15 Maidonjuoksetuskokeet (ks. edellä) osoittivat, että pXX-11 sisältävien transformanttien ATCC 20778 viljelmäsu-pernatantilla oli merkittävä maitoa juoksettava vaikutus.
Esimerkki 2
Telakoitumiskohdan muodostaminen: Villin tyypin 20 ΒΙΟ-geeni, joka vastaa ATCC 20774:n bio-6-alleelia, kloonattiin komplementaation kautta seuraavasti. Muodostettiin pLD40:n (joka on pBR322 + LEU2 EcoRI-kohdassa) BamHI-koh-taan sijoitetusta, Sau3A:lla osittain pilkotusta Y. lipolytica -kromosomi-DNA:sta koostuva geenikirjasto ja val-25 mistettiin suuri määrä kirjasto-DNA:ta seosviljelmä - E. coli -plasmidivalmisteena. (Tätä samaa kirjastoa käytettiin XPR2-geenin kloonaamiseen.) Muutamia mikrogrammoja kirjasto-DNA:ta pilkottiin Apal-entsyymillä (joka saa aikaan yhden katkeamisen LEU2-alueella). Sitten transformoi-30 tiin ATCC 20774 (leu2 xpr2 bio) tällä DNA:lla siirrostaen transformaatioseos leusiinittomalle synteettiselle alustalle. Saatiin kymmeniä tuhansia leusiinistä riippumattomia transformantteja. Sen selvittämiseksi, mitkä, jos mitkään, pesäkkeet sisälsivät kirjastoplasmideja, joissa on 35 ΒΙΟ-geeni, leusiinistä riippumattomat transformantit rep-likasiirrostettiin agarlevyille, jotka sisälsivät 44 90 3S2 biotiinivalikointialustaa (sisältää litrassa 25 mg detio-biotiinia, 20 g glukoosia, 5 g ammoniumsulfaattia, 1 g KH2P04, 0,5 g MgS04-7H20, 0,1 g CaCl2, 0,1 g NaCl, 500 ^ug boorihappoa, 400 ^ug tiamiinihydrokloridia, 400 ^ug ZnSo4.
5 7H20, 400 yug MnSC>4.H20, 200 ^ug Na2Mo04.2H20, 200 /ug
FeCl3.6H20, 100 ^,ug KI ja 40 ^,ug CuS04.5H20),
Yksi muutamasta biotiinivalikointialustalla kasvavasta Y. lipolytica BI0+ -transformantista nimettiin DL31:ksi. Sitten pyrittiin eristämään Y. lipolytica -kan-10 nasta DL31 ΒΙΟ-geenin sisältävän geenikirjastoplasmidin. Kannan DL31 viljelmästä preparoitiin kromosomi-DNA. Muutama mikrogramma tätä kromosomi-DNA:ta pilkottiin restrik-tioentsyymillä Apal kirjastoplasmidin irrottamiseksi. Osa pilkotusta DNA:sta käytettiin ligaatioreaktiossa tuntemat-15 toman kirjastoplasmidin sulkemiseen renkaaksi. Ligaatio-seoksella transformoitiin sitten E. coli -viljelmä ampi-silliiniresitentiksi tuntemattoman ΒΙΟ-geenin sisältävän plasmidin keräämiseksi E. coliin. Saatiin muutamia ampisil-liiniresitenttejä E. coli -transformantteja. E. coli -trans-20 formanteista valmistettiin pienet plasmidipreparaatit. Siten saadun plasmidi-DNA:n restriktioentsyymipilkkomiset osoittivat, että tuntematon ΒΙΟ-geenin sisältävä plasmidi oli, kuten odotettiin, ekvivalenttinen pLD40:n kanssa, joka sisältää insertin BamHI-kohdassa. Tämän plasmidin täy-25 tyy olla peräisin geenikirjastosta ja se nimettiin pLD51:ksi. Plasmidi pLD56 muodostettiin pLD51:n alikloonina poistamalla pLD51:stä LEU2-geeniseuraavasti. Osa plasmidis-ta pLD51 pilkottiin EcoRI:llä LEU2-alueen poistamiseksi. Pilkottu DNA käytettiin DNA-ligaatioreaktiossa plasmidin 30 sulkemiseen uudelleen renkaaksi. Sitten transformoitiin E. coli pienemmän ΒΙΟ-geenin sisältävän plasmidin kloonaamiseksi. Yhden ampisilliiniresitenteistä E. coli -trans-formanteista osoitettiin sisältävän odotetun pienemmän plasmidin, joka nimettiin pLD56:ksi. pLD56:lle tehtiin useita 35 restriktioentsyymipilkkomisia. pLD56:n ΒΙΟ-geenin sisältävä 45 90352 segmentti, joka esiintyy inserttinä pBR322:n BamHI-kohdas-sa, oli noin 3,6 ke;n pituinen.
pBR322:n BamHI-kohdassa olevan 3,6 ke:n Y. lipoly-tica -DNA-insertin (muodostuu pLD56:sta) hyvin karkeaa 5 restriktiokarttaa kuvataan seuraavassa; approksimatiivinen etäisyys (emäsparia) insertion alusta annetaan suluissa. Kokoarvioinnit tehtiin muutamalta agaroosigeeliltä ja niissä voi olla suhteellisen suuria kvantitatiivisia virheitä: PvuII (800), PvuII (1 200), PstI (1 800), MluI (2 000), 10 PstI (2 300), EcoRV (2 700) ja Ncol (3 200) (orientaatio on sellainen, että pBR322;n Sali-kohta edeltäisi kuvattuja kohtia ja Hindlll-kohta olisi niiden jälkeen).
Kanta ATCC 20744 (MATB leu2-40 bio-6 spr-2-1002) transformoitiin koskemattomalla pLD56:lla (pBR322 + noin 15 3,6 ke y. lipolytica -kromosomi-DNA:ta, joka sisältää ΒΙΟ-geenin). Kolmesta erilaisesta biotiinista riippumattomasta transformantista tutkittiin suuritiheyksinen Nrul-pilkotun (kohdistuu pBR322:een) pLD40:n (LEU2 pBR322:ssa) transformaatio verrattuna lähtökantaan, sen määrittämisek-20 si, mikä transformantti sisälsi ΒΙΟ-alueeseen integroituneen pBR322:n. Kaikissa kolmessa havaittiin suuritiheyksinen transformaatio, joka aiheutui pLD40:n integroitumisesta transformantissa olleeseen pBR322:een. Tämä vahvistettiin Southern-täpläkokein. Yksi kolmesta alkuperäisestä 25 Y. lipolytica BIO -transformantista nimettiin DL118:ksi ja sitä käytettiin edelleen DNA-vastaanottajana. Edellä esitettyä restriktiokarttaa tarvittiin määritettäessä (i) mitä osaa käytetään ΒΙΟ-spesifisenä hybridisaatiokoettimena (Ncol-PvuII-pala), (ii) mitä entsyymiä tarvitaan pLD56-30 plasmidin oikeaan irrottamiseen (MluI), (iii) mikä entsyymi tekee kerran katkaisun vain pBR322-osassa (Clal) ja (iv) mikä entsyymi ei pilko plasmidia ollenkaan (Apal).
ATCC 20774:n ja DL118;n DNA:n Clal- ja Apal-pilkkomistuot-teiden Southern-hybridisaatiot (koettimena ΒΙΟ-fragmentti) 35 osoittivat, kuten odotettiin, että kooltaan pLD56 vastaava DNA-additio oli katkaissut DLl18:n biotiinialueen 46 9 0 3 5 2 (verrattuna ATCC 20774:n ΒΙΟ-alueeseen). DL118-DNA:n MluI-pilkkomistuotteet (koettimena pBR322) osoittivat lisäksi, että additio oli saman kokoinen kuin koskematon pLD56.
Ilmentymis/erittymisplasmidin pLD-34 muodostaminen: 5 On muodostettu ilmentymisplasmidi, jossa XPR2-erittymis-signaaleilla (157 aminohapon prepro-sekvenssit) varustettu prorenniiniä koodaava sekvenssi sijaitsee LEU2-promootto-rin jäljessä. Tämä ilmentymisplasmidi osoittaa, että muutakin kuin XPR2-promoottoria voidaan käyttää heterologis-10 ten proteiinien ilmentymisen aikaansaantiin. Tällä ilmen-tymisvektorilla on lisäksi kyky saada aikaan ilmentyminen/ erittyminen riippumatta integraatiokohdasta Y. lipolytica -genomissa. Prorenniinin menestyksellinen eritys muulla promoottorilla kuin XPRsllä osoittaa, miten käyttökelpoi-15 nen ilmentymisvektorirakenne on vaihtoehtoisten uusien promoottorien identifioinnissa Y. lipolyticassa. Tätä lähestymistapaa voidaan lisäksi käyttää ilmentymisviljelmän aikaansaantiin, jossa on kaksi erillistä hybridiprorennii-nigeeniä, joista toinen ilmentyy LEU2-promoottorin ja toi-20 nen XPR2-promoottorin ohjaamana, integroituina isäntäge-nomin eri kohtiin.
Vaiheet, joita käytettiin muodostettaessa ilmenty-misvektori, joka sisältää LEU2-promoottorisekvenssin ohjauksessa ilmentyvän, alkalisen proteaasin erittymissignaa-25 leiliä (157 aminohapon XPR2-prepro-sekvenssi) varustetun prorenniinigeenin, esitetään pääpiirteittäin kuviossa 13. Tämän plasmidin muodostaminen aloitettiin valmistamalla LEU2-promoottorifragmentti, joka sisälsi noin 300 emäspa-ria 5'-pään transloitumatonta sekvenssiä, joka edeltää bee-30 ta-isopropyylimalaattidehydrogenaasigeenin (kuvio 12) luennan aloituskodonin ATG. 300 ep:n HindiII-Fokl-DNA-fragmentti, joka sisältää 270 ep:n osan LEU2-promoottorisekvens-sistä, eristettiin sukkulavektorista pLD40. Tämä fragmentti ligatoitiin 54 ep:n pituiseen synteettiseen kytkijään 47 90352 —---—---Leu2-------
FokI
5 ' - ATACAACCACACACATCCACAATG 3 ' - TTGGTGTGTGTAGGT GTTAC
5 -----------------Xpr2----------------
Bgll AAGCTCGCTACCGCCTTTACTATTCTCACTGCCGTTC-3 ’ TTCGAGCGATGGCGGAAATGATAAGAGTGACGGC -5’ T4-ligaasia käyttäen, minkä jälkeen tehtiin pilkkominen 10 HindIII:lla. Tuloksena olevat ligatoidut sekvenssit puhdistettiin eristämällä geelielektroforeettisesti noin 360 ep:n pituinen HindIII-BglI-DNA-fragmentti. Toinen rakenneosana toimiva fragmentti, joka koodaa loppuosaa XPR2-prepro-sekvenssistä ja prorenniinin 152 ensimmäistä amino-15 happoryhmää, eristettiin ilmentymisplasmidista pXX-33 (kuvio 6) pilkkomalla Bgll:llä ja Xmalrllä ja puhdistamalla saatu 887 ep:n DNA-fragmentti geelillä. Kolmas fragmentti, joka sisältää loppuosan prorenniinigeenistä, XPR2-terminaattorin ja vektorisekvenssit, valmistettiin pilkko-20 maila pXX-33 HindIII:lla ja Xmalrllä ja puhdistamalla geelillä noin 8,0 ke:n vektorifragmentti. Nämä kolme DNA-fragmenttia ligatoitiin edellä kuvatulla tavanomaisella menettelyllä. Ligaatiosekseoksella transformoitiin E. coli K12 -kanta HB101. Ampisilliiniresistenssin perusteella va-25 likoiduista transformanteista eristettiin plasmidit ja plasmidi pLX-34 identifioitiin restriktiokarttansa perusteella (kuvio 13).
Y. lipolytica ATCC 20794 (DL118) transformoitiin Nrul-pilkotulla pLX-34-DNA:11a, jolloin saatiin Y. lipo-30 lytica ATCC 20975 (DL251), ja tutkittiin leusiinista riippumattoman transformanttiviljelmän alustaan erittämä pro-renniini edellä pLS-3:n yhteydessä kuvatulla tavalla. Tämä transforrnointimenettely ohjasi pLX-34:n integroitumaan pBR322-sekvenssiin, joka oli aiemmin viety isäntäkromoso-35 min (kuvattu edellä) bio-lokukseen. pLX-34:n integroituminen tähän kohtaan varmistettiin Southern-analyysillä.
48 90352 DL118:n käyttö vastaanottajana; Southern-hybridi- saatiot tehtiin seuraavasti: DL118-transformantti:DNA:n (hybridisoitui esimerkiksi prokymosiinikoettimen kanssa, kun sijoitettu plasmidi oli prokymosiini-ilmentymisplas- 5 midi) pilkkominen Nrul:llä irrotti tarkasti transformant- tiin sijoitetun plasmidin. Muutamalla nanogrammalla NruI- pilkottua transformointiplasmidia tarkistettiin hybridi- soituvan vyöhykkeen oikea koko. Myös näiden transformant- 32 tien DNA:n (koettimena P-leimattu pBR322) pilkkominen 10 Mlul:llä (MluI ei katkaissut transformointiplasmideja) osoitti, että DL118:ssä olleen pBR322-sekvenssin oli katkaissut yksi tai useampia molekyylejä lisättyä transformointiplasmidia. Tämä osoitti, että integroituminen tapahtui haluttuun kohtaan.
15 Y. lipolytica ATCC 20795 (DL251) -transformantti- viljelmää kasvatettiin YEPD-alustassa 22°C:ssa LEU2-pro-moottorin ohjauksessa tapahtuvan ilmentymisen edistämiseksi, Prorenniinin läsnäolo viljelmien supernatanteissa varmistettiin happoaktivoitujen viljelmäsupernatanttien mai-20 donjuoksetuskokeella (ks. edellä) ja vahvistettiin vielä immuunitäpläanalyysillä (ks. edellä). Nämä tulokset osoittavat, että tämä hybridigeeni on riippumaton ilmentymisyk-sikkö, jolla on kyky saada aikaan ilmentyminen/erittyminen integroituna muuhun kuin XPR2- tai LEU2-kohtaan. Tämä piir-25 re antaa mahdollisuuden muodostaa ilmentymisviljelmä, jossa on useita hybridigeenejä ja jolla on mahdollisesti kyky saada aikaan ekrasellulaarisen prorenniinin tuotantomäärän lisääntyminen.
Esimerkki 3 30 Ihmisen C5a;ta koodaava synteettinen geenisekvenssi:
Suunnitelma, jota noudatettiin ihmisen anafylatoksiini C5a:n tuottamiseksi bakteereissa, oli analoginen aiempien menetelmien kanssa, joita käytettiin EGF:n syntetisoimi-seen ja tuottamiseen ja joita kuvataan EP-hakemusjulkai-35 sussa 147 178. Siinä käytettiin geenirakennetta, jossa aktivoitunutta komplementtikomponenttia C5a koodaava 49 90352 sekvenssi valmistettiin synteettisesti. Ihmisen C5a:n tunnetun aminohapposekvenssin perusteella suunniteltiin DNA-fragmentti, joka koodaa sen 74 aminohappoa (kuvio 9). Synteettinen geenisekvenssi valittiin siten, että käytettiin 5 mahdollisimman paljon E. colin ja S. cerevisiaen suosimia kodoneja ja muodostettiin useita restriktioendonukleaasi-kohtia karakterisoinnin helpottamiseksi. Tämä lähestymistapa mahdollisti anafylatoksiinigeenin suoran ilmentämisen E. colissa sijoittamalla proteiinisynteesin aloituskodoni 10 ATG C5a-polypeptidin ensimmäistä aminohappoa koodaavan tripletin eteen. Jotta helpotettaisiin synteettisen C5a-geenin sijoittamista oikein orientoituneena plasmidiin pBR322, se suunniteltiin sisältämään EcoRI- ja Hindlll-restriktioendonukleaasitunnistuskohdat päissään. Valmistet-15 tavan C5a-geenisekvenssin muodostamiseksi syntetisoitiin 10 47-meeriä ja koottiin niistä 235 emäsparin kaksisäikeinen DNA-fragmentti. C5a-geenifragmentti insertoitiin asianmukaisesti avattuun pBR322:een ja kloonattu geeni identifioitiin tekemällä sattumanvaraisesti valituista transforman-20 teista eristetyille plasmidi-DNA:ille restriktiopilkkomis-analyysi. Useiden C5a-kloonien DNA sekventoitiin sitten oikean sekvenssin sisältävän kloonin identifioimiseksi. Haluttu C5a-geenialueen nukleotidisekvenssi löydettiin kahdesta kloonista tutkittujen viiden kloonin joukosta.
25 ihmisen C5a:n tuottaminen bakteerissa: C5a-ilmen- tymisplasmidien muodostaminen aloitettiin pilkkomalla C5a-aliklooni restriktioendonukleaasilla EcoRI, minkä jälkeen tehtiin defosforylaatio käsittelemällä bakteriaalisella alkalisella fosfataasilla. C5a-ilmentymisplasmidi muodos-30 tettiin käyttämällä pPFZ-R2:sta eristettyä 360 ep:n EcoRI-DNA-fragmenttia, joka sisälsi trp-promoottori-operaattorin ja ribosomin sitoutumiskohdan. E. coli -kannan HB101 kompetentit solut transformoitiin ligaatioseoksella. Kustakin transformaatioseoksesta puhdistettiin useita lääkkeelle 35 resistenttejä pesäkkeitä ja tehtiin niiden plasmidi-DNA:ille restriktiokartoitus niiden DNA:iden löytämiseksi, joissa 50 90 352 trp-promoottori on sellaisessa orientaatiossa, joka johtaisi C5a-geenin transkriptioon. Tästä ligaatioreaktio-seoksesta identifioitiin useita näytteitä, joissa oleva plasmidi sisälsi rinnakkaiset anafylatoksiinigeenin ja 5 bakteriaalisen promoottorin C5a-geenin suoran ilmentymisen vaatimassa konfiguraatiossa. C5a-ilmentymisplasmidin pC5a-48 restriktiokartta esitetään kuviossa 10.
Ihmisen anafylatoksiinin tuottaminen ja erittäminen Y. lipolyticassa: Ihmisen anafylatoksiini C5a:n eritystä 10 koodaava ilmentymis/erittymisvektori pC5aX-3 valmistettiin käyttämällä menetelmiä, joita kuvattiin esimerkissä 1 pXX-33:n yhteydessä. Y. lipolytica ATCC 20774 transformoitiin sitten tällä ilmentymisvektorilla ja tutkittiin transformoitujen viljelmien tuottama ihmis-C5a muuten edel-15 lä kuvatulla tavalla, mutta käytettiin immuunitäpläkokeis-sa vuohen anti-C5a:ta ja kaniinin anti-vuohi-IgG:tä. C5a:n läsnäolo viljelmäsupernatantissa vahvistettiin tämän keksinnön mukaiselle plasmidille.
Ilmentymis/erittymisplasmidin pC5aX-3:n muodostami-20 nen: Anafylatoksiini-ilmentymis/erittymisplasmidin pC5aX-3:n muodostamiseen liittyneet vaiheet esitetään pääpiirteittäin kuviossa 11. Tämä plasmidi sisältää "täydellistä" XPR2-promoottoria vastaavan sekvenssin ja 157 aminohapon signaalia ja propeptidiä vastaavan sekvenssin liittyneenä 25 synteettiseen sekvenssiin, joka koodaa 74 C5a-aminohappo-ryhmää. pC5aX-3:n muodostamissuunnitelma oli samanlainen kuin pXX-33:n yhteydessä käytetty. Ensin pilkottiin plasmidi pXHP-24 (tai muu halutun sekvenssin sisältävä plasmidi) HindIII:lla ja Aval:llä ja puhdistettiin geelillä 30 XPR2-promoottorin sisältävä 1 150 ep:n fragmentti. Toinen fragmentti, joka sisälsi XPR2-propeptidin 3'-päätä koodaa-van jakson ja C5a-rakennegeenisekvenssin, muodostettiin tavanomaisella ligaatioreaktiolla, jossa käytettiin E. coli -ilmentymisplasmidista pC5a-48 eristettyä 220 emäsparin 35 HinfI-HindIII-DNA-fragmenttia ja synteettistä fragmenttia 51 90352 5 ’ CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGA 3' 3 ' CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTTGA 5' yhdessä T4-ligaasin kanssa, minkä jälkeen tehtiin pilkko-5 minen Aval:llä ja HindIII:lla. Tuloksena olevat ligatoidut sekvenssit puhdistettiin geelielektroforeesilla ja valikoitiin noin 250 ep:n AvaI-HindIII-fragmentti. Promoottorin sisältävä HindIII-AvaI-fragmentti ja C5a:ta koodaava AvaI-HindIII-fragmentti ligatoitiin sitten T4-ligaasilla, 10 minkä jälkeen tehtiin pilkkominen HindIII:lla. Noin 1,4 ke:n fragmentti puhdistettiin geelillä ja ligatoitiin Hindm-pilkotun pterm 4:n (kuvattiin edellä) kanssa. Li-gaatioseoksella transformoitiin E. coli K12 -kanta MM294. Ampisilliiniresistenssin perusteella valikoidut plasmidit 15 eristettiin valikoiduista transformanteista ja plasmidi pC5aX-3 identifioitiin restriktiokarttansa perusteella.
Y. lipolytica -kanta PC-30869, ATCC 20774, transformoitiin sitten SnaBI-pilkotulla pC5aX-3:lla ja tutkittiin transformoitujen viljelmien alustaan erittämä anafylatoksiini edel-20 lä kuvatulla tavalla. C5a:n läsnäolo viljelmäsupernatan-tissa vahvistettiin edellä kuvatulla tavalla.
On tunnettua, että monet endoplasman retikulumiin sitoutuneiden ribosomien syntetisoimat proteiinit tuotetaan glykoproteiineissa. Glykosylaatio saattaa itse asias-25 sa vaikuttaa kyseessä olevan proteiinin erittymiseen. Euka-rioottisten proteiinien N-sidottu glykosyloituminen tapahtuu tripeptidisekvensseissä asparagiini-X-treoniini ja asparagiini-X-seriini, jossa X voi olla mikä tahansa amino-happoryhmä, paitsi mahdollisesti aspartaatti /Hubbard, S.
.. . 30 et ai., Ann. Rev. Biochem. 50 (1981) 555./. Prorenniinin aminohapposekvenssi sisältää kaksi tällaista tripeptidi-sekvenssiä; Y. lipolytica -viljelmien erittämän prorenniinin geelielektroforeesianalyysissä ei kuitenkaan havaittu mitään merkkejä glykosyloitumisesta. On todennäköistä, et-35 teivät tripeptidisekvenssien sisältämät tietyt asparagiinit 52 90352 glykosyloidu, koska ne ovat glykosylaatioentsyymien tavoittamattomissa .
Ihmisen C5a;n ollessa kyseessä aminohapposekvenssi sisältää yhden glykosylaatiokohdan eli tripeptidisekvens-5 sin (Asn-Ile-Ser), jossa normaalisti on monimutkainen oligosakkaridi liittyneenä asparagiiniin /Fernandez, H. et ai., J. Immunol. 117 (1976) 1688/. Osa Y. lipolytican kasvualustaan erittyvistä C5a-molekyyleistä näyttää olevan gly-kosyloituneita, koska immuunitäpläkokeessa havaitaan suu-10 ria molekyylipainoja vastaavassa osassa laaja antigeeni-aktiivisuusalue. Tämä heterogeeninen liikkuvuus elektroforeesissa vastaa muiden erittyneiden proteiinien yhteydessä havaittua käyttäytymistä ja aiheutuu todennäköisesti vaih-televassa määrin tapahtuvasta hiilihydraattien liittymi-15 sestä. Tämän keksinnön yhteydessä tiettyjen heterologis-ten proteiinien ilmeinen glykosyloituminen viittaa siihen, että ilmentymistä ja erittymistä Y. lipolyticassa voidaan käyttää monien normaalisti glykosyloituneiden eukaryoot-tisten proteiinien tuotantoon.

Claims (41)

  1. 53. O 3 5 2
  2. 1. Menetelmä heterologisen proteiinin tuottamiseksi Y. lipolytica -viljelmän avulla, tunnettu 5 siitä, että (i) Y. lipolyticaan viedään ilmentymisvektori, joka sisältää Y. lipolyticalle heterologista proteiinia koodaavan DNA-sekvenssin ja siihen toiminnallisesti liittyneenä (a) Y. lipolytican XPR2-geenin, tai (b) vähintään 10 yhden seuraavista: Y. lipolytican XPR2-geenin signaali-sekvenssi, prol- tai pro2-sekvenssi ja vähintään yhden seuraavista: LEU2-geeni tai sen promoottorisekvenssi tai XPR2-geenin promoottorisekvenssi; (ii) viljellään siten saatua kohdan (i) mukaista
  3. 15 Y. lipolytica -transformanttia sopivassa ravintoalustas sa; ja (iii) otetaan talteen heterologinen proteiini.
  4. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heterologista proteiinia 20 koodaava DNA-sekvenssi on prorenniiniä tai ihmisen anafy-latoksiini C5a:ta koodaava sekvenssi.
  5. 3. Menetelmä heterologisen proteiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään Y. lipolytica -transformanttia, jolla on kannan ATCC 20780 tunnis- 25 tusominaisuudet, sopivassa ravintoalustassa.
  6. 4. Menetelmä heterologisen proteiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään Y. lipolytica -tranformanttia, jolla on kannan ATCC 20779 tunnis-tusominaisuudet, sopivassa ravintoalustassa.
  7. 5. Menetelmä heterologisen proteiinin tuottamisek si, tunnettu siitä, että viljellään Y. lipolytica -transformanttia, jolla on kannan ATCC 20778 tunnis-tusominaisuudet, sopivassa ravintoalustassa.
  8. 6. Menetelmä heterologisen proteiinin tuottamisek- 35 si, tunnettu siitä, että viljellään Y. lipolytica -transformanttia, jolla on kannan ATCC 20777 tunnis-tusominaisuudet, sopivassa ravintoalustassa. 54 90352
  9. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heterologista proteiinia koodaava geeni sijoitetaan XPR2-geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssin väliin.
  10. 8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heterologista proteiinia koodaava geeni on prorenniiniä tai ihmisen anafylatok-siini C5a:ta koodaava geeni.
  11. 9. Menetelmä alkalista proteaasia tuottamattoman
  12. 10 Y. lipolytica -transformantin valmistamiseksi, tun nettu siitä, että transformoidaan Y. lipolytican XPR+-kanta XPR-ilmentymisrakenteella.
  13. 10. Menetelmä Y. lipolytica -tranformanttien toteamiseksi, joissa vektori-DNA on integroituneena XPR2-gee- 15 niin, tunnettu siitä, että (i) transformoidaan Y. lipolytican XPR*-kanta XPR-ilmentymisrakenteella; ja (ii) tutkitaan kohdan (i) mukaisesti tuotetuista transformanteista alkalisen proteaasin aktiivisuuden hä- 20 viäminen.
  14. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Y. lipolytican XPR+-kanta transformoidaan pilkkomattomalla plasmidin pLS3 DNA:11a tai Snal-pilkotulla pLS3-DNA:11a.
  15. 12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Y. lipolyticalla on Y. lipolytica -kannan ATCC 20688 tunnistusominaisuudet.
  16. 13. Menetelmä Y. lipolytica -transformantin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että integroidaan 30 ilmentymisvektori Y. lipolytica -transformanttiin, joka sisältää heterologisen vektori-DNA:n kanssa homologisen alueen, joka sisältää eksogeenista DNA:ta, joka toimii vastaanottokohtana Y. lipolytican integratiivisen trans-formoinnin aikana.
  17. 14. Menetelmä heterologisen proteiinin tuotta- 55 90352 miseksi, tunnettu siitä, että viljellään Y. lipolytica -transformanttia, jolla on kannan 20795 tunnistusominaisuudet, sopivassa ravintoalustassa.
  18. 15. Menetelmä heterologisen proteiinin tuotta-5 miseksi, tunnettu siitä, että viljellään Y. lipolytica -transformanttia, joka sisältää ilmentymis-vektorin, joka sisältää Y-lipolyuicalle heterologista proteiinia koodaavan DNA-sekvenssin ja siihen toiminnallisesti liittyneenä (a) Y. lipolytican XPR2-geenin, tai 10 (b) vähintään yhden seuraavista: Y. lipolytican XPR2-gee- nin signaalisekvenssi, prol- tai pro2-sekvenssi, ja vähintään yhden seuraavista: LEU2-geeni tai sen promootto-risekvenssi tai XPR2-geenin promoottorisekvenssi ja heterologisen vektori-DNA:n kanssa homologisen alueen, joka 15 sisältää eksogeenistä DNA:ta, joka toimii vastaanottokohtana Y. lipolytican integratiivisen transformoinnin aikana, ja joka homologia-alue on peräisin pBR322:sta tai sen johdannaisesta.
  19. 16. Menetelmä plasmidin pXX-33 valmistamiseksi, 20 tunnettu siitä, että pilkotaan plasmidi pXHP-24 Hindlllrlla ja Aval:llä, jolloin saadaan 1 150 emäsparin fragmentti, eristetään mainittu fragmentti, ligatoidaan mainittu fragmentti synteettisen DNA-25 fragmentin 5'CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG 3'
  20. 3. CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTAG 5' 30 kanssa T4-ligaasin läsnä ollessa, pilkotaan siten saatu ligaatiotuote HindIIX:lla ja BamHI:llä, jolloin saadaan 1 196 emäsparin fragmentti, eristetään mainittu 1 196 emäsparin fragmentti, 35 ligatoidaan mainittu 1 196 emäsparin fragmentti 56 90 352 440 emäsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 BamHIrllä ja Xmal:llä ja noin 8,0 emäsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 HindIII:llä ja Xmalrllä, T4-ligaasin läsnä ollessa, 5 transformoidaan E. coli siten saadulla ligaatio- tuotteella, valikoidaan ampisilliiniresistentit transformantit ja eristetään plasmidi pXX-33 mainituista transfor-10 mänteistä.
  21. 17. Menetelmä plasmidin pXX-22 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että pilkotaan plasmidi pXHP-24 HindIII:lla ja Bglllrlla, jolloin saadaan 890 emäsparin fragmentti, 15 eristetään mainittu fragmentti, ligatoidaan mainittu fragmentti synteettisen DNA-fragmentin 5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3’ 20 3 * AACGACTCTAGTGATCCTAG 5 * kanssa T4-ligaasin läsnä ollessa, pilkotaan siten saatu ligaatiotuote Hindlllrlla ja 25 BamHI:llä, jolloin saadaan 920 emäsparin fragmentti, eristetään mainittu 920 emäsparin fragmentti, ligatoidaan mainittu 920 emäsparin fragmentti 440 emäsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 BamHI:llä ja Xmalrllä ja noin 8,0 kiloemäs-30 parin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 Hindlllrlla ja Xmalrllä, T4-ligaasin läsnä ollessa, transformoidaan E. coli siten saadulla ligaatio-tuotteella, 35 valikoidaan ampisilliiniresistentit transformantit 57 90352 ja eristetään plasmidi pXX-22 mainituista transfor-manteista.
  22. 18. Menetelmä plasmidin pXX-11 valmistamiseksi, 5 tunnettu siitä, että pilkotaan plasmidi pXHP-24 HindIII:lla ja Bglllrlla, jolloin saadaan 750 emäsparin fragmentti, eristetään mainittu fragmentti, ligatoidaan mainittu fragmentti synteettisen frag- 10 mentin
  23. 5. TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3' 3'AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5’ 15 kanssa T4-ligaasin läsnä ollessa, pilkotaan siten saatu ligaatiotuote Hindlllilla ja BamHl:llä, jolloin saadaan 790 emäsparin fragmentti, eristetään mainittu 790 emäsparin fragmentti, ligatoidaan mainittu 790 emäsparin fragmentti 20 440 emäsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 BamHIrllä ja Xmalrllä ja noin 8,0 kiloemäs-parin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 HindIII:lla ja Xmal:llä, T4-ligaasin läsnä ollessa, ' 25 transformoidaan E. coli siten saadulla ligaatio- tuotteella, valikoidaan ampisilliiniresistentit transformantit Ja eristetään plasmidi pXX-11 mainituista transfor-30 mänteistä. » 58 50352 X. Förfarande för framställning av ett heterologt protein med en odling av Y. lipolytica, k ä n n e -5 tecknat därav, att (i) en expressionsvektor införs i Y. lipolytica, vilken expressionsvektor innehäller en DNA-sekvens som kodar ett protein vilket är heterologt i förhällande tili Y. lipolytica, och, funktionellt bunden därmed, (a) XPR2- 10 genen i Y. lipolytica, eller (b) ätminstone en av följan-de: signal-, prol- eller pro2-sekvensen av XPR2-genen i Y. lipolytica och ätminstone en av följande: LEU2-genen och dess promotorsekvens eller promotorsekvensen av XPR2-genen; 15 (ii) den säledes erhällna Y. lipolytica-transfor- manten enligt punkt (i) odlas i ett lämpligt näringsme-dium, och (iii) det heterologa proteinet tillvaratas.
  24. 2. Förfarande enligt patentkrav 1, kanne- 20 tecknat därav, att DNA-sekvensen som kodar det heterologa proteinet är sekvensen som kodar prorennin eller humant anafylatoxin C5a.
  25. 3. Förfarande för framställning av ett heterologt protein, kännetecknat därav, att man odlar 25 en Y. lipolytica-transformant med de identifierande ka-rakteristika hos stammen ATCC 20780 i ett lämpligt nä-ringsmedium.
  26. 4. Förfarande för framställning av ett heterologt protein, kännetecknat därav, att man odlar 30 en Y. lipolytica-transformant med de identifierande ka-rakteristika hos stammen ATCC 20779 i ett lämpligt nä-ringsmedium.
  27. 5. Förfarande för framställning av ett heterologt protein, kännetecknat därav, att man odlar 35 en Y. lipolytica-transformant med de identifierande ka- 59 9 0 3 5 2 rakteristika hos stammen ATCC 20778 i ett lämpligt nä-ringsmedium.
  28. 6. Förfarande för framställning av ett heterologt protein, kännetecknat därav, att man odlar 5 en Y. lipolytica-transformant med de identifierande ka-rakteristika hos stammen ATCC 20777 i ett lämpligt nä-ringsmedium.
  29. 7. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat därav, att genen som kodar det heterologa 10 proteinet placeras mellan promotor- och terminätorsekven-sen av XPR2-genen.
  30. 8. Förfarande enligt patentkrav 5, kännetecknat därav, att genen som kodar det heterologa proteinet är genen som kodar prorennin eller humant ana- 15 fylatoxin C5a.
  31. 9. Förfarande för framställning av en Y. lipolyti-ca -transformant som inte producerar alkaliskt proteas, kännetecknat därav, att en XPR*-stam av Y. lipolytica transformeras med en XPR-expressionskons- 20 truktion.
  32. 10. Förfarande för pävisning av Y. lipolytica -transformanter, i vilka vektor-DNA har integrerats i XPR2-genen, kännetecknat därav, att (i) en XPR*-stam av Y. lipolytica transformeras ' : 25 med en XPR-expressionskonstruktion; och (ii) förlusten av alkalisk proteas -aktivitet hos transformanter producerade enligt punkt (i) undersöks.
  33. 11. Förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat därav, att XPR*-stammen av Y. lipolytica 30 transformeras med ospjälkt DNA frän plasmiden pLS3 eller med pLS3-DNA som spjälkts med Snal.
  34. 12. Förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat därav, att Y. lipolytica har de identifierande karakteristika hos stammen ATCC 20688. 35 13. Förfarande för framställning av en Y. lipoly tica-transformant, kännetecknat därav, att en 60 90352 expressionsvektor integreras i en Y. lipolytica-transfor-mant, som innehäller ett omräde homologt med det hetero-loga vektor-DNA:t och innehällande exogent DNA, som fun-gerar som recipientställe under den integrativa transfor-5 mationen av Y. lipolytica.
  35. 14. Förfarande för framställning av ett heterologt protein, kännetecknat därav, att man odlar en Y. lipolytica-transformant med de identifierande ka-rakteristika hos stammen ATCC 20795 i ett lämpligt nä- 10 ringsmedium.
  36. 15. Förfarande för framställning av ett heterologt protein, kännetecknat därav, att man odlar en Y. lipolytica-transformant, som innehäller en expressionsvektor innehällande en DNA-sekvens som kodar ett 15 protein vilket är heterologt i förhällande till Y. lipolytica, och, funktionellt bunden därmed, (a) XPR2-genen i Y. lipolytica, eller (b) ätminstone en av följande: sig-nalsekvensen, prol- eller pro2-sekvensen av XPR2-genen i Y. lipolytica, och ätminstone en av följande: LEU2-ge-20 nen och dess promotorsekvens eller promotorsekvensen av XPR2-genen, och ett omräde homologt med det heterologa vektor-DNA:t och innehällande exogent DNA, som fungerar som recipientställe under den integrativa transformatio-nen av Y. lipolytica, och härstammande frän pBR322 eller 25 ett derivat av denna.
  37. 16. Förfarande för framställning av plasmid pXX-33, kännetecknat därav, att plasmiden pXHP-24 spjälks med HindiII och Aval, varvid ett fragment med 1 150 baspar erhälls, 30 nämnda fragment isoleras, nämnda fragment ligateras med det syntetiska DNA-fragmentet
  38. 5. CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG 3 1 35 3' CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTAG 5' 61 90352 i närvaro av T4-ligas, den säledes erhällna ligationsprodukten spjälks med Hindlll och BamHl, varvid ett fragment med 1 196 bas-par erhälls, 5 nämnda fragment med 1 196 baspar isoleras, nämnda fragment med 1 196 baspar ligateras med ett fragment med 440 baspar, som erhälls genom att spjalka plasmiden pLS3 med BamHl och Xmal, och med ett fragment med ca 8,0 baspar, som erhälls genom att spjälka plasmi-10 den pLS23 med Hindlll och Xmal i närvaro av T4-ligas, E. coli transformeras med den säledes erhällna ligationsprodukten , ampicillinresistenta transformanter utväljs och plasmiden pXX-33 isoleras frän nämnda transforman- 15 ter.
  39. 17. Förfarande för framställning av plasmid pXX-22, kännetecknat därav, att plasmiden pXHP-24 spjälks med Hindlll och Bglll, varvid ett fragment med 890 baspar erhälls, 20 nämnda fragment isoleras, nämnda fragment ligateras med det syntetiska DNA-fragmentet 5' GATCTTGCTGAGATCACTAG. 3' 25 3’ AAC GACTCTAGTGATCCTAG 5’ 1 närvaro av T4-ligas, den säledes erhällna ligationsprodukten spjälks med Hindlll och BamHl, varvid ett fragment med 920 baspar - 30 erhälls, nämnda fragment med 920 baspar isoleras, nämnda fragment med 920 baspar ligateras med ett fragment med 440 baspar, som erhälls genom att spjälka plasmiden pLS3 med BamHl och Xmal, och med ett fragment 35 med ca 8,0 kilobaspar, som erhälls genom att spjälka 62 90352 plasmiden pLS3 med Hindin och Xmal, i närvaro av T4-li-gas, E. coli transformeras med den säledes erhällna li-gationsprodukten, 5 ampicillinresistenta transformanter utväljs och plasmiden pXX-22 isoleras frän nämnda transforman- ter.
  40. 18. Förfarande för framställning av plasmid pXX-11, kännetecknat därav, att 10 plasmiden pHPX-24 spjälks med HindiII och Bglll, varvid ett fragment med 750 baspar erhälls, nämnda fragment isoleras, nämnda fragment ligateras med det syntetiska DNA-fragmentet 15 5' TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3' 3'AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5' i närvaro av T4-ligas, 20 den säledes erhällna ligationsprodukten spjälks med Hindlll och BamHI, varvid ett fragment med 790 baspar erhälls, nämnda fragment med 790 baspar isoleras, nämnda fragment med 790 baspar ligateras med ett 25 fragment med 440 baspar, som erhälls genom att spjälka plasmiden pLS3 med BamHI och Xmal, och med ett fragment med ca 8,0 kilobaspar, som erhälls genom att spjälka plasmiden pLS3 med Hindlll och Xmal, i närvaro av T4-li-gas,
  41. 30 E. coli transformeras med den säledes erhällna li gationsprodukten, ampicillinresistenta transformanter utväljs och plasmiden pXX-11 isoleras frän nämnda transformanter.
FI864206A 1985-10-18 1986-10-17 Menetelmä heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmä Yarrowia lipolytica -transformanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi sekä menetelmä transformanttien valmistamiseen käyttökelpoisten plasmidien valmistamiseksi FI90352C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78920685A 1985-10-18 1985-10-18
US78920685 1985-10-18
US06/841,121 US4937189A (en) 1985-10-18 1986-03-18 Expression and secretion of heterologous proteins by Yarrowia lipolytica transformants
US84112186 1986-03-18

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI864206A0 FI864206A0 (fi) 1986-10-17
FI864206A FI864206A (fi) 1987-04-19
FI90352B true FI90352B (fi) 1993-10-15
FI90352C FI90352C (fi) 1994-01-25

Family

ID=27120892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI864206A FI90352C (fi) 1985-10-18 1986-10-17 Menetelmä heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmä Yarrowia lipolytica -transformanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi sekä menetelmä transformanttien valmistamiseen käyttökelpoisten plasmidien valmistamiseksi

Country Status (24)

Country Link
US (1) US4937189A (fi)
EP (1) EP0220864B1 (fi)
JP (1) JP3096297B2 (fi)
KR (1) KR900008950B1 (fi)
CN (3) CN1034428C (fi)
AT (1) ATE86302T1 (fi)
AU (1) AU586041B2 (fi)
CA (1) CA1340837C (fi)
DD (7) DD267995A5 (fi)
DE (1) DE3687878T2 (fi)
DK (1) DK496886A (fi)
EG (1) EG18142A (fi)
ES (1) ES2038966T3 (fi)
FI (1) FI90352C (fi)
HU (1) HU209150B (fi)
IE (1) IE59774B1 (fi)
IL (7) IL99893A (fi)
NO (2) NO177318C (fi)
NZ (1) NZ217985A (fi)
PH (3) PH27026A (fi)
PL (2) PL155850B1 (fi)
PT (1) PT83562B (fi)
RU (2) RU2157845C2 (fi)
YU (2) YU46412B (fi)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH082304B2 (ja) * 1987-12-17 1996-01-17 オリエンタル酵母工業株式会社 プラスミドとその製造方法
FR2626584B1 (fr) * 1988-01-28 1990-07-13 Agronomique Inst Nat Rech Sequence ars efficace chez yarrowia lipolytica et procede pour sa preparation
EP0382332A3 (en) * 1989-01-06 1990-11-14 Collaborative Research Inc. Improved supersecreting mutants of saccharomyces cerevisiae
JPH0669365B2 (ja) * 1989-05-22 1994-09-07 株式会社ミドリ十字 アルブミン遺伝子を含むプラスミド、形質転換体、形質転換体の製造方法、アルブミンの製造方法
EP0402226A1 (en) * 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
WO1995006739A1 (en) * 1993-09-02 1995-03-09 Pfizer Inc. Multiple integrative vectors and yarrowia lipolytica transformants
US5837499A (en) * 1993-12-06 1998-11-17 Ciba-Geigy Corporation DNA encoding C5A receptor antagonists having substantially no agonist activity and methods of expressing same
US5807824A (en) * 1993-12-06 1998-09-15 Ciba-Geigy Corporation C5A receptor antagonists having substantially no agonist activity
DE19513152A1 (de) 1995-04-07 1996-10-10 Bundesrep Deutschland Verwendung eines "Immundefizienzvirus-supprimierenden Lymphokins (ISL)" zur Hemmung der Virusvermehrung, insbesondere von Retroviren
WO1996039503A1 (en) * 1995-06-05 1996-12-12 Novartis Ag C5a RECEPTOR ANTAGONISTS HAVING SUBSTANTIALLY NO AGONIST ACTIVITY AND METHODS FOR PREPARATION
EP0747484A1 (en) * 1995-06-08 1996-12-11 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Upstream activator sequences and recombinant promoter sequences functional in yarrowia and vectors containing them
EP0922109A1 (en) 1996-05-21 1999-06-16 Novo Nordisk A/S Novel yeast promoters suitable for expression cloning in yeast and heterologous expression of proteins in yeast
FR2782733B1 (fr) * 1998-09-01 2002-02-08 Agronomique Inst Nat Rech Procede de transformation non-homologue de yarrowia lipolytica
US7259255B2 (en) * 2003-06-25 2007-08-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase promoters for gene expression in oleaginous yeast
US20110059496A1 (en) * 2003-06-25 2011-03-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase promoters for gene expression in oleaginous yeast
US7459546B2 (en) 2003-06-25 2008-12-02 E.I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase regulatory sequences for gene expression in oleaginous yeast
WO2005049805A2 (en) * 2003-11-14 2005-06-02 E.I. Dupont De Nemours And Company Fructose-bisphosphate aldolase regulatory sequences for gene expression in oleaginous yeast
US7264949B2 (en) * 2004-09-15 2007-09-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Glycerol-3-phosphate o-acyltransferase promoter for gene expression in oleaginous yeast
US20060094102A1 (en) * 2004-11-04 2006-05-04 Zhixiong Xue Ammonium transporter promoter for gene expression in oleaginous yeast
CN103589650A (zh) 2005-03-18 2014-02-19 米克罗比亚公司 产油酵母和真菌中类胡萝卜素的产生
EP2078092A2 (en) 2006-09-28 2009-07-15 Microbia, Inc. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
FR2927089B1 (fr) * 2008-02-05 2011-03-25 Inst Nat De La Rech Agronomique Inra Procede d'integration ciblee de multicopies d'un gene d'interet dans une souche de yarrowia
US8597931B2 (en) * 2008-07-11 2013-12-03 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Mutant yeast strains capable of accumulating a large quantity of lipids
FR2962133B1 (fr) 2010-07-01 2014-09-12 Agronomique Inst Nat Rech Optimisation de la synthese et de l'accumulation de lipides
EP2658962A1 (en) 2010-12-30 2013-11-06 E.I. Du Pont De Nemours And Company Use of saccharomyces cerevisiae suc2 gene in yarrowia lipolytica for sucrose utilization
EP2691518A1 (en) 2011-03-31 2014-02-05 E.I. Du Pont De Nemours And Company Yarrowia diacylglycerol acyltransferase promoter regions for gene expression in yeast
EP2694657A1 (en) 2011-04-05 2014-02-12 E. I. Du Pont de Nemours and Company Yarrowia n-alkane-hydroxylating cytochrome p450 promoter regions for gene expression in yeast
WO2012138612A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Yarrowia peroxisomal 2,4-dienoyl-coa reductase promoter regions for gene expression in yeast
GB201106188D0 (en) * 2011-04-12 2011-05-25 Csir Production of extracellular polypeptides
FR3002774A1 (fr) 2013-03-04 2014-09-05 Agronomique Inst Nat Rech Levures mutantes ayant une production accrue de lipides et d'acide citrique
FR3005317B1 (fr) 2013-05-02 2016-03-18 Agronomique Inst Nat Rech Levures mutantes capables de produire un acide gras inhabituel
WO2015116781A2 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Dsm Ip Assets B.V. Promoters suitable for heterologous gene expression in yeast
WO2015189352A1 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Institut National De La Recherche Agronomique Improved lipid accumulation in yarrowia lipolytica strains by overexpression of hexokinase and new strains thereof
WO2016075314A1 (fr) 2014-11-13 2016-05-19 Institut National De La Recherche Agronomique Identification de facteurs de transcription de yarrowia lipolytica affectant la production de proteines
FR3028527A1 (fr) 2014-11-13 2016-05-20 Pivert Identification de facteurs de transcription de yarrowia lipolytica
DK3387134T3 (da) 2015-12-11 2020-12-21 Danisco Us Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til øget nukleasemedieret genommodifikation og reducerede virkninger uden for målstedet
EP3390631B1 (en) 2015-12-18 2020-04-08 Danisco US Inc. Methods and compositions for t-rna based guide rna expression
WO2017194424A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 Institut National De La Recherche Agronomique Mutant yeast strains with enhanced production of erythritol or erythrulose
EP3348647A1 (en) 2017-01-13 2018-07-18 Institut National De La Recherche Agronomique Mutant yeast strain capable of producing medium chain fatty acids

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4321365A (en) * 1977-10-19 1982-03-23 Research Corporation Oligonucleotides useful as adaptors in DNA cloning, adapted DNA molecules, and methods of preparing adaptors and adapted molecules
US4394443A (en) * 1980-12-18 1983-07-19 Yale University Method for cloning genes
US4666847A (en) * 1981-01-16 1987-05-19 Collaborative Research, Inc. Recombinant DNA means and method
US4775622A (en) * 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
US4546082A (en) * 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
NZ207926A (en) * 1983-04-25 1988-04-29 Genentech Inc Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast
IN163393B (fi) * 1983-10-06 1988-09-17 Pfizer
US4628033A (en) * 1983-10-06 1986-12-09 Pfizer Inc. Novel host strain for transformation of Yarrowia lipolytica
DE3572688D1 (en) * 1984-06-26 1989-10-05 Agronomique Inst Nat Rech Transformation vector for yeast yarrowia lipolytica, transformation process and transformed yeast

Also Published As

Publication number Publication date
CN1069346C (zh) 2001-08-08
DD269397A5 (de) 1989-06-28
NO177318B (no) 1995-05-15
DD267995A5 (de) 1989-05-17
AU586041B2 (en) 1989-06-29
IL80297A (en) 1993-02-21
EG18142A (en) 1992-08-30
RU2157845C2 (ru) 2000-10-20
PH27026A (en) 1993-02-01
FI90352C (fi) 1994-01-25
DD267997A5 (de) 1989-05-17
NO177318C (no) 1995-08-23
DD267998A5 (de) 1989-05-17
EP0220864B1 (en) 1993-03-03
DE3687878D1 (de) 1993-04-08
CN1141339A (zh) 1997-01-29
NO864148L (no) 1987-04-21
RU2069694C1 (ru) 1996-11-27
CN1034428C (zh) 1997-04-02
NO923616L (no) 1987-04-21
HU209150B (en) 1994-03-28
PT83562A (en) 1986-11-01
NO864148D0 (no) 1986-10-17
NO923616D0 (no) 1992-09-17
IL99894A (en) 1993-02-21
HUT43632A (en) 1987-11-30
DK496886D0 (da) 1986-10-17
US4937189A (en) 1990-06-26
JPS63164889A (ja) 1988-07-08
CN1138632A (zh) 1996-12-25
PL154427B1 (en) 1991-08-30
PT83562B (pt) 1989-05-31
FI864206A (fi) 1987-04-19
IE862754L (en) 1987-04-18
DD276886A5 (de) 1990-03-14
KR900008950B1 (ko) 1990-12-15
FI864206A0 (fi) 1986-10-17
ATE86302T1 (de) 1993-03-15
AU6416186A (en) 1987-05-14
CA1340837C (en) 1999-12-07
JP3096297B2 (ja) 2000-10-10
PH27171A (en) 1993-04-02
IL80297A0 (en) 1987-01-30
YU124588A (en) 1989-08-31
PL261912A1 (en) 1987-10-19
NO178793B (no) 1996-02-26
YU177386A (en) 1989-04-30
IL99894A0 (en) 1992-08-18
CN86106522A (zh) 1987-09-16
KR870004138A (ko) 1987-05-07
DK496886A (da) 1987-06-11
DD267996A5 (de) 1989-05-17
YU46571B (sh) 1993-11-16
IL99892A0 (en) 1992-08-18
YU46412B (sh) 1993-10-20
IL99893A (en) 1993-02-21
IE59774B1 (en) 1994-04-06
DE3687878T2 (de) 1993-07-15
EP0220864A1 (en) 1987-05-06
DD269396A5 (de) 1989-06-28
NO178793C (no) 1996-06-05
PL155850B1 (en) 1992-01-31
IL99893A0 (en) 1992-08-18
PH27198A (en) 1993-04-16
NZ217985A (en) 1991-06-25
ES2038966T3 (es) 1993-08-16
IL99892A (en) 1993-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI90352B (fi) Menetelmä heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmä Yarrowia lipolytica -transformanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi sekä menetelmä transformanttien valmistamiseen käyttökelpoisten plasmidien valmistamiseksi
KR0181179B1 (ko) 피치아 파스토리스 산성 인산효소 유전자의 디앤에이 단편 및 이를 사용하는 방법
EP0301669A1 (en) DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha-factor leader sequence for directing secretion of heterologous derivatives
HU204097B (en) Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species
EP0213593B1 (en) Repressible yeast promoters
EP0341215A2 (en) Improvements in the production of polypeptides
WO1992013951A1 (en) Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
EP0147178B1 (en) Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria
US5217891A (en) DNA constructs containing a kluyveromyces α factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides
EP0362183B1 (en) Process for the production of human lysozyme
US5182195A (en) Method for increasing gene expression using protease deficient yeasts
KR970005584B1 (ko) 폴리 펩타이드의 개선된 제조방법
RU2198923C2 (ru) Нуклеотидная последовательность гена leu2 yarrowia lipolytica (варианты), рекомбинантный днк-материал (варианты), штамм дрожжей yarrowia lipolytica (варианты)
CA2002480C (en) Process for the production of human lysozyme
PL156255B1 (pl) Sposób wytwarzania wektorów ekspresyjnych do transformowania Yarrowia lipoiytica

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
FG Patent granted

Owner name: PFIZER INC.

MA Patent expired