PL154427B1 - Method for manufacturing and separating heterological protein through yarrow lipolytica culturing - Google Patents

Description

OPIS PATENTOWY

Patent dodatkowy do patentu nr-Zgłoszono: 86 10 17 JP, 261912,/

Pierwszeństwo ^{85 10 18}

03 18 dla zastrz.1,4-7,9, 10,12,13

Stany Zjadn.Ameryki dla zastrz.2,3.6.11 Stany ZjednAmeryki

Zgłoszenie ogłoszono: 87 10 19

Opis patentowy opublikowano: 1991 11 29

154 427

Int. Cl.⁵ C12N 15/81 tmitn

LO

Twórca wynalazku

Uprawniony z patentu: Pfizer Inc.,

Nowy Oork /Stany Zjednoczone Ameerki/

SPOSÓB WYTWARRZAIIA I WDZIELANIA BIAŁKA HETEROLOGICZNEGO PRZEZ HODOWLE, YARROWIA LIPOLYTICA

Przedmiotem wynalazku Jest sposób wytwarzania i wydzielania białka heterologicznego przez hodowlę Yarrowia lipolytica /okreśaanego dalej w tekście jaio Y.lipolytica/.

Poszukiwania dróg równomiernego i ilościowo pokrywającego zapotrzebowanie, wytwarzania białek i polipeptydów cennych dla przemysłu /na przykład proreniny, bydlęcego hormonu lub dla celów medycznych /ur^ogastron, aktywator plazminogenu tkankowego, ludzka anafiloloksyna C5a/, a zwłaszcza poszukiwania źródeł^z których można byłoby uzyskiwać produkty o wysokiej jakości w łatwej do wyodrębniania funkcjonalnej formie, skierowały wysiłki badaczy w kierunku atrakcyjnej ekonomicznie technologii reilmeinaaji DNA i wytwarzania heterollgicznych białek w mikrlorganimmach jako “fabrykach”.

Prowadzone obecnie szerokie badania ogniskują się na wydzielaniu białka, jako na potencja^ym rozwiązaniu trudności napotykanych przy odzyskiwaniu egzogennego lub heterologicznego /obcego/ białka w postaci aktywnej biologicznie, a gromadzonego wewnntrz zrekombinowanych komórek gospodarza, zwłaszcza na wyodrębnieniu z komórek E.coli# W E.coli białko heterologiczne jest zazwyczaj wytwarzane we wnętrzu ^ιηόι^ι w formie silnie uginających światło ciał inkluzyjnych, Białko to na ogół jest słabo rozpuszczalne w wodzie i wykazuje niewielką aktywność biologiczną lub wcale nie wykazuje aktywnośśi. Ekstrakcja tego białka z tych ciał inkluzyjnych wymaga zazwyczaj ostrej obróbki cheιiicznea, która może być kosztowna, a w wyniku jaj stosowania można otrzymać niewiele, lub wcale nie uzyskać białka w żądanej, natywnne, biologicznie aktywnej postaci. Ponadto możliwość zanieczyszczenia tego białka niepożądanymi substancjami wytwarzanymi przez E.coli zwiększa się przez konieczność niszczenia komórek w celu uwolniania z ciał inkluzyjnych. Poza E.coli, inne organizmy również wytwarzają białko heterologiczne w nierozpuszczalnej formie wewnntriileórkowea. Przykładowo, w opisie paternowym

154 427

154 427

Wielkiej Brytanii nr 2 091 271 ujawniono modyfikację genetyczną S. cerevisiee na drodze technologii rekombinnaCi ONA dla uzyskania ekspresji reniny lub chymozyny cielęce;)· przy czym terminy te stosowano zamiennie. Z powodu powyższych trudności, badania skierowano na wydzielenie tego białka poza organizm gospodarza, widząc w tym możliwość opracowania drogi wytwarzania tego białka w jego natywnej, aktywnej konfiguracci·

Okazuje się, że to czy konkretne białko,w tym białko lub pclipeptyd hjterrlogiczπy jest wydzielane przez dany organizm poza komórkę, zależy od tego białka· W większości komórek eukariotycznych część aparatu syntetyzującego białko jest związana z błoną endoplazmatyczną retikulum, a sekwencja aminokwasów /zwana sekwencją sygnałową/ w pobliżu N-końca powsjałegr łańcucha prlipepfydowego służy do kierowania białka do przechodzenia przez błonę. Ta sekwencja sygnałowa jest następnie odszczepiana proteolitycznie w procesie sekrecci, w wyniku czego powssaje aktywna, dojrzałe białko. Czyniono szereg wysiłków w celu opracowania sposobów wydzielania białek heterologicznych z zastosowaniem sekwencji sygnałowych w mikroorganizmach, w tym w Baclllus ^όϋΐ^, Sacchar'reycjj ce^yńs^oe i w hodowlach komórkowych ssaków. Okazało się jednak, że te organizmy nie są idealne.

W wysiłkach tych przeszkoddily właściwości gatunkowe B-subbilis. Bakteria ta wydziela wiele białek, w tym liczne proteazy, które rozkładają wyddielane białko heterologiczne.

Transrormowane szczepy tych bakterii są niestabilne tracąc heterologiczny ONA.

Udało się metodą inżynierii genetycznej modyfikować komórki ssaków w taki sposób, aby zachodziła w nich ekspresja i i^ddielanie białek heterologicznych. Hodowla takich układów Jest Jednak technologicznie trudna i kosztowna, co powodyle, że wytwarzanie większości białek na skalę przemysłową staje się nieopłacalne. Pomimo, iż badania wyddiθlania białka w organizmach S.cereulsiee są bardziej obiecujące niż w organizmach B^ubbilis, to okazało się, że S .cereulsiae , Jako układy ^^ddże^lijnl.a· białek stwarzają również pewne ograniczenia wynikające z cech gatunkowych tego gospodarza. W opisie zgłoszenia patentowego europejskiego nr 0 123 544 opublkoowanym 31 października 1984 r. ujawniono izolowanie genów czynnika - rCs.ceΓjvijiae i użycie w plazmidzie ich części zawierających promoto i/lub sekwencję sygnałową białka w połączeniu z ONA kodującym białko he tero logiczn e dla drożdży, dla tΓ^^nsr)moo8nia komó rek drożdży, zdolnych do wytwarzania oddzielnego od pre-sekweencj, dojrzałego białka podczas hodowU komórek. W opisie zgłoszenia patentowego europejskiego nr 0 088 632 op^lk^wonym 14 września 1983 r. opisano sposób uzyskiwania ekspressi i sekrecci białka heterologccznego w S.cerevisiae. Jednak wielkość białek, które S.cerevisiae są w stanie wydajnie wydzielać w tych i innych układach wydzielniczych jest ograniczona do około 20.000 dalion^. Przezwyciężenie tej ogólnej niewydolności S.cereuisiae, Jako organizmu wydzielniczego wymaga wielokrotnych mutacci, opisanych przez Smith'a i wsp. Science 229, 1219-1224 /1985/. Jedynym wyjątkeem od tej zasady jest ^serwaccs, że enzymy pochodzące z Aspergillusy masie większej od 20.000 daltonów, mogą być wydzielane przez S.cerevisiae, ale w gospodarzu tym, enzymy te mają wysoki stopień zglikozylowania, co może mieć wpływ na wydajność sekrecci.

Przedmiotem szczególnego zaintejesowania jest Yarrowia lipolytica, ważny z punktu widzenia przemysłowego gatunek drożdży, stosowany do produkeci kwasu cytrynowego i białka komórkowego. Można go również stosować do produk^i erytrytu /butanotetraolu/, Mnnń^olu i kwasu izopropylo-jabłoowego. Są to drożdże szczególnie cenne, gdyż w przeciwieństwie do S.cerevisiaj, Y.lipolytica wykazują zdolność wydajnego wydzielania białek o wysokim ciężarze cząsteczkowym /proteaza alkaliczna, proteaza kwaśna i RNA-za/ do środowiska wzrostu podłoże, co pozwala na wyodrębnienie białek heterologicznych w ich natywnej forme, bez potrzeby niszczenia wytwarzających je łreerek. Ponadto, Y.lipolytica w^tidiela ^ośc^ko bardzo niewiele białek, stwarzając potencjalne eorliooóci produkeci żądanego białka heterologicznego w środowisku wzrostu, jako białka yominującjgo, co ułatwia odzysk tego białka heterrlrgicznegr.

Y.lipolytica wytwarza duże ilości przałrmórkroej proteazy. Jest to główne białko wydzielane przez Y.lipolytica. Rodzaj konkretnej proteazy /alkalcczna, kwaśna lub obojętna/ zależy od użytego szczepu Y.lipolytica /Ogrydziak i wsp., J.Gen.Microbbol. 128, 1225-1234 /1982/. W pubbikacji tej cytuje się częściową analizę sekwan^i fragmentu N-końcowych reszt aminokwas^ych alkalicznej , przakomórkroθj proteazy.

154 427

W opisie zgłoszenie patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 634 505 z dnia 25 Upce 1984 r. opisano sposoby ti^t^nsLimowania Y.lipolytica i klonowania genów Y.lipolytica przez koeplerneetację eutacCi· Ujawniono tam klonowanie genu XPR2 kodującego wydzielany elkalćczny proteazę przez iomelemerlację mutacj xpr2 Y.lipolytica· Metodologia ta obejmuje transformowanie szczepu gospodarza Y.lipolytica produktem częściowego trawienia enzymem Bg1ll banku genów Y.lipolytica w wektorze pLD40, opisanym w opisie zgłoszenia patentowego europejskiego nr O 138 508 opublikowanym 24 kwietnia 1985 r· « βtanowiycrgo odpowiednik podanego powyżej zgłoszenia Stanów Zjednoczonych AJneeyki·

Wynalazek obejmuje ekspresję i'wydzielanie dojrzałego białka heterologicznego, a zwłaszcza proreniny i ludzkiej c^^filok^ksγny C5a, z genetycznie zmienionych hodowli komórek Y.lipolytica. Odkrycie i dokładne oznaczenie sekwennci em.nokwaso^^j oraz eekwennji ONA dla pozakomórkowej proteazy alkalicznej Y.lipolytica urnmżliwiło u^ta^en^e, że białko heterologiczne może być wytwarzane i wydzielane na drodze ^kombinaac! ONA i produkowane w hodow^ ^t^ókow^. W przypadku proreniny, wytwarzana Jest i wydzielana dojrzała forma zymogenu /prekursora reniny/·

Okazało się, le drożdże Y.lipolytica można modyfikować genetycznie na drodze technologii rriombinaaji ONA, otrzymujęc transfomanty zdolne do ekspresji i wydzielania białek (neurologicznych w ich formie natywnee · Uzyskano to przez skonstruowanie wektorów zawierajęcych część sygnałowę lub część sygnałowę i pierwszę /pro 1/ lub obydwie prżsrilθncJe /pro 1 + pro 2/ genu XPR2, przyłączone do sekwennci genu strukturalnego, wydzielanego białka hetrrżlżgicznego·

Transformanty otrzrmαnr przez integrację w l^ocus XPR2 wektora ONA zawierającego fragment genu XPR2, z pominięciem komponent regula too^^y^ch lub strukturalnych na obydwu końcach tego genu, przestaję wytwarzać alkalcczną proteazę, co jest cechę polędanę nie tylko z punktu widzenie wyddżelanie heterologicznego białka, lecz również dlatego, że cechę tę można wykorzystać do Jiriningu przewidywanych tΓ^anJ^ormantól· Ponadto, wektory zawierające promotor XPR2 i sekwencje kodujęce lydzielnijzę sekwencję sygnałowę alkalicznej proteazy nadaję aransfoemżwanej komórce Y.lipolytica zdolność wyridzelania dojrzałego, heteologicznego białka· Niektóre wektory rrkżmbinaltolrgż DNA tego typu nadaję zdolność ekspressi i lydziθlalia niezależnie od miejsca integracji z genomem gospodarza drożdżowego· Na ogół, wektory zawierające wystarczajęce boczne regiony flankujące 5' i 3 DNA, wy^of^^jją ekspresję produktu niezależnie od miejsca inargracji.

Nieoczekiwanie okazało się także, że integracja plazmidu pochżdiącrgż z pBR322 z chromosomal-nym DNA Y.lipolytica daje obszar hommżożii, który sprzyja dalszej, kierowanej miejscem, transformacci integracyjnej· Zinregżowala kopia pBR322 służy zatem jako tzw· platforma dokowania dla przyłączanego DNA tralJforeuJącrgż· Integracja kopii pBR322 z chromosomal-nym DNA Y.lipolytica stwarza zatem znane miejsce docelowe dla integracji pomimo tego, że pBR322 nie jest nat^rnym DNA Y^ipolytica· Transformamy Y.lipolytica, które przyjęły plazmid, takie, które zalirrają tego rodzaju miejsce, maję dwie cechy korzystne, lrirlyższaJąjr transfomanty, które nie maję tego miejsca, obecność regionu o znanej Jrklenlji i znanej mapie restrykcyjnej, który to region ma służyć jako cel dla kierowanej miejscem integracji oraz sposobność do określenia /stosując pBR322 jako cel int^racc i/, czy wchodzęcy plazmid zawiera koepletną jednostkę funkcjonalnę lub gen, czy jedynie część ^danego genu· Przykładowo, plazmid zawierający tylko fragment 3* genu XPR2 mógłby tι^^^r^sforΓ^t^wać przy^m^ęcy go XPR2-1002, jeśli zawi^r^^ilby on kodon typu dzikiego i integrował w locus XPR2. Jednak ten sam plazmid nie mógłby transformować gospodarza XPFR?-1002 dajęc fenotyp prżteaiż-dodatni, jeśli byłby zintegoowany w pBR322, ponieważ nie zawiera on iżmeletlrj jednostki funkcjonalnoe·

Tak więc, w transżorealtach y.lipolytica posiadających obszar homeżożli z heterologicznym DNA wektora, obszar ten, ialierający egzogenny DNA służy jako miejsce przyjmujęce podczas integracyjnej transformacci tych Y.lipolytica· Poza pBR3— i jego pochodnymm, do wytwarzania transo omant ów Y.lipolytica posiadających tę tzw· platfojmę dokowania możno zastosować kosmldy, bakteriofagi, takie jak M13 i lambda, DNA otrzymany syntetycznie oraz powszechnie znane plazmidy, takie jak pUC13·

154 427

Termin sekwencje promotora LEU2 oznacza nie podlegający translacji region przed ATG. Zawiera ona większość, jeśli nie wszystkie cechy wymagane dla eksppeeSi·

Termin sekwencja promotora XPR2 oznacza nie podlegający translacji region przed sekwencję /lub presekwencją/ sygnałową. Best on niezbędny dla ekspresji. Ponadto, można zastosować sekwencję sygnałową z genu XPR2 /z/uub bez prosekwennjj/ dla uzyskania wydzielania białek pod kontrolą promotorów ekspresyjnych Y.lipolytica innych niż gen XPR2. Zatem, wektory posiadające promotor LEU2 i sekwencje sygnałowe dla wyddielania alkalicznej proteazy są zdolne do spowodowania wydzielanie przez tr8nstarstowaną komórkę Y.lipolytica, dojrzałego heterologccznego białka.

Ludzka anafitotoksyna C5a, znane również Jako białko dopełniacza C5a /ludzka C5a/ jest biologicznie aktywnym odcinkiem polipeptyowwym powstającym in vivo w wyniki aktywami dopełniacza. Działa ona jako immulcmodulatoΓ w regulacji pewnych aspektów himmoalnej i komórkowej odpowwedzi immulntogiccnca. Struktura pierwszorzędowa tej acafilotoksyny i innych acafllotoksyc została już wyjaśniona. Ich własności chemiczne, fizyczne i właściwości biologiczne zostały opisane przez Hugli*sgo w Complement”, pod redakcją H.3.MuHer-Eberhard'a i P.A. Miescher'a, str. 73-99 /1985/ wydawca, Springer-yerlag, Nowy 3ork.

Dla speccalistów jest zrozumiałe, że w niciθtitym wynalazku, po dokonaniu niezbędnych zalan, może być zastosowany hetaaologiczcy DNA kodujący dowolną znaną sekwencję aminokwasową.

Ujawniona tutaj meaodotogia, po dokonaniu niezbędnych zmian, nadaje się do zastosowania w produkeci i wyddielaniu dowolnego znanego białka hθteaologicznago. Przykłady takich białek są podane w opisie patenoowym Stanów Zjednoczonych Ameeyki nr 4 532 207. Poza tym, zamast genu XPR2 można zastosować dowolny inny gen z Y.lipolytica kierujący wydzialanaem białek, na przykład geny dla rybonukieazy czy kwaśnej proteazy oraz geny hybrydowe, konstruowane przez połączenie fragmentów dwóch lub więcej tych genów, na przykład sekwannc! sygnałowej genu XPR2 i sekwan^i genu dla aybocukleaiy.

Zakresem wynalazku objęte są również funkcjonalne aównoweżnCki opisanych powyżej DNA lub sekwan^i nuklettydoeyjh. Degeneracja kodu genetycznego pozwala na podstawienie niektórych kodonów innymi kodonami określającymi ten sam aminokwas, przez co można uzyskać zwiększone wytwarzanie tego samego białka.

DNA lub nuklattydowa sekwencje mogą różnić się znacznie, ponieważ za wyjątkeem meeioniny i tryptofanu, znane aminokwasy kodowane są przez więcej niż jeden kodon. Tak więc, części lub cały gen XPR2 można syntetyzować, otrzymując sekwencję DNA znacznie się różniącą od przedstawionej na fig.3. Powinna być jednak zachowana kodowana przez ten gen sekwencja aminokwasowa. Takie funkcjonalne zmiany danej sekwan^i DNA lub cikleotydowej dają sposobność do pobudzania wydzielania i/uub przetwarzania heterologccznych białek kodowanych przez przyłączone do niej sekwencje obcego DNA. Wszystkie zmiany sekwen^^ nlklaotydoeej genu XPR2 i jej fragmentów dopuszczalne w zakresie kodu genetycznego są zatem również objęte zakresem wynalazku. Oest również możliwe wykonanie delecji kodonów lub iodstawiacia jednego lub więcej kodonów przez kodony inne niż kodony iyageceaoeane, co prowadzi do wytworzenia polipeptydu o imoOytikowanej strukturze, ale takiego, który ma takie samo zastosowanie lub aktywność jak polipeptyd wytwarzany przez cząsteczkę ciezmodyfikoeanego DNA. Te dwa iollpθityyt są funkcjonalnie równoważne, tak jak równoważne są te dwie cząsteczki DNA, które wy^w^ją ich zwiększone wytwarzanie, nawet jeśli różnice między tymi cząsteczkami ONA są nie związane z degeneracją kodu genetycznego. Najprostszym tego przykładem jest iaoaecina A i iataacica B, dwie formy alleiczzoe iaoaanint, różniące się jedynie obecnością reszty kwasu łSiłrłgCnoeago w pozycc! 286 w pΓoaaninie A i obecnością reszty glicyny w tej samej pozycc! w iroaacicia B.

Stosując tę metodooogię, uzyskano ekspresję i wydyielacia hetaaologicznyjh białek ssaków - pro^niny i ludzkiej acafilotoksycy C5a w Y.lipolytica, stosując sygnały ekspres^ i eyddielłcił z genów Y.lipolytica XPR2 i/uub LEU2. Sekwencje DNA dla lub ludzkiej acafitotoksynt C5a łączy się poprzez syntetyczne tligoπlklettydt z sekwencją genu XPR2 w miejscach, które przypuszczalnie zawierają kod dla paptfdl sygnałowego alkalicznej proteazy albo w miejscach kierujących przetwarzanie prekursora proteazy, oznaczonych jako pro 1 i

154 427 pro 2 i stosuje się je do wytworzenia konstruktów genu. Następnie, dokonuje się lnsercji tych konstruktów do Y.lipolytica poprzez transformację integracyjną. Hodowle rekombinantowe wytwarzają heterologiczne białka o ciężarze cząsteczkowym i reaktywności immuunlogicznej znawenn^j dla proreniny i ludzkiej anafiloooksyny C5a i wydzielają te białka do środowiska wzrostu. Przypuszcza się, że tak wytworzona prorenina jest pofałdowana w konfiguracji natywnego białka, gdyż po usunięciu propeptydu wykazuje pełnę aktywność enzymatyczną.

Termin mat^ri^iał rekombinantowego ONA oznacza każdy maeriał zawierający co najmniej jeden z następujących składników gen XPR2 z Y.lipolytica; sekwencję sygnałową /lub presygnałową/, pro 1- i pro 2- /które łącznie stanowią pro-region/j sekwencję promotora lub terminatora tego genu; promotor LEU2 oraz funkcjonalne równowwaniki powyższych sekweenci mooma z racji dogon^acc i kodu genetycznego.

Takim reprezentatoinym maeri^^łem rekombinantowego DNA są fragmenty DNA, plazmidy lub wektory albo transformanty, zawierające niektóre lub wszystkie z wyżej wymienionych seki-wenci. Maaeriały Endonukleazy restrykcyjne i ligazę T4 otrz^sno z New England Biolabs, bakteryjną fosfatazę alkaliczną otrzymano z Bethesda Research Laboratories, kinaza polinukleotydowa T4 pochodziłt z PL-Bilchβmicals, a- P-ATP pochoddżł z firny New England Nuclear. Wszystkie enzymy stosowano w warunkech zalecanych przez dostawcę. Podłoża. Podłoże GPP /glicerol/ pożywka ; prkteαztpeptki zawierała w litrze: 5,7 g glicerolu, 1,6 g prodzapepton Difco'’, 1,7 g wyciągu drożdżowego “Difco Yeast Nitrogen Base° bez aminokwasów i siarczanu amonowego, 30 mg uracylu i 0,5 ml/litr glikolu polipoo^pyłioiwego o ciężarze częstecz kowym 2000 /Polyscinces/ w 40 ml buforze fosfo^^wym /pH 6,8//w hodowlach przeznaczonych do stosowania w próbach oznaczania reniny glikol polipropyłθnooy nie występowot/. Pożywkę protekiowo-peptynową oddzielnie sterylizuje się w autoklawie w buforze fosfoannowym.

Podłoże YEPD - /podłoże; wyciąg drożdżowy/ /pepton/ /glkkoza/ zawierało w litzee-t 5 g wyciągu drożdżowego, 10 g peptonu i 20 g glikozy. Hodowlę E.coli prowadzono na podłożu LB w temperaturze ³⁷°C. Podł^e ^LB zawierało w ł-itrze: 10 ^g Bactott^yptknu, ^{10 g} wyci^ągu drożdżowe^ “Bacto⁰, 10 g chlorku sodowego; pH podłoża doprowadzano do wartości 7,5 wodorotlθikłei sodowym Analiza sekwannc^ DNA. Odcinki DNA z różnych plazmidów izolowano w żelach poliaktykaimiOowyjh i oznaczano ich sekwencje metodą MaKarn^a i wsp., Methods in Enzymolkgy 55, 499 /1980/.

Metody ligacji. Odcinki DNA, w tym pocięte wektory plazmidowe poddawano ligacji przez zmieszanie żądanych komponentów /odcnnków DNA z końcami odpowiednio zmodyfikowanymi, aby zapewnić prawidłowe łączenie/ z ligazą DNA T4. Na iiZΓlgΓamkWł ilości fragmentów wektora i insertu stosowano około 10 jednostek ligazy. Produktami reakcji ligacji translrimowaio kompocn^e komórki E.coli K12, szczep MM294 /ATCC 33525/ lub HB101 /ATCC-33694/. Wytwarzanie syntetyzowanego jhθmicznił DNA.

W celu skonstruowania genów hybrydowych kodujących ekspresję i sekrecję pro^niny, syntetyzuje się 8 oligonukleoyddów zmodyfikowaną metodą z zastosowaniem pochodnych arnidolosfinowych /Sinha i wsp., Tetrahłirli Letters 24, 5843 /1983/ w automatycznym aparacie do syntezy ONA “Cenetic Design 650(3“ /Watertown, MA. Oligknukleoΐyiy te oczyszcza się w 20% żelach poliaktykaimilowych z dodatkiem 6 M ioljiika. Odpowiednie ilości komplementarnych oligonukleotydów miesza się ^{i łą}cz^y ze so^bą w odcinki dwuniciowe /przyża^a/ w temperaturze ⁴°C firm dobę w buforze TE /10 mM tris-HCl; pH 8,0, 1 mM NaEDTAA. Odpowóednie ilości /około 2 /jg/ dwunicioi^yjh oligonukleotydów fosforylu;^ się w 20 /j1 mieszaniny reakcyjnej zawierającej 70 mM Tris /pH 7»6/, 10 mM Mg^’ 5 mM di t iot rei tolu, 5 mM ATP, w temperaturze 37°C, stosując kinazę poliπukleotydooę T4.

Wytwarzanie plazmidowego DNA. Wyywarzanie plazmidowego DNA na dużą skalę prowadzi się metodą Holmes”^ i wsp., Anal. Biochem. 114, 195-197 /1981/ i następnie wiruje się w gradiencie gęstości bromku etikuum 1 CaCl. MiiipreptΓatywił ilości plazmidowego DNA przygotowuje się stosując metodę alkalicznej ekstrakcc! w połączeniu z elektroforezą żelową - wobec SOS, opisaną przez Bi.rmboim'a i wsp., NAR 1, 1513 /1979/.

Konstrukcja wektorów ekspresyjio-oydiielniczyci dla pro^niny. Dla otrzymania finalnych wektorów ekspresyjnych wykonuje się serię różnych konsst^ukkci. Wszystkie etapy są tjhemitycznie przedstawione na załączonych figurach. Na ogół, odcinki DNA izoluje się w

154 427 procesie elektroforezy żelowej 1 poddaje ligacji z innymi odcinkami albo z przeciętnym plazmidowym DNA w 20/ul buforu 50 iM Tria HCl /pH 7,5/, 10 aM MgClg 20 mM ditiotreltolu, mM ATP^, wobec ²⁰⁰ je^dnoetak l.igaz^{n T4}, w temperaturze ⁴°C. Tam gtJzie wymagane Jest częściowe trawienie DNA Bndonukleazę restrykcyjną, optymalny czas reakcji rozszczepiania oznacza eię lk8peΓyrameleSnle. Identyfikacja proreniny w płynie hodowli.

Transformanty drożdży zawlarajęce wektory ekspresyjne hoduje się przez dobę na podłożu GPP /patrz powlneJ/. Po odwirowaniu komórek drożdży do każdej próbki płynu hodowU w i.loścl. ⁵ ml ^dodeje sl^ę 1 ml ⁵⁰% TCA i u^zymuje się w temperaturze ⁴°C w czasie 60 minut. Osady otrzymane w wyniku wirowania przemywa się dwukrotnie 2 ml zimnego acetonu. Wytrącone białko rozpuszcza się w 100 /ul buforu próbki SDS i poddaje elektroforezie na 10% żelach poliaknylaylIlddowych - wobec SDS /Lseoyłl U.K., Naturę 227 , 680 /1970/. Białka rozdzielane na żelu przenosi się elektroforetycznie na nitrocelulozę /Schlelcher i SchueH; 0,22yjm/ i identyfikuje proreninę wykonując ant^ilzg immmunlogiczną typu “biot /bibułowa/ wycinków żelu /Hawkes R. i wsp., Anal.Blochem. 119, 142 /1982/. Na filtry nawarstwia się przeciwciała przeciw proreninie królika 1 lnkubuje się ze s^^ugo^nymi penksydazę kozimi przeciwciałami przeciw IgG królika /Cappel, Mluern, Pa/. Związana przeciwciała wykrywa się przez barwienie 4-chloro-lnnatoolm i nadtlenkiem wodoru.

Oznaczanie aktywności pronniny w płynie hodowU w próbie ścinania męka. Płyny tadoMU różnych tran8loymantól Ydlpolytlce oznacza się na aktywność ścinania Biska etnujęc molynfkację metody Endooma D.Dairy Sci. 41, 1664 /1958/. Pola-ótce, metoda ta polega na pocmarze czasu, w którym renina zawarta w aktywowanych sup^rnentach hodowU ścina buforowane, oddzielone od śmietanki mleko 1 porównuje wartości ze standardem oczyszczonej renlny. Hodowle drożdży /25 ml/ poddaje się wzrostowi przez dobę w podłożu GPP. Po odwirowaniu komórek, próbki po 5 ml 3uplrnsntól hodowU liofiliuuje się. Każdą próbkę liofiUzownnego supernantu zawiesza się plnolnil w 300 /jl wody destylowanej Deko standardowe próbki kontrolne przygotowuje się seryjnie rozcieńczenia oczyszczonej prominy cielęcej . Proreninę zawartą w koncentratach podłoży 1 w próbkach kontrolnych aktywuje się przez dodanie około 5 do 10/Ul stężonego HCl, do osią^ięc^ ^pH około 2 ⁱ i^ulbację przez godzinę w temperaturze 22°C. Zbierane mleko przygotowuje się przez dodanie 60 g suchego sproszkowanego zbieranego mleka /Dlfco/ do 500 ml roztworu zawierającego 41,5 mM octanu sldollgl /pH 6,3/ i 13,6 mM CaCl? i meszanie w czasie 20 minut w temperaturze 4°^C. ^Mle^ko to stosuJi s^ię do pró^{b b}ezpośmdnio po przodowaniu. Do ilości 1 ml tego zbieranego mleka w tly^er^^drzl 37°C dodaje się po 60 ul /Hość równoważna 1 ml supernaniu hodo^l/ każdego preparatu enzymu i mierzy czas ścinania mleka.

Wytwarzanie syntetycznych dligonukleonydów dla genu anafildoksyny C5a. Oligdlukl·lotydy stosowane do syntezy genu strukturalnego dla anafiOoloksyπn C5a przygotowuje się na drodze chemicznej zmodyfikowaną metodą poprzez pochodne amidofosfinom /Sinha i wsp. cyt. powyyżl/ w automatycznym aparacie do syntezy DNA Genetic Design 6500* /Wannown, MA/ z nośnikiem szklanym o kontrolowanej wielkości porów. Według przepisu, do Wszczepiana grupy tΓÓjllπyOymltylowsj stosuje się 3% /wag .obb ./ kwas dwu^^ructowy w dwuchlorommeanie, ΧΙπ^κι aktywowanie pochodnej amicc! osflnows j nasyconym roztworem tetrazolu w acetonit ryłu, zablokowanie lfθpΓzeesallwanych grup DH luklldzydu związanego z nośnikiem za pomocą tetrazolidu diltoasnflsfiny i utlenianie mieszaniną: wodny roztwór jodu /THF/ Matteucci i wsp., □ .Ame^Chem. Soc. 105, 3183/. Całkowity czas jednego cyklu addycji wynosi 14 mni^t. Dtrzymuje się dziesięć 47-mlrów /segmenty A - □ na fig.9/ ze średnią wydajnością 98,6%/ etap /oznaczaną metody analizy grupy trójlenylometyllwθa/. segmenty te odblokowuje się metodą Miteucci i wsp. /cyt, powyżej, wytrąca etanolem z 0,3 M roztworu octanu sodowego i izoluje metodą preparatywnej elektroforezy na 10% żelach denaturujących: pollakrydoamid-yocznίk, po czym prowadzi się reakcję tworzenia odcinków dwunίclowncl /przyżarzania/.

Konstruowanie, klonowanie i analiza seksencji genu ludzkiej anafiloooksyny C5a.

Na fig.9 przedstawiono sekwencję aminokwasną tego białka oraz rozmieszczenie syntetycznych lligonuklθonydΰl wymagane dla powstania genu kodującego białko ludzkiej anafiloloksyπn C5a. Wszystkie oligomery, za wyjątkom A i F fosforyluje się na końcach 5*, stosując kinazę polilukllltydową T4. Skonstruowanie tego genu wymaga przeprowadzenia dwóch pieKSZOrzędowych

154 427 reakcji tworzenia odcinków dwuniciowych /przydarzania/ i ligacji oligomerów A, 8, I 1 J oraz oligomerów C, D, E, F, G i H. Otrzymane odcinki dwuniciowego ONA o długości 94 pary zasad i 141 par zasad izoluje się po elektroforezie w 10% żelu poliakyyoaarnioowym, poddaje reakcji ligacji i otrzymany produkt o długości 235 par zasad izoluje się metodę elektroforezy żelowej. Ten odcinek DNA o długości 235 par zasad, zawierajęcy gen strukturalny anafiootoksyny C5a włęcza się przez insercję pomiędzy miejsca EcoRI i HinddII w ONA wektora pBR322 i trans formuje do koroppeentnych komórek E.coli K12, szczep HB101. Analiza restrykcyjna plazmidowego DNA wyizolowanego z 6 transtoamantów że 5 spośród 6 klonów zawiera fragment EcoRR/Hind Ul o właściwej długości. Sekwencję nukleotydowę regionu genu anafilotoksyny C5a każdego z tych plazmidów oznacza się metodę Maxam'a i wsp., Methods Enzymmo. 65, 499 /1980/. Konstrukcja i charakteryzacja plazmidu zawierającego gen ekspresji a^^^i-otto^l^i^y^ny C5a do transfommowania E.coli.

Postępowanie przy izolacji odcinka ONA i warunki reakcji ligacji sę opisane przez Maniatisa i wsp., Molecular Cloning: A laboratory Manuał, Cold Spring Harbor /1982/. Region , promotor trp - operator z E.coli gtΓZimano po raz pierwszy z ptrpLl /Edman i wsp.. Naturę,

291, 503 /1981/. Odcinek EcoRI o długości 360 par zasad, zawierajęcy sekwencję: promotor trp-opeeator, stosowany w plazmidzie ekspresyjnym genu a^^'fi.lo^^l^(^y^ny C5a /pC5a-48/ izoluje się z plazmidu ekspresyjnego genu proreniny pPFZ-R2, opisanego w europejskim zgłoszeniu patenoowym nr 0 147 178 z 3 lipca 1985 r.

Identyfikacja anafigotoksyiy C5a w płynie hgdowOi. Y.lipolytica. Stosuje się tekę sarnę procedurę, jak opisano po^y^^^j dla proreniny z tym, że w teście Immunnlogicznym stosuje się kozie przeciwciała przeciw aiafilotoksynle C5a i królicze przeciwciała przeciw IgG kozy /Cappee/. Kozie przeciwciała przeciw ludzkiej anafilotoksynie C5a otrzymuje się metodę Mandarino i wsp. OJmu^. Methods 53, 41-50 /1982/.

Weetory. pLD40 - opisany w europejskim zgłoszeniu patenoowym nr 0 138 508 z 24 kwietnia 1985 r.

Mikroorganizmy:

ATCC 20774 ATCC 20781 ATCC 20776

ATCC 20775

Yarrowia lipolytica PC 30869

Yarrowia lipolytica DL112 - PC - 30869 transtoimowany genem XPR2, Yarrowia lipolytica OL-148. Transformant Y.lipolytica ATCC 20688 zawierający plazmid pLS-3 trawiony Sna BI,

Yarrowia lipolytica DL-144. Transformant Y.lipolytica ATCC 20688 zawierajęcy niecięty pLS-3,

ATCC	20777	T ransformant	Y.lipolytica	PC-30869	zawierajęcy	plazmid	pC5aX-	3
		trawiony SnaBI,
ATCC	20778	Transformat	Y.lipolytica	PC-30869	zawierajęcy	plazmid	ρΧΧ-11	t rawiony
		SnaBI,
ATCC	20779	Transformat	Y.lipolytica	PC-30869	zawierajęcy	plazmid	pXX-22	trawiony
		SnaBI,
ATCC	20780	Transformat	Y.lipolytica	PC-30869	zawierajęcy	plazmid	ρΧΧ-33	trawiony
		SnaBI,
ATCC	20794	Transformat	Y.lipolytica	PC-30869	zawlierajęcy	plazmid	pLD56.
ATCC	20795	T ransformant	Y.lipolytica	ATCC 20794 zawierajęcy plazmid pLX-	34 tra-

wiony Nrul.

Na mocy Porozumienia iBudapesztańskiego mikroorganizmy te sę zdeponowane w AMeican Type Culture 001^01^^ Ιίοο^ίΐ^, Maryland ogólnie znanym muzeum, zapewniającym niezmienność szczepów i powszechnę dostępność, jeśli na to zgłoszenie zostanie udzielony patent. Zdeponowane szczepy sę dostępne w czasie trwania tymczasowej ochrony zgłoszenia osobom okreś^nym przez Kommsarza Urzędu Patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki jako do tego uprawnionych, zgodnie z 37 CFR 1. 14 i 35 Kodeksu Stanów Zjednoczonych 122 oraz w krajach, w których dokonano zgłoszenia niniejszego ^wynalazku, zgodnie z prawem patentowyi danego kraju. Wszystkie ograniczenia dostępności zdeponowanych aikrggΓganiimóo będę nijgdwotalnij zniesione po udzieleniu patentu.

154 427

Badania taksonomiczne Y.lipolytica ATCC 20774 /w kolekcji firny Pfizer Inc. oznaczone Jako PC 30869/ zostały przeprowadzone przez dr 3.R. DeZaeuw, który sporządził poniższy opis. W badaniach tych zastosowano metody zalecane przez 3.L.Lodeer*a w The Yeasts, II wydanie, N.Hollend Publishing CoAmsterdam, 19710.

Dla porównania prowadzono badanie CBS 599, hodowli typowej dla gatunku Candida lipolytica /The Yeaats, II wydanie, N. Holland Publishing Co., Amsterdam 1970/ i CBS 6124, hodowU typowej dla Saccharomycopsis lipolytica /The Yeasts, HI wyddaie/. Wczeóniej gatunek ten był oznaczony Jako Endornmcopsis lipolytica. 3ego niedoskonałe formą Jest Candida lipolytica. Pozycje taksonomiczne tego gatunku ustalił van der Walt i von Arx, /Antonie van Leeuwenhoek, 46, 517-521 /1980/. Obecnie zalecane nazwą Jest Yarrowia lipolytica.

Charakterystyka hodo'wlβnθ, morfologiczna i fizjologiczna szczepu PC-30869 odpowiada standarowwemu opisowi dla gatunku opisanego Jako Saccharomycopsis lipolytica w The Yeasts, III wydanie, pod redakcje Kryger-van Rij, str. 406-408, Elsevier Science Publishers B.V., Anm-ter-dam 1984.

Tablica 1

Porównanie szczepów Yarrowia lipolytica

Oznaczenie f^my Pfizer	1 ł	Źródło	• τ · 1 1	Genotyp
PC-30265	1 1 1 . · 1. .	NRRL YB-423 /również CBS 6124/. typowa hodowle w The Yeasts, HI wyd.	1 1 1 - X _	Diploid typu dzikiego
PC-30286	1 1 - - u	CBS 599, typowe hodowle w The Yeaets, II wyd.	1 1 - X -	Haploid MATA typu dzikiego
PC-30869	1 1	patrz poniżej	1 1	MATB bio-6 leu2-40 xpr2-1002

Λ

PC-30869 otrzymuje sią przez genetyczną rekombinacją ^pow^dni^ mutantów Y.liprlytic8 PC-22208, wyizoCwanych w fi-mmie Pfizer z gleby i Y.lipolytica PC-30026, podhodowH NRRL Y-1094. Pod względem fąnrcppowym PC-30869 różni sią od szczepów rodzicielskich dzikiego typu tym, że: 1/ nie wytwarza aktywnej p^a^mó^nej proteazy alkalicznej, 2/ do wzrostu wymaga biotyny i 3/ wymaga źródła L-leucyny·

Podczas fazy wzrostu logarytmicznego PC-30869 na podłożu: ekstrakt drożdżowypepton-glikoza /YEPD/ pączkujące kuTrki są owalne i mają średnie wymmary 2,6 x 5,5 mikronów. Na agarze YEPD wyróżniają sią: pseudogrzybnia i grzybnia właściwa. Obecne są blastospory ^^^^ąpujące głównie pojedynczo w pozycjach pleuralnych. Nie stwierdza sią barwników karrtenridowcih· Hodowla zachowuje sią jak hap^oid o typie kojarzenia B w próbach krzyżowania z porównawczymi szczepami testowymi tego gatunku /tablica 5/.

Na agarze VS obserwuje sią typową askospolrlacię. Dane dotyczące asymilacj węgla przedstawiono w tablicy 2. Fermentacja nie zachoozi. Jedynymi źródłami azotu przyswajanego są: jon amoniowy i ιπϋηΐί, ale nie azotany /tablcca 3/.

Szczep PC-30669 wymaga jako witamin tienny i D-bioty^ /tablćca 4/. Hodowle rodzicielska ^dzikiego typu wymmggj^ą t^ko tiaminy. W temperaturze ³⁷°C me rbserm^;)e si^ą wzrostu.

154 427

Tablica 2 Asymilacja węgla

r------------ — , Źródło węgla	* Wniesienie do opisu w iieeaaturze	i H o d o w 1	a .
30266 -l- - - - . 1	1 30286 t	1 r 1	30869 ,
J 1 1	/0/
' 1 ·	L-a rabinoza
i 2.	Celobioza	1	-	1	«.	1 -	1 |
i 3.	E ryt ryt /butanotetracyl/	1	*	t	4+4	444	1	♦ ♦♦
1 4.	O-galaktoza	1	-	ł	-		1	-
' 5.	O-glukoza	1		r	444	1 ♦♦♦	1	444
ι θ*	Inozyt	1	-	1	-	1 -	1 |	-
i 7.	Laktoza	1	-	1	-	' -	1	-
• 8.	Maltoza	1	-	1	-	1	1	-
' 9.	O-Ma aninl	1	♦	1 |	444	1 + ♦ +	I	444
ΐ 10 ·	Rafirnza	1	-	1	-		1	-
i 11«	Rybitol	1	-	1	-	' -	ł 1	-
> 12.	0-ryboza	1	-/♦/	1	-	1 _	1	44
1 13.	L-Remnoza	1	-	1	-		1	-
' 14.	Skrobia rozpuszczalna	I	-	1	-		1	-
, 15.	Sacharoza	1	-	1	-	• -	1	-
i 16.	Trechaioza	1	-	1	-	1 -	1	-
1 17.	0-ksyloza	1	-	1	-	1	«	-
' 18.	Kwas bursztynowy	1	♦	1	444	1 + ♦♦	1	444
' 19·	Kwas cytrynowy	1	♦	1	444	1 444	1	444
4 - -				“ f

a/ jako podłoże podstawowe stosowano podłoże azotowe Bactoyeast z dodatkiem 10 yig/litr D-biotyny i 149 i/l.itr chlorowodorku estru etylowego L-laucyny, co odpowiada 100 mg/ litr L-laucyny.

b/ Kreger-van Rij /cyoowany powyyżj/

Tablica 3 Prz^yswajanie azotu ^a/

Źródło azotu	i Odniθsiinie do i w lieeaaturze	opisu D/	1 H o d o , 30265 '	w 1 a 30286	__r.	30869
			_ - - - - 1- .		- L
i. /nh4/2so4	t 4		1 444 1	444	1	4+ +
2. KNO3			1 1	-	1	-
3. Mocznik	1 4 1		1 * 444 .	444	1 1	♦ + ♦

u a/ Jako podłoże podstawowe stosowano podłoże węglowe Bacto-yeast z dodatkiem 116 mg/litr soli sodowej kwasu kito-ilkjaplnπowegl /co jest równoważne 100 mg/litr L-leucyny i lOyu/fi-tr D-biotyny.

154 427 b/ Kreger-Van Rij /^(^yto^wany powyżej/

Tablica 4 Wymaagaia witaminowe

	Ί 1 1	Odniesienie do opisu w lieeaaturze b/	, Hodowla ,
1 1	Dodatek do podłoża podstawowego c/
i 30265	30286	Γ	30869 i
Γ 1	1. Bez dodatku	1	.		.,. . . . - ślady	ślady	f a	.
1	2. Tiamina.HCl	1	♦		1 ♦++	++ +	1	-
1 1	3. D-biotyna	1	-		i ślady	ślady	1	ślady
1	4. Tiamina ♦ biotyna	1	♦		• i +++	+♦+	1
L		_ -·				L - - - -	4

a/ Jako podłoże podstawowe stosowano podłoże drożdżowe Bacto bez witamin oraz 149 mg/litr chlorowodorku estru etylowego L-leucyny /co odpowiada 100 mg/litr L-lsucyny/.

b/ Kreger-van Rij /cyoowany powyyee/.

c/ 200 yju/litr chlorowodorku tisminy i/Uub 10 /jg/litr D-biotyny, według wskazania tablicy.

Tablica 5

Askospooulacja

Szczep porównawczy

H o d o w 1 a

30265

Brak /samokooarzenie 30264 /typ kojarzenia A/ 30267 /tyb kojarzenia B/ + ♦ ++ ♦ +

“Γ“* 1	30286	...7. 1	30869
1 1	-	1 1	-
1	-	1	+++
1	♦ + +	1 1	-

a/ Hodowle 30264 i 30267 sę szczepami haploidalnymi o typie kojarzenia odwrotnego, udostępnionymi /rzecziośclowl przez dr L.3. Wickerham 'a. Sę one opisane a Science 167,

1141 /1970/.

b/ 30264 jest szczepem C.lipolytica YB-421 opisanym przez Wickerham'a. c/ 30267 jest szczepem C.lipolytica YB-423-12 opisanym przez Wickerham'a.

Tablica 6 Inne cechy charakterystyczne

	100^6516^8 do	u H o d o	w 1 o
	.opisu w liteaaturze	, 30265 '	30286	1 30869
	1 /a/	1		1
				“1 --------
Kształt komórek	1 owalny	owalny i	owelny	i owalny
średnie wymmary	' /2-4,5 x 4-22/	' 3,3 x 9.1 '	3,0 x 8.2	'2,6 x 5,5
komórek /w mikronach/		1		1
Rozaniżθnie wegetatywne pęczkowanie	I pęczkowanie	pęczkowanie	1 pęczkowanie
Fermentacja	i nie zachodzi	i nie zachodzi	nie zachodzi	nie zachodzi
Wzn6t w temp. 37°C	i brak	brak ,	brak	, brak

Wzrost kolonii

Te trzy kolonie rosnę podobnie, zgodnie z opisem lieeraturwwym. Wyróżnia się grzybnia rzekoma i właściwa. Obecne sę plastospory, głównie pojedynczo w pozycjach pleuralnych. Nie stwierdza się barwników karlienlidoyych.

e/

Kregar-van Rij /cyoowany powyżej/

154 427

Szczep PC-30869 różni się od innych szczepów Y.lipolytica opisanych w literaturze patentowej, czego dowodzi porównanie ich cech fenotypowych //tablice 7 i 8/.

Szczep 20228 /Ntbel i wsp.. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameeyki nr 4 155 811// cechuje odżywianie dzikiego typt. Zachowuje się on tak, jak szczepy typowe dla gattnkt, CBS 599 i CBS 6124. Nie wyeaga on do wzrostu tracylt, letcyny ltb biotyny i rozpłynnia żelatynę.

Szczep ATCC 20628 /DeZeetw. i wsp., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 407 953/ odmiennie niż ATCC 20228 wyeaga do wzrostu dodatku letcyny. Podobnie jak ATCC 20228 nie wyeaga do wzrostu tracylt ltb biotyny i również rozpłynnla żelatynę.

Szczep ATCC 20688 /opis zgłoszenia patentowego etropejskiego nr D 138 508,/ rośnie tylko wówczas, jeśli podłoże zawiera zarówno tracyl Jak i letcynę. Te wyeegenia w stostnkt do tracylt odróżniaję szczep ATCC 20688 zarówno od ATCC 20228 jak i ATCC 20628. ATCC 20688 nie wyeaga biotyny i rozpłynnia żelatynę.

Hodowla PC-30869 różni się od wszystkich powyższych. Wyeaga ona do wzrostt biotyny i letcyny, ale nie tracylt. Nie rozpłynnia żelatyny.

Tablica 7

Wyrnaagnia składników odżywczych

4
1	Hodowla	1 Składniki	odżywcze poi^er^iręte	w podłożt			1
1		, Brak	1	Letcyna	1	Uracyl	1	Biotyna
4			• 1 -		- J -		4
1	CBS 599	1 ♦++	1	44 4	1	444	1	44 4
1	CBS 6124	1 44 4	1	4 4 4	1 |	44 4	|	44 4
1	ATCC 20228	1 444	1	4 4 4	1	444		4 4 4
1	ATCC 20628	1 +++	t	-	1	4 44	1	444
1	ATCC 20688	1 + + +	1	-	1	-		44 4
1 1	PC-30869	1 4 4 4	1 1	-	1 1	44 4		-

Pełne podłoże zawiera 16,7 g/litr wycięgt drożdżowego Bacto bez witaein 4 100 eg/ litr tracylt, 100 eg/litr L-leucyny, 10 /ug/litr D-biotyny i 200 /jg/litr chlorowodorkt t iaeiny.

Tablica 8

Rozpłynnianie żelatyny

	Hodowla	I 1	Rozpłynnianie
	CBS 599	1 1	4
	CBS 6124	1	4
	ATCC 20228	1	4
	ATCC 20628	1	4
	ATCC 20688	1	4
	PC-30869	1	-

Podłoże zawiera 120 g/litr żelatyny i 16,7 g/litr wycięgt drożdżowego Bacto bez witaein oraz 100 ag/litr tracylt, 100 ^/Τ!·/γ L-leucyny, 10 /ug/litr D-biotyny i 200 /Ug/litr chlorowodorkt tiaeiny.

Opis rystnków. Fig.l przedstawia częściowę liniowę eapę restrykcyjnę częściowo pokrywających się plazeidów pLD 57, pLD 58 i pLD 62, wyizolowanych z Y.lipolytica, szczep DL 112.

Fig.2 przedstawia syntetyczne olggonukeeotydowe sondy dla gent XPR2. W opublikowanej sekwencji dla większości z pierwszych 25 reszt ^^nokwasowych dojrzałej proteazy /Ogrydziak

154 427 i wsp., cytowany powyżej/ dwa regiony ^(^^nac^one jako 1 i II/ stwarzają możliwość zsyntetyzowania 14-merowych sond olggonukleotydowych z 32-krotną lub mnnejszą degeneracją. Te dwa regiony zaczynają się odpowiednio od aminokwasów 7 i 18. Dla każdego regionu przygotowano cztery różne mieszane sondy o 8-krotnej degenneacji i oznaczono numerami od 170 do 186.

W przewidywanych kwasach nukleinowych, sekwencje oznaczone znakiem X oznaczają wszystkie cztery zasady, sekwencje oznaczone jako U oznaczają obydwie zasady purynowe, a sekwencje oznaczone jako Y oznaczają obydwie zasady pirymidynowe.

Fig.3 przedstawia sekwencją nukleotydową genu XPR2, w której uwidoczniony Jest promotor, pre-sekwencja /-157 do - 136/, pro 1 /- 135 do - 98/, pro 2 / - 97 do - 1/ oraz sekwencje dla zewnątrzkomórkowej proteazy i sekwencje terminatora.

Fig. 4 przedstawia schemat konstruowania sekwan^i dla wektora terminatora pterm 4.

Fig. 5 przedstawia schemat konstruowania sekwann^ i mapę restrykcyjną plazmidu pIS-3.

Fig. 6 przedstawia schemat konstruowania sekwann^ i mapę restrykcyjną plazmidu ρΧΧ-33.

Fig. 7 przedstawia schemat konstruowania sekwen^^ i mapę restrykcyjną plazmidu pxx-22.

Fig. 8 przedstawia schemat konstruowania sekwan^i i mapę restrykcyjną plazmidu

ΡΧΧ-11.

Fig. 9 przedstawia sekwencję aminokwasowę ludzkiej arna^i-loo^l^^^ny C5a.

Fig. 10 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pJ5a-48.

Fig. 11 przedstawia schemat konstruowania sekwann^ i mapę restrykcyjną plazmidu pC5aX-3.

Fig. 12 przedstawia sekwencję nuklnotydową genu LEU 2.

Fig. 13 przedstawia schemat konstruowania sekwan^i i mapę restrykcyjną plazmidu pL-34 .

Analiza sekwan^i genu XPR2. Analizę sekwernji DNA w sklonowanym genie XPR2 prowadzi się metodą degradacj chemicznej /Maxam i wsp., Methods Enzymoo, 65, 499 /1980/, pokrywających się częściowo odcinków restrykcyjnych otrzymanych z plazmidów pLD 57, pLD58, pLD62 /fig.l/ oraz pLD84 i pLD86 /patrz ponCżer/. Wynćki analizy wskazuuą. Ze sklonowane genomowe DNA drożdży rzeczywiście zawierają gen dla pozakomórkowej alkalicznej proteazy. Sekwencja nukleotydową genu XPR2 oraz wyprowadzona z sekwan^i nukleotydtwrj sekwencja a^^nokwas^wa prekursora alkalicznej proteazy łącznie z jego sekwencją sygnałową przedstawiona jest ne fig.3 Dotychczas duża część sekwan^i aminokwasowej pozakomórkowej proteazy była nieoznaczona /Ogrydziak i wsp., cytowany powyżs^ i w niniejstym opisie jest przedstawiona po raz pierwszy. Ponadto, po raz pierwszy opisane są tu sekwencje wymagane dla ekspresji i wyddielania pozakomórkowej proteazy. Sekwencja DNA kodująca alkaliczną proteazę, jej prekursor i sekwencje sygnałowe składają się ze 1362 par zasad /fig.3/. Z sekwennci tej wyprowadzono strukturę pierwszorzędową łańcucha tego polipeptydu. Zawiera ona 454 reszt aminokwasi^^ych. Alkaliczna proteaza jest syntetyzowana w komórce w formie prekursora, który jest proteolitycznie przetwarzany w formę dojrzałą, wydzielaną poza komórkę. Analiza N-terminalnej sekwan^i aminokwasowej wyprowadzonej z s^wennc! nukleotydowej ujawniła w cząsteczce prekursora obecność dotych czas domniemanego peptydu sygnałowego. Ten peptyd sygnałowy zawiera 22 reszty aminokwasowę, a jego cechy strukturalne są podobne do cech peptydów sygnałowych w wyższych organizmach prokariotycznych i eukariotycznych /Perlman i wsp., D.Moo .Biol., 167, 391 /1983/. Region w wyprowadzonej sekwennci aminokwasowee, zasadniczo zgodny ze znaną N-terminalną sekwencją 25 aminokwasów dojrzałej alkalicznej proteazy /Ogrydziak i wsp., D.Gen.Microtiot., 128, 1225 /1982/, jest poprzedzony 157-mioma resztami a^^nok^^so^^i^i, zawierającymi peptyd sygnałowy i dwa miejsca podlegające trawieniu trypsyną /Lys-Arg/. Te miejsca rozszczepienia stosuje się do podzielenia pro-regionu na pro 1 /—135 do -98/ oraz pro 2 /-9i7 do -1/, /patrz fig.3/. 3ak wynika z sekwannc! cuklrotyytwer, dojrzała alkaliczna proteaza zawiera 297 aminokwasów. Sekwencje aminokeastwθ różnych form proteazy, wyprowadzone z sekwennci cuklettydowrj są w

154 427 zgodzie z rozmiarami oczyszczonych form tego enzymu. Poza strukturalny sekwencję prekursora alkalicznej proteazy oznaczono sekwencję flankujący -5' o wielkości około 500 par zasad i sekwencję flankującą -3' o wielkości 600 par zasad. Analiza tych regionów wykazała, że zaWLera ją one sekwencje analogiczne do sekwencji innych promotorów i terminatorów eukariotycznych i również są niezbędne dla ekspresji alkalicznej proteazy.

□ak wspomniano powyżej, w opisie patentowym europejskim nr EP 0138508 podana jest matodologia trenBoommowania Y.lipolytica i klonowania genów Y.lipolytica przez komplem^8cję mutaccj, łęcznie z klonowaniem genu XPR2 zawierającego kod dla wydzielania alkalicznej proteazy na drodze komilθmietacji mutacji xpr2. Opisana tam metoda polega na aran8tormooaniu szczepu gospodarza Y.lipolytica produktem częściowego trawienia banku genów Y.lipolytica w wektorze pLD40 enzymem Bg 111. Wektor ten charakteryzuje się tym, że zawiera mały segment zewierajęcy region LEU 2 z Y.lipolytica oraz następujęce miejsca dla endonukleaz restrykcyjnych: 3 miejsca dla Eco RI, 4 miejsca dla Eco RV, 6 miejsc dla Ava 1, 1 miejsce dla Bg HI, jedno miejsce dla Nco I, 1 miejsce dla Apa I, dwa miejsca dla Xho 1 i Jedno miejsce dla Bat XI. Oeden z transCmantów Y. lipolytica XPR2 użyto do wyodrębniania genu typu dzikiego /pL084 i pLD86/ pochodzącego z Y.lipolytica NRRL Y-1094 i użyto go do konstruowania wektora ekspre8yjno-wyddielnijzjgo, co Jest opisane w przykładzie 1.

Analiza sekweneci genu LEU 2. Analizę sekwennci DNA genu LEU 2 klonowanego w plazmidzie pLD25 /opis patentowy europejski nr O 138 508/ wykonuje się metodę degradacci chemicznej /Mlaxam i wsp., Methods Enzymoo. 65, 499 /1980/ pokrywających się częściowo odcinków restrykcyjnych. Ola zlokalioowania regionu kodującego dehydrogenazę β -izopropylojabcczanu /PPM/ i właściwej remy odczytu wykorzystano sekwencję amilokwjsowę wyprowadzoną z oznaczonego wcześniej genu LEU 2 z Scereylsiee /Andreatis i wsp., O.Biol. Chem. 259, 8059 /1984/. Zidentyfikowano region genomowej sekwaneci Y.lipolytica, kodujący sekwencję αmilokwjsową hommtogiczlą z regionem dla sekwennci białkowej w S.cerevijiαe. Sekwencja nukleotydowa genu LEU 2 o wielkości 2,8 kilofiar zasa^d oraz wy^^adzona z je^kwencji nukleotydowej se^encja aiino^koejtoe /3dehydrogenazy -IPM Jest przedstawiona na fig.12. Ponadto w liniθjizmm opisie po raz pierwszy opisano sekwencje wylęgane dla ekspressi β-dehydrogenazy-IPM w Y.lipolytica. Sekwencja ONA zawierająca kod dla tego białka złożonego z 405 aminokwasów, składa się z 1215 par zasad /fig .12/.

Poza sekwencję kodującą β -dehydrogenazę-UW , oznaczono sekwencję flankującą -5' o długości 798 par zasad oraz sekwencję flankującą -3 o długości 797 par zasad /w tym kodon zakończenia translacji TM/. Analiza tych regionów wykazała, że zawierają one sekwencje analogiczne do sekwennci innych promotorów i terminatorów eukariotycznych i że odgrywają one podstawową rolę w ekspressi.

W genie Y.lipolytica LEU 2, region znajdujący się “w górę od 5* zawiera sekwencję TATATATA iltkelitowθną w odległości 78 par zasad przed początkiem translacji i 30 par zasad przed przypuszczalnym miejscem sterowym dla informacyjnego RNA. Następną sekwencję ważną dla inictowenie transkrypt i u ecker^tów jest tzw. skrzynka CAAT, która w genie LEU 2 jest z^kalż^Na^ w odległości 74 par zasad przed przepuszczalnym miejscem początku transkrypeci, znajdującym się w odległości -48 par zasad od ATG /fig. 12/.

Region w dół od 3', za kodonem stopu TAA zawiera sekwencję od siedemdziesiątego drugiego do studwudziestego nukleotydu, homologiczną do proponowanej) przez Zareta sekwermji 5' -TAG .. .TA/T/GT.. .TTT-3' /Zaret i wsp., Celi., 28, 563 /1982//, odpowiedzialnej według tego autora za zakańczanie transkrypcji w S.cerevisiae.

Przykład I. Bako szczep gospodarza stosuje się ATCC 20774 /MATB leu2-40 bio-6 xpr2-1002/. Transformant XPR2, Y.lipolytCca ATCC 20781, wykrywa się jako kolonię tworzącą strefą na płytkach indykatooowych zbieranego mleka po posiewach na płytki-repliki z płytek z podłożem bez leucyny. Z tego transforrnantu wypreparowuje się chromosomainy DNA stosując metodę podaną w opisie petenliwye europejskim nr O 138 508. DNA ten stosuje się do wyizolowania genu dla wydzielanej proteazy. Ten chromosomainy DNA trawi się częściowo enzymem Bglll, poddaje ligacji z odcinkiem wektora zawierającym zarówno replikom E.coli Jak i gen oporności na amppcylinę, z utworzenne® cząsteczki kolistej i stosuje się do transloemowania

154 427

E.coli. Chromosornalny ONA trawi się również enzymem Sali i stosuje w próbie Southern'a, która wykazuje, że normalny region LEU 2 w transformancie nie jest uszkodzony /jako sondę stosuje się odcinek Sal 1 - Eco Rl o długości 520 par zasad z regionu LEU 2, znajdujący się w kierunku 5* od odcinka LEU 2 zawartego w plazmidzie pLD 40/. Ponieważ do integracji plazmidu pochodzącego z banku w Y.lipolytica wymagana jest hornologia, to miejscem integracji musi być region XPR 2.

Z Y.lipolytica ATCC 20781 wyodrębnia się początkowo 3 częściowo pokrywające się lecz różne plazmidy: pLO 57, pLO 58 i pLO 62. Są one przedstawione na fig.l. Próby hybrydyzacji z sondami syntetycznych oligonukleotydów dla genu XPR 2, zsyntetzoowanych w oparciu o znaną sekwencję pierwszych 25 reszt aminokwas^ych dojrzałego wydzielanego białka proteazy /fig.2 i 3/ wykazuuą, że gen dla wydzielanej proteazy został sklonowany. Dla określenia, czy wyodrębniony gen jest kopią typu dzikiego czy kopią przyjmujący ten gen szczep

Y.lipolytica transformuje się plazmidem pLD58. Ponieważ nie otrzymano prltθazo-dldatnich transloomant6w z żadnego z tr^^r^sorm^am^ó^w niezależnych od leucyny, wyciągnięto wniosek, że pL058 zawiera zmutowaną allelę tego genu.

Formę genu XPR 2 obecną w szczepie dzikiego typu - NRRL Y-1094 otrzymuje się w próbach hybrydyzacji kolonii E.coli. Dako sondę stosuje się odcinek Pvul do EcuRI o długości 2 kilopary zasad, który jak wynika z danych dotyczących sekweenci, powinien zawierać cały gen strukturalny. Z oryginalnego banku odcinków DNA pochodzących z częściowego trawienia enzymem Sau 3A DNA NRRL Y-1094 w plazmidzie pLD40, opisanego w opisie patemowym europejskim nr 0 138 508 otrzymuje się szereg kolonii, które hybrydyzują z tą sondą. Dwie z tych kolonii zawierają bardzo podobne plazmidy oznaczone symbolami pLD84 i pLD86. Plazmidy te stosuje się do przygotowania wektorów ekspresyjnych. Obydwa te plazmidy zawierają ten sam koniec 5': region XPR 2 - miejsce dla Sau 3A /które przyłącza się i regeneruje miejsce dla SsoHI w od którego zaczyna się sekwencja przedstawiona na fig.3. Każdy z tych plazmidów zawiera cały gen strukturalny dla proteazy, przypuszczalny terminator transkrypcji oraz cały insert z regionu XPR 2 szczepu NRRL Y-1094 o wielkości 4 do 5 kilopar zasad. Insert w plazmidzie pLO86 zawiera przy końcu 3' kilkaset dodatkowych par zasad. Ponieważ do konstruowania wektora ekspresyjnego użyliśmy przedłużenia 3' Jako miejsca dla Bgg.II /para zasad 2655/ plazmidy te zawierają DNA, który jest funkcjonalnie identyczny co do sekwan^i z DNA przedstawionym na fig.3.

Konstruowanie wektorów ekspresyjnl-wydyiθlnijzyjh. Dla uzyskania ekspresji i wydzielania proreniny w Y.lipolytica opracowano plan skonstruowania różnych genów hybrydowych w integrujcie) wektorze przeznaczonym do klonowania. W takim podejściu, konstruuje się szereg różnych plazmidów posiadających długie regiony zwykłych jekwejcji DNA. W rzeczywistości, zastosowano modułowy schemat konsstukcci wektorów z insercją genu dla proreniny w kierunku 3' do przypuszczalnego miejsca przetwarzania peptydu sygnałowego XPR 2, przypuszczalnego miejsca przetwarzania pro 1- oraz miejsca rozszczepiania, o którym wiadomo, że generuje dojrzałą alkalcczną proteazę. W zasadzie,dla uzyskania ekspreesi jest pożądane, aby dokonywać insercji genu heterologccznego pomiędzy sekwencjami promotora i terminatora drożdżowego. Zakłada się, że część N-terminalna jekwθecji genu hybrydowego będzie się różnić w różnych konstrukcjach plazmidowych, lecz w każdej konssrukii palzmidu ekspresyjnego powinna być zawarta taka sama sekwencja genu strukturalnego proreniny, sekwencja terminatora XPR 2 oraz DNA wahadłowego wektora yrlZyZlW0lbθkteryjnegl /shuttle vector/.

W za łożeniach planu przyjęto, że w każdej konssrukcći plazmidu ekspresyjnego powinien być użyty ten sam odcinek genu struktura^ego dla pro^niny i terminator/wektor, co jest opisane ponnżej . Różne konstrukcje plazmidowe dla ekspressi i wydzielania pro^niny różnią się w regionie bezpośrednio za sekwencją promotora genu XPR 2 pod względem długości N-terO,nβlljj sekwannc! dla prekursora alkalicznej proteazy, która poprzedza sekwencję genu dla proreniny. Tak więc, komponentę odcinka promotora w każdym plazmidzie ekspresyjnym zaprojektowano jako sekwencję zmienną w regionie połączenia: XPR 2 - prlrjrrina. Wszystkie ekspresyjno-w^bdle^icze skonstruowano w podobnych reakcjach ligacji z użyciem trzech odcinków składowych.

154 427

Etapy doświadczalne 2as^c^^owane podczas konstruowania wektora terminatora ptem 4 przedstawione sę na fig. 4. Syntetyczny linker poddaje się ligacji z odcinkeem zawierająyym koniec 3* genu XPR 2 łęcznie z sygnałami zakańczania transkrypcci i poliadenylacći. Pokrótce, plazmid pLD84 trawi się endonukleazę KpnI i poddaje ligacji z syntetycznym, dwuuiciowym l^ksema! DNA przedstawionym na fig .4. Produkt ligacji rozszczepie się endonukleazami Hind III i Bggll i wyizolowany odcinek o długości 760 par zasad włęcza się przez insercję do plazmidu pLD4l doprowadzonego uprzednio do postaci, linóowei tymi samymi dwiema endonukleazami Otrzymuje się plazmid pterm 4. Plazmid ten jest scharakteryzowany mapę restrykcyjnę. Zanalizowano odcinki powstałe w wyniku seryjnego trawienia endonukleazami restrykcyjnymi: EcoRV, EcoRI, KpnI, BgglI-Hinlll i Bggll-Bcll.

W wyniku tego trawienie otrzymuje się odpowiednie odcinki potwierdzające obecność syntetycznego linken i całkowitego końca 3' genu XPR 2 w wahadłowym /shuttle/ plazmidzie pLD41 opisanym w pubbikacji zgłoszenia europejskiego 0 138 508. Częściowa mapa restrykcyjna tego wektora terminatora o długości 7,3 kilopar zasad jest przedstawiona na fig.4. Konstruowa nie plazmidu ekspresyjno-wydzielniczego pLS-3.

Na fig.5 przedstawiona Jest konstrukcja pierwszego plazmidu utytego do w}liotθnia sekrecji proreniny w Y.lipolytica. Na tej figurze jest przedstawiona mapa restrykcyjna tego plazmidu. Konssrukcję plazmidu zawierającego kod dla wytidielania proreniny rozpoczyna się od przygotowania odcinka zawierającego główną część sekwennji genu strukturennego dla proreniny. Z plazmidu pPFZ-84A E.coli zawierającego kod ekspressi proreniny izoluje się po częścoowym trawieniu enzymami BclI-BemHI, fragment DNA o długości 1080 par zasad, zawierajęcy sekwencje kodujęce reszty aminokwasie proreniny od 6 do 365. /Plazmid pPFZ-84A jest pochodnę plazmidu ekspresyjnego dla proreniny pPFZ-R2, którego konstruowanie jest opisane w opisie patent<5wym europejskim nr 0 147 178. Plazmid ten otrzymano na drodze mutagenezy kierowanej syntetycznym oligonukleotydem, z zastosowaniem wymiany odcinka restrykcyjnego. Plazmid pPFZ-84A rćżni się od plazmidu pPFZ-R2 tylko dwiema parami zasad kodujęc^! reszty aminokwasie proreniny 214 /Asn—»-Asp/ i 286 /Asp—> Gly/, to znaczy zawiera on kod tak zwanej alleli proreniny A. Obydwa plazmidy iawleraią Jednakże potrzebnę sekwencję dla proreniny i w tym przykładzie sę równo^aon/.

Kompoieπtą odcinka promooon, iawierljęcą sekwencje kodujęce prekursor alkalicznej proteazy, aminokwasy 1 do 157 i proreninę, aminokwasy 1 do 5, przygotowuje się w sposób następujęcy: z pod-ktonooliegt genem XPR plazmidu pLD90 izoluje się odcinek DNA Hind III Aval o długości 870 par zasad, zawieraiącl region promotora i koniec 5' genu alkalicznej proteazy. Odcinek ten poddaje się ligacji z syntetycznym fragmentem o strukturze:

5' CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATTGCCAAkGCGAGCTGAGATCACTAG 3'

3' CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTATGGATCCTAG 5' kierunek odczytu -►

Powssała sekwencja zawiera lepki koniec Ava I, po którym następuję sekwencje ostatnich 9 kodonów dla propeptydu alkalicznej proteazy, a za nimi, sekwencje kodujęce cztery pierwsze aminokwasy proreniny i kończy się miejscem dla Bam^H.

Komyonϋntą odcinka promotora przygotowuje się w standardowej reakcji ligacji fragmentu syntetycznego z odcinkiem Hind Ili - Ανβ I o długości 870 par zasad, wobec ligazy T4 i przez następne trawienie enzymam. Hind III i Ban HI. Powiała zimowane sek^^r^^je oczyszcza się metodę elektroforezy w żelu poliaklyllymitowyy, oddzielajęc odcinek DNA Hind III-Im HI o długości 916 par zasad. Koniec 3* genu hybrydowego otrzymuje się z plazmidu: terminator/ wektor, pterm 4, opisanego powyyej . Plazmid pterm 4 trawi się enzymami Hind III i Bc II, po czym z żelu lilrozoojgt izoluje się fragment terminator/wektor Hind IH-BclI o długości 7,3 kilopar zasad, zlwijrliący terminator XPR 2, yyrker selekcyjny LEU 2 i pBR322.

Plazmid pL£-3, iawierliący kod ekspres^ i ϋydzielliil proreniny otrzymuje się przez inkubację trzech opisanych powyżej składowych odcinków DNA /tliwtonl Hind III-BclI plazmid ptem 4, promotor Hind Ill-am HI o długości 916 par zasad oraz odcinek Ban HI - Bc II o długości 1080 par zasad, ilwierliącl gen proreniny,/ w obecności ligazy T4 /patrz fig.5/.

154 427

Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformowania E.coli K12, szczep MM 294 metodę Oagerta i wsp. z utyciem CaC^ /Gene, 6, 23-28 /1979/. Z transformantów wyselekcjonowanych w oparciu o cechę oporności na arppcylinę izoluje się plazmidy i plazmid pLS-3 identyfikuje się jego mapą restrykcyjnę /fig.6A/. Dla potwierdzenia prawidłowej sekwencji syntetycznego DNA i właściwego połęczenia żądanych odcinków prowadzi się analizę sekweenci regionu XPR 2 - prorenina w tym plazmidzie.

Przygotowanie plazmidu pLD90. Plazmid ten zawiera podklon z plazmidu pLD84. Region DNA rozcięgajęcy się od miejsca dla Pvul w regionie promotora XPR 2 do miejsca dla EcoRI w regionie terminatora podklonowuje się do miejsca dla Hind III w plazmidzie pBR322 w sposób następujący: kilka /kikaanaście/ mikrogramów pLD84 trawi się wyżej wymienionymi enzymami restrykcyjnymi. Następnie, na lepkie końce trawionych cząsteczek DNA działa się fragmentem Klenowa polimerazy DNA I. Następnie końce te łączy się z poddanymi uprzednio działaniu kinazy lćnkerami Hind III /(AAGCTTG, z firny New Englend Biolabs/ za pomocą llgazy DNA T4. Nadrnmar lćnkerów usuwa się i generuje lepkie końce Hind III przez następne trawienie tym enzymem. Mieszaninę cząsteczek DNA rozdziela się w preparat^wnym żelu agarozowym i wycina się żądane pasmo o długości 2 kilopar zasad. Po oczyszczeniu stosuje się go do reakcji ligacji z traktowanym oakteryjną fosfatazą alkaHczną wektorem pBR322 po jego uprzednim trawieniu enzymem Hind HI. Mieszaninę po ligacji stosuje się do tr^^r^sosm^owania kom^tentnych komórek E.coli· Plazmid o orientacji takiej, że miejsce dla Eco Rl terminatora XPR 2 jest bliżej miejsca dla Eco Rl w plazmidzie pBR322 nazwano pLO9O, a plazmid o orientacji odwrotnej nazwano pLD 91.

Kraniec 5' regionu promotora XPR 2 włączony do pLS-3 Jest miejscem dla Pvu I o długości około 280 par zasad, liczęc od początku obszaru podanego na fig.3. Okazało się, że plazmidy zawierające gen proteazy dzikiego typu pod kontrolą jedynie tej części prommoora, jeśli zostaną zintegoowane z genomem w miejscu z dala od znajdującego się w nim locus xpr2, da nadają transforma^owi zdolności wytwarzania dużych ilości proteazy /co określono wielkością strefy klar^owania na płytkach ze zbiermym m^l^iem/. Zauważyliśmy, że jeśli plL5-3 zawiera skrócony, a zatem jakby niekompletny promo^T, to w^^t^zas zineegoowana cząstka, powstała w wyniku rekombinacji między plazmidem a obecnym tam genem XPR 2 dzikiego typu mogłaby dawać kompletny promotor kierujący ekspresją produktu fuzyjnego prochymozyny, ale niekompletny promotor kierujący ekspresją proteazy. Analogiczny typ doświadczenia przerywania genu przeprowadził z genem aktyny S.cerewisi^ae i wsp. /Science 217, 371 - 373 /1982/. Zgodnie z naszymi oczekiwaniami, niektóre leucyno-niezależne tractformanty transformowane pLS-3 były istotnie ubogie w proteazę. Być może transici-manty ubogie w pro^azę są bardziej pożądanymi produktami integracji w locus XPR 2 niż niepożądane produkty uboczne, takie jak konwe^a^y genowe w locus leu 2. Okazało się, że w przyjmującym szczepie ATCC 20688, niecięty pLS-3 generował 6,5% transformantów ubogich w proteazę, podczas gdy plazmid cięty enzymem SnaBI dawał około 70% ti^anskimanti^w ubogich w proteazę. Aspekt rozerwania genu w tej transformacci został zastosowany dla ominięcia potrzeby wykonania wielkiej ilości prób Southerna dla znalezienia właściwie zintegrowanej cząstki spośród wszystkich transforrrctóe.

Plazmidy zawierające gen strukturalny proteazy dzikiego typu pod kontrolą promotora XPR 2 /zaczynający się sekwencjami przedstawionymi na fig.3/, jeśli zostaną włączone do komórek Y.lipolytica i zintθgfowact w miejscu innym niż locus xpr2, wywołują ekspresję znacznych ilości protezy. Jednak wydajna ekspresja genów heterologicznych z tego rodzaju integrantów może wymagać dalszej rofdtlkacji tego kontrolnego regionu DNA.

lroreciny. Y.lipolytica, szczep ATCC 20688 transformuje się DNA nieciętego plazmidu pLS-3 i DNA plazmidu pLS-3 trawionego przez SnaBI, otrzymując odpowiednio transiormanty xpr~ leu* ATCC 20775 /DL 144/ i ATCC 20776 /DL 148/. Te szczepy t(^£^nsh)man^^w posiewa się do probówek testowych na podłoże YEPD i poddaje wzrostowi przez dobę w terplΓaturzt 28°C. Ilość 250 yil tych hfdowei rozcieńcza się ilością 25 ml podłoża GPP /rozcieńczanie 1 : 100/ i prowadzi hodowlę w kolbach w trzęsawce w temperaturze 28°c przez 16 - 18 godzin, do czasu uzyskania absorbancci przy 600 nM = 5,0 - 7,0. Kommrki zbiera się przez wirowanie. Otrzymany płyn hodowwi lub tupeΓcatant analizuje się na obecność lrortcict przez iatężtcie supernaniu i poddanie analizie elektrolitycznej w żelu lolraktylormżfewyr wobec SOS. Wycinek żelu przenosi

154 427 się elektroforetycznie na bibułę nitrocelulozową w roztworze zawierającym 20 mM zasady Tris, 150 mM glicyny, 20% metanolu i 500 jednostek ampicyliny przez 2 godziny w temperaturze 4°C. Usunięcie białka z wycinka żelu sprawdza się przez barwienie błękitem Coomassśe.

Bi^buł^ę nitooce^^oową susz^y si^ę w temperaturze 3⁷°C i o^grzewa w temperaturze 65°C przez godzinę, po czym przemywa w roztworze TBS /200 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl /pH 7,5/.

Bibułę tę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 30 minut w roztworze TBS zawierającym 10% surowicy końskiej /Gibco, Chagrin Falls, Ohio/ i następnie inkubuje w roztworze TBS zawierającym 10% surowicy końckiej i odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała przeciw proreninie przez 15 godzin w temperaturze pokojowej Bibułę przemywa się trzykrotnie przez 10 minut w roztworze TBS, następnie inkubuje w roztworze TBS zawierającym 10% surowicy końskiej , a po tym inkubuje przez 2 godziny w roztworze TBS zawierającym 10% surowicy końskiej i rdpowiednie rozcieńczenie koziego przeciwciała przeciw IgG królika skrnjugowanegr z peroksydazą chrzanu.

Bibułę przemywa się trzykrotnie przez 10 minut w roztworze TBS 1 wywoouje w roztworze TBS z dodatkiem 0,01% nadtlenku wodoru, w obecności 4-chlrro-l-naftrlu /3 ng/ml, w Mt^ι^oOu/, dodanego w takiej ilości, aby uzyskać stężenie 0,5 mg/ml.

W obydwu supernantach stwierdza się obecność proreniny o ciężarze coąsteczriwyy

40.000.

W próbkach przygotowanych z hodowwi trβnsroymantów ATCC 20775 i 20776, zawierających pLS-3 występuje znaczna aktywność ścinania mleka po aktywacji kwasem zatężonych supernantów hrdowii /patrz ^wwyże/. Oak oczekiwano, w supernancie kont rolnej hodowM szczepu wyjściowego Y.lipolytica ATCC 20588 nie stwierdza się aktywności ścinania mleka. Konstruowanie ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pX-33.

Na fig.6 przedstawiona Jest moodfikacja polegająca na przeprowadzeniu plazmidu pLS-3 w ulepszony plazmid ekspresyjny pXX-33. W morzfikacji tej, powiększa się region promotora XPR 2 o 280 par zasad. Tak Jak w przypadku plazmidu pLS-3, ekspresyjny plazmid pW^-33 zawiera gen hybrydowy kodujący cały pre-proptptyd /157 reszt aminokwasowych/ alkalicznej irrteaoy_ł który to gen jest przyłączony do sekwan^i kumpe^ego genu strukturalnego kodującego proreninę.

Przed konstruowaniem plazmidów ekspresyjno-wydzielniczych dla proreniny zawierających sekwencję promotora XPR2 powiększoną o 280 par zasad w stosunku do pLS-3, niezbędne jest podklrnowanit odcinka restrykcyjnego zawierającego koypietny gen alkalicznej proteazy do miejsca Hind III. Taki p^klon preparuje się przez podłączenie syntetycznych linkerów do odcin ka restrykcyjnego wyizolowanego z banku klonów genom^ego XPR2 w ^086. Konstruowanie p^klonu XPR2 z górnym miejscem dla Hind III rozpoczyna się od przygotowania odcinka DNA zawierająceg cały gen alkalicznej proteazy. Fragment otrzymany w wyniku częściowego trawienia enzymami EcoRI-BamHI o długości 2,3 kilopar zasad gromowego regionu klonu XPR2 w plLD-86 oczyszcza się przez elektroforezę w żelu agarozowym i poddaje ligacji z syntetycznym fragmentem o sekweenci:

5' GATCGAAGCTTG 3'

3' TTCGAACTTAA 5'

Ta sekwencja linkera zawiera lepki koniec BamHI /eecz nie regeneruje miejsca Bammi/, po którym następuje miejsce dla Hind III, a następnie lepki koniec EcoRI. Produkt ligacji trawi się za pomocą Hind III i dokonuje insercji w miejscu dla Hind III w plazmidzie pBR322. Plazmid ρΧΗΡ-24 identyfikuje się przez mapow^ie restrykcyjne. Stanowi on źródło odcinków promotora XPR2 dla następnych konstrukcci plazmidowych.

Gen XPR2 iodklonowany w plazmidzie pXl^^^24 zawiera w swej sekwennci 5' promotora XPR2 o około 280 par zasad więcej niż sekwencja promotora XPR2 w plazmidzie pLS-3. Komponentę odcinka promotora wytwarza się w standardowej reakcji ligacji odcinka syntetycznego DNA /opisane go powyżej dla pLS-3/ z odcinkiem Hind III - Aval o długości 1150 par zasad, pochodzącym z ρΧΗΡ-24, za pomocą ligazy T4 i przez następne trawienie enzymami Hind III i Bam HI. Otrzymane połączone sekwencje oczyszcza się metodą elektroforezy żelowej, rddzoelając fragment Hind III BamHI o długości około 1196 par zasad. Drugi odcinek zawierający sekwencje kodujące reszty ayiirkwasowt proreniny od 6 do 151 preparuje się z plazmidu pLS-3 przez trawienie enzymami BamHI i X^^.X i następne oczyszczanie na drodze elektroforezy żelowej otrzymanego odcinka BamHI - Xmal o długości 440 par zasad.

154 427

Trzeci odcinek zawierający resztę genu proreniny, terminator XPR2 i sekwencje wektora, wytwarza się z pLS-3 przez trawienie za pomocą Hind HI i Xmal i następne oczyszczanie na drodze elektroforezy żelowej fragmentu wektora Hind III - Xmal o długości 8,0 kilopar zasad. Te trzy odcinki poddaje się ligacji metodę standardową opisaną powyyej. Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformowania E.coli K12, szczap MM 294. Z transformantów wyselekcjonowanych w oparciu o cechę oporności na ampicylinę izoluje się plazmidy 1 plazmid pXX-33 identyfikuje się przez mapowanie restrykcyjne /fig.6/. Ola potwierdzenia właściwego żędanych odcinków wykonuje się analizę sekwannci regionu proteaza-prorenina w tym plazmidzie.

Plazmidem pX-30, po jego uprzednim trawieniu enzymem SneBI transformuje się Y.lipolytica ATCC 20774, otrzymując Y.lipolytica ATCC 20780. Proreninę wydzielaną do podłoża przez transformowanj hodowle oznacza się w sposób opisany powyżej dla pLS-3. Stwierdza się obecność proreniny w supernancie hodowwl. Po aktywami kwasem zatężonych supernantów hodowwi obserwuje się znacznę aktywność ścinania mleka w próbkach przygotowanych z transoormantowej hodowwi Y.lipolytica ATCC 20780. Konstruowanie ekspraeyjno-wyddielniczago plazmidu pXX-22.

Etapy konstruowania ekspresyjno-wy(^2^:Leln:^(^:^€^go plazmidu pXX-22 przedstawione sę na fig.7. Między tym wektorem ekspresyjnym a pLS-3 występują dwie różnica. Podobnie jak pXX-33, zawiera on dodatkowy segment o długości 260 per zasad w sekwannci promotora XPR2. Po drugie, zawiera on sekwencję kodującą peptyd sygnałowy alkalicznej proteazy i tylko 38 reszt am.nokwasowych iro-peitydu /pro 1/.

Schemat konstruowania pXX-22 Jest analogiczny do schematu dla pXX-33. Na początku przygotowuje się komponentę odcinka promotora w standardowej reakcji ligacji odcinka Hind III - Bggil o długości 890 par zasad, pochodzącego z pXHP-24 z syntetycznym odcinkiem o set^ae^i:

5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3' * AACGACTCTAGTGATCCTAG 5' wobec ligazy T4 i przez następne trawienie enzymami Hind III i Barnu. Otrzymane pouczone sekwencje oczyszcza się na drodze elektroforezy w żelu, izolując odcinek ONA Hind III BamHI o długości 920 par zasad.

Drugi odcinek, kodujęcy reszty aHinokaasoae proreniny od 6 do 151 izoluje się z pLS-3 przez trawienie Bem HI i Xmal i następne oczyszczanie w żelu, otrzmrnanego odcinka BamHI Xmal o długości 440 par zasad. Trzeci odcinek, zawierający resztę genu proreniny, terminator XPR2 i sekwencje wektora preparuje się przez trawienie pLS-3 enzymami Hind III i XMa I 1 oczyszczanie na drodze elektroforezy żelowej fragmentu wektora o długości około 8,0 kilopar zasad. Następnie dokonuje się ligacji tych trzech odcinków DNA, stosujęc standardową, opisanę powyżej procedurę. Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformfaania E.coli K12, szczep MM294.

wyselekcjonowanych transfomantów izoluje się plazmidy i plazmid pXX-22 identyfikuje się przez mapę restrykcyjną /fig. 7/.

Plazmidem pXX-22 uprzednio traw^nym enzymem Snat^I transformuje się Y.lipolytica ATCC 20774 otrzymując Y.lipolytica ATCC 20779. Proreninę wydzielaną przez transfrrmoaana hodowle do podłoża hodowwi oznacza się w sposób opisany dla pL^-3. Obecność proreniny w supernancie hodowwi stwierdza się wyżej opisaną metodą. Po aktywacc! kwasem zatężonych supernantów hodowwi /patrz poMy^że/ obserwuje się znaczną aktywność ścinania mleka w próbkach transfrHmoaanyjh hodowwi Y.lipolytica ATCC 20779.

Konstruowanie ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pXX-ll.

Etapy eksperymentalne zastosowane do konstruowania plazmidu ekspresyjno-wydzielniczego proreniny pXX--l przedstawiono na fig.8. Ten plazmid zawiera sekwencję promotora -PR2 i sekwencję dla 22 reszt aminokwasowych peptydu sygnałowego, przyłączone do sekwennii kodującej proreninę. Schemat konstruowania plazmidu pXX-ll jest podobny do schematu zastosowanego dla ρΧΧ-22 i pXX-33. Pokrótce^komponentę odcinka promotora przygotowuje się w standardowej reakcji ligacji fragmentu Hind III - Bglll o długości 750 par zasad pochodzęcego z pXHP-24 z syntetycznym odcinkiem o sekwencji:

5* TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3'

3' AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGAACGGCAACCTAGTGATCCTAG 5'

154 427 wobec ligazy T4 i przez następne trawienie enzymami Hind III i Bam HI. Połączone sekwencje oczyszcza się metodę elektroforezy żelowej izolując odcinek DNA Hind III - Ban HI o długości 790 par zasad. Drugi odcinek, kodujący reszty aminokwasowe proremny od 6 do 151 izoluje się z pLS-3 przez cięcie enzymami Ban HI i Xma I i oczyszcza się na drodze elektroforezy żelowej, izolując odcinek DNA BanHI - Xmal o długości 440 par zasad. Trzeci odcinek zawierający pozostałę część genu strukturalnego proreniny, terminator XPR2 i sekwencje wektora wahadłowego /shuttle vector/ preparuje się przez trawienie plazmidu pLS-3 enzymam. Hind III i Xmal,i oczyszcza na drodze elektroforezy żelowej . Izoluje się odcinek wektora o długości około 8,0 kilopar zasad. Następnie^te trzy odcinki DNA poddaje się ligacji stosujęc opisanę powyżej metodę standardową. Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformowania E.coli K12, szczep MI294. Z wyselekcjlnowalych transformantów izoluje się plazmidy i plazmid pXX--l identyfikuje się przez mapowanie restrykcyjne /fig.8/. Dla potwierdzenia właściwej sekwanj tego syntetycznego DNA i prawicowego pouczenia Zędanych odcinków, prowadzi się analizę sekweenj! części XPR2 - pro^nina w tym plazmidzie.

Plazmidem pXX--l, uprzednio traw^nym enzymem SnaBI, transformuje się Y.lipolytica ATCC 20774 otrzymujęc Y.lipolytica 20778. Proreninę wydzielaną do podłoża hodofva:L przez transoomowanie komórki oznacza się w sposób opisany dla pLS-3. Obecność proreniny w supernancie hodowai stwierdza się wyżej opisanę Próba na ścinanie mleka /patrz lowyyzj/ wykazuje znacznę aktywność ścinania mleka w supernancie hodowwi transoomantów ATCC 20778 zawierających plazmid p^X--l.

Przykład II. Konstruowanie tzw. platfosmy dokonanna. Gen BIO dzikiego typu, odpowwadajęcy alleli bio-6 w szczepie ATCC 20774 klonuje się przez e^cję w sposób następujęcy: Komtruuje się bank genów trawionego częściowo enzymem Sau 3A chromosoma^ego DNA Y.lipolytica, wlęczonych w miejscu dla Ban HI w plazmidzie pLD 40 /plD40 jest plazmidem pBR322 + LEU2 w miejscu dla EcoRI/ i przygotowuje się dużę Oość ONA tego banku w postaci mieszaniny z preparatem plazmidowym z hodowwi E.coli /jest to ten sam bank, który stosuje się do klonowania genu XPR2/. Kilka /kikkanaście/ mikrogramów DNA z tego banku trawi się enzymem Apal, który daje jedno cięcie w regionie LEU-2. Następnie, ten DNA stosuje się do transformowania ATCC 20774 /eeu 2 xpr 2 bio/, posiewajęc mieszaninę transformacyjnę na płytki z syntetycznym podłożem nie zawierającym leucyny. Otrzymuje się izijsiątki tysięcy tΓansOormαntóa leucyno-niezależnych. Ola wykrycia kolonni, które zawieraję plazmidy banku z genem BIO, transformanty leucylo-liezrleżne posiewa się technikę replik na płytki agarowe z podłożem selekcyjnym pod wzglądem biotyny. Podłoże to w 1 litrze zawiera: 25 mg destiobiotyny, 20 g glikozy, 5 g siarczanu amonowego, 1 g 0^04, 0,5 g MgS04 x 7 H^, 0,1 g CaClg, 0,1 g NaCl,

500 Ąig kwasu borowego, 400 jg chlorowodorku tiaminy, 400 /ug ZnS04 x 7 HgO, 400 jg MnS04 x H^, 200 /ig Na^oO x 2 HgO, 200 jg FeClg x 6 H20, 100 jg KO i 40 /ig CuS0₄ x H₂0/.

OeCn z ki-lku trans^formaltóa BIO* Y.lipol^ytica mających r^do^lnoś^ć wzrostu na ^pod^łożu selekcyjnym pod względem biotyny nazwano DL31. Następnie, ze szczepu Y.lipolytica DL31 odzyskuje się plazmid z banku genów, zawierający gen BIO. Z hodowwi szczepu DL31 preparuje się chΓ^,Όrotfrrlly DNA. Kilka mikrogrmmóa tego chrorosoralnjgo DNA trawi się enzymem restrykcyn nm Apa I dla wycięcia plazmidu pochodzęcego z banku. Pewnę ilość trawionego DNA poddaje się reakcji ligacji dla zamknięcia pierścienia nieznanego plazmidu z banku. Następnie, mieszaninę ligacyjnę stosuje się do tt^^r^sOtmf^liα hodowwi E.coli dla nadania jej oporności na em^icylinę, w celu odzyskania nieznanego plazmidu reaieraJęijgo BIO w E.coli. Otrzymuje się kilka opornych na a^^y^nę transocmantów E.coli. Z tych transOormeltóa E.coli wykonuje się preparaty plazmidowe w małej skali. Produkty trawienia enzymami restrykcyjnymi tak ott^^^raljgo plazmidowego DNA dowodzą, Ze jak oczekiwano, nieznany plazmid zawierajęcy gen BIO Jest równoważny z plazmidem pLD 40 z inercję w miejscu Ban HI. Plazmid ten musi pochodzić z banku genów - nadano mu nazwę pLD51.

Plazmid pLD 55 generuje się jako podklon plazmidu pLD 51 przez usunięcie z pLD 51 · genu Leu 2 w sposób następujący. Pewnę ilość plazmidu pLD 51 trawi się enzymem EcoRI dla usunięcia regionu LEU2. Trawiony DNA poddaje się reakcji ligacji dla utworzenia postaci

154 427 kolistej plazmidu, następnie prowadzi się transformację E.coli w celu podklonowania mniejszego plazmidu zawierajęcego gen BIO. Oeden z opornych na ampicylinę transformantów E.coli zawiera oczekiwany mńi^jjszy plazmid, któremu nadano nazwę pLO 56. Prowadzi się szereg reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi tego plazmidu. Segment zawierajęcy gen BIO w plazmidzie pLO 56 Jest insertem w pBR322 w miejscu dla Ban HI 1 mm długość około 3,6 kilopar zasad.

Poniżej podana jest bardzo pobieżne mapa restrykcyjna insertu o długości 3,6 kilopar zasad DNA Y.lipolytica, podłączonego w miejscu dla Ban HI plazmidu pBR 322 /zawierającego pLD 56/. Przybliżone odległości /wyrażone w parach zasad/ od początku insarcji podane sę w nawiasach. Oznaczeń wielkości dokonano na podstawie kilku analiz w żelach agarozowych, sę one obarczone stosunkowo dużymi błędami iooścóowymi: PvuII /800/, PvuII /1200/, Pstl /1600/, Mlul /2000/, Pstl /2300/, EcoRV /2700/, Ncol /3200/. Dla orientacji, miejsce dla Sal I w plazmidzie pBR322 powinno poprzedzić opisane miejsca, a miejsce dla Hind III powinno znajdować się za nim.

Szczep ATCC 20774 /MATB leu-2-40 bio-6 xpr2-1002/ transformuje się intakrnym pLD 56 /pBR322 * około 3,6 kilopar zasad chromosoma^ego DNA Y.lipolytica zewierajgcych gen BIO/.

Trzy różne transformanty biotyno-niazależne testuje się na wysokę częstość transforma^i ciętego przez Nrul /cel w pBR322/ pLD40 /gen LEU 2 w pBR322/ w stosunku do szczepu rodzicielskiego, dla określenia, który z nich zawiera region tkwięcego w nim pBR322 zineegoowany z genem BIO. Wszystkie trzy transformanty maję zdolność transformat i z wysokę częstościę, ponieważ pLD40 jest zintegfowann z zawartym w nich Potwierdza ją to próby hytory dyzac c i Southerna typu biot. Oeden z trzech nowych transoonnantów BIO Y.lipolytica otrzymał nazwę DL 118 i został użyty jako biorca DNA. Sporządzenie powyższej mapy restrykcyjnej było potrzebne w celu określenia: /i/ co można zastosować jako BlO-specyficzną sondę hybrydyzacyjną /odcinek Ncoo-PvuII/, /ii/ Jęki enzym jest potrzebny dle prawidoowego cięcia plazmidu pLD56 /Mlu 1/, /iii/ który enzym tnie tylko raz w obszarze pBR322 /Ciał/ i /IV/ jaki enzym nie dokonuje żadnych cięć w plazmidzie /Apel/.

Próby hybrydyzacci Southerna produktów trawienia DNA z ATCC 20774 i DL 118 enzymami Ciał i Apal /jako sondę stosuje się odcinek -BIO/ wykazulą, że jak oczekiwano, region biotyny w DL 118 /w porównaniu do regionu BIO w ATCC 20774/ Jest rozdzielony insercją DNA o wielkości odpowiadaaącej pLD 56. Produkty trawienia DNA Dl 118 przez Mlu I /aako sondę stosuje się pBR322/ również wykazują insertę o takiej samej wielkości jak intaktny pLD56.

Konstruowanie ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pLX-34. Konstruuje się plazmid ekspresyjny, który umieszcza sekwencję kodującą proreniny wraz z sygnałami wydzielniczymi XPR2 /157 aminokwasów pre-pro-sekweenjί/ w dół od promotora LEU2. Ten plazmid ekspresyjny jest dowodem na to, że dla uzyskania wydzielania heterologćcznych białek można użyć promotora innego niż promotor XPR2. Ten wektor ma ponadto zdolność wywoływania ekspressi i wydzielania niezależnie od miejsca integracji w genomie Y.lipolytica. Uzyskanie wydzielania proreniny z użyciem promotora innego niż promotor XPR2 demonntruje możliwość skonstruowania wektora ekspresyjnego w celu identyfikacji nowych alternatywnych silnych promotorów w Y.lipolytica. Takie założenie może być zastosowane do wytwarzania hodowwi szczepu wykazującego ekspresję, z dwoma oddzielnymi hybrydowymi genami proreniny, ziniegnywanymi w różnych miejscach w genomie gospodarza, przy czym ekspresja jednego jest wywołena przez promotor LEU2, a drugiego - przez promotor XPR2

Na fig.13 przedstawione są etapy eksperymentalne konstruowania wektora ekspresyjnego, który zawiera gen proreniny z sygnałami sekracji alkalicznej proteazy /157 aminokwasów preprosikweerji XPR2/, przy czym ekspresja tego genu jest wywoływana przez sekwencję promotora LEU2. Konstruowanie tego plazmidu rozpoczyna się od proparowania odcinka promotora LEU/ zawierającego około 300 par zasad nlipodlegającij translacji sekwan^i 5', poprzedzającej kodon inicjacji translacji ATG w genie ^de^hy^drngenθz^y /3-izopropylojab^aanu /fig.12/. Z wektora wahadłowej /shuttle vector/ pLD40 izoluje się odcinek DNA Hind III - Fok I o długości 300 par zasad, zawierający porcję 270 par zasad sekwenrli promotora LEU2. Ten odcinek poddaje się ligacji wobec ligazy T4 z syntetycznym linkeiθm o długości 54 pary zasad o sekweenji:

--- _ _ - Leu2 - -- - - Foki

154 427

5'- ATACAACCACACACATCCACAATG

3'- TTGGTGTGTGTAGGTGTTAC

----------------------- Xpr2 --------------------Bgll

AAGCTCGCTACCGCCTTTACTATTCTCACTGCCGTTC - 3'

TTCGAGCGATGGCGGAAATGATAAGAGTGACGGC - 5' a następnie poddaj a się trawieniu enzymem Hind HI. Otrzymane połączone sekwencje oczyszcza się na drodze elektroforezy żelowej izolując odcinek ONA Hind III - Bgll o długości około 360 par zasad. Następnę kompponntę, to znaczy odcinek kodujęcy pozostałą część prepro-sekwencji XPR2 i pierwsze 152 reszty emitokwasown proreniny izoluje się z plazmidu ekspresyjnego pXX-33 /fig.6/ przez trawienie enzymami Bgll i Xmml. Otrzymany odcinek ONA o długości 887 par zasad oczyszcza się przez elektroforezę żelową. Trzeci odcinek zawierający resztę genu proreniny, terminator XPR2 i sekwencje wektora preparuje się przez cięcie plazmidu pXX-33 enzymami Hind III i Xmal i oczyszczanie na żelu fragmentu wektora o długości około 8,0 kilopar zasad.

Te trzy odcinki DNA poddaje się ligacji standardową metodą opisaną powyyżń. Mieszaninę ligacyjną stosuje się do transformowania E.coli K12 szczep HB101. Z transformantów wyselekcjonowanych w oparciu o cechę oporności na amppcylinę izoluje się plazmidy i plazmid pLX-34 identyfikuje się poprzez jego mapę restrykcyjną /fig.13/.

Plazmidem pLX-34 trawoonym uprzednio enzymem Nrul transformuje się Y.lipolytica ATCC 20794 /OL 118/ otrzymując Y.lipolytica ATCC 20795 /DL 251/. Proreninę wydzielaną do płynu hodowli przez hodowlę tego lθucyto-tinzalθżnego transformantu oznacza się w sposób opisany dla pLS-3. Ta procedura transformat i ukierunkowuje integrację plazmidu plH-34 do sekwennci pBR322 wprowadzonych uprzednio do locus bio w chromosomie gospodarza /co jest opisane powwżże/. Integracją pDt-34 w tym miejscu potwierdza analiza Southerna.

Użycie DL 118 Jako biorcy. Próby hybrydyzacci Southerna prowadzi się w sposób następujący. Trawienie enzymem Nrul DNA pochodzącego z tr^^nsfomen^^w DL 118 /produkty trawienia hybrydyzuje się z sondę, na przykład prochymozyny jeśli wchodzący plazmid był plazmidem ekspresyjnym prochymozyny/ dokładnie wycina wchodzący plazmid. Próbka kilku na^ę^^w transformującego plazmidu trawionego Nrul służy do sprawdzania dokładnego miejsca hybrydyzującego pasma.

Również produkty trawienia enzymem Mlul /Mlu I nie ma miejsce cięcia w transformujących plazmi32 dach/ DNA pochodzącego z tych transtomantów /hybrydyzowane z sondą znaczonego P-pBR332/, wykazują, że sekwencja pBR322 znajdująca się w DL 118 Jest przedzielona itsnrjją jednej lub więcej cząsteczek tr^ans^omuj^j^ego plazmidu. Dowodzi to, że integracja zachodzi w żądanym nej scu.

Tretsformowatż szczep Y.lipolytica ATCC 20795 /DL 251/ hoduje się na podłożu YEPD w temperaturze ²²°C, w warun^ch sprztających ekspresji ^prom^tora U;U2. ^Obejtfś^{ć p}roΓntin^y w superna^ie hodowH wykrywa się w próbie ścinania mleka przez aktywowane kwasem supernamy hodowH i potwierdza się poprzez analizę immrunfogicztą /patrz pow^cej. Powyższe wyniki wskazuję, że ten gen hybrydowy jest niezależną jednostką ekspresyjną zdolną do ekspressi i wydzielania, Jeśli zinnegfowata jest w rinjJju innym niż XPR2 lub LEU2. Ta cecha pozwala na konstruowanie szczepu ekspresyjnego z wiekna genami hybrydowymi, co deje potencjalne mooliwości uzyskiwania zwiększonych poz^rnów pozakomórkowej proreniny.

Przykład III. Sekwencja syntetycznego genu dla ludzkiej ene^lo!: oksyny C5a.

Zaprojektowany plan uzyskania produkcji ludzkiej anafilotoksyny C5a w organizmach bakteryjnych jest analogiczny do metod poprzednich stosowanych do syntezy i ekspressi EGF, opisanych w zgłoszeniu patemowym europejskim nr O 147 178. W planie tym stosuje się konstrukcję genu, o którym sekoiencja kodująca aktywowaną komponentę dopełniacza C5a jest otrzymana syntetycznie. Wychodząc ze znanej sekwennci aminokwasowej ludzkiej C5a zaprojektowaliśmy fragment DNA kodujący informację dla jej 74 aminokwasów /fig.9/. Sekwencja syntetycznego genu została wybrana dla maksymalnego zużytkowania kodonu prefeoowanego przez E.coli i S.cerevisiae. Pozwala to również na wprowadzenie szeregu miejsc dla endonukleaz restrykcyjnych dla ułatwienia charakteryzaaci. Takie podejście umoożiwia ponadto bezpośrednią ekspresję anafildoksyny C5a w E.coli przez wprowadzenie kodonu ATG inicjujceego syntezę białka przed tripletmm kodującym

154 427 pierwszy aminokwas polipeptydu C5a. Dla ułatwiania insercji tego syntetycznego genu w plazmidzie pBR322 w żądanej orientacji, gen C5a tak skonstruowano, aby na swych końcach zawierał miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne EcoRI i Hind III. W celu wytworzenia sekwennji genu C5a zeyntatyzowano 10 47-merów metodę poprzez pochodne amidofosfńnowe i połączono je w dwuniciowy fragment DNA o długości 235 par zasad. Następnie dokonuje się insarcji tego fragmentu DNA do odpowiednio przeciętego plazmidu pBR322 i klonowany gen identyfikuje się metodę analizy odcinków restrykcyjnych plazmidowego DNA z arbitralnie wybranych transformantów. Następnie analizuje się kilka klonów zawierających gen anafilotoksyny C5a na drodze sekwencjmowania DNA w celu zidentyfikowania klonu zawierającego właściwą sekwencję. Właściwą sekwencję nukleotydowę dla regionu genu C5a wykryto w 2 spośród 5 badanych klonów.

Ekspresja ludzkiej anafilotoksyny C5a w bakteriach.

Konstruowanie plazmidów ekspresyjnych dla ludzkiej anafilotoksy^πy C5a rozpoczyna się przez rozszczepienie podklonu C5a endonukleazę restrykcyjną EcoRI. Następnie prowadzi się defnsforylację przez traktowanie bakteryjną fosfatazą alkaliczną. Plazmid ekspresyjny C5e konstruuje się stosując odcinek ONA EcoRI o długości 350 par zasad z plazmidu pPFZ-R2 zawierający region promotor t^-operator i sekwencje posiadające miejsca wiązania z ribosomem. Kompetentne komóóki E.coli szczep HB 101 transformuje się mieszaniną ligacyjną. Kilka opornych na lek kolonii pochodzących z każdej transforma^i oczyszcza się i ich plazmidowy ONA analizuje się przez mapowanie miejsc restrykcyjnych w celu identyfikacji tych, w których orientacja promotora trp umplliaiłaby transkrypcję genu C5a. Po wielokrotnej izolacji produktów, z tej mieszaniny ligacyjnej wyodrębnia się plazmidy zawierające gen anafilotok8yny C5a sąsiadujący z sekwencją promotora bakteryjnego w konniguracci wymmganej dla bezpośredniej ekspresji anafilotoksyny C5a. Mapa restrykcyjna plazmidu ekspresyjnego pC5a-48 zawierająceg. gen ludzkiej Bnafilotoksyny C5a jest przedstawiona na fig.10.

Ekspresja i wyddielanie ludzkiej anafilotoksyny C5a w Y.lipolytica.

Ekspresyjno-wyddielniczy wektor pC5aX-3 kodujący wydzzelanie ludzkiej anafitotoksyⁿy C5a preparuje się techniką podaną w przykładzie I dla plazmidu pXX-33. Następnie tym wektorem W^I^zielnic2^p transformuje się Y.lipolytica ATCC 20774 otrzymując Y.lipolytica ATCC 20777. Ludzką anafilotoksynę C5a wytwarzaną przez hodowle transforrnantów oznacza się w sposób podany powyżae, z tym, że w próbie ipmpunlooicznej stosuje się kozie przeciwciała przeciw anafilotoksynie C5a i przeciwciała królika przeciw koziej igG. Dla plazmidu opisanego w tym przykładzie stwierdzono obecność ludzkiej anafilotoksyny C5a w supei-nancie hodowwi.

Konstruowanie ekepresyjno-wydzielniczego plazmidu pC5aX-3.

Etapy konstruowania plazmidu pC5aX-3 zawierającego kod ekspressi i ayddielania anafilotoksyny C5a są przedstawione na fig.11. Ten plazmid zawiera sekwencje dla “całego* promotora XPR2, 157 aminokwasów sygnałowych i pro-peptydu, przyłączone do syntetycznej sekwencji kodującej 74 reszty apinlkaasowa ludzkiej anafiloooksyny C5a. Plan konstruowania pC5aX-3 jest podobny do planu konstruowania pXX-33. Na początku, plazmid pXHP-24 /uub inny plazmid zawierający żądaną sekwenncę/ rozszczepia się enzymami Hind III i Aval i izoluje się w żelu odcinek o długości 1150 par zasad, zawierający promotor XPR2. Drugi odcinek zawierający sekwencje końca 3' pn-peptydu XPR2 i genu strukturannego C5a wytwarza się w standardowej reakcji ligacji odcinka Hnfl - Hind III o długości około 220 par zasad, pochodzącego z ekspresyjnego plazmidu pC5a-48 E.coli z syntetycnnyp fragmentem o jakweenji:

5' CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGA 3'

3' CTAAGGACGAAGAA3ATTACGGTTCGCTTGA 5' wobec ligazy T4 i następnie trawi się enzymami Aval i Hind III. Otrzymane połączone sekwencje oczyszcza się metodą elektroforezy żelowej izolując odcinek Aval - Hind iii o długości około 250 par zasad. Następnie poddaje się ligacji odcinek Hind iii - Aval zawierający promotor z odcinkiem Aval - Hind iii kodującym anafilotoksynę C5a wobec ligazy T4, po czym trawi się enzymem Hind III. Fragment o długości około 1,4 kilopar zasad oczyszcza się w żelu i stosuje do ligacji z trawionym Hind III plazmidem pterm 4 /opSsθnyp poważθt/· Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transtopmlwania E.coli K12, szczep MM 294. Z tΓanstopmantóa wyselekcjonowanych w oparciu o cechę oporności na ampicylinę izoluje się plazmidy i plazmid pC5aX-3

154 427

Identyfikuje się przez mapowanie restrykcyjne.

Plazmidem pC!^j^^—3 po uprzednim trawieniu enzymem SnaBI transformuje się Y.lipolytica szczep PC-30869, ATCC 20774. Anafilotoksynę C5a wydzielaną do podłoża hodowai przez transformowane komórki oznacza się a sposób opisany powyyej. Stwierdza się obecność ludzkiej anafitotok8yny C5a a sbperna-ncie hodowWl.

Wiadomo, że aiele białek syntetyoowanych przez ribosomy zaięzane z retikuuum endoplazmatycznym powstaje a formie glikoprotein. W istocie, glikozylacja może apłyaać na wydzielanie danego białka. Glikozylacja przy grupie aminoaej a białkach eukariotycznych aystępuje a tróJeeptyOowych sekaencjach jrginina-X-tjθonina i asparagina-X-seryna, gdzie X oznacza dowolny aminokaas oprócz przypuszczalnie kaasu asparaginoaego /Hubbard S. i asp. Ann.Rev.Biochem. 50, 555 /1981/. Sekaencja aminokaasoaa proreniny zaaiera daie takie trójpeptydoae sekwencje, jednakże analiza metodę elektroforezy żeloaej proreniny aydzielanej przez hodowle Y.lipolytica nie aykazała glikozy^eci. W innych aydzielanych białkach eukariotycznych nie aezystkie miejsca asparagH^^-t^onina lub seryna eę zglikozyooaane. Gest praadopodobne, że niektóre reszty asparaginy a obrębie sekwennci tróJpeptyOowyjh nie sę zglikozyloaane, gdyż sę niedostępne dla enzymóa glikozylujących.

W przypadku ludzkiej anafitotok8yiy C5a, sekaancja aminokaasoaa zaaiera Jedno miejsce glikozylacji lub sekaancję trójpepyydoaę /Asn-Ile-Ser/, przy której normalnie aystępuje złożony oligosacharyd przyłączony do asparaginy /Fernandez H. i asp., 3.Immunit. 117, 1688 /1976/. Peana część cząsteczek anafiloooksyny C5a aydzielanych do podłoża hodował Y.lipolytica Jest zglikozyooaane, ponieaaż a próbie imιrrnitooicznθj Jest aidoczny szeroki region aktyaności ant^genoacj a części o aysokim ciężarze częsteczkcaym. Ta heterogeniczna ruchliaość jlektroforetyczna jest analogiczna do obse^ao^^i^^j dla innych aydzielanych białek i praadopodobnie aynika z różnych stopni podstaaienia aęgloaodanami.

W przypadku aynalazku, aidoczna glikozylacja niektórych aydzielanych białek heterologicznych że sposób ekspressi 1 aydzielania białek z użyciem Y.lipolytica może być użyteczny do aytaerzanie aielu normalnie iglitozytawanych białek eukariotycznych.

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patenoowe

   1. Sposób aytaerzania i aydzzelania białka heterologicznego przez hodowlę Y.lipolytica, znamienny tym, że do Y.lipolytica apooaayia się aektor ekspresyjny zsaierajęcy sekaencję DNA kodujęcę białko heterologiczne a stosunku do Y.lipolytica, gen Y.lipolytica albo pochodzące z genu Y. lipolyticej sekaancję promoora, sekaancję sygiałoaę i sekacn^ę zakończenia transkryp^^, proaadzi się hodowlę tak a^taorzonego transforma^u Y.lipolytica /i/ a oypoaieyiir środoalsku azrostu, ayodrębnia się heterologiczne białko.
2. 2. Sposób aytaarzania białka heterologccznego a hodowai Y.lipolytica, znamienny t y m, że do Y.lipolytica apooaayia się aektor ekspresyjny zaaforający DNA kodujęcy białko heterologiczne a stosunku do Y.lipolytica i przynajmniej jeden z następujących genóa: gen LEU2, tjkaencją promotora lub terminatora tego genu, gen XPR, sekasncję irorotora, syg^^łoaą, pro 1-, pro 2- lub tekaencją terminatora z tego genu XPR2, proa/adzi się hodowlę tak aytatoioijgt transformantu Y.lipolytica /i/ a od^al^nim śooytaitku azrostu, ayodrąbii^ się heterologiczne białko.
3. 3. Sposób aedług zastrz.2, znamienny tym, że Jako gen stosuje się gen XPR 2 lub gen LEU2.
4. 4. Sposób aedług zastrz.3, znamienny tym, że Jako białko heterologiczne aytaarza się ioooeniię lub ludzkę εiafitotoksyią C5a.
5. 5. Sposób aytaaΓiaiia białka heterologćcznego a hodowai Y.lipolytica, znamienny tym, że jako Y.lipolytica stosuje się transformano ATCC 20780 a odpoaijyiir środoa^sku azrostu.

   154 427

   5. Sposób wytwarzania białka hetarologicznego w hodowli Y.lipolytica, znamienny tym, że jako Y.lipolytica stosuje się transformant ATCC 20779 w odpowiednim środowisku wzrostu.
6. 7. Sposób wytwarzania białka heterolooiczneoo w hodowli Y.lipolytica, znamienny tym, że Jako Y.lipolytica stosuje się transformant ATCC 20778 w odpowiednim środowisku wzrostu.
7. 8. Sposób wytwarzania białka hetero logicznego w hodowU Y.lipolytica, znamienny tym, .że Jako Y.lipolytica stosuje się transformant ATCC 20777 w odpowiednim środowisku wzrostu.
8. 9. Sposób według zastrz.3, znamienny tym, że insarcji genu kodującego heterologiczne białko dokonuje eię pomiędzy sekwencjami, promotora i terminatora w genie XPR2
9. 10. Sposób według zastrz.7, znamienny tym, że jako gen kodujący białko hθteΓrlogiczne stosuje się gen dla pro^niny lub ludzkiej anafirorok8yny C5a.
10. 11. Sposób wytwarzania hθterrlogicznθgr białka, znamienny tym, że prowadzi eię hodowlę transformantu Y.lipolytica ATCC 20795 w odpowiednim środowisku wzrostu.
11. 12. Sposób wytwarzania hetenlogicznego białka, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę transformantu Y.lipolytica posiadającego region homm0oo0i z heterorogicznym DNA wektora, który to region zawiera ogzogezzy /obcy/ DNA służący jako miejsce przyjmujące podczas integracyjnej transformacj tego Y.lipolytica.
12. 13., Sposób według zastrz.12, znamienny tym, że region homrrorOi pochodzi z wektora pBR322 lub jego pochodnnj.

    ___pl_D58 pLD57

    PL062 ____ pi i-----4kb-pBR----1 ^p-Yli^p _|^pJ.__lEU2—> >

    ^BF F M f

    --------------1

    --I pp22-OO2..>

    B B E,B

    --------l_n(X00

    Schematyczne przedstawienie plazmidów wyodrębnionych z transformantu Y lipolitica, szczep DL 112, zawierającego gen.XPR2.

    Zaznaczone regiony zawierają (od strony lewej do prawej) materiał z Y. lipolytica, który nie byt sekwencjoncwany, maty segment plazmidu pBR 322 pomiędzy miejscem dla EcoRl a miejscem łączenia z DNA Y. lipolytica (poprzednio miejsce dla Barn HI), gen L EU 2 z Y. lipolytica, duży segment plazmidu pBR322 oraz zmutowaną allelę XPR2, której sekwencje zajtaty zanalizowane.

    Miejsca dla Bg 11 są oznaczone symbolem B, a miejsca dla EcoRl symbolem E .

    Te trzy plazmidy, przedstawione w postaci liniowej wyodrębniono jako cząsteczki koliste, połączone końcami w miejscu dla BgUI.

    Fig. 1

    154 427

    sekwencja białka val thr gin trp gly mRNA 5* GTX ACX CAU TGG GG 3' sondy 3* CAX TGX GTY ACC CC 5' 170 3' CAA TGX GTY ACC CC 5' 172 3' CAT TGX GTY ACC CC 5' 174 3 CAG TGX GTY ACC CC 5' 176 3 CAC TGX GTY ACC CC 5’

    sekwen icja biatka lys lys ala gin thr mRNA 5* AAU AAU GCX CAU AC 3 sondy 3’ TTY TTY CGX GTY TG 5’ 180 3' TTC TTY CGX GTC TG 5 182 3' TTT TTY CGX GTC TG 5’ 184 3’ TTT TTY CGX GTT TG 5 186 3' TTC TTY CGX GTT TG 5' Fig. 2

    GATCCGGGGTTCT/TT(?(^yTT(^CCTGAA/\CATTGATTGGA/\/TTT/A^C/TT/\TG/^GCT

    GttTGCTTTTTGCATTCAAGGGCGCAGCTTATCTTGTATCCTTAATTACACATG

    ACCTCT T ACATCTTCTAATCTATTCCTGGCGTCΔGTTCAGTGGAGCAACCCATT

    TTCTCTCCTT TATCTAACATAT TAATTCAATTATAGTCTAAAAATACACAAAAT

    TTCACTGGTCATAACAACCTACCCCACATTACTCACTACTAACCCTGGTCTCCCT

    TCAACGATCAACATCAGGGTTCATAGATAAGCAATATAATTTATAATATGATGAC

    TACTGTTAAAAAGATCCCACTACTTATAATCAAACCCTTTTTTACATATACACTA

    TACCATTACGTCCATAACATΔTGΔTGΔACCAATπTAAAAAACTTACATCΪΆCCc

    CACATTATAT T TCAATAAAATTCAACT TCCAATCTAACTTTAAACCCCTATCAAC

    TATTCTAAACAAAACC(3AATCT^ACT^ACATATACACTCTATCTAΊATTACACTC

    AAATCCTACAAATATCATTTTAACACATCTTAACAAAAA(XATATTTCATAATAT

    AATCCAAACCAT T TC TAAATAATATTT TATCCCACAATATAATATAAACTTCATC

    AATAAATCCCTTAAAAACTCCTACCCTCTTCTTC^CAATAATA\ΊT^AAACA

    Fig. 3-1

    -157 met lys leu ala thr ala phe -150 thr ile ATG AAG CTC GCT ACC GCC TTT ACT ATT leu thr ala val leu ala ala -1M> pro leu CTC ACT GCC GTT CTG GCC GCT CCC CTG a la ala pro ala pro ala pro asp ala GCC GCC CCT GCC CCT GCT CCT GAT GCT -13) a la pro ala ala val pro glu gly pro GCC CCT GCT GCT GTG CCT GAG GGC CCT a la -120 ala ala ala ^ty^r ser ser i le leu GCC GCC GCT GCC TAC TCA TCT ATT CTG ser val -110 val ala lys gin ser lys lys TCC GTG GTC GCT AAG CAG TCC AAG AAG phe lys his -100 his lys arg asp leu asp ΓΓΤ AAG CAC CAC AAG CGA GAT CTT GAT glu lys asp gin -90 phe ile val val phe GAGAAG GAT CAG TTC ATC GTT GTC TTT

    Fig. 3-2

    asp GAC ser AGT ser AGC ala GCT ala GCC ser TCC asp GAC ser TCT leu CTG val GTC -60 asn AAC gty GGT ile ATC thr ACC pro CCT -50 val GTC ^ty^r TAC thr ACG leu CTC gly GGA -40 phe TTT val GTT thr ACT ile ATC val GTT -30 asp GAC ser TCT val 6TT leu CTG thr ACG

    -80 thr val asp gin ile ACT GTT GAC CAG ATC -70 glu ile gin lys leu GAA ATC GAG AAG CTG asp glu asp ser ser GAC GAG GAC TCG TCC ser ala leu asp leu TCT GCT CTT GAT CTT asp gly ser giy phe GAT GGA TCT GGC TTT gly lys phe asn ser GGA AAG TTC AAC TCC lys leu lys glu ser AAG CTC AAG GAG TCG -20 val glu pro asp thr GTC GAG CCC GAT ACC

    Ul

    A.

    ro

    Fig. 3-3

    -10 i le val ser leu pro glu ile pro ala ATT GTG TCT CTC CCC GAG ATT CCT GCT ser ser asn ala lys arg 1 ala ile gin TCT TCT AAT GCC AAG CGA GCT ATC CAG thr thr pro val thr gin trp gly leu ACT ACT CCC GTC ACT CAA TGG GGC CTG 20 ser arg ile ser his lys lys ala gin TCT AGA ATC TCT CAT AAG AAG GCC CAG 30 thr gty asn tyr ala tyr val arg glu ACT GGń AAC TAC GCC TAC GTT CGA GAG thr val gly lys his pro thr val ser AO GTT GGC AAG CAC CCC ACC GTT TCT 40 tyr val val asp ser giy ile arg thr TAC GTT GTT GAC TCT GOT ATC CGA ACC 50 thr his ser glu phe gly giy arg ala ACC CAC TCC GAG TTC GGA GGC CGA GCT

    Fig. 3-4

    60 ναΐ trp gly a la asn phe ala asp thr GTC TGG GGA GCC AAC TTC GCT GAC ACA gin asn ala 70 asp leu leu giy his giy CAG AAC GCT GAT CTT CTC GGT CAC GGC sa thr his val ala giy thr val giy giy ACT CAC GTT GCA GGT ACC GTG GGA GGA val 90 lys thr tyr giy asp ala asn thr AAG ACA TAC GGA GTC GAC GCC AAC ACC 500 lys leu val ala val lys val phe ala AAG CTG GTG GCC GTC AAG GTG ΓΤΤ GCA ua gly arg ser ala ala leu ser val ile GGC CGA TCC GCA GCT CTC TCC GTC ATC Ϊ20 asn gin gly phe thr trp ala leu asn AAC CAG GGC TTC ACC TGG GCT CTC AAC osp tyr H© S@ir lys arg asp thr leu GAC TAC ATC TCC AAG CGA gag O CTG

    Fig. ^{3 -} 5

    130

    pro arg giy val leu asn phe ser giy CCT CGA GGA GTG CTG AAC TTC TCT GGA 10 giy gly pro lys ser ala ser gin asp GGA GGA CCC AAG TCC GCT TCC CAG GAC 10 a la leu ^trp ser arg ala thr gin glu GCC CTA TGG TCT CGA GCT ACC CAG GAG 90 gly leu leu val ala ile ala ala giy GGT CTG CTT GTC GCC ATC GCT GCG GGA 10 asn asp ala val asp ala cys asn asp AAC GAT GCC GTG GAC GCC TGT AAC GAC ISO ser pro giy asn i le giy giy ser thr TCT CCC GGT AAC ATT GGA GGC ICC ACC 190 ser giy ile ile thr val gly ser i le TCT GGT ATC ATC ACT GTG GGT TCC ATT 200 asp ser ser asp lys ile ser val trp GAC TCT AGC GAT AAG ATC TCC GTC TGG

    Fig. 3-6

    210 ser giy giy gin giy ser asn tyr gly TCC GGT GGA CAG GGA TCC AAC TAC GGA thr cys val asp val phe ala pro gty ACT TGT GTT GAT GTC TTT GCC CCC GGC 220 ile ile gin ser asp ser ala ser tyr TCC GAT ATC ATC TCT GCC TCT TAC CAG ser 230 asp ser giy thr leu val tyr ser TCC GAC TCT GGT ACT TTG GTC TAC TCC gly thr 240 ser met ala cys pro his val GGT ACC TCC ATG GCC TGT CCC CAC GTT 2S0 a la giy leu ala ser tyr tyr leu ser GOC GGT CTT GCC TCC TAC TAC CTG TCC 260 ile asn asp glu val leu thr pro ala ATC AAT GAC GAG GTT CTC ACC CCT GCC 270 gin val glu ala leu ile thr glu ser CAG GTC GAG GCT CTT ATT ACT GAG ICC

    Fig. 3-7

    154 427

    asn thr g'y val leu pro 280 thr thr asn AAC ACC GGT ATT CTT COC ACC ACC AAC leu lys giy ser pro asn ala 290 val ala CTC AAG GAC TCT CCC AAC ACT ATT ACC tyr TAC asn AAC giy GAT val ATT giy GAC 297 ile ATT TAG ACAATAA

    CAGATAGTTTGCO&TGATAATTCTCT TAACCTCCC ACACTCCT AAAACAAAACATA TTATATATCGATACT GTAAATAGACCAGATATTGT'TGTAAATAGAAAAACA AACATGAAAGTGGCTAAATCCCAACT TTAT TCATCA AATCCCACAAAAACTACTCGTCATCCCTAAAAA TTC AΛCAGTCGTGTTA TATT ATCCATACGTACGAAAAAG AGATGCCCGTGT ACAAAATCAAAAAACGCACAATCC ATCGATTACTCTACACACACACTCACGCATGGCAAA AAOCTACATCAAAACACAACTAACAAGAAAGAAACA ACATTCAAAAΔΔAACACAAGCAGAGAGTAATGTAAA G<CTXTAATAGCAACTACTGCTAAATATAAAAAAAGA AG6TGTAAAAACAGCCAAAACAACTT TCTATATACA CCTGTί:GCATACSAGCACQQCAίcAQAGCAACTίATAA ATaGCCATGGTβGTCAGAGTCQGQG(:AQAAACTIG

    Fig. 3-8

    AAACAAAAGCAACAGAAACAGCAGAAGAAAGT TG CAGTGAGACAGAGAT T AAACCJGAAAA^AACACGC TCAGATCT

    Fig. 3-9

    154 427 οφοτηοίό ηα ' amfHcylMiny

    Eco Rl ^odporność na tetracyklinę leu 2

    Hind lll, Bglll ligacja z 15 merem 5'AGCTTGATATCTGATCATAGGTAC 3’ 3' ACTATAGACTAGTATC 5’

    Fig.4c.d

    Hind Ml; Bglll izolacja odcinka 76Obp (par zasad) ligaza T4

    Transformacja E .cdi

    Fig. 4

    154 427

    HindH

    Hindlll _Htrp-promotor odporność na amp^linę

    Hind III, Ανα l izolacja odcinka 870bp «jępr-terminator indBI

    U pterm4 I ^pBR322Ą ^9bp) I ll·™² prorenina ma l.\

    Iligacja z 42-merem izolacja odcinka 916 bp Hind III, Barn Hi

    Barn HI (partial) izolacja odcinka 108)bp

    Hindlll, Bel i izolacja odcinka 7,3kb

    Fig. 5 c.d.

    ł ligaza T4_ | Transformacja E.c°^lMM294 _xpr-proncctor/prepro HinSl^^ prorenina Bctl|| xpr- terminator

    Fig. 5

    154 427 <EjXpp·- promotor/prepro

    HindM,Aval izolacja odcinka115Obp fligacja z 42-merem

    I Hind IW, Barn HI liaolacja opinka Γ »1196 bp ’ os Xpr - promotor/prepro

    Hind lll,Xmal izolacja odcinka ~8,0kb

    BamHl,Xmal izolacja odcinka 440bp

    Fig. 6 c.d. ł

    11 igaza T4_ ł Transformacja E.coli odporność na tetrac^bnn^zEf2® Xpr- promotor/prepro prorenina

    -terminator odporność ampicylinę

    Fig. 6

    154 427

    PBR

    Hind B, Bglll izolacjo odcinka890bp ,ligacjjaz16-merem

    Hind tU,Xma l iz<ol^^ja odcinka * 8,Okb

    Hind E, BamHl izolacja odcinka 920bp

    BamHl, Xmal iz<Oia<cj^ odcinka 440bp

    Fig. 7 c.d.

    ł _I ligaza T4_ transformacja E.coli odporność to tetra^klinę;^ Hi n® Xpr-promotor/prepro orenina

    Xpr- terminator odp^ność TO_ ampicylinę

    Fig. 7

    154 427

    Hind «I, Bgl I izolacja odcinka 750bp ligacja z 40-merem

    EffiXjxpOoonrator/prepro

    Hind HI, Barn Hi izolacja odcinka 790bp

    Fig. 8 c.d.

    Baon HI, Xma I izolacja odcinka 440bp

    Hind III, Xma I izolacja odcinka ~ 8,0 kb

    L ligaza T4 1 transformacja E.coli

    ^odporn^ość ^nc* Xpr-p?omotor/piepxo>

    tetraccklinjn^i^™^ ^Hind«SnoBI <maf prorentn i

    >jor- terminator odporność na ampicylinę

    Fig. 8

    154 427

    EcoRI thr leu gin lys lys ile glu glu ile αία αία lys _(A)_

    AATTCT AG ACT CTG CAA AAG AAG ATC GAA GAA ATC GCT GCT AAG GA TAC TGAGAC GTT TTC TTC TAG CTT CTT TAG CGA CGA TTC (□) tyr lys his ser ναΐ val lys lys cys cys tyr asp gly ala __(B)_

    TAC AAG CAC TCC GTC GTT AAG AAG TGT TGT TAC GAT GGT GCA

    ATG TTC GTG AGG CAG CAA TTC TTC ACA ACA ATG CTA CCA CGT ~ (i) cys val asn asn asp glu thr cys glu gin arg (C)

    TO GTC AjAC MC GAG GAA ACC TGT GAA CAA CGA GCT GCT CGT

    ACG CAG TTG’ TTG CTG CTT TGG ACA CTT GTT GCT CGA CGA GCA (H)

    Fig. 9 c.d.l

    i le ser leu giy pro arg cys ile lys . 5° ala phe thr glu ATT TCT CTG GGC CCT CGC TGT ATC AAG GCT TTC ACT GAA TAA AGA GAC CCG GGA GCG ACA TAG TTC CGA AAG TGA CTT 60 IG) cys cys val val ala ser gin leu arg ala asn ile ser IE) TGT TGT GTT GTC GCT TCC CAA CTG CGC GCT AAC ATT TCT ACA ACA CAA CAG CGA AGG GTT GAC GCG CGA TTG TAA AGA 70 74 (F, his lys asp met gin leu giy arg stop

    _Hind III

    CAC AAG GAC ATG CAA CTC GGC CGC TAA A GTG TTC CTG TAC GTT GAG CCG GCG ATT TTCGA ~

    Fig.9

    154 427

    Fig.HO

    Hind ΙΙΙ,ΒΑΡ izolacjo odcinka 7,3kb

    Hind ΙΙΙ,ΑναΙ izolacja odcinka tl50bp

    Hind III izolacja odcinka 570bp

    Hnf I lizdacja odcinka 221 bp

    Fig. 11 c.d ł

    T4 ligaza_

    Hind III izolacja odcinka 1,4 kb

    Hind III. Aval ligacja z 28-merem izolacja odcinka 250 bp ligaza T4 transformacja E coli MM 294

    EX{ęr-promotor/prepro • Hind Hl¹^^ł^gen C⁵a

    Xpr -terminator

    Fig. 11 pBR 322

    GTCG/^(^/^(^(^AT/^T(CATATAAAACTAACAATGCAT TGCTTArrACGAAGACTACCCGTTGCTATCTCCA CTACGTTATCTAAACGGTCCAAAGGCTGATCAAT GTGCTGCATACGTAACGTGGGGTGCAACATTGAG CACAT/^lSTACTr TTCAGAAAACAGGCGATAATTA AGTGTG CACTCCAACT T T TCACACTGAGAGTATA< TT(TTGGGGΔΔGΔAΔΪCGGCACTAAAAAGTAAGGT TTACTGGATTATGTATCATGTTTATGAATATCTAT TGCTACAGT AATGCCC AGCA TCGAGGGGTAT TGT GΓCACCAACACAATAGTGGAAGA TGAAGCGCTCG TGAT TGTAGTATGAGTC TTTA T TGGTG ATGGGAA GAGTTCACTCMTAT TCTAGTTACTGCAAAATAA CATAGGTAATCGGAAAGACACAATGGAT G TAGA TC AC CMACC TG TGAATG TTA T TCGAGC TAAAATGCA AATGGTTGGTGGTA(TTAGTAGTTGCTGTCGAATTC C^K^GK^C^CCTC^/^^TT^ATCAT TTAT T TACCAGT TG GACACAAAACC T T GACCATC TCG TATGTCCCCTC CGACA^ TCCAGGCCGGCTGGGGTAAGTTCGAT TTCGAAATCGGCATCGACAAGGTTTGGGTAAATA GCCGATACCGCACT ACC T GAGTAACAATCTTAGG

    TCAACATAGCAAGGGAAAAT6TG ATTATATATACAAGAGAGTT TGAAAGCCAAAGAT TTTCTATAAAAAAACCACATCAAAAATAAAACAA

    Fig.12-1

    1 -----».

    met glu pro glu thr CAG ACATCCACA AGT GAA CCC GAA ACT lys lys fhr lys 10 thr asp ser iys lys AAG AAG ACC AAG ACT GAC TCC AAG AAG ile val leu leu gly 20 giy asp phe cys ATT GTT CTT CTC GGC GGC GAC TTC TGT 30 gly pro glu val ile ala glu ala val GGC CCC GAG GTG ATT GCC GAG GCC GTC 40 lys val leu lys ser val ala glu ala AAG GTG CTC AAG TCT GTT GCT GAG GCC glu 50 ser gly thr glu phe val phe asp TCC GGC ACC GAG TTT GTG TTT GAG GAC arg leu ile gly giy ala ala ile glu CGA CTC ATT GGA GGA GCT GCC ATT GAG 60 lys glu g>y glu pro ile thr asp ala AAG GAG GGC GAG CCC ATC ACC GAC GCT

    Fig. 12-2

    arg lys ala asp CGA AAG GCT GAC ab val @y g^ly GCT GTC GGA GGC trp thr thr pro TGG ACC ACT CCC val arg pro glu GTG CGA CCC GAG no leu arg lys asp CTG CGA AAG GAC asn 10 leu arg pro AAC CTG CGA CCC pro lys 10 leu ala CĆC AAG CTC GGC srg oso val !40 gb CGA AAG GTT G/sG

    gly thr osp phe ile ile val arg glu GGC ACC GAC TTC ATC ATT GTC CGA GAG 150 leu val gly gly ile tyr phe giy glu CTC GTC GGA GGT ATC TAC TTT GGA GAG org 10 lys glu asp asp gly ser giy val CGA AAG GAG GAT GAC GGA TCT GGC GTC αία ser 10 asp thr glu thr tyr ser val GCT ICC GAC ACC GAG ACC TAC TCC GTT pro glu val 180 gb arg ile ala arg met CCT GAG GTT GAG CGA ATT GCC CGA ATG ola ola phe leu 150 ala leu gin his asn GCC GCC TTC CTG GCC CTT CAG CAC AAC pro pro leu pro val 200 trp ser leu asp CCC CCT CTT CCC GTG TGG TCT CTT GAC ly§ ab wl leu ala 21 ser ser arg AAG GCC AAC GIG CTG GCC TCC TCT CGA

    Fig. 12-4

    leu trp arg lys thr val thr 220 arg val CTT TGG CGA AAG ACT GTC ACT CGA GTC leu lys asp glu phe pro gin leu 230 glu CTC AAG GAC GAA TTC CCC CAG CTC GAG leu asn his gin leu ile asp ser ala CTC AAC CAC CAG CTG ATC GAC TCG GCC 240 a la met ile leu ile lys gin pro ser GCC ATG ATC CTC ATC AAG CAG CCC TCC lys 250 met asn giy ile ile ile thr thr AAG ATG AAT GGT ATC ATC ATC ACC ACC asn met 260 phe giy asp ile ile ser asp AAC ATG TTT GGC GAT ATC ATC TCC GAC glu ala ser 270 val ile pro giy ser leu GAG GCC TCC GTC ATC CCC GGT TCT CTG gly leu leu pro 2βΟ ser ala ser leu ala GGT CTG CTG CCC TCC GCC TCT CTG GCT

    Fig. 12-5

    ser leu pro asp thr 290 asn glu ala phe TCT CTG CCC GAC ACC AAC GAG GCG TTC gly leu ^ty^r glu pro cys 300 his giy ser GGT CTG TAC GAG CCC TGT CAC GGA TCT ala pro asp leu giy lys gin 310 lys val GCC CCC GAT CTC GGC AAG CAG AAG GTC asn pro ile ala thr ile leu ser 330 ala AAC CCC ATT GCC ACC ATT CTG TCT GCC ala met met leu lys phe ser leu asn GOC ATG ATG CTC AAG TTC TCT CTT AAC 330 met lys pro ala giy asp ala val glu ATG Aag CCC GCC GGT GAC GCT GTT GAG ala 330 ala val lys glu ser val glu ala GCT GCC GTC AAG GAG TCC GTC GAG GCT gly ile 350 thr thr ala asp ile giy giy GGT ATG ACT ACC GCC GAT ATC GGA GGC

    Fig. 12-6

    ser ser ser 360 thr ser glu vdl giy asp TCT TCC TCC ACC TCC GAG GTC GGA GAC leu leu pro thr 370 arg ser arg ser cys TTG TTG CCA ACA AGG TCA AGG AGC TGC ser arg arg ser lys 380 ser phe leu arg TCA AGA AGG AGT AAG TCG TTT CTA CGA arg ile asp gly arg ser 390 lys leu thr CGC ATT GAT GGA AGG AGC AAA CTG ACG arg leu arg val giy leu pro 400 ala giy CGC CTG CGG GTT GGT CTA CCG GCA GGG ser ala ser TCC GCT AGT 405 val GTA OC TAA GACTCTATAAAAAG

    G^<S(3C;TC^<S(S<STrC^(STT\/\T^C^/\/XATG/\TG/^TTTATAAT T TACTGG T G TAGCAACTT TGACTAGAAGAAGCAGA T TGGGTG TGTT TGTAGTGGAGGACAGTGGTACGTT UGGMACAGTCTTCTTGAAAGTGTCTTGTCTACA GTATAT(TACTCATAACTTCAATGGCCAAGGGTGT AGTCGGTTTATTAAAGGAAGGGAGTTGTGGCTGAT

    Fig.t2-7

    GTGGATAGATATCTTTAAGCTGGO^^TGCACCC AACGAGTGTGGTGGTAGCTTGTTACTGTATATTC GGTAAGATATA T TT TGCGGGGTT TTAGTGGCGTT TGGTAGGTCAGTGCTTGGTATATGAGTTGCAGTG ACGACAACTCGGAAAGGGGTGGACC TTTGGTACA TTGCGGGATCCGAATACGTTAGTTTCTGTAGTGC AACCGTTACTAACGACACAAAGAAGCGCACTTGT CCTCACCCTCTTTAACCGGTTGTACAT(TA^GCCGG TCTGAGAGCGCAGTGGGACGGC TT CTTTCAGCG CACπGATCCTTAGAGGCAGAGCACATGCAGTGT GGTATGGTAAGGCTGAGGGCATAAC GTAGGGTGG T TGTACTGACAGC GACAGAGGCG CGAGCTAGTACC T TATGAGATACACT CG GGT TC AT T T CAGGCCGGTA CTCGATTCATACTAC TAGCGTCGAAATCGGπGAT CACCCGTTGAC CCCGGAAGAGTC GTCGGCAGCGTC TCGGATGTΔGΔ.TπAGGπ TCGπGAGGGGTATTT GGGTTTGTGTGAGTΓGAATT

    154 427

    Fig. 12-=8

    154 427 odporność ηα odporność 00^,333$® Ι^ηοα/ΜΪΓ^ Hindlllsng

    EEETUc^rcffrnjtco/prepro temnrcrtnr odporność rai , ---ampicylinę prorenina iHind W, Folki i izolacja odcinka 3OObp

    Fig. 13 c.d.

    ł

    Xmal, H'in^d Ul I I ΒΦ l,_X^{mQ l} rotacja fragmentuj j izolacja oćfcintei ^887bp>

    Hind Ul izolacja fragmentu 350 bp I ligaza T4 transformacja E.coli

    Leu 2 promotor

    Fig. 13 odporność tetracykliny |\V

    Nrul xpr/prepro

    Jiti odporność ampicylinę prorenina

    Xpr-terminator f

    154 427

    Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz. Cena 3000 zł