NO177318B - Fremgangsmåte for fremstilling av prorennin og human-anafylatoksin C5a i Y. lipolytica, samt plasmider til fremstillingen - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse befatter seg meg gjærcelleprotein-sekreteringsteknologi. Den benytter rekombinante Yarrowia lipolytica-kloningsvektorer som omfatter heterolog DNA som koder for ekspresjon og sekretering av pattedyrprotein (for eksempel prochymosin) og andre polypeptider; og ekspresjonsvektorer som omfatter en Y. lipolytica-genpromoter (for eksempel XPR2 eller LEU2) t alkalisk proteasesignal (eller pre)-sekvens, pro-område og XPR2-terminatorområdet. Varianter eller funksjonelle ekvivalenter av disse fremkommer fra degenerasjon av den genetiske kode eller ved bruk av en annen Y. lipolytica-genkomponent.

Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen fremgangsmåter som angitt i krav 1-8 og plasmider som angitt i krav 9-11.

Den økonomiske tiltrekningskraft for en stabil og tilstrekkelig tilførsel av en rekke proteiner eller polypeptider, verdi-fulle i industri (for eksempel prorennin, bovint veksthormon)

eller til medisinske formål (for eksempel urogastron, vevsplasmino-genaktivator, human-anafylatoksin C5a) og spesielt for en kilde som tilbyr et høykvalitetsprodukt i en lett påvisbar, funksjonell form, har ledet mange forskere til å anvende rekombinant DNA-teknologi på mikroorganismer som "fabrikker" for produksjon av heterologe proteiner.

Utstrakt forskning er fokusert på proteinsekretering som en potensiell løsning på vanskeligheter som påtreffes i utvinning av eksogent eller heterologt (fremmed) protein i en biologisk aktiv form fra intracellulære oppsamlinger i rekombinante vertsceller, spesielt fra Escherichia coli. I E. coli produseres det heterologe protein ofte inne i cellen i form av refraktile inklusjonslegemer. Nevnte protein er generelt av lav vannløselighet og har liten eller ingen biologisk aktivitet. Ekstraksjon av nevnte protein fra de refraktile inklusjonslegemer involverer generelt hardhendt kjemisk behandling, som kan være kostbar og kan resultere i liten eller ingen utvinning av proteinet i den ønskede, naturlige, biologisk aktive form. Videre blir muligheten for forurensning av nevnte protein med uønskede stoffer produsert av E. coli, økt gjennom behovet for å ødelegge cellene for å frigjøre de refraktile legemer. Andre organismer sammen med E. coli kan også produsere heterologt protein i uløselig intracellulær form. For eksempel beskriver britisk patent nr. 2 091 271 genetisk modifisering av S. cerevisiae via rekombinant DNA-teknologi for å uttrykke kalve-rennin, eller chymosin, navnene brukes om hverandre her. I lys av disse vanskeligheter er sekresjon av nevnte protein fra vertsorganismen blitt vendt til et forsøk på å produsere proteinet i en naturlig, aktiv konfigurasjon.

Om det er et spesielt protein, inkludert heterolog-protein eller polypeptid som blir sekretert av en gitt organisme, viser seg å være avhengig av proteinet. I de fleste eukaryotiske celler er noe av proteinsyntese-apparatet assosiert med den endoplasmatiske retikulum-membran, og sekvensen av aminosyrer (kalt "signalsekvensen") nær amino-terminus av den voksende polypeptidkjede tjener til å dirigere proteinet til å krysse membranen. Signalsekvensen blir videre spaltet proteolytisk under sekreterings-prosessen, hvilket gir aktivt modent protein. Flere forsøk er blitt gjort for å utvikle prosesser for sekretering av heterologe proteiner ved å bruke signalfrekvenser i mikroorganismer, inkludert Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae og i pattedyrceller i kultur. Imidlertid har nevnte organismer ikke vist seg å være ideelle.

Nedarvete egenskaper av for eksempel B. subtilis, sekreterer mange proteiner inkludert tallrike proteaser som tenderer til å nedbryte det sekreterte heterologe protein; ustabilitet av transformerte stammer som resulterer fra tap av heterolog DNA,

har hindret dets utvikling.

Pattedyrceller er på en vellykket måte blitt genetisk utformet til å uttrykke og sekretere heterologe proteiner, men disse systemer er teknologisk krevende og dyre å operere og forblir upraktiske for kommersiell produksjon av de fleste proteiner som produkter.

Mens proteinsekreteringsstudier har vært mer vellykkete med

S. cerevisiae enn med B. subtilis, viser selv S. cerevisiae seg

å ha noen nedarvete begrensninger som proteinsekretringssystem. Europeisk patentsøknad, publ. nr. 123544, beskriver isolering av

S. cerevisiae a-faktorgenene, og bruk av promoteren og/eller signalpeptiddelene av denne i kombinasjon med DNA som koder for proteiner som er heterologe med gjærceller i et plasmid for transformasjon av gjærceller som er i stand til å produsere adskilt, modent protein på cellekultur. Europeisk patentsøknad, publ. nr. 88632, beskriver en prosess for ekspresjon og sekretering av heterologt protein i S. cerevisiae. Imidlertid viser størrelsen av proteinene som S. cerevisiae på en effektiv måte vil sekretere med disse og andre sekreteringssystemer, seg å være begrenset til omtrent 20 000 dalton. Overvinnelse av denne gene-relle manglende effektivitet av S. cerevisiae som sekreterings-organisme har krevet multiple mutasjonsforandringer som beskrevet av Smith et al., Science 229; 1219-1224 (1985). Et unntak fra denne trend er observasjonen at Aspergillus-enzymer større enn 20 000 tilsynelatende kan sekreteres av S. cerevisiae, men disse enzymer blir høyt glykosylert av S. cerevisiae, og dette kan influere på effektiviteten for sekretering.

Spesiell interesse hviler over Yarrowia lipolytica, en industrielt viktig art av gjærcelle brukt til å produsere sitron-syre og enkeltcelleprotein. Den kan også brukes til å produsere erytritol, mannitol og isopropylmaleinsyre. I kontrast til S. cerevisiae er Y. lipolytica av spesiell interesse og verdi på grunn av dens evne til effektivt å sekretere høymolekylvekt-proteiner (alkalisk protease, syreprotease og RNAse) inn i vekstmediet og således tillate potensiell utvinning av heterolog-proteiner i den naturlige tilstand uten behov for å ødelegge de produserende celler. I tillegg sekreterer Y. lipolytica svært få proteiner og tilbyr således potensial for produksjon av et ønsket heterologt protein i vekstmediet som det predominante proteinslag og forenkler utvinning av nevnte heterologe proteinprodukt.

Y. lipolytica produserer høye nivåer av ekstra-cellulær protease. Dette er det predominante protein sekretert av Y. lipolytica. Den spesielle protease (alkalisk, sur eller nøytral) avhenger av den anvendte stamme av Y. lipolytica (Ogrydziak et al., J. Gen. Microbiol. (1982) 128. 1225-1234).

En partiell sekvensanalyse av den N-terminale aminosyresekvens

av alkalisk ekstracellulær protease er rapportert av Ogrydziak et al., (loe.eit.).

US-søknad nr. 634 505 beskriver metoder for transformering av Y. lipolytica og for kloning av Y. lipolytica-gener ved komplettering av mutasjoner. uen oesKnver Kxoning av xkk^-genet, som koder for en sekretert alkalisk protease, ved komplettering av en xp_r2-mutas jon av Y. lipolytica. Metodikken inkluderer transformering av en vertsstamme av Y. lipolytica med et Bglll-partielt spaltet stykke av et Y. lipolytica-genbibliotek i vektor pLD40 beskrevet i norsk patentsøknad nr. 81.4001 som tilsvarer den ovenfor nevnte US-søknad.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer vektorer som, når de innføres i Y. lipolytica-verter, påvirker vertenes evne til å produsere og sekretere spesifikke proteiner kodet for av heterolog DNA fra enhver kilde, men spesielt fra eukaryotisk og syntetisk DNA, inn i mediet; rekombinant Y. lipolytica-klonings-vektorer, som omfatter heterolog DNA som koder for ekspresjon av pattedyr-protein og andre polypeptider, inkludert plasmider som er egnet for transformering av Y. lipolytica-verter, og spesielt integrerende ekspresjonsvektorer som omfatter LEU2-genpromoteren, XPR2-genpromoteren, alkalisk protease prepro-området og XPR2-terminatorområdet; og ekspresjonsplasmider som har en heterolog kodende sekvens med XPR2-sekreterinassianaler nedstrøms fra LEU2-promoteren som er i stand til å uttrykke og sekretere et heterologt protein inn i Y. lipolytica transformert med denne.

Oppfinnelsen illustrerer således ekspresjon og sekretering av modent heterologt protein, nemlig prorennin og humant anafylatoksin C5a, fra genetisk forandrete cellekulturer av Y. lipolytica. Oppdagelsen av den nøyaktige identitet av aminosyresekvensen såvel som DNA-sekvensen for den eksocellulære alkaliske protease av Y. lipolytica har muliggjort den påvisning at heterologt protein kan uttrykkes og sekreteres via rekombinante DNA-teknikker for produksjon i cellekultur. I tilfellet med prorennin blir den modne form av zymogenet (rennin-forløper) uttrykt og sekretert.

Det er nå blitt funnet at Y. lipolytica kan modifiseres genetisk via rekombinant DNA-teknologi for å produsere transformanter som er i stand til å uttrykke og sekretere heterologe proteiner i sin naturlige form. Dette utføres ved konstruksjon av vektorer som bærer signalet, eller signalet og den første (prol) eller begge prosekvenser (prol + pro2) av XPR2-<g>enet som er bundet til den strukturelle gensekvens for det heterologe protein som det er ønsket å sekretere.

Transformanter produsert ved integrasjon ved XPR2-locus av vektor-DNA som omfatter et fragment av XPR2-<g>enet som mangler regulatoriske eller strukturelle komponenter i begge ender av genet, produserer ikke lenger alaklisk protease, en karakteristikk som ikke bare er ønskelig for heterolog proteinsekretering, men som kan brukes til å "screene" for antatte transformanter.

Videre er vektorer som bærer XPR2-promoteren og sekvenser for alkalisk protease-sekretorisk signalsekvens, i stand til i en transformert Y. lipolytica-celle å oppnå sekretering av det modne heterologe protein. Noen rekombinante DNA-vektorer av denne type er i stand til å oppnå ekspresjon/sekretering uavhengig av integra-sjonssete i et gjærcellegenom. Generelt gir vektorer som inneholder tilstrekkelig 5'- og 3<1->flankerende DNA, ekspresjon av produkt uavhengig av integrasjonssetet.

Det er videre overraskende og uventet funnet at integrasjon av et pBR322-derivert plasmid inn i Y. lipolytica kromosomal DNA gir et område med homologi som er i stand til å gi ytterligere setedirigert integrerende transformasjon. Den integrerte kopi av pBR322 tjener således som en "docking platform" for innkommende transformert DNA. Integrasjonen av en residerende kopi av pBR322 inn i kromosomal Y. lipolytica-DNA, på tross av det faktum at pBR322 ikke er naturlig Y. lipolytica-DNA, gir således et kjent mål for integrasjon. Y. lipolytica-transformasjon-resipienter som omfatter et slikt sete, byr på to hovedfordeler i forhold til mot-takere som mangler et slikt sete; nemlig, tilstedeværelsen av et område som har en kjent sekvens og et kjent restriksjonskart til å tjene som et mål for setedirigert integrasjon; og, anledningen til å bestemme, ved å bruke pBR322 som integrasjonsmål, om inntaks-plasmidet inneholdt en fullstendig funksjonell enhet eller et gen som motsvarte bare en del av det ønskede gen. For eksempel kunne et plasmid som inneholdt bare et 3'-fragment av XPR2-genet, transformere en XPR2-1002-mottager hvis den inneholdt vill-typekodon og integrerte ved XPR2-locus. Imidlertid ville det samme plasmid ikke transformere XPR2-1002-verten til den protease-positive fenotype hvis den integrerte inn i pBR322 fordi den manglet hele den funksjonelle enhet.

Således, i Y. lipolytica-transformanter som omfatter et område med homologi med heterolog vektor-DNA, tjener nevnte område som omfatter eksogen DNA som et mottagersete under integrerende transformasjon av nevnte Y. lipolytica. I tillegg til pBR322 og derivater derav, kan kosmider, bakteriofag slik som M13 og lambda, syntetisk derivert DNA og vanlige plasmider slik som pUC13 brukes til å produsere Y. lipolytica-transformanter som har en "docking platform".

Ved "LEU2"-promotersekvens menes det oppstrøms utranslaterte område oppstrøms for ATG som inneholder de fleste, hvis ikke alle, egenskaper som kreves for ekspresjon.

Ved "XPR2"-promotersekvens menes det oppstrøm utranslaterte område foran signal (eller pre)-sekvensen som er nødvendig for ekspresjon. I tillegg kan signalet, med eller uten pro-sekvens, fra XPR2-genet brukes til å sekretere proteiner under ekspresjons-kontroll av Y. lipolytica-promotere som er forskjellige fra XPR2-genet. Således er vektorer som bærer LEU2-<p>romoteren og sekvenser for alkalisk protease-sekretorisk signal, i stand til i en transformert Y. lipolytica-celle å utføre sekretering av modent heterologt protein.

Human-anafylatoksin C5a, også kjent som humant komplement-protein C5a (human-C5a), er et bioaktivt polypeptidfragment dannet in vivo som et resultat av komplement-aktivering. Det virker som en immunomodulator i regulering av spesielle aspekter av den humorale og cellulære immunrespons. Den primærstruktur og strukturen til andre anafylatoksiner er blitt klarlagt. Et sammendrag av den kjemiske, fysiske og biologiske karakterisering er presentert av Hugli i "Complement", utgitt av H. J. Muller-Eberhard og P. A. Miescher, s. 73-99, 1985, Springer-Verlag, New York.

Det vil forstås av fagmannen på området at heterolog DNA som koder for praktisk talt enhver kjent aminosyresekvens, kan anvendes med de nødvendige forandringer i den foreliggende oppfinnelse. Metodikken beskrevet her er med de nødvendige forandringer anvend-bar til produksjon og sekretering av ethvert heterologt protein, hvorav representative medlemmer er oppregnet i US-patent 4 532 207. I tillegg kan ethvert annet gen av Y. lipolytica-sekreterte proteiner slik som ribonuklease og syreproteasegenene, brukes istendefor XPR2-<g>enet som også hybridgener konstruert ved å kombinere fragmenter av to eller flere av de nevnte gener kan det, for eksempel signalsekvensen av XPR2-genet og promotersekvensen av ribonuklease-genet.

Degenerasjonen av den genetiske kode tillater substitusjon av spesielle kodoner ved andre kodoner som spesifiserer den samme aminosyre og således ville gi opphav til det samme protein. DNA-eller nukleotid-sekvensen kan variere vesentlig siden, med unntak av metionin og tryptofan, de kjente aminosyrer kan kodes for av mer enn ett kodon. Således kunne alle deler av XPR2-genet syntetiseres for å gi en DNA-sekvens som er signifikant forskjellig fra den som er vist i figur 3. Den kodede aminosyresekvens av dette ville imidlertid bli bevart. Slike funksjonelle forandringer av en gitt DNA- eller nukleotid-sekvens gir anledning til å fremme sekretering og/eller prosessering av heterologe proteiner kodet for av fremmede DNA-sekvenser som er fusjonert med denne. Alle variasjoner i nukleotidsekvensen av XPR2-genet og fragmenter av denne tillatt av den genetiske kode er derfor inkludert i denne oppfinnelse. Videre er det mulig å deletere kodoner eller å substituere ett eller flere kodoner ved andre kodoner enn degenererte kodoner for å produsere et strukturelt modifisert poly-peptid, men et som har i det vesent-lige den samme anvendbarhet eller aktivitet av polypeptidet produsert av de umodifiserte DNA-molekyl. De nevnte to polypeptider er funksjonelt ekvivalente, som også de to DNA-molekylerr>som gir opphav til deres produksjon er det, selv om forskjellene mellom nevnte DNA-molekyler ikke er relatert til degenerasjon av den genetiske kode. Det enkleste eksempel på dette finnes i prorennin A og prorennin B, de to alleliske former av prorennin, som er forskjellige bare i tilstedeværelsen av en asparaginrest ved posisjon 286 i prorennin A og en glycinrest ved den posisjon i prorennin B.

Ved å anvende denne metodikk er ekspresjon og ekskresjon av de heterologe pattedyrproteiner prorennin og human-anafylatoksin C5a blitt oppnådd i Y. lipolytica ved å bruke ekspresjons- og sekreteringssignaler fra Y. 1ipolytica- XPR2- og/eller - LEU2-gener. DNA-sekvensene for prorennin og human-anafylatoksin C5a ble bundet sammen via syntetiske oligonukleotider til XPR2-gensekvensen ved steder som ble antatt å kode for det alkaliske proteasesignal-peptid eller protease-forløper-prosesseringssteder, betegnet her som prol og pro2, og brukt til å produsere genkonstruksjoner som så ble innført i Y. lipolytica ved integrerende transformasjon. De rekombinante kulturer uttrykt og eksportert inn i de vekstmedium-heterologe proteiner har molekylvekten og immunoreaktiviteten til prorennin og human-anafylatoksin C5a. Prorennin som produseres slik menes å være foldet inn i en naturlig konfigurasjon siden den etter fjerning av propeptidet utøver full enzymatisk aktivitet.

Betegnelsen "rekombinant DNA-materiale" som brukt her, inkluderer ethvert materiale som inkluderer minst ett av de følgende: XPR2-<g>enet av Y. lipolytica, signalet (eller pre), prol- og pro2-(som sammen omfatter pro-området) promoter eller terminatorsekvensen av disse; LEU2-promoteren; og funksjonelle ekvivalenter av de tidligere nevnte sekvenser som er mulig på grunn av degenerasjonen av den genetiske kode.

Representative for nevnte rekombinante DNA-materiale er DNA-fragmenter, plasmider eller vektorer eller transformanter som inneholder en hvilken som helst eller alle de tidligere nevnte sekvenser.

Materialer.

Alle enzymer ble brukt under betingelser anbefalt av forhandleren.

Medier.

GPP medium-(glycerol/proteose-pepton-medium) inneholdt (pr. liter): 6,7 g glycerol, 1,6 g Difco proteose-pepton,

1,7 g Difco gjærnitrogenbase uten aminosyrer og ammoniumsulfat,

30 mg uracil og 0,5 ml/l polypropylenglykol molekylvekt 2000 (Polysciences) i 40 mM-fosfatbuffer (pH 6,8). (Polypropylenglykol ble utelatt ved bruk i kulturer dyrket for bruk i rennin-enzym-assays)). Proteose-pepton ble autoklavert separat i fosfatbufferen, YEPD-medium - (gjærekstrakt/pepton/ dekstrose-medium) inneholdt (pr. liter): 5 g gjærekstrakt, 10 g pepton og 20 g dekstrose.

E. coli ble dyrket i LB-medium ved 37°C. LB-medium inneholdt (pr. liter): 10 g Bactotrypton, 10 g Bacto gjærekstrakt, 10 g natriumklorid; justert til pH 7,5 med natriumhydroksyd.

DNA- sekvens- analvse.

DNA-fragmentene fra de forskjellige plasmider beskrevet her ble isolert på polyakrylamidgeler og sekvensert ved metoden til Maxam et al., Methods in Enzymology, 65, 499 (1980).

Ligerin<g>sprosedyrer.

DNA-fragmenter, inkludert spaltede vektorplasmider, ble ligert ved å blande de ønskede komponenter (DNA-fragmenter med ender som var passende konstruert til å gi korrekt tilpasning) med T4 DBA-ligase. Omtrent 10 enheter ligase ble tilsatt for /xg-mengder av vektor og innfelte fragmenter. Den resulterende ligeringsreaksjon ble transformert inn i kompetente celler av E. coli K12 stamme MM 294 (ATCC-33625) eller HB101 (ATCC-33694).

Fremstilling av kjemisk syntetisert DNA.

For å konstruere hybridgenene for ekspresjon og sekretering av prorennin ble åtte oligonukleotider syntetisert ved en modifisert fosforamiditt-prosedyre (Sinha et al., Tetrahedron Letters, 24., 5843 (1983) på en genetisk design 6500 (Watertown, MA) automatisert DNA synthesizer, og ble renset fra 6M urea-20% polyakrylamidgeler. Alikvoter av komplementære oligonukleotider ble blandet og koblet til hverandre ved 4°C over natten i TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM NaEDTA). Alikvoter (omtrent 2 ug) av de dobbeltstrengete oligonukleotider ble fosforylert i 20 /il reaksjonsblanding som inneholdt 70 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 5 mM ATP, ved 37°C ved å bruke T4 polynukleotidkinase.

Fremstilling av plasmid DNA.

Storskala-fremstilling av plasmid-DNA ble fremstilt ved fremgangsmåten til Holmes et al., Anal. Biochem., 114. 195-197

(1981), fulgt av ethidium-bromid-CsCl flytende tetthetsgradient-sentrifugering. Miniprep-mengder av plasmid-DNA ble fremstilt ved alkalisk-SDS-prosedyren til Birnholm et al., NAR 1, 1513 (1979).

Konstruksjon av ekspresjons/ sekreterings- vektorer for prorennin.

En rekke forskjellige konstruksjoner ble laget for å få slutt-ekspresjonsvektorene. Alle trinn er vist i diagram i de medfølgende figurer. Generelt ble DNA-fragmenter isolert ved gel-elektroforese og ligert til andre fragmenter, eller spaltet plasmid-DNA, i 20 jul 50 mM Tris-Hcl (ph 7,5), 10 mM MgCl2, 20 mM ditiotreitol, 1 mM ATP og 200 enheter av T4 ligase ved 4°C. Hvis delvis fordøying av DNA med restriksjons-endonuklease var påkrevet, ble optimale spalt-ningstider opprettet eksperimentelt.

Identifisering av prorennin i kulturfluid.

Gjærcelletransfor-manter som inneholdt ekspresjonsvektorene, ble dyrket over natten i GPP-medium (se ovenfor). Etter sentrifugering for å fjerne gjærceller ble 1 ml av 50% TCA tilsatt til hver 5 ml alikvot av kulturfluid, og holdt ved 4°C i 60 minutter. Man fikk pellets ved sentrifugering og vasket to ganger med 2 ml kald aceton. Presipitert protein ble løst i 100 jul SDS-prøvebuffer og alikvoter kjørt på elektroforese i 10% SDS-polyakrylamidgeler (Laemmli, U.K., (1970) Nature 227, 680). Geloppløste proteiner ble elektroforetisk overført til nitrocellulose (Schleicher og Schuell, 0,22 lim), og prorennin ble identifisert ved immuno-blot-analyse'av gelmengder (Hawkes, R. et al., (1982) Anal. Biochem. 119, 142). Filteret ble oversjiktet med kanin-ar.tiprorennin-antistoff, fulgt av inkubering med peroksidase-konjugert geite-anti-kanin-IgG-antistoff (Cappel, Malvern, Pa). De bundne anti-stoffer ble påvist ved å farve med 4-klor-l-naftol og hydrogen-peroksyd.

Melkesammenløpingsaktivitet av prorennin i kulturfluid.

Kulturfluidet av forskjellige Y. lipolytica-transformanter ble bestemt for melkesammenløpingsaktivitet i henhold til en modifisering av metoden til Ernstrom, J. Dairy Sei. 41, 1664 (1958). I korte trekk omfatter den måling av den tidsperiode som kreves for rennin i aktiverte kultursupernatanter til å koagulere bufret skummet-melk, og korrelering av disse verdier mot en renset rennin-standard. Gjærcellekulturer (25 ml) ble dyrket over natten i GPP-medium. Etter sentrifugering for å fjerne celler ble 5 ml alikvote mengder av kultursupernatantene frysetørket under vakuum. Hver lyofiliserte supernatant ble resuspendert i 3 00 /xl destillert vann. En fortynningsserie av renset kalveprorennin ble også fremstilt som kontrollreferansestandard. Prorennin i media-konsentratene og kontrollene ble aktivert ved tilsetning av omtrent 5-10 /il konsen-trert HC1 for å gi en pH på omtrent 2, og inkubering i 1 time ved 22°C. Skummetmelk ble fremstilt ved å tilsette 60 g tørt skummet melkepulver (Difco) i 500 ml 41,5 mM natriumacetat (pH 6,3) og 13,6 mM CaCl2 og røre i 20 minutter ved 4°C. Substratet ble brukt til assays umiddelbart etter at det var fremstilt. En alikvot på 60 /il (ekvivalent med 1 ml kultur-supernatant) av hvert enzym-preparat ble tilsatt til en 1 ml alikvot av skummetmelk ved 37"C og sammenløpningstiden notert.

Fremstilling av syntetiske oligonukleotider for C5a- gen.

01igodeoksynukleotidene som var brukt i C5a-strukturgen-syntesen ble kjemisk fremstilt ved en modifisert fosforamiditt-prosedyre (Shinha et al., loe. eit.) ved å bruke en kontrollert poreglassbærer på en genetisk design 6500 (Watertown, MA) automatisert DNA-synthesizer. Protokollen brukte 3% (vekt/volum) diklor-eddiksyre i diklormetan til ditritylering, direkte aktivering av fosforamidittene med mettet tetrazol i acetonitril, tildekking med di-etoksyfosfin-tetrazolid og oksydering med vandig jodin/THF (Matteucci et al., 1981, J. Amer. Chem. Soc, 105. 3183). Den totale tid pr. tilleggssyklus var 14 minutter. De ti 47-merer, segmenter A-J i figur 9, ble oppnådd i 98,8% gjennomsnitt utbytte/trinn (ved tritylanalyse), avblokkert ved prosedyren til Matteucci et al., etanol-presipitert fra 0,3M natriumacetat og isolert ved preparativ gel-elektroforese på 10% polyakrylamidurea-denatureringsgeler før kobling.

Sammensetning, kloning og sekvensering av human- C5a- gen.

Figur 9 viser aminosyresekvensen av det ønskede protein og

arrangementet for syntetiske oligonukleotider som trengs for å lage et gen som koder for humant C5a-protein. Alle oligomerer unntatt A og F ble fosforylert ved sine 5'-ender med T4 poly-nukleotidkinase. Sammensetningen av genet involverte to primære varmekoblings/ ligeringsreaksjoner som inneholdt: oligomerer A, B, I og J; og oligomerer C, D, E, F, G og H. De resulterende 94 bp og 141 bp dobbelttrådete DNA-fragmenter ble isolert etter elektroforese på en 10% polyakrylamidgel, ligert sammen, og deres 235 bp produkt

isolert ved gel-elektroforese. 235 bp DNA-fragmenter som inneholdt et strukturelt gen som koder for C5a, ble innført mellom EcoRI- og Hindlll-stedene i pBR322 vektor-DNA og tranformert inn i kompetente celler av E. coli K12 stamme HB101. Restriksjonsanalyse av plasmid-DNA isolert fra 6 transformanter, viste at 5 av de 6 klonene inneholdt et EcoRI/Hindlll-fragment med den korrekte størrelse. Nukleotidsekvensen for C5a-genområdet i hvert av disse plasmider ble bestemt ved metoden til Maxam et al., Methods Enzymol. 65,

499 (1980).

Konstruksjon og karakterisering av C5a- ekspresjonsplasmid for E. coli.

Prosedyrer for DNA-fragmentisolering og betingelser for ligeringsreaksjonene var som publisert av Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor. E. coli trp promoter-operatoren ble opprinnelig levert fra ptrpLl (Edman et al., (1981) Nature 291, 503). 360 bp-EcoRI-fragmentet som inneholdt trp promoter-operatorsekvensen brukt i C5a-ekspresjons-plasmidet (pC5a-48), ble isolert fra prorennin-ekspresjonsplasmid pPFZ-R2, beskrevet i europeisk patentsøknad, publ. nr. 147178.

Identifisering av C5a i Y. lipolytica- kulturfluid.

Prosedyren var den samme som den beskrevet ovenfor for prorennin med unntak av at geite-anti-C5a og kanin-annti-geite-IgG (Cappel) ble brukt i immunoavtrykket. Geite-anti-human-C5a-antistoff ble fremstilt ved metoden til Manderino et al., J. Immunol. Methods 53, 41-50 (1982).

Vektorer

plD40 - beskrevet i EP-søknad, publ. nr. 138508 Mikroorganismer:

De er deponert under betingelsene i Budapest-avtalen i den amerikanske type-kultursamling, Rockville, Maryland, et godkjent oppbevaringssted som gir permanens av de deponerte organismer og lett tilgjengelighet til dem for publikum. De deponerte organismer er tilgjengelige under behandling av denne søknad for en som er utpekt av sjefen for De forente staters patent- og varemerke-kontor til å være berettiget til det under 37 CFR 1.14 og 35 USC 122, og i hen-hold til utenlandske patentlover, i land hvor tilsvarende søknader eller etterkommere er inngitt. Alle restriksjoner på tilgjengelig-heten for publikum til mikroorganismene som er deponert, vil bli ugjenkallelig fjernet ved bevilgning av patent.

Det taksonome studium av Y. lipolytica ATCC 20774 (identifisert i kultursamlingen til Pfizer Inc. som PC 30869) ble utført av Dr. J. R. DeZeeuw som ga beskrivelsen som følger. De anvendte fremgangsmåter er de som er anbefalt av J. L. Lodder i "The Yeasts",

2. utgave, N. Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970.

CBS 599, typekulturen for artene Candida lipolytica ("The Yeasts", 2. utgave, N. Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970)

og CBS 6124, typekulturen for Saccharomycopsis lipolytica i "The Yeasts", 3. utgave, ble kjørt for sammenligning. Tidligere ble artene også referert til som Endomycopsis lipolytica. Dets uperfekte tilstand er Candida lipolytica. Den taksonomiske

posisjon av artene ble fastsatt av van der Walt og von Arx, Antonie van Leeuwenhoek, 46, 517-521 (1980). Det foretrukne navn er nå Yarrowia lipolytica.

De kulturelle, morfologiske og fysiologiske karakteristika av stamme PC-30869 faller sammen med standardbeskrivelsen for artene nedtegnet som Saccharomycopsis lipolytica i "The Yeasts", 3. utgave, utgitt av Kreger-van Rij, s. 406-408, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1984.

PC-30869 ble konstruert ved genetisk rekombinasjon av egnete mutanter av Y. lipolytica PC-22208, et Pfizer jordisolat, og Y. lipolytica PC-30026, en sub-kultur av NRRL Y-1094. PC-30869 er fenotypisk forskjellig fra sitt villtypeopphav i (1) ved at den ikke produserer noe aktiv eksocellulær alkalisk protease,

(2) at den krever biotin for vekst, og

(3) at den krever en kilde for L-leucin.

Under log-fasevekst av PC-30869 i gjærekstrakt-pepton-glukose (YEPD)-buljong er knoppceller ovoide og har en gjennomsnittsstør-relse på 2,6 x 5,5 /xm. På YEPD-agar er pseduo- og sant-mycelium utpreget. Blastosporer er til stede for det meste enkeltvis i pleurale posisjoner. Ingen karotenoidpigmenter er synlige. Kulturen oppfører seg som en "B"-parringshaploid i krysning med eutentiske teststammer for artene (tabell 5). Typisk ascosporule-ring er observert på V8-agar. Karbonassimileringsmønster er vist i vedlagte tabell 2. Fermentering er fraværende. Ammonium og urea, men ikke nitrat, er anvendt som de eneste nitrogenkilder (tabell 3). Stamme PC-3 0869 krever vitaminene thiamin og D-biotin (tabell 4). Bare thiamin kreves av kulturens villtypeopphav. Ingen vekst er observert ved 37°C.

PC-30869 er forskjellig fra andre stammer av Y. Lipolytica beskrevet i patentlitteraturen som fremkommer fra en sammenligning av deres fenotyper (tabell 7 og 8).

ATCC 20228 (Nubel et al., US-patent 4 155 611) beskriver villtype-ernæring som oppfører seg lik typestammene for artene CPS 599 og CBS 6124. Spesifikt krever den ikke uracil, leucin eller biotin for vekst, og den gjør gelatin flytende.

ATCC 20628 (DeZeeuw et al., US-patent 4 407 953) krever forskjellig fra ATCC 20228 tilsetning av leucin for vekst. Lik ATCC 2 0228 krever den ikke uracil eller biotin. Den vil også gjøre gelatin flytende.

ATCC 20688 (europeisk patentsøknad, publ. nr. 138508) vokser bare hvis mediet er tilsatt både uracil og leucin. Dette krav om uracil atskiller ATCC 20688 fra både ATCC 20228 og ATCC 20628. ATCC 2 0688 krever ikke biotin, og den gjør gelatin flytende.

Kultur PC-30869 er forskjellig fra alle de ovenfor nevnte. Den krever biotin og leucin, men ikke uracil, for vekst. Den gjør ikke gelatin flytende.

Det totale medium inneholdt 16,7 g/l Bacto-vitaminfri gjærcellebase pluss 100 mg/l uracil, 100 mg/l L-leucin, 10 mcg/1 D-biotin og 200 mcg/1 ThiaminTHC1.

Mediet inneholdt 120 g/l gelatin og 16,7 g/l Bacto-vitaminfri gjærcelle pluss 100 mg/l uracil, 100. mg/l L-leucin, 10 mcg/1 D-biotin og 200 mcg/1 thiamin.HC1.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 - Partielt lineært restriksjonskart av overlappende plasmider pLD 57, pLD 58 og pLD 6 2 isolert fra Y. lipolytica stamme DL 112. Fig. 2 - Syntetiske oligonukleotidprøver for XPR2-genet. Fra den publiserte sekvens for de fleste av de første 25 aminosyrerester av den modne protease (Ogrydziak et. al., loe.eit.) gir to områder(merket I og II) mulighet for konstruksjon av 14-mer oligonukleotidprøver med degenerasjonsgrad på 32 ganger eller mindre. De to om-rådene begynner ved aminosyrer henholdsvis 7 og 18. Fire forskjellige 8-gangers degenererte blandede prøver ble fremstilt for hvert område og gitt tall mellom 170 og 186 som vist. I de viste forutbestemte nuklein-syrer betyr "X" alle fire baser, "U" betyr begge purin-er og "Y" betyr begge pyrimidiner.

Fig. 3 - Niiikleotidsekvens av XPR2-gen som viser promoter,

pre (-157 til -136), prol (-135 til -98), pro2 (-97 til -1), alkalisk ekstracellulær protease og terminatorsekvenser.

Fig. 4 - Konstruksjonssekvens for terminatorvektor pterm 4.

Fig. 5 - Konstruksjonssekvens og restriksjonskart for plasmid

pLS-3.

Fig. 6 - Konstruksjonssekvens og restriksjonskart for plasmid pXX-33. Fig. 7 - Konstruksjonssekvens og restriksjonskart for plasmid

pXX-22.

Fig. 8 - Konstruksjonssekvens og restriksjonskart for plasmid

pXX-11.

Fig. 9 - Aminosyresekvens for human-anafylatoksin C5a.

Fig. 10 - Restriksjonskart for plasmid pC5a-48.

Fig. 11 - Konstruksjonssekvens og restriksjonskart for plasmid

pC5aX-3.

Fig. 12 - Nukleotidsekvens for LEU2-genet.

Fig. 13 - Konstruksjonssekvens og restriksjonskart for plasmid pLX-34.

Sekvensanalyse av XPR2- genet. DNA-sekvensanalyse av det klonete XPR2-gen ble utført ved hjelp av den kjemiske nedbrytningsmetode (Maxam et al. 1980, Methods Enzymol. 6_5, 499) på overlappende restriksjonsfragmenter fremstilt fra plasmider pLD57, pLD58, pLD62 (fig. 1) og pLD84 og pLD86 (se nedenfor). Resultatene viste at de klonete gjærcellegenomiske DNA virkelig inneholdt genet for den eksocellulære alkaliske protease. Nukleotidsekvensen for XPR2-<g>enet og aminosyresekvensen for den' alkaliske proteaseforløper med dens signalsekvens som dedusert fra nukleotidsekvensen er vist i fig. 3. En stor del av aminosyresekvensen for den ekstra-cellulære protease var ukjent (Ogrydziak et al., loe.eit.) og er presentert her for første gang.

Videre er sekvensene som kreves for ekspresjon og sekretering av den .eksocellulære protease, beskrevet her for første gang. DNA-sekvensen som koder for den alkaliske protease, dens forløper og signalsekvenser består av 13 62 basepar (fig. 3).

Den primære struktur av denne polypeptidkjede ble dedusert fra nukleotidsekvensen til å være 454 aminosyrerester. Den alkaliske protease syntetiseres i cellen i en forløperform som blir proteolytisk bearbeidet til den sekreterte eller modne form. Analyse av den N-terminale aminosyresekvens dedusert fra nukleotidsekvensen åpenbarte eksistensen av et antatt signalpeptid i forløpermolekylet. Nevnte signalpeptid inneholder 22 aminosyrerester, og de strukturelle egenskaper er lik egenskapene til høyere eukaryotiske og prokaryotiske signalpeptider (Perlman et al., 1983, J. Mol. Biol. 167, 291). Et område i den forutsagte aminosyresekvens i generelt samsvar med de kjente 25 N-terminale aminosyrer av den modne alkaliske protease (Ogrydziak et al., 1982, J. Gen. Microbiol. 128, 1225) ble foregått av 157 aminosyrerester som inneholdt signalpeptidet og to trypsin-type-spaltingsseter (Lys-Arg). Nevnte spaltingsseter ble brukt til å dele proområdet inn i prol (-135 til -98) og pro2 (-97 til -1). Se figur 3. Den modne alkaliske protease har 297 aminosyrer som dedusert fra nukleotidsekvensen. Aminosyresekvensene forutsagt for de forskjellige former av protease fra nukleotidsekvensen er overensstemmende med størrelsene av de rensete formene av enzymet. I tillegg til den alkaliske proteaseforløper-strukturelle sekvens ble ca. 700 bp av 5<1->flankerende sekvens og 600 bp av 3<1->flankerende sekvens bestemt. Analyser av disse områder demonstrerte at de inneholder sekvenser som er analoge med andre eurkaryotiske promotere og terminatorer, og er trolig essensielle for alkalisk protease-ekspresjon.

Som nevnt ovenfor er fremgangsmåte for transformering av

Y. lopilytica og for kloning av Y. lipolytica-gener ved komplettering av mutasjoner, inkludert kloning av* XPR2-genet, som koder for en utskilt alkalisk protease, ved komplettering av en xpr2-mutasjon, gjengitt i EP 138508. Prosedyren beskrevet der inkluderer transformering av en Y. lipolytica-vertsstamme med et BglII-partielt, spaltet stykke av et Y. lipolytica-genbibliotek

i vektor pLD40, idet nevnte vektor er karakterisert ved det faktum at den har et lite segment som inneholder LEU2-området av Y. lipolytica, og 3EcoRI, 4EcoRV, 6AvaI, lBglll, INcoI, lApal, 2XhoI og IBstXI endonuklease-restriksjonsseter. Én av Y. lipolytica XPR2-transformantene ble brukt til å utvinne villtypegenet (pLD84 og pLD86) fra Y. lipolytica NRRL Y-1094 for anvendelse i ekspresjons/sekreterings-vektorkonstruksjon som beskrevet i eksempel 1.

Sekvensanalyse av LEU2- qenet.

DNA-sekvensanalyse av de klonete LEU2-gen i PLD25 (EP 138508) ble bestemt ved den kjemiske nedbrytningsmetode (Maxam et al. 1980, Methods Enzmol. 65, 499) på overlappende restriksjonsfragmenter. For å lokalisere det Ø-isopropylmalat-(IPM)dehydrogenasekodende område og den riktige leseramme tok man fordel av den forutsagte aminosyresekvens tidligere påvist for LEU2-<g>enet av S. cerevisiae (Andreadis et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 8059). Området av den Y. lipolytica-genomiske sekvens som koder for en aminosyresekvens som er homolog med et område på S. cerevisiae-proteinsekvensen ble identifisert. Nukleotidsekvensen av 2,8-kb-LEU2-genet og aminosyresekvensen av /?-IPM-dehydrogenase som dedusert fra nukleotid-sekvensen, er vist i fig. 12. Videre er sekvensene som kreves for ekspresjon av Y. lipolytica-/3-IPM-dehydrogenasen, beskrevet her for første gang. DNA-sekvensen som koder for dette 405 aminosyreprotein består av 1215 basepar (fig. 12). I tillegg til /?-IPM-dehydrogenase-kodende sekvens ble ca. 798 bp av 5'-flankerende sekvens og 797 bp av 3'-flankerende sekvens (inkludert det TAA-translaterende termineringskodon) bestemt. Analyser av disse områder demonstrerte at de inneholder sekvenser som er analoge med andre eukaryotiske promotere og terminatorer, og er essensielle for ekspresjon. 5 *-oppstrømsområdet av Y. lipolytica LEU2-genet inneholder en TATATATA-sekvens 78 bp foran den translasjonene start og 30 bp foran den foreslåtte mRNA-start. En annen sekvens som er viktig for transkripsjonsinitiering i eukaryoter, er CAAT-ruten som i LEU2-<g>enet er lokalisert 74 bp foran det antatte transkripsjons-initieringssete som er -48 bp fra ATG (figur 12). 3 *-nedstrømsområdet har en sekvens ved 72 til 120 nukleotider etter stopp-kodon (TAA) homolog med 51-TAG....TA(T)GT TTT-31 sekvensen foreslått av Zaret et al., Cell 28., 563 (1982) som viktig for transkripsjonsterminering i S. perevisiae.

EKSEMPEL 1

Vertsstammen som ble anvendt, var ATCC 20774 (MATB leu2- 40 bio- 6 xpr2- 1002). XPR2-transformanten. Y. lipolytica ATCC 20781, ble oppdaget som en koloni som dannet en sone på skummetmelk-indikatorplater, etter replika-plating fra leucin-manglende plater. Kromosomal DNA ble fremstilt fra transformanten ved fremgangsmåten i europeisk patentsøknad, publ. nr. 138508 og brukt til å utvinne genet for den sekreterte protease. Den kromosomale DNA ble partielt spaltet med Bglll-enzym, ligert for å sirkularisere fragmentet som inneholdt både E. coli-replikon og ampicillin-resistensgenet fra vektoren, og brukt til å transformere E. coli. Den kromosomale DNA ble også spaltet med Sall-enzym og brukt i et Southern-eksperiment som indikerte at det normale LEU2-området i transformanten ikke var forandret. (Et 520 bp stort Sall-til EcoRI-segment av LEU2-området bare 5" til segmentet av LEU2 inneholdt i pLD40, ble brukt som probe). Derfor, siden homologi er nødvendig for integreringen av et bibliotekplasmid inn i Y. lipolytica, må XPR2-området ha vært sete for integrering. Tre overlappende, men forskjellige plasmider, pLD57, pLD58 og pLD62 ble i utgangspunktet utvunnet fra Y. lipolytica ATCC 20781. De er vist i figur 1. Hybridiseringer med syntetiske oligonukleotid-prøver for XPR2-genet, basert på den kjente sekvens av de første 25 aminosyrerester i det modne, sekreterte proteaseprotein (fig. 2 og 3), viste at genet for den sekreterte protease var blitt klonet. For å bestemme om det utvunnete gen representerte villtypekopien eller mutantkopien, ble mottakerstammen Y. lipolytica transformert med pLD58. Siden ingen protease-positive transformanter resulterte fra noen leucin-uavhengige transformanter, ble det konkludert at pLD58 inneholdt mutant-allelen av genet.

Formen av XPR2-genet til stede i villtypestamme NRRL Y-1094 ble oppnådd ved et E. coli-kolonihybridiseringseksperiment. Som probe ble det 2 kb store Pvul- til EcoRI-fragment forutsagt fra sekvensdannelsesdata å inneholde hele det strukturelle gen, anvendt. Fra det opprinnelige bibliotek av Sau3A partielt spaltete fragmenter av NRRL Y-1094-DNA i pLD40, beskrevet i europeisk patentsøknad, publ. nr. 138508 fikk man flere kolonier som hybridi-serte med prøven. To av disse kolonier inneholdt de svært like plasmider betegnet pLD84 og pLD86, som ble brukt til å utvikle ekspresjonsvektorer. Begge plasmider inneholder den samme 5<1->ende av XPR2 området - Sau 3A-setet (som ble forenet med og regenererte BamHI-setet av vektoren) hvorfra sekvensen begynner i figur 3. Hver inneholder hele det strukturelle gen for proteasen og den antatte transkripsjonsterminator og inkluderer ca. 4 til 5 kb totalt innfelt stykke fra XPR2-regionen av stamme NRRL Y-1094. Innfellingen i pLD86 inneholder noen få hundre basepar ekstra ved 3'-enden. Siden vi brukte 3'-området så langt som Bglll-setet

(basepar 2 655) for ekspresjonsvektorkonstruksjon, tilførte de to plasmider det samme DNA som var funksjonelt identisk i sekvens med figur 3.

Konstruksjon av ekspresions/ sekreteringsvektorer.

Planen som ble uttenkt for å oppnå ekspresjon og sekretering av prorennin i Y. lipolytica anvender konstruksjonen av forskjellige hydbrid-gener i en integrerende kloningsvektor. En slik tilnærming danner flere forskjellige plasmider som deler utstrakte områder av felles DNA-sekvenser. Faktisk ble et modulært konstruk-sjonsskjema brukt til å sette sammen vektorer med prorennin-genet innført 3<1> til det forutsagte XPR2-signalpeptidprosesseringssete, det antatte prol-prosesseringssete og spaltingssete kjent for å danne den modne alkaliske protease. Hovedsakelig er det ønskelig at det heterologe gen blir innført mellom gjærcellepromoteren og terminatorsekvenser for ekspresjon. Det ble oppdaget at den N-terminale del av hybrid-gensekvensene vil variere i de forskjellige plasmidkonstruksjoner, men den prorennin-strukturelle gensekvens, XPR2-terminatorsekvensen og skyttelvektor DNA ville være den samme i hver ekspresjonsplasmid-konstruksjon. Det var planlagt at det samme prorennin-strukturelle genfragment og terminator/vektor-plasmidet skulle brukes i hver ekspresjonsplasmidkonstruksjon, som beskrevet nedenfor. De forskjellige prorenninekspresjons/ sekreteringsplasmid-konstruksjoner varierer i området i umiddelbar nedstrømsretning fra XPR2-<g>enpromotersekvensen i lengden av den N-terminale alkaliske proteaseforløpersekvens som kommer foran prorennin gensekvensen. Derfor ble promoterfragmentkomponenten av hvert ekspresjonsplasmid utformet til å være den variable sekvens i området av XPR2-prorennin-forbindelsen. Alle ekspresjons/sekreteringsvektorer ble satt sammen ved en lignende ligeringsreaksjon som inneholdt tre komponentfragmenter.

De eksperimentelle trinn anvendt for konstruksjon av terminal-vektor pterm 4, er vist i fig. 4. Først ble en syntetisk linker ligert til et fragment som inneholdt 3'-enden av XPR2-genet, inkludert transkripsjonstermineringen og polyadenyleringssignaler. I korte trekk ble plasmid pLD84 spaltet med endonukleoase Kpnl og ligert med den syntetiske dobbelt-trådete linker DNA vist i fig. 4. Ligeringsproduktet ble spaltet med endonukleaser Hindlll og Bglll, og et 760 baseparfragment ble innført i plasmid pLD41, linearisert med de samme to endonukleaser til å gi pterm 4. Plasmid pterm 4 ble identifisert ved sitt restriksjonskart. Resultatene fra en rekke restriksjons-endonuklease-fordøyinger der man brukte EcoRV, EcoRI, Kpnl, Bglll-Hindlll og Bgllll-Bcll ble analysert. For-døyelsene gir egnete fragmenter som bekrefter tilstedeværelsen av den syntetiske linker og den "fullstendige" 3'-ende av XPR2-<g>enet i skyttelplasmid pLD41, beskrevet i europeisk patentsøknad, publ. nr. 138508. Et partielt kart av denne 7,3 kb terminatorvektor er vist i fig. 4.

Konstruksjon av ekspresions/ sekreteringsplasmid pLS- 3.

Figur 5 gir en oversikt over konstruksjonen av det initielle plasmid brukt til sekretering av prorennin i Y. lipolytica. Dets restriksjonskart er presentert i figur 5. Konstruksjonen av prorennin-sekreteringsplasmidet ble initiert ved fremstilling av et fragment som inneholdt det meste av den prorennin-strukturelle gensekvens. Det 1080 basepar lange BclI-BamHI (partielle) DNA-fragment som inneholdt den kodede sekvens for prorennin-rester 6 til 365 ble isolert fra E. coli-prorennin-ekspresjonsplasmid pPFZ-84A. (Plasmid pPFZ-84A er et derivat av prorennin-ekspresjonsplasmid pPFZ-R2, hvis konstruksjon er beskrevet i europeisk patent-søknad, publ.nr.147178, og ble dannet ved syntetisk oligonukleotid-dirigert mutagenese som anvendte restriksjonsfragment-erstatning. Spesifikt er pPFZ-84A forskjellig fra pPFZ-R2 bare ved to basepar ved prorennin-amino-syrerester 214 (Asn - > Asp) og 286 (Asp -»• Gly) , for å kode for det såkalte prorennin A-allel, imidlertid inneholder begge plasmider den ønskede sekvens for prorennin og er funksjonelt ekvivalente i dette eksempel). XPR2 promoterkomponentfragmentet som inneholder kodende sekvenser for alkalisk prosetaseforløper 1 til 157 og prorennin 1 til 5, ble fremstilt som følger. Det 870 basepar lange HindIII-AvaI-DNA-fragment som inneholder promoterområdet og 5'-enden av det alkaliske proteasegen, ble isolert fra XPR2-subklon-plasmid pLD90. Dette fragment ble ligert med et syntetisk fragment som har strukturen:

Denne sekvens inneholder en sammenhengdende Aval-terminus, fulgt av sekvenser som koder for de siste ni kodoner av det alkaliske protease-propeptid, fulgt av sekvenser som koder for de første fire aminosyrer av prorennin, og terminerer i et BamHI-sete. Promoterkomponentfragmentet ble dannet ved en standard-ligerings-reaksjon hvor man anvendte det syntetiske fragment og 870 bp-HindIII-AvaI-fragmentet med T4-ligase fulgt av spalting med Hindlll og BamHI. De resulterende ligerte sekvenser ble renset ved polyakrylamid-gelelektroforese idet man selekterte for det passende 916 basepar lange HindIII-BamHI-DNA-fragment. Man fikk 3<1->enden av hybridgenet fra terminator/vektorplasmid-pterm 4, beskrevet ovenfor. Plasmid pterm 4 ble spaltet med Hindlll og Bell, og det ca. 7,3 kb lange Hindlll-BclI-terminator/vektor-DNA-fragment, som inneholdt XPR2-terminatoren, LEU2 selekterbar markør og pBR322, ble isolert fra en agarosegel.

Prorennin-ekspresjons/sekreteringsplasmid pLS-3 ble satt sammen ved å inkubere de tre komponent-DNA-fragmenter (Hindlll-Bcll-spaltet pterm 4 plasmid, sammen med 916 bp langt Hindlll-BamHI-promoter og 1080 bp lange BamHI-BclI-prorennin-gel-inneholdende fragmenter), konstruert som beskrevet ovenfor i nærvær av T4-ligase (se fig. 5). Ligeringsblandingen ble brukt til å transformere E. coli K12 stamme MM294 via CaCl2-metoden til Dagert et al., Gene 6, 23-28 (1979). Plasmider ble isolert fra . ampicillinresistente selekterte transformanter, og plasmid pLS-3 ble identifisert ved sitt restriksjonskart (fig. 6A). XPR2-prorenninområdet av dette plasmid ble sekvensert for å bekrefte den riktige sekvens av den syntetiske DNA og den riktige forbindelse av de ønskede fragmenter.

Fremstilling av pLD9 0.

Dette plasmid inneholder en subklon fra pLD84. Et område av DNA fra Pvul-setet i promoterområdet av XPR2 til EcoRI-setet i terminatorområdet ble subklonet i Hindlll-sete av pBR322 som følger. Flere mikrogram av pLD84 ble spaltet med de to restrik-sjonsenzymer nevnt ovenfor. Så ble de "tilpassbare" ender av de spaltete DNA-molekyler fylt med Klenow-fragmentet av DNA-polymerasel. De kinasebehandlete Hindlll-linkere (CAAGCTTG) ble tilsatt på endene med T4-DNA-ligase. Overskuddslinkere ble fjernet, og tilpassbare Hindlll-ender ble dannet ved påfølgende fordøying med Hindlll-enzymet. Blandingen av DNA-molekyler ble kjørt på en preparativ agarosegel, og det ønskede 2 kb lange bånd ble kuttet ut, renset og tilsatt til en ligeringsblanding med Hindlll-spaltet, bakteriell alkalisk fosfatase-behandlet vektor pBR322. Ligeringsblandingen ble brukt til å transformere kompetent E. coli. Orienteringen med EcoRI-setet av XPR2 terminator nærmere EcoRI-setet av pBR322 ble kalt pLD90, og den motsatte orientering ble kalt pLD91.

Den 5<1->ekstreme ende av XPR2-promoter-området som ble inkludert i pLS-3, er Pvul-setet, ca. 280 bp i fra begynnelsen av området sekvensert i figur 3. Det ble funnet at plasmider som inneholdt villtype-proteasegenet under kontroll av bare så mye av promoteren, når de integrerte inn i genomet på et sted som var borte fra det residente xpr_2-locus, ikke gjorde tranformanten i stand til å lage store mengder protease (bedømt ved oppklarings-soner på skummetmelkplater).

Vi la merke til at hvis pLS-3 inneholdt en forkortet og derved "mangelfull" promoter, da ville en integrant som resulterte fra en rekombinasjon mellom plasmidet og et resident villtype-XPR2-gen, gi en fullstendig promoter-dirigerende ekspresjon av prorennin-fusjonsproduktet, men en mangelfull promoterdirigerende protease-ekspresjon. Et analogt genavbruddstype-eksperiment ble utført med S. cerevisiae-aktingenet av Shortle et al. (Science 217; 371-373

(1982). I overensstemmelse med våre forventninger var faktisk noen leucin-uavhengige transformanter med pLS-3 nå protease-manglende. De proteasemanglende transformanter var mer trolig de ønskede integranter ved XPR2-locus enn de uønskede biprodukter slik som gen-konvertanter ved leu2. Med mottakerstamme ATCC 20688 fant vi at ukuttet pLS-3 dannet 6,5% protease-manglende transformanter, mens SnaBI-kuttet plasmid ga ca. 70% protease-manglende transformanter. Gen-avbruddsaspektet av denne transformasjon ble brukt til å forbigå behovet for et stort antall Southern blot-eksperimenter for å finne den korrekte integrant blant alle transformantene.

Plasmider som inneholdt villtypeprotease-strukturelt gen under kontroll av XPR2-promoteren (idet man begynner som sekvensert i figur 3) tillater ekspresjon av signifikante mengder protease når de blir integrert inn i Y. lipolytica-celler på et sete som er forskjellig fra xp_r2-locus. Imidlertid kan tilstrekkelig ekspresjon av heterologe gener fra disse typer integranter kreve videre modifisering av dette kontrollområde-DNA.

Sekretering av prorennin.

Y. lipolytica stamme ATCC 20688 ble transformert med ukuttet pLS-3-DNA og SnaBI-spaltet pLS-3-DNA for å få xpr" leu<+->transformanter henholdsvis ATCC 20775 (DL144) og ATCC 20776 (DL148). Disse transformantstammer ble inokulet i et testrør som inneholdt YEPD-medium. Cellene ble dyrket over natten ved 28°C. En alikvot mengde (250 /ul) av disse kulturer ble fortynnet 1:100 inn i et 25 ml av GPP-medium. Cellene ble dyrket i rystekolbe ved 28°C i 16-18 timer, til en absorbans ved 600 nm på 5,0-7,0, og høstet ved sentrifugering. Det resulterende kulturfluid eller supernatanten ble bestemt for tilstedeværelse av prorennin ved å konsentrere supernatanten og utsette konsentratet for SDS-PAGE. Gelmengden ble elektroforetisk overført til nitrocellulosepapir i nærvær av 20 mM Tris-base, 150 mM glycin, 20% metanol ved 500 mamp i 2 timer ved 4°C. Fjerning av proteinet fra gelmengden ble verifisert ved farging med Coomassie-blått.

Nitrocellulosepapiret ble tørket ved 37°C og varmet ved 65°C i 1 time, så vasket i TBS (200 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5). Papiret ble så inkubert ved romtemperatur i 3 0 minutter i TBS som inneholdt 10% hesteserum (Gibco, Chargrin Falls, Ohio) etterfulgt av inkubering i TBS som inneholdt 10% hesteserum og en passende fortynning av prorennin-antistoff i 16 timer ved romtemperatur. Papiret ble så vasket tre ganger i 10 minutter i TBS, fulgt av inkubering i TBS som inneholdt 10% hesteserum fulgt av inkubering i 2 timer i TBS som inneholdt 10% hesteserum og en passende fortynning av geite-anti-kanin-IgG-antistoff konjugert med pepperrot-peroksidase. Papiret ble så vasket tre ganger i 10 minutter i TBS og utviklet i tilstedeværelse av 4-klor-l-naftol (3 mg/ml i metanol), tilsatt til en konsentrasjon på 0,5 mg/ml, i TBS som inneholdt 0,01% hydrogenperoksyd. Tilstedeværelsen av prorennin med en molekylvekt på 40 000 ble bekreftet i begge supernatanter.

Etter syreaktivering av konsentrerte kultursupernatanter (se ovenfor) var signifikant melkesammenløpingsaktivitet til stede i prøvene fremstilt fra transformant-kulturer ATCC 20775 og 20776 som inneholdt pLS-3. Som forventet ble ingen melkesammenløpings-aktivitet oppnådd i kontrollkultursupernatanten av mottakerstamme Y. lipolytica ATCC 2 0688.

Konstruksjon av ekspresions/ sekreteringsplasmid pXX- 33.

Modifisering for å omdanne pLS-3 til et forbedret ekspresjonsplasmid pXX-33 er vist i fig. 6. Slik modifisering økte XPR2-promoterområdet med 280 bp. Som i tilfellet med pLS-3 inneholder ekspresjonsplasmid pXX-33 et hybridgen som koder for hele prepro-peptidet (157 aminosyrerester) av alkalisk protease forenet med hele den strukturelle gensekvens av prorennin.

Før konstruksjon av prorennin-ekspresjons/sekreterings-plasmidene med 280 bp mer av XPR2 promotersekvensen enn i pLS-3, var det nødvendig å subklone et restriksjonsfragment som inneholdt hele det alkaliske proteasegen, inn i et Hindlll-sete. Denne subklon ble satt sammen ved å tilsette syntetiske linkere til et restriksjonsfragment isolert fra den XPR2-<g>enomiske samlingsklon pLD86. Konstruksjonen av denne XPR2-subklon med et oppstrøms-Hindlll-sete ble initiert ved å fremstille et DNA-fragment som inneholdt hele det alkaliske proteasegen. 2,3 kb EcoRI-BamHI (partielt)-fragment fra det genomiske område av XPR2-klon pLD-86 ble renset ved agarose-gel-elektroforese og ligert med et syntetisk fragment som har sekvensen

Denne linkersekvens inneholder et sammenhengende BamHI-terminus (men regenererer ikke BamHI-setet), etterfulgt av et Hindlll-sete fulgt av en tilpassbar EcoRI-ende. Ligeringsproduktet ble spaltet med Hindlll og innfelt i Hindlll-setet til pBR322. Plasmid pXHP-24 ble identifisert ved sitt restriksjonskart og ble kilden for XPR2-promoter-fragmentene for fremtidige ekspresjonskonstruksjoner.

I plasmid pXHP-24 inneholder det subklonete XPR2-gen ca.280 basepar mer av 5<*> XPR2-promotersekvensen enn XPR2-promotersekvensen inneholdt i pLS-3. Først ble promoter-komponentfragmentet dannet ved en standard-ligeringsreaksjon som anvendte det syntetiske DNA-fragment (beskrevet ovenfor for pLS-3) og 1150 basepar Hindlll-Aval-fragmentet fra pXHP-24 med T4-ligase fulgt av spalting med Hindlll og BamHI. De resulterende ligerte sekvenser ble renset ved gel-elektroforese ved å selektere for det ca. 1196 basepar Hindlll-BamHI-fragment. Et annet fragment som inneholdt sekvenser som kodet for prorennin-aminosyrerester 6 til 151 ble fremstilt fra pLS-3 ved spalting med BamHI og Xmal, og gelrensing av det resulterende 440 basepar store BamHI-Xmal DNA-fragment. Et tredje fragment som inneholdt resten av prorennin-genet, XPR2-terminatoren, og vektorsekvenser, ble fremstilt fra pLS-3 ved spalting med Hindlll og Xmal, og gelrensing av det ca. 8,0 kb store Hindlll-Xmal-vektorfragment. De tre fragmenter ble så ligert ved å bruke standardprosedyren beskrevet ovenfor. Ligeringsreaksjonen ble brukt til å transformere E. coli K12 stamme MM294. Plasmider ble isolert fra transformantene selektert på grunnlag av ampicillin-resistens, og plasmid pXX-3 3 ble identifisert ved sitt restrik-sjonskart (fig. 6). Protease-prorennin-området av dette plasmid ble sekvensert for å bekrefte den riktige forbindelse av de ønskede fragmenter.

Y. lipolytica ATCC 20774 ble så transformert med SnaBI-spaltet pXX-33 for å gi Y. lipolytica ATCC 20780 og prorennin sekretert inn i kulturbuljongen ved de transformerte kulturer bestemt som beskrevet ovenfor i tilfellet med pLS-3. Tilstedeværelse av prorennin i kultursupernatanten ble bekreftet.

Etter syreaktivering av konsentrerte kultursupernatanter (se ovenfor) ble signifikant melkesammenløpingsaktivitet observert i prøvene fremstilt av den transformerte kultur Y. lipolytica ATCC 20780.

Konstruksjon av ekspresjons/ sekreterinqsplasmid pXX- 22.

De eksperimentelle trinn anvendt for konstruksjon av ekspresjons/sekreteringsplasmid pXX-22 er vist i fig. 7. Ekspresjons-vektoren er forskjellig fra pLS-3 i to henseender. Lik pXX-33 inneholder den tilleggs-280 bp segment XPR2-promotersekvensen. For det andre inneholder den sekvensen som koder for det alkaliske protease-signalpeptid og bare 38 aminosyrerester av propeptid (prol).

Konstruksjonsplanen for pXX-22 var analog den som ble brukt for pXX-33. Først ble promoterkomponentfragmentet dannet ved en standard-ligeringsreaksjon ved å bruke det 890 basepar store Hindlll-Bglll fragment fra pXHP-24 og det syntetiske fragment med sekvensen

med T4-ligase fulgt ved fordøying med Hindlll og BamHI. De resulterende ligerte sekvenser ble renset ved gel-elektroforese-isolering av det 920 basepar store Hindlll-BamHI DNA-fragment.

Et annet fragment som kodet for prorennin-rester 6 til 151, ble isolert fra pLS-3 ved spalting med BamHI og Xmal, og gelrensing av det resulterende 440 basepar store BamHI-Xmal DNA-fragment. Et tredje fragment som inneholdt resten av prorennin-genet, XPR2-terminator, og vektorsekvenser, ble fremstilt ved spalting av pLS-3 med Hindlll og Xmal, og gelrensing av det ca. 8,0 kb store vektorfragment. Så ble de tre DNA-fragmenter ligert ved å bruke standard-prosedyren beskrevet ovenfor. Ligeringsreaksjonen ble brukt til å transformere E. coli K12 stamme MM294. Plasmider ble isolert fra de selekterte transformanter, og plasmid pXX-22 ble identifisert ved sitt restriksjonskart (fig. 7).

Y. lipolytica ATCC 20774 ble så transformert med SnaBI-spaltet pXX-22 for å gi Y. lipolytica ATCC 20779 or prorennin sekretert inn i kulturbuljongen ved de transformerte kulturer bestemt som beskrevet i tilfellet med pLS-3. Tilstedeværelsen av prorennin i kultursupernatanten ble bekreftet i henhold til prosedyren beskrevet ovenfor. Etter syreaktivering av konsentrerte kultursupernatanter (se ovenfor) ble signifikant melkesammenløpings-aktivitet observert i prøvene fremstilt av den transformerte kultur Y. lipolytica ATCC 20779.

Konstruksjon av ekspresjons/ sekreteringsplasmid pXX- 11.

De eksperimentelle trinn for konstruksjon av de prorenninekspresjons/sekreteringsplasmid pXX-11 er vist i fig. 8. Dette plasmid inneholder sekvensen for XPR2- promoteren og det 22 amino-syrerestsignalpeptid forbundet med sekvensen som koder for prorennin. Konstruksjonsplanen brukt for pXX-11 var lik den som ble brukt for pXX-22 og pXX-33. I korte trekk ble promoter-komponent-fragmentet dannet ved en standard-ligeringsreaksjon ved å anvende det ca. 750 basepar store Hindlll-Bgll DNA-fragment fra pXHP-24 og det syntetiske fragment med sekvensen

med T4-ligase fulgt av spalting med Hindlll og BamHI. De resulterende ligerte sekvenser ble renset ved gel-elektroforese som selekterte det 790 basepar store Hindlll-BamHI DNA-fragment.

Et annet fragment som kodet for prorennin-rester 6 til 151, ble isolert fra pLS-3 ved spalting med BamHI og Xmal, og gelrensing av det resulterende 440 basepar store BamHI-Xmal DNA-fragment.

Et tredje fragment som inneholdt resten av det prorennin-strukturelle gen, XPR2-terminator, og skyttelvektorsekvenser,

ble fremstilt ved spalting av pLS-3 med Hindlll og Xmal, og gelrensing av det ca. 8,0 kb store vektorfragment. Så ble de tre DNA-fragmenter ligert ved å bruke standard-prosedyren beskrevet ovenfor. Ligeringsreaksjonen ble brukt til å transformere E. coli K12 stamme MM294. Plasmider ble isolert fra de selekterte transformanter, og plasmid pXX-11 ble identifisert ved sitt restriksjonskart (fig. 8). XPR2-prorennindelen av dette plasmid ble sekvensert for å bekrefte den riktige sekvens av det syntetiske DNA og den riktige forbindelse av de ønskede fragmenter.

Y. lipolytica ATCC 2 0774 ble så transformert med SnaBI-spaltet pXX-11 til å gi Y. lipolytica 20778, og prorennin som var sekretert inn i kulturmediet ved de transformerte kulturer, ble bestemt som beskrevet ovenfor i tilfellet med pLS-3. Tilstedeværelse av prorennin i kultursupernatanten ble bekreftet i henhold til prosedyren beskrevet ovenfor.

Melkesammenløpings-assays (se ovenfor) viste at det var signifikant melkesammenløpingsaktivitet i kultursupernatanten av transformanter ATCC 2 0778 som inneholdt pXX-11.

EKSEMPEL 2

Konstruksjon av " docking platform"

Villtype-BIO-genet som tilsvarte bio-6-allelet i ATCC 20774, ble klonet ved komplettering som følger. Et genbibliotek av partiell Sau3A-spaltet Y. lipolytica kromosomal DNA innfelt i BamHI-setet i pLD40 (som er pBR322 pluss LEU2 ved EcoRI-setet) ble konstruert, og en stor mengde av DNA-biblioteket ble fremstilt som et blandet-kultur-E. coli-plasmidpreparat. (Dette er det samme bibliotek som ble brukt til å klone XPR2-genet). Flere mikrogram av DNA-biblioteket ble spaltet med enzymet Apal (som kutter én gang i LEU2-området). Så ble denne DNA brukt til å transformere ATCC 20774 (leu2 xpr2 bio), med transformasjonsblandingen platet ut på syntetisk medium som manglet leucin.

Man fikk ti-tall av tusener av leucin-uavhengige transformanter. For å finne hvilke, hvis noen, kolonier som inneholdt bibliotekplasmider som inkluderte BIO-genet, ble leucin-uavhengige transformanter replika-platet på agarplater som inneholdt biotin-seleksjonsmedium (oppskrift pr. liter: 25 mg destiobiotin, 20 g glukose, 5 g ammoniumsulfat, 1 g KH2P04, 0,5 g MgS04.7H20, 0,1 g CaCl2, 0,1 g NaCl, 500 fig borsyre, 400 fig thiamin.HC1,

400 fxg ZnS04.7H20, 400 fig MnS04.H20, 200 iig Na2Mo04. 2H20,

200 fig FeCl3.6H20,, 100 ug Kl og 40 ug CuS04.5H20).

Én av flere Y. lipolytica BI0+ transformanter for vekst på biotin-seleksjonsmedium ble kalt DL31. Vi gikk så videre i prosedyren for å utvinne genbibliotekplasmidet som inneholdt BIO-<g>enet fra Y. Lipolytica stamme DL31. Kromosomal DNA ble fremstilt fra en kultur av stamme DL31. Noen få mikrogram av dette kromosomale DNA

ble spaltet med restriksjonsenzymet Apal for å fjerne bibliotek-plasmidet. En alikvot av det spaltete DNA ble brukt i en ligerings-reaksjon for å sirkularisere det ukjente bibliotekplasmid. Ligeringsblandingen ble så brukt til å transformere en E. coli-kultur for ampicillinresistens for å innføre det ukjente BIO-inneholdende plasmid inn i E. coli. Man fikk noen få ampicillinresistente E. coli-transformanter. Plasmidpreparater i liten skala ble laget på E. coli-transformantene. Restriksjonsfordøyelser av plasmid DNA som ble oppnådd på denne måte, åpenbarte at det ukjente BIO-inneholdende plasmid, som forventet, var ekvivalent med pLD40 med et innført stykke inn i BamHI-setet. Dette plasmid må opprinnelig ha kommet fra vårt genbibliotek og ble kalt pLD51.

Plasmid pLD56 ble dannet som en subklon av pLD51 ved fjerning av LEU2-<g>enet fra pLD51, som følger. En alikvot av plasmid pLD51 ble spaltet med enzymet EcoRI for å fjerne LEU2-området. Det spaltete DNA ble brukt i en DNA-ligeringsreaksjon til å resirkula-risere plasmidet. Så ble en E. coli-transformasjon utført for å klone det mindre BIO-inneholdende plasmid. Én av de ampicillinresistente E. coli-transformanter ble vist å inneholde det for-ventede mindre plasmid, som ble kalt pLD56. Flere restriksjons-spaltete stykker av pLD56 ble laget. Det BIO-inneholdende segment av pLD56, som forekommer som et innfelt stykke ved BamHI-setet i pBR322, var ca. 3,6 kb langt.

Et svært grovt restriksjonskart av det 3,6 kb lange innførte stykke av Y. lipolytica DNA i BamHI-setet i pBR322 (inkludert pLD56) er beskrevet nedenfor med den omtrentlige distanse i basepar fra begynnelsen av det innfelte stykke angitt i paranteser. Størrelse-estimatene ble laget av noen få agarose-geler og er " utsatt for relativt store kvantitative feil: PvuII (800), PvuII

(1200), Pstl (1800), Mlul (2000), Pstl (2300), EcoRV (2700), Ncol

(3200). Til orientering ville Sall-setet i pBR322 komme foran de beskrevne steder, og Hindlll-setet ville følge etter dem).

Stamme ATCC 20774 (MATB leu2- 40 bio- 6 xor2- 1002) ble transformert med intakt pLD56 (pBR322 pluss ca. 3,6 kb av Y. lipolytica-kromosomal-DNA som inneholdt BIO-genet). Tre forskjellige biotin-uavhengige transformanter ble testet for høyfrekvens-transformasjon av Nrul-kuttet (målrettet til pBR322) pLD40 (LEU2 på pBR322) relativt til foreldrestammen for å påvise hvilken som inneholdt et resident pBR322 integrert inn i BIO-området. Alle tre viste høy-frekvenstransformasjon på grunn av integrasjon av pLD40 inn i det residente pBR322. Dette ble bekreftet av Southern-blot-hybridise-ringseksperimenter. Én av de tre opprinnelige Y. lipolytica BIO-transformanter ble kalt DL118 og brukt videre som en DNA-mottaker. Restriksjonskartet ovenfor trenges for å bestemme

i) hva man skulle bruke som BIO-spesifikk hybridiseringsprøve (et

NcoI-PvuII-stykke),

ii) hvilket enzym trengtes for på en korrekt måte å avkutte pLD56-plasmidet (Mlul),

iii) hvilket enzym kuttet bare én gang i pBR322-delen (Clal) og iv) hvilket enzym kuttet ikke i plasmidet i det hele tatt (Apal).

Southern-hybridiseringer av Clal- og Apal-spaltete stykker av DNA fra ATCC 20774 og DL118 (probet med et BIO-fragment) viste, som forventet, at biotin-området av DL118 (når det ble sammenlignet med BIO-området av ATCC 20774) ble avbrutt ved en tilsetning av DNA med en omtrentlig størrelse på PLD56. Nlul-spaltete stykker av DL118-DNA (probet med pBR322) viste videre at tilsetningen hadde samme størrelse som intakt pLD56.

Konstruksjon av ekspresjons/ sekreterinqsplasmid pLX- 34.

Et ekspresjonsplasmid er blitt konstruert, som plasserer prorennin-kodingssekvensen med XPR2-sekreteringssignaler (157 aminosyre-prepro-sekvenser) i nedstrømsretning av LEU2-promoteren. Dette ekspresjonsplasmid demonstrerer at en promoter som er forskjellig fra XPR2-promoteren, kan brukes til å oppnå sekretering av heterologe proteiner. Videre er denne ekspresjonsvektor i stand til å oppnå ekspresjon/sekretering uavhengig av setet for integrering i Y. lipolytica-genomet. Vellykket sekretering av prorennin med en promoter som er forskjellig fra XPR-promoteren demonstrerer muligheten for en ekspresjonsvektor-konstruksjon for identifisering av alternative nye sterke promotere i Y. lipolytica. I tillegg kan denne tilnærming brukes til å få en ekspresjonskultur med to adskilte hybrid-prorennin-gener, én uttrykt ved LEU2-promoteren og den andre ved XPR2-promoteren, integrert på forskjellige steder i verts-genomet.

De eksperimentelle trinn anvendt for konstruksjon av en ekspresjonsvektor som inneholder prorenningenet med alkalisk protease-sekresjonssignaler (157 aminosyre XPR2-prepro-sekvens) uttrykt ved LEU2-<p>romoter-sekvenser. er vist i fig. 13. Konstruksjonen av dette plasmid ble initiert ved fremstilling av et LEU2-promoter-fragment, som inneholdt omtrent 300 basepar av den 5'-utranslaterte sekvens som kommer foran det ATG-translasjonale initierings-kodon av jø-isopropylmalat-dehydrogenase-genet (fig.

12) . 300 bp Hindi11-Foki-DNA-fragmentet som kodet for en 270 bp del av LEU2-promoter-sekvensen ble isolert fra skyttelvektoren pLD40. Dette fragment ble ligert med en 54 bp syntetisk linker med sekvensen

med T4 ligase fulgt av fordøying med Hindlll. De resulterende ligerte sekvenser ble renset ved gel-elektroforese-isolering av det ca. 360 basepar lange Hindlll-Bgll DNA-fragment. Et annet komponentfragment som kodet for resten av XPR2-prepro-sekvensen og de første 152 aminosyrerester av prorennin, ble isolert fra ekspresjonsplasmid pXX-3 3 (fig. 6) ved spalting med Bgll og Xmal, og gelrensing av det resulterende 887 basepar lange DNA-fragment. Et tredje fragment som inneholdt resten av prorennin-genet, XPR2-terminator, og vektorsekvenser, ble fremstilt ved spalting av pXX-33 med Hindlll og Xmal, og gelrensning ved spalting av det ca. 8,0 kb lange vektorfragment. De tre DNA-fragmenter ble ligert ved å bruke standardprosedyren beskrevet ovenfor. Ligeringsreaksjonen ble brukt til å transformere E. coli K12 stamme HB101. Plasmider ble isolert fra transformanter selektert på grunnlag av ampicillin-resistens, og plasmid pLX-34 ble identifisert ved sitt restriksjonskart (fig. 13).

Y»lipolytica ATCC 20794 (DL118) ble transformert med Nrul-spaltet pLX-34 DNA for å gi Y. lipolytica ATCC 20795 (DL251), og prorennin sekretert inn i kulturfluidet ved den leucin-uavhengige transformantkultur ble bestemt som beskrevet ovenfor i tilfellet med pLS-3. Denne transformasjonsprosedyre dirigerte integrasjonen av pLX-34 inn i en pBR322-sekvens tidligere introdusert inn i bio locus i vertskromosomet (beskrevet ovenfor). Integrasjon av pLX-34 ved dette sete ble bekreftet ved Southern-analyse.

Bruk av PLI18 som mottaker.

Southern-hybridiserings-eksperimenter ble gjort som følger: Nrul-spaltete stykker av DNA fra transformanter av DL118 (hybridi-sert med en prochymosinprøve, for eksempel når input-plasmidet var et prochymosin-ekspresjonsplasmid) fjernet input-plasmidet nøyaktig. Noen få nanogram av Nrul-spaltet transformerende plasmid tjente til å sjekke den korrekte størrelse av det hybridiserende bånd. Også Mlul-spaltete stykker (Mlul kuttet ikke i de transformerende plasmider) av DNA fra disse transformanter (probet med 32p-merket pBR322) viste at den residente pBR322-sekvens av DL118 ble avbrutt ved tilsetning av ett eller flere molekyler av det transformerende palsmid. Dette demonstrerte at integrasjon forekom ved det ønskede sete.

Transformant-kultur Y. lipolytica ATCC 20795 (DL251) ble dyrket i YEPD-medium ved 22°C for å fremme ekspresjon av LEU2-promoteren. Tilstedeværelse av prorennin i kultur-supernatantene ble bekreftet ved melkesammenløpings-assay (se ovenfor) av syre-aktiverte kultursupernatanter og verifisert ved immuno-avtrykks-analyse (se ovenfor). Disse resultater viser at dette hybridgen er en uavhengig ekspresjonsenhet i stand til ekspresjon/sekretering når den integreres i et sete som er forskjellig fra XPR2 eller LEU2. Denne egenskap tillater konstruksjon av en ekspresjonskultur med multiple hybridgener som potensielt er i stand til å oppnå forhøyete nivåer av ekstracellulært prorennin.

EKSEMPEL 3

Sekvens av syntetisk gen for human- C5a

Planen som ble brukt til å oppnå bakteriell produksjon av human-anafylatoksin C5a var analog tidligere fremgangsmåter brukt for syntese og ekspresjon av EGT, som beskrevet i europeisk patent-søknad, publ. nr. 147178. Den anvendte konstruksjon av et gen hvor den kodende sekvens for den aktiverte komplement-komponent C5a ble laget syntetisk. Gitt den kjente aminosyresekvens av human-C5a utarbeidet vi et DNA-fragment som kodet for informasjon for sine 74 aminosyrer (figur 9). Den syntetiske gensekvens ble valgt til å maksimere E. coli- og S. cerevisiae-foretrukket kodon-anvendelse og gi mulighet for flere restriksjons-endonuklease-seter for å lette karakterisering. Denne tilnærming ga mulighet for direkte ekspresjon i E. coli av anafylatoksin ved å introdusere et ATG-initierings-kodon for protein-syntese foran tripletten som kodet for den første aminosyre av C5a-polypeptidet. For å forenkle dets innføring i en ønsket orientering inn i plasmid pBR322 ble det syntetiske C5a-gen utformet til å inneholde EcoRI- og Hindlll-restriksjons-endonuklease-gjenkjenningsseter ved dets termini.

For å produsere den resulterende C5a-gensekvens ble to 47-merer syntetisert ved fosforamiditt-metoden og satt sammen inn i et 235 bp langt dobbelttrådet DNA-fragment. C5a-genfragmentet ble innført i pBR322 spaltet på passende måte, og det klonete gen ble identifisert ved restriksjons-spaltingsanalyse av plasmid DNA fra vilkårlige valgte transformanter. Flere C5a-kloner ble så analysert ved DNA-sekvensering for å identifisere en klon med den riktige sekvens. Den påtenkte nukleotidsekvens for C5a-genområdet ble funnet i 2 av de 5 undersøkte kloner.

Bakteriell ekspresjon av human- C5a.

Konstruksjon av C5a-ekspresjonsplasmidene ble initiert ved spalting av C5a-subklonen med restriksjons-endonuklease EcoRI, fulgt av defosforylering ved behandling med bakteriell alkalisk fosfatase. Ved å bruke et 360 bp langt EcoRI-DNA-fragment fra pPFZ-R2 som inneholdt trp-promoter-operatoren og ribosom-bindings-setesekvenser, ble et C5a-ekspresjonsplasmid konstruert. Kompetente celler av E. coli stamme HB101 ble transformert med ligeringsreaksjonen. Flere medisin-resistente kolonier fra hver transformasjon ble renset, og deres plasmid-DNA- ble utsatt for restriksjons-endonuklease-kartleggingsanalyse for å identifisere dem som hadde trp-promoteren i en orientering som ville resultere i transkripsjon av C5a-genet. Multiple isolater fra denne ligerings-reaksjon ble identifisert med plasmider som inneholdt anafylatoksin-genet til-støtende den bakterielle promotersekvens i konfigurasjonen som krevdes for direkte ekspresjon av C5a. Et restriksjonskart for C5a-ekspresjonsplasmid pC5a-48 er illustrert i figur 10.

Ekspresjon oa sekretering av human- anafylatoksin i Y. lipolytica

Ekspresjons/sekreteringsvektor pC5aX-3 som koder for sekretering av human anafylatoksin C5a, ble fremstilt ved å bruke teknikker som fremsatt i eksempel 1 for pXX-33, vist i fig. 11.

Y. lipolytica ATCC 20774 ble så transformert ved hjelp av denne sekreteringsvektor og det humane C5a produsert ved de transformerte kulturer bestemt som beskrevet ovenfor, med unntak av at geite-anti-C5a og kanin-anti-geite-IgG ble brukt i immunoblot-prosedyren. For plasmidet beskrevet i dette eksempel ble tilstedeværelse av C5a i kultur-supernatanten bekreftet.

Konstruksjon av ekspresjons/ sekreteringsplasmid pC5aX- 3.

De eksperimentelle trinn for konstruksjon av anafylatoksin-ekspresjons/sekreteringsplasmid pC5aX-3 er vist i figur 11. Dette plasmid inneholder sekvensen for "fullstendig" XPR2-<p>romoter og 157 aminosyrerestsignalet og pro-peptidet forenet med en syntetisk sekvens som koder for de 74 aminosyrerester av C5a. Konstruksjonsplanen anvendt til pC5aX-3 var lik den som ble anvendt til pXX-33. Først ble plasmidet pXHP-24 (eller et annet plasmid som inneholdt den ønskede sekvens) spaltet med Hindlll og Aval, og det 1150 basepar-fagment som inneholdt XPR2-promoteren ble gelrenset.

Et annet fragment som inneholdt 3'-enden av XPR2-pro-peptidet og den C5a-strukturelle genfrekvens, ble dannet ved en standard-ligeringsreaksjon ved å anvende det ca. 220 basepar lange Hinfl-HindIII-DNA-fragment fra E. coli-ekspresjonsplasmid pC5a-48 og det syntetiske fragment med sekvensen

med T4-ligase fulgt av spalting med Aval og Hindlll. De resulterende ligerte sekvenser ble renset ved gel-elektroforese ved å selektere det omtrent 250 basepar lange Aval-Hindlll fragment. Hindlll-Aval-fragmentet som inneholdt promoteren og Aval-Hindlll-fragmentet som kodet for C5a, ble så ligert med T4-ligase fulgt av spalting med Hindlll. Det ca. 1,4 kb lange fragment ble gelrenset og brukt i en ligering med Hindlll-spaltet pterm 4 (beskrevet ovenfor) . Ligeringsreaksjonen ble brukt til å transformere E. coli K12 stamme MM294. Plasmider selektert for ampicillinresistens ble isolert fra de selekterte transformanter, og plasmid-pC5aX-3 ble identifisert ved sitt restriksjonskart. Y. lipolytica stamme PC-30869, ATCC 30774, ble så transformert med SnaBI-spaltet pC5aX-3, og anafylatoksin sekretert inn i kulturmediet ved de transformerte kulturer ble bestemt som beskrevet ovenfor. Tilstedeværelse av C5a i kultursupernatanten ble bekreftet ved prosedyren beskrevet ovenfor.

Det er erkjent at mange proteiner syntetisert ved ribosomer bundet til det endoplasmiske reticulum, produseres som glyko-proteiner. Faktisk kan glykosylering påvirke sekreteringen av et gitt protein. N-bundet glykosylering av eukaryotiske proteiner forekommer ved tripeptidsekvensene asparagin-X-threonin og asparagin-X-serin, hvor X kan være enhver aminosyre unntatt muligens aspartat (Hubbard, S., et al. 1981, Ann. Rev. Biochem.

50; 555). Aminosyresekvensen til prorennin inkluderer to slike tripeptid-sekvenser, imidlertid viste gelelektroforetisk analyse av prorenninet, sekretert i Y. lipolytica-kulturer, ikke noe tegn på glykosylering. I andre sekreterte eukaryotiske proteiner er ikke alle asparagin-X-threonin/serin-seter glykosylert. Det er sann-synlig at noen asparaginer i tripeptidsekvensen ikke er glykolysert fordi de er utilgjengelige for glykosylerings-enzymene.

I tilfellet med human-C5a inkluderer aminosyresekvensen et enkelt glykosyleringssete eller en tripeptidsekvens (Asn-Ile-Ser), som normalt har et komplekst oligosakkarid festet til asparagin (N. Fernandez et al. 1976, J. Immunol. 117, 1688) en del av C5a-molekylene sekretert inn i Y. lipolytica-kulturmediet viser seg å være glykolysert fordi et bredt område av antigen virkning sees i høymolekylærvektdelen av immuno-avtrykket. Denne heterogene elektroforetiske mobilitet er analog med den som er observert med andre sekreterte proteiner og er sannsynligvis forårsaket av varierende grader av karbohydrat-tilsetning. I den foreliggende beskrivelse antyder den tilstedeværende glykolysering av noen sekreterte heterologe proteiner at Y. lipolytica-ekspresjon og -sekretering vil kunne anvendes for produksjon av mange normalt glykolyserte eukaryotiske proteiner.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et heterologt protein ved hjelp av en Y. lipolytica-kultur, karakterisert ved at den omfatter: (i) å innføre i nevnte Y. lipolytica en ekspresjons-vektor som omfatter DNA som koder for et protein som er heterologt med Y. lipolytica, og, operabelt knyttet til dette, promotersekvensen av XPR2- eller LEU2-genet fra Y. lipolytica, signalsekvensen og eventuelt prol- og/ eller pro2-sekvensen fra XPR2-<g>enet fra Y. lipolytica, samt terminatorsekvensen fra XPR2- eller LEU2-genet fra Y. lipolytica; (ii) å dyrke den således produserte Y. lipolytica-transformant i (i) i et passende næringsmedium; og (iii) å utvinne det heterologe protein.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at genet for prorennin eller humant anafylatoksin C5a innfelles mellom promoter- og terminatorsekvensen i XPR2-genet.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av prorennin, karakterisert ved å dyrke en Y. lipolytica-transformant med deponeringsnummer ATCC 2 0780, i et passende næringsmedium.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av prorennin, karakterisert ved å dyrke en Y. lipolytica-transformant med deponeringsnummer ATCC 20779, i et passende næringsmedium.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av prorennin, karakterisert ved å dyrke en Y. lipolytica-transformant med deponeringsnummer ATCC 2 0778, i et passende næringsmedium.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av humant anafylatoksin C5a, karakterisert ved å dyrke en Y. lipolytica-transformant med deponeringsnummer ATCC 20777, i et passende næringsmedium.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av prorennin, karakterisert ved at den omfatter å dyrke en Y. lipolytica-transformant med deponeringsnummer ATCC 20795, i et passende næringsmedium.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av prorennin eller humant anafylatoksin C5a i henhold til krav 1, karakterisert ved at Y. lipolytica-transformanten omfatter et område med homologi til heterolog vektor DNA, idet nevnte område omfatter eksogen DNA som tjener som resipient-punkt under integrerende transformasjon av nevnte Y. lipolytica.

9. Plasmid pXX33 (fig. 6), karakterisert ved at det inneholder DNA-sekvensen for, og kan uttrykke,, prorennin og human-anafylatoksin C5a ved hjelp av en Y. lipolytica-kultur.

10. Plasmid pXX22 (fig. 7), karakterisert ved at det inneholder DNA-sekvensen for, og kan uttrykke, prorennin og human-anafylatoksin C5a ved hjelp av en Y. lipolytica-kultur.

11. Plasmid pXXll (fig. 8), karakterisert ved at det inneholder DNA-sekvensen for, og kan uttrykke, prorennin og human-anafylatoksin C5a ved hjelp av en Y. lipolytica-kultur.