JPH0773501B2 - メチロトローフ酵母のアルコールオキシダーゼ▲ｉｉ▼調節領域をコードするｄｎａ配列 - Google Patents
メチロトローフ酵母のアルコールオキシダーゼ▲ｉｉ▼調節領域をコードするｄｎａ配列Info
- Publication number
- JPH0773501B2 JPH0773501B2 JP1162492A JP16249289A JPH0773501B2 JP H0773501 B2 JPH0773501 B2 JP H0773501B2 JP 1162492 A JP1162492 A JP 1162492A JP 16249289 A JP16249289 A JP 16249289A JP H0773501 B2 JPH0773501 B2 JP H0773501B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna fragment
- methanol
- regulatory function
- alcohol oxidase
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組換えDNAバイオテクノロジーの分野に関す
る。その一つの観点において、本発明はDNAの転写を調
節するDNA配列に関する。他の観点において、本発明は
上記DNA配列を取込むベクターに関する。更に、他の観
点において、本発明は上記ベクターで形質転換した新規
細胞に関する。
る。その一つの観点において、本発明はDNAの転写を調
節するDNA配列に関する。他の観点において、本発明は
上記DNA配列を取込むベクターに関する。更に、他の観
点において、本発明は上記ベクターで形質転換した新規
細胞に関する。
本発明は一般的には遺伝子材料の巧妙な取扱いに関し、
特にDNAからRNAへの転写頻度の調節に関する。本発明は
特にピキア・パストリス（Pichia pastoris）アルコー
ルオキシダーゼII遺伝子の調節領域に関する。
特にDNAからRNAへの転写頻度の調節に関する。本発明は
特にピキア・パストリス（Pichia pastoris）アルコー
ルオキシダーゼII遺伝子の調節領域に関する。
（従来技術） 組換えDNAバイオテクノロジが近年発達してきたため、
細胞による多種類の有用ポリペプチドの制御生産が可能
になってきた。真核生物の多数のポリペプチド、例えば
ヒト成長ホルモン、白血球のインターフェロン、ヒトイ
ンシュリンおよびヒトプロインシュリンはいろいろな微
生物によって生産されている。すでに研究中の技術の応
用を続けると、将来、数多くの他の有用ポリペプチド生
成物の組換え生産が可能になると期待される。
細胞による多種類の有用ポリペプチドの制御生産が可能
になってきた。真核生物の多数のポリペプチド、例えば
ヒト成長ホルモン、白血球のインターフェロン、ヒトイ
ンシュリンおよびヒトプロインシュリンはいろいろな微
生物によって生産されている。すでに研究中の技術の応
用を続けると、将来、数多くの他の有用ポリペプチド生
成物の組換え生産が可能になると期待される。
組換え技術の分野で使われる基本技術は当業者に既知で
ある。組換えDNAバイオテクノロジーを実行するために
あたって存在するのが望ましい要素は、これらに限定さ
れるわけではないが； （１） １個以上の所望のポリペプチドをコードする遺
伝子であって、宿主細胞で発現するために必要とされる
適切な調節配列と機能しうるように連結した（“機能し
うるように連結した”とは、成分がそれらの通常の機能
を果たすように配列された並置を指す）上記遺伝子； （２） 通常プラスミドであるヌクレオチド配列を挿入
しうるベクターであって；宿主の形質転換を可能にする
構築物を含む任意のヌクレオチド配列であるベクター； （３） 所望のヌクレオチド配列を伝達しうる適切な宿
主であって、伝達されたヌクレオチド配列にコードされ
た情報を発現させるための細胞器官をも有する宿主； が含まれる。
ある。組換えDNAバイオテクノロジーを実行するために
あたって存在するのが望ましい要素は、これらに限定さ
れるわけではないが； （１） １個以上の所望のポリペプチドをコードする遺
伝子であって、宿主細胞で発現するために必要とされる
適切な調節配列と機能しうるように連結した（“機能し
うるように連結した”とは、成分がそれらの通常の機能
を果たすように配列された並置を指す）上記遺伝子； （２） 通常プラスミドであるヌクレオチド配列を挿入
しうるベクターであって；宿主の形質転換を可能にする
構築物を含む任意のヌクレオチド配列であるベクター； （３） 所望のヌクレオチド配列を伝達しうる適切な宿
主であって、伝達されたヌクレオチド配列にコードされ
た情報を発現させるための細胞器官をも有する宿主； が含まれる。
組換え技術に用いられる基本要素はプラスミドであり、
これは最初、微生物に発見された環状の染色体外二本鎖
DNAである。プラスミドは細胞あたり多コピー存在する
ことがわかっている。天然のプラスミドに加えて、多数
の人造プラスミドが調製されている。プラスミド内に含
まれるものにはプラスミドの再生産に必要な情報、即ち
自己複製配列および／または複製開始点がある。形質転
換した細胞内に存在するプラスミドを表現型で選択する
１個以上の手段もまたプラスミドにコードされる情報に
含まれるであろう。抗生物質耐性のような表現型または
マーカー選択特性は、目的とするプラスミドを含む宿主
細胞のクローンが選択培地内での細胞の優先増殖によっ
て認識かつ選択されることを可能にする。ベクターまた
はプラスミドは、特異的ヌクレオチド配列を個々に認識
する１種類以上の制限エンドヌクレアーゼまたは制限酵
素によって特異的に切断されるであろう。そうした後、
異種遺伝子、即ち調節領域との結合が天然には存在しな
い遺伝子、に機能しうるように連結した調節領域、また
は他のヌクレオチド配列は、切断サイトまたは切断サイ
トに隣接した再構築末端に所望の遺伝材料を機能しうる
ように連結することによって挿入されるであろう。
これは最初、微生物に発見された環状の染色体外二本鎖
DNAである。プラスミドは細胞あたり多コピー存在する
ことがわかっている。天然のプラスミドに加えて、多数
の人造プラスミドが調製されている。プラスミド内に含
まれるものにはプラスミドの再生産に必要な情報、即ち
自己複製配列および／または複製開始点がある。形質転
換した細胞内に存在するプラスミドを表現型で選択する
１個以上の手段もまたプラスミドにコードされる情報に
含まれるであろう。抗生物質耐性のような表現型または
マーカー選択特性は、目的とするプラスミドを含む宿主
細胞のクローンが選択培地内での細胞の優先増殖によっ
て認識かつ選択されることを可能にする。ベクターまた
はプラスミドは、特異的ヌクレオチド配列を個々に認識
する１種類以上の制限エンドヌクレアーゼまたは制限酵
素によって特異的に切断されるであろう。そうした後、
異種遺伝子、即ち調節領域との結合が天然には存在しな
い遺伝子、に機能しうるように連結した調節領域、また
は他のヌクレオチド配列は、切断サイトまたは切断サイ
トに隣接した再構築末端に所望の遺伝材料を機能しうる
ように連結することによって挿入されるであろう。
次いでベクターは宿主細胞内に導入され、細胞内ではベ
クターに含まれるヌクレオチド配列が宿主に種々の工程
または機能を実行するように導くであろう。そのような
実例は数少ないが、その中には異種のポリペプチドの発
現または同種あるいは異種ポリペプチドの過剰発現が含
まれる。宿主細胞内へのヌクレオチド導入の工程は一般
に形質転換と呼ばれる。多量のベクターが、そのベクタ
ーのコピー数を増加させるのに適切な宿主的にベクター
を導入することによって得られるであろう。ベクターの
コピー数を増加させるために通常用いられる宿主細胞は
大腸菌（E.coli）である。次いでベクターを第一宿主か
ら単離し、さらにベクターに支配される所望の活性、例
えばポリペプチドの生産、が起こるであろう第二の宿主
細胞に導入する。このようなDNAからの最終生成物の生
産を発現と呼ぶ。コードするヌクレオチド配列の転写お
よび翻訳を支配するベクター部分に関して遺伝子が正確
にベクター内に挿入されている場合、得られたベクター
は挿入遺伝子がコードするポリペプチド配列の生産を導
くために使用され得る。
クターに含まれるヌクレオチド配列が宿主に種々の工程
または機能を実行するように導くであろう。そのような
実例は数少ないが、その中には異種のポリペプチドの発
現または同種あるいは異種ポリペプチドの過剰発現が含
まれる。宿主細胞内へのヌクレオチド導入の工程は一般
に形質転換と呼ばれる。多量のベクターが、そのベクタ
ーのコピー数を増加させるのに適切な宿主的にベクター
を導入することによって得られるであろう。ベクターの
コピー数を増加させるために通常用いられる宿主細胞は
大腸菌（E.coli）である。次いでベクターを第一宿主か
ら単離し、さらにベクターに支配される所望の活性、例
えばポリペプチドの生産、が起こるであろう第二の宿主
細胞に導入する。このようなDNAからの最終生成物の生
産を発現と呼ぶ。コードするヌクレオチド配列の転写お
よび翻訳を支配するベクター部分に関して遺伝子が正確
にベクター内に挿入されている場合、得られたベクター
は挿入遺伝子がコードするポリペプチド配列の生産を導
くために使用され得る。
発現は調節領域に支配される。調節領域はいろいろな刺
激に応答し、RNA転写頻度に影響を及ぼす異種のヌクレ
オチド配列である。発現は刺激に応答してスイッチを入
れたり切ったりする。刺激に応答してスイッチオンとな
っている発現は通常抑制解除または誘導と呼ばれる。誘
導発現システムの例は数少ないが、ピキア・パストリス
（Pichia pastoris）のAOX1システム、キセノプス・ラ
エビス（Xenopus laevis）のエストロゲンシステム、な
らびにサル、ヒト、ハムスター、マウスおよびラットの
メタロチオネインシステムが上げられる。誘導発現シス
テムは通常構成システムより厳重な支配下にある。この
ようなシステムは遺伝子工学の目的とうまく適合する。
激に応答し、RNA転写頻度に影響を及ぼす異種のヌクレ
オチド配列である。発現は刺激に応答してスイッチを入
れたり切ったりする。刺激に応答してスイッチオンとな
っている発現は通常抑制解除または誘導と呼ばれる。誘
導発現システムの例は数少ないが、ピキア・パストリス
（Pichia pastoris）のAOX1システム、キセノプス・ラ
エビス（Xenopus laevis）のエストロゲンシステム、な
らびにサル、ヒト、ハムスター、マウスおよびラットの
メタロチオネインシステムが上げられる。誘導発現シス
テムは通常構成システムより厳重な支配下にある。この
ようなシステムは遺伝子工学の目的とうまく適合する。
実際問題として、組換えDNA技術を用いると異種のヌク
レオチド配列を発現する能力をもつ細胞が作り出される
であろう。異種のヌクレオチド配列は宿主内に天然には
存在しないヌクレオチド配列である。そのような例とし
て、宿主内に天然に存在する調節領域とこの調節領域と
は本来関連のない構造遺伝子との新規の結合が上げられ
る。もう一つの例として、宿主内には天然に存在しない
遺伝子と調節領域との結合が挙げられる。異種のポリペ
プチドは融合ポリペプチド、即ち同種または異種のポリ
ペプチドのアミノ酸配列の一部に融合させた異種のポリ
ペプチド、として生産されるであろう。最初に得られる
融合ポリペプチド生成物は時として、融合ポリペプチド
が細胞外環境で切断される迄不活性な不活性型として生
産される。
レオチド配列を発現する能力をもつ細胞が作り出される
であろう。異種のヌクレオチド配列は宿主内に天然には
存在しないヌクレオチド配列である。そのような例とし
て、宿主内に天然に存在する調節領域とこの調節領域と
は本来関連のない構造遺伝子との新規の結合が上げられ
る。もう一つの例として、宿主内には天然に存在しない
遺伝子と調節領域との結合が挙げられる。異種のポリペ
プチドは融合ポリペプチド、即ち同種または異種のポリ
ペプチドのアミノ酸配列の一部に融合させた異種のポリ
ペプチド、として生産されるであろう。最初に得られる
融合ポリペプチド生成物は時として、融合ポリペプチド
が細胞外環境で切断される迄不活性な不活性型として生
産される。
以前、欧州特許出願第86114700.7号明細書に開示したよ
うに（この特許はここに参照として合成させる）、ピキ
ア・パストリス（Pichia pastoris）ゲノムは２種類の
機能性アルコールオキシダーゼ遺伝子、AOX1およびAOX
2、をコードしている。
うに（この特許はここに参照として合成させる）、ピキ
ア・パストリス（Pichia pastoris）ゲノムは２種類の
機能性アルコールオキシダーゼ遺伝子、AOX1およびAOX
2、をコードしている。
我々は、今、AOX2構造遺伝子と関連する５′調節領域を
発見した。この調節領域はメタノールによってまたは炭
素源を涸渇させることによって誘導されうる。しかしな
がら、AOX2調節領域からの発現の最高水準はAOX1調節領
域（AOX1遺伝子は欧州特許出願第85201235.0号明細書に
開示されており、ここに参照として合体させる）の発現
の約５％〜11％のみである。
発見した。この調節領域はメタノールによってまたは炭
素源を涸渇させることによって誘導されうる。しかしな
がら、AOX2調節領域からの発現の最高水準はAOX1調節領
域（AOX1遺伝子は欧州特許出願第85201235.0号明細書に
開示されており、ここに参照として合体させる）の発現
の約５％〜11％のみである。
AOX2調節領域は異種遺伝子を発現するために使用可能で
あり、蛋白質の高水準発現が不都合であるような状況下
で特に有効である。
あり、蛋白質の高水準発現が不都合であるような状況下
で特に有効である。
（発明の構成） 本発明に従って、我々はDNAからRNAへの転写頻度を調節
するDNA配列を発見し、単離し、さらにその特徴を調べ
た。本発明の新規DNA配列はピキア・パストリス（Pichi
a pastoris）のようなメチロトローフ酵母によるポリペ
プチド生成物の生産に有益である。
するDNA配列を発見し、単離し、さらにその特徴を調べ
た。本発明の新規DNA配列はピキア・パストリス（Pichi
a pastoris）のようなメチロトローフ酵母によるポリペ
プチド生成物の生産に有益である。
本発明に従って、少なくとも１つの以下の条件に応答す
る調節領域を含む新規DNA配列が提供される；条件と
は、宿主の周囲環境にメタノールが存在すること、また
は宿主細胞がメタノール以外の基質で増殖している場合
には炭素源が涸渇することである。本発明の調節領域
は、mRNAの生産をコードするDNA配列の５′末端に機能
しうるように連結した場合にRNAの転写頻度を制御する
能力をもつ。
る調節領域を含む新規DNA配列が提供される；条件と
は、宿主の周囲環境にメタノールが存在すること、また
は宿主細胞がメタノール以外の基質で増殖している場合
には炭素源が涸渇することである。本発明の調節領域
は、mRNAの生産をコードするDNA配列の５′末端に機能
しうるように連結した場合にRNAの転写頻度を制御する
能力をもつ。
本発明のさらなるもう一つの態様に従って、上述のDNA
配列を含むプラスミドおよび形質転換された生物ならび
に該物を生産する方法が提供される。
配列を含むプラスミドおよび形質転換された生物ならび
に該物を生産する方法が提供される。
本発明のこれらのまたはこれ以外の目的は、ここに提供
された開示および特許請求の範囲より明確になるであろ
う。
された開示および特許請求の範囲より明確になるであろ
う。
1.アルコール オキシダーゼ調節領域の特徴 完全なAOX2遺伝子は第１図（ｂ）に提供された制限地図
内に含まれる。AOX2調節領域は第１図（ｂ）の制限地図
に示すように５′末端から第一番目のEco RI部位および
AOX2構造遺伝子の開始コドンとの間に含まれる。アルコ
ール オキシダーゼII蛋白質をコードするDNA配列部分
は制限地図の下に太い棒で示してある。アルコール オ
キシダーゼＩ遺伝子の制限地図は二つの遺伝子を比較す
る目的で第１図（ａ）に提供する。遺伝子の蛋白質コー
ド部分を除いて、意味のある配列の相同性は認められな
かった。
内に含まれる。AOX2調節領域は第１図（ｂ）の制限地図
に示すように５′末端から第一番目のEco RI部位および
AOX2構造遺伝子の開始コドンとの間に含まれる。アルコ
ール オキシダーゼII蛋白質をコードするDNA配列部分
は制限地図の下に太い棒で示してある。アルコール オ
キシダーゼＩ遺伝子の制限地図は二つの遺伝子を比較す
る目的で第１図（ａ）に提供する。遺伝子の蛋白質コー
ド部分を除いて、意味のある配列の相同性は認められな
かった。
lacZ融合構築物を用いてAOX2調節領域のさらなる特徴を
調べた結果、約−1500塩基対から約−１塩基対（第１表
に示す）以外は調節活性に必要でないことがわかった。
AOX2調節領域を含むDNAフラグメントのヌクレオチド配
列を第１表に示す。
調べた結果、約−1500塩基対から約−１塩基対（第１表
に示す）以外は調節活性に必要でないことがわかった。
AOX2調節領域を含むDNAフラグメントのヌクレオチド配
列を第１表に示す。
AOX2調節領域は少なくとも１つの次の条件：ピキア・パ
ストリス（Pichia pastoris）のようなメチロトローフ
酵母宿主については唯一の炭素源としてメタノールが存
在すること、または該宿主細胞の炭素源が涸渇するこ
と：に応答する。さらにAOX2調節領域によって促進され
るβ−ガラクトシダーゼの蛋白質生産はAOX1調節領域に
よるそれのおよそ５〜11％である。
ストリス（Pichia pastoris）のようなメチロトローフ
酵母宿主については唯一の炭素源としてメタノールが存
在すること、または該宿主細胞の炭素源が涸渇するこ
と：に応答する。さらにAOX2調節領域によって促進され
るβ−ガラクトシダーゼの蛋白質生産はAOX1調節領域に
よるそれのおよそ５〜11％である。
II.ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのアル
コール オキシダーゼII調節領域の単離 AOX2調節領域はピキアMC100−３株（arg4 his4 aox1
Δ::SARG4 aox2Δ::Phis4）を形質転換することによっ
て単離された。この株はAOX2遺伝子内に挿入されたピキ
アのHIS4遺伝子の変異体コピーを含み、さらにMC100−
３株をpBR322のBamHIサイトに挿入したピキアのHIS4遺
伝子を含む2.7kbのBgl IIフラグメントを含むプラスミ
ドpYM5で形質転換した。数種のMC100−３（pYM5）His+
形質転換株からのDNAはサザン（Southern）フィルター
ハイブリダイゼーションを行ない、MC100−３のAOX2座
に位置するHIS4フラグメントに組込まれたpYM5を含む形
質転換体を選択した。次いで、このようにして得られた
株のうちの１株からのDNAをHind IIIで消化し、その結
果AOX2のKpm Iサイトの５′側配列を5.3kb、ピキアのHI
S4遺伝子を2.7kb、およびpBR322を4.0kbを含む約12kbの
ゲノムのフラグメントを遊離させた。Hind III切断DNA
を結合させ、大腸菌に形質転換した。形質転換体はアン
ピシリン耐性で選択した。プラスミドpMR4を回収した。
このプラスミドpMR4の制限地図を第５図に示す。
コール オキシダーゼII調節領域の単離 AOX2調節領域はピキアMC100−３株（arg4 his4 aox1
Δ::SARG4 aox2Δ::Phis4）を形質転換することによっ
て単離された。この株はAOX2遺伝子内に挿入されたピキ
アのHIS4遺伝子の変異体コピーを含み、さらにMC100−
３株をpBR322のBamHIサイトに挿入したピキアのHIS4遺
伝子を含む2.7kbのBgl IIフラグメントを含むプラスミ
ドpYM5で形質転換した。数種のMC100−３（pYM5）His+
形質転換株からのDNAはサザン（Southern）フィルター
ハイブリダイゼーションを行ない、MC100−３のAOX2座
に位置するHIS4フラグメントに組込まれたpYM5を含む形
質転換体を選択した。次いで、このようにして得られた
株のうちの１株からのDNAをHind IIIで消化し、その結
果AOX2のKpm Iサイトの５′側配列を5.3kb、ピキアのHI
S4遺伝子を2.7kb、およびpBR322を4.0kbを含む約12kbの
ゲノムのフラグメントを遊離させた。Hind III切断DNA
を結合させ、大腸菌に形質転換した。形質転換体はアン
ピシリン耐性で選択した。プラスミドpMR4を回収した。
このプラスミドpMR4の制限地図を第５図に示す。
III.AOX2調節領域の性質 AOX2調節領域の発現をAOX1のそれと比較するために、AO
X2−lacZ発現ベクターをAOX1−lacZ融合ベクターである
pSAOH5（第10図に示す）にできる限り似せて構築した。
AOX2−lacZベクター、pYJ55、の構築法の工程図を第９
図に示す。AOX2の５′末端からの予備的なDNA配列デー
タは、AOX2がAOX1構造遺伝子中に認められるものと同じ
構造遺伝子の位置にある２つのBamHIサイトを含むこと
を示していた。それ故、pYJ55構築の第一段階はAOX2調
節領域および45塩基対のアミノ末端蛋白質コード配列を
含む1.8kbのBgl II−BamHIフラグメントをpBPf1のBamHI
サイトに挿入してpYJ38を作製することであった。第二
段階はpYJ38をBamHIで切断し、さらにAOX1−lacZベクタ
ーを構築するために挿入したのと同一のアダプターオリ
ゴヌクレオチド（５′−GATCACCCGGGT−３′）を挿入す
ることであった。このアダプターを挿入するとpYJ38のB
amHIサイトが破壊され、挿入位置に新しくSma Iサイト
ができる。このプラスミドpYJ45をSma Iで消化し、さら
に修飾されたAOX2プロモーターを含む1.8kbのSma Iフラ
グメントをpBPf1に挿入してプラスミドpYJ46を作製し
た。プラスミドpJY46はEco RIで消化してPYJ46のAOX2フ
ラグメントの５′末端から0.3kbのフラグメントを除去
した。プラスミドを再結合させてヌクレオチドpYJ55を
作製した。プラスミドpYJ55の制限地図を第８図に提供
する。
X2−lacZ発現ベクターをAOX1−lacZ融合ベクターである
pSAOH5（第10図に示す）にできる限り似せて構築した。
AOX2−lacZベクター、pYJ55、の構築法の工程図を第９
図に示す。AOX2の５′末端からの予備的なDNA配列デー
タは、AOX2がAOX1構造遺伝子中に認められるものと同じ
構造遺伝子の位置にある２つのBamHIサイトを含むこと
を示していた。それ故、pYJ55構築の第一段階はAOX2調
節領域および45塩基対のアミノ末端蛋白質コード配列を
含む1.8kbのBgl II−BamHIフラグメントをpBPf1のBamHI
サイトに挿入してpYJ38を作製することであった。第二
段階はpYJ38をBamHIで切断し、さらにAOX1−lacZベクタ
ーを構築するために挿入したのと同一のアダプターオリ
ゴヌクレオチド（５′−GATCACCCGGGT−３′）を挿入す
ることであった。このアダプターを挿入するとpYJ38のB
amHIサイトが破壊され、挿入位置に新しくSma Iサイト
ができる。このプラスミドpYJ45をSma Iで消化し、さら
に修飾されたAOX2プロモーターを含む1.8kbのSma Iフラ
グメントをpBPf1に挿入してプラスミドpYJ46を作製し
た。プラスミドpJY46はEco RIで消化してPYJ46のAOX2フ
ラグメントの５′末端から0.3kbのフラグメントを除去
した。プラスミドを再結合させてヌクレオチドpYJ55を
作製した。プラスミドpYJ55の制限地図を第８図に提供
する。
プラスミドYJ55をGS115（his4）に形質転換し、さらにH
is+の形質転換体を組込みプラスミドの存在を示す安定
なHis+表現型について選択した。数種の安定なHis+株の
ゲノムのDNAをサザンフィルターハイブリダイゼーショ
ンで分析して存在を確認すると共にプラスミドの所定位
置を決定した。
is+の形質転換体を組込みプラスミドの存在を示す安定
なHis+表現型について選択した。数種の安定なHis+株の
ゲノムのDNAをサザンフィルターハイブリダイゼーショ
ンで分析して存在を確認すると共にプラスミドの所定位
置を決定した。
AOX1プロモーターおよびAOX2プロモーターの強さを比較
するために、pYJ55およびpSAOH5によるβ−ガラクトシ
ダーゼの生産を、これらのプラスミドをGS115に形質転
換することによって調べた。形質転換したGS115株はそ
れぞれGS115（pYJ55）およびGS115（pSAOH5）と名付け
た。それぞれの株はHIS4座に組込まれたプラスミドを含
んでいる。それぞれの株の細胞はグリセロール培地で増
殖させ、次に炭素源を含まない培地で24時間培養し、そ
うした後さらに50時間メタノール含有培地で培養した。
それぞれの培養液のサンプルは個々の増殖期が終わるた
びごとに採取し、抽出物を調製してβ−ガラクトシダー
ゼについてアッセイした。これらのアッセイの結果を第
２表に示す。
するために、pYJ55およびpSAOH5によるβ−ガラクトシ
ダーゼの生産を、これらのプラスミドをGS115に形質転
換することによって調べた。形質転換したGS115株はそ
れぞれGS115（pYJ55）およびGS115（pSAOH5）と名付け
た。それぞれの株はHIS4座に組込まれたプラスミドを含
んでいる。それぞれの株の細胞はグリセロール培地で増
殖させ、次に炭素源を含まない培地で24時間培養し、そ
うした後さらに50時間メタノール含有培地で培養した。
それぞれの培養液のサンプルは個々の増殖期が終わるた
びごとに採取し、抽出物を調製してβ−ガラクトシダー
ゼについてアッセイした。これらのアッセイの結果を第
２表に示す。
有効水準のβ−ガラクトシダーゼ活性は、グリセロール
増殖細胞ではAOX1−lacZおよびAOX2−lacZ株共に認めら
れなかった。炭素源を含まない培地では、AOX2−lacZ株
の活性水準はAOX1−lacZ株で認められる活性のおよそ1/
10であった。AOX2−lacZ含有細胞にメタノールを加える
と、その結果β−ガラクトシダーゼの活性水準はAOX1−
lacZ細胞のそれの約1/9になった。このように、AOX1お
よびAOX2遺伝子は同一様式で調節されている。差異を示
す一つの特徴はAOX2調節遺伝子によるメタノールに対す
る応答および炭素源の涸渇に対する応答が著るしく低い
ことである。
増殖細胞ではAOX1−lacZおよびAOX2−lacZ株共に認めら
れなかった。炭素源を含まない培地では、AOX2−lacZ株
の活性水準はAOX1−lacZ株で認められる活性のおよそ1/
10であった。AOX2−lacZ含有細胞にメタノールを加える
と、その結果β−ガラクトシダーゼの活性水準はAOX1−
lacZ細胞のそれの約1/9になった。このように、AOX1お
よびAOX2遺伝子は同一様式で調節されている。差異を示
す一つの特徴はAOX2調節遺伝子によるメタノールに対す
る応答および炭素源の涸渇に対する応答が著るしく低い
ことである。
ここでは宿主酵母細胞内へのAOX2調節領域−β−ガラク
トシダーゼ遺伝子融合物の導入について記載したが、当
業者は環状プラスミドまたはβ−ガラクトシダーゼ構造
遺伝子を用いることが本発明を実施するにあたって必要
ではないことを認識している。従って酵母内に保持され
うる別のベクターもまた、この調節領域を別の異種遺伝
子と共に利用するために用いることができる。さらに、
他の異種遺伝子に機能しうるように連結させたAOX2調節
領域は、組込みベクターを用いて宿主酵母細胞の染色体
中に組込むことができる。さらに、ここに記載したAOX2
調節領域を含む機械的変異体は５′末端からのより短い
DNA配列からなり、異種遺伝子の発現を調節するために
も利用され得る。また、当業者には理解されるとおり、
機能的変異体としては、第１表に記載の配列の調節機能
を実質的に変更しない範囲で、５′末端のみならず配列
内の１または複数の塩基が付加、欠失もしくは置換され
ているものも含まれる。即ち、調節活性が維持される限
り、これらの変形もまたAOX2調節領域の定義に含まれ
る。ここで、塩基の付加、欠失もしくは置換は、公知技
術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid
Reserich,Val.10,No.20,p6487−6500,1982を参照され
たい）により実施することができ、１または複数の塩基
とは、部位特異的変異誘発法により付加、欠失もしくは
置換できる程度の数の塩基を意味する。
トシダーゼ遺伝子融合物の導入について記載したが、当
業者は環状プラスミドまたはβ−ガラクトシダーゼ構造
遺伝子を用いることが本発明を実施するにあたって必要
ではないことを認識している。従って酵母内に保持され
うる別のベクターもまた、この調節領域を別の異種遺伝
子と共に利用するために用いることができる。さらに、
他の異種遺伝子に機能しうるように連結させたAOX2調節
領域は、組込みベクターを用いて宿主酵母細胞の染色体
中に組込むことができる。さらに、ここに記載したAOX2
調節領域を含む機械的変異体は５′末端からのより短い
DNA配列からなり、異種遺伝子の発現を調節するために
も利用され得る。また、当業者には理解されるとおり、
機能的変異体としては、第１表に記載の配列の調節機能
を実質的に変更しない範囲で、５′末端のみならず配列
内の１または複数の塩基が付加、欠失もしくは置換され
ているものも含まれる。即ち、調節活性が維持される限
り、これらの変形もまたAOX2調節領域の定義に含まれ
る。ここで、塩基の付加、欠失もしくは置換は、公知技
術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid
Reserich,Val.10,No.20,p6487−6500,1982を参照され
たい）により実施することができ、１または複数の塩基
とは、部位特異的変異誘発法により付加、欠失もしくは
置換できる程度の数の塩基を意味する。
（実施例）実施例に関係する一般情報 株 ピキア・パストリス（Pichia pastoris）NRRL Y−11430 ピキア・パストリス（Pichia pastoris）GS115（his4）
NRRL Y−15851 ピキア・パストリス（Pichia pastoris）PPF1（arg4 hi
4）NRRL Y−18017 ピキア・パストリス（Pichia pastoris）KM7121（arg4
his4 acx1Δ::SARG4 aox2Δ::PH1S4）NRRL Y−18019 大腸菌（E.coli（MC1061［F-araD139 Δ（ara ABDIC−l
eu）7679Δ1acX74 galU galK rpsL hsdR］ 培地、緩衝液および溶液 1M−トリス（Tris）緩衝液:121.1gトリス塩基/800ml H2
O;濃HCl（35％）水溶液を必要容量加えてpHを調整す
る；最終的にpHを調整する前に溶液を室温に冷却する；
最終容量１に希釈する。
NRRL Y−15851 ピキア・パストリス（Pichia pastoris）PPF1（arg4 hi
4）NRRL Y−18017 ピキア・パストリス（Pichia pastoris）KM7121（arg4
his4 acx1Δ::SARG4 aox2Δ::PH1S4）NRRL Y−18019 大腸菌（E.coli（MC1061［F-araD139 Δ（ara ABDIC−l
eu）7679Δ1acX74 galU galK rpsL hsdR］ 培地、緩衝液および溶液 1M−トリス（Tris）緩衝液:121.1gトリス塩基/800ml H2
O;濃HCl（35％）水溶液を必要容量加えてpHを調整す
る；最終的にpHを調整する前に溶液を室温に冷却する；
最終容量１に希釈する。
TE緩衝液 1.0mM EDTA/0.01M（pH7.4）トリス緩衝液 SSC 0.15M−NaCl 15mMクエン酸ナトリウム NaOHでpH7.0に調整 TAE 40mM酢酸、5mM EDTA/0.02M（pH8.3） トリス緩衝液 デンハート（Denhardt）の溶液（50x） 5gフィコール 5gポリビニルピロリドン 5g牛血清アルブミン〔BSA;ペンタックス（Pentax）フラ
クションＶ〕 水で総容量を500mlにする SSPE（20倍）20mM EDTA 0.16M−NaOH 0.2M−NaH2PO4−H2O 3.6M NaCl NaOHでpHを7.0に調整 LB〔ルリアーベルタニ（Luria−Bertani）〕培地 5gバクト−トリプトン 50バクト−酵母エキス 2.5g NaCl/1lH2O NaOHでpHを7.5に調整 YPD培地 １％バクト−酵母エキス ２％バクト−ペプトン ２％デキストロース YNB培地 6.75gアミノ酸非含有酵母窒素塩基 〔ディフコ（Difco）〕11 H2O SED 1M ソルビトール 25mM−EDTA 50mM−DTT SCE緩衝液 9.1g ソルビトール 1.47g クエン酸ナトリウム 0.168g EDTA 50ml H2O HClでpHを5.8に調整 CaS 1M ソルビトール 10mM−CaCl2 濾過滅菌 PEG溶液 20％ポリエチレングリコール 10mM−CaCl2 10mM トリス塩酸（pH7.4） 濾過滅菌 SOS 1M ソルビトール 0.3x YPD培地 10mM−CaCl2 ホルムアミド染料混合物 0.1％ キシレン シレノールFF 0.2％ ブロモフェノール ブルー 10mM EDTA 95％ 脱イオン化ホルムアミド ゲル（最上部）76.8g 尿素 24ml アクリルアミド原液 8ml 10x TBE 最初容量を160mlにする アクリルアミド原液 38g アクリルアミド 2g ビス（N,N−メチレンビスアクリルアミド） 水を加えて総容量100mlとする ゲル（底部）14.4g 尿素 3.0g スクロース 7.5ml 10x TBE 4.5ml アクリルアミド原液 0.3ml ブロモフェノールブルー溶液（0.01g/ml） 水を添加し総容量を30mlとする ジデオキシ:dd ATTP 0.125mＭ dd CTP 0.10mＭ dd GTP 0.10mＭ dd TTP 0.80mＭ DNTP原液 0.5mＭ dGTP 0.5mＭ dCTP 0.5mＭ TTP 0.5mＭ dATP クレノー（Klenow）希釈用緩衝液（10x） 70mM トリス・HCl、pH7.5 200mM NaCl 70mM MgCl2 1mM EDTA 10xTMD,pH7.5 0.1M トリス・HCl、pH7.5 0.05M MgCl2 0.075M DTT 特に明記しない限り、上記溶液は使用時の基本濃度（1
x）で表わした。実施例を通して、異なる濃度水準が用
いられ、その事実は溶液を基本濃度（1x）の倍率で呼ぶ
ことによって示した。
クションＶ〕 水で総容量を500mlにする SSPE（20倍）20mM EDTA 0.16M−NaOH 0.2M−NaH2PO4−H2O 3.6M NaCl NaOHでpHを7.0に調整 LB〔ルリアーベルタニ（Luria−Bertani）〕培地 5gバクト−トリプトン 50バクト−酵母エキス 2.5g NaCl/1lH2O NaOHでpHを7.5に調整 YPD培地 １％バクト−酵母エキス ２％バクト−ペプトン ２％デキストロース YNB培地 6.75gアミノ酸非含有酵母窒素塩基 〔ディフコ（Difco）〕11 H2O SED 1M ソルビトール 25mM−EDTA 50mM−DTT SCE緩衝液 9.1g ソルビトール 1.47g クエン酸ナトリウム 0.168g EDTA 50ml H2O HClでpHを5.8に調整 CaS 1M ソルビトール 10mM−CaCl2 濾過滅菌 PEG溶液 20％ポリエチレングリコール 10mM−CaCl2 10mM トリス塩酸（pH7.4） 濾過滅菌 SOS 1M ソルビトール 0.3x YPD培地 10mM−CaCl2 ホルムアミド染料混合物 0.1％ キシレン シレノールFF 0.2％ ブロモフェノール ブルー 10mM EDTA 95％ 脱イオン化ホルムアミド ゲル（最上部）76.8g 尿素 24ml アクリルアミド原液 8ml 10x TBE 最初容量を160mlにする アクリルアミド原液 38g アクリルアミド 2g ビス（N,N−メチレンビスアクリルアミド） 水を加えて総容量100mlとする ゲル（底部）14.4g 尿素 3.0g スクロース 7.5ml 10x TBE 4.5ml アクリルアミド原液 0.3ml ブロモフェノールブルー溶液（0.01g/ml） 水を添加し総容量を30mlとする ジデオキシ:dd ATTP 0.125mＭ dd CTP 0.10mＭ dd GTP 0.10mＭ dd TTP 0.80mＭ DNTP原液 0.5mＭ dGTP 0.5mＭ dCTP 0.5mＭ TTP 0.5mＭ dATP クレノー（Klenow）希釈用緩衝液（10x） 70mM トリス・HCl、pH7.5 200mM NaCl 70mM MgCl2 1mM EDTA 10xTMD,pH7.5 0.1M トリス・HCl、pH7.5 0.05M MgCl2 0.075M DTT 特に明記しない限り、上記溶液は使用時の基本濃度（1
x）で表わした。実施例を通して、異なる濃度水準が用
いられ、その事実は溶液を基本濃度（1x）の倍率で呼ぶ
ことによって示した。
再生用寒天 １） 寒天−KCl％9gバクトー寒天、13.4g塩化カリウ
ム、240ml H2O、オートクレーブ。
ム、240ml H2O、オートクレーブ。
２） 10xグルコース:20gデキストロース、100ml H2O、
オートクレーブ。
オートクレーブ。
３） 10x YNB:6.75gの酵母窒素塩基（アミノ酸非含
有）、100ml、H2O、オートクレーブ。（オートクレーブ
の前または後に最大で200μg/ml濃度の任意の所望のア
ミノ酸または核酸を加える。） ４） 30mlの10xグルコースおよび30mlの10x YNBを240m
lの融解寒天−KCl溶液に添加する。0.2mg/mlビオチンを
0.6mlおよび任意の他の所望アミノ酸または核酸を濃度
が20μg/mlになるように加えた。融解した再生用寒天は
55〜60℃に保った。
有）、100ml、H2O、オートクレーブ。（オートクレーブ
の前または後に最大で200μg/ml濃度の任意の所望のア
ミノ酸または核酸を加える。） ４） 30mlの10xグルコースおよび30mlの10x YNBを240m
lの融解寒天−KCl溶液に添加する。0.2mg/mlビオチンを
0.6mlおよび任意の他の所望アミノ酸または核酸を濃度
が20μg/mlになるように加えた。融解した再生用寒天は
55〜60℃に保った。
ピキア・パストリスの増殖 ピキア・パストリスはYPD（濃厚）またはYNB（最少）培
地で増殖させた。必要に応じて、YNB培地には炭素源
（２％デキストロース、１％グリセロール、または0.5
％メタノール）および50μg/mlのアミノ酸を補足した。
地で増殖させた。必要に応じて、YNB培地には炭素源
（２％デキストロース、１％グリセロール、または0.5
％メタノール）および50μg/mlのアミノ酸を補足した。
配列決定 DNAの配列決定はサンガー（Sanger）ら；プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミィー・オブ・サイ
エンス・オブ・ザ・ユナイティッド・ステイツ・オブ・
アメリカ（PNAS）,74,5463（1977）；のジデオキシヌク
レオチド チェイン・ターミネーション（dideoxynucle
otide chain−termination）法に従って行なった。
ングス・オブ・ナショナル・アカデミィー・オブ・サイ
エンス・オブ・ザ・ユナイティッド・ステイツ・オブ・
アメリカ（PNAS）,74,5463（1977）；のジデオキシヌク
レオチド チェイン・ターミネーション（dideoxynucle
otide chain−termination）法に従って行なった。
以下の略号を実施例を通じて使用する。
EDTA エチレンジアミン四酢酸 TEMED N,N,N′,N′−テトラメチレンジアミン DTT ジチオスレイトール BSA 牛血清アルブミン EtBr 臭化エチジウム Ci キュリー dATP デオキシアデノシン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 TTP ナミジン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 dXTP デオキシ三リン酸ヌクレオチドの“総称” オリゴ（dT）12 〜 18コールラボラティブ・リサーチ社
（Collaborative Research,Inc.）製 ザイモリアーゼ（Zymolyase）60,000 マイルス・ラボラトリー（Miles Laboratories）製 アルコール オキシダーゼII調節領域の単離 実施例1.PPF1xKM7121の交配およびMC100−３の作製 ピキア・パストリス（Pichia pastoris）PPF1（arg4 hi
s4）（NRRL Y−18017）およびKM7121（arg4 his4 aox1
Δ::SARG4 aox2Δ::PH1S4（NRRL Y−18019）は新鮮なYP
D平板培地から無菌水の入ったチューブにそれぞれ接種
した。約５×107細胞からなるそれぞれの株を混合し、
簡単に超音波処理して細胞凝塊を粉砕し、さらにGNAP寒
天平板培地（５％デキストロース、２％ペプトン、１％
酵母エキス、0.5％寒天、2.3％栄養寒天）上に撒いた。
未混合のそれぞれの株（およそ１×108細胞）を対照照
準サンプルとして同様の方法で処理した。GNAP平板培地
は30℃で24時間インキュベーションし、次いで胞子形成
用寒天平板培地（0.5％酢酸ナトリウム、１％KCl、２％
寒天）にレプリカ培養した。このプレートを20時間30℃
でインキュベーションし、次いで炭素源を含まない最少
寒天平板培地にレプリカ培養した。メタノールは最少培
地上の細胞に蒸気相として流加した。
（Collaborative Research,Inc.）製 ザイモリアーゼ（Zymolyase）60,000 マイルス・ラボラトリー（Miles Laboratories）製 アルコール オキシダーゼII調節領域の単離 実施例1.PPF1xKM7121の交配およびMC100−３の作製 ピキア・パストリス（Pichia pastoris）PPF1（arg4 hi
s4）（NRRL Y−18017）およびKM7121（arg4 his4 aox1
Δ::SARG4 aox2Δ::PH1S4（NRRL Y−18019）は新鮮なYP
D平板培地から無菌水の入ったチューブにそれぞれ接種
した。約５×107細胞からなるそれぞれの株を混合し、
簡単に超音波処理して細胞凝塊を粉砕し、さらにGNAP寒
天平板培地（５％デキストロース、２％ペプトン、１％
酵母エキス、0.5％寒天、2.3％栄養寒天）上に撒いた。
未混合のそれぞれの株（およそ１×108細胞）を対照照
準サンプルとして同様の方法で処理した。GNAP平板培地
は30℃で24時間インキュベーションし、次いで胞子形成
用寒天平板培地（0.5％酢酸ナトリウム、１％KCl、２％
寒天）にレプリカ培養した。このプレートを20時間30℃
でインキュベーションし、次いで炭素源を含まない最少
寒天平板培地にレプリカ培養した。メタノールは最少培
地上の細胞に蒸気相として流加した。
５日後、約200個のコロニーが混合した細胞からレプリ
カ培養した最少平板培地上に表われた。非混合の対照標
準平板培地上にコロニーは発生せず、このような結果は
混合平板培地上のArg+His+Mut+（Mut+はメタノール資化
性を示す）コロニーはPPF1およびKM7121細胞が交配した
結果得られた二倍体であることを示唆している。このよ
うなArg+His+Mut+株の二倍体の性質はサザンフィルター
ハイブリダイゼーションを行なってこれらの株の４株の
AOX座を試験することによって確認した。使用した特異
的プローブは:pPG3.0（NRRL B−18022）、AOX2特異的プ
ローブ;pYJ30（NRRL B−15890）、HIS4に特異的なプロ
ーブ；およびpPG4.0（NRRL B−15868）、AOX1に特異的
なブロープ；である。
カ培養した最少平板培地上に表われた。非混合の対照標
準平板培地上にコロニーは発生せず、このような結果は
混合平板培地上のArg+His+Mut+（Mut+はメタノール資化
性を示す）コロニーはPPF1およびKM7121細胞が交配した
結果得られた二倍体であることを示唆している。このよ
うなArg+His+Mut+株の二倍体の性質はサザンフィルター
ハイブリダイゼーションを行なってこれらの株の４株の
AOX座を試験することによって確認した。使用した特異
的プローブは:pPG3.0（NRRL B−18022）、AOX2特異的プ
ローブ;pYJ30（NRRL B−15890）、HIS4に特異的なプロ
ーブ；およびpPG4.0（NRRL B−15868）、AOX1に特異的
なブロープ；である。
PPF1xKM7121二倍体の胞子を形成させるために、最初に
コロニー（MC100）をメタノール含有の二倍体選択用平
板倍地より回収した。約１×106個のこれら細胞をGNAP
平板培地に撒き、交配方法に記載した方法に従って処理
したが、胞子形成用培地は４日間30℃でインキュベーシ
ョンして細胞を完全に胞子化した。胞子はそれぞれのプ
レートを5mlの無菌水でリンスすることによって平板培
地から回収した。懸濁液は3mlのリン酸緩衝液（0.1M Na
3PO4、pH7.5）で２回洗浄した。酵母溶菌用酵素グルス
ラーゼ（Glusulase）〔エンド・ラボラトリーズ（Endo
Laboratories）、ニューヨーク）およびザイモリアーゼ
（Zymolyase）〔60,000単位/g;マイルス・ラボラトリー
ズ（Miles Laboratories）〕ならびにβ−メルカプトエ
タノールの混合物を最終濃度がそれぞれ２％（v/v）、
0.5mg/ml、および0.1％になるように加えて栄養細胞を
破壊した。混合物は５時間30℃でインキュベーションし
た。
コロニー（MC100）をメタノール含有の二倍体選択用平
板倍地より回収した。約１×106個のこれら細胞をGNAP
平板培地に撒き、交配方法に記載した方法に従って処理
したが、胞子形成用培地は４日間30℃でインキュベーシ
ョンして細胞を完全に胞子化した。胞子はそれぞれのプ
レートを5mlの無菌水でリンスすることによって平板培
地から回収した。懸濁液は3mlのリン酸緩衝液（0.1M Na
3PO4、pH7.5）で２回洗浄した。酵母溶菌用酵素グルス
ラーゼ（Glusulase）〔エンド・ラボラトリーズ（Endo
Laboratories）、ニューヨーク）およびザイモリアーゼ
（Zymolyase）〔60,000単位/g;マイルス・ラボラトリー
ズ（Miles Laboratories）〕ならびにβ−メルカプトエ
タノールの混合物を最終濃度がそれぞれ２％（v/v）、
0.5mg/ml、および0.1％になるように加えて栄養細胞を
破壊した。混合物は５時間30℃でインキュベーションし
た。
そうした後、胞子調製物は0.2％ツウィーン（Tween）80
（v/v）を含む無菌水で２度洗浄し、リン酸緩衝液に再
懸濁した。次いで調製物は20秒周期の超音波処理を３回
行なって胞子の凝塊を粉砕した。そうした後、胞子調製
物サンプルを希釈し、2.0％グルコースならびに50μg/m
lずつのアルギニンおよびヒスチジンを含む最少培地の
非選択マスタープレートに撒いた。これらは48時間30℃
でインキュベーションした。次いで、それぞれのマスタ
ープレートを次の一連の最少平板培地上にレプリカ培養
した。:1）グルコース，−arg,−his 2）グルコース，
−arg,＋his 3）グルコース，＋arg,−hisおよび４）グ
ルコース，＋arg,＋his。
（v/v）を含む無菌水で２度洗浄し、リン酸緩衝液に再
懸濁した。次いで調製物は20秒周期の超音波処理を３回
行なって胞子の凝塊を粉砕した。そうした後、胞子調製
物サンプルを希釈し、2.0％グルコースならびに50μg/m
lずつのアルギニンおよびヒスチジンを含む最少培地の
非選択マスタープレートに撒いた。これらは48時間30℃
でインキュベーションした。次いで、それぞれのマスタ
ープレートを次の一連の最少平板培地上にレプリカ培養
した。:1）グルコース，−arg,−his 2）グルコース，
−arg,＋his 3）グルコース，＋arg,−hisおよび４）グ
ルコース，＋arg,＋his。
24時間30℃でインキュベーションした後、コロニーのAr
gおよびHis表現型を調べた。次いでArg+His-のコロニー
をYNBメタノール寒天平板培地上で画線培養してメタノ
ール上での増殖性を試験した。約１週間室温でインキュ
ベーションした後、平板培地をMut表現型について調べ
た。１つのArg+His-Mut-株をMC100−３と名付けた。
gおよびHis表現型を調べた。次いでArg+His-のコロニー
をYNBメタノール寒天平板培地上で画線培養してメタノ
ール上での増殖性を試験した。約１週間室温でインキュ
ベーションした後、平板培地をMut表現型について調べ
た。１つのArg+His-Mut-株をMC100−３と名付けた。
実施例II.ピキア・パストリスの形質転換 酵母細胞を約10mlのYPD培地に接種し、30℃で12〜20時
間振とう培養した。次いで細胞をA600が約0.01〜0.1に
なる様に希釈し、30℃で６〜８時間YPD培地で対数増殖
期に保った。100mlのYPD培地にA600が約0.1の種培養0.5
mlを接種し、30℃で約12〜20時間振とう培養した。そう
した後、培養液はA600が約0.2〜0.3（およそ16〜20時間
後）になった時点でDAMON IEC DPR−600遠心分離機を用
いて1500gで５分間遠心分離することによって集菌し
た。
間振とう培養した。次いで細胞をA600が約0.01〜0.1に
なる様に希釈し、30℃で６〜８時間YPD培地で対数増殖
期に保った。100mlのYPD培地にA600が約0.1の種培養0.5
mlを接種し、30℃で約12〜20時間振とう培養した。そう
した後、培養液はA600が約0.2〜0.3（およそ16〜20時間
後）になった時点でDAMON IEC DPR−600遠心分離機を用
いて1500gで５分間遠心分離することによって集菌し
た。
スフェロプラストを調製するために、細胞を10mlの無菌
水（遠心分離は洗浄のたびごとに上述の方法に従って行
なった）で１回、10mlの新しく調製したSEDで１回、10m
lの滅菌1Mソルビトールで１回洗浄し、5mlのSCE緩衝液
に再懸濁した。4mg/mlザイモリアーゼ（Zymolyase）60,
000〔マイルス ラボラトリィーズ（Miles Laboratorie
s）〕を５μ加え、細胞を30℃で約30分間インキュベ
ーションした。
水（遠心分離は洗浄のたびごとに上述の方法に従って行
なった）で１回、10mlの新しく調製したSEDで１回、10m
lの滅菌1Mソルビトールで１回洗浄し、5mlのSCE緩衝液
に再懸濁した。4mg/mlザイモリアーゼ（Zymolyase）60,
000〔マイルス ラボラトリィーズ（Miles Laboratorie
s）〕を５μ加え、細胞を30℃で約30分間インキュベ
ーションした。
スフェロプラストの形成は次のようにして検査した。10
0μアリコートの細胞をザイモリアーゼ添加前または
直後およびさまざまなインキュベーション期間後に900
μの５％SDSおよび900μの1Mソルビトールに添加し
た。インキュベーションは細胞がSDSで溶菌されるがソ
ルビトールでは溶菌されない時点で終了させた。スフェ
ロプラスト形成後、10mlの1M−ソルビトール滅菌溶液で
１回洗浄して1,000gで５〜10分間遠心分離し、さらに10
mlの無菌CaSで１回洗浄し遠心分離して、0.6mlのCaSに
再懸濁した。
0μアリコートの細胞をザイモリアーゼ添加前または
直後およびさまざまなインキュベーション期間後に900
μの５％SDSおよび900μの1Mソルビトールに添加し
た。インキュベーションは細胞がSDSで溶菌されるがソ
ルビトールでは溶菌されない時点で終了させた。スフェ
ロプラスト形成後、10mlの1M−ソルビトール滅菌溶液で
１回洗浄して1,000gで５〜10分間遠心分離し、さらに10
mlの無菌CaSで１回洗浄し遠心分離して、0.6mlのCaSに
再懸濁した。
形質転換を行なうために、水またはTE緩衝液内のDNAサ
ンプル（総容量20μ）を12×75mmの無菌ポリプロピレ
ンチューブに加えた。（少量のDNAを用いて形質転換を
最大にするためにはそれぞれのサンプルに、５μg/mlの
超音波処理した大腸菌DNAを約１μ使用する。）100μ
のスフェロプラストを各々のDNAサンプルに加え、室
温で約20分間インキュベーションした。1mlのPEG溶液を
各々のサンプルに加え、室温で約15分間インキュベーシ
ョンした。サンプルは1,000gで５〜10分間遠心分離し、
上澄液を除去した。ペレットを150μのSOSに再懸濁
し、室温で30分間インキュベーションした。850μの
無菌1M−ソルビトールを各々に加え、サンプルを下記の
方法に従って平板培養した。
ンプル（総容量20μ）を12×75mmの無菌ポリプロピレ
ンチューブに加えた。（少量のDNAを用いて形質転換を
最大にするためにはそれぞれのサンプルに、５μg/mlの
超音波処理した大腸菌DNAを約１μ使用する。）100μ
のスフェロプラストを各々のDNAサンプルに加え、室
温で約20分間インキュベーションした。1mlのPEG溶液を
各々のサンプルに加え、室温で約15分間インキュベーシ
ョンした。サンプルは1,000gで５〜10分間遠心分離し、
上澄液を除去した。ペレットを150μのSOSに再懸濁
し、室温で30分間インキュベーションした。850μの
無菌1M−ソルビトールを各々に加え、サンプルを下記の
方法に従って平板培養した。
10mlの再生用寒天は形質転換サンプルが準備できる少な
くとも30分前にプレートに注いだ。また10mlアリコート
の再生用寒天は形質転換サンプルがSOS内にある期間に
チューブに分配し45〜50℃の浴内に置いた。次いでサン
プルをチューブに加え固体の底部寒天層を含むプレート
上に注ぎ、さらに30℃で３〜５日間インキュベーション
した。
くとも30分前にプレートに注いだ。また10mlアリコート
の再生用寒天は形質転換サンプルがSOS内にある期間に
チューブに分配し45〜50℃の浴内に置いた。次いでサン
プルをチューブに加え固体の底部寒天層を含むプレート
上に注ぎ、さらに30℃で３〜５日間インキュベーション
した。
いろいろな時点でのスフェロプラストの質は次のように
して決定した。10μのサンプルを採取し、990μの1
Mソルビトールに加えて100倍希釈した。10μの希釈液
を採取して、さらなる990μアリコートの1M−ソルビ
トールを加えた。両希釈液100μをYPD寒天培地に撒き
平板培養して調製物中に残存するスフェロプラスト化し
ていない全細胞の濃度を定量した。100μの各々の希
釈液は、宿主に必要な40μg/mlの全アミノ酸を追加した
再生用寒天10mlに加えて再生可能なスフェロプラストの
総数を定量した。形質転換実験では良好な値が得られ、
1ml当たりの再生可能なスフェロプラスト総数は１〜３
×107個であり、1ml当りの全細胞は１×103個であっ
た。
して決定した。10μのサンプルを採取し、990μの1
Mソルビトールに加えて100倍希釈した。10μの希釈液
を採取して、さらなる990μアリコートの1M−ソルビ
トールを加えた。両希釈液100μをYPD寒天培地に撒き
平板培養して調製物中に残存するスフェロプラスト化し
ていない全細胞の濃度を定量した。100μの各々の希
釈液は、宿主に必要な40μg/mlの全アミノ酸を追加した
再生用寒天10mlに加えて再生可能なスフェロプラストの
総数を定量した。形質転換実験では良好な値が得られ、
1ml当たりの再生可能なスフェロプラスト総数は１〜３
×107個であり、1ml当りの全細胞は１×103個であっ
た。
実施例III.MC100−３（pYM5）の構築 約10μｇのpBR322をBamHIで消化し、さらに脱リン酸化
した。ピキアHIS4遺伝子を含む約50μｇのpYJ8（NRRL B
−15889）はBg1 IIで消化した。約2.7kbのBal IIフラグ
メントを0.8％調製アガロースゲルから単離した。300ng
のフラグメントおよび300ngのBamHIで消化したpBR322は
0.5単位のT4DNAリガーゼを用い、総容量10μの66mMト
リス塩酸pH7.4、6.6mM−MgCl2、10mM−DTTおよび0.4mM
−ATP溶液中で24時間４℃でインキュベーションして結
合させた。
した。ピキアHIS4遺伝子を含む約50μｇのpYJ8（NRRL B
−15889）はBg1 IIで消化した。約2.7kbのBal IIフラグ
メントを0.8％調製アガロースゲルから単離した。300ng
のフラグメントおよび300ngのBamHIで消化したpBR322は
0.5単位のT4DNAリガーゼを用い、総容量10μの66mMト
リス塩酸pH7.4、6.6mM−MgCl2、10mM−DTTおよび0.4mM
−ATP溶液中で24時間４℃でインキュベーションして結
合させた。
結合反応物は実施例Ｖ記載の方法に従って大腸菌MC1061
をアンピシリン耐性に形質転換するために用いた。形質
転換体は制限消化を行なってその特徴を調べると共に、
正確な挿入サイズおよび方向をアガロースゲル電気泳動
によって確認した。このプラスミドはpYM5と呼ばれ、マ
ニアチス（Maniatis,T.）、フーリッシュ（Fritsch,E.
F.）およびサムブロークス（Sambroox,J.）、モレキュ
ラークローニング（Molecular Cloning）：ア・ラボラ
トリー・マニュアル（A Laboratory Manual）,1982,コ
ールド スプリング ハーバーラボラトリー（Cold Spr
ing Harbor Laboratory），コールド スプリング ハ
ーバー（Cold Spring Harbor），ニューヨーク；に記載
のアルカリ溶菌プラスミド調製技術（the alkaline lys
is plasmid preparation technigne）を用いて大腸菌よ
り回収した。
をアンピシリン耐性に形質転換するために用いた。形質
転換体は制限消化を行なってその特徴を調べると共に、
正確な挿入サイズおよび方向をアガロースゲル電気泳動
によって確認した。このプラスミドはpYM5と呼ばれ、マ
ニアチス（Maniatis,T.）、フーリッシュ（Fritsch,E.
F.）およびサムブロークス（Sambroox,J.）、モレキュ
ラークローニング（Molecular Cloning）：ア・ラボラ
トリー・マニュアル（A Laboratory Manual）,1982,コ
ールド スプリング ハーバーラボラトリー（Cold Spr
ing Harbor Laboratory），コールド スプリング ハ
ーバー（Cold Spring Harbor），ニューヨーク；に記載
のアルカリ溶菌プラスミド調製技術（the alkaline lys
is plasmid preparation technigne）を用いて大腸菌よ
り回収した。
約10μｇのpYM5はMC100−３を形質転換する前にStu Iで
消化した。こうすることによってプラスミドはMC100−
３に存在するHIS4遺伝子配列のうちの本来のHIS4座また
は修飾されたAOX2座のどちらか１方に組込まれる。形質
転換は実施例IIに概説した方法に従って行なった。
消化した。こうすることによってプラスミドはMC100−
３に存在するHIS4遺伝子配列のうちの本来のHIS4座また
は修飾されたAOX2座のどちらか１方に組込まれる。形質
転換は実施例IIに概説した方法に従って行なった。
数種のMC100−３（pYM5）His+形質転換体からのDNAを実
施例IVに従って単離し、サザンフィルターハイブリダイ
ゼーションによってAOX2座に位置するHIS4遺伝子に組込
まれたpYM5をもつ形質転換体を選択した。使用した特異
的プローブは:pPG3.0（NRRL B−18022）、AOX2に特異的
なプローブ;pYJ30（NRRL B−15890）、HIS4に特異的な
プローブ：である。
施例IVに従って単離し、サザンフィルターハイブリダイ
ゼーションによってAOX2座に位置するHIS4遺伝子に組込
まれたpYM5をもつ形質転換体を選択した。使用した特異
的プローブは:pPG3.0（NRRL B−18022）、AOX2に特異的
なプローブ;pYJ30（NRRL B−15890）、HIS4に特異的な
プローブ：である。
アルコール オキシダーゼII調節領域の性質 実施例IV 酵母DNAの調整 酵母細胞は100mlのYNB培地に２％デキストロースを添加
した培地中、30℃でA600が１〜２になるまで増殖させ、
その後ダモン（Damon）IEC DRR−6000遠心分離を用いて
2,000gで５分間遠心分離して細胞をペレット状にした。
ペレットはdH2Oで１回、SEDで１回、1M−ソルビトール
で１回洗浄し、次いで5mlの0.1Mトリス塩酸pH7.0および
1Mソルビトールの溶液に再懸濁した。次いで細胞に4mg/
mlのザイモリアーゼ6000溶液〔マルイス・ラボラトリー
ズ（Miles Laboratories）〕を50〜100μ加えて混合
し、30℃で１時間インキュベーションした。そうした
後、得られたスフェロプラストを1,000gで５〜10分間遠
心分離し、さらに5mlのリシス・バッファー（Lysis Buf
fer）〔0.1％SDS,10mMトリス塩酸（pH7.4）、5mM−EDT
A、および50mM−NaCl〕に懸濁した。プロテイナーゼＫ
〔ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannhei
m）〕およびRNアーゼＡ〔シグマ（Sigma）〕をそれぞれ
100μg/ml加え、溶液を37℃で30分間インキュベーショ
ンした。DNAは調製物に同容量のイソアミルアルコール
含有クロロホルム（1:24、v/v）を加えて緩やかに混合
することによって除蛋白し、さらに層を12,000gで20分
間遠心分離することによって分離させた。上（水性）層
を新しいチューブに移し、さらに同量のフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した。層を前
記のようにして分離し、最上部層を２〜３倍容量の冷10
0％エタノールを含むチューブに移した。サンプルは緩
やかに混合し、DNAはプラスチック棒に巻き取ることに
よって収集した。DNAはすぐに1mlのTE緩衝液に溶解し、
さらに100倍容量のTE緩衝液を用いて４℃で一晩透析し
た。
した培地中、30℃でA600が１〜２になるまで増殖させ、
その後ダモン（Damon）IEC DRR−6000遠心分離を用いて
2,000gで５分間遠心分離して細胞をペレット状にした。
ペレットはdH2Oで１回、SEDで１回、1M−ソルビトール
で１回洗浄し、次いで5mlの0.1Mトリス塩酸pH7.0および
1Mソルビトールの溶液に再懸濁した。次いで細胞に4mg/
mlのザイモリアーゼ6000溶液〔マルイス・ラボラトリー
ズ（Miles Laboratories）〕を50〜100μ加えて混合
し、30℃で１時間インキュベーションした。そうした
後、得られたスフェロプラストを1,000gで５〜10分間遠
心分離し、さらに5mlのリシス・バッファー（Lysis Buf
fer）〔0.1％SDS,10mMトリス塩酸（pH7.4）、5mM−EDT
A、および50mM−NaCl〕に懸濁した。プロテイナーゼＫ
〔ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannhei
m）〕およびRNアーゼＡ〔シグマ（Sigma）〕をそれぞれ
100μg/ml加え、溶液を37℃で30分間インキュベーショ
ンした。DNAは調製物に同容量のイソアミルアルコール
含有クロロホルム（1:24、v/v）を加えて緩やかに混合
することによって除蛋白し、さらに層を12,000gで20分
間遠心分離することによって分離させた。上（水性）層
を新しいチューブに移し、さらに同量のフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した。層を前
記のようにして分離し、最上部層を２〜３倍容量の冷10
0％エタノールを含むチューブに移した。サンプルは緩
やかに混合し、DNAはプラスチック棒に巻き取ることに
よって収集した。DNAはすぐに1mlのTE緩衝液に溶解し、
さらに100倍容量のTE緩衝液を用いて４℃で一晩透析し
た。
実施例V.pMR4の構築 DNAは実施例IVの方法に従って、実施例IIIで作製したMC
100−３（pYM5）His+形質転換体より単離した。10μｇ
のこのゲノムDNAはHind IIIで消化してさらに結合させ
た。結合反応は４℃で24時間、66mMトリス塩酸pH7.4、
6.6mM−MgCl2、10mM−DTT、0.4mM−ATPおよび0.5単位の
T4DNAリガーゼ中で行なった。
100−３（pYM5）His+形質転換体より単離した。10μｇ
のこのゲノムDNAはHind IIIで消化してさらに結合させ
た。結合反応は４℃で24時間、66mMトリス塩酸pH7.4、
6.6mM−MgCl2、10mM−DTT、0.4mM−ATPおよび0.5単位の
T4DNAリガーゼ中で行なった。
結合混合物は直接大腸菌MC1061細胞に形質転換した。こ
のMC1601は形質転換に適格なように作られており、マニ
アチス（Maniatis）ら（1982）によって記載され上記方
法に従って形質転換した。アンピシリン耐性株の選択は
細胞を50μg/mlのアンピシリンを追加したLB培地または
2B培地（0.2％NH4PO4、1.2％Na2HPO4、0.013％MgSO4・7
H2O、0.074％CaCl2・2H2O、１μg/mlチアミン、0.4％デ
キストロース）のどちらかで培養して行なった。
のMC1601は形質転換に適格なように作られており、マニ
アチス（Maniatis）ら（1982）によって記載され上記方
法に従って形質転換した。アンピシリン耐性株の選択は
細胞を50μg/mlのアンピシリンを追加したLB培地または
2B培地（0.2％NH4PO4、1.2％Na2HPO4、0.013％MgSO4・7
H2O、0.074％CaCl2・2H2O、１μg/mlチアミン、0.4％デ
キストロース）のどちらかで培養して行なった。
pMR4と命名した12.0kbプラスミドはマニチアスら（198
2）の上記方法に従って回収した。このプラスミドは5.3
kbのAOX2−Kpn Iサイトの５′側DNA、2.7kbのピキア H
IS4遺伝子および4.0kbのpBR322を含んでいた。
2）の上記方法に従って回収した。このプラスミドは5.3
kbのAOX2−Kpn Iサイトの５′側DNA、2.7kbのピキア H
IS4遺伝子および4.0kbのpBR322を含んでいた。
実施例IV.pYJ55の構築 AOX2プロモーターの調節および発現を測定するために、
大腸菌のlacZ遺伝子に融合させたAOX2の５′側配列を含
むベクターを構築した。50μｇのpMR4（実施例Ｖ）は製
造業者の指導に従ってBgl IIおよびBamHIで消化した。A
OX2プロモーターを含む1.8kgのBgl II−BamHIフラグメ
ントは0.8％調製用アガロースゲルより単離した。10μ
ｇのpBPf1（NRRL B−15892）をBamHIで消化し、さらに
アルカリホスファターゼを用いて50μの反応容量で脱
リン酸化した（１単位の酵素を用いて37℃で１時間50mM
トリス塩酸pH9.0、1mM−MgCl2、100μＭ−ZnCl2および1
mMスペルミジン中でインキュベーションした）。
大腸菌のlacZ遺伝子に融合させたAOX2の５′側配列を含
むベクターを構築した。50μｇのpMR4（実施例Ｖ）は製
造業者の指導に従ってBgl IIおよびBamHIで消化した。A
OX2プロモーターを含む1.8kgのBgl II−BamHIフラグメ
ントは0.8％調製用アガロースゲルより単離した。10μ
ｇのpBPf1（NRRL B−15892）をBamHIで消化し、さらに
アルカリホスファターゼを用いて50μの反応容量で脱
リン酸化した（１単位の酵素を用いて37℃で１時間50mM
トリス塩酸pH9.0、1mM−MgCl2、100μＭ−ZnCl2および1
mMスペルミジン中でインキュベーションした）。
300ngの1.8kbフラグメントおよび300ngのpBPf1は以下の
ようにしてT4リガーゼを用いて結合させた。結合反応は
23℃で１時間、10μ反応容量の66mMトリス塩酸pH7.
6、5mM−MgCl2、5mMジチオスレイトール、1mM−ATPおよ
び１ブァイス（weiss）単位のT4リガーゼを含む溶液中
で行なった。得られたベクターはpYJ38と命名した。
ようにしてT4リガーゼを用いて結合させた。結合反応は
23℃で１時間、10μ反応容量の66mMトリス塩酸pH7.
6、5mM−MgCl2、5mMジチオスレイトール、1mM−ATPおよ
び１ブァイス（weiss）単位のT4リガーゼを含む溶液中
で行なった。得られたベクターはpYJ38と命名した。
新規SmaI制限サイトは以下のようにしてpYJ38内に作製
した。アダプターオリゴヌクレオチドはアプライド・バ
イオシステムズのDNAシンセサイザ（Applied Biosystem
s DNA Synthesizer）、モデル（Model）308Aを用い、シ
アノエチルホスホルアミダイト（cyanoethylphosphoram
idite）法を用いて化学的に合成した： ５′−GATCACCCGGGT−３′ 10μｇのpYJ38をBamHIで消化し、さらに上記の方法に従
ってアルカリホスファターゼで脱リン酸化した。１μｇ
の上記アダプターおよび0.1μｇのBamHI消化pYJ38は上
記方法に従ってT4リガーゼを用いて結合させた。修飾し
たベクターはpYJ45と命名した。修飾されたAOX2プロモ
ーターを含む1.8kbのSam Iフラグメントは、50μｇのpY
J45をSma Iで消化することによって得られた。フラグメ
ントは0.8％調製用アガロースゲルから単離した。0.3μ
ｇのフラグメントおよび0.3μｇのSma I消化pBPf1を上
記方法に従って結合したベクターpYJ46を作製した。0.3
kbのEco RIフラグメントを次のようにしてpYJ46のAOX2
セグメントの５′末端から欠落させた。10μｇのpYJ46
をEco RIで消化し、上記方法に従ってアルカリホスファ
ターゼで処理した。これとは別に50μｇアリコートのpY
J46もまたEco RIで消化し、1.5kbフラグメントを0.8％
調製用アガロースゲルから単離した。約0.3μｇずつの
ホスファターゼ処理したpYJ46および単離フラグメント
を結合させ、上記方法に従って大腸菌内へ形質転換し
た。正しい構造をもつ１つのプラスミドを単離し、pYJ5
5と命名した。
した。アダプターオリゴヌクレオチドはアプライド・バ
イオシステムズのDNAシンセサイザ（Applied Biosystem
s DNA Synthesizer）、モデル（Model）308Aを用い、シ
アノエチルホスホルアミダイト（cyanoethylphosphoram
idite）法を用いて化学的に合成した： ５′−GATCACCCGGGT−３′ 10μｇのpYJ38をBamHIで消化し、さらに上記の方法に従
ってアルカリホスファターゼで脱リン酸化した。１μｇ
の上記アダプターおよび0.1μｇのBamHI消化pYJ38は上
記方法に従ってT4リガーゼを用いて結合させた。修飾し
たベクターはpYJ45と命名した。修飾されたAOX2プロモ
ーターを含む1.8kbのSam Iフラグメントは、50μｇのpY
J45をSma Iで消化することによって得られた。フラグメ
ントは0.8％調製用アガロースゲルから単離した。0.3μ
ｇのフラグメントおよび0.3μｇのSma I消化pBPf1を上
記方法に従って結合したベクターpYJ46を作製した。0.3
kbのEco RIフラグメントを次のようにしてpYJ46のAOX2
セグメントの５′末端から欠落させた。10μｇのpYJ46
をEco RIで消化し、上記方法に従ってアルカリホスファ
ターゼで処理した。これとは別に50μｇアリコートのpY
J46もまたEco RIで消化し、1.5kbフラグメントを0.8％
調製用アガロースゲルから単離した。約0.3μｇずつの
ホスファターゼ処理したpYJ46および単離フラグメント
を結合させ、上記方法に従って大腸菌内へ形質転換し
た。正しい構造をもつ１つのプラスミドを単離し、pYJ5
5と命名した。
実施例VII.GS115（pYJ55）株の作製 ピキア・パストリスGS115、ヒスチジン栄養要求株（NRR
L Y−15851;his4）を実施例II記載の方法に従ってプラ
スミドpYJ55（実施例VI）で形質転換した。安定なHis+
株からのゲノムDNAをサザンフィルター ハイブリダイ
セーションで分析してプラスミドの位置を決定した。HI
S4座に組込まれたpYJ55を含む１つの形質転換体をGS115
（pYJ55）と命名した。
L Y−15851;his4）を実施例II記載の方法に従ってプラ
スミドpYJ55（実施例VI）で形質転換した。安定なHis+
株からのゲノムDNAをサザンフィルター ハイブリダイ
セーションで分析してプラスミドの位置を決定した。HI
S4座に組込まれたpYJ55を含む１つの形質転換体をGS115
（pYJ55）と命名した。
実施例VIII.AOX1プロモーターおよびAOX2プロモーター
の比較 AOX1およびAOX2のプロモーターの調節および発現は、GS
115（pSAOH5）株およびGS115（pYJ55）株のβ−ガラク
トシダーゼ活性を定量することによって比較した。それ
ぞれの株の培養液100mlをYNBの１％グリセロール添加培
地で24時間30℃で増殖させた後、炭素源を含まないYNB
培地に移して24時間30℃で培養し、その後0.5％メタノ
ール含有のYNB培地に移して50時間30℃で培養した。そ
れぞれの培養液からのサンプルは以下の時期に採取し
た:1）グリセロール培地で24時間培養液、２）炭素源を
含まない培地に移して24時間後、３）メタノール培地に
移して24時間後および50時間後。抽出物を調製し、下記
方法に従ってβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセ
イを行なった。これらのアッセイの結果を第２表に示
す。
の比較 AOX1およびAOX2のプロモーターの調節および発現は、GS
115（pSAOH5）株およびGS115（pYJ55）株のβ−ガラク
トシダーゼ活性を定量することによって比較した。それ
ぞれの株の培養液100mlをYNBの１％グリセロール添加培
地で24時間30℃で増殖させた後、炭素源を含まないYNB
培地に移して24時間30℃で培養し、その後0.5％メタノ
ール含有のYNB培地に移して50時間30℃で培養した。そ
れぞれの培養液からのサンプルは以下の時期に採取し
た:1）グリセロール培地で24時間培養液、２）炭素源を
含まない培地に移して24時間後、３）メタノール培地に
移して24時間後および50時間後。抽出物を調製し、下記
方法に従ってβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセ
イを行なった。これらのアッセイの結果を第２表に示
す。
β−ガラクトシダーゼのアッセイ法 １）必要な溶液 Ｚ−バッファー 最終濃度 Na2HPO4・7H2O 16.1 ｇ 0.06 Ｍ NaH2PO4 5.5 ｇ 0.04 Ｍ KCl 0.75g 0.01 Ｍ MgSO4・7H2O 0.246g 0.001Ｍ ２−メルカプトエタノール 2.7 ml 0.05 Ｍ 水で１にする;pHは７になる ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ONPG） 400mgONPG〔シグマ（Sigma）Ｎ−1127〕を100mlの蒸留
水に溶解し、4mg/mlのONPG溶液を作った。
水に溶解し、4mg/mlのONPG溶液を作った。
２） 細胞を除去した蛋白質抽出物の調製 それぞれのサンプルはdH2Oで１回、溶菌用緩衝液で１回
洗浄し、さらに溶菌用緩衝液に濃度が150A600/mlになる
ように再懸濁した。0.5gのガラスビーズを350μアリ
コートのサンプルに加え、さらに混合物を氷上で１回に
つき60秒間、１分間隔で４回うず巻き撹拌した。細胞ス
ラリーをガラスビーズから除去し、上澄液を５分間微量
遠心機で遠心分離した。上澄液はアッセイを行なうため
にポリプロピレン製の微量遠心管に移した。それぞれの
抽出物中の総蛋白質量はブラケットフォルド（Bradfor
d）アッセイ法〔バイオ・ラド（Bio−Red）〕によって
定量した。BSAを標準蛋白質として用いた。
洗浄し、さらに溶菌用緩衝液に濃度が150A600/mlになる
ように再懸濁した。0.5gのガラスビーズを350μアリ
コートのサンプルに加え、さらに混合物を氷上で１回に
つき60秒間、１分間隔で４回うず巻き撹拌した。細胞ス
ラリーをガラスビーズから除去し、上澄液を５分間微量
遠心機で遠心分離した。上澄液はアッセイを行なうため
にポリプロピレン製の微量遠心管に移した。それぞれの
抽出物中の総蛋白質量はブラケットフォルド（Bradfor
d）アッセイ法〔バイオ・ラド（Bio−Red）〕によって
定量した。BSAを標準蛋白質として用いた。
３） アッセイ法 １〜50μの細胞除去蛋白質抽出物に1mlのＺ・バッフ
ァーを加えた。次いで、混合物をうず巻き撹拌し、さら
に５分間30℃でインキュベーションした。反応は0.2ml
のOPNG（4mg/ml）を添加することによって開始させた。
0.5mlの1M−Na2CO3溶液を適当な時間（A420＜１）に加
えて反応を停止させた。その後、420nmの吸光度を測定
した。
ァーを加えた。次いで、混合物をうず巻き撹拌し、さら
に５分間30℃でインキュベーションした。反応は0.2ml
のOPNG（4mg/ml）を添加することによって開始させた。
0.5mlの1M−Na2CO3溶液を適当な時間（A420＜１）に加
えて反応を停止させた。その後、420nmの吸光度を測定
した。
４） β−ガラクトシダーゼ活性単位の計算 1Uとは、30℃、pH7で１分間に1nmoleのオルトニトロフ
ェノール（ONP）を遊離する酵素活性をさす。1nmoleのO
NPは1cmの光路長で0.0045の420nmの吸光度（A420）を持
つ。それ故、420nmでの吸光度１は222nmoles ONP/ml、
または378nmoles ONP/1.7ml（分析した上澄液の総容量
は1.7mlであった）に相当する。第２表に表示した単位
は次式に従って計算した：
ェノール（ONP）を遊離する酵素活性をさす。1nmoleのO
NPは1cmの光路長で0.0045の420nmの吸光度（A420）を持
つ。それ故、420nmでの吸光度１は222nmoles ONP/ml、
または378nmoles ONP/1.7ml（分析した上澄液の総容量
は1.7mlであった）に相当する。第２表に表示した単位
は次式に従って計算した：
第１図はAOX1（ａ）およびAOX2（ｂ）遺伝子の制限地図
を表わす模式図である。 第２図はpBR322の制限地図を表わす模式図である。 第３図はpYJ8の制限地図を表わす模式図である。 第４図はプラスミドpYM5の制限地図を表わす模式図であ
る。 第５図はプラスミドpYM4の制限地図を表わす模式図であ
る。 第６図はpMR4構築のための工程図である。 第７図はプラスミドpBPf1の制限地図を表わす模式図で
ある。 第８図はプラスミドpYJ55の制限地図を表わす模式図で
ある。 第９図はプラスミドpYJ55構築のための工程図である。 第10図はプラスミドpSAOH5の制限地図を表わす模式図で
ある。
を表わす模式図である。 第２図はpBR322の制限地図を表わす模式図である。 第３図はpYJ8の制限地図を表わす模式図である。 第４図はプラスミドpYM5の制限地図を表わす模式図であ
る。 第５図はプラスミドpYM4の制限地図を表わす模式図であ
る。 第６図はpMR4構築のための工程図である。 第７図はプラスミドpBPf1の制限地図を表わす模式図で
ある。 第８図はプラスミドpYJ55の制限地図を表わす模式図で
ある。 第９図はプラスミドpYJ55構築のための工程図である。 第10図はプラスミドpSAOH5の制限地図を表わす模式図で
ある。
Claims (7)
- 【請求項１】酵母宿主細胞のための唯一の炭素源として
のメタノールの存在に応答するメチロトローフ酵母由来
であり、アルコールオキシダーゼII構造遺伝子の５′上
流の調節機能を有するDNA断片であって、その際、上記
調節機能とはメタノールの存在に応答して該DNA断片の
下流に連結された異種遺伝子の発現を誘導することであ
り、そして該断片の５′末端がEco RI切断部位であり、
３′末端が上記アルコールオキシダーゼ構造遺伝子を開
始コドンの直ぐ５′上流の塩基であり、Pvu IIにより１
箇所で切断され、プロモーター活性を有し、かつ下記ヌ
クレオチド配列： を有する1.5kbのDNA断片、または上記DNA断片中の１も
しくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換されている
が上記DNA断片の調節機能を有するDNA断片。 - 【請求項２】異種遺伝子を機能させるように連結され
た、請求項１記載のDNA断片。 - 【請求項３】以下の工程： ピキア・パストリスPPF1株（NRRL Ｙ−18017）とKM712
1株（NRRL Ｙ−18019）を交配し； 適切なプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション
によりArg+His+Mut+（アルギニン原栄養性・ヒスチジン
原栄養性・炭素源としてメタノールを資化できる）の遺
伝子型を有する二倍体株を同定し；そして 上記二倍体株を胞子形成させて、選択培地によりArg+Hi
s+Mut-（アルギニン原栄養性・ヒスチジン栄養要求性・
炭素源としてメタノールを資化できない）の遺伝子型を
有する株を選択する； ことにより得られる、アルギニン原栄養性であり、ヒス
チジン栄養要求性であり、かつ、炭素源としてのメタノ
ールを資化できない、ピキア・パストリス株。 - 【請求項４】酵母宿主細胞のための唯一の炭素源として
のメタノールの存在に応答するメチロトローフ酵母由来
であり、アルコールオキシダーゼII構造遺伝子の５′上
流の調節機能を有するDNA断片であって、その際、上記
調節機能とはメタノールの存在に応答して該DNA断片の
下流に連結された異種遺伝子の発現を誘導することであ
り、そして該断片の５′末端がEco RI切断部位であり、
３′末端が上記アルコールオキシダーゼ構造遺伝子の開
始コドンの直ぐ５′上流の塩基であり、Pvu IIにより１
個所で切断され、プロモーター活性を有し、かつ下記ヌ
クレオチド配列： を有する1.5kbのDNA断片、または上記DNA断片中の１も
しくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換されている
が上記DNA断片の調節機能を有するDNA断片を、ピキア・
パストリスのゲノムから単離することを特徴とする、DN
Aの調製法。 - 【請求項５】酵母宿主細胞のための唯一の炭素源として
のメタノールの存在に応答するメチロトローフ酵母由来
であり、アルコールオキシダーゼII構造遺伝子の５′上
流の調節機能を有するDNA断片であって、その際、上記
調節機能とはメタノールの存在に応答して該DNA断片の
下流に連結された異種遺伝子の発現を誘導することであ
り、そして該断片の５′末端がEco RI切断部位であり、
３′末端が上記アルコールオキシダーゼ構造遺伝子の開
始コドンの直ぐ５′上流の塩基であり、Pvu IIにより１
箇所で切断され、プロモーター活性を有し、かつ下記ヌ
クレオチド配列： を有する1.5kbのDNA断片、または上記DNA断片中の１も
しくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換されている
が上記DNA断片の調節機能を有するDNA断片と、ポリペプ
チドをコードするDNA断片を連結することからなる、発
現カセットの調製法。 - 【請求項６】このようにして作成した前記発現カセット
をベクター内に取り込むことを含む、請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】微生物をこのようにして作成した前記ベク
ターで形質転換することを含む、請求項６記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/211,007 US5032516A (en) | 1985-10-25 | 1988-06-24 | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region |
| US221007 | 1988-06-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0253489A JPH0253489A (ja) | 1990-02-22 |
| JPH0773501B2 true JPH0773501B2 (ja) | 1995-08-09 |
Family
ID=22785222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1162492A Expired - Lifetime JPH0773501B2 (ja) | 1988-06-24 | 1989-06-23 | メチロトローフ酵母のアルコールオキシダーゼ▲ｉｉ▼調節領域をコードするｄｎａ配列 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5032516A (ja) |
| EP (1) | EP0347928A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0773501B2 (ja) |
| KR (1) | KR960010590B1 (ja) |
| CN (1) | CN1039616A (ja) |
| AU (1) | AU615078B2 (ja) |
| CA (1) | CA1306211C (ja) |
| DD (1) | DD284047A5 (ja) |
| DK (1) | DK175822B1 (ja) |
| FI (1) | FI104497B (ja) |
| HU (1) | HUT51673A (ja) |
| IE (1) | IE67039B1 (ja) |
| MX (1) | MX16518A (ja) |
| NO (1) | NO301285B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ229534A (ja) |
| PH (1) | PH27314A (ja) |
| PT (1) | PT90970A (ja) |
| YU (1) | YU128789A (ja) |
| ZA (1) | ZA894495B (ja) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992013951A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-20 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells |
| CA2063890C (en) * | 1991-03-27 | 2007-03-13 | Masami Miura | Mutant aox2 promoter, microorganism carrying same, method of preparation thereof and production of heterologous protein using such microorganism |
| JPH07106153B2 (ja) * | 1991-03-27 | 1995-11-15 | 株式会社ミドリ十字 | 変異型ａｏｘ２プロモーターを担持するプラスミド、形質転換体および異種蛋白質の製造方法 |
| JPH0829102B2 (ja) * | 1991-03-27 | 1996-03-27 | 株式会社ミドリ十字 | 変異型ａｏｘ２プロモーター、当該プロモーターを担持する菌株、その取得方法およびその菌株を利用した異種蛋白質の製造方法 |
| JP3505743B2 (ja) * | 1993-07-27 | 2004-03-15 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | 変異型ａｏｘ２プロモーター、それを担持するベクター、形質転換体および異種蛋白質の製造方法 |
| IT1270196B (it) * | 1994-06-09 | 1997-04-29 | Enichem Spa | Procedimento catalitico per la produzione di ossime |
| US5863894A (en) * | 1995-06-05 | 1999-01-26 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5872098A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-16 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| AU711405B2 (en) * | 1994-10-18 | 1999-10-14 | Dendreon Corporation | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| US5866542A (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5866543A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| US5945275A (en) * | 1994-10-18 | 1999-08-31 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| JP2000500014A (ja) * | 1995-11-09 | 2000-01-11 | ザイモジェネティクス，インコーポレイティド | ピヒア・メタノリカ中で異種ポリペプチドを生産するための組成物と方法 |
| MX9605082A (es) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
| EP2322644A1 (en) | 2000-06-28 | 2011-05-18 | GlycoFi, Inc. | Methods for producing modified glycoproteins |
| US8697394B2 (en) * | 2000-06-28 | 2014-04-15 | Glycofi, Inc. | Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures |
| US7449308B2 (en) | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
| US7863020B2 (en) * | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
| US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
| US7625756B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
| EP1385866A4 (en) | 2001-04-05 | 2006-03-29 | Univ Nebraska | ALCOHOL OXIDASE-1 REGULATING NUCLEOTIDE SEQUENCES FOR HETEROLOGIC GENE EXPRESSION IN YEAST |
| DE60335602D1 (de) * | 2002-12-18 | 2011-02-17 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante Desoxyribonuclease I aus Rinder-Pankreas mit hoher spezifischer Aktivität |
| DE60319333D1 (de) * | 2002-12-20 | 2008-04-10 | Roche Diagnostics Gmbh | Hitzelabile Desoxyribonuklease I-Varianten |
| US7332299B2 (en) * | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
| EP1460425A1 (en) * | 2003-03-17 | 2004-09-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Deglycosylated enzymes for conjugates |
| CA2486195C (en) * | 2003-12-05 | 2012-03-06 | Stephan Glaser | Recombinantly expressed carboxypeptidase b and purification thereof |
| US7981635B2 (en) * | 2005-09-14 | 2011-07-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin |
| JP4216875B2 (ja) * | 2006-09-29 | 2009-01-28 | 株式会社東芝 | メタノール応答性プロモーター、プロモーターと外来遺伝子を発現可能な様式で連結した融合遺伝子、ベクター、形質転換体、およびタンパク質の生産方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3583194D1 (de) * | 1984-07-27 | 1991-07-18 | Unilever Nv | Verfahren zur herstellung von einem polypeptid mittels eines transformierten mikroorganismus, ein dazu geeigneter transformierter mikroorganismus, und zur herstellung dieser mikroorganismen geeignete dns sequenzen. |
| US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
| US4882279A (en) * | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| IL82935A0 (en) * | 1986-08-12 | 1987-12-20 | Phillips Petroleum Co | Secretion of heterologous proteins from yeast |
| NZ228948A (en) * | 1988-05-13 | 1991-06-25 | Phillips Petroleum Co | Hbv particles containing s and pre-s 2 proteins and recombinant processes for their production in yeast cells |
-
1988
- 1988-06-24 US US07/211,007 patent/US5032516A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-06-13 ZA ZA894495A patent/ZA894495B/xx unknown
- 1989-06-13 NZ NZ229534A patent/NZ229534A/en unknown
- 1989-06-14 CA CA000602769A patent/CA1306211C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-19 MX MX1651889A patent/MX16518A/es unknown
- 1989-06-21 DD DD89329825A patent/DD284047A5/de unknown
- 1989-06-23 HU HU893208A patent/HUT51673A/hu unknown
- 1989-06-23 PT PT90970A patent/PT90970A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-06-23 CN CN89104253A patent/CN1039616A/zh active Pending
- 1989-06-23 YU YU128789A patent/YU128789A/sh unknown
- 1989-06-23 AU AU37002/89A patent/AU615078B2/en not_active Expired
- 1989-06-23 PH PH38829A patent/PH27314A/en unknown
- 1989-06-23 IE IE205589A patent/IE67039B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-06-23 EP EP89111464A patent/EP0347928A3/en not_active Withdrawn
- 1989-06-23 KR KR1019890008823A patent/KR960010590B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-06-23 DK DK198903131A patent/DK175822B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-06-23 NO NO892634A patent/NO301285B1/no not_active IP Right Cessation
- 1989-06-23 JP JP1162492A patent/JPH0773501B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-26 FI FI893109A patent/FI104497B/fi active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO892634D0 (no) | 1989-06-23 |
| HUT51673A (en) | 1990-05-28 |
| IE67039B1 (en) | 1996-02-21 |
| AU615078B2 (en) | 1991-09-19 |
| FI104497B (fi) | 2000-02-15 |
| NO892634L (no) | 1989-12-27 |
| NZ229534A (en) | 1991-04-26 |
| US5032516A (en) | 1991-07-16 |
| DD284047A5 (de) | 1990-10-31 |
| DK313189D0 (da) | 1989-06-23 |
| JPH0253489A (ja) | 1990-02-22 |
| NO301285B1 (no) | 1997-10-06 |
| EP0347928A3 (en) | 1990-02-07 |
| ZA894495B (en) | 1990-03-28 |
| CN1039616A (zh) | 1990-02-14 |
| YU128789A (sh) | 1992-07-20 |
| PH27314A (en) | 1993-05-28 |
| KR960010590B1 (ko) | 1996-08-06 |
| IE892055L (en) | 1989-12-24 |
| DK175822B1 (da) | 2005-03-14 |
| FI893109A0 (fi) | 1989-06-26 |
| CA1306211C (en) | 1992-08-11 |
| PT90970A (pt) | 1989-12-29 |
| MX16518A (es) | 1993-10-01 |
| DK313189A (da) | 1989-12-25 |
| KR910001049A (ko) | 1991-01-30 |
| FI893109A (fi) | 1989-12-25 |
| EP0347928A2 (en) | 1989-12-27 |
| AU3700289A (en) | 1990-01-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0773501B2 (ja) | メチロトローフ酵母のアルコールオキシダーゼ▲ｉｉ▼調節領域をコードするｄｎａ配列 | |
| JP3786662B2 (ja) | ピチア・パストリスにおけるヒト血清アルブミンの発現 | |
| US4882279A (en) | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia | |
| EP0594594B1 (en) | Methods of producing hybrid g protein-coupled receptors | |
| CA1340837C (en) | Expression and secretion of heterologous proteins by yarrowia lipolytica transformants | |
| US4797359A (en) | Heat shock regulated production of selected and fused proteins in yeast | |
| CZ284251B6 (cs) | Způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce | |
| CA1340617C (en) | Expression of hepatitis b s and pres2 protiens in methylotrophic yeasts | |
| JPH02167095A (ja) | 異種蛋白質の製造方法、組換えｄｎａ、形質転換体 | |
| EP0121884B1 (en) | Hybrid dna synthesis of insulin | |
| JP2973430B2 (ja) | 誘導可能な系を用いた酵母による蛋白質の製造方法、ベクター及びその形質転換株 | |
| JP2769541B2 (ja) | 平衡型構成誘導性転写系 | |
| EP0374913A1 (en) | Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene | |
| IE67053B1 (en) | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region | |
| FI105825B (fi) | Pichia pastoris -kantoja | |
| NO315206B1 (no) | Nye celler inneholdende alkoholoksidase II regulatorisk område | |
| JPS62272980A (ja) | プラスミドの調製法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070809 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080809 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080809 Year of fee payment: 13 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080809 Year of fee payment: 13 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080809 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090809 Year of fee payment: 14 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |