NO315206B1

NO315206B1 - Nye celler inneholdende alkoholoksidase II regulatorisk område

Info

Publication number: NO315206B1
Application number: NO19954360A
Authority: NO
Inventors: James Michael Cregg
Original assignee: Res Corp Technologies Inc
Priority date: 1988-06-24
Filing date: 1995-10-31
Publication date: 2003-07-28
Also published as: NO954360L; NO954360D0

Description

Oppfinnelsen angår området rekombinant-DNA-bioteknologi. En side ved oppfinnelsen angår biologiske renkulturer av Pichia pastoris, transformert med vektorer som inneholder DNA-sekvenser som styrer transkripsjonen av DNA.

Den foreliggende oppfinnelse angår generelt manipuleringen av genetisk materiale, særlig styringen av hyppigheten av transkripsjon av RNA fra DNA. Oppfinnelsen angår spesielt et regulatorisk område av Pichia pastoris alkoholoksidase II-genet.

Etter hvert som rekombinant-DNA-bioteknologi har utviklet seg i de senere år, er den styrte produksjon ved celler av en mengde forskjellige nyttige polypeptider blitt mulig. Mange er eukaryote polypeptider, for eksempel humant veksthormon, leukocytrinterferoner, humant insulin og humant proinsulin som er blitt fremstilt ved forskjellige mikroorganismer. Den fortsatte anvendelse av teknikker som man allerede beherskersventes i fremtiden å tillate rekombinant produksjon av en rekke forskjellige andre nyttige polypeptidprodukter.

De grunnleggende teknikker som anvendes innen området rekombinant-teknologi, er kjent av fagfolk. De elementer som fortrinnsvis foreligger for utførelse av rekombinant-DNA-bioteknologi, omfatter men er ikke begrenset til: (1) et gen som koder for ett eller flere ønskede polypeptider operabelt forbundet (operabelt forbundet betegner en sammenstilling hvorved komponentene er anordnet slik at de utfører sin vanlige funksjon) med adekvate styringssekvenser som er nødvendige for ekspresjon i vertscellen; (2) en vektor, vanligvis et plasmid, inn i hvilken en nukleotidsekvens kan innsettes, en vektor er et hvilket som helst nukleotidsekvensholdig konstruert stykke, som kan transformere en vert; (3) en egnet vert inn i hvilken den ønskede nukleotidsekvens kan overføres, hvor verten også har det celleapparat som tillater ekspresjon av den informasjon som det er kodet for, ved den overførte nukleotidsekvens.

Et grunnleggende element som anvendes i rekombinant-teknologi er plasmidet, som er et sirkelformet ekstrakromosomalt dobbelttrådet DNA, som først ble funnet i mikroorganismer. Plasmider er blitt funnet å opptre i flere kopier pr. celle. Foruten naturlig forekommende plasmider, er en rekke forskjellige, av mennesker fremstilte plasmider blitt preparert. I plasmidet er det inkludert informasjon som er nødvendig for plasmid reproduksjon, dvs. en autonom replikasjonssekvens og/eller et opprinnelsessted for replikasjon. En eller flere metoder til fenotypisk seleksjon av plasmidet i transformerte celler, kan også være innlemmet i den informasjon som er kodet inn i plasmidet. De fenotypiske egenskaper, eller markørseleksjons-egenskaper, såsom resistens for antibiotika, tillater at kloner av vertscellen som inneholder det plasmid som er av interesse, kan gjenkjennes og selekteres for ved preferentiell dyrking av cellene i selektive media. Vektorer, eller plasmider kan kløyves spesifikt av ett eller flere restriksjonsendonukleaser eller restriksjonsensymer, som hver gjenkjenner en spesiell nukloetidsekvens. Deretter kan et regulatorisk område, operabelt forbundet med et heterologt gen, dvs. et gen som ikke forekommer naturlig i kombinasjon med det regulatoriske område, eller andre nukleotidsekvenser, innsettes ved å forbinde operabelt det ønskede genetiske materiale ved kløyvingssetet, eller ved rekonstruerte ender som grenser opp til kløyvingssetet.

Vektoren blir deretter innført i en vertscelle, hvor dens nukleotidsekvens kan beordre verten til å utføre forskjellige prosesser eller funksjoner. Noen eksempler omfatter ekspresjon av heterologe polypeptider, eller overekspresjon av homologe eller heterologe polypeptider. Prosessen hvor nukleotid innføres i vertcellen, blir generelt betegnet transformasjon. Store mengder av vektoren kan fås ved innføring av vektoren i en egnet vert for å øke dens kopitall. En vertscelle som det er vanlig å bruke for å øke kopitallet av vektoren, er E. coli. Vektorene blir deretter isolert fra den første vert, og innført i en annen vertscelle hvor de ønskede vektorbeordrede aktiviteter vil finne sted f.eks. produksjonen av et polypeptid. Produksjonen av et endeprodukt fra DNA på denne måte, blir betegnet som ekspresjon. Når genet er riktig innsatt i vektoren med hensyn til de partier av vektoren som styrer transkripsjon og translasjon av den kodede nukleotidsekvens, kan den resulterende vektor benyttes til å beordre produksjonen av polypeptidsekvensen for hvilken det innsatte gen koder.

Ekspresjon styres av et regulatorisk område. Regulatoriske områder er heterogene nukleotidsekvenser, som reagerer på forskjellige stimuli og virker inn på hyppigheten av RNA-transkripsjon. Ekspresjon kan skrus på eller av som reaksjon på stimuli. Ekspresjon som skrus på som reaksjon på en stimulus, blir vanligvis betegnet som derepresjon eller induksjon. Noen eksempler på induserbare ekspresjonssystemer er AOX1 -systemer i Pichia pastoris. estrogensystemene i Xenopus laevis og metalltioneinsystemene hos aper, mennesker, hamstere, mus og rotter. Induserbare ekspresjonssystemer er vanligvis under mer stringent styring enn konstitutive systemer. Disse systemer er vel egnede for gentekniske formål.

I praksis kan bruken av rekombinant-DNA-bioteknologi danne celler som kan uttrykke heterologe nukleotidsekvenser. Heterologe nukleotidssekvenser er nukleotidsekvenser som ikke opptrer naturlig i verten. Eksempler på slike vil være nye kombinasjoner av regulatoriske områder som opptrer naturlig inne i verten med strukturelle gener som ikke er naturlig knyttet til dette regulatoriske område. Et annet eksempel vil være kombinasjonen av et regulatorisk område med et gen som ikke forekommer naturlig i verten. Det heterologe polypeptid kan produseres som et fusjonspolypeptid, dvs. et heterologt polypeptid, sammenføyet med et parti av aminosyresekvensen av et homologt eller heterologt polypeptid. Det opprinnelig oppnådde fusjonspolypeptidprodukt blir iblant produsert i en inaktiv form, inntil det sammenføyde polypeptid kløyves i en ekstracellulær omgivelse.

Slik det tidligere er angitt i Europapatentsøknad nr. 86114700.7, koder Pichia pastoris-genomet for to funksjonelle alkoholoksidasegener AQX1 og AQX2.

Det er nå funnet et 5' regulatorisk område som er knyttet til det AOX2 strukturelle gen. Dette regulatoriske område er induserbart ved metanol eller karbonkildehunger. Det maksimale ekspresjonsnivå fra det AQX2 regulatoriske område er imidlertid bare 5 - 11% i forhold til det fra det AOX1 regulatoriske område f AOXl-genet er angitt i Europapatentsøknad nr. 85201235.0).

Det AOX2 regulatoriske område kan anvendes til å uttrykke heterologe gener og er særlig nyttig i de situasjoner hvor høye ekspresjonsnivåer av et protein er ufordelaktige.

Det er derfor en hensikt å tilveiebringe nye celler som ikke har ulempene angitt ovenfor. Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse, er det funnet, isolert ogkarakterisertbiologisk renkultur av Pichia pastoris med en DNA-sekvens som styrer hyppigheten av transkripsjonen av DNA til RNA. De nye DNA-sekvenser er nyttige for produksjonen av polypeptidprodukter ved metylotrofe gjærsorter såsom Pichia pastoris.

Kort beskrivelse av tegningen:

- Fig. 1 viser restriksjonskartet av AOX1 (a) og AQX2 (b) genene.

- Fig. 2 viser et restriksjonskart av pBR322.

- Fig. 3 viser et restriksjonskart av pYJ8.

- Fig. 4 viser et restriksjonskart av plasmid pYM5.

- Fig. 5 viser et restriksjonskart av plasmid pMR4.

- Fig. 6 viser et flytdiagram for konstruksjonen av pMR4.

- Fig. 7 viser et restriksjonskart av plasmid pBPfl.

- Fig. 8 viser et restriksjonskart av plasmid pYJ55.

- Fig. 9 viser et flytdiagram for konstruksjonen av plasmid pYJ55.

- Fig. 10 viser et restriksjonskart av plasmid pSAOH5.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse, er der skaffet celler med en ny DNA-sekvens inneholdende et regulatorisk, område som reagerer på minst en av de følgende betingelser: nærværet av metanol i vertsomgivelsen eller karbonkildehunger når vertscellen dyrkes på substrater andre enn metanol. Det regulatoriske område ifølge oppfinnelsen kan styre transkripsjonshyppigheten av RNA når det er operabelt forbundet ved 5'-enden av en DNA-sekvens, som.koder for produksjonen av mRNA.

Disse og andre hensikter med oppfinnelsen vil fremgå av beskrivelsen og de tilhørende krav.

I. Karakteriserin<g>av det alkoholoksidase regulatoriske område.

Det fullstendige AOX2-gen inneholdes i det restriksjonskart som er vist på fig. l(b). Det AOX2 regulatoriske område inneholdes mellom det første EcoRI-sete fra 5'-enden, og startkodonet av det AQX2 strukturelle gen som vist ved restriksjonskartet på fig. 1 (b). Det parti av DNA-sekvensen som koder for alkoholoksidase II-proteinet, er vist ved det skraverte område under restriksjonskartet. Et restriksjonskart av alkoholoksidase I-genet, er vist for sammenligning av de to gener, fig. 1 (a). Ingen betydelig sekvenshomologi ble observert utenfor genenes proteinkodende parti.

Det AOX2 regulatoriske område er ved et lacZ-fusjonskonstruert stykke, blittkarakteriserttil å behøve ikke mer enn fra ca. basepar -1500 til ca. basepar -1, for regulatorisk aktivitet (som vist i tabell 1). Nukleotidsekvensen, for et DNA-fragment, inneholdende det AOX2 regulatoriske område, er vist i tabell 1. Det A0X2 regulatoriske område reagerer på minst en av de følgende betingelser: Nærværet av metanol som den eneste karbonkilde for metylotrofe gjærverter, såsom Pichia<p>astoris. eller karbonkildehunger i de nevnte vertsceller. Dessuten stimulerer det AOX2 regulatoriske område tilnærmet 5-11% av proteinproduksjonen av B-galaktosidase sammenlignet med det AOX1 regulatoriske område.

II. Isolasjon av alkoholoksidase II regulatorisk. område fra Pichia pastoris.

Det AOX2 regulatoriske område ble isolert ved transformasjon av Pichia-stamme MC 100-3 (arg4, his4. aoxl=j=: : SARG4 aox2^: : Phis4). Denne stamme inneholder en mutantkopi av Pichia HIS4-genet insatt i AOX2-genet. MC 100-3 ble transformert med pYM5, et plasmid sammensatt av et 2,7 kb BglH-fragment inneholdende Pichia HIS4-genet insatt ved BamHI-setet av pBR322. DNA fra flere MC 100-3 (pYM5) His<+->transformanter, ble sortert ved Southern filter-hybridisering for transformanter som inneholdt pYM5 integrert med HIS4-fragmentet anordnet i AOX2-lokuset av MC 100-3. DNA fra en av disse stammer ble deretter digerert med Hindlll, som førte til frigjøring av et genomisk fragment på ca. 12 kb inneholdende 5,3 kb av sekvensen 5' av AOX2 Kpnl-setet, 2,7 kb av Pichia HIS4-genet og 4,0 kb av pBR322. Det Hindlll-kuttede DNA ble ligatisert og transformert inn i E. coli. Transformanter ble selektert ved resistens for ampicillin. Et plasmid, pMR4, ble utvunnet og et restriksjonskart av dette plasmid er vist på fig. 5.

II. Egenskaper av det AOX2 regulatoriske område.

For å sammenligne ekspresjon av det AOX2 regulatoriske område med det for AOX1. ble en AOX2- lacZ-ekspresjonsvektor konstruert som var så lik som mulig pSAOH5 (vist på fig. 10), en AQX1 - lacZ-fusjonsvektor. Flytdiagrammet for konstruksjon av AOX2- IacZ-vektoren, pYJ55, er vist på fig. 9. Preliminære DNA-sekvensdata fra 5'-enden av AOX2. viste at AOX2 inneholder to BamHI-seter i posisjoner i det strukturelle gen identiske med dem man finner i AOX1 strukturelt gen. Følgelig var det første trinn i konstruksjonen av pYJ55 å innsette et BgHI-BamHI-fragment på 1,8 kb, som inneholder det AOX2 regulatoriske område, og 45 basepar av den aminoterminale proteinkodende sekvens inn i BamHI-setet av pBPfl for å danne pYJ38. Det annet trinn var å kutte pYJ38 med BamHI, og innsette det samme adaptor-oligonukleotid som var innsatt for konstruksjonen av AOXl- lacZ-vektoren (5'-GATCACCCGGGT-3'). Innsettingen av denne adaptor ødela BamHI-setet av pYJ38 og dannet et nytt Smal-sete ved punktet for innsettingen. Dette plasmid, pYJ45, ble digerert med Smal, og det 1,8 kb Smal-fragment inneholdende den modifiserte AOX2-promotor ble innsatt i pBPfl for å danne plasmid pYJ46. Plasmid pYJ46 ble digerert med EcoRI for å fjerne et 0,3 kb fragment fra 5'-enden av AOX2-fragmentet i pYJ46. Plasmidet ble religatisert for å danne plasmid pYJ55. Et restriksjonskart av plasmid pYJ55 er vist på fig. 8.

Plasmid pYJ55 ble transformert inn i GS115 (his4), og His<+->transformanter ble sortert for en stabil His<+->fenotype som indikerte nærværet av et integrert plasmid. Genomisk DNA fra flere stabile His<+->stammer ble analysert ved Southern filter-hybridisering for å bekrefte nærværet og bestemme lokaliseringen av plasmidet.

For å bedømme relative styrker av AOX1- og AOX2-promotorene ble produksjonen av IJ-galaktosidase ved pYJ55 og pSAOH5 sammenlignet ved transformasjon av disse plasmider inn i GS115. De transformerte GS115-stammer ble betegnet henholdsvis GS115 (pYJ55) og GS115(pSAOH5). Hver stamme inneholder plasmid intergrert ved HIS4-lokuset. Celler av hver stamme ble dyrket i glyserolmedium, byttet over til et medium uten karbonkilde i 24 timer og deretter byttet over til et medium med metanol i ytterligere 50 timer. Prøver av hver kultur ble fjernet ved slutten av hver vektsfase og ekstrakter ble preparet og analysert for B-galaktosidase. Resultatene av disse analyser er vist i tabell 2.

Betydelige mengder B-galaktosidase, ble ikke observert i glyseroldyrkede celler, av hverken AQXl- lacZ- eller AQX2- lacZ-stammer. I mediet uten karbonkilde, var aktivitetsnivået i AOX2- lacZ-stammen tilnærmet en tiendedel av den som ble obsevert for AOX1 - lacZ-stammen. Tilsetningen av metanol til de AOX2- lacZ-holdige celler, førte til nivåer av li-galaktosidase som nådde opp i ca. en niendedel av dem hos AOXl- lacZ-celler. Således er AOX1- og AOX2-<g>enene regulert på lignende måte. Det ene trekk som skiller er en betydelige lavere reaksjon på metanol og karbonkildehunger, av det AOX2 regulatoriske område.

Skjønt innføringen av det AOX2 regulatoriske område/B-galaktosidase gen-fusjon i en vertsgjærcelle er blitt beskrevet her, vil fagfolk innse at det ikke er nødvendig for utførelse av oppfinnelsen å benytte sirkelformede plasmider eller det li-galaktosidase strukturelle gen. Således kan andre vektorer som kan opprettholdes i gjær benyttes i anvendelsen av dette regulatoriske område sammen med andre heterologe gener. Alternativt kan dette regulatoriske område operabelt forbundet med andre heterologe gener integreres inn i kromosomet av vertsgjærcellen ved anvendelse av integrative vektorer. Dessuten kan funksjonelle mutanter av det AOX2 regulatoriske område som her er beskrevet, bestående av kortere DNA-sekvens fra 5'-enden, også anvendes til å regulere heterolog genekspresjon.

Eksempler Generell informasjon som angår eksemplene.

Stammer

Medier, buffere og oppløsninger

1 M Tris-buffer 121,1 g Tris-base i 800 ml H2O; juster pH på den ønskede verdi ved tilsetning av konsentrert (35%) vandig HC1; tillat oppløsningen å kjølne til værelsestemperatur før endelig pH-justering, fortynn til et endelig volum på 1 1.

TE-buffer 1,0 mM EDTA

i 0,01 M (pH 7,4) Tris-buffer SSC 0,15MNaCl

15 mM natriumcitrat justert til pH 7,0 med NaOH

TAE 40 mM eddiksyre

5 mM EDTA

i 0,02 M (pH 8,3) Tris-buffer Denhardfs oppløsning 5 g Ficoll

(50x) 5 g polyvinylpyrrolidon

5 g bovinserumalbumin (BSA; Pentax Fraction V) brakt på et samlet volum på 500 ml med vann 20X SSPE 20 mM EDTA

0,16 M NaOH

0,2 M NaH2P04 H20 3,6MNaCl justert til pH 7,0 med NaOH

LB (Luria-Bertani) 5 g Bacto-trypton

-medium 5 g Bacto-gjærekstrakt

2,5 g NaCl i 1 1 vann, justert til pH 7,5 med NaOH

YPD-medium 1% Bacto-gjærekstrakt 2% Bacto-pepton 2% Dekstrose YNB-medium 6,75 g gjaer-nitrogenbase uten aminosyrer

(DIFCO) i 1 1 vann

SED IM sorbitol

25 mM EDTA

50 mM DTT

SCE-buffer 9,1 g sorbitol

1,47 g natriumcitrat 0,168 g EDTA

50 ml H20

-pH til 5,8 med HC1

CaS 1 M sorbitol lOmMCaCb

—filtersteriliser PEG-oppløsning 20% polyetylenglykol-3350 10 mM CaCl2 10 mMTris HCI (pH 7,4)

--filtersteriliser

SOS 1 M sorbitol

0,3x YPD-medium 10 mM CaCl2

Formamide fargeblanding 0,1% xylencylenol FF

0,2% bromfenolblått 10 mM EDTA

95% avionisert formamid Toppgel 76,8 g urea 24 ml akrylamide-utgangsmateriale

8 ml 10x TBE

bring på et endelig volum på 160 ml

Akrylamidutgangs- 38 g akrylamid

materiale 2 g bis(N,N-metylenbisakrylamid)

tilsett vann til et endelig volum på 100 ml

Bunngel 14,4 g urea

3,0 g sakkarose

7,5 ml 10x TBE

4,5 ml akrylamidutgangsmateriale 0,3 ml bromfenolblått-oppløsning

(0,01 g/ml)

tilsett vann til å gi et endelig volum på 30 ml Dideoksy:

dd ATP 0,125 med mer

ddCTP 0,10 med mer

ddGTP 0,10 med mer

dd TTP 0,80 mM

DNTP-utgangsmaterialer 0,5 mM dGTP

0,5 mM dCTP

0,5 mM TTP

0,5 mM dATP

10X Klenow fort<y>nnin<g>s- 70mM TrisHCl, pH 7,5

buffer 200mM NaCl

70mM MgCl2

ImM EDTA

10X TMD. pH 7. 5 0,1M Tris HC1, pH 7,5

0,05M MgCl2

0,075M DTT

Med mindre noe annet er angitt, representerer de ovenfor angitte oppløsninger den grunnleggende konsentrasjon (lx) som ble anvendt. Gjennom alle eksemplene der hvor forskjellige konsentrasjoner anvendes er dette faktum angitt ved at oppløsningene er betegnet som et multippel av den grunnleggende (lx) konsentrasjon.

Re<g>enererin<g>sagar

1) Agar-KCl: 9 g Bacto-agar, 13,4 g kaliumklorid, 240 ml H20, autoklavering.

2) 10x glukose: 20 g dekstrose, 100 ml H20, autoklavering.

3) lOx YNB: 6,75 g gjær-nitrogenbase uten aminosyrer, 100 ml H2O, autoklavering. (Tilsett eventuell aminosyre eller nukleinsyre inntil en konsentrasjon på 200 ug/ml før eller etter autoklavering). 4) Tilsett 30 ml 10x glukose og 30 ml 10x YNB til 240 ml av den smeltede Agar/KCl-oppløsning. Tilsett 0,6 ml av 0,2 mg/ml biotin, og eventuelt en hvilken som helst annen ønsket aminosyre eller nukleinsyre til en konsentrasjon av 20 pg/ml. Hold smeltet regenereringsagar på 55-60°C.

Dyrking av Pichia pastoris

P. pastoris ble dyrket i YPD (rikt) eller YNB (minimalt) medium. Etter behov ble YNB-medium supplert med karbonkilde (2% dekstrose, 1% glycerol, eller 0,5% metanol) og med 50 ug/ml aminosyre.

Sekvensering

DNA-sekvensering var ved dideoksynuklotid-kjedeavslutningsmetoden i henhold til Sanger et al., PNAS 74, 5463 (1977).

De følgende forkortelser er benyttet i eksemplene:

EDTA etylendiamintetraeddiksyre

TEMED N,N,N',N'-tetrametylendiamin

DTT ditiotreitol

BSA bovineserumalbumin

EtBr etidiumbromid

Ci Curie

dATP deoksyadenosintrifosfat

dGTP deoksyguanosintrifosfat

TTP thymidintrifosfat

dCTP deoksycytidintrifosfat

dXTP "generisk" deoksytrifosfatnukleotid

oligo(dT)i2is kilde: Collaborative Research, Inc.

Zymolyase 60.000 kilde: Miles Laboratories

Isolering av alkoholoksidase II regulatorisk område

Eksempel I

Paring av PPF1 X KM7121 og utvikling av MC100- 3

Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) (NRRL Y-18017) og KM7121 ( arg4 his4 aoxl=j=: : SARG4 aox24/: :PHIS4) (NRRL Y-l 8019) ble hver kodet fra en ny YPD-plate inn i et rør med sterilt vann. Ca. 5 x 10<7>celler av hver stamme ble blandet, behandlet med lyd (sonicated) i en kort periode for å bryte opp celleklumper, og spredt på en GNAP-agarplate (5% dekstrose, 2% pepton, 1% gjæreksrakt, 0,5% agar, 2,3% næringsagar). En ublandet sammenligningsprøve av hver stamme (ca. 1x10 celler) ble behandlet på samme måte. GNAP-platene ble inkubert ved 30°C i ca. 24 timer, og deretter replikaplatet på spordannelsemedium-agarplater (0,5% Na-acetat, 1% KC1, 2% agar). Disse plater ble inkubert i ca. 20 timer ved 30°C, og deretter replikaplatet på minimalmedium-agarplater uten noen karbonkilde. Metanol ble matet til cellene på minimalplatene i dampfasen.

Etter 5 dager kom ca. 200 kolonier til syne på minimalplaten, som mottok de blandede celler. Ingen kolonier ble noen gang utviklet på de ublandede sammenligningsplater, et resultat som antyder at Arg<+>His<+>Mut<+->koloniene på den blandede plate var diploide, som et resultat av paringer mellom PPF1- og KM7121-celler (Mut<+>= metanol utnyttelse). Den diploide karakter av disse Arg<+>His<+>Mut<+->stammer ble bekreftet ved undersøkelse av AOX-loci hos fire av disse stammer ved Southern filter-hybridisering. Spesifikke prober som ble benyttet var: pPG3.0 (NRRL B-18022), en AOX2 spesifikk probe; pYJ30 (NRRL B-15890), en HIS4 spesifikk probe og pPG4.0 (NRRL B-15868), en AQX1 spesifikk probe.

For å sporulere PPF1 x KM7121 diploidene, ble en koloni (MC 100) først utvunnet fra metanolmediets diploide seleksjonsplate. Ca. 1 x IO<6>av disse celler ble spredt på GNAP-plater, og behandlet som beskrevet for paringsfremgangsmåten, bortsett fra at spordannelseplaten ble inkubert i fire dager ved 30°C for å tillate cellene og fullføre sporedannelsen. Sporer ble utvunnet fra platene ved rensing av hver plate med 5 ml sterilt vann. Suspensjonen ble vasket 2 ganger med 3 ml fosfatbuffer (0,1M Na3<p>04, pH 7,5). En blanding av de gjær-lytiske ensymer Glusulase (Endo Laboratories, NY) og Zymolyase (60.000 enheter/g; Miles Laboratories) og 13- . merkaptoetanol, ble satt til endelige konsentrasjoner på henholdsvis på 2% (v/v), 0,5 mg/ml og 0,1% for å ødelegge vegetative celler. Blandingen ble inkubert i 5 timer ved 30°C.

Sporepreparatet ble deretter vasket 2 ganger i sterilt vann inneholdene 0,2% Tween 80 (v/v) og resuspendert i fosfatbuffer. Preparatet ble deretter behandlet med tre 20-sekunders sykluser av lydbehandling, for å bryte opp klumper av sporer. En prøve av sporpreparatet ble deretter fortynnet og spredt på ikke-selektive masterplater av minimalt medium, med 2% glukose og 50 ug/ml hver av arginin og histidin. Disse ble inkubert i 48 timer ved 30°C. Hver masterplate ble deretter replikaplatet på den følgendes serie av minimale plater: 1) glukose, -arg, -his 2) glukose, -arg, +his 3) glukose, +arg, -his og 4) glukose, +arg, +his.

Etter inkubering i 24 timer ved 30°C, ble koloniene undersøkt for Arg- og His-fenotyper. Kolonier som var Arg<+>His-, ble deretter testet for vekst på metanol ved utstrykning på YNB-metanolagarplater. Etter ca. 1 uke ved værelsestemperatur ble platene undersøkt for Mut-fenotype. En Arg<+>His- Mut—stamme ble betegnet MC100-3.

Eksempel II

Transformasjon av Pichia pastoris

Gjærceller ble podet inn i ca. 10 ml YPD-medium og ristedyrket ved 30°C, i 12-20 timer. Cellene ble deretter fortynnet til en A600på 0,01 - 0,1, og opprettholdt i logaritmisk fase i YPD-medium ved 30°C i 6 - 8 timer. 100 ml YPD-medium ble podet med 0,5 ml av podekulturen ved en Acoopå ca. 0,1, og ristedyrket ved 30°C i 12-20 timer. Kulturen ble deretter høstet når A600var 0,2 - 0,3 (etter tilnærmet 16 - 20 timer) ved sentrifugering ved anvendelse av en DAMON IEC DPR-6000 sentrifuge ved 1500 g i 5 minutter.

For å fremstille sfæroplaster, ble cellene vasket en gang i 10 ml sterilt vann

(sentrufugering ble utført etter vasking som det beskrevet ovenfor), en gang i 10 ml nylig fremstilt SED, en gang i 10 ml steril IM sorbitol, og resuspendert i 5 ml SCE-buffer. 5 yl av 4 mg/ml Zymolyase 60.000 (Miles Laboratories), ble tilsatt og cellen inkubert ved 30°C i ca. 30 minutter.

Sfæroplastdannelse ble overvåket som følger. 100 ul porsjoner av celler, ble satt til 900 yl av 5% SDS og 900 yl av IM sorbitol før eller like etter tilsetningen av Zymolayse, og på forskjellige tidspunkter i løpet av inkubasjonsperioden. Inkubasjonen ble stoppet ved det punkt hvor cellene lyserte i SDS, men ikke sorbitol. Straks de var dannet, ble sfæroplaster vasket en gang i 10 ml steril IM sorbitol ved sentrufugering ved 1.000 g i 5-10 minutter, og vasket en gang i 10 ml sterilt CaS ved sentrufugering, og resuspendert i 0,6 ml CaS.

For den egentlige transformasjon, ble DNA-prøver i vann eller TE-buffer tilsatt (inntil 20 yl samlet volum), til 12 x 75 mm sterile polypropylenrør. (For små mengder DNA, finner maksimal transformasjon sted ved anvendelse av ca. 1 yl 5 mg/ml lydbehandlet E. coli-DNA i hver prøve). 100 yl sfæroplaster ble satt til hver DNA-prøve og inkubert ved værelsestemperatur i ca. 20 minutter. 1 ml PEG-oppløsning ble satt til hver prøve, og inkubert ved værelsestemperatur i ca. 15 minutter. Prøvene ble sentrifugert ved 1.000 g i 5-10 minutter, og supernantanten ble kassert. Pelletene ble resuspendert i 150 yl SOS og inkubert ved værelsestemperatur i 30 minutter. 850 yl steril IM sorbitol, ble satt til hver, og prøvene ble platet som beskrevet nedenfor.

10 ml regeneringsagar ble helt på hver plate minst 30 minutter før transformasjonsprøvene var ferdige. Porsjoner på 10 ml regeneringsagar ble også fordelt på rørene i et bad på 45-50°C, i løpet av den periode som transformasjonsprøvene var i SOS. Prøver ble deretter satt til rørene, helt på plater inneholdene det faste bunnagarlag, og inkubert ved 30°C i 3-5 dager.

Sfæroplastkvalitet på forskjellige punkter ble bestemt som følger. 10 pl prøve ble fjernet og fortynnet 100 x ved tilsetning til 990 yl IM sorbitol. 10 yl av fortynningen ble fjernet, og en ytterligere 990 yl porsjon av IM sorbitol ble tilsatt. 100 yl av begge fortynninger ble utstrykningsplatet på YPD-agarmedium for å bestemme konsentrasjonen av ikke-sfæreoplastdannende hele celler som var tilbake i preparatet. 100 yl av hver fortynning ble satt til 10 ml regeneringsagar som var blitt supplert med 40 yg/ml av alle de aminosyrer som var nødvendige for verten for å bestemme de samlede regenererbare sfæroplaster. Gode verdier for transformasjonseksperimentet var 1 - 3 x 10<7>, samlede regenererbare sfæroplaster pr. ml og ca. 1 x IO<3>hele celler pr. ml.

Eksempel III

Konstruksjon av MC 100- 3 ( pYM5)

Ca. 10 yg pBR322 ble digerert med BamHI og defosforylert. Ca. 50 yg pYJ8 (NRRL B-15889), som inneholder Pichia HJS4-genet, ble digerert med Bglll. Et 2,7 kb Bglll-fragment ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. 300 ng av fragmentet og 300 ng av BamHI-digerert pBR322, ble ligatisert ved anvendelse av 0,5 enheter T4 DNA-ligase i 10 yl samlet volum, av 66 mM Tris HCl, pH 7,4, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT og 0,4 mM ATP, i 24 timer ved 4°C.

Ligasjonsreaksjonen ble anvendt til å transformere E. coli MC 1061 ti ampicillinresistens som beskrevet i eksempel V. Tranformanter blekarakterisert vedrestriksjonsdigereringer, og den riktige størrelse og orientering av det innskutte stykke ble bekreftet ved agarosegelelektroforese. Dette plasmid ble kalt pYM5, og ble utvunnet fra E. coli ved anvendelse av den alkaliske lyse-plasmidpreparerings-teknikk beskrevet hos Maniatis et al (1982). (Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambroox, J. (1982). Molecular Clonine: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.)

Ca. 10 yg pYM5 ble digerert med Stul før transformasjon av MC 100-3. Dette trinn beordret plasmidet til å integrere ved en av de HIS4-gensekvenser som forelå i MC 100-3, enten det native HIS4-lokus eller det modifiserte AOX2-lokus. Transformasjon ble utført i henhold til fremgangsmåter vist i eksempel II.

DNA fra en rekke MC100-3(pYM5) His<+->transformanter ble isolert i henhold til eksempel IV og sortert ved Southern filter-hybridisering, for transformanter som inneholdt pYM5 integrert ved HIS4-fragmentet anordnet ved AOX2. Spesifikke prober som ble anvendt var: pPG 3.0 (NRRL B-18022), en AOX2 spesifikk probe; pYJ30 (NRRL B-15890), en HIS4 spesifikk probe.

Egenskaper av det alkoholoksidase II regulatoriske område

Eksempel IV

Giær- DNA- fremstilling

Gjærceller ble dyrket i 100 ml YNB-medium + 2% dekstrose ved 30°C, inntil A^o var lik 1 - 2 og deretter pelletert ved anvendelse av en Damon IEC DPR-6000, sentrifuge ved 2000 g i 5 minutter. Pelletten ble vasket en gang i dH20, en gang i SED, en gang i IM sorbitol og deretter resuspendert i 5 ml av en oppløsning av 0,1M TrisHCl, pH 7,0 og IM sorbitol. Cellene ble deretter blandet med 50 - 100 ul av en 4 mg/ml oppløsning av Zymolyase 60.000 (Miles Laboratories) og inkubert ved 30°C i 1 time. De resulterende sfæroplaster ble deretter sentrifugert ved 1 000 g i 5 - 10 minutter og suspendert i 5 ml lysebuffer [0,1% SDS, lOmM Tris HCl (pH 7,4), 5mM EDTA og SOmMNaCl]. Proteinase K (Boehringer Mannheim) og RNase A (Sigma) ble hver satt til 100 pg/ml og oppløsningen inkubert ved 37°C i 30 minutter. DNA ble avproteinisert ved forsiktig omrøring av preparatet med et like stort volum kloroform inneholdende isoamylalkohol (24:1, v/v), og fasene ble separert ved sentrifugering ved 12 000 g i 20 minutter. Den øvre (vandige) fase ble overført til et nytt rør, og ekstrahert med et like stort volum fenol/kloroform/ isoamylalkohol. Fasene ble separert som tidligere, og toppfasen anbragt i et rør inneholdende 2-3 volumer kald 100% etanol. Prøven ble forsiktig omrørt og DNA ble oppsamlet ved oppvikling på en plaststav. DNA ble øyeblikkelig oppløst i 1 ml TE-buffer, og dialysert over natten ved 4°C mot 100 volumer TE-buffer.

Eksempel V

Konstruksjon av pMR4

DNA ble isolert i henhold til fremgangsmåten i eksempel IV fra en MCI 00-3(pYM5) His<+->transformant generert som angitt i eksempel III. 10 yg av dette genomiske DNA ble digerert med Hindlll og ligatisert. Ligasjonsreaksjonen ble utført ved 4°C i 24 timer i 66 mM Tris HC1, pH 7,4, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,4 mM ATP, og 0,5 enheter T4 DNA-ligase.

Ligasjonsblandingen ble transformert direkte inn i E. coli MC 1061-celler, som var blitt gjort kompetente for transformasjon og transformert som beskrevet av Maniatis et al. (1982). Seleksjon for ampicillinresistens ble utført ved dyrking av cellene i enten LB-medium eller 2B-medium (0,2% NH4P04, 1,2% Na2HP04, 0,013% MgS04 7H20, 0,074% CaCl2'2H20, 1 ug/ml tiamin, 0,4% dekstrose) supplert med 50 yg/ml ampicillin.

Et 12,0 kb plasmid betegnet pMR4 ble utvunnet i henhold til Maniatis et al. (1982). Dette plasmid inneholdt 5,3 kb DNA 5', i forhold til AOX2 Kpnl-setet. 2,7 kb av Pichia HIS4-genet, og 4,0 kb av pBR322.

Eksempel VI

Konstruksjon av pYJ55

For å bestemme reguleringen og ekspresjonen av AOX2-promotoren. ble en vektor inneholdende AOX2 5-sekvensen føyet til E. coli lacZ-<g>enet konstruert. 50 yg av pMR4 (Eksempel V) ble digerert med Bglll og BamHI i henhold til produsentens retningslinjer. Et Bglll - BamHI-fragment på en 1,8 kb inneholdende AOX2-promotoren, ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. 10 ug pBPfl (NRRL B-15892) ble digerert med BamHI og defosforylert ved anvendelse av alkalisk fosfatase i et reaksjonsvolum på 50 ul (1 U enzym ved 37°C i 1 time i 50mM Tris HCl, pH 9,0, ImM MgCl2, 100 yMZnCl2, ImM spermidin).

300 ng av 1,8 kb-fragmentet og 300 ng av pBPfl ble ligatisert med T4-ligase som følger. Ligasjonsreaksjonen ble utført ved 23°C i 1 time i et 10 ul reaksjonsvolum inneholdende 66mM_ TrisHCl, pH 7,6, 5mM_ MgCl2, 5mM_ ditiotreitol, ImM ATP og 1 Weiss-enhet T4-ligase. Den resulterende vektor ble betegnet pYJ38.

Et nytt Smal-restriksjonssete ble dannet i pYJ38 som følger. Et adaptoroligonukleotid ble syntetisert ved anvendelse av en Applied Biosystems DNA Synthesizer, Model 380 A, ved anvendelse av cyanoetylfosforamiditt-kjemi: 10 ug pYJ38 ble digerert med BamHI og behandlet med alkalisk fosfatase som angitt ovenfor. 1 ug av den ovenfor angitte adaptor og 0,1 ug av BamHI-di<g>erert pYJ38 ble ligatisert ved anvendelse av T4-ligase som beskrevet ovenfor. Den modifiserte vektor ble betegnet pYJ45. Et 1,8 kb Smal-fragment inneholdende den modifiserte AOX2-promotor ble oppnådd ved digerering av 50 ug pYJ45 med Smal. Fragmentet ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. 0,3 ug av fragmentet og 0,3 ug av Smal-digerert pBPfl, ble ligatisert som angitt ovenfor for å danne vektoren pYJ46. Et 0,3 kb EcoRI-fragment ble slettet fra 5'-enden av AQX2-segmentet i pYJ46 som følger. 10 ug pYJ46 ble digerert med EcoRI og behandlet med alkalisk fosfatase som beskrevet ovenfor. En separat 50 yg porsjon av pYJ46 ble også digerert med EcoRI og et 1,5 kb-fragment ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. Ca. 0,3 yg hver av fosfatasert pYJ46 og det isolerte fragment ble ligatisert og transformert inn i E. coli som beskrevet ovenfor. Et plasmid som hadde den riktige struktur ble isolert og betegnet pYJ55.

Eksempel VII

Utvikling av stamme GS115 f<p>YJ55)

Pichia pastoris GS115, en histidin-auxotrof (NRRL Y-15851; his4) ble tranformertmed plasmid pYJ55 (Eksempel VI) som beskrevet i eksempel II. Genomisk DNA fra stabile His<+->stammer, ble analysert ved Southern filter-hybridisering for å bestemme plasseringen av plasmidet. En transformant inneholdende pYJ55 integrert ved HIS4-lokuset. ble betegnet GS115 (pYJ55).

Eksempel VIII

Sammenligning mellom AOX1- og AOX2- promotorene

Regulering og ekspresjon av AOX1- og AQX2- promotorene, er blitt sammenlignet ved bestemmelse av B-galaktosidaseaktiviten av stammer GS115(pSAOH5) og GS115(pYJ55). 100 ml kulturer av hver stamme ble dyrket i YNB pluss 1% glycerolmedium i 24 timer ved 30°C, byttet om til YNB-medium uten en karbonkilde i 24 timer ved 30°C, deretter byttet om til YNB-medium med 0,5% metanol i 50 timer ved 30°C. Prøver av hver kultur ble fjernet på de følgende tidspunkter:

1) etter 24 timer i glycerolmedium

2) etter 24 timer i ikke noe karbonmedium

3) etter 24 og 50 timer i metanolmedium.

Ekstrakter ble fremstilt og analysert for B-galaktosidaseaktivitet som beskrevet nedenfor. Resultatene av disse analyser er vist i tabell 2.

fi- galaktosidaseanalvse

1) Nødvendig oppløsning:

fyll opp til 1 1; pH bør være 7

O- Nitrofenvl- B- D- galaktosid ( ONPG):

Oppløs 400 mg ONPG (Sigma N-l 127) i 100 ml destillert vann for å danne en 4 mg/ml ONPG-oppløsning.

2) Preparering av cellefritt proteinekstrakt:

Hver prøve ble vasket en gang i CIH2O, en gang i lysebuffer og resuspendert i lysebuffer ved en konsentrasjon på 150 Agoo/ml. 0,5 g glassperler ble satt til en 350 ul porsjon av prøve og blandingen ble svirret fire ganger i 60 sekunder hver med ett minutts mellomrom på is. Celleoppslemmingen ble fjernet fra glassperlene og suspensjonen ble sentrifugert i 5 minutter i en mikrosentrifuge. Supernantanten ble overført til et mikrosentrifugerør av polypropelen for analyse. Mengden av samlet protein i hvert ekstrakt ble bestemt ved Bradfords analysemetode (Bio-Rad). BSA tjente som proteinstandarden.

3) Analysemetode:

1 - 50 yl cellefritt proteinekstrakt ble satt til 1 ml Z-buffer. Blandingen ble svirret og inkubert i 5 minutter ved 30°C. Reaksjonen ble startet ved tilsetning av 0,2 ml ONPG (4 mg/ml). 0,5 ml av IM Na2C03-oppløsning ble tilsatt for å stanse reaksjonen på et passende tidspunkt (A42o<l)- Absorbansen ved 420 nm ble deretter avlest.

4) Beregning av 13-galaktosidase-aktivitetsenheter

1 U = 1 nmole ortonitrofenol (ONP) ble dannet hvert minutt ved 30°C og pH=7. 1 nmole ONP har en absorbans ved 420 nm (A420) på 0,0045 med en banelengde på 1 cm. Følgelig representerer en absorbans på 1 ved 420 nm, 222 nmole ONP/ml eller 378 nmole ONP/1,7 ml (det samlede volum av supernantant som ble analysert var 1,7 ml). Enheter uttrykt i tabell 2 ble beregnet som følger:

Claims

1. Biologiske renkulturer av Pichia pastoris. karakterisert vedat de er prototrofe for arginin, auxotrofe for histidin og ikke i stand til å anvende metanol som en karbonkilde.

2. Renkultur som angitt i krav 1, karakterisert vedat stammen er MC 100-3.