NO830780L - Uttrykking, behandling og sekresjon av heterologt protein av gjaer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse er generelt rettet mot rekombinant DNA teknologi som utnytter gjær-vert systemer og ekspresjonsbefordrere som uttrykker, behandler og utskiller heterologt protein, som avsondret produkt uten ledsagelse av uønsket forløpersekvens eller annen ekspresjonsuregelmessighet.

Den oppdagelse som foreliggende oppfinnelse er basert på,

er det første tilfellet hvor et protein som vanligvis er heterologt for en gjærvert, er utvinnbart i nyttige mengder fra mediet som forsørger gjærkulturen, idet det er blitt uttrykt, behandlet og utskilt av gjærorganismen på en måte som etterligner dens fremstilling i naturlig celleomgivelser. Foreliggende oppfinnelse er følgelig er resultat av den vellykkede manipulering av ekspresjonsbefordrere og gjær-vert, for å styre syntesen av protein som vanligvis ikke syntetiseres av gjærverten, og særlig å regulere gjærverten for å bringe proteinet under styring av dens sekresjons-

spor. Foreliggende oppfinnelse er følgelig rettet mot midlene, og fremgangsmåtene for å erholde nyttige mengder heterologt protein fra mediet til en gjærkultur med leve-nyttige celler som inneholder ekspresjonsbefordrere med DNA som koder for proteinet. Det er en enorm fordel at

man ved hjelp av foreliggende oppfinnelse settes i stand til å erholde nyttige, avsondrede proteinprodukter i celle-kulturmediet, og derved fjerner behovet for å måtte ty til cellelyset for å utvinne produkter som hittil bare har vært tilgjengelig fra celleinnholdene, ofte i en uferdig form.

De publikasjoner og annet materiale som det her refereres

til for å belyse bakgrunnen for oppfinnelsen, og i spesielle tilfeller for å gi ytterligere detaljer med hensyn til dens praktisering, er her tatt med som referanser og er for be-kvemmelighets skyld henvist til med tall, og samlet i den tilføyde bibliografien.

Gjærorganismer transporterer naturlig et lite antall av visse homologe proteiner til og noen ganger gjennom plasmamembranen, som et vesentlig bidrag til vekst i celleoverflaten og cellemetabolismen. Når cellen knoppskyter i forbindelse med reproduksjonsforberedelse til dannelse av en datter-celle, kreves det ytterligere proteiner for dannelse av cellevegg og plasmamembran samt til metabolisme. Noen av disse proteinene må finne veien til sitt funksjonssted, følgelig antas det å foreligge et sekresjonsspor (1).

Visse homologe proteiner involvert i de ovenfor nevnte pro-sessene, dannes ved translasjon i det endoplasmatiske reti-kulum. Homologe proteiner er de som vanligvis fremstilles av gjærartene, og som kreves for deres levedyktighet.

Når de først er dannet, forflytter de seg ved hjelp av enzymatisk overføring til Golgi-apparatet, deretter innenfor hulrom til plasmamembraner hvor noen bindes, eller i noen grad trenger gjennom og inn i rommet mellom plasmamembranen og celleveggen. Et lite antall homologe proteiner ser ut til å utføres fullstendig gjennom celleveggen, slik som a-faktor, og "killer"-toxin (2, 3).

Igjen synes knoppskytingsområdet i cellen å være tiltrek-ningsstedet for vesiklene, og ved hjelp av deres sammen-smelting med den indre overflaten i knoppen, bidrar de til den totale veksten for plasmamembranen, og ventelig for celleveggen, (4, 5, 6). Denne teori gir ikke noe bevis for at sekresjon eller forflytning av protein(er) gjennom mem-branen faktisk finner sted. På samme måte er det fremde-les omstridt hvorvidt glykosylering av, proteinet kan bidra til, eller er innbefattet i, den såkalte sekresjonsprosessen. Videre antas "utskilte"-proteiner pr. definisjon å ha et signal-forløperpeptid som er postulert å være forbundet med transport- eller innlemmingsprosessen ved membranover-flaten. Den eventuelle virkningen av slike modifikasjoner av det komplette proteinet i sekresjonsprosessen og den totale betydning av sekresjonssporet for overflatevekst, er spekulasjoner som ikke er basert på sikre bevis.

Det ble studert på om rekombinant DNA teknologi kunne gi verdifulle bidrag til å svare på de åpne spørsmålene vedrør-ende sekresjonsprosessen hos gjærorganismer, i betraktning av dens beviste anvendelighet til å muliggjøre slikt, få organismer til å produsere store mengder heterologe poly-peptidprodukter endogent (se f.eks. 7-17) ved å utføre: passende manipulering av gjærverten for å styre sekresjonen av heterologt protein i avsondret, komplett form.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den oppdagelse at gjærorganismer kan bringes til å uttrykke, behandle og utskille protein som vanligvis er heterologt for gjærorganismen, og som ikke kreves for dens levedyktighet, slik at proteinet kan erholdes fra mediet som forsørger de levedyktige, produserende gjærcellene i avsondret form, uten ledsagelse av uønsket polypeptid-forløpersekvens, eller annen ekspresjonsuregelmessighet. Passende gjærceller i en levedyktig kultur transformeres ved hjelp av ekspresjons-fordrere med DNA som koder for et heterologt protein, og et heterologt signal-polypeptid. Etter ekspresjon av proteinet sammen med det heterologe signal-polypeptidet, behandles ekspresjonsproduktet og det komplette heterologe proteinet føres ut i mediet til cellekulturen. Produktet fjernes forholdsvis lett fra mediet uten behov for øde-leggende forstyrrelse av de levedyktige gjærcellene, og utvinnes i en ellers naturlig form for bruk uten behov for å fjerne uønsket forløpersekvens, ellér andre uregelmessig-heter fra ekspresjonen (f.eks. metioninet knyttet til den ellers første aminosyren i N-enden som er, en ekspresjonen konsekvens av AUG-startsignalkodonet for translasjon). Mediet kan følgelig erholdes i en form som i det vesentlige er fri for levedyktige ellerødelagte (dvs. lyste eller på annen måte oppløste) celler, og som, under forut-setning av at det inneholder det ønskede produkt-,- er mot-tagelig for rensingsteknikker som lett lar seg utføre. Etter rensing, er et slikt produkt klar til den påtenkte bruk. F.eks. brukes menneske-leukocyttinterferon-produkt som et antiviralt og/eller anti-tumor middel for mennesker.

(Se generelt 7 til 17) .

Kortfattet omfatter den foreliggende oppfinnelse et protein som vanligvis er heterologt for en gjærorganisme, og som ikke kreves for dens levedyktighet, i avsondret form uten ledsagelse av polypeptid-forløpersekvens eller annen ekspresjonsuregelmessighet, som et produkt av uttrykking, behandling og sekresjon hos gjær, samt midlene og fremgangsmåtene som anvendes for å fremstille slikt protein. Videre tilveie-bringer foreliggende oppfinnelse gjærkulturer som er istand til å fremstille slikt protein, og resulterende gjærkultur-media som inneholder slikt protein som produkt.

Med uttrykket "heterologt protein" slik det herder brukt, menes det protein som vanligvis ikke fremstilles av eller kreves for levedyktigheten til en gjærorganisme. Dette be-grepet forutsetter den virksomme innføring av DNA som kode for slikt protein, via rekombinant DNA teknologi, i en ekspresjonsbefordrer som igjen brukes til å transformere en gjærorganismevert. Virksom innføring av DNA betyr igjen innføringen av DNA som koder for det heterologe proteinet og forløpersekvensen i en ekspresjonsvektor under kontroll av ekspresjonsstyrende promotorsystemer. Eksempler på

slike heterologe proteiner er hormoner, f.eks. menneske-veksthormon, okse-veksthormon, etc; lymfokiner; enzymer; interferoner, f.eks. menneske-fibrablast, menneske-immun-

og menneske- og hybrid-leukocyttinterferoner, etc.; virus antigener eller -immunogener, f.eks. munn- og klovsyke antigener, influensa-antigenisk protein, hepatittis kjerne-og overflateantigener, etc.; og forskjellige andre polypeptider, f.eks. menneske-serum albumin, menneske-insulin, forskjellige glykoproteiner, etc. "Heterolog forløperse-kvens" eller "heterologt signalpolypeptid" refererer seg til slike polypeptider som vanligvis ikke fremstilles eller anvendes av et gjærsystem, og kan velges fra det naturlige signalpolypeptidet for det aktuelle heterologe proteinet

eller andre heterologe "signal"-polypeptider som er funksjo-nelt knyttet til det aktuelle heterologe proteinet.

"Sekresjon" betyr, slik det her er brukt, utførselen av produkt gjennom plasmamembranet, og i det minste inn i eller gjennom celleveggen hos gjærorganismen og inn i mediet som forsørger cellekulturen. I denne sammenheng vil det forstås at det "utskilte" produkt i noen tilfeller er forbundet på en eller annen måte med celleveggen, noe som kanskje nødvendiggjør en annerledes rensingsfremgangsmåte eller en modifikasjon av strukturen og funksjonen til gjærverten. "Behandling" betyr den cellulære avspalting av signalpolypeptidet fra det komplette protein for å fremstille proteinet uten ledsagelse av fremmedpeptid i såkalt avsondret, komplett form. Med fremmedpeptid er det også ment peptid-uregelmessigheter fra ekspresjonen, slik som meteonin som nevnt ovenfor. Behandling tillater uvesentlig spalting av signal polypeptiden på et stéd som ikke ligger inaktiver-ende nært det nøyaktige punktet for foreningen mellom signa-polypeptidet og det komplette proteinet.

Fig. 1 viser en sammenligning av aminosyresekvensen til signal-forløper peptidet til menneske IFN-ctl, (pre D) ,

-IFN-a2 (pre A),-IFN-al,2 (pre D/A), -IFN-y (pre y), og -IFN-3 (pre 3). Aminosyrene som er understreket, utgjør forskjeller mellom aminosyresekvensene til pre A og pre D. Ddel-stedet angir foreningen mellom D og A forløpersé-kvensene ved fremstillingen av den hybride pre D/A forløper-sekvens. Fig. 2 er et diagram over gjærens ekspresjonsplasmid YEpIPT, som her er brukt som en generell; befordrer for ekspresjon av forskjellige geneinnskudd, og som viser noen av dets restriksjonssteder og forskjellige områder av interesse. Fig. 3 viser oppbyggingen av et EcoRI fragment som inne holder forløper-pluss IFN-al genet for direkte ekspresjon av IFN-al i gjær. Fig. 4 viser oppbyggingen av et EcoRI fragment som inneholder det komplette IFN-ct2 genet for direkte ekspresjon i gjær. Fig. 5 viser oppbyggingen av et EcoRI fragment som inneholder forløper-pluss IFN-a2 genet med sekvensen som koder for de første 14 aminosyrene i forløperfrekvensen pre-IFN-al, for direkte ekspresjon av IFN-a2 i gjær. Fig. 6 viser oppbyggingen av et EcoRI fragment som inneholder forløper-pluss IFN-y genet med en 7 0 basepar stor styringssekvens forut for ATG initieringskodonet for ekspresjon av IFN-y i gjær. Fig. 7 viser oppbygginen av et EcoRI fragment som inneholder forløper-pluss IFN-y genet for den direkte ekspresjonen av IFN-y i gjær. Fig. 8 gir en oppsummering av alle oppbygningene som er brukt for å praktisere den foreliggende oppfinnelse ved ekspresjonen, behandlingen og sekresjonen av de forskjellige IFN-genene igjær.

Fig. 9 er en vekstkurve for a) YEplPT.LeIFAl/pep4-3 og

b) YEplPH-preIFA53t/pep4-3 målt ved hjelp av absorbsjon ved 660 my. Media ble analysert på interferonaktivitet for a) og for b) ved å bruke en biologisk analyse. Tiden refererer seg til veksttimer ved 30°C. Fig. 10A er en vekstkurve for 5 liter gjæringsvæske med YEplPT.preLeIFA53t/pep4-3. (0) er Abs66Qmy og (0) millio-ner enheter pr. liter med interferonaktivitet innen cellene. Fig. 10B er den samme vekstkurve som definert i fig. 10A, som illustrerer aktivitet fra mediene.

Fig. 11 er en elueringsprofil av mediaforløper D/A LelF

fra en kolonne med monoklonalt antistoff.

Fig. 12 er HPLC-undersøkelsen av den interferonmengden fra kolonnen med monoklonalt antistoff som ga toppen A. Fig. 13 er resultatet av aminosyre-sekvensering av produktet erholdt etter HPLC-rensing. Fig. 14 skildrer de forskjellige oppbygninger som anvendes for å fremstille menneske-veksthormon (HGH) i overensstemmelse hermed. Fig. A illustrerer skjematisk restriksjonskartet for den 3,1 kg basepar store Hind III-innføringen av vektor pBl fra hvilken PGK-promotoren ble isolert. Innføringen av et EcoRI-sted og et Xbal-sted i den 5 *-tilgrensende DNA

hos PGK-genet.

Fig. B illustrerer den 5<1->tilgrensende sekvens pluss den første kodende sekvens for PGK-genet før innføring av et Xbal og EcoRI-sted. Fig. C illustrerer skjematisk teknikken som anvendes for å innføre et Xbal-sted ved posisjon -8 i PGK-promotoren,

og for å isolere et 3 9 basepar stort fragment av den 5'-tilgrensende sekvens hos PGK som inneholder denne Xbal-enden og en Sau3A-ende.

Fig. D illustrerer skjematisk oppbyggingen av et 300 basepar stort fragment som inneholder den ovenfor nevnte fragmentet med 39 baserpar, og dertil PGK 5<1->tilgrensende sekvens (265 basepar) fra Pvul til Sau3A (se fig. A),

og et EcoRI-sted grensende opp til Xbal.

Fig. E illustrerer skjematisk oppbygningen av det 1500 basepar store PGK promotorfragmentet ( Hind III/ EcoRI) som inne holder i tillegg til det i fig. 4 oppbygde fragmentet, et 1300 Hindlll til Pvul fragment fra PGK 5'-merket-tilgrensende sekvens (se fig. A).

Materiell.

Anne enzymer for DNA restriksjon og metabolismen ble levert av New England Biolabs og av Bethesda Research Laboratories. Restriksjonsenzymer for DNA og metabolske enzymer ble brukt under betingelser og i buffere foreskrevet av deres respek-tive fabrikkanter. ATP og deoksynucleotid trifosfåtene dATP, dGTP, dCTP og dTTP ble levert av PL Biochemicals.

DNA sammenkoblere ble fremstilt ved hjelp av standard fremgangsmåter.

DNA fremstilling og transformasjon.

Rensing av kovalente, lukkede, sirkulære plasmid DNA-er

fra E. Coli (18) og transformasjon av E. Coli (19) ble utført i overensstemmelse med tidligere beskrevne fremgangsmåter. Miniscreen av E. coli var som beskrevet i (20). Transformasjon av gjær ble utført som tidligere beskrevet (21), imidlertid med de følgende modifikasjoner. 200 ml celler ble brukt ved 2 x 10<7>celler pr. ml, og vasket med

25 ml H20 under sentrifugering. Disse celler ble behandlet med 10 ml IM sorbitol, 25 mM EDTA (pH=8) og 5 0 mM ditiotrei-tol i 10 minutter ved 30°C etterfulgt av en 10 ml vask med IM sorbitol. Pelleterte celler ble så forsiktig suspendert på nytt i 10 ml SCE (IM sorbitol, 0,1M natriumsitrat, pH=5,8, og 0,01M EDTA) og behandlet ved 3 0°C med 2 00 yg zymoliase 60.000 (Kirin Brewery). Sferoplasting ble fulgt til 80% ved å tilsette 100 yl av suspensjonen til 0,9 ml av 10% SDS og måle AbSgQQm ,idet det ble brukt en fortynning av celler før tilsetning av enzymet som 0% (lyse i den 10% SDS resulterer i et fall i AbSgQg). Cellene ble deretter vasket 3 ganger med 10 ml IM sorbitol. Celler kan lagres flere dager ved 0°C i sorbitolen. Cellene ble så vasket en

gang med IM sorbitol, 10 mM CaCl2, og 10 mM Tris-CHl (pH 7,4) og så suspendert på nytt i 1 ml av det samme. 5 til •15 yg renset plasmid DNA eller 20 yl E. coli avledet miniscreen DNA (2/5 av plasmid DNA fra en 5 ml stasjonær kultur av E. coli dyrket i LB) ble så tilsatt og forsiktig blandet med 100 yl av de resuspenderte cellene i 15 minutter. Så ble 1 ml av en oppløsning som inneholdt 20% (vekt/volum) polyetylenglukol 400 (Baker), 10 mM CaCl2, og 10 mM Tris-HC1 (pH 7,5) tilsatt under forsiktig blanding i 15 minutter. Cellene ble så sentrifugert ned og forsiktig resuspendert i 200 yl SOS (IM sorbitol, 33,5% (volum/volum) i EPD dyrkingsvæske, og 6,5 mM CaCl2), og inkubert ved 30°C i 20 minutter. 100 yl av denne suspensjonen ble så plassert på en petriskål som inneholdt 20 ml bunnagar (182 g sorbitol, 20 g glukose, 6,7 g YNB, og 30g Difco agar pr. liter H20) og dekket med 10 ml 50°C toppagar (samme som bunnagar men med 1 ml adenin) 1,2 mg/ml), 1 ml uracil (2,4 mg/ml), og 1 ml -trp utløserblanding pr. 50 ml bunnagar [-trp utløserblanding inneholdende disse aminosyrene pr. 100 ml Hz „0: 0,2 g arg1,), 0,lg his, 0,6g ile, 0+,6g leu, 0,4g lys, 0,lg met, 0,6g phe, 0,5gthr]. Denne Trp seleksjon gir 3 4 10 til 10 gjærtransformanter pr. yg plasmid DNA.

Gjærplasmid ble erholdt fra gjær ved å dyrke 15 ml gjær til stasjonær fase (Abs^g - 5-6) i YNB+CAA (se Stammer og media nedenunder) ved sfæroplasting som i fremgangsmåten ovenfor, ved pelletering av celler, og ved å anvende E. coli miniscreen fremgangsmåten (uten lysoxym) som beskrevet

i (20).

Plasmiders stabilitet i gjær ble bestemt ved å fortynne celler under selektiv dyrking i YNB+CAA og utplating på YEPD plater (ikke-selektivt). Etter 2 dagers dyrking ved 30°C, ble disse platene replica-utplatet til YNBiCAA plater (Trp<+>seleksjon). Den prosentvise plasmidstabilitet ble beregnet ved hjelp av antall kolonier som vokser ikke-selektivt minus de som ikke vokser selektivt, dividert med antall kolonier dyrket ikke-selektivt multiplisert med 100.

Stammer og media.

E. coli K-12 stamme 294 (ATCC nr. 31446) (22) ble brukt til alle de øvrige bakterietransformasjoner. Gjærstammene pep4-3 (20B-12, d trpl pep4-3) (23) og GM3C-2 (a, leu 2-3, leu 2-112, trp 1-1, his 4-519, cyc 1-1, cyj33,1) (24) ble brukt til gjær transformasjoner. Gjærstammene 20B-12 og GM3C-2

er deponert uten restriksjoner hos the American Type Culture Collection, med henholdsvis ATCC nr. 20626 og 20625, begge den 5. mars 1982. forskjellige gjærstammer kan anvendes, se Lodder et al., The Yeasts, a Taconomic Study, North-Holland Publ. Co., Amsterdam. På samme måte kan forskjellige media anvendes, se Difco Manual of Dehydra-ted Culture Media and Reagents for Microbiological and Cli-nical Laboratory Procedures, 9. utg., Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan (1953).

LB var som beskrevet av Miller (25) med tilsetning av 20 yg/ml ampicillin (Sigma) etter at media er autoklavert og avkjølt. Gjær ble dyrket på de følgende media: YEPD som inneholdt 1% gjærekstrakt, 2% pepton og 2% glukose ± 3% Difco agar. YNB+CAA som inneholdt 6,7 g gjær-nitrogenbase (uten aminosyrer) (YNB) (difco), 10 mg adenin, 10 mg uracil, 5 g Difco casaminosyre (Caa), 20 g glukose og ± 30 g agar pr. liter (brukt til Trp<+>seleksjon).

Vekstkurve og ekstraktfremsti11ing.

Adskilte kolonier av gjærstammene YEpIPT-preLeIF-A 53t/pep4-3 og YEpIPT-LeIF-A i/pep4-3 ble dyrket i 7 timer ved 30°C i 100 ml YNB+CAA til en Ag60på ca. 1,1^..

100 ml av disse kulturene ble fortynnet til 1 liter med YNB+CAA, hvorved man fikk en oppløsning med A^^q på o,l. Disse 1 liter kulturer ble så dyrket ved 30°C og 10 ml

aliquoter ble tatt ut med jevne mellomrom for å måle optisk densitet, interferonfremstilling og -sekresjon. For analyse ble hver 10 ml aliquot sentrifugert ved 7 K opm i 15 minutter i en "Sorval RC3B". Supernatanten (media)

ble analysert uten fortynning. Cellene ble resuspendert i 0,4 ml 7M guanidin-HCl som inneholdt et like stort volum med glasskuler og virvelbehandlet to ganger i to minutter ved høy hastighet. Cellelysatet ble så fortynnet i PBS/ BSA (150 mM NaCl, 20 mM natriumfosfat (pH=7,9), og 0,5% okse-serumalbumin) for biologisk analyse.

Interferon- analyser.

Ekstrakter av gjær ble analysert for interferon ved å sammenligne med interferon standarder ved hjelp av inhi-ber ingsanalysen av cytopatisk virkning (CPE) (26). Gjær-ekstrakter ble fremstilt på følgende måte: 10 ml kulturer ble dyrket i YNB+CAA inntil man nådde A6g0_ tilnærmet lik 1-2. Celler ble samlet opp ved sentrifugering og så resus— pendert i 3 ml med 1,2 M sorbitol, lOmM Kf^PO^, pH=6,8 og 1% zymolyase 60,000, deretter inkubert ved 30°C i 30 minutter (til 90% spheroplasting). Sferoplaster ble pelletert ved 3000 x g i 10 minutter, deretter resuspendert i 150 yl 7M guanidinhydroklorid (GHC1) pluss 1 mM fenylmetylsulfonyl-fluorid (PMSF).Ekstrakter ble fortynnet 20 til 100 ganger i PBS/BSA buffer (20 mM NaH2P04, pH=7,4, 150 mM NaCl, 0,5% BSA) umiddelbart før analysen. Alternativt ble 10 ml celler ved den samme<A>660pelletert og resuspendert i 0,4 ml 7M GHC1 i etEppendorf (1,5 ml) rør som inneholdt ca. 0,4 ml glasskuler (0,45 til 0,5 mm), B. Braun Melsurgen AG). Disse rørene ble virvelbehandlet 2 ganger i 2 minutter ved høyeste virvelhastighet, idet de ble holdt på is i mellom-tiden. Ekstraktene ble sentrifugert 0,5 minutter i Eppen-dorf sentrifuge og fortynnet i PBS/BSA buffer so_m ovenfor. Bioanalyser ble utført med MDBK celler (26) for LelF A, LelF D, og for løper formene, men med HeLa celler (26) for INF-y og for løperIFN-y.

Rensing av ( forløper D/ A) LelF A fra mediene.

En enkelt koloni med gjær stamme YEpIPT-preLeIF-A 53t/pep4-3 ble dyrket ved 30°C i 500 ml YNB+CAA til en & 66Q på 2,4.

500 ml av denne kulturen ble fortynnet til 5 liter med YNB+CAA hvorved man fikk en på 0,21; den resulterende 5 liter kultur ble dyrket ved 30°C inntil Ag60= 4. På dette tidspunkt ble 5 liter-kulturen innhøstet ved sentrifu-ger ing ved 7.000 opm i 10 minutter. 10 ml aliquoter ble tatt ut med jevne mellomrom under dyrkingen for å måle optisk tetthet, interferonfremstilling og -sekresjon.

Før analysen ble hver aliquot sentrifugert i 5 minutter i en avkjølt bordplate-sentrifuge for å separere cellene fra mediene. Mediet og cellene ble analysert som beskrevet ovenfor. (Se fig. 9, 10A, 10B).

Mediene ble konsentrert til et sluttvolum på 200 ml og deretter diafiltrert mot tris/cys/EDTA, pH 8,0 på en 1000 dalton ultrafiltreringsmembran (O-PS, Osmonics) i et "Amicon" apparat med smale kanaler (TCF 10). Det tilbake-holdte (200 ml) ble sendt gjennom en 1,5 ml immunaffinitets-kolonne som inneholdt et monoklonalt antistoff for LeIF-A kovalent bundet til "Affigel 10" (BioRad) med en strøm-ningshastighet på 15 ml/time. Mer enn 80% av interferonaktiviteten i den opprinnelige oppløsning ble bundet i kolonnen. Det som strømmet gjennom, ble på nytt tilført kolonnen med en strømningshastighet på 40 ml/time. Etter den annen tilførsel, ble omtrent 7% av den opprinnelige interferonaktiviteten gjenfunnet i det som strømmet gjennom. Kolonnen ble så vasket med 0,2M NaCl i tris/cys/EDTA, pH 8,0. Omtrent 1,7% av aktiviteten ble eluert ved denne utvasking.

Hovedmengden av interferonaktiviteten (rundt 50% av den opprinnelige aktivitet) ble så eluert fra kolonnen med

51,5 ml pH 5,5 deionisert vann. Kolonnen ble til slutt vasket med 22,5 ml 0,2M eddiksyre for å eluere ethvert gjen-

værende protein, omtrent 8% av den opprinnelige aktivitet ble eluert. Etter eddiksyreelueringen, ble kolonnen på

.nytt ekvilibrert med tr is/cys/EDTA, pH 8,0. Fraksjoner

på 2,25 til 4,5 ml ble samlet opp under vann-, eddiksyre-og tris/cys/EDTA-utvaskingene (Fig. 11). Fraksjonene med nr. 1-7 ble slått sammen og lyofilisert til tørrhet. Resten ble på nytt oppløst i 200 yl 0,1% trifluoreddiksyre (TFA), pH 2,5 og ytterligere renset ved hjelp av HPLC på en "Synchropak RP-P"-kolonne. Kolonnen ble eluert ved en strømningshastighet på 1 ml/minutt med en lineær gradient på 0 til 100% acetonitril i 0,1% TFA, pH 2,5. 1 ml fraksjoner ble samlet opp og analysert etter fortynning i PBS/BSA som beskrevet ovenfor. En 2,5 yg prøve med renset IFN-A ble også kromatografert som en kontroll (Fig. 12). Interferonet eluerte fra kolonnen som en enkel toppsentrert rundt fraksjon 39. Denne fraksjon ble lyofilisert til tørrhet og resten ble sekvensert.

Sekvensanalyser.

Sekvensanalyser ble basert på Edman-degraderingen (27). Prøven ble innført i skålen i et Beckman 890B sekvensappa-rat med roterende skål. Polybren TM (poly N,NfN"'"N^-tetra-metyl - N-trimetylenheksametylendiammoniumdiacetat) ble bruk som en bærer i skålen (28). Sekvensapparatet ble modifisert med en kaldfelle og noen programendring for p redusere bakgrunnstopper. Reagensene var Beckman<1>s se-kvensgrad 0,1 molar Quadrol buffer, fenylisotiocyanat,

og Heptafluorsmørsyre.

En modifikasjon omfattet også automatisk omdannelse av 2-anilino-5-tiazolinon-derivatene etterhvert som de ble ekstrahert fra sekvensapparatet. 1-klorbutanet ble samlet opp i en "Pierce Reacti-Vial TM" og tørket under nitrogen. Så ble 25% trifluoreddiksyre (TFA) i vann tilsatt til 2-anilino-5-tiazolinonet og oppvarmet til 20°C i 10 minutter for å omdanne det til 3-fenyl-2-tiohydantoinet (PTH- derivat) (29). PTH-amihosyreresten ble deretter automatisk oppløst i 50% acetonitril og vann og injisert i en omvendt--fase høytrykksvæskekromatograf. Hver PHT-aminosyre ble så identifisert ved sammenligning med tilbakeholdelsestidene for en standard blanding av PTH-aminosyrer som blé innført i omdannelses-flasken, og behandlet på samme måte som en syklus fra sekvensapparatet. Resultater er oppsummert i fig. 13 og diskutert nedenunder.

" Western" elektroforeseflekk- fremgangsmåte.

Proteiner ble først utsatt for elektroforese på en polyakrylamid plategel i nærvær av natriumdodecylsulfat (46, 47) før elektroforetisk overføring til nitrocellulosepapir (S + S BA 85) og deretter immunologisk identifikasjon av HGH. Over føringsapparatet (Elektroblot, E.C. Apperatus Corp., St. Petersburg, FL) ble montert etter at gelen og nitrocellulosepapiret hurtig var blitt vasket med en overføringsbuffer som inneholdt 25 mM tris, 192 mM glycin, pH 8,4. Overføringen ble utført ved 400 ma i 1,5 timer, hvoretter flekken ble plassert i 50 mM tris pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,25 % gelatin (vekt/volum), 0,05 % NP-40 og rystet forsiktig over natten. En passende fortynning av kanin anti-menneske-HGH antiserum ble plassert i en plastpose sammen med flekken, og NP-40/gelatinbuffer (vanligvis 100 yl/cm 2) og inkubert 2 timer ved værelsestemperatur med forsiktig rysting. Flekken ble vasket hurtig med H2O etterfulgt av NP-40/gelatin i 1 time, og under-søkt med (125 I) protein A (New England Nuclear) fortynnet i NP-40/gelatin buffer i en "Seal-a-Meal"-pose i 1 time ved værelsestemperatur med forsiktig rysting. Etter vasking flere ganger med 1^0, ble flekken innpakket i cellofan og plassert i en kassett over natten med "X-Omat-AR"-film (Kodak) med en forsterkende raster ved -70°C.

Gelfarging.

Polyakrylamid-geler som inneholdt protein ble farget ved hjelp av fremgangsmåten til Oakley et al., (41).

Sekresjonssignal- sekvenser i pattedyr- interferongener.

Med den nylige isolering av cDNA-er som inneholder genene for leukocytt (7), fibroblast (10) og immuninterferoner (30), og den nylige utvikling av gjær som et ekspresjons-system for heterologe gener (14), ble det mulig å prøve ekspresjonen for heterologe gener som inneholder kodende områder for signalpeptid-sekvenser i gjær.

Fig. 1 viser signalsekvensene for 5 forskjellige interferoner. Disse aminoende-sekvensene antas å lette sekresjonen av inter feronproteiner fra pattedyrceller. I løpet av fremgangsmåten, fjernes signalsekvensen ved hjelp av spesifik proteasespalting mellom posisjon -1 og +1, hvorved man får det som er kjent som den komplette form for interferonet. Disse sekvensene har de generelle karakteristika for andre sekresjonssignal-sekvenser (31). De er alle svært hydrofobe, har omtrent den samme mengde som andre signaler, og har en liten aminosyre til venstre for spalt-ingsstedet. Selv om preLelFA, preLelFD og PrelFN-y alle spaltes mellom glycin og cystein, så er dette ikke en generell regel for andre pattedyr-signaler slik det er bevist ved preIFN-8.

I virkeligheten finnes der ingen felles signalsekvens

blant organismer eller innenfor den samme organisme. Der er heller ingen felles sekvens ved spaltingspunktét mellom signalsekvensen og den komplette formen for proteinproduktet.

Det var derfor av stor interesse å prøve ekspresjonen av disse for løper-inter feronene i gjær for å bestemme hvorvidt disse heterologe proteinene ville bli utskilt fra gjær, og hvordan behandlingsmåten for disse proteinene kunne være. .Selv om gjær er en eukariotisk organisme, på samme måte som pattedyrceller, og selv om gjær synes å ha et sekresjonsspor som på mange måter er likt med det til høyre eukario-ter (1,32) er den en svært primitiv eukariot, og den korrekte virkning og behandling av disse geneproduktene ville kreve en høy bevaringsgrad for fremgangsmåten under utviklingsprosessen fra gjær til pattedyrceller, hvis resultater ikke i det hele tatt synes å være slik.

Oppbygging av et gjærplasmid for ekspresjon av foreløper-interferongenene.

Det er publisert informasjon for oppbyggingen av et plasmid til ekspresjonen av et heterologt gen i gjær (14).

Plasmidet som anvendes i dette arbeidet, er vist i fig.2. Dette plasmidet inneholder en del av pBR322 (33) med ampicillin-resistens (Ap ) genet og E. coli-replikasjonsoppha-vet for seleksjon og stabil vekst i E. coli (brukt som et mellomprodukt mellom in vitro oppbygging og transformasjon av gjær). Plasmidet inneholder også TRPI genet på et EcoRI til Pstl fragment som skriver seg fra kromosom III hos gjær (34-36). Dette genet gir anledning til seleksjon av trpl gjær og kan følgelig brukes til å isolere gjærceller som inneholder plasmidet og for opprettholdelse av plasmidet. Videre inneholder plasmidet et gjær,-replika-sjonsopphav på et 2,0 kg basepar stort fragment fra endogen gjær 2 y plasmid DNA (37). Dette opphavet lar DNA repli-kere autonomt i gjær og opprettholeds som et plasmid.

Den andre hovedbestanddel i systemet er gjær-3-fosfoglyce-rat kinase (PGK) promotor framentet som gir opphav til transkripsjon nær det eneste EcoRI stedet i plasmidet (det andre EcoRI stedet ble fjernet ved å bygge opp det innskrenkede stedet under anvendelse av E.coli DNA poly- raerase I (Klenow) etterfulgt av buttende-sammenkobling).

Isoleringen av 3-fosfoglyceratkinase (PGK) genet er diskutert annet steds (37a) og det er også oppbyggingen av det 1,6

kg basepar store promotor fragmentet (se nedenunder). Et Hind III/Bgl II fragment fra gjær TRP 1 gen-området (34-36) av kromosom III ble brukt som en omformer for Hind III til Bgl'; II for sammenkobling med Barn HI stedet til pBR322, hvilket gjorde plasmidet tetracyklinfølsomt (Tc ). Videre skal det nevnes at dét 2,0 kg basepar store fragmentet fra 2 y DNA utøver en annen funksjon ved det at det inneholder et transkripsjonsavslutning/polyadenyleneringssignal som vanglivis er avslutningssignalet for "Able"-genet i 2y-plasmid (37). Et slikt område synes å være vesentlig for god ekspresjon. Geneinnskudd som EcoRI fragmenter i den rette orientering kan så uttrykkes som protein når vektoren plasseres i gjær.

Oppbygning av gjærplasmidet for ekspresjonen av de forskjellige interferon- genene.

Gjær-ekspresjonsplasmidet i YEpIPT inneholder et enkelt EcoRI restriksjonssted. Innføring av et fremmed gen i

dette unike EcoRI stedet fører til ekspresjonen av dette genet under kontroll av gjær-fosfoglyceratkinase (PGK) promotoren. En bekvem måte å innføre de forskjellige interferongenene i EcoRI stedet til dette gjærplasmidet på, er å ha DNA fragmenter med EcoRI steder som grenser opp til oppstartingskodonet og avslutningskodonet hos de forskjellige interferongener. Vi beskriver her oppbyggingen av slike EcoRI fragmenter for ekspresjonen av interferongener. Det er viktig å bruke omformere for EcoRI ved 3'-enden i genet slik at de ikke avslutter transkripsjon men lar transkripsjonen fortsette gjennom til 2 jj termina-toren.

Vi beskrev tidligere oppbyggingen av et EcoRI sted like

foranATGoppstartingskodonet for det komplette IFN-al

genet (14, 17), det komplette IFN-a2 genet (7), det komplette IFN-3 genet (10) og det komplette IFN-y genet (30).

DNA restriksjonsanalyser viser at der er et EcoRI sted passende lokalisert i det 3<1->ikke-kodede området hos cDNA klonen til IFN- la(8), følgelig gir nedbryting av plasmidet pLeIFD3 (17) med EcoRI et 583 basepar stort EcoRI fragment, som inneholder hele IFN-al genet.

Fig. 3 viser oppbygningen av et EcoRI fragment som inneholder pre-IFN-al genet. Et Haelll sted ligger mellom den første og den andre aminosyren i pre-IFN-al (8).

Et 254 basepar stort fragment som er delvis Haelll nedbrutt, og som strekker seg fra dette Haelll'stedet til Bgl II stedet i midten av det kodende området, ble isolert. Et selv-komplementært, syntetisk oligonucleotid 5'-CCATGAATT-CATGG-3', ble buttende-sammenkoblet med det 254 basepar store Haelll- Bglll fragmentet for å frembringe et EcoRI

sted som ligger foran ATG oppstartingskodonet. Deretter ble et 264 basepar stort EcoRI - Bglll fragment isolert ved nedbrytning av sammenkoblingsblandingen med EcoRI og Bg1II. Dette EcoRI-Bglll fragmentet som inneholder den første halvdel av prelFN- 1 genet, ble så sammenkoblet med den bakre halvdelen av pre-IFN- 1 genet, et 372 basepar stort Bglll- EcoRI freagment isolert fra nedbrytingen av IFN-al cDNA klonet med Bglll og EcoRI. EcoRI fragmentet

som inneholder hele pre-IFN-al genet ble så fremstilt ved å bryte ned sammenkoblingsblandingen med EcoRI og isolere et fragment med 636 basepar.

Fig. 4 viser oppbyggingen av et EcoRI fragment som inneholder det komplette IFN-a2 genet. Et EcoRI- Pst-I fragment med 876 basepar som inneholder det komplette IFN-a2 genet med et EcoRI sted like foran ATG oppstartingskodonet og med 400 basepar av 3'-ikke-kodende området avledet fra cDNA klonen ble isolert ved nedbryting av plasmidet pLeIFA25 (7) med EcoRIog Pstl. PstI enden av dette fragmentet med

-876 basepar, ble så omformet til et EcoRI sted ved å bruke et adaptorfragment. Dette adaptorfragmentet med 978 basepar inneholder et indre EcoRI stede og har Pstl steder i begge ender. 230 basepar av dette fragmentet som strekker seg fra en Pst ende til EcoRI stedet, skriver seg fra gjærplasmid 2 DNA (37). 847 basepar av resten av fragmentet som strekker seg fra EcoRI stedet til den andre Pstl enden skriver seg fra bakterieplasmidet pBR322 (hele fragmentet er avledet fra YEpl3 (37b)). Sammenkobling av dette adaptor fragmentet med EcoRI- Pstl fragmentet med 876 basepar, som inneholder det komplette IFN-y2 genet, etterfulgt av nedbryting med EcoRI gir et fragment med 1096 basepar som inneholder det komplette IFN-a2 genet med EcoRI steder i begge ender. Fig 5 viser oppbyggingen av et EcoRI fragment som inneholder pre-IFN-a2 genet. Restriksjonsanalyse viser at det er et felles Ddel sted tilstede mellom den 14.og den 15. aminosyren i forløper sekvensen fra både pre-IFN-al og a2 genet. Sammenkobling av EcoRI- Ddel fragmentet med 55 basepar avledet fra EcoRI fragmentet som koder for pre-IFN-al genet og Ddel-Pstl fragmentet med 900 basepar avledet fra cDNA klonen av IFN-a2 etterfulgt av nedbrytning med EcoRI og Pstl gir et fragment med 944 basepar. Dette EcoRI- Pstl fragmentet med 944 basepar inneholder den kodende sekvensen for de første 14 aminosyrene i forløperpeptidet avledet fra IFN-al, den kodende sekvensen for resten av forløperpepti-det, og hele det komplette proteinet avledet fra IFN-a2. Pstl enden av dette fragmentet med 944 basepar ble så omformet til et EcoRI sted ved å bruke adaptorfragmentet som i tilfellet med oppbyggingen av et EcoRI fragment for komplett IFN-a2. Fig. 6 viser oppbyggingen av et EcoRI fragment som inneholder pre-IFN-y genet med 70 basepar styr ingssekvens

foran ATG oppstartingskodonet. Nedbrygning av IFN-y cDNA-klonen (30) gir et Sau3A fragment med 942 basepar med en 5<1->tilgrensende sekvens på 60 basepar, den hele kodende sekvensen for pre-IFN-y og 3<1->ikke-kodende sekvens med 290 basepar. Dette Sau3A fragmentet ble så klonet inn i en BamHI nedbrutt vektor pUC7, et plasmid-motstykke til den enkelt-kjedede fag M13mp<7>(38) . Plasmidet pUC7 ble avledet av pBR322 ved først å fjerne EcoRI-PvuII fragmentet med 2067 basepar som inneholder genet for tetracyklinresistens, og deretter innføre et Haell fragment med 425 basepar fra mP7-derivatet fra fagen M13 (38), inn i Haell stedet til det resulterende plasmid ved posisjon 2352 (angitt i forhold til pBR322). Haell fragmentet fra mp7 inneholder det området i E.coli lacZ genet som koder for N-ende, hvor det ved hjelp av flere restriksjonsenzymer er iført et kloningssted i sekvensen mellom den 4. og den 5. aminosyre-resten hos B-galaktosidase. Innføring av et fremmed DNA-fragment i disse kloningsstedene ødelegger kontinuiteten mellom lac promotoren og lacZ genet, og endrer derved fenotypen til en JM83 som er transformert ved hjelp av plasmidet fra lac<+>til lac-. Ettersom der er to EcoRI steder som grenser opp til BamHI stedene i fler-restrik— sjons-kloningsstedet hos pUC7, vil nedbryting av plasmidet som inneholder Sau3A innskuddet med 842 basepar ved hjelp av EcoRI, gi et fragment med 862 basepar som inneholder hele pre-IFN-y sekvensen flankert av EcoRI steder.

Nedbryting av plasmidet pIFN- trp48 (30) med EcoRI og

Bgll gir et fragment med 689 basepar med .en EcoRI ende foran ATG oppstartingskodonet, hele den kodende sekvens

for komplett IFN-y, og 210 basepar med ikke-kodende sekvens. Bgll enden ble så omformet til en EcoRI ende ved sammenkog-ling med en Bgll- EcoRI adaptor med 29 basepar avledet fra pre-IFN-y EcoRI fragmentet beskrevet tidligere Etterfølg-ende nedbryting av sammenkoblingsblandingen med EcoRI vil så gi et EcoRI fragment med 718 basepar som inneholder det komplette IFN-y genet.

Fig. 7 viser oppbygningen av et EcoRI fragment som inneholder pre-IFN-y genet med en EcoRI ende og sekven AAA som

.kommer foran ATG oppstartingskodonet. EcoRI fragmentet

som inneholder pre-IFN-y genet beskrevet tidligere, ble brutt ned ved hjelp av EcoRI og MboII hvorved man fikk et fragment med 184 basepar. Dette fragmentet som inneholder den forreste delen av pre-IFN-y genet, ble varme-denaturert og herdet (10) til et 5'-kinasebehandlet, syntetisk oligonucleotid 5'-pATGAAATATACA som koder for de første 4 aminosyrene i pre-IFN-y genet. Ved hjelp av den nedre kjeden i EcoRI- MboII fragmentet, templetten,

og oligonucleotidet som herder, ble Klenow-fragment fra E.coli DNA polymerase brukt til å syntetisere den øvre kjeden, og til å fjerne den 3<1->fremstikkende ende fra den nedre kjede. Det resulterende fragment med 178 basepar og butte ender som strekker seg fra ATG oppstartingskodonet til det første MboII stedet nedenunder, ble deretter koblet til en selv-komplementær 5' -TTTGAATTCAAA-3' EcoRI sammen-kobler. Nedbryting av sammenkoblingsblandingen med EcoRI og Ddel- EcoRI gir et EcoRI- DdeI fragment med 165 basepar som inneholder den forreste delen av pre-IFN-y-genet. Hele genet ble deretter satt sammen ved å koble Ddel-EcoRI fragmentet med 600 basepar som inneholder den bakre delen av IFN-y genet til det 3'-ikke-kodende området. Sammenkobling sblandingen ble så brutt ned ved hjelp av EcoRI hvorved man fikk et EcoRI fragment med 765 basepar som inneholdt hele pre-IFN-y genet.

En oppsummering av alle disse oppbygningene med EcoRI fragmenter (I til IX) er vist i fig. 8. Alle disse oppbygningene ble plassert i vektoren YEpIPT (fig. 2) for ekspresjon og sekresjonseksperimenter under anvendelse av gjær.

Ekspresjon- og sekresjonsnivåer for interferoner fra gjær som inneholder disse plasmider.

Etter at EcoRI-fragmentgenene fra fig. 8 var plassert i

YEpIPT (Fig. 2), kontrollert med hensyn til orientering og plassert i gjæren ved å bruke Trp+ komplementer ing, ble gjæren som inneholdt disse plasmidene analysert med hensyn på interferon ved å bruke cytopatisk virkning (CPE)-analyse (26) (biologisk analyse) på ekstrakter, frigjort cellevegg-materiale og medier. Interferonanalyser ble utført på tre adskilte deler av gjærkulturen. Resultatene fra slike analyser er vist i tabell 1.

Tabell 1 forts.

-a) Se fremgangsmåter for ekstraktfremstilling. Legg merke til at det er anvendt to fremgangsmåter for ekstrakter. Når celler omdannes til sfaeroplaster, er mengden "innenfor cellen" virkelig innvendig materiale; når det er

angitt N.D. (ikke bestemt) er imidlertid mengden "innenfor cellen" og mengden "frigjort etter fjerning av cellevegg" begge deler av mengden "innfor cellen", idet denne typen ekstrakt omfatter glasskulebehandling av celler

uten celleveggfjerning. Legg merke til at glasskule-ekstrakter uten dannelse av sferoplastere alltid ble fremstilt for IFN- og prelFN- • og at PBS buffer ble brukt istedet for 7M GHC1. b) De spesifike aktivitetene for LelFA og LelFD er begge antatt å være 10 g enheter pr. mg protein for beregning-ene. En gjærkultur inneholder ca. 100 mg protein i kulturen ved en Absr,„=l.

c) Se fremgangsmåter for dannelse av sferoplastere.

d) Abs for kultur hvor analyse ble utført.

e) % sekresjon er prosenten "frigjort etter celleveggfjerning" pluss prosenten "utenfor cellen". Når sferoplast-dannelse ikke ble utført, omfatter ikke "prosent utskilt aktivitet" denne celleveggsekresjonsaktivitet, og prosenten er lavere (kanskje halv)_ enn den egentlige skulle være. Det første området er innenfor cellen. Denne fraksjonen måles ved å lage et celleekstrakt etter at celleveggen er •fjernet, og angir interferonaktivitet som ikke utskilles. De to andre områdene er mediene (materiale som er fullstendig adskilt fra gjærcelle) og aktiviteten som er frigjort fra cellene etter celleveggfjerning ved anvendelse av zymolyase. (utskilt materiale men oppfanget ikke-kovalent i celleveggen). Både mediafraksjonen og fraksjonen som ble frigjort etter cellevegg-fjerning, representerer det totale utskilte materialet. Alternativt omfatter,

når celleveggen ikke fjernes, (se fremgangsmåter), aktivitet innenfor cellen også den utskilte aktivitet som henger igjen i celleveggen.

I tabell 1 før det legges merke til at (pre D/A) LelFA er et komplett LelFA gen med en hybrid signalpeptidsekvens (se fig. 1 og 8). Denne oppbyggingen er blitt omtalt tidligere, men i repetisjon så ble den oppbygd ved å anvende Ddel restriksjonsstedet som er felles for både preLelFD og preLelFA. Fig. 1 viser dette Ddel stedet ved aminosyre-10. De understrekede aminosyrene utgjør forskjeller mellom aminosyresekvensen til preLelFD og preLelFA. Den hybride (pre D/A) LelFA er mer lik preD enn preA.

Både komplett LelFA og LelFD-gener (oppbygninger I og III) uttrykkes i gjæren med nivåer på 1,0% av det totale cellulære proteinet (nivåer på 2,0% har også forekommet). De ukorrekte orienteringene for disse genene eller forløper-genene gir ikke ekspresjon. For disse to genene samt for det komplette IFN-a genet, oppstår det ingen sekresjon.

Når det imidlertid brukes forløper sekvenser på disse genene, finner man alle tre proteinproduktene i mediene som utskilte produkter. Nivåer så høye som 8% av den totale._aktivitet er observert i mediene til (pre D/A) LelFA ved en AbSggg= 3-4. Det bør legges merke til at alle dissepplasmidene foreligger i 95% av cellene i en kultur som dyrkes under Trp<+>selektivt trykk, noe som vitner om nærværet av et autonomt replikerende plasmid.

Vekstkurve og fremstilling i mediene fra en gjær som inneholder ( pre D/ A) LelFA genet.

To interferon-produserende gjær ble undersøkt ved ytterligere karakterisering. Disse var YEplPT-preLeIFA53t/pep4-3 og YEplPT-LEIFAl/pep4-3. Den første inneholder to kopier

av oppbygningen IV (fig. 8) i EcoRI stedet til YEplPT

og gir aktivitet som foreligger innenfor cellen, i celleveggen og utenfor cellen (media). Dette plasmidet som inneholder genet i to kopier (i.opar - begge orientert for korrekt ekspresjon), ble brukt istedet for oppbygningen med en enkelt kopi etter som det noen ganger ga høyere nivåer med interferonaktivitet i mediene. Pep 4-3-gjær ble brukt etter som den har kraftig reduserte nivåer for intracellulær og ekstracellulær protease (23), hvilket kan være en fordel for å erholde ikke-nedbrutt protein (interferon) fra mediene.

Den sistnevnte inneholder oppbygning III (fig. 8) i YEplPT og uttrykker komplett LelFA innenfor cellen men utskiller det ikke.

Fig. 9 viser en vekstkurve for disse to gjærstammene i YNB+CAA (Trp<+>selektiv vekst). Log fase fortsetter til

en AbSggg my på 3-4 og deretter inntrer stasjonær fasé. Begge kurvene er i det vesentlige identiske, hvilket

antyder at produksjonen av disse to forskjellige proteinene (LelFA og (pre D/A) LelFA) ikke påvirker gjærens vekst og levedyktighet. Biologiske analyser ble utført på mediene til forskjellige tidspunkter under celleveksten for å undersøke vekstkurvens avhengighet av disse to stam-menes produksjon av interferon i mediene. Av disse resultatene er det tydelig at forløper sekvensen på LelFA forår-saker en frigjøring av interferonaktivitet ut i mediene.

Uten denne tendensen frigjøres i det vesentlige ikke noen aktivitet. Det er også tydelig at aktivitetsnivåene i .mediene når en maksimumverdi nær den stasjonlære fasen.

Rensing av ( pre D/ A) LelFA fra mediene.

For å bestemme beskaffenheten til sekresjonsprosessen for '

(pre D/A) LelFA ut i gjærmedia, var det nødvendig å rense proteinproduktet fra mediene. Dersom gjær er istand til å utskille proteinet, behandler den sannsynligvis amino-enden på en eller annen måte under sekresjonsprosessen slik som pattedyr-celler vanligvis gjør med et forløper-interferon protein. Formålet med ytterligere eksperi-menter var å bestemme beskaffenheten til denne behandlingen på følgende måte:

A) Dyrking i 5 liter gjæringsvæske.

Fig. 10A viser inter feronaktiviteten innenfor celleveggen og i cellen under den samme fermentering. Disse ekstraktene ble fremstilt ved pelletering etterfulgt av glasskulebehandling i 7M GHC1 slik at denne aktiviteten inneholder både intracellulært og intracelleveggmateriale. Denne aktiviteten når en maksimumsverdi på ca. 25 x 10

enheter/liter ved en Abs^g<g>my på 1,5 til 2,0, hvilket antyder at intracellulær interferonproduksjon stanser i logfasen før den går over i stasjonær fase i motsetning til ekstracellulært materiale. Således utskilles ca. 8% av aktiviteten fritt i mediene. Igjen kan imidlertid like mye aktivitet være tilbake i celleveggen (se tabell 1). Ekstraktmaterialet inneholder for det meste intracellulær interferon, og dette materialet renses nå for å undersøke som det er behandlet eller ikke-behandlet.

Fig. 10B viser en vekstkurve for en 5 liter fermentering av YEplPT-preLelFA 53t/pep4-3 i YNB+CAA. Ved slutten av denne fermenteringen var der ca. 2,0 x 10^ enheter/liter interferonaktivitet målt ved MDBK analyser. På nytt finner maksimumproduksjonen sted i den stasjonære fasen. Det bør legges merke til at interferonproduktet i disse"media er svært stabilt, selv med 24 timer ytterligere rysting ved 30°C etter at den stasjonære fasen er nådd. Disse media ble brukt for ytterligere rensingstrinn. B) Mediakonsentrat over på immunologisk affinitetskolonne.

Mediene fra YEplPT-preLeIFA53t/pep4-3 ble først ultrafiltrert. Dette konsentratet ble tilsatt en kolonne som inneholdt et monoklonalt antistoff for komplett LelFA. Etter vasking med 0,2MNaCl i tris/cys/EDTA, pH=8,0, ble interferonet eluert med F^O (pH=5,5), slik som vist i fig. 11. Eluert topp A (pil angir når U^ O ble tilsatt) ble erholdt ved hjelp av denne fremgangsmåten, og utgjør 50% av aktiviteten som ble tilført kolonnen. Topp A ble samlet opp, slik som vist ved haker, og brukt for videre rensing. Eluering med 0,2M eddiksyre resulterte i topp B (pil angir punktet for bufferending), og posisjon C angir punktet for tilførsel av opprinnelig vaskebuffer.

C) Kjøring av aktivitet fra topp A på HPLC.

Topp A fraksjoner ble lyofilisert til tørrhet og deretter kjørt på HPLC (se fremgangsmåter). Fig. 12 viser resultatene fra denne kjøringen. En 2,5 yg prøve med renset LelFA (fra E.coli) ble kjørt separat som en kontroll.

Både standarden og (pre D/A) LelFA (eller preLelF A) hadde identiske tilbakeholdelsestider, slik det tydelig fremgår av figuren. Disse resultatene viser at interferonet fra mediene behandles ettersom preLelF A har en svært avvik-ende tilbakeholdelsestid. Den sjatterte fraksjonen fra denne HPLC-kjøringen ble så brukt til protein-sekvensering.

NH^- endesekvens fra ( pre D/ A) LelF A isolert fra gjærmedia.

•Fig. 13 viser delvis resultatene fra sekvenseringen av

det rensede interferon. Den øverste sekvensen var den forventede for (pre D/A) eller LelF A dersom ingen behandling opptrer. Det normale spaltingspunktet for dette interferonet som sannsynligvis gjenkjennes av pattedyrceller,

er vist.

Proteinsekvensen ble tydet ved å legge merke til hvilken PTH aminosyre som økte i antall i hver tilsvarende Edman syklus, og deretter avtok i antall i den følgende syklus. PTH aminosyre som vanligvis gir lave utbytter (cys, ser, thr, arg, his) ble antatt å- foreligge når ingen økning av noen annen PTH amonsyre kunne ses. Mengden ivmg ble beregnet ved å sammenligne områdene til den tydede resten med områder fra en standardblanding av PTH aminosyrer kjørt på den samme HPLC. Det ble utført en intert standard av nor-leucin i hvert kromatogram for å sikre at tilbakeholdelsestidene var reproduserbare.

Fig. 13 viser proteinsekvenseringsresultatene som ble oppnådd for det rensede (pre D/A) LelF A. Den forventede sekvens dersom ingen behandling opptrådte, og det normale spaltingspunktet i dette foreløperinterferonet hos pattedyrceller, er også vist. To uavhengige sekvenskjøringer ble utført på to forskjellige rensede prøver fra celler og media. Fig. 13 viser at det meste av interferonet i mediet ble korrekt behandlet (64%), men en annen form (36%) som inneholdt 3 ytterligere aminosyrer fra forløper-sekvensen, var også tilstede. Det intracellulære interferonet inneholdt også disse toformene, men i lett avvik-ende forhold, samt en 3. form som inneholdt 8 aminosyrer fra for løper sekvensen. For løper sekvens i full lengde ble aldri observert, hvilket antyder at gjær behandler alt pre-IFN på en eller annen måte.

Det er mulig at den behandlede formen som inneholdt 3 aminosyrer fra for løper sekvensen skyldtes hybridnaturen til pre D/A signalsekvens. Derfor ble også behandlingen av det ikke-hybride (pre D) LelF D også undersøkt. Pre D er forskjellig, fra pre D/A bare ved aminosyreposisjon -2 (leu mot val). Når behandlingen av pre IFN-al som var isolert fra mediet, ble undersøkt, ble igjen både +1 og -3 formene funnet (fig. 13). En minoritetstype, som ikke ble funnet hos (pre D/A) LelF A, var imidlertid også tilstede i mediet som en -14 form.

For å undersøke sekresjonen av heterologe proteiner fra

S. cerevisiae, har vi bygd opp plasmider for in vivo transkripsjon av genene til forskjellige komplette inter— feroner (IFN-er) og forskjellige pre IFN-er. Alltid når de kodende sekvensene for hydrofobe signalpeptider var tilstede, kunne det utvinnes IFN antiviral aktivitet både fra vertcellene og fra kulturmediet, mens alt IFN hvis syntese ble styrt av gener for komplett IFN, forble inne i cellene. Vi har forsøkt å karakterisere kravene for sekresjon ved å foreta oppbyggingen hvor inter ferongenet ville foreligge sammen med sine egne naturlige signalsekv-enser, slik som i (pre D/A LelF D, eller ville foreligge sammen med en hybrid signalsekvens utformet som en blanding av 2 IFN-a arter, slik som i (pre D/A) LelF A.

Mens gjærcellene som inneholdt disse oppbygningene vanlig vis utskilles det IFN i kulturmediet, varierte aktivitets-mengden mellom stammene og IFN-typene som ble renset og sekvensert, varierte også. 3 former av ikke-utskilt interferon som utgjær 90% av den totale mengde uttrykt interferon, ble isolert fra celler som inneholdt (pre D/A) LelF A genet. En form (33%) ble korrekt behandlet ( + 1, fig. 13), en annen fo-rm (55%) som inneholdt 3 ytterligere aminosyrer (-3, fig. 13) og en tredje form (11%) som inneholdt 8 ytterligere aminosyrer (-8). Den sistnevnte formen ble ikke funnet i medium, mens IFN med en for løper sekvens av full lengde aldri ble funnet i celler eller media.

Behandling av ( pre D) LelF D.

Istedet for dyrking i rysteflaske som ble brukt for (pre D/A) LelF A gjær, ble (pre D/A) LelF D-uttrykkende gjær dyrket i en 10 liter fermenter til en A^^q = 60.

Når behandling av (pre D) LelF D isolert fra mediet (rensingen var den samme som for pre D/A LelF A) ble undersøkt, ble det funnet både +1 og -3 formene (fig. 13). En ytterligere, minoritetstype var også tilstede i mediet som en -14 form. Undersøkelser av mediumprotein mot cellulært protein ved hjelp av SDS gel elektroforese,

ga ingen bevis for at cellelyset oppsto i kulturen. Interessant nok ble det ved denne høye veksttettheten oppnådd en svært høy prosentvis sekresjon (30%) i mediet for LelF D. Dyrkinger.i høy tetthet av gjær som uttrykker (pre D/A) LelF A, oppviser også denne.høye prosentvise sekresjon.

Gjær synes å behandle både det utskilte og ikke-utskilte interferonet. Mengden utskilt aktivitet varierer avhengig av dyrkingsstadiet for cellene, idet maksimumsprosentene opptrer i stasjonær fase i rysteflasken, og ved slutten av dyrkinger i høy tetthet (30%9 media).

Bekreftelse av sammensetningen av plasmidene i gjær som inneholder YEplPT. preLeIFA53t og YEplPT- LeIFA1.

Gjæren som inneholder disse to plasmidene som brukes til de forutgående eksperimentene ble ytterligere kontrollert ved gjenvinning av plasmidene fra gjæren. Dette_ble gjort ved isolering av plasmid DNA fra gjærekstrakt ved transformasjon av E.coli, etterfulgt av "miniscreen" DNA fremstilling og restriksjonsanalyse av DNA fra plasmidet. Flere plasmid DNA-er isolert fra E.coli blekarakterisertfor begge gjærtypene. I alle tilfellene inneholdt plasmid-.ene den forventede restriksjonsfrekvensen som vitnet om nærværet av forløpersekvensen på (pre D/A) LelF A inneholdende plasmid og mangelen på den i plasmid som inneholder komplett LelF A.

Restriksjonskart og delvis sekvensering av 3, 1 kg basepar stort innskudd i pBl.

300 yg pBl (37a) ble grundig brutt opp ved hjelp av Hindlll i et 500 yl reaksjonsvolum, deretter utsatt for elektroforese på en preparativ agarose (Sea Kem) gel med 1% agarose. Det 3,1 kb Hindlll innskuddet ble tatt ut av den etidiumfargede gelen, elektroeluert (39), ekstrahert tomganger med like store volumer buffer-mettet fencl, og kloroform før etanolutfelling, Det ble delt opp por-sjoner av det resuspenderte DNA fragment og disse ble utsatt for restriksjons-spaltinger ved hjelp av en gruppe forskjellige restriksjonsenzymer hvorved man fikk det delvis restriksjonskartet som er vist i fig. A. 30 yg av det rensede 3,1 kb innskuddet ble spaltet med Sau3A og deretter kjørt på en 6% akrylamidge1. Fragmenter som svarer til de 265 bp og 141 bp ble renset hver for seg ved elektroelueoing som beskrevet ovenfor. Hvert DNA fragment ble så gjort til gjenstand for DNA sekvens-analyse (39).

En del av denne DNA sekvensen er vist i fig. B. Aminosyrer som svarer til aminosyrene i N-enden til det strukturelle PGK genet, er skrevet inn over DNA sekvensen.

Innføring av et restriksjonssted i 5' promotor området til

PGK.

Et syntetisk oligonucleotid med sekvensen 5'ATTTGTTGTAAA31 ble syntetisert ved hjelp av standardmetoder (40). 100 ng av denne oppstarter ble merket i 5'-enden ved å bruke

• 10 enheter T4 polynucleotidkinase i en 20 yl reaksjonsblanding som også inneholdt 200 yCi [y 3 2-P] ATP. Denne merkede starteroppløsning ble brukt i en starter-utbedringsreaksjon utformet for å være det første trinn i en flertrinns

fremgangsmåte for å innføre et EcoRI restriksjonssted i det 5<1->tilgrensende DNA hos PGK som kommer like foran strukturgensekvensen hos PGK. Flertrinnsfremgangsmåten er forklart nedenunder:

Trinn 1 (fig. C)

Reaksjoner ved oppstarting av utbedring og kloning av

39 bp XbaI-til- Sau3A PGK-stykke.

100 yg pBl ble fullstendig brutt opp ved hjelp av Haelll og deretter kjørt på en 6% polyakrylamidgel. Det øverste båndet på den titiumfargede gelen (som inneholder PGK promoterområde) ble isolert ved hjelp av en elektroeluering som beskrevet ovenfor. Dette 1200 bp Haelll stykket med DNA ble kortet ned ved hjelp av Hindll og deretter kjørt på en 6% akrylamidgel. 650 bp båndet ble isolert ved elektroeluering. 5 g DNA ble isolert. Dette 650 bp HaeIII-til- HindII stykket med DNA ble resuspendert i 20 yl dIH20, og deretter blandet med de 20 yl av den fosforylerte oppstarter-oppløsningen beskrevet ovenfor. Denne blandin-gen ble ekstrahert 1 gang med fenol-kloroform og deretter utfelt med etanol. Tørket DNA ble resuspendert i 50 yl H20 og deretter oppvarmet i et bad med kokende vann i

7 minutter. Denne oppløsningen ble så hurtig avkjølt i

et tørris-etanol-bad (10-20 sekunder) og deretter overført til et isvann-bad. Til denne oppløsningen ble det tilsatt 50 yl av en oppløsning som inneholdt 10 yl 10X..CNA polymerase I buffer (Boehringer Mannheim), 10 yl av en på forhånd fremstilt oppløsning med 2,5 mM av hver deoksynucleosid-triforsfat (dATP, dTTP, dGTP og dCTP), 25 yl dIH20 og

5 enheter DNA polymerase I, Klenow fragment. Denne 100 yl reaksjonsblanding ble inkubert ved 37°C i 4 timer. Oppløs-ningen ble så ekstrahert 1 gang med fenol-kloroform, utfelt med etanol, tørket ved lyofili ser ing og deretter grundig restriksjonsbehandlet med 10 enheter Sau3A. Denne oppløs-ningen ble så kjørt på 6% acrylamidgel. Båndet som svarer til 39 bp i størrelse ble tatt ut av gelen og deretter isolert ved elektroeluering som beskrevet ovenfor. Dette 39 bp båndet har en butt ende og en Sau3A utstikkende ende. Dette fragmentet ble klonet inn i en modifisert pFIFtrp69 vektor (10). 10 g pFIFtrp69 ble gjort linjaer ved hjelp av Xbal, ekstrahert 1 gang med fenol-kloroform og deretter utfelt med etanol. Den Xbal utstikkende ende ble gjenfylt ved å bruke DNA polymerase I Klenow fragment i en 50 yl reaksjonsoppløsning som inneholdt 250 PM av hvert nucleosid trifosfat. Denne DNA ble kuttet med BamHI og deretter kjørt på 6% akrylamidgel. Vektorfrag-mentet ble isolert fra gelen ved elektroeluering og deretter resuspendert i 20 yl dIH20. 20 ng av denne vektoren ble koblet sammen med 20 ng av det 39 bp store fragmentet syntetisert ovenfor i 4 timer ved værelsestemperatur. 1/5 av sammenkoblingsblandingen ble brukt til å transformere E.coli stamme 294 til ampicillinresistens (på LB + 20 yg/ml amp plater). Plasmider fra transformantene ble undersøkt ved hjelp av en hurtig skridning-fremgangsmåte (20). Et plasmid, pPGK-39 (fig. C) ble valgt ut til se-kvensanalyse. 20 yg av dette plasmidet ble brutt opp ved hjelp av Xbal, utfelt med etanol og deretter behandlet med 1000 enheter bakteriell alkalisk fosfatase ved 68°C i 45 minutter. DNA ble ekstrahert 3 ganger med fenol-kloroform og deretter utfelt med etanol. De defosforylerte endene ble så merket i en 20 yl reaksjonsblanding som inneholder 200 yCi [6 3 2-P] ATP og 10 enheter T4polynucleotidkinase. Plasmidet ble så kuttet med Sali og kjørt på en_6% akrylamidgel .

Båndet for det merkede innskuddet ble isolert fra gelen

og delt opp i sekvenser ved hjelp av den kjemiske degrada-sjonsmetoden (39). DNA sekvensen ved 3'-enden i dette promoter stykket var som forventet.

Trinn 2 (fig. D).

Oppbygging av 312 bp PvuI-til- EcoRI PGK promoterfragment.

25 yg pPGK-39 (fig. C) ble samtidig brutt opp med Sali og Xbal (5 enheter av hver) og deretter utsatt for elektroforese på en 6% gel. 390 bp båndet som inneholdt det 39 bp promoter stykket, ble isolert ved elektroeluering. Det resuspenderte DNA ble restriksjonsbehandlet med Sau3A og deretter utsatt for elektroforese på en 8% akrylamidgel. 39 bp PGK promotor båndet ble isolert ved elektroeluering. Dette DNA inneholdt 39 bp av 5' enden av PGK promoteren

på et Sau3A-til- XbaI fragment.

25 yg pBl ble restriksjonsbehandlet med Pvul og Kpnl og deretter utsatt for elektroforese på en 6% gel. 0,8 kbp bandet med DNA ble isolert ved elektroeluering, deretter restriksjonsbehandlet med Sau3A og utsatt for elektroforese på en 6% gel. 265 bp båndet fra PGK promoteren (fig. A)

ble isolert ved elektroeluering.

Dette DNA ble så koblet sammen med 39 bp promoter fragmentet nevnt ovenfor i 2 timer ved værelsestemperatur. Sammenkoblingsblandingen ble restriksjonsbehandlet med Xbal og Pvul og deretter utsatt for elektroforese på en 6% akrylamidgel. 312 bp Xba-til- PvuI restriksjonsfragmentet ble isolert ved elektroeluering, deretter tilsatt til en sammen-koblingsblanding som inneholdt 200 ng pBR322(33) tidligere isolert uten det 162 bp PvuI-til- Pstl restriksjonsfragmentet og 200 ng av Xbal-til- Pstl LelFA cDNA gene.t_. som på forhånd var isolert fra 20 yg pLEIFtrpA. Denne sammenkoblingsblandingen med 3 faktorer ble brukt til å transformere E.coli stamme 294 til tetracyklinresistens. Transformant- kolonier ble miniscreened og en av koloniene, pPGK-300 , ble isolert med 304 bp PGK 5'-tilgrensende DNA sammensmel-tet med LelFA genet i en pBR322 basert vektor. 5'-enden av LelFA genet har den følgende sekvens: 5'CTAGAAATTC 3', sammenslåling av Xbal stedet fra PGK promoterfragmentet med denne sekvensen tillater følgelig tilsetningen av et EcoRI sted til Xbal stedet. pPGK-300 inneholder følgelig deler av PGK promoter isolert i et PvuI-til- EcoRI fragment.

Trinn 4.

Oppbygging av et 1500 bp EcoRI-til- EcoRI PGK promoterfrag-merrt. 10 yg pBl ble brutt opp ved hjelp av Pvul og EcoRI og kjørt på en 6% akrylamidgel. Dette 1,3 kb PvuI-til- EcoRI DNA båndet fra det PGK 5<1->tilgrensende DNA ble isolert ved elek troeluering. 10 yg pPGK-300 ble brutt opp ved hjelp av EcoRI og Pvul og 312 bp promoterfragmentet ble isolert ved elektroeluering etter å ha utsatt oppbrytningsblandingen for elektroforese på en 6% gel. 5 yg pFRL4 ble kuttet med EcoRI, utfelt med etanol og deretter behandlet med bakteriell alkalisk fosfatase ved 68°C i 45 minutter. Etter 3 ganger behandling av DNA med fenol/kloroform, utfelling med etanol og resuspensjon i 20 ml dlH^O, ble 200 ng av vektoren koblet sammen med 100 ng av 312 bp EcoRI-til-Pvul DNA fra pPGK-300 og 100 ng EcoRI-ti.l- PvuI DNA fra pBl. Sammenkoblingsblandingen ble brukt til å transformere E.coli stamme nr. 294 til ampicillinresistens. Fra en av Ap koloniene, ble det erholdt pPGK-1500. Dette plasmid inneholder det 1500 bp PGK promoterfragment som et EcoRI-til- EcoRI eller HindIII-til- EcoRI stykke med DNA.

Oppbygging av ekspresjonsplasmider for komplett._ HGH ( menneske/ veksthormon) og for pre HGH.

Strukturene A til E på fig. 14 ble satt sammen i vektorer med passende avsnitt. I Struktur A, ble det laget et syntetisk DNA for å duplikere DNA sekvensen ved begynnelsen

av preHGH cDNA (42) fra Hpa II stedet med dannelsen av

et EcoRI sted foran translasjonsstarten ATG. Hpall til Pstl framentet ble holdt fra preHGH cDNA (42) og dette fragmentet med det syntetiske DNA ble koblet sammen med en EcoRI-til- Pstl vektor (pHGH 207-1, med EcoRI til Pstl fragment med ApR gen fjernet, og begge deler på nytt koblet sammen til ifylling ifølge Klenow for å fjerne begge steder), som inneholder fra Pstl-til- Smal stedet i HGH cDNA (43) for å erholde struktur A. Struktur B ble laget fra et plasmid som inneholder det komplette HGH genet som tidligere var blitt fanget opp for direkte ekspresjon og som inneholder en syntetisk kodende sekvens for 23 aminosyrer ved NH2~enden (44). Et plasmid som inneholt dette genet ble kuttet med PvuII i HGH genet og BamHI i

R

Tc -genet. Det store fragmentet som inneholdt det meste

av genet ble så koblet sammen med syntetisk . DNA som dupli-kerer enden av HGH genet (TAG) og skaper et Hindlll sted. Dette Hindlll stedet ble koblet sammen med Hindlll/ Baml fragmentet til pBR322 som den tredje faktor i 3-faktors sammenkobling til et plasmid som inneholdt struktur B.

A og B ble så kombinert som vist i fig. 14 hvorved man fikk struktur C. C ble ytterligere modifisert til D,

hvor Hindlll stedet ble formet til et EcoRI (eller ( EcoRI) sted.: Det således erholdte EcoRI stykket ble plassert i EcoRI stedet til gjær-ekspresjonsplasmidet .YEplPT for ekspresjon av preHGH genet i gjær. Struktur E ble også laget ved å bruke omformeren brukt i D for å få et komplett inter f erongen (laten signalsekvensen for sekresjon) på et EcoRI fragment for ekspresjon i YEplPT.

Ekspresjon av komplett HGH og preHGH i gjær.

mHGH strukturen (E) i YEplPT ble plassert i stamme pep-4-3 trpl (20B-12) og det ble fremstilt ekstrakter ved

å bruke glasskuler som beskrevet under fremgangsmåter. Glasskuler ble imidlertid tilsatt til 10 ml pelleterte - celler med 0,5 ml 0,1% SDS. Fortynninger ble laget i hesteserum og SIA analyser ble utført som tidligere beskrevet (44) .

Ved RIA ble HGH uttrykt som ca. 0,5% av totalt gjærprotein ved en AggQpå 1,0 (0,5 mg/l/A660). Det ble ikke påvist noe HGH i mediet.

preHGH-strukturen (D) i YEplPT ble også plassert i gjær og celler og medium ble analysert for HGH. Det ble påvist et lavere ekspresjonsnivå i cellene (0,08 mg/l/AggQ) eller ca. 0,08% av samlet gjærprotein. Nivået er følgelig ca.

1/6 av det til komplett HGH ekspresjon, hvilket er svært likt resultatene for leukocyttinterferon. Dette behøver imidlertid ikke å være en rettferdig sammenligning, ettersom kodon-bruken til komplett HGH (44) er forskjellig for 23 aminosyrer i forhold til de samme aminosyrene hos preHGH.

En slik forskjell kan resultere i forskjeller i ekspresjons-nivået for disse to produktene (45). 10% eller 8ug/l/(AggQ = 1) av den uttrykte mengde i cellen, ble funnet i mediet til den preHGH uttrykkende gjær. I en 10 liter fermentor ved en A,-,-q = 85, var det igjen ca. 10% sekresjon med h' mq/ liter HGH i mediene.

Beskaffenheten av preHGH ekspresjon.

En sammenligning av HGH protein i cellen.mot den som er utenfor cellen, ble gjort ved å bruke en "Western" elektroforeseflekk-fremgangsmåte som beskrevet ovenfor. Resultatene viser medium fra en fermentering med høy tetthet (Af>50<=>85) av PreIiGH uttrykkende gjær. Et enkelt bånd som svarer til komplett HGH størrelse, er tilstede. Dette båndet svarer til 1-2% av gjær-mediumproteinet.

Når dette medium/HGH ble renset ved hjelp av antistoff affinitetskromatografi (Hybritec Ab) og HPLC brukt på samme måte som for interferonene, viste sekvensoppdelingen i • NH2~enden, at nesten 100% av HGH var komplett HGH (sekvens-oppdeling ble utført for 10 rester), slik som delvis vist i fig. 13. Følgelig behandles alt medium-HGH trofast slik det gjøres av menneskeceller.

Til tross for at henvisning er gjort til bestemte fore-trukne utførelsesformer, vil det videre forstås at den foreliggende oppfinnelse ikke må utlegges som begrenset til slike, men heller til det rettmessige omfang ifølge de vedføyde krav.

Litteraturliste.

-1. Novick, P., Field, C, og Shekman, Cell 21, 205-215

(1980) .

2. Duntze et al., Science 168, 1472 (1970).

3. Woods et al., J. Gen. Microbiol. 51, 115 (1968).

4. Cabib et al., J. Bacteriology 124, 1586 (1975).

5. Farkas, Microbiol. Rev. 43, 117 (1979).

6. Moor, Arch. Mikrobiol. 57, 135 (1967).

7. Goeddel et al., Nature 287, 411 (1980).

8. Goeddel et al., Nature 290, 20 (1981).

9. Yelverton et al., Nucleic Acids Research 9, 731

(1981) .

10. Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057

(1980) .

11. Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).

12. Wetzel et al., Biochemistry 19, 6096 (1980).

13. Davis et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 78,

5376 (1981).

14. Hitzeman et al., Nature 293, 717 (1981).

15. Kleid et al., Science 214, 1125 (1981).

16. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 6104 (1981).

17. Weck et al.-, Nucleic Acids Res. 9, 6153 (1981).

18. Clarke, L. og Carbon, J., Cell 9, 91-99 (1976).

19. Clarke, L. og Carbon, J., PNAS 72, 4361-4365 (1975). 20. Eirnboim, H.C. og Doly, J., Nucleic Acids Resi 1513-1523 (1979). 21. Hinnen, A., Hicks, J.J., og Fink, F.R., Proe. Nati.

Sei., USA 75, 1929-1933 (1978). 22. Backman, K., Ptashne, M., og Gilbert, W., Proe. Nati.

Acad. Sei., USA 73, 4174-4178 (1976).

23. Jones, E., Genetics 85, 23 (1976).

24. Faye, G., Leung, D.W., Tachell, K., Hall,B.D. og Smith, M., Proe. Nati. Aca. Sei., USA 78,^2258-2262

(1981) .

25. Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Har bor, NY.

26. Stewart, W.E., II The Interferon System (Springer,

New York. 1979).

27. P. Edman, G. BEgg, "A Protein Sequencer", Eur.J.

Biochem., 1, 80.91 (1967). 28. Tarr, G.E., Beecher, J.F., Bell, M og McKean, D.J.,

Anal. Biochem, 84, 622-627, (1978). 29. Wittmann-Leibold, B., Graffunder, H., og Kohls, H,

Anal. Biochem, 75, 621-633 (1976).

30. Gray, P.W., et al., Nature 295, 503-508 (1982).

31. Ernr, S.D. et al., Nature 285 , 82-85 (1980).

32. Novick, P. og Schekman, Proe. Nati. Acad. Sei, USA 76, 1858-1862 (1979). 33. Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Green, P.Y., Betlach, M.C., Heyneker, H.L., Boyer, H.W., Crosa, Y.H. og Kalkow, S., Gene 2, 95-113 (1977). 34. Stinchcomb, D.T., Struhl, K. og Davis R.W., Nature 282, 39-43 (1979). 35. Kingsman, A.j.m Clarke, L., Mortiner, R., og Carbon,

J., Gene 7, 141-153 (1979).

36. Tschumper, G. og Carbon, J., Gene 10 (1980).

37. Hartley, J.L. og Donelson, J.E., Nature 286, 860-865

(1980).

37a. Hitzeman, R.A., Clarke, L. og Carbon, J., J. Biol.

Chem. 255, 12073 (1980) .

37b. Broach et al., Gene 8, 121 (1979).

38. Messing et al., Nucleic Acids Research 9, 309 (1981). 39. Maxam, A.M. og Gilbert, W., Methods in Enzymol. 65, 490-565 (1980) . 40. Crea, R. og Horn, T., Nucleic Acids Res. 8, 2331-2348. 41. Oakley, B.R. et al., Anal. Biochem. 105, 361 (1980). 42. Goodman, H.M. et al., i Specific Eukaryotic Genes (Ut§. Engberg, J., Klenow, H og Leick, V.) 179-190

(Munskagaard, København, 1979).

43. DeBoer, H., et al., i Promoters: Structure and

Function (utg. Prayer) 468-481 (1982).

44. Goeddel, D.V., et al., Nature 281, 544 (1979).

45. Bennetzen, J.L. og Hall, B.D., J. Biol. Chem 257, 3026 (1982).

■46. Ames, G.F.-L., J. Biol. Chem. 249, 634 (1974).

47. Towbin, H. el al., Proe. Nati. Acad. 76, 4350 (1979).

Claims (9)

1. Heterologt protein, karakterisert ved at det er et produkt av ekspresjon, behandling og sekresjon av en gjærorganisme og foreligger i avsondret form uten ledsagelse av uønsket polypeptid-for løper sekvens eller annet uregelmessighet ved ekspresjonen.

2. Cellekultur av gjærorganisme som er istand til å fremstille et heterologt protein for gjærorganismen, karakterisert ved at den omfatter

1) legedyktige gjærceller transformert med en ekspresjonsbefordrer som på en virksom måte inneholder DNA som koder for proteinet sammen med et heterologt signalpolypeptid for dette, og

2) et medium som forsørger cellekulturen, idet mediet inneholder proteinet som et produkt av gjærorganismens ekspresjon, behandling og sekresjon.

3. Cellekultur ifølge krav 2, karakterisert ved at det heterologe signalpolypeptidet er en hybrid av signalet som er naturlig for proteinet, og av et annet heterologt signalpolypeptid.

4. Medium fra en cellekultur av en gjærorganisme ifølge krav 2, karakterisert ved at det i det alt vesentlige er fritt for levedyktige eller øde-lagte gjærceller, og at det inneholder et protein som er heterologt for gjærorganismen, og som er et produkt av gjærorganismens ekspresjon, behandling og sekresjon.

5. Gjær-ekspresjonsbefordrer, karakterisert ved at den er YEplPT som på en virksom måte inneholder DNA som koder for et protein som er heterologt for gjærorganismen.

6. Befordrer ifølge krav 5, karakterisert ved at den i tillegg inneholder DNA som koder for et heterologt signal-polypeptid, i en avlesningsramme egnet for translasjon sammen med den DNA som koder for det heterologe proteinet.

7. Befordrer ifølge krav 6, karakterisert ved at det heterologe signalpolypeptidet er en hybrid av det for proteinet naturlige signal og av et annet heterologt signalpolypeptid.

8. Gjær-ekspresjonsbefordrer, karakterisert ved at den på en virksom måte inneholder DNA som koder for menneske-leukocytt DA signalpolypeptid i en avlesningsramme egnet for translasjon sammen med menneske-leukocytt A protein.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av protein som er heterologt for en gjærorganisme, i form av et produkt av gjærens ekspresjon, behandling og sekresjon, karakterisert ved at den omfatter og transformerer en gjærorganisme. med en ekspresjonsbefordrer som på en virksom måte inneholder DNA som koder for proteinet og et heterologt signalpolypeptid, fremstille en kultur av orga-nismen, dyrke kulturen og utvinne proteinet fra kulturmediet.