CZ282905B6 - Způsob získávání proteinu heterologního pro organismus kvasinek jako produktu exprese, opracování a sekrece kvasinek - Google Patents

Abstract

Způsob získávání proteinu heterologního pro organismus kvasinek jako produktu exprese, opracování a sekrece kvasinek, spočívající v tom, že kvasinkový organismus se transformuje expresním vektorem funkčně nesoucím DNA kodující protein a heterologní signální polypeptid, že se připraví kultura shora uvedeného organismu, že se kultura kultivuje a že se isoluje protein z media shora uvedené kultury. Buněčná kultura uvedeného organismu kvasinek, schopná produkovat heterologní protein a medium buněčné kultury. Kvasinkový expresní vektor YEpiPT nesoucí DNA kodující protein, který je heterologní pro organismus kvasinek.ŕ

Description

Oblast techniky

Tento vynález se obecně týká technologie rekombinantní DNA využívající hostitelského systému kvasinek a expresních vektorů k expresi, opracování a sekreci heterologního proteinu (bílkoviny) jako diskrétního produktu, který není doprovázen nepotřebnými sekvencemi nebo jinými artefakty exprese.

Objev, na kterém je tento vynález založen, je prvním příkladem toho, že protein, který je normálně heterologní k hostitelským kvasinkám, je isolovatelný v užitečných množstvích z prostředí kultury kvasinek. V organismu kvasinek dochází k expresi, opracování a sekreci proteinu podobně jako při jeho produkci v okolí přirozených buněk. Tento vynález je tedy výsledkem úspěšné manipulace s expresními vektory a hostitelskými kvasinkami vedoucí k syntéze proteinů, které nejsou hostitelskými kvasinkami normálně syntetizované, a k regulaci hostitelských kvasinek tak, že dojde k sekreci proteinu. Tento vynález se tedy týká prostředků a způsobů získávání použitelných množství heterologních proteinů z prostředí kultury kvasinek, které obsahují živé buňky nesoucí expresní vektory obsahující DNA, která kóduje protein. Obrovskou výhodou tohoto vy nálezu je schopnost získávat užitečný diskrétní proteinový produkt v médiu kultury buněk. Lze též eliminovat rozklad buněk, který byl dosud při isolaci produktu až dosud dostupného pouze z obsahu buněk nutný (při tom buňky byly často v jiné než maturační formě).

Dosavadní stav techniky

Publikace a další materiály, které se týkají tohoto vynálezu, které objasňují pozadí vynálezu a které ve zvláštních případech poskytují další podrobnosti, pokud jde o praktické použití, jsou zde zahrnuty jako odkazy. Protože je to výhodné, jsou očíslovány a souhrnně uvedeny na konci popisu pod označením literatura.

Organismy kvasinek přirozeně transportují malá množství jistých homologních proteinů k a někdy skrz plasmovou membránu jako podstatný příspěvek k růstu povrchu buněk a metabolismu buněk. U buněčných pupenů pro tvorbu dceřinné buňky jsou potřebné další proteiny pro tvorbu buněčné stěny, plasmové membrány a také pro metabolismus. Některé z těchto proteinů musí najít cestu k místu, kde jsou potřebné. Předpokládá se, že tedy existuje sekreční cesta (1). Jisté homologní proteiny ve shora uvedených procesech jsou vytvářeny translací v endoplasmickém retikulu. Homologní proteiny jsou takové proteiny, které jsou normálně produkované kvasinkami a které jsou potřebné pro životaschopnost kvasinek. Když se vytvoří, migrují enzymatickým transferem do Golgiho aparátu, odtamtud váčky do plasmových membrán, kde některé asociují nebo do jistého stupně pronikají do prostoru mezi plasmovou membránou a buněčnou stěnou. Zdá se, že malá množství homologních proteinů zcela procházejí stěnou buňky, jako je například α-faktor a smrtící toxin (2,3).

Zdá se, že oblast pupenu buňky je místo, kam jsou váčky přitahovány, kde se spojují s vnitřním povrchem, přispívají k celkovému růstu plasmové membrány a pravděpodobně i buněčné stěny (4, 5, 6). Tato teorie nepřináší žádný důkaz, že skutečně dochází k sekreci nebo migraci proteinu (proteinů) membránou. Rovněž tak je stále polemické, zda v tak zvaném sekrečním procesu asistuje nebo zdaje v něm zahrnuta glykosylace. Definované sekretované proteiny se zdají mít signální prepeptid, který by měl být činný při transportu nebo připojení k membránovému povrchu. Funkce takových modifikací maturačního proteinu, pokud nějaká existuje, v procesu

- 1 CZ 282905 B6 sekrece a celková role sekreční cesty na povrchu růstu jsou spekulace, které nejsou založeny na pevném základu.

Předpokládá se, že technologie rekombinantní DNA by mohla být cenná při odpovědi na 5 otevřené otázky o sekrečním procesu v organismech kvasinek a že by mohla prokázat schopnost těchto a dalších organismů endogenní produkce hojných množství heterelogních polypeptidových produktů (viz například citace 7 až 17) při příslušné manipulaci hostitelskými kvasinkami tak, aby sekrece heterologního proteinu probíhala v diskrétní maturační formě.

Podstata vynálezu

Tento vynález je založen na objevu, že organismy kvasinek mohou způsobit expresi, opracování a sekreci proteinu, který je normálně heterologní pro organismus kvasinek a není pro organismus 15 kvasinek, pro jejich životaschopnost, potřebný. Dále je tento vynález založen na objevu, že uvedený heterologní protein lze získat z média obklopujícího živé, produkující buňky kvasinek v diskrétní formě s tím, že není doprovázen nepotřebnou polypeptidovou sekvencí nebo jiným artefaktem exprese. Vhodné buňky kvasinek v živném prostředí jsou trasformovány expresními vektory nesoucími DNA kódující hetereologní protein a heterologní signální polypeptid. Po 20 expresi proteinu spolu s heterologním signálním polypeptidem je produkt exprese dále opracováván. Maturační heterologní protein pak přechází do média kultur buněk. Z média se produkt odstraní relativně velice snadno. Nedochází při tom k poškození živých buněk kvasinek, které se isolují v přirozené formě schopné dalšího použití bez toho, že by bylo potřeba odstraňovat nepotřebné sekvence nebo jiné artefakty exprese (například methionin připojený na první N25 konec aminokyseliny , jako důsledek vyjádření AUG jako iniciační signální kodon při translaci).

Médium lze tedy získat v takovém stavu, který prakticky neobsahuje volné živé nebo zničené buňky (tj. rozložené nebo jinak poničené buňky); pokud jde o žádaný produkt v médiu, pak je výhodné, že se mohou snadněji používat čisticí techniky. Takový produkt je po vy čištění připraven pro zamýšlené použití. Například lidský leukocytový interferon se používá jako protivirové 30 a/nebo protinádorové činidlo u člověka (viz například citace 7 až 17).

Souhrnně, tento vynález se týká proteinu, který je normálně pro organismus kvasinek heterologní a není pro jejich životaschopnost potřebný, v diskrétní formě bez doprovodných nepotřebných sekvencí nebo jiných artefaktů exprese. Tento protein je produktem exprese, opracování 35 a sekrece proteinu kvasinkami a také prostředků a způsobů použitých při vý robě takového proteinu. Dále se podle tohoto vynálezu získávají kultury kvasinek, které jsou schopné produkovat takový protein, a výsledné médium kultury kvasinek, které takový protein obsahuje jako produkt.

Termín heterologní protein tak, jak je zde používán, znamená protein, který normálně není organismem kvasinek produkován ani není pro životaschopnost kvasinek potřebný. V tomto termínu je zahrnuto, že DNA, která kóduje takový protein, je funkčně vložena via technologii rekombinantní DNA do expresního vektoru a ten je dále použit hostitelským organismem kvasinek ktransformaci. Funkční vložení DNA znamená vložení DNA kódující heterologní 45 protein a presekvenci do expresního vektoru za kontroly exprese řídicím promotorovým systémem. Příklady takových heterologních proteinů jsou hormon, například lidský růstový hormon, hovězí růstový hormon atd., lymfokiny, enzymy, interferony, například lidský fibroplast, lidské imunní a lidské a hybridní leukocytové interferony atd., virové antigeny nebo imunogeny, např. antigeny nemocí nohou a úst. chřipkový antigenový protein, jaderné 50 a povrchové antigeny hepatitidy atd., a další různé polvpeptidy, například lidsky serumalbumin, lidský insulin, různé glykoproteiny atd. Pojmy heterologní presekvence” nebo heterologní signální polypeptid znamenají takové polvpeptidy, které normálně nejsou produkovány ani používány kvasinkovým systémem. Lze je vybrat ze signálního polypeptidů odpovídajícího

-2CZ 28290S B6 příslušnému heterolognímu proteinu nebo jiného heterologního (signálního) polypeptidu, který je funkčně spojen s příslušným heterologním proteinem.

Pojem sekrece tak, jak je zde používán, znamená dopravu produktu plasmovou membránou alespoň do buněčné stěny organismu kvasinek nebo touto buněčnou stěnou do média obklopujícího kulturu buněk. V této souvislosti je tomu třeba rozumět tak, že sekretovaný produkt je v některých případech nějakým způsobem spojen s buněčnou stěnou, snad je to nutné kvůli různým čisticím postupům nebo modifikaci struktury a funkce hostitelské buňky - kvasinky. Pojem opracování znamená buněčné odštěpení signálního polypeptidu od maturačního 10 proteinu, takže dochází k produkci proteinu, který není doprovázen externím peptidem v - tak zvané - maturační formě. Mezi externí peptidy patří peptidové artefakty exprese, jako je například methionin, jak bylo shora uvedeno. Opracování připouští nekonsekvenční neaktivační odštěpení signálního polypeptidu blízko místa spojení signálního polypeptidu s maturačním proteinem.

Příklady provedení vynálezu

Obrázek 1 popisuje srovnání sekvence aminokyselin signálního prepeptidu lidského IFN-al (pře

D), IFN-a2 (pre A), IFN-al,2 (pře D/A), IFN-γ (pre γ) aINF-β (pre β). Aminokyseliny, které jsou podtrženy, jsou aminokyselinové sekvence, které jsou různé pro pre A a pre D. Místo Ddel znamená spojení presekvencí D a A při přípravě hybridní pre D/A presekvence.

Obrázek 2 je diagram kvasnicového expresního plasmidů YEpIPT, který je zde použit jako 25 obecný vektor exprese různých genových insertů (vkladů). Tento diagram ukazuje některá jeho restrikční místa a různé oblasti zájmu.

Obrázek 3 ukazuje konstrukci EcoRI fragmentu obsahující pre-plus IFN-al gen pro přímou expresi IFN-al v kvasinkách.

Obrázek 4 ukazuje konstrukci EcoRI fragmentu obsahující maturační IFN-a2 gen pro přímou expresi v kvasinkách.

Obrázek 5 ukazuje konstrukci EcoRI fragmentu obsahující pre-plus IFN-a2 gen s kódovací 35 sekvencí prvních 14 aminokyselin v presekvencí pre-IFN-al pro přímou expresi IFN-a2 v kvasinkách.

Obrázek 6 ukazuje konstrukci EcoRI fragment obsahující pre-plus IFN-γ gen se 70 bp [pokud zde kdekoliv bude uvedena jednotka bp, pak tato jednotka znamená pár baží; 1 kbp je pak rovno 40 1000 bp] leader sekvence (vedoucí sekvence) předcházející iniciaci ATG kodonu pro expresi

IFN-γ v kvasinkách.

Obrázek 7 ukazuje konstrukci EcoRI fragment obsahující pre-plus IFN-γ gen pro přímou expresi INF-γ v kvasinkách.

V obrázku 8 jsou zahrnuty všechny konstrukce, které se používají v praxi podle tohoto vynálezu při expresi, opracování a sekreci různých IFN genů v kvasinkách.

Obrázek 9 je kultivační křivka a) ΥΕρΙΡΤ-LeIFA f/pep4-3 a b) YEplPT-preLeIFA53t/pep4-3 měřená pomocí Abseóo nm· Média byla testována na interferonovou účinnost pro ad a) a ad b) biotestem (bioassay). Čas znamená počet hodin kultivace při 30 °C.

- j CZ 282905 B6

Obrázek 10A je křivka kultivace 51 fermentace YEplPT-preLeIFA53t/pep4-3. (O) znamená Abssfio nm a (O) milionů jednotek na litr interferonové aktivity uvnitř buněk.

Obrázek 10B je stejná kultivační křivka jako je popsána na obrázku 10A udávající aktivitu 5 získanou z média.

Obrázek 11 je eluční profil média pře D/A LelF z kolony s monoklonální protilátkou.

Obrázek 12 je vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC) maxima A interferonu z kolony 10 s monoklonální protilátkou.

Obrázek 13 je výsledek aminokyselinové sekvence produktu získané po vyčištění na HPLC.

Obrázek 14 popisuje různé konstrukce, které se používají při produkci lidského růstového 15 hormonu (HGH) podle tohoto vynálezu.

Obrázek A schematicky ilustruje restrikční mapu 3,1 kbp Hind ΠΙ insertu vektoru pBl z něhož se isoluje PGK promotor. Je označeno vložení (inserce) EcoRI místa a Xbal místa na místě sousedícím s 5'-místem DNA genu PGK.

Obrázek B ilustruje 5'-konec sekvence plus původní kódovací sekvenci PGK genu před vložením Xbal a EcoRI míst.

Obrázek C ilustruje schematicky techniky, které jsou používány pro vložení Xbal místa do 25 polohy 8 v PGK promotoru a pro isolaci 39 bp fragmentu sousedícího s 5'-sekvencí PGK obsahující tento Xbal konec a Sau3A konec.

Obrázek D schematicky ilustruje konstrukci 304 bp fragmentu obsahujícího shora uvedený 39 bp fragment, další PGK 5'-sekvenci (265 bp) od Pvul k Sau3A (viz obr. A) a EcoRI místo přilehlé 30 k Xbal.

Obrázek E schematicky ilustruje konstrukci 1500 bp PGK promotorového fragmentu (HindlII/EcoRI). který vedle fragmentu konstruovaného na obrázku 4, obsahuje 1300 bp fragment Hind III až Pvul od PGK 5'-konce sekvence (viz obrázek A).

Všechny DNA restrikční a metabolické enzymy byly získány zNew England Biolabs a z Bethesda Research Laboratories. DNA restrikční enzym a metabolické enzymy byly používány za těch podmínek a v takových pufrech, které jsou popsány příslušnými výrobci. ATP a deoxynukletidové trifosfáty dATP, dGTP, dCTP a dTTP byly získány od PL Biochemicals. 40 DNA linkery byly dělány standardními způsoby.

Čištění kovalentně uzavřených cirkulámích plasmidů DNA kyselin z E.coli (18) a transformace E.coli (19) byly dělány shora popsanými postupy. Minitesty (miniscreen) s E.coli byly prováděny tak, jak je to popsáno v literatuře (20). Kvasinky byly transformovány tak, jak to bylo 45 dříve popsáno (21), avšak s následujícími modifikacemi. Bylo používáno 200 ml buněk při koncentraci 2.10' buněk/ml. Tyto buňky byly promyly 25 ml vody centrifugací. Pak byly zpracovány s 10 ml 1M sorbitolu, 25 mM EDTA (pH = 8) a 50 mM dithiothreitolu při 30 °C během 10 minut. Následovalo promytí deseti mililitry 1M sorbitolu. Peletované buňky byly pak mírně resuspendovány v 10 ml SCE (1M sorbitol, 0,lM citran sodný, pH = 5,8, aO.OlM EDTA) 50 a zpracovány při 30 °C se 200 pg zymolyasy 60 000 (Kirin Brewery). Přidáním 100 μΐ suspenze k 0,9 ml 10% SDS došlo z 80 % ke sferoplastingu; zředěním buněk před přidáním enzymu byla změřena Abs_8Oo nm jako 0 procent (rozklad v 10% SDS má za následek pokles Abs_soo). Buňky byly promyty 3 x 10 ml 1M sorbitolu. Buňky lze skladovat několik dnů při 0 °C v sorbitolu.

-4CZ 28290S B6

Potom byly buňky promyty jednou 1M sorbitolem, lOmM chloridem vápenatým a lOmM TrisHC1 (pH 7,4), načež byly suspendovány v 1 ml stejného roztoku. Pět až 15 μg vyčištěného plasmidu DNA nebo 20 μΐ z E.coli odvozené DNA (2/5 plasmidu DNA z 5 ml stacionární kultury E.coli vyrostlé v LB) bylo po přidání mírně mícháno po dobu 15 minut se 100 μΐ suspendovaných buněk. Pak se přidá 1 ml roztoku, který obsahuje 20 procent (hmotnostní procenta na objemová procenta) polyethylenglykolu 4000 (Baker), lOmM chlorid vápenatý a lOmM Tris-HCl (pH 7,5). Suspenze se mírně míchá 15 minut. Buňky se pak odcentrifugují, mírně suspendují ve 200 μΐ SOS (1M sorbitol, 33,5 % YEPD broth (objemová procenta) a6,5mM chlorid vápenatý) ainkubují se 20 minut při teplotě 30 °C. 100 μΐ této suspenze se 10 přenese do Petriho misky, která obsahuje 20 ml spodního agaru (182 g sorbitolu, 20 g glukosy,

6,7 g YNB a 30 g Difco agaru na litr vody) a překryje se 10 ml vrchního agaru o teplotě 50 °C [stejný jako spodní agar až na to, že obsahuje 1 ml adeninu (1,2 mg/1 ml), 1 ml uracilu (2,4 mg na 1 ml) a 1 ml směsi trp-drop-out na 50 ml spodního agaru (trp-drop-out směs obsahuje ve 100 ml vody tyto aminokyseliny: 0,2 g arg, 0,1 g his, 0,6 g ile, 0,6 g leu, 0,4 g lys, 0,1 g met, 15 0,6 g phe a 0,5 g thr)]. Tato Trp’ selekce má za výsledek 10³ až 10⁴ kvasinkových transformantů na pg plasmidu DNA.

Kvasinkový plasmid byl získán z kvasinek kultivací 15 ml kvasinek do stacionární fáze (Abs₆6o ⁼ 5 až 6) v YNB + CAA (o kmenech a médiích viz dále o dva odstavce později) sferoplastací jako 20 ve shora uvedeném postupu, peletací buněk a za použití E.coli minitestovacího postupu (bez lysozomu) jak popsáno v citaci 20.

Stabilita plasmidů v kvasinkách byla stanovena zředěním buněk během selektivní kultivace v YNB + CAA a umístěním na YEPD desky (neselektivní). Po dvou dnech kultivace při 30 °C 25 byly tyto desky přerazítkovány na YNB + CAA desky (Trp' selekce). Stabilita plasmidu v procentech byla vypočtena jako počet kolonií, které rostly neselektivně, minus ty, které nerostly selektivně, děleno počteno kolonií, které vyrostly neselektivně, krát 100.

Pro všechny další bakteriální transformace bylo použito E.coli K-12 kmen 294 (ATCC č. 31446) (22). Pro kvasinkové transformace byly použity kvasinkové kmeny pep4-3 (20B-12, d trpí pep43) (23) a GM3C-2 (a, leu 2-3, leu 2-112, trp 1-1, his 4-519, cyc 1-1, cyp 3-1) (24). Kvasinkové kmeny 20B-12 aGM3C-2 byly uloženy bez omezení v Američan Type Culture Collection, ATCC č. 20 626 a 20 625, dne 5. března 1982. Lze použít různé kmeny kvasinek - viz Lodder a spol.: The Yeast, a Taxonomie Study, North-Holland Publ. Co., Amsterodam. Podobně lze používat i různá média - viz Difco Manual of Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiological and Clinical Laboratory Procedures, 9. vydání, Difco Laboratories, lne., Detroit, Michigan (1953).

LB byl podle Millera (25); po tom, co médiu bylo autoklávováno a ochlazeno, bylo přidáno

20 pg/ml ampicilinu (Sigma). Kvasinky byly kultivovány na následujících médiích: YEPD s obsahem 1 procenta kvasinkového extraktu, 2 procent peptonu a 2 procent glukosy ± 3 procenta Difco agaru; YNB + CAA s obsahem 6,7 g kvasinkové dusíkové báse (bez aminokyselin) (YNB) (Difco), 10 mg adeninu, 10 mg uracilu, 5 gramů Difco kasaminokyselin (CAA). 20 gramů glukosy ± 30 gramů agaru na litr (použito pro Trp' selekci).

Individuální kolonie kvasinek kmenů YEpIPT-preLeIF-A 53t/pep4-3 a YEpIPT-LelF-Λ L'pep4-3 byly kultivovány 7 hodin při 30 °C ve 100 ml YNB - CAA až do A_óóo přibližné 1,1. Sto mililitrů této kultury se přidáním YNB + CAA zředí na 1 litr. Získá se tak roztok s A₆₆₀ asi 0.1. Takto připravený 1 litr kultury se pak kultivuje při 30 °C. Periodicky se odebírá lOml podíl pro měření 50 optické hustoty, produkce interferonu a sekrece interferonu. Při testu se každý lOml podíl 15 minut centrifuguje při 7000 otáčkách za minutu v Sorval RC3B. Supernatant (média) se testuje bez zředění. Buňky se resuspendují v 0,4 ml 7M hvdrochloridu guanidinu, který obsahuje stejný objem skleněných kuliček, a směsí se víří dvakrát dvě minuty při vysoké rychlosti. Buněčný lysát

- 5 CZ 282905 B6 se pro bioassay (biotest) zředí PBS/BSA [150mM chlorid sodný, 20mM fosforečnan sodný (pH = 7,9) a 0,5% hovězí serumalbumin].

Extrakty kvasinek se na interferon testují srovnáním s interferonovými standardy testem inhibice (26) cytopathického efektu (CPE). Extrakty kvasinek se připravují následovně: Deset mililitrů kultury se nechá růst v YNB + CAA dokud se nedosáhne A₆óo asi 1 až 2. Buňky se odcentrifuguj í a pak se znovu suspendují ve 3 ml 1,2M sorbitolu, lOmM dihydrogenfosforečnanu draselného, pH = 6,8, a 1 % zymolyasy 60 000 a inkubují se 30 minut při 30 °C (tak, aby došlo k90% sferoplastingu). Sferoplasty se peletují při 3000-násobku g 10 minut, resuspendují se ve 150 μΐ ιο 7M hydrochloridu guanidinu (GHCI) a lmM fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF). Extrakty se bezprostředně před testem zředí 20krát až lOOkrát PBS/BSA pufrem (20mM dihydrogenfosforečnan sodný, pH = 7,4, 150mM chlorid sodný a 0,5 % BSA). Alternativně se 10 ml buněk při stejné A₆óo peletuje a resuspenduje v 0,4 ml 7M GHCI v Eppendorfově zkumavce (1,5 ml), která obsahuje asi 0.4 ml skleněných kuliček (0,45 x 0,5 mm, B. Braun Mulsrungen AG). Tyto 15 zkumavky se víří 2x2 minuty při nejvyšší rychlosti; mezi tím se ponechají v ledu. Extrakty se centrifugují 0,5 minuty v Eppendorfově zkumavce. Pak se zředí PBS/BSA pufrem jak shora uvedeno. Bioassay (biotest) se provádí pro LelF A, LelF D a pro pre-formy s MDBK buňkami, pro IFN-γ a pro pre IFN-γ s Hela buňkami (26).

Jedna kolonie kvasinek kmene YEpIPT-preLeIF-A53t/pep4-3 se nechá růst při 30 °C v 500 ml YNB + CAA do A₆₆₆ asi 2,4. Pět set mililitrů této kultury se zředí 5 1 YNB + CAA; výsledkem je A₆6o asi 0,21. Výsledných 5 litrů kultury se nechá růst při 30 °C do Ačóo = 4. V tomto okamžiku se 5 1 kultury centrifuguje 10 minut při 7000 otáčkách/minutu. Během fermentace se periodicky odebírají lOml podíly pro měření optické hustoty, produkce interferonu a sekrece interferonu.

Před testem se každý podíl centrifuguje 5 minut na stolní chlazené centrifuze, kde se buňky oddělují od média. Médium a buňky se testují jak shora popsáno (viz obrázky 9, 10A a 10B).

Médium se zahustí na konečný objem 200 ml. Po diafiltraci s tris/cys/EDTA o pH = 8,0 na ultrafiltrační membráně (mol. hm. 1000, O-PS, Osmonics) v přístroji Amicon TCF 10, se retentát 30 (200 ml) nechá projít l,5ml imunoafmitní kolonou, která obsahuje monoklonální protilátku na

LeIF-Α kovalentně vázanou na Affigel 10 (Bio-Rad), při průtoku 15 ml/h. Na kolonu se navázalo více než 80 % aktivity (interferonové) původního roztoku. Proteklá kapalina se znovu nechá projít kolonou při průtoku 40 ml/hodinu. Nyní zůstalo v proteklé kapalině přibližně 7 % původní interferonové aktivity. Kolona se promyje 0,2M chloridem sodným v tris/cys/EDTA o pH = 8,0.

Během tohoto promývání se vymylo asi 1,7 procenta účinnosti.

Hlavní část interferonové účinnosti (asi 50 % původní účinnosti) se pak eluuje z kolony deionisovanou vodou (51,5 ml) o pH 5,5. Nakonec se kolona promyje 22,5 ml 0,2M kyseliny octové. Eluuje se tak všechen zbývající protein (eluovalo se asi 8 % původní účinnosti). Po eluci 40 kyselinou octovou se kolona ekvilibruje znovu a to účinkem tris/cys/EDTA o pH = 8,0. Během promývání vodou, kyselinou octovou a tris/cys/EDTA se odebírají frakce o velikosti 2,25 až

4,5 ml (viz obr. 11). Frakce č. 1 až 7 se spojí a lyofilizují se dosucha. Zbytek se rozpustí ve 200 μΐ 0,1% kyseliny trifluoroctové (TFA), pH = 2,5, a dále se čistí HPLC na koloně obsahující Synchropak RP-P. Kolona se eluuje gradientem (lineární), při čemž se koncentrace acetonitrilu 45 v 0,1% TFA o pH = 2.5 zvyšuje postupně od 0 do 100 %. Průtok 1 ml/minutu. Odebírají se jednomililitrové frakce, které se po zředění PBS/BSA, testují jak shora popsáno. Jako kontrola se chromatografuje také vyčištěný vzorek (2,5 pg) IFN-A (obr. 12). Interferonová aktivita eluovaná z kolony je soustředěna kolem frakce 39 jako jediné maximu. Tato frakce se lyofilizuje dosucha. Zbytek se podrobí sekvenční analýze.

Sekvenční analýza byla založena na Edmanově degradaci (27). Vzorek se vloží do kelímku sekvenátoru Beckamn 890 B. Jako nosič v kelímku se použije Polybren™ (poly-Ν,Ν,Ν’,Ν¹tetramethyl-N-trimethylenhexamethylen-diamonium-diacetát) (28). Sekvenátor byl modifikován

-6CZ 282905 B6 vymrazovačem a některými změnami v programu, aby bylo sníženo pozadí maxim. Použitá činidla - 0,1 molámí pufr Quadrol, fenylisothiokyanatan a heptafluormáselná kyselina - byla Beckmanova sekvenčního stupně.

Mezi modifikace patří také automatická konverse 2-anilino-5-thiazolinových derivátů po jejich extrakci ze sekvenátoru. 1-Chlorbutan v reakční nádobce Pierce ™ byl sušen nad dusíkem. Ke 2anilino-5-thiazolinonu se pak přidá vodná 25% trifluoroctová kyselina (TFA). Směs se zahříváním po dobu 10 minut na 20 °C převede na 3-fenyl-2-thiohydantoin (PTH-derivát) (29). PTH-aminokyselinový zbytek se pak automaticky rozpustí v 50% vodném acetonitrilu io a chromatografuje se na obrácených fázích vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC).

Každá PTH aminokyselina se pak identifikuje srovnáním s retenčním časem standardní směsi aminokyselin, které byly dány do konversní nádobky a zpracovány stejně jako cyklus v sekvenátoru. Výsledky jsou souhrnně uvedeny na obrázku 13 a diskutovány jinde.

Západní blotovací procedura. Proteiny byly nejdříve podrobeny elektroforéze na polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu (46, 47) před elektroforetickým přenosem na nitrocelulosový papír (S + S BA 85) a následnou imunologickou identifikací s HGH. Po rychlém promytí gelu a nitrocelulosového papíru transfemím pufrem, který obsahoval 25mM Tris a 192mM glycin, pH = 8,4, byl použit aparát pro přenos (Electroblot, E.C. Apperatus Corp., St.

Petersburg, Fl.). Přenos byl prováděn 1,5 hodiny při 400 mA. Potom byl blot přemístěn do 50mM Tris, pH - 7,4, 0,15M chloridu sodného, 5mM EDTA, 0,25% želatiny (hmotnostní procenta v objemový ch procentech), 0,05 % NP-40 a mírně třepán přes noc. Příslušné zředěné králičí anti-lidské hGH antisérum bylo umístěno do plastického sáčku s blotem aNP40/želatinovým pufrem (typicky 100 μΐ/cm²) a inkubováno 2 hodiny za teploty místnosti za mírného třepání (houpání). Blot byl rychle promyt vodou, pak 1 hodinu NP-40/želatinovým pufrem a zkoušen se [^l2:iI] Proteinem A (New England Nuclear) zředěným NP-40/želatinovým pufrem v zataveném sáčku na jídlo 1 hodinu za teploty místnosti a mírného houpání. Po několikahodinovém promytí vodou se blot obalí celofánem a umístí se přes noc do kazety s filmem X-Omat-AR (Kodak) s kontrastním filtrem při - 70 °C.

Polyakrylamidové gely, které obsahují protein, byly barveny způsobem, který popisují Oakley a spol. (41).

Sekreční signální sekvence savčích interferonových genů. Nedávná isolace cDNA kyselin 35 obsahujících geny pro leukocytové (7), fibroblastové (10) a immunní interferony a nedávné vyvinutí kvasinek jako systému pro expresi heterologních genů (14), umožnilo expresi heterologních genů obsahujících kódovací oblasti signálních peptidových sekvencí v kvasinkách.

Obrázek 1 ukazuje signální sekvence pro pět různých interferonů. O těchto amino-terminálních 40 sekvencích se věří, že usnadňují sekreci interferonových proteinů ze savčích buněk. Během opracování se signální sekvence odstraní specifickým protesovým štěpením mezi polohami +1 a-1. Získá se tak to, co je známo jako maturační forma interferonů. Tyto sekvence mají obecné charakteristiky jiných sekrečních signálních sekvencí (31). Všechny jsou velmi hodrofóbní, asi stejně dlouhé jako jiné signály a mají málo aminokyselinu nalevo od místa štěpení. Ačkoliv 45 preLelFA, preLelFD a preIFN-γ štěpí mezi glycinem a cysteinem, není to obecné pravidlo pro jiné savčí signály, jak ukazují preIFN-β.

Skutečně neexistuje signální žádná sekvence nej lepšího souhlasu mezi organismy nebo uvnitř samotného organismu. Rovněž neexistuje žádná sekvence nejlepšího souhlasu vmiste štěpení 50 mezi signální sekvencí a maturační formou proteinového produktu.

Bylo proto velmi zajímavé pokusit se o expresi těchto preinterferonů v kvasinkách a určit, zda by bylo možné, aby tyto heterologní proteiny byly sekretovány z kvasinek a co by mohlo být

-7CZ 282905 B6 původcem opracování těchto proteinů. Ačkoliv kvasinky stejně jako savčí buňky jsou eukaiyotickým organismem a ačkoliv mají kvasinky v mnoha směrech podobnou sekreční cestu jako vyšší eukaryoty (1, 32), jsou velmi primitivním eukaryotem. Patřičná funkce a opracování těchto genových produktů by vyžadovala, aby tento proces byl zachován během evoluce od kvasin5 kových k savčím buňkám, což zdaleka není zřejmé.

Informace o konstrukci plasmidu pro expresi heterologního genu v kvasinkách byla již publikována (14).

Plasmid, který byl v této práci použit, je uveden na obrázku 2. Tento plasmid obsahuje část pBR322 (33) s genem ampicilinové resistence (Ap^R a E.Coli počátek replikace pro selekci a stálý růst v E.coli (použitý jako meziprodukt mezi konstrukcí in vitro a transformací kvasinek). Plasmid obsahuje také TRP 1 gen na fragmentu EcoRI - Pst 1, který pochází zchromosomu III kvasinek (34 - 36). Tento gen dovoluje selekci v trp Γ kvasinek. Lze ho tedy použít pro isolaci kvasinkových buněk, které obsahují plasmid, a pro zachování plasmidu. Plasmid obsahuje také kvasinkový počátek replikace na 2,0 kbp fragmentu z endogenního kvasnicové 2 μ plasmidové DNA (37). Tento počátek umožňuje autonomní replikaci DNA v kvasinkách a udržování jako plasmid.

Další hlavní složkou systému je kvasnicový PGK promotorový fragment, který počíná transkripci blízko jediného EcoRI plasmidového místa (další EcoRI místo bylo odstraněno zarovnáním konce ligace za použití E.coli DNA polymerasy I (Klenowův fragment)).

Isolace PGK genu byla diskutována jinde (37a), rovněž tak i konstrukce 1,6 kbp fragmentu 25 promotoru. Fragment Hind III/Bgl II z oblasti kvasnicového TRP 1 genu (34 - 36) chromosomu

III byl použít jako konvertor Hind III na Bgl II pro ligaci s místem Bam HI pBR322, způsobující, že plasmid je citlivý na tetracyklin (Tc^s). Dále by mělo být uvedeno, že fragment 2,0 kbp z 2 μ DNA má další funkci v tom, že obsahuje transkripční terminační/polyadenylační signál, který je normálně terminačním signálem Able genu ve 2 μ plasmidu (37). Taková oblast je pro dobrou 30 expresi důležitá. Jestliže je vektor vložen do kvasinek, pak může dojít k expresi genových insertů (jako EcoRI fragmenty ve správné orientaci) jako protein.

Konstrukce kvasinkových plasmidů pro expresi různých interferonových genů. Kvasinkový expresní plasmid YEpIPT obsahuje EcoRI restrikční místo. Vložení cizího genu do tohoto 35 jediného EcoRI místa vede k expresi tohoto genu pod kontrolou kvasnicového (PGK) promotoru.

Vhodným způsobem vložení různých intergeronových genů do EcoRI místa tohoto kvasnicového plasmidu je mít DNA fragmenty s EcoRI místy vedle iniciačního a terminačního kodonu různých interferonových genů. Zde je popsána konstrukce takových EcoRI fragmentů pro expresi interferonových genů. Na 3'konci genu je důležité použít konvertorů na EcoRI tak, aby nekončily 40 transkripci, ale aby dovolovaly transkripci přes 2 μ terminátor.

Zde popisujeme konstrukci EcoRI místa předcházející ATG iniciační kodon pro maturační IFNal gen (14, 17). maturační IFN-a2 gen (7), maturační IFN-β gen (10) a maturační IFN-γ gen (30).

DNA restrikční analýza ukazuje, že existuje EcoRI místo vhodně umístěné v 3'-nekódovací oblasti cDNA klonu IFN-al (8): štěpením plasmidu pLeIFD3 (17) EcoRI se generuje 583 bp EcoRI fragment, který' obsahuje úplný IFN-al gen.

Obrázek 3 ukazuje konstrukci EcoRI fragment, který obsahuje pre-IFN-al gen. Hae III místo je umístěno mezi první a druhou aminokyselinou pre-IFN-al (8). Isoluje se Hae III částečně odštěpený fragment (254 bp), který se nachází mezi tímto Hae III místem a Bgl II místem ve středu kódovací oblasti. Komplementární syntetický oligonukleotid 5'-CCATGAATTCATGG-3'

-8CZ 282905 B6 byl zpracován ligací s 254 bp Hae III - Bgl II fragmentem, aby se generovalo EcoRI místo předcházející ATG iniciační kodon. 264 bp EcoRI - Bgl II fragment byl pak isolován štěpením ligační směsi s EcoRI a Bgl II. Tento EcoRI - Bgl II fragment, který· obsahuje čelní polovinu pre IFN-al genu, byl pak ligován na zadní polovinu pre-IFN-al genu. 372 bp fragment (Bgl Π 5 EcoRI) isolovaný štěpením IFN-al klonu s Bgl II a EcoRI. EcoRI fragment, který- obsahuje celý pre-IFN-al gen, byl pak generován štěpením ligační směsi s EcoRI a isolací 636 bp fragmentu.

Obrázek 4 ukazuje konstrukci EcoRI fragmentu, který obsahuje IFN-a2 gen. 876 bp EcoRI - Pst I fragment, který' obsahuje maturační IFN-a2 gen s EcoRI místem, které předchází ATG iniciační ío kodon, se 400 bp 3'-nekódovací oblastí odvozenou od cDNA klonu, byl isolován štěpením plasmid pLeIFA25 (7) působením EcoRI a Pst I. Pst I konec tohoto 876 bp fragmentu byl pak převeden za použiti adaptorového fragmentu na EcoRI místo. Tento 978 bp adaptorový fragment obsahuje vnitřní EcoRI místo a Pst I místa na obou koncích. 230 bp tohoto fragmentu od jednoho Pst I konce k EcoRI místu je odvozen od kvasinkové plasmidové 2 μ DNA (37). 748 bp zbytek 15 fragmentu od EcoRI místa ke druhému Pst I konci je odvozen od bakteriálního plasmidu pBR322 (celý fragment je odvozen od YEpl3) (37b). Ligace tohoto adaptorového fragmentu na 876 bp EcoRI-Pst I fragment obsahující maturační IFN-a2 gen poskytne po štěpení s EcoRI 1096 bp fragment obsahující maturační IFN-a2 gen s EcoRI místy na obou koncích.

Na obrázku 5 je uvedena konstrukce EcoRI fragmentu obsahující pre-IFN-a2 gen. Restrikční analýza ukazuje, že obvyklé Dde I místo je přítomno mezi 14. a 15. aminokyselinou v presekvenci jak pre-IFN-al, tak a2 genu. Ligace 44 bp EcoRI - Dde I fragmentu, odvozeného od EcoRI fragment kódující pre-IFN-al gen, s 900 bp Ddel - Pst I fragmentem, odvozeným od cDNA klonu IFN-a2, a následné postupné štěpení s EcoRI a Pst I dává vznik 944 bp fragmentu.

Tento 944 bp EcoRI-Pstl fragment obsahuje kódovací sekvenci prvních 14 aminokyselin v prepeptidu odvozeném od IFN-al, kódovací sekvenci zbytku prepeptidu a celý maturační protein odvozený od IFN-a2. Pstl konec tohoto 944 bp fragmentu byl pak převeden na EcoRI místo použitím adaptorového fragmentu jako v případě konstrukce EcoRI fragmentu maturačního IFN-a2.

Na obrázku 6 je ukázána konstrukce EcoRI fragmentu obsahující pre IFN-γ gen, se 70 bp leader sekvencí předcházející ATG kodon. Štěpení IFN-γ cDNA klonu (30) poskytuje 842 bp Sau3A fragment se 60 bp 5'-sousedící sekvencí, celou kódovací oblastí sekvence pre-IFN-γ a 290 bp 3'nekódovací sekvencí. Tento Sau3A fragment byl pak klonován na vektoru pUC7 štěpeným 35 BamHl, plasmidovým protějškem jednovláknového fága M13mp⁷ (38). Plasmid pUC7 byl odvozen od pBR322 tak, že se nejdříve odstraní 2067 bp EcoRI-PvuII fragment obsahující tetracyklinový resistenční gen, pak se vloží 425 bp Haell fragment z fága M13mP7 (38) na Haell místo výsledného plasmidu v poloze 2352 (vzhledem kpBR322 notaci). Haell fragment z mp7 obsahuje N-terminální kódovací oblast E.coli lacZ genu do které bylo mezi 4. a 5. Amino40 kyselinový zbytek β-galaktosidasy vloženo multirestrikční enzymové klonovací místo sekvence.

Vložením cizí-DNA fragmentu do těchto klonovacích míst přerušuje kontinuitu mezi lac promotorem a lacZ genem, takže fenotyp JM83 je transformován plasmidem z lac' na lac'. Jelikož v multirestrikčním klonovacím místě pUCZ jsou dvě EcoRI místa obklopená BamHl místy, štěpením plasmidu obsahujícího 842 bp Sau3A insert s EcoRI by se získal 862 bp 45 fragment obsahující celou pre IFN-γ sekvenci obklopenou EcoRI místy.

Štěpením plasmidu pIFN-γ trp48 (30) s EcoRI a Balí generuje 689 fragment s EcoRI koncem předcházejícím ATG iniciační kodon, celou kódovací sekvenci maturačního IFN-γ a 210 bp nekódovací sekvenci. BglI konec byl pak převeden na EcoRI konec ligací s 29 bp BglI - EcoRI 50 adaptorem odvozeným od shora popsaného pre-IFN-γ EcoRI fragmentu. Následujícím štěpením ligační směsi s EcoRI se získá 718 bp EcoRI fragment obsahující maturační IFN-γ gen.

-9CZ 282905 B6

Obrázek Ί ukazuje konstrukci EcoRI fragmentu obsahující pre-IFN-γ gen s EcoRI koncem a sekvencí AAA předcházející ATG iniciační kodon. EcoRI fragment obsahující pre-IFN-γ gen, který byl popsán dříve, byl štěpen působením EcoRI a MboII za vzniku 184 bp fragmentu. Tento fragment, obsahující čelní část pre-IFN-γ genu, byl tepelně denaturován a napojen (10) na 5'fosforylovaný syntetický oligonukleotid 5’-pATGAAATATACA kódující první čtyři aminokyseliny pre-IFN-γ genu. Spodní řetězec EcoRI-MboII fragmentu a oligonukleotid, Klenowův fragment E.coli DNA polymerasy byly použity k syntéze horního řetězce a k odstranění 3’přečnívajícího konce postranního řetězce. Výsledný 178 bp zarovnaný fragment, který se nalézá mezi ATG iniciačním kodonem a prvním MboII místem na dolním řetězci, se pak EcoRI linkerem liguje ke komplementární sekvenci 5’-TTTGAATTCAAA-3'. Štěpením ligační směsi s EcoRI a Ddel vznikne 165 bp EcoRI-Ddel fragment, který obsahuje čelní část pre-IFN-γ genu. Celý gen byl pak připraven ligací 600 bp Ddel - EcoRI fragmentu, který obsahuje zadní část INFγ genu a 3'-nekódovací oblast. Ligační směs pak byla štěpena s EcoRI za vzniku 765 bp EcoRI fragmentu obsahujícího celý pre-IFN-γ gen.

Souhm konstrukcí (I až IX) všech těchto EcoRI fragmentů je uveden na obr. 8. Všechny tyto konstrukce byly umístěny do vektoru YEpIPT (obr. 2) pro pokusy exprese a sekrece za použití kvasinek.

Geny s EcoRI fragmenty z obrázku 8 byly umístěny do plasmidu YEpIPT (obr. 2), byly zkontrolovány v orientaci a za použití trp' komplementace byly uloženy do kvasinek. Kvasinky, které obsahují tyto plasmidy, se testují na interferon testem cytopathické účinnosti (CPE) (26) (biotest) extraktů, materiálu uvolněného z buněčných stěn a média. Interferonové testy byly dělány u všech třech oblastí kultury kvasinek. Výsledky těchto testů jsou uvedeny v tabulce 1.

- 10CZ 282905 B6

Ο_λ cn Ο_λ cm qs

		m			o
oo	<ΖΊ	r-	ΙΖΊ
o ΟΛ	o o	o ΟΛ	O ΟΛ	Q	Q
o o o	o*	cT	θ' o	Z	Z

Ό O o o*

Ό o

cd o o o

© o ©

S© 5©

O o o’ c>

o θ' konstruk- hladiny exprese interferonu

G 5 *-» o k. G

O

Q >C ©

>

CL >

tf tr>	Γ*Ί
o o	o
G> <O	1 °
© θ' O θ'	! θ'

O, πγ ·ο γί cn m Q A — o ~ o θ' o” Z Z ci ó z z ci ci z z

Ό © Ό Ό — OO od ~~ c*y Oζ>.

O* o*— >> © > ©

t> o

~ © © ol «3 > cl o ©I © >o

CM 1	CM t	CM			ÍN
o	o	rn c*i c*i Q	m	m	ó
	m		Tj-	Tt	m
S O	C	Q. 2. GS O OJ u *q a. x x U	a cl	o. ω CL	Σ o

I TF

CL <υ cl

		<			<
< <	<	Z			Z
X X	X	Q			Q
4> 4>	ω	Q			u
X X	X	+			-L
< < Q Q	< Q x	Z	O s un	<υ Q 5	ž ©	O 'S·.	D O S	>Z	>- 1 Z
OJ 1> — i—	2 Ž	<D	O _c/)	> ©	Q	\r.	> ©	1)
X X	X X	X.	o	k.	1)	x>	k.
' '—-		CL	ťn	C/5	CL		yj	CL	CL

a) Viz způsoby přípravy extraktu. Je třeba si povšimnout, že pro extrakty jsou použity dva způsoby. Jestliže jsou buňky sferoplastovány, pak množství označené uvnitř buněk skutečné znamená materiál uvnitř buněk; jestliže však je uvedeno N.D. (což znamená nestanoveno), pak 5 uvnitř buněk a uvolněno po odstranění buněčných stěn je oboje částí množství uvnitř buněk - tento typ extraktu zahrnuje buňky na skleněných perličkách, aniž by byla buněčná stěna odstraněna. Je třeba si všimnout, že extrakty těchto skleněných kuliček bez sferoplastování byly dělány vždy pro IFN-γ a pro pre-IFN-γ a že místo 7M GHCl byl použit PBS pufr.

b) Pro výpočty se předpokládá, že specifické aktivity LelF A a LelF D jsou 10⁸ U/mg proteinu. Kultura kvasinek obsahuje asi 100 mg proteinu v kultuře při Abs66o ⁼ Ιο) viz způsoby sferoplastování

d) Abs kultury, která byla testována.

e) Procento sekrece je procento uvolnění po odstranění buněčné stěny plus procento vně buňky. Jestliže nedošlo ke sferoplastování, pak procento vyloučené aktivity nezahrnuje vyloučenou aktivitu této buněčné stěny a procento je nižší (možná 1/2) než by skutečně mělo být.

První oblast je uvnitř buňky. U této frakce se změří buněčný extrakt po odstranění buněčné stěny. Definuje se interferonová aktivita, která není sekretována. Dalšími dvěma oblastmi jsou médium (materiál úplně odstraněný, oddělený z buňky kvasinek) a aktivita uvolněná z buněk po odstranění buněčných stěn zymolyasou (vyloučený materiál a zachycený nekovalentně v buněčné 25 stěně). Frakce z média a frakce uvolněná po odstranění buněčné stěny dohromady představují celkový sekretovaný materiál. Jestliže buněčné stěny nejsou odstraněny (viz způsoby), pak aktivita uvnitř buňky zahrnuje také sekretovanou aktivitu obsaženou v buněčné stěně.

K tabulce 1 by se mělo poznamenat, že (pře D/A) LelF A je maturační LelFA gen s hybridní 30 signální peptidovou sekvencí (viz obrázek 1 a 8). Tato konstrukce byla již dříve diskutována.

V přehledu byla konstruována použitím Dde I restrikčního místa jak pro pře LelFD, tak pro pre LelFA. Obrázek l ukazuje toto Dde I místo na aminokyselině - 10. Podtržené aminokyseliny představují rozdíly v aminokyselinových sekvencích pre LelFD a pre LelFA. Hybrid (pre D/A) LelFA je spíše preD než preA.

K expresi obou maturačních LelFA a LelFD genů (konstrukce I a III) dochází v kvasinkách při 1,0% hladině celkového množství buněčných proteinů (byly nalezeny také 2% hladiny). Při špatné orientaci těchto genů nebo pre genů nedochází k expresi. U obou těchto genů ani u maturačního IFN-α genu nedochází k sekreci.

Jestliže jsou však použity presekvence na těchto genech, pak se všechny tři proteiny nacházejí v médiu jako sekretované produkty. V médiu (pre D/A) LelFA při Abséeo = 3 až 4 byly pozorovány až 8% hladiny z celkové aktivity. Je třeba poznamenat, že všechny tyto plasmidy v 95 % buněk kultury rostou Trp' selektivním tlakem, což ukazuje na přítomnost autonomního 45 replikačního plasmidu.

Dále byly zkoumány oboje interferon produkující kvasinky, YEplPT-preLelFA52t/pep4-3 a YEplPT-LelFAL’pep4-3. První z nich obsahují dvě kopie konstrukce IV (obrázek 8) v EcoRI místě YEplPT. Výsledkem je aktivita uvnitř buněk, v buněčných stěnách a vně buněk (médium).

Tento plasmid, který' obsahuje gen ve dvou kopiích (v tandemu - oba s orientací pro příslušnou expresi), byl použit místo konstrukce sjednou kopií, protože dává někdy vyšší hladiny interferonové aktivity v médiu. Byly použity kvasinky pep4-3, protože značně snižují intracelulámí a extracelulární hladiny proteasy (23). To může být výhodné pro získání

- 12 CZ 282905 B6 nedegradovaného proteinu (interferonu) z média.

Druhé obsahují konstrukci III (obr. 8) vYEplPT. K expresi maturačního LelFA genu dochází uvnitř buňky, ale nedochází k sekreci.

Obrázek 9 ilustruje křivku kultivace těchto dvou kvasinkových kmenů v YNB + CAA (Trp selektivní kultivace). Logaritmická fáze pokračuje k Abs₆₆o nm 3 až 4, pak začíná stacionární fáze. Obě křivky jsou v podstatě identické (lze tedy říci, že produkce těchto dvou proteinů [LelFA a(pre D/A) - LelFA] neovlivňuje růst nebo životnost kvasinek). Pro zjištění závislosti produkce interferonu v médiu těmito dvěma kmeny na křivce kultivace byl prováděn biotest (bioassay) média při různých dobách kultivace buněk. Z těchto výsledků je zřejmé, že presekvence na LelFA způsobuje uvolnění interferonové účinnosti v médiu. Bez této sekvence nedochází v podstatě k žádnému uvolnění účinnosti. Je také zřejmé, že hladiny aktivity v médiu dosahují maxima blízko stacionární fáze.

Aby bylo možno určit původ sekrečního procesu (pre D/A) - LelFA v kvasinkovém prostředí, bylo nutné oddělit proteinový produkt od média. Jestliže jsou kvasinky schopné vylučovat protein, pak amino-terminální konec vzniká pravděpodobně nějakým způsobem během sekrečniho procesu, což savčí buňky dělají normálně s pre-interferonovým proteinem. Cílem dalších pokusů bylo stanovit původ tohoto procesu následujícím způsobem:

A) 5L fermentace

Na obrázku 10A je uvedena interferonová aktivita uvnitř buněčných stěn a v buňce během téže fermentace. Tylo extrakty byly dělány peletací s následujícím zpracováním se skleněnými kuličkami v 7M GHC1, takže tato aktivita obsahuje jak intracelulámí materiál, tak i materiál z vnitřních stěn buňky. Tato aktivita dosáhla maxima při asi 25.10⁶ U/l při Abs₆₆o nm 1,5 až 2,0. Lze tedy říci, že intracelulámí interferonová produkce končí v logaritmické fázi před stacionární fází na rozdíl od extracelulámího materiálu. Do média je tak volně sekretováno asi 8 procent aktivity. Avšak opět stejné množství aktivity může být v buněčných stěnách (viz tabulka 1). Extrahovaný materiál obsahuje většinou intracelulámí interferon. Tento materiál se nyní čistí, aby se zjistilo, zdaje nebo není opracován.

Obrázek 10B ukazuje křivku kultivace 51 fermentace YEpIPT-preLeIFA53t/pep4-3 v YNB + CAA. Podle MDBK testu interferonová aktivita na konci fermentace byla asi 2,0.10⁶ U/l. K maximální produkci dochází opět ve stacionární fázi. Je třeba poznamenat, že po dosažení stacionární fáze je interferonový produkt v tomto prostředí velice stálý i při dalším čtyřiadvacetihodinovém třepání při 30 °C. Toto médium bylo použito pro další čisticí stupně.

B) Koncentrace média na immunoafinitní koloně

Médium z YEplPT-preLeIFA53t/pep4-3 bylo nejdříve ultrafiltrováno. Tento koncentrát se nanese na kolonu s monoklonální protilátkou k maturačnímu LelFA. Po promytí 0,2M chloridem sodným v tris/cys/EDTA o pH = 8,0 se interferon eluuje vodou (pH = 5.5). jak ukazuje obrázek

11. Tímto postupem se získá eluované maximum A (šipka ukazuje místo, kde byla použita voda). Maximum představuje 50 % aktivity, která byla na kolonu nanesena. Maximun A bylo spojeno, jak ukazují závorky, a použito pro další čištění. Eluce 0,2M kyselinou octovou poskytla maximum B (šipka ukazuje místo, kde došlo ke změně pufru) a poloha C znamená bod. kdy byl opět použit původní vodný pufr.

C) Zpracování frakce maxima A na HPLC

- 13 CZ 282905 B6

Frakce odpovídající maximu A byly lyofilizovány dosucha. Pak byly chromatografovány na HPLC. Obrázek 12 ilustruje výsledky této chromatografie. Jako kontrola byl odděleně chromatografován vzorek 2,5 pg vyčištěného LelFA (z E.coli).

Jak standard tak (pre D/A)LeIFA (nebo preLeiF A) měly shodné retenční časy, jak je zřejmé z obrázku. Tyto výsledky ukazují, že interferon z média je opracován, protože preLeiF A má značně odlišnou retenční dobu. Frakce z této HPLC na obrázku 12, která je tam vytečkovaná, byla pak použita pro sekvenování proteinu.

ío Obrázek 13 zčásti ukazuje výsledky sekvenování vyčištěného interferonu. Horní sekvence je sekvence, kterou lze očekávat pro (pre D/A) LelF A, jestliže nedochází k opracování. Je ukázán normální bod štěpení tohoto interferonu, který pravděpodobně savčí buňky rozeznávají.

Proteinová sekvence byla interpretována podle toho, která PTH aminokyselina stoupá v každém 15 odpovídajícím Edmanově cyklu a pak klesá v následujícím cyklu. Když není vidět zvýšení kterékoliv jiné PTH aminokyseliny, pak lze předpokládat PTH aminokyselinu, která normálně dává nízké výtěžky (cys, ser, thr, arg, his). Miligramová množství byla vyhodnocována srovnáním ploch interpretovaných výsledků s plochou standardní směsi PTH aminokyselin chromatografovaných stejnou HPLC. Pro zajištění reprodukovatelnosti retenčních časů byl do každého 20 chromatogramu jako vnitřní standard zahrnut norleucin.

Obrázek 13 ukazuje výsledky sekvence proteinů získaných pro vyčištěný (pre D/A) LelF A. Je také uvedena sekvence, která je očekávána, jestliže nedochází k žádnému opracování, a normální místo štěpení tohoto preinterferonu v savčích buňkách. Bylo provedeno nezávisle sekvenování 25 dvou různých vyčištěných vzorků z buněk a z prostředí. Obrázek 13 ukazuje, že většina interferonu v prostředí byla patřičně opracována (64 procent), byla však přítomna také druhá forma (36 procent), která obsahuje další tři aminokyseliny pre-sekvence. Intracelulámí interferon také obsahoval tyto obě formy, ale v poněkud odlišných poměrech, dále obsahoval také třetí formu, která má 8 aminokyselin presekvence. Celá délka presekvence nebyla nikdy nalezena. Z toho se 30 usuzuje, že kvasinky nějakým způsobem opracovávají všechen pre-IFN.

Je možné, že oměněná forma, která obsahuje tři aminokyseliny presekvence, je důsledkem hybridové povahy pre D/A signální sekvence. Proto bylo také zkoumáno opracovávání nehybridového (pre D) LeiF D. Pre D se od pre D/A liší pouze v aminokyselině v poloze -2 (leu 35 versus val). Jestliže bylo zkoumáno opracováváni pre IFNa-1, který byl vyčištěn tak, že neobsahoval médium, byly opět pozorovány obě formy -1 i -3. (obrázek 13). V médiu však byl nalezen minoritní vzorek -14 formy, která pro (pre D/A) LelF A nebyla nalezena.

Pro výzkum sekrece heterologních proteinů ze S. cerevisiae byly zkonstruovány plasmidy pro in 40 vivo transkripci genů pro několik maturacních interferonů (IFN) a několik pre IFN. Kdykoliv byla přítomna kódovací sekvence hydrofóbních signálních peptidů, bylo možno isolovat IFN antivirovou aktivitu jak z hostitelských buněk, tak z kultivačního média, při čemž všechny IFN, jejichž syntéza byla řízena maturačními IFN geny, zůstaly uvnitř buněk. Pokusili jsme se charakterizovat požadavky sekrece vytvořením konstrukcí, v nichž by se interferonový gen získal 45 se svými vlastními přirozenými sekvencemi, jako u (pre D) LelF D, nebo by se získal s hybridní signální sekvencí, označenou jako systém dvou IFN-ct částic, jako u (pre D/A) LelF A. I když obecně kvasinkové buňky, které nesou tyto konstrukce, vylučují IFN do kultivačního média, aktivita kmenů se liší a vzorky IFN po vyčištění a sekvenování se také liší.

Tři formy nesekretovaného interferonu, které představují 90 procent celkové exprese interferonu, byly vyčištěny od buněk nesoucích (pre D/A) LelF A gen. Jedna forma (33 %) byla patřičně opracována (+1, obrázek 13), druhá forma (55 procent) obsahovala tři další aminokyseliny (-3, obrázek 13) a třetí forma (11 %) obsahovala 8 dalších aminokyselin (-8). Poslední forma nebyla

- 14CZ 282905 B6 v médiu pozorována, při čemž IFN s úplnou délkou pre-sekvence nebyl nikdy pozorován ani v buňkách ani v médiu.

Opracování (pře D) LelF D. Místo kultivačních baněk použitých pro (pre D/A) LelF A kvasinky, 5 byly kvasinky pro expresi (pre D) LelF D kultivovány v 101 fermentoru až do A550 = 60.

Při sledování opracování (pre D) LelF D vyčištěného od média (čištění bylo shodné jako u pře D/A LelF A) byly pozorovány +1 i-3 formy (obrázek 13). V médiu byla přítomna také další, minoritní část jako -14 forma. Nebyl nalezen žádný důkaz, že by v kultuře buněk docházelo 10 k rozkladu buněk; to plyne ze srovnání SDS gelové elektroforézy proteinů z média a buněčných proteinů. Zajímavé je, že při této vysoké hustotě kultivace dochází k velmi vysokému procentu sekrece (30 %) LelF D do média. To platí i pro expresi (pre D/A) LelF A.

Zdá se, že kvasinky opracovávají jak sekretovaný, tak nesekretovaný interferon. Množství sekre15 tované aktivity závisí na stadiu kultivace buněk. K maximu dochází ve stacionární fázi v kultivačních baňkách a ke konci fermentací o vysoké hustotě (30 procent v médiu).

Kvasinky, které obsahují plasmidy YEplPT-preLeIFA53t a YEplPT-LelFAl a které byly použity pro předcházející experimenty, byly zkontrolovány odstraněním plasmidů z kvasinek. To bylo 20 provedeno tak, že se isoluje plasmidová DNA z kvasnicového extraktu transformací E.coli, následuje miniscreen DNA preparace a restrikční analýza plasmidových DNA kyselin. Některé plasmidové DNA kyseliny isolované z E.coli byly charakterizovány pro oba typy kvasinek. Ve všech případech plasmidy obsahovaly restrikční sekvenci očekávanou pro přítomnost presekvence na plasmidů obsahujícím (pre D/A) LelF A a nepřítomnost na plasmidů, který obsahuje 25 maturační LelF A.

Restrikční mapa a částečné sekvenování 3,1 kb insertu bBl. 300 gg pBl (37a) se úplně rozštěpí působením HindlII v 500 μΐ reakčním objemu. Následuje elektroforéza v 1% preparativním agarovém (Sea Kelm) gelu. Z ethidiem zabarveného gelu byl oddělen 3,1 kb Hind insert, 30 elektroeluován (39), 2 x extrahován stejnými objemy pufru (nasycený fenol s chloroformem), načež se vysráží ethanolem. Části suspendovaného fragmentu DNA se oddělí a podrobí restrikčnímu štěpení skupinou různých restrikčních enzymů. Získá se tak částečná restrikční mapa, která je uvedena na obrázku A.

30 pg vyčištěného 3,1 kb insertu se odštěpí působením Sau3A. Pak se nechá projít 6% akrylamidovým gelem. Fragmenty, které odpovídají 265 bp a 141 bp, byly každý zvlášť přečištěny shora popsanou elektroelucí. Každý fragment byl pak podroben DNA sekvenční analýze (39).

Část této DNA sekvence byla uvedena na obrázku B. Aminokyseliny, které odpovídají N-terminálním aminokyselinám PGK strukturního genu jsou vytisknuty nad DNA sekvencí.

Syntetický oligonukleotid se sekvencí 5ATTTGTTGTAAA3' se syntetizuje standardními způsoby (40). 100 ng tohoto proteinu se labeluje na 5'konci účinkem 10 jednotek T4 poly45 nukleotid-kinasy ve 20 μΐ reakci, která obsahuje také 200 pCi [γ³²-Ρ]ΑΤΡ. Tento roztok labelovaného příměru se použije v reakci závislé na primeru (očku), která je prvním stupněm vícestupňového procesu, při němž se do PGK 5'sousedící DNA, která předchází PGK strukturní genovou sekvenci, vkládá EcoRI restrikční místo. Vícestupňový- proces je vysvětlen níže.

Stupeň 1 (obrázek C)

Reakce závislá na primeru a klonování 39 bp Xba I - Sau3A PGK části

- 15CZ 282905 B6

100 μg pBl se úplně rozštěpí účinkem HaelII. Potom se nechá projít 6% polyakrylamidovým gelem. Horní pás ethidiem zabarveného gelu (obsahující oblast PGK promotoru) se isoluje elektroelucí jak shora popsáno. Tento 1200 bp HaelII kus DNA se rozštěpí restrikční endonukleasou HindlI. Pak se nechá projít 6% polyakrylamidovým gelem. 650 bp pás se isoluje 5 elektroelucí. Isoluje se 5 pg DNA. Tento 650 bp HaelII-HindlI kus DNA se resuspenduje ve μΐ DIH₂O a pak se smíchá s20 μΐ shora popsaného roztoku fosforylovaného primeru. Tato směs se extrahuje jednou směsí fenolu s chloroformem a vysráží se ethanolem. Vysušená DNA se resuspenduje v 50 μΐ vody. Směs se pak zahřívá sedm minut ve vroucí vodní lázni. Tento roztok se pak ry chle ochladí v lázni ledu s ethanolem (10 až 20 sekund) a pak se přenese do lázně io ledu s vodou. K tomuto roztoku se přidá 50 μΐ roztoku, který obsahuje 10 μΐ pufru DNA polymerasy I (Boehring Mannheim), 10 μΐ předem připraveného roztoku z 2,5 mM každého deoxynukleosidtrifosfátu (dATP, dTTP, dGTP a dCTP), 25 μΐ dIH₂O a 5 jednotek DNA polymerasy I (Klenowův fragment). Tato 100 μΐ reakce se inkubuje 4 hodiny při 37 °C. Roztok se pak jednou extrahuje směsí fenolu s chloroformem, vysráží se ethanolem, vysuší se lyofilizací 15 a pak se úplně štěpí 10 jednotkami Sau3A. Tento roztok se pak nechá projít 6% akrylamidovým gelem. Pás, který svou velikostí odpovídá 39 bp, se oddělí z gelu a isoluje se elektroelucí jak shora uvedeno. Tento 39 bp pás má jeden zarovnaný konec a jeden Sau3A přečnívající konec. Tento fragment se klonuje na modifikovaný pFIFtrp69 vektor (10). 10 μg pFIFtrp69 se linearizuje s Xbal, jednou se extrahuje směsí fenolu s chloroformem a vysráží se ethanolem.

Xbal přečnívající konec byl pak zaplněn použitím DNA polymerasy I(Klenowa fragmentu) v 50 μΐ reakci obsahující 250 μΜ každého nukleosid-trifosfátu. Tato DNA byla oddělena BamHI a potom nechána projít 6% polyakrylamidovým gelem. Vektorový fragment byl z gelu isolován elektroelucí. Pak se suspenduje ve 20 μΐ dIH₂O. 20 ng tohoto vektoru se liguje s 20 ng shora syntetizovaného 39 bp fragmentu 4 hodiny za teploty místnosti. Jedna pětina ligační směsi se použije pro transformaci E.coli kmenem 294 na ampicilinovou resistenci (na LD + 20 pg/ml amp desek). Plasmidy z transformantů byly zkoumány rychlým testovacím postupem (20). Po sekvenční analýze byl vybrán jeden plasmid, pPGK-39 (obrázek C). 20 pg tohoto plasmidu bylo rozštěpeno s Xbal. vysráženo ethanolem a pak zpracováváno s 1000 jednotkami bakteriální alkalické fosfásy při 68 °C 45 minut. DNA byla třikrát extrahována směsí fenolu s chloroformem 30 a vysrážena ethanolem. Defosforylované konce byly pak labelovány ve 20 μΐ reakci, obsahující 200 pCi [δ³²-] ATP a 10 jednotek T₄ polynukleotid-kinasy. Plasmid byl odštěpen Sáli a nechán projít 6% akrylamidovým gelem.

Pás labelovaného insertu byl isolován z gelu a sekvenován chemickou degradační metodou (39). 35 Na 3'-konci tohoto kousku promotoru byla očekávaná DNA sekvence.

Stupeň 2 (obrázek D)

Konstrukce fragmentu 312 bp Pvul - EcoRI PGK promotoru pg pPGK-39 (obr. C) se současně štěpí působením Sáli a Xbal (každého pět jednotek). Pak se podrobí elektroforese na 6% gelu. Elektroelucí byl isolován 390 bp pás, který obsahuje 39 bp kus promotoru. Resuspendovaná DNA byla rozštěpena restrikční endonukleasou Sau3A a pak podrobena elektroforeze na 8% akrylamidovém gelu. Elektroelucí byl isolován 39 bp pás 45 promotoru. Tato DNA obsahovala 39 bp na 5’ - konci PGK promotoru na Sau3A - Xbal fragmentu.

pg pBl bylo rozštěpeno restrikční endonukleasou (působením Pvul a KpnI) a pak podrobeno elektroforese na 6% gelu. Elektroelucí byl isolován 0,8 kbp pás DNA. Ten se rozštěpí restrikční 50 endonukleasou Sau3A a podrobí elektroforese na 6% gelu. Elektroelucí byl z PGK promotoru isolován 265 bp pás (obrázek A).

- 16CZ 282905 B6

Tato DNA se pak liguje se shora připraveným 39 bp fragmentem promotoru během dvou hodin za teploty místnosti. Ligační směs se rozštěpí restrikční endonukleasou Xbal a Pvul a podrobí elektroforese v 6% akrylamidovém gelu-elektroelucí se isoluje 312 bp Xbal - Pvul restrikční fragment. Pak byl přidán k ligační směsi, která obsahuje 200 ng pBR322 (33) [dříve isolovaný 5 chybějící 162 Pvul - Pstl restrikční fragment] a 200 ng Xbal - Pstl LeiFA cDNA genu již dříve isolovaného z 20 pg pLEIFtrpA. Tato 3-faktor ligační směs byla použita k transformaci E.coli kmene 294 na tetracyklinovou resistenci. Transformované klony byly podrobeny miniscreeningu. Jedna z kolonií, pPGK 300, byla isolována; měla 304 bp PGK 5'-sousedící DNA spojenou s LeiFA genem v pBR322 vektoru. 5'-Konec LeiFA má následující sekvenci: 5'-CTAGAAATTC io 3'. Napojení Xbal místa z fragmentu promotoru (PGK promotor) na sekvenci dovoluje přidání EcoRJ místa k Xbal místu. pPGK-300 tak obsahuje část PGK promotoru isolovaného v PvulEcoRI fragmentu.

Stupen 4

Konstrukce 1500 bp fragmentu EcoRI-EcoRI PGK promotoru pg pBl bylo rozštěpeno působením Pvul a EcoRJ a necháno projít 6% akrylamidovým gelem. Elektroelucí byl isolován 1,3 kb Pvul-EcoRI DNA pás z PGK 5'-sousedící DNA. 10 pg PGK-300 20 bylo rozštěpeno působením EcoRI a Pvul. Elektroelucí po elektroforese rozštěpené směsi na 6% gelu byl isolován 312 bp fragment promotoru. 5 pg pFRI4 bylo rozštěpeno působením EcoRI. vysráženo ethanolem a zpracováváno s bakteriální alkalickou fosfotasou u 68' po dobu 45 minut. Po trojím zpracování se směsí fenolu s chloroformem se vysráží ethanolem a suspenduje ve 20 ml dIH₂O. 200 ng vektoru se liguje se 100 ng 312 bp EcoRI-PvuI DNA z pPGK 300 a 100 ng 25 EcoRI-PvuI DNA zpBl. Ligační směsí se transformuje kmen 294 E.coli na ampicilinovou resistenci. Z jedné Ap^R kolonie se získá pPGK-1500. Tento plasmid obsahuje 1500 bp fragmentu PGK promotoru jako EcoRI - EcoRI nebo HindlII - EcoRI část DNA.

Konstrukce plasmidů pro expresi maturačního HGH (lidský růstový hormon) a preHGH. 30 Konstrukce A až F na obrázku 14 byly konstruovány ve vektorech s vhodnými místy.

V konstrukci A syntetická DNA duplikuje DNA sekvenci na začátku pre HGH cDNA (42) z Hpall místa s vytvořením EcoRI v čele počátku translace ATG. Hpall - Pstl fragment byl získán z pre HGH cDNA (42). Tento fragment se syntetickou DNA byl ligován s EcoRI - Pstl vektorem (pHGH 207-1, s EcoRI - Pstl fragmentem obsahujícím odstraněný Ap^R gen a po 35 doplnění Klenowen oběma místy opět ligovaný) obsahujícím část Pstl - Smál HGH cDNA (43).

Získá se tak konstrukce A. Konstrukce B se připraví z plasmidů, který obsahuje maturační HGH gen pro přímou expresi obsahující 23 aminokyselin syntetické kódovací sekvence na aminovém konci (44). Plasmid obsahující tento gen byl štěpen působením PvuII v HGH genu a BamHI v Tc^R genu. Velký fragment, který obsahuje většinu genu, byl pak ligován se syntetickou DNA, 40 která duplikuje konec HGH genu (TAG) a vytváří HindlII místo. Toto HindlII místo bylo ligováno s fragmentem HindlII/BamHI pBR322 jako třetí faktor ze třech vazebných faktorů. Získá se tak plasmid, který obsahuje konstrukci B.

Konstrukce A a B byly spojeny, jak ukazuje obrázek 14. Získá se tak konstrukce C. Konstrukce 45 C byla dále upravena na konstrukci D, kde HindlII místo je převedeno na EcoRI (nebo EcoRI) místo. Takto získaná EcoRI část byla umístěna do EcoRI místa kvasinkového expresního plasmidů YEpIPT pro expresi preHGH genu v kvasinkách. Konstrukce E se také získá použitím konvertoru z konstrukce D. Získá se maturační interferonový gen (bez sekreční signální sekvence) na EcoRI fragmentu pro expresi v YEpIPT.

Exprese maturačního HGH a pre HGH v kvasinkách. mHGH konstrukce (E) v YEpIPT se umístí do kmene pep4-3 trpí (20B-12). Shora popsanými způsoby pomocí skleněných kuliček byly připraveny extrakty. Skleněné kuličky však byly přidány k 10 ml peletovaných buněk s 0,5 ml

- 17CZ 282905 B6

0,1% SDS. Zředění byla dělána v koňském seru. RIA testy (assays) byly prováděny jak bylo dříve popsáno (44).

Podle RIA došlo kaši 0,5% expresi HGH z celkového kvasnicového proteinu při A₆₆₀ asi 1,0 5 (0,5 mg/l/Abs₆66)· Žádný HGH nebyl v médiu nalezen.

Pre HGH konstrukce (konstrukce D, obrázek 14) vYEpIPT byla vložena také do kvasnic. Byl hodnocen obsah HGH v buňkách a v médiu. V buňkách byla detegována nižší hladina exprese (0,08 mg/l/A₆6o) nebo asi 0,08 procenta z celkového kvasnicového proteinu. Hladina je tedy asi io 1/6 hladiny exprese maturačního HGH. To je velmi podobné výsledkům leukocytového interferonu. Toto srovnání však nemusí být úplně v pořádku, jelikož použití kodonu maturačního HGH (44) se pro 23 aminokyselin liší ve srovnání s aminokyselinami pre HGH. Takový rozdíl může způsobit rozdíly v hladinách exprese těchto dvou produktů (45). V médiu při expresi pre HGH kvasnicemi byla u buněk nalezena 10% nebo 8 jJ.g/1 (A₆6ó ⁼ 1) exprese. V 10-litrovém 15 fermentoru při A_55O = 85 byla opět asi 10% sekrece s 1 mg/1 HGH v médiu.

Srovnání HGH proteinu v buňce s HGH proteinem vně buňky bylo provedeno použitím shora popsaného západního blotovacího postupu (Western blotting proceduře). Výsledky ukazují médium při vysoké hustotě fermentace (Α₅₅₀ = 85) kvasnic při expresi pre HGH. Je přítomen 20 jeden pás odpovídající maturačnímu HGH. Tento pás odpovídá 1 až 2 procentům proteinu v kvasinkovém médiu.

Jestliže se tento HGH z média vyčistí afinitní chromatografií na protilátce (Hybritech Ab) aHPLC jako u interferonů, NH₂-terminální sekvenování ukazuje, že téměř 100 % HGH byl 25 maturační HGH (sekvenováno bylo 10 zbytků), jak je částečně ukázáno na obrázku 13. Všechen HGH v médiu je tedy opracován věrně stejně jako v lidských buňkách.

Odkazy byly vybrány se zřetelem na zvláště výhodná uspořádání. Tomu je třeba rozumět tak, že tento vynález není konstruován tak, aby byl omezen uvedenými odkazy, ale pouze rozsahem 30 připojeného předmětu vynálezu.

Literatura:

I. Novick P., Field C., Schekman: Cell 21, 205-215 (1980).

2. Duntze a spol.: Science 168, 1472 (1970).

3. Woods a spol.: J. Gen. Mikrobiol. 51, 115 (1968).

4. Cabib a spol.: J. Bacteriology 124, 1586 (1975).

5. Farkas: Mikrobiol. Rev. 43, 117 (1979).

6. Moor: Arch. Mikrobiol. 57, 135 (1967).

7. Goeddel a spol.: Nátuře 287, 411 (1980).

8. Goeddel a spol.: Nátuře 290, 20 (1981).

9. Yelverton a spol.: Nucleic Acids Research 9, 731 (1981).

10. Goeddel a spol.: Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980).

II. Wetzel: Američan Scientist 68, 664 (1980).

12. Wetzel a spol.: Biochemistry 19, 6096 (1980).

13. Davis a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 78. 5376 (1981).

14. Hitzeman a spol.: Nátuře 293, 717 (1981).

15. Kleid a spol.: Science 214, 1 125 (1981).

16. Lawn a spol.: Nucleic Acids Research 9, 6103 (1981).

17. Weck a spol.: Nucleic Acids Research 9, 6153 (1981).

18. Clarke L.. Carbon J.: Cell 9, 91-99 (1976).

19. Clarke L., Carbon J.: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), 72, 4361 až 4365 (1975).

20. Bimboim H.C., Doly J.: Nucleic Acids Research 7, 1513 až 1523 (1979).

- 18CZ 282905 B6

21. Hinnen A., Hicks J.B., Fink F.R.: Proč. Nati. Acad. Scí. (USA) 75, 1929 až 1933 (1978).

22. Backman K.., Ptashne M., Gilbert W.: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 73, 4174 až 4178 (1976).

23. Jones E.: Genetics 85, 23 (1976).

24. Faye G., Leung D.W., Tachell K.., Halí B.D., Smith M.: Proč. Nati Acad. Sci. (USA) 78, 2258 až 2262 (1981).

25. Miller J.H.: Experiments in Molecular Genetics, str. 431 až 433, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., USA.

26. Stewart W.E.: The Interferon Systém, Springer, New York, 1979.

27. Edman P., Begg G.: Protein Sequencer v Eur. J. Biochem. 1, 80 až 91 (1967).

28. Tarr G.E., Beecher J.F., Bell M., McKean D.J.: Anal. Biochem. 84, 622 až 627 (1978).

29. Wittmann-Liebold B., Graffunder H., Kohls H.: Anal. Biochem. 75, 621 až 633 (1976).

30. Gray P.W. a spol.: Nátuře 295, 503 až 508 (1982).

31. Emr S.D. a spol.: Nátuře 285, 82 až 85 (1980).

32. Novick P„ Schekman: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 76, 1858 až 1862 (1779).

33. Bolivar F., Rodriguez R.L., Green P.Y., Beetlach M.C., Heyneker H.L., Boyer H.W., Crosa Y.H., Falkow S.: Gene 2, 95 až 113 (1977).

34. Stinchcomb D.T., Struhl K., Davis R.W.: Nátuře 282, 39 až 43 (1979).

35. Kingsman A.J., Clarke L., Mortimer R., Carbon J.: Gene 7, 141 až 152 (1979).

36. Tschumper G., Carbon J.: Gene 10, (1980).

37. Hartley J.L., Donelson J.E.: Nátuře 286, 860 až 865 (1980)

37a. Hitzeman R.A., Clarke L., Carbon J.: J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980).

37b. Broach a spol.: Gene 8, 121 (1979).

38. Messing a spol.: Nucleic Acids Research 9, 309 (1981).

39. Maxam A.M., Gilbert W.: Methods in Enzymol. 65, 490 až 565 (1980).

40. Crea R., Hom T.: Nucleic Acids Research 8, 2331 až 2348.

41. Oakley B.R. a spol.: Anal. Biochem. 105, 361 (1980).

42. Goodman H.M. aspol. ve Specific Eukaryotic Genes, str. 179 až 190, red. Engberg J., Klenow H., Leick V., Munskagaard, Copenhagen, 1979.

43. DeBoer H. aspol. v Promotors: Structure and Function, red. Prayer, str. 468 až 481 (1982).

44. Goeddel D.V. a spol.: Nátuře 281, 544 (1979).

45. Bennetzen J.L., Halí B.D.: J. Biol. Chem. 257, 3026 (1982).

46. Ames G.F.-L.: J. Biol. Chem. 249, 634 (1974).

47. Towbin H. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 76, 4350 (1979).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (17)

1. Způsob získávání proteinu heterologního pro organismus kvasinek jako produktu exprese, opracování a sekrece kvasinek, vyznačující se tím, že kvasinkový organismus se transformuje expresním vektorem funkčně nesoucím DNA kódující protein a heterologní signální polypeptid, že se připraví kultura shora uvedeného organismu, že se kultura kultivuje

a že se isoluje protein z média shora uvedené kultury. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že proteinem je lidský interferon. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že proteinem je lidský leukocytový interferon.

- 19CZ 282905 B6

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že proteinem je lidský leukocytový interferon A nebo D.

5 5. Buněčná kultura organismu kvasinek podle nároku 1, schopná produkovat protein heterologní pro uvedený organismus, kterou jsou a) živé kvasinkové buňky transformované expresním vektorem funkčně nesoucím DNA kódující uvedený protein spolu s heterologním signálním polypeptidem ab) médium kultury uvedených buněk, přičemž uvedené médium obsahuje uvedený protein jako produkt exprese, opracování a sekrece uvedeného organismu io kvasinek.

6. Buněčná kultura podle nároku 5, kde organismus kvasinek je Saccharomyces cerevisiae.

7. Buněčná kultura podle nároku 5, kde heterologní signální polypeptid je hybrid signálního

15 přirozeného polypeptidu vzhledem k uvedenému proteinu a druhého heterologního signálního polypeptidu.

8. Buněčná kultura organismu kvasinek podle nároku 6, schopná exportovat heterologní protein v diskrétní formě do média.

9. Buněčná kultura podle nároku 8, kde kvasinkovým organismem je Saccharomyces cerevisiae.

10. Médium buněčné kultury organismu kvasinek podle nároku 1, prosté živých nebo

25 poničených buněk kvasinek, obsahující protein, který je heterologní pro uvedený organismus kvasinek, jako produkt exprese, opracování a sekrece uvedeného organismu kvasinek.

11. Kvasinkový expresní vektor YEpIPT podle nároku 1, funkčně nesoucí DNA kódující protein, který je heterologní pro organismus kvasinek.

12. Vektor podle nároku 11, nesoucí DNA kódující heterologní signální polypeptid v translační čtecí formě se shora uvedenou DNA kódující heterologní protein.

13. Vektor podle nároku 12, kde heterologní signální polypeptid je hybrid signálního

35 přirozeného polypeptidu shora uvedeného proteinu a druhého heterologního signálního polypeptidu.

14. Vektor podle nároku 13, funkčně nesoucí DNA kódující lidský leukocytový DA signální polypeptid v translační čtecí formě a lidským leukocitovým A proteinem.

Překlady pojmů, které jsou uvedeny na obrázcích připojených k tomuto vynálezu

Obrázek 1

45 Aminokyselinové sekvence sekrečních signálů

Ddel místo v DNA

Místo štěpení [cleavage site]

50 Obrázek 2

Kvasnicový expresní plasmid

Místo pro vložení (inserci) genů [gene inserts]

Směr transkripce [transcription direction]

-20CZ 282905 B6 promotorovy fragment [promotér fragment]

Počátek transkripce [ori]

Kvasnicový gen TRPÍ [yeast TRPÍ gene]

Počátek replikace 2 μ plasmidu [yeast 2 μ origin of replication]

5 Terminace transkripce [transcription termination]

Obrázek 3

IFN-al cDNA klon [IFN-al cDNA cloně] io Isoluj 254 bp fragment - isoluj 264 bp fragment - isoluj

372 bp fragment -- isoluj 636 bp fragment

T4 DNA ligasa [T4 DNA ligase]

Syntetická DNA [Synthetic DNA]

Pre-IFN-al RI fragment [pre-IFN-al RI fragment]

Obrázek 4

Isoluj 876 bp fragment -- isoluj 1096 bp fragment.

T4 DNA ligasa

20 Maturační IFN-cc2 RI Fragment [mature IFN-cc2 RI fragment]

230 bp kvasnicová dvoumikronová DNA [230 bp yeast 2 μ DNA]

Obrázek 5

25 IFN-a2 cDNA klon [IFN-a2 cDNA cloně]

Isoluj 44 bp fragment -- isoluj 900 bp fragment -- isoluj

944 bp fragment -- isoluj 1174 bp fragment.

T4 DNA ligasa [T4 DNA ligase]

230 bp kvasnicová dvoumikronová DNA [230 bp yeast 2 μ DNA]

30 pre-IFN-a2 RI fragment [pre-IFN-a2 RI fragment]

Obrázek 6

IFN-γ cDNA klon [IFN-γ cDNA cloně]

35 Isoluj 842 bp fragment -- isoluj 862 bp fragment.

Plasmid pUC7 rozštěpený BamHI [BamHI digested pUC7]

T4 DNA ligasa [T4 DNA ligase]

Vyber pDNA s 862 bp EcoRI insertem [Select pDNA with 862 bp EcoRI insert] pre-IFN-γ RI fragment se 70 bp leader (vedoucí) sekvencí

40 [pre-IFN-γ RI fragment with 70 bp leader sequence]

Obrázek Ί

IFN- 862 bp EcoRI fragment

45 Isoluj 164 bp fragment -- Isoluj 600 bp fragment -- isoluj

765 bp fragment -- Isoluj 178 bp fragment -- isoluj 165 bp fragment.

Denaturuj [denature].

Přidej oligonukleotid 5'-ATGAAAATATACA-3' [add 5'-ATGAAATATACA-3'].

Synthetický primer (očko) [Synthetic primer]

50 DNA polymerasa podle Klenowa [Klenow DNA polymerase]

Syntetický EcoRI linker [synthetic EcoRI linker]

T4 DNA ligasa [T4 DNA ligase] pre-IFN-γ RI fragment [pre-IFN-γ RI fragment]

-21 CZ 282905 B6

Obrázek 8

Interferonové geny použité v kvasnicovém expresním plasmidu

Signální sekvence

5 Maturační interferonová sekvence

Konvertor [converter]

5'-Sousedící sekvence [5'-flanking sequence]

Kvasnicová dvoumikronová DNA [yeast 2 μ DNA]

Část LelF D [part of LelF D]

Obrázek 9

Aktivita při biotestu [bioassay activity]

Doba (hodiny) [Time (hours)]

15 Obrázek 10a

MU/litr fermentace [MU/liter fermentation]

Buňky [cells]

Doba (hodiny) [Time (hours)]

Obrázek 10b

MU/litr fermentace [MU/liter fermentation]

Média [media]

Doba (hodiny) [Time (hours)]

Obrázek 11

Nanesení [load]

Promývání [wash]

30 frakce [fractions] Interferonová aktivita [interferon aktivity]

Obrázek 12

35 Maturační LelF A [mature LelF A] Opracovaný pre LelF A [processed pře LelF A] Číslo frakce [fraction number]

40 Obrázek 13

Opracování (pre D/A) LelF A, (pre D) LelF D a pre HGH kvasinkami [processing of... by yeast] Interferon z kultivačního média [growth medium interferon]

Intracelulámí a periplasmický interferon [intracellular and periplasmic interferon] Lidský růstový hormon z kultivačního média [growth medium human growth hormon]

45 Maturační LelF A sekvence [mature LelF A sequence]

Savčí buňky [mammalian cell]

Místo štěpení [cleavage site]

Maturační HGH sekvence [mature HGH sequence] pre D/A sekreční signální sekvence [pre D/A secretion signál sequence]

50 [None] 0 %

-22CZ 282905 B6

Obrázek 14

Syntetická DNA [synthetic DNA]

Maturační HGH (z pHGH 207-1) [mature HGH (from pHGH 207-1]

HGH terminační kódovací translace [HGH translation stop]

5 Konvertor PvuII na HindlII duplikující cDNA genovou sekvenci [Converter of Pvu II.......gene sequence to the translation stop]

Zarovnaný konec [blunt] pre HGH gen [pre HGH gene]

Maturační HGH gen [mature HGH gene] io HindlII -> EcoRI konvertor [Hind III to EcoRI converter]

A přidán stejný konvertor jako u D [plus same converter as in D added]

Obrázek B

15 DNA sekvence 5'konce kvasinkového 3-PGK strukturního genu a sousedící DNA

Obrázek A

Vložení (inserce) EcoRI místa na 5'sousedící DNA 3-fosfoglycerátového genu kvasnic

20 PGK gen [PGK gene]

Vložit EcoRI - Xbal místa [Insert EcoRI - Xbal sites]

Obrázek C

25 PGK strukturní gen a sousedící DNA [PGK structural gene and flanking DNA]

Isoluj 650 bp fragment -- isoluj 39 bp fragment — isoluj vektor z gelu [isolate vector from gel], PGK transkripce [PGK transcription]

Anneluj (připoj) primer (očko) [Anneal primer]

Klenowova polymerasa I [Klenow Pol.I]

30 3'- 5'exonukleasa [3'-5'exonuclease]

T4 DNA ligasa [T4 DNA ligase]

Obrázek D

35 Isoluj LelF A fragment [isolate LelF A fragment].

Isoluj 39 bp fragment - isoluj 265 bp fragment -- isoluj 304 bp fragment.

T4 DNA ligasa [T4 DNA ligase]

Velký fragment [large fragment]

Obrázek E

Z YRP-7 bylo odstraněno jedno EcoRI místo [one EcoRI site removed from YRP-7]

Isoluj 1,3 kb fragment [isolate 1,3 kb fragment].

Isoluj promotorovy fragment [isolate promotor fragment].

45 PGK transkripce [PGK transcription]

T4 DNA ligasa [T4 DNA ligase]

Poznámka k popisu obrázků: při překladu je uveden český výraz, za ním anglicky; v naprosto jasných případech není anglický výraz uveden. Pokud se stejný výraz vyskytuje v jednom 50 obrázku několikrát, je uveden jen jednou.