NO894916L

NO894916L - Pichia pastoris glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenasegen.

Info

Publication number: NO894916L
Application number: NO89894916A
Authority: NO
Inventors: Mary Ellen Digan
Original assignee: Phillips Petroleum Co
Priority date: 1988-12-22
Filing date: 1989-12-07
Publication date: 1990-06-25
Also published as: JPH02222685A; NO894916D0; KR900009990A; CA2000101A1; DK656289A; DK656289D0; EP0374913A1

Description

Oppfinnelsen angår området rekombinant-DNA-bioteknologi. En side ved oppfinnelsen angår nye DNA-fragmenter som inneholder en del av eller hele Pichia pastoris glyceraldehyde-3-fosfat dehydrogenase-genet. En annen side ved oppfinnelsen angår anvendelse av de ovenfor beskrevne DNA-fragmenter. Nok en side ved oppfinnelsen angår nye vektorer og celler transformert med disse ovenfor beskrevne DNA-fragmenter.

Etterhvert som rekombinant-DNA-bioteknologi har utviklet seg i de senere år, er den regulerte produksjon ved celler av en enorm mengde forskjellige nyttige polypeptider blitt mulig. Mange eukaryote polypeptider, f.eks. humanveksthormon, leukocyttinterferoner, humaninsulin og humanproinsulin er blitt fremstilt ved forskjellige rekombinante celler. Den fortsatte anvendelse av teknikker som allerede beherskes ventes i fremtiden å tillate rekombinant produksjon av en rekke andre nyttige polypeptidprodukter.

De grunnleggende teknikker som anvendes innen området rekombinant teknologi er kjent av fagfolk. De elementer som det er ønskelig skal foreligge for utførelse av rekombinant-DNA-bioteknologi, omfatter men er ikke begrenset til: (1) Et gen som koder for et eller flere ønskede polypeptider, operabelt koblet til et regulatorisk område som styrer ekspresjonen i vertscellen, idet operabelt koblet betegner en sammenstilling hvor komponentene er satt sammen slik at de utfører deres vanlige funksjon. (2) en vektor, vanligvis et plasmid inn i hvilken en nukleotidsekvens kan innsettes, en vektor er et hvilket som helst nukleotidsekvensholdig konstruert stykke som kan transformere en vert, (3) en egnet vert inn i hvilken den ønskede nukleotidsekvens kan overføres, hvor verten også har det celleapparat som kan uttrykke den informasjon som er kodet for i den overførte

nukleotidsekvens.

Det er særlig ønskelig å ha 5<1>regulatoriske områder som skaffer høye nivåer av DNA-transkripsjon til RNA og reagerer på eksogen miljømessig stimulans. For tiden er intet 5' regulatorisk område kjent i faget som kan benyttes sammen med den meget produktive fermenteringsgjær Pichia pastoris som transkriberes ved høyt nivå som reaksjon på nærværet av en rekke karbonkilder såsom glukose, glycerol og metanol. Da glukose, glycerol og metanol er forholdsvis billige, lett tilgjengelige karbonkilder, vil det være et betydelig bidrag til teknikkens stand å isolere et regulatorisk område som transkriberes med høy hastighet som reaksjon på nærværet av disse karbonkilder.

Det er således en hensikt med oppfinnelsen å skaffe et 5' regulatorisk område som transkriberes med høy hastighet som reaksjon på en rekke forskjellige karbonkilder såsom glukose, glycerol og metanol.

Det er videre en hensikt med oppfinnelsen å skaffe vektorer som inneholder det nevnte 5<1>regulatoriske område operabelt koblet til heterologe DNA-sekvenser som koder for minst ett polypeptid, og fremgangsmåte til å indusere det nevnte regulatoriske område for å lette ekspresjonen av heterologe DNA-sekvenser som koder for minst ett polypeptid. En annen hensikt med oppfinnelsen er å skaffe en 3'-transkripsjons-avslutningssekvens. Nok en hensikt med oppfinnelsen er å skaffe DNA-sekvensen av det Pichia pastoris glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase strukturelle gen (GAPDH).

Andre sider, hensikter og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå fra beskrivelsen, eksemplene og kravene.

I henhold til oppfinnelsen er der skaffet et nytt DNA-fragment bestående stort sett av det Pichia pastoris GAPDH 5' regulatoriske område.

En ytterligere side ved oppfinnelsen angår nye vektorer omfattende det GAPDH 5' regulatoriske område som kan replikere i celler valgt fra gruppen bestående av prokaryote og eukaryote celler.

Nok en side ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til aktivering av det GAPDH 5' regulatoriske område for å lette ekspresjonen av heterologe DNA-sekvenser i store mengder som koder for minst ett polypeptid, omfattende å bringe en egnet vertscelle som er blitt transformert med det GAPDH 5' regulatoriske område som er operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens i berøring med en forbindelse valgt av gruppen bestående av glukose, glycerol og/eller metanol eller kombinasjoner derav, på en måte som letter vertscellens inntak av den nevnte forbindelse under betingelser som er egnet for dyrking av vertscellen.

Ved nok en side ved oppfinnelsen har man også isolert et nytt DNA-fragment bestående stort sett av Pichia pastoris GAPDH 3'-transkripsj onsavslutningssekvensen.

I henhold til en annen side ved oppfinnelsen er der skaffet et nytt isolert DNA-fragment bestående stort sett av det Pichia pastoris GAPDH strukturelle gen.

Fig. 1 viser et tilnærmet restriksjonskart av Pichia pastoris GAPDH-genet.

Restriksjonskart A viser plasseringen av de GAPDH 5' regulatoriske områder, det GAPDH strukturelle gen (som koder for GAPDH-polypeptidet), og den 3' GAPDH transkripsjonsavslutnings-sekvens. Stjernen på tegningen angir restriksjonsseter for hvilke ikke alle setene nødvendigvis er vist inne i fragmentet. Restriksjonskartene B og C viser to DNA-fragmenter av det GAPDH 5<*>regulatoriske område som kan bevirke transkripsjon av DNA til RNA. Restriksjonsfragment B er også blitt sekvensert, det begynner ved tilnærmet nukleotid -490 og strekker seg til ca. nukleotid -1 som vist i tabell 1. Restriksjonskart D viser et kart av de restriksjonsseter som foreligger i det GAPDH strukturelle gen. Restriksjonskart E viser et restriksjonskart av GAPDH 3'-transkripsjonsavslutningssekvensen.

Fig. 2 viser en plan for konstruksjonen av plasmid pRAHO.

Fig. 3 viser en plan for konstruksjonen av plasmid pSL19. Forkortelsen, GAPDHp, betegner et GAPDH 5' regulatorisk område-fragment. Fig. 4 viser et tilnærmet restriksjonskart av plasmid pSL20A. Forkortelsen, GAPDHp, betegner et GAPDH 5' regulatorisk område-fragment.

I de ledsagende figurer er de restriksjonsseter som anvendes for håndtering av nukleotidsekvensene, men som ødelegges ved ligasjon, antydet ved å sette forkortelsen for det ødelagte sete i parentes.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er der skaffet et nytt isolert DNA-fragment som omfatter et GAPDH-gen som fås fra Pichia pastoris. Et partielt restriksjonskart av Pichia pastoris GAPDH-genet og flankerende DNA er vist på fig. 1. Dette gen er blitt ytterligerekarakterisert vedden partielle nukleotidsekvens som er angitt i tabell 1.

Videre er der ved den foreliggende oppfinnelse skaffet nye DNA-fragmenter som omfatter det GAPDH 5' regulatoriske område som fås fra Pichia pastoris.

Videre i henhold til oppfinnelse er der skaffet et nytt DNA-fragment som omfatter GAPDH 3' transkripsjonsavslutningssekvensen av GAPDH-genet som fås fra Pichia pastoris.

Ved nok en side ved oppfinnelsen er der skaffet det GAPDH strukturelle gen som koder for Pichia pastoris GAPDH-polypeptidet. Det GAPDH strukturelle gen, GAPDH 5' regulatoriske område og GAPDH 3'-transkripsjonsavslutningssekvensen av Pichia pastoris, kan utvinnes fra Pichia pastoris-kulturer såsom NRRL nr. 11430 ved fremgangsmåter som er analoge med dem som er angitt i de følgende eksempler. En generell fremgangsmåte til utvinning av Pichia pastoris GAPDH-genet består av å anvende en GAPDH-probe, såsom et GAPDH-genfragment fra en beslektet gjær, for å screene et bibliotek av Pichia pastoris-DNA i Southern blot. Det 2,2 kb Hindlll-fragment fra plasmid pp6y, beskrevet av Musti et al.

(1983) Gene 25, 133-143, vil være en egnet probe som kan anvendes. Andre prober kan velges eller syntetiseres basert på den sekvens som er angitt i tabell 1. Southern blot kan utføres ved en hvilken som helst egnet fremgangsmåte som er kjent for fagfolk. Pichia pastoris-biblioteker kan fremstilles ved teknikker som er kjent i faget, innbefattet men ikke begrenset til den fremgangsmåte som er beskrevet av Cregg et al. (19 85), Mol. Cell Bio. 5, 3376-3385. Andre metoder til isolering av dette gen fra Pichia pastoris kan også anvendes.

Det GAPDH strukturelle gen, GAPDH 5' regulatoriske område-fragment (fig. 1 (B)) og GAPDH 3'-transkripsjonsavslutningssekvensen, kan også fås ved anvendelse av den nukleotidsekvens som er vist i tabell 1 og syntetisering av sekvensen ved bruk av kjente enzymatiske eller kjemiske metoder. Egnede metoder innbefatter men er ikke begrenset til kjemiske fremgangsmåter basert på fosfotriester-, fosfitt- eller cyanoetylfosforamiditt-kj emi.

Fagfolk vil også innse at det isolerte Pichia pastoris GAPDH strukturelle gen, GAPDH 5' regulatoriske område eller GAPDH 3'-transkripsjonsavslutningssekvensen ifølge oppfinnelsen sammen- lignet med det senere isolerte Pichia pastoris GAPDH strukturelle gen, GAPDH 5' regulatoriske områder, eller GAPDH 3'-transkripsjonsavslutningssekvenser kan inneholde et de minimis antall nukleotid-differanser pga. genetisk avvik eller sekvenseringsfeil som kan inntreffe.

Modifisering av det GAPDH strukturelle gen, GAPDH 5' regulatoriske område og GAPDH 3<1->transkripsjonsavslutningssekvensen kan også utføres f.eks. ved tilsetning av linker-DNA eller ved å utføre M13-mutagenese for å skaffe nye restriksjonsseter, fjærne eksisterende 5'- eller 3<1->restriksjonsseter eller gi fragmentene butte ender.

Når det GAPDH strukturelle gen, GAPDH 5' regulatoriske område eller GAPDH 3'-transkripsjonsavslutningssekvensen er utvunnet kan den opprettholdes eller replikeres i eukaryote eller prokaryote plasmid/vert-systemer såsom pBR322 opprettholdt i E. coli eller hvilke som helst andre egnede systemer som er kjent i faget.

Fagfolk vil innse at en rekke andre DNA-sekvenser også kan innlemmes i vektoren som anvendes såsom bakterielt plasmid-DNA, markørgener, bakteriofag-DNA, autonome replikasjonssekvenser for å nevne bare noen få representative eksempler.

Det GAPDH 5' regulatoriske område inneholdes i det DNA-fragment som strekker seg fra Bglll-setet ved tilnærmet nukleotid -1200 til tilnærmet Aatll-setet nær begynnelsen av det strukturelle gen ved tilnærmet nukleotid 16 (som vist på fig. 1 (A)). 3'-enden av dette fragment kan imidlertid slutte ved nukleotid -1 uten noe tap av virkning. Det GAPDH 5' regulatoriske område kan også utvinnes i et tilnærmet 490 basepar DNA-fragment som begynner ved BamHI-setet ved tilnærmet nukleotid -490 og strekker seg tilnærmet nukleotid -1. For letthets skyld kan et restriksjonssete innsettes ved tilnærmet nukleotid 1, såsom det EcoRI-sete som er angitt med små bokstaver i tabell 1. Eksempel VII viser en fremgangsmåte hvorved et EcoRI-sete innsettes ved tilnærmet nukleotid 1 (angitt med små bokstaver i tabell 1) ved anvendelse av ml3-mutagenese, for således å skaffe et BamHI/EcoRI-fragment som fungerer som et GAPDH 5' regulatorisk område (se fig. 1 (B)). Både BglII/AatII-fragmentet og BamHI/EcoRI-fragmentet kan bevirke transkripsjon av DNA til RNA når de er operabelt koblet til og anordnet ved 5'-enden av en heterolog DNA-sekvens som koder for minst ett polypeptid.

For å anvende det GAPDH 5' regulatoriske område som her er angitt, kan fragmentene som er beskrevet på fig. 1 (B eller C) være operabelt koblet til heterologe DNA-sekvenser som koder for minst ett polypeptid. Slik uttrykket anvendes i den foreliggende beskrivelse betyr heterologe DNA-sekvenser kombinasjoner av DNA-sekvenser som ikke opptrer naturlig i forbindelse med det nevnte regulatoriske område.Egnede heterologe DNA-sekvenser som koder for minst ett polypeptid som kan være operabelt koblet sammen med det GAPDH 5' regulatoriske område innbefatter, men er ikke begrenset til, streptokinase, vevsplasminogen-aktivator, hepatitt-overflateantigener og bovinlysozym. Heterologe DNA-sekvenser som anvendes med den foreliggende oppfinnelse bør inneholde et 5' ATG-startkodon, et 3<1->stoppkodon og kan dessuten innbefatte nukleotidsekvenser som tjener til å stabilisere mRNA eller styre polyadenylering.

Kombinasjonen av det GAPDH 5' regulatoriske område operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens kan være innsatt i en egnet vektor. En rekke gjærvektor/vertscelle-kombinasjoner er mulige og er kjent for fagfolk. Ytterligere sekvenser såsom markør-gener eller andre sekvenser som gjør vektorene i stand til vekstforøkelse og hurtig formering i bakterier eller gjær kan også foreligge.

Egnede vertsceller for bruk av det GAPDH 5' regulatoriske område omfatter gjær såsom Saccharomyces, Pichia og Hansenula, og særlig Pichia pastoris.

Transformasjon av det GAPDH strukturelle gen, GAPDH 5' regulatoriske område eller GAPDH 3<1->transkripsjonsavslutningssekvensen inn i en vertscellelinje ved en kompatibel vektor kan oppnås ved egnede transformasjonsteknikker som er kjent for fagfolk.

Det GAPDH 5' regulatoriske område når det er operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som er blitt transformert inn i en egnet vert vil tillate transkripsjonen av DNA til RNA. Ekspresjon av heterologe DNA-sekvenser er operabelt koblet til et regulatorisk område som er transformert i en egnet vert kan induseres til høyere nivåer av ekspresjon ved bruk av en fremgangsmåte som omfatter å bringe den transformerte vert i berøring med forskjellige karbonkilder, såsom de som velges fra gruppen bestående av glukose, glycerol og/eller metanol, på en måte som letter vertscellens inntak av en av de ovenfor angitte forbindelser under betingelser som er egnet til dyrking av vertscellen. Glukose og glycerol foretrekkes for tiden for induksjon av høyere transkripsjonsnivåer av den heterologe DNA-sekvens som er blitt transformert inn i vertscellen operabelt koblet til det GAPDH 5' regulatoriske område.

Man er også klar over at ikke alle gjærverter kan utnytte alle karbonkilder. Følgelig vil det være fordelaktig å selektere gjærverter som kan utnytte glukose, glycerol eller metanol for oppnåelse av høyere transkripsjonsnivåer. Selv i gjær som ikke kan utnytte disse karbonkilder, kan transkripsjon på lavt nivå observeres.

Fagfolk vil også innse at den optimale mengde glukose, glycerol og/eller metanol som anvendes for oppnåelse av høye tran-skrips j onshastigheter vil variere fra gjær til gjær avhengig av en rekke forskjellige faktorer. For Pichia pastoris antar man for tiden at høyere nivåer av transkripsjon kan oppnås fra celler transformert med det GAPDH 5' regulatoriske område operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for minst ett polypeptid med (a) metanolkonsentrasjoner på mellom 0,2 og 1,5 % vekt pr volum matningsmateriale, fortrinnsvis ca 0,5% vekt pr. volum matningsmateriale; (b) glukosekonsen-trasjoner mellom 1 og 5% vekt pr. volum matningsmateriale, fortrinnsvis ca 2% vekt pr. volum matningsmateriale; og (c) glycerolkonsentrasjoner mellom 1 og 5% vekt pr. volum matningsmateriale, fortrinnsvis ca 2% vekt pr. volum matningsmateriale, idet alle andre næringsstoffer og vekstbetingelser er rikelig sørget for. Andre gjærsorter som kan anvende glukose, glycerol eller metanol antas å ha forskjellige områder over hvilke høyere transkripsjonsnivåer kan fås, hvilket kan bestemmes av fagfolk.

GAPDH 3' transkripsjonsavslutningssekvensen av GAPDH-genet antas å avslutte mRNA-transkripsjonen eller stabilisere mRNA når den er koblet 3' til en DNA-sekvens som koder for et polypeptid. Denne 3<1->avslutningssekvens er blitt ytterligerekarakterisert vedden partielle nukleotidsekvens som er vist i tabell 1 fra ca nukleotid 1005 til ca nukleotid 1380. GAPDH 3'-transkripsjonsavslutningssekvensen inneholdes i det DNA-fragment som strekker seg fra ca Clal-setet ved tilnærmet nukleotid 970 til ca Bglll-setet ved tilnærmet nukleotid 2000 (som vist på fig. 1 (E)). GAPDH 3<1->avslutningssekvensen behøver imidlertid bare å strekke seg ca 300 basepar 3' i forhold til GAPDH-stoppkodonet som er anordnet ved tilnærmet nukleotid 1000 (som vist i tabell 1) for å avslutte mRNA-transkripsjon. Således kan GAPDH 3<1->transkripsjonsavslutningssekvensen bestå av fra tilnærmet 300 til tilnærmet 1000 nukleotider av DNA 3'

i forhold til det GAPDH strukturelle gen. Det er imidlertid funnet nyttig i Pichia pastoris å også innlemme 10-30 nukleotider 5' merket i forhold til stoppkodonet for å fremme messenger-RNA-transkripsjonsavslutning. Det foretrekkes for tiden at GAPDH 3'-transkripsjonsavslutningssekvensen anvendes som et ClaI/BglII-fragment bestående av ca 1000 nukleotider. GAPDH 3'-transkripsjonsavslutningssekvensen kan være operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for et polypeptid og anvendes til å avslutte transkripsjonen av eller stabilisere mRNA i gjær såsom Saccharomyces, Pichia og Hansenula men er spesielt godt egnet til bruk i Pichia pastoris.

Det GAPDH strukturelle gen strekker seg fra ca nukleotid 1 til ca nukleotid 999 (som vist i tabell 1 eller fig. 1 (D)). Det

GAPDH strukturelle gen kan anvendes i rekombinant bioteknologi for en rekke forskjellige formål innbefattet, men ikke be-grensent til, (a) DNA-konstruerte-stykker for utførelse av additiv homolog rekombinasjon (en fremgangsmåte til innsetting av heterologe DNA-sekvenser i Pichia pastoris-genomet ved GAPDH-locuset uten å forstyrre GAPDH-genaktivitet), og (b) produksjonen av Pichia pastoris glyceraldehyd-3-fosfatdehydro-genase-protein for analyser.

De følgende ikke-begrensede eksempler er angitt for å belyse utførelsen av den foreliggende oppfinnelse.

Eksempler

Generell informasjon

Stammer

Pichia pastoris NRRL Y-11430

Pichia pastoris GS115 (his4) NRRL Y-15851

E. coli MC1061 [F"araD139 A(araABDIC-leu) 7679AlacX74 galU

gal K rpsL hsdR]

E. coli JM103 A(lacpro) thi rpsl (strA) SupE endA sbcB hsdR

Medier, buffere oa oppløsninger

Med mindre noe annet er angitt, representerer de ovenfor angitte oppløsninger den grunnleggende (lx) konsentrasjon som anvendes. I eksemplene, hvor forskjellige konsentrasjonsnivåer anvendes, er dette faktum angitt ved henvisning til opp-løsningen som et multippel av den grunnleggende (lx) konsentrasjon.

Re<g>enererin<g>sa<g>ar

1) Agar-KCl : 9 g Bacto-agar, 13,4 g kaliumklorid, 240 ml H2O, autoklavering. 2) 10x glukose : 20 g dekstrose, 100 ml H20, autoklavering . 3) lOx YNB : 6,7 5 g gjærnitrogenbase uten aminosyrer, 100 ml H2O, autoklavering. 4) Tilsett 30 ml 10x glukose og 30 ml 10x YNB til 240 ml av den smeltede agar/KCl-oppløsning. Tilsett 0,6 ml 0,2 mg/ml biotin og en hvilken som helst annen ønsket aminosyre eller nukleinsyre til en konsentrasjon på 20 ug/ml. Hold smeltet regenereringsagar på 55-60°C.

Zvmolase 60 000 Kilde: Miles Laboratories

Sekvenserin<g>

DNA-sekvensering var ved dideoksynukleotid-kjedeavslutnings-metoden i henhold til Sanger et al., PNAS 74, 5463 (1977).

De følgende forkortelser er anvendt:

EDTA etylendiamintetraeddiksyre TEMED N,N,N',N'-tetrametylendiamin DTT ditiotreitol

BSA bovinserumalbumin

EtBr etidiumbromid

Ci Curie

dATP deoksyadenosintrifosfat dGTP deoksyguanosintrifosfat dTTP deoksythymidintrifosfat dCTP deoksycytidintrifosfat dXTP"generisk" deoksytrifosfat-nukleotid

Restriksjons- og DNA-modifiseringsenzymer ble innkjøpt fra Bethesda Research Laboratories, New England Biolabs, eller Bohringer Mannheim.

Eksempel I

Isolering av GAPDH- qen fra Pichia pastoris

20 ug plasmid pp6y [Musti, et al., Gene 25, 133 (1983)] ble digerert med Hindlll. Et 2,2 kb HindIII-fragment ble isolert fra en 0,8% agarosegel og merket ved nicktranslasjon (Maniatis, et al. 1982). Dette fragment inneholdt mesteparten av kodings-sekvensen og 5'-sekvensen av en av de tre S. cerevisiae glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase-gener (GAPDH). 6 ug genomisk DNA fra Pichia pastoris NRRL Y-11430 (fremstilt i henhold til eksempel III) ble digerert med EcoRI eller Hindlll. Dette genomiske DNA ble screenet ved Southern filterhybridisering ved anvendelse av 1 ug kuttet genomisk DNA/bane og det merkede 2,2 kb HindIII-fragment som er angitt ovenfor. Et enkelt bånd av hybridisering ble observert med begge de digererte stykker.

Denne probe ble også brukt til å screene et bibliotek av Pichia pastoris genomisk DNA. Biblioteket er blitt beskrevet tidligere [Mol. and Cell Bio. 5, 3376 (1985)] og er et partielt Sau3A digerert stykke av Pichia genomisk DNA insatt i BamHI-setet i YEpl3 (ATCC 37115). Biblioteket ble screenet ved transformasjon av kompetente MC1061 bakterieceller (Maniatis et al., 1982), plating av disse celler på LB og 5 0 ug/ml ampicillinplater, og utførelse av filterløft som beskrevet hos Grunstein og Hogness, PNAS 72:3961 (1975). Individuelle positive kolonier ble undersøkt ved bruk av BamHI, Sali og PvuII digererte stykker av DNA fremstilt ved standard miniprep-prosedyre (Maniatis et al., 1982). Fra disse minipreparerte digererte stykker, ble tre forskjellige men overlappende kloner identifisert og betegnet pPGAP-6, pPGAP-7, OG pPGAP-9. Det partielle restriksjonskart av et kompositt av disse er vist på fig. 1.

Restriksjonsfragmenter av de genemiske kloner inneholdende det GAPDH strukturelle gen ble identifisert ved hybridisering av Saccharomyces-proben til Southern blot av klonene. På disse blot hybridiserte et tilnærmet 700 bp Sall-fragment sterkt, og det tilstøtende tilnærmet 760 bp BamHI/Sall-fragment hybridi serte også. Disse fragmenter ble isolert fra en 0,8% agarosegel etter digerering av 40 ug pPGAP-6 med Sali og BamHI. Det 700 bp Sall-fragment ble subklonet inn i Sall-digerert og alkalisk-fosfatase-behandlet Ml3 mpl8-DNA, hvilket førte til M13-subklonen som ble betegnet Gl. På samme måte ble 760 bp Sall/BamHI-fragmentet subklonet inn i Sali- og BamHl-kuttet og alkalisk-fosfatase-behandlet M13 mpl8-DNA, hvilket førte til M13-subklonen betegnet G15. Andre DNA-stykker ble brukt til DNA-sekvensering. De karboksylterminal-kodende og 3' ikke-kodende sekvenser ble bestemt ved sekvensering av template-DNA fra andre M13-subkloner. Sekvensene av det Pichia pastoris GAPDH strukturelle gen og omgivende 5<1>og 3' genomisk DNA er vist i tabell 1. For hybridisering til filterbundet DNA, ble renset DNA underkastet elektroforese gjennom 0,7% agarosegeler buffret i IX TBE buffer (Maniatis et al., 1982) og overført til nitrocellulosefiltere ved bruk av standardfremgangsmåter [Southern, J. Mol. Bio. 98, 503 (1975)]. DNA fra bakterie-kolonier ble overført til nitrocellulose etter kloramfenicol-amplifikasjon ved bruk av standardmetoder [Grunstein and Hogness, PNAS 72, 3961 (1975)]. Merking av DNA ved nicktranslasjon ble utført ved bruk av standardmetoder (Maniatis et al., 1982). Kryssart-hybridiseringer til genomiske Southern blot eller til bakteriekolonioverføringer var i 40% formamid, 5X SSPE, 5X Denhardts, 0,1% SDS og 0,1% natriumpyrofosfat og vasket ved 50°C i 3X SSC, ImM EDTA, 0,1% SDS og 0,1% natrium-pyrof osf at.

Eksempel II

Transformasjon av Pichia pastoris

Gjærceller ble inokulert i ca 10 ml YPD-medium og rystedyrket ved 30°C i 12-20 timer. Cellene ble deretter fortynnet til en Agoo På 0,01 - 0,1 og opprettholdt i logaritmisk fase i YPD-medium ved 30°C i 6-8 timer. 100 ml YPD-medium ble inokulert med 0,5 ml av podekulturen ved en Agoo0,1 oa rystedyrket ved 30°C i 12-20 timer. Kulturen ble deretter høstet når Agoo var 0,2 - 0,3 ved sentrifugering ved bruk av en DAMON IEC DPR-

6000 sentrifuge ved 1500 g i 5 minutter.

For å fremstille sfæroplaster, ble cellene vasket en gang i 10 ml sterilt vann (sentrifugering ble utført etter hver vask som beskrevet ovenfor), en gang i 10 ml nylig fremstilt SED, en gang i 10 ml steril IM sorbitol og resuspendert i 5 ml SCE-buffer. 5 ul av 4 mg/ml zymolyase 60 000 (Miles Laboratories) ble tilsatt og cellene ble inkubert ved 30°C i ca 30 minutter.

Sfæroplastdannelse ble overvåket som følger: 100 ul porsjoner av celler ble satt til 900 ul 5% SDS og 900 ul IM sorbitol før eller like etter tilsetting av zymolyase og på forskjellige tidspunkt i løpet av inkubasjonsperioden. Inkubasjonen ble stanset på det punkt hvor cellene lyserte i SDS men ikke i sorbitol. Når de var dannet ble sfæroplaster vasket en gang i 10 ml steril IM sorbitol ved sentrifugering ved 1 000 g i 5-10 minutter, vasket en gang i 10 ml sterilt CaS ved sentrifugering, og resuspendert i 0,6 ml CaS.

For den egentlige transformasjon ble DNA-prøver i vann eller TE-buffer (typisk 1-10 ug i inntil 20 ul samlet volum) satt til 1,5 ml Eppendorf-mikrosentrifugerør. (For små mengder DNA finner maksimal transformasjon sted ved bruk av ca. 1 pl 5 mg/ml lydbehandlet E. coli DNA i hver prøve). 100 ul sfæroplaster ble satt til hver DNA-prøve og inkubert ved værelsestemperatur i ca 20 minutter. 1 ml PEG-oppløsning ble satt til hver prøve og inkubert ved værelsestemperatur i ca 15 minutter, og prøvene ble platet som beskrevet nedenfor. 10 ml regenereringsagar ble helt på hver plate minst 30 minutter før transformasjonsprøvene var ferdige. 10 ml-porsjoner av regenereringsagar ble også fordelt på rør i en 45-50°C sats i løpet av den periode som transformasjonsprøvene var i SOS. Prøver ble deretter satt til rørene, helt på plater inneholdende det fast bunnagarlag og inkubert ved 30°C i 3-5 dager.

Sfæroplastkvalitet ble bestemt som følger. 10 ul prøve ble fjernet og fortynnet 100 X ved tilsetning til 990 ul IM sorbitol. 10 pl av fortynningen ble fjernet, og en ytterligere porsjon på 990 pl IM sorbitol ble tilsatt. 100 pl av begge fortynninger ble spredt på YPD-agarplater for å bestemme konsentrasjonen av ikke-sfæroplast hele celler som var tilbake i fremstillingen. For å bestemme de samlede regenererbare sfæroplaster, ble 100 pl av hver fortynning satt til 10 ml regenereringsagar som var blitt supplert med 40 pg/ml av alle de aminosyrer som var nødvendige for verten. Gode verdier for et transformasjonseksperiment var 1-3 X 10<7>samlede regenererbare sfæroplaster per ml og ca 1 X 10^ hele celler per ml.

Eksempel III

Giær- DNA- fremstilling

Gjærceller ble dyrket i 100 ml YNB-medium pluss 2% dekstrose ved 30°C inntil A50Qvar 1-2 og deretter pelletert ved bruk av en Damon IEC DPR-6000 sentrifuge ved 2000 g i 5 minutter. Pelleten ble vasket en gang i dH^O, en gang i SED, en gang i IM sorbitol og deretter resuspendert i 5 ml av en oppløsning av 0,1M Tris-HCl, pH 7,0, IM sorbitol og 10 mM EDTA. Cellene ble deretter blandet med 50-100 pl av en 4 mg/ml oppløsning av zymolase (60 000 Miles Laboratories) og inkubert ved 30°C i 1 time. De resulterende sfæroplaster ble deretter sentrifugert ved 1 000 g i 5-10 minutter og suspendert i 5 ml lysebuffer [0,1% SDS, lOmM Tris-HCl (pH 7,4), 5mM EDTA og 50mM NaCl]. Proteinase K (Boehringer Mannheim) og RNase A (Sigma) ble hver satt til 100 pg/ml og oppløsningen inkubert ved 37°C i 30 minutter. DNA ble deproteinisert ved forsiktig blanding av preparatet med et like stort volum kloroform inneholdende isoamylalkohol (24:1, v/v), og fasene ble separert ved sentrifugering ved 12 000 g i 20 minutter. Den øvre (vandige) fase ble suget av inne i et nytt rør og ekstrahtert med et like stort volum av en 50/48/2 blanding av fenol/kloroform/isoamylalkohol. Fasene ble separert som tidligere og den øvre fase anbragt i et rør inneholdende 2-3 volumer kald 100% etanol. Prøven ble forsiktig blandet og DNA ble samlet opp ved oppvikling på en plaststav. DNA ble øyeblikkelig oppløst i 1 ml TE-buffer og dialysert over natten ved 4°C mot 100 volumer TE-buffer.

Eksempel IV

Konstruksjon av pRAHO

10 ug pBR322 ble digerert med EcoRV og PvuII i henhold til fabrikantens instruksjoner. Plasmidet ble ligert ved bruk av 0,5 enheter T4 DNA-ligase i 66mM Tris-HCl, pH 7,4, 6,6mM MgCl2, lOmM DTT og 0,4 mM ATP i 24 timer ved 4°C. Dette ble betegnet PBR3 22A1. 20 ug pGAP-7 (fra eksempel I) ble digerert med Aatll og EcoRI. Et 2,85 kb fragment inneholdende den 5' ikke-kodende sekvens og aminoterminal-kodende sekvens av Pichia pastoris GAPDH-genet, ble isolert fra 0,8% agarosegel. 10 ug pBR322Al ble digerert med Aatll og EcoRI og defosforylert ved bruk av alkalisk fosfatase i 100 ul reaksjonsvolum i henhold til fabrikantens instruksjoner. 3,3 ug av AatII/EcoRI-fragmentet og 100 ng av plasmidet ble ligert som angitt ovenfor. Det resulterende plasmid ble betegnet pPGAPlOl. 10 ug av pPGAPlOl ble digerert med Aatll og defosforylert som angitt ovenfor. Et nytt Bglll-sete ble dannet i pPGAPlOl som følger. Et adapter-oligonukleotid ble syntetisert ved bruk av et DNA-syntese-apparat, modell 38OA, fra Applied Biosystems ved bruk av cyanoetylfosforamiditt-kjemi:

500 ng av oligonukleotidet ble sammenføyet ved oppvarming til 80°C, tillatt å avkjøle langsomt og deretter kinasert (se Maniatis et al.; 1982) 30 ng av den sammenføyde adapter og 10 ng av det Aatll-digererte pPGAPlOl ble ligert ved bruk av T4-ligase som beskrevet ovenfor. Det resulterende plasmid ble betegnet pPGAP345. 20 ug av pPGAP345 ble digerert ved Bglll. Et 1,2 kg BglII-fragment fra pPGAP345 ble deretter isolert fra en 0,8% agarosegel. 10 ug av pBPfl (NRRL nr B-15892) ble digerert med BamHI og defosforylert som angitt ovenfor. 100 ng av 1,2 kb

Bglll-fragmentet og 50 ng av det BamHI-digererte og fosfatase-behandlede pBPfl ble ligert som angitt ovenfor. Det resulterende plasmid ble betegnet pRAHO, og inneholdt de ovenfor beskrevne partier av Pichia pastoris GAPDH-genet føyet inn i ramme med E. coli p-galaktosidase-genet fra pBPfl. Konstruksjonen av pRAHO er angitt i detalj på fig. 2.

Eksempel V

Fremstilling av stamme GS115 ( pRAHO)

Pichia pastoris GS115, en histidin-auksotrof, (NRRL Y-15851; his4) ble transformert med plasmid pRAHO (fra eksempel IV) som beskrevet i eksempel II. Før transformasjonen ble pRAHO digerert med BamHI for å lette integrering av plasmidet i vertsgenomet. Genomisk DNA fra individuelle, stabile His<+>- transformanter ble analysert ved Southern-filterhybridisering for å bestemme den genomiske plassering av plasmidet. 1,5 ug genomisk DNA ble fremstilt i henhold til eksempel III. Dette DNA ble digerert med Bglll, underkastet elektroforese ved bruk av 0,7% agarosegeler og overført til nitrocellulosefiltere [Southern, J. Mol. Bio. 98, 503 (1975)]. En probe komplementær med P. pastoris HIS4-lokuset (pYM4) og en probe komplementær med P. pastoris GAPDH-lokuset (pRA10 6) ble merket ved nicktranslasjon og brukt til å bestemme setet for integrasjon av pRAl10-plasmidet. [pRA10 6-plasmidet ble dannet ved ligering av 100 ng Sall-digerert og alkalisk-fosfatase-behandlet pUCl9-DNA med 200 ng av det 700 bp Sall-fragment som ble isolert fra 20 ug Sall-kuttet pPGAP-6 DNA etter elektroforese gjennom 0,8% agarose]. [Plasmid pYM4 kan fås ved digerering av pYM30 (NRRL nr B-15890) med Clal og religering av endene]. En transformant inneholdene pRAHO integrert ved GAPDH-lokuset ble betegnet GS115 (<p>RAHO) .

Eksempel VI

Produkt av p- galaktosidase- fusionsprotein ved anvendelse av

P. pastoris GAPDH- promotor pluss 5' kodingssekvens

Regulering og ekspresjon av GAPDH-promotoren er blittkarakterisert vedbestemmelse av (3-galaktosidase-aktiviteten i stammen GS115 (pRAHO) . 25 0 ml kulturer ble dyrket i YNB-medium og enten 2% glukose eller 0,5% metanol ved 30°C. Kulturen ble fortynnet ved regelmessige mellomrom for å holde celler i logaritmisk vekst. Prøver på 25 OD-enheter celler (ca 1,5 X 90^ celler) ble fjernet ved forskjellig tidspunkt i løpet av logaritmisk vekst og kulturen ble frosset ved -20°C.

p-galaktosidase-aktivitet ble bestemt som følger.

( 3- galaktosidase- analvse

1) Oppløsning som er nødvendig:

fyll opp til 1 1; pH bør være 7

O- nitrofenvl- tf- D- aalaktosid ( ONPG):

Oppløs 400 mg ONPG (Sigma N-1127) i 100 ml destillert vann for å gi en 4 mg/ml ONPG-oppløsning.

2) Fremstilling av cellefritt proteinekstrakt

Hver prøve ble vasket en gang i d^O, en gang i lysebuffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 8,7, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF), og resuspendert i 400 ul lysebuffer. 0,5 g av 0,45 mm glassperler ble satt til en.400 ul porsjon prøve, og blandingen svirret fire ganger, i 60 sekunder hver gang, med ett minutts inter-valler på is. Celleopslemmingen ble fjernet fra glassperlene, og suspensjonen ble sentrifugert i 5 minutter i en mikrosentri-fuge. Supernantanten ble overført til et mikrosentrifugerør av polypropylen for analyse. Mengden av samlet protein i hvert ekstrakt ble bestemt ved Lowrys analysemetode. BSA tjente som proteinstandarden.

3) Analysemetode

1 pl cellefritt proteinekstrakt ble satt til 1 ml Z-buffer. Blandingen ble deretter svirret og inkubert i 5 minutter ved 30°C. Reaksjonen ble startet ved tilsetningen av 0,2 ml ONPG (4mg/ml). 0,5 ml av en IM Na2C03~oppløsning ble tilsatt for å stanse reaksjonen på et passende tidspunkt, (A42q<1) vanligvis mellom 2 og 5 minutter. Absorbansen ved 420 nm ble deretter avlest.

4) Beregning av p-galaktosidase-aktivitetsenheter

1 U = 1 nmol ortonitrofenol (ONP) dannet pr. minutt ved. 30°C og pH 7. 1 nmol ONP har en absorbans ved 420 nm (A420) på 0,0045 med en banelengde på 1 cm. Følgelig representerer en absorbans på 1 ved 420 nm 222 nmol ONP pr. ml, eller 37 8 nmol ONP pr. 1,7 ml (det samlede volum av supernantant som ble analysert var 1,7 ml). Enheter angitt i tabell 2 ble beregnet som følger:

Glvceraldehvd- 3- fosfatdehvdroaenase- analvse

Glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase-aktivitet ble analysert i 1,0 ml reaksjoner inneholdene 0,1 M kaliumfosfat (pH 7,4), 1,0 mM NAD<+>, 10 mM EDTA, 0,1 mM ditiotreitol, og 4,0 mM glyceral-dehyd-3-fosfat. NADH-dannelse ble overvåket spektrofotometrisk ved 340 nm. Glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase-aktivitetsenheter er uttrykt som umol NADH dannet pr mg protein pr min ved 25°C [McAllister og Holland, JBC 260, 15017 (1985)].

Eksempel VII

Konstruksjon avPRA104

Et nytt EcoRI-sete som overlapper det initierende metionin i Pichia GAPDH-genet ble dannet som følger. Et oligonukleotid med den følgende sekvens ble syntetisert ved bruk av et DNA-synteseapparat, modell 380A fra Applied Biosystems, ved bruk av cyanoetylfosforamiditt-kj emi:

M13-klonen, G15 (se eksempel I), tjente som templaten for mutagenesen. Denne klon inneholdt Pichia pastoris GAPDH-genet BamHI-til-Sall-fragmentet anordnet ved -494 til +271. Sammen-føyning, mutagen oligonukleotidforlengelse og alkalisk sakkarosegradient-sentrifugering ble utført i henhold til Zoller og Smith, Meth. Enzymol. 100, 468 (1983). Screening av positiver ble utført ved oppløsningshybridisering og elektroforese gjennom agarosegeler som beskrevet av Hobden et al., Analytical Biochem. 144, 75 (1985). DNA-klonen som bar det nye EcoRI-sete ble kalt mpl8G15<*>. Den riktige plassering og sekvens av setet i DNA ble bekreftet ved DNA-sekvensering i henhold til metoden angitt av Sanger et al. PNAS 74, 5463 (1977). DNA inneholdende dette nye restriksjonssete ble ført inn i pBR322-baserte plasmider ved kutting av replikativform DNA fra mpl8G15<*>og fra plasmid pRA103 (se nedenfor) med BamHI og Sali, og kombinering av det store BamHI/Sall-stykke av pRA10 3 med det lille BamHI/Sall-stykke fra mpl8G15<*>. I pRA103 ble det tilnærmet 3,6 kb genomiske HindIII-til-SalI-fragment som strakte seg fra -3,25 kb til +0,27 kb fra den Pichia genomiske klon, pPGAP-7, subklonet inn i HindIII-til-SalI-setene av pBR322. Den analoge klon som bærer det mutageniserte BamHI/- Sall-fragment ble betegnet pRA104.

Eksempel VIII

Konstruksjon avPSL17

1 ug pBR322 ble digerert med Sali, fylt inn med Klenow-polymerase og ligert. Det resulterende plasmid ble betegnet pSL14. 14 ug av plasmid pTHBSl ble digerert med Pstl og EcoRI og et ca 1,1 kb fragment inneholdende tilnærmet 800 bp av pBR3 22-DNA og et ca 300 bp avslutningsfragment fra Pichia pastoris AOXl-genet ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. Dette samme 300 bp avslutningsfragment kan isoleres som et StuI/HindIII-fragment fra plasmid pBSAGI5I, som er deponert som NRRL nr. B-180 21 og EcoRI-linkere kan føyes til Stul-setet. 9 ug av pSL14 ble digerert med Pstl og EcoRI og defosforylert ved anvendelse av alkalisk fosfatase fra kalvetarm beskrevet ovenfor. 80 ng av 1,1 kb Pstl/EcoRI-fragment ble ligert til 12,5 ng av det Pstl/EcoRI-digererte pSL14 og det resulterende plasmid ble betegnet pSL15. 18 ug av pRA104 (fra eksempel VII) ble digerert ved EcoRI og

BamHI og et 515 bp fragment inneholdende Pichia pastoris GAPDH-promotoren ble isolert fra en 5% polyakrylamidgel. 10 ug pSL15 ble digerert ved BamHI og EcoRI og defosforylert ved anvendelse av kalvetarm alkalisk fosfatase som beskrevet ovenfor. 50 ng av EcoRI/BamHI-fragmentet ble ligert til 15 ng av det EcoRI/BamHI-digererte pSL15. Det resulterende plasmid ble betegnet pSL16. 10 pg av pSL16 ble digerert med BamHI og defosforylert med alkalisk fosfatase som angitt ovenfor.

Pichia pastoris HIS4-genet ble føyet til pSL16 for bruk som en selekterbar markør. Det tilnærmet 2,7 kb BglII-fragment ble isolert fra plasmidet pYMI12A ved kutting av 10 ug pYMI12A med Bglll og isolering av det 2,7 kb BglII-fragment fra en 0,8% agarosegel. Dette samme BglII-fragment kan isoleres fra plasmid pYJ8 som er deponert som NRRL nr. B-15889. Det BglII-fragment som inneholder HIS4-genet i plasmid pYMI12A har imidlertid hatt et BamHI-sete som eksisterer inne i genet fjernet ved digerering av pYJ8 med BamHI og gjenfylling av de utstikkende ender ved bruk av Klenow-polymerase fulgt av butt-ende-ligering. Fjerning av BamHI-setet fra BglII-fragmentet inneholdende HIS4-genet virker ikke inn på HIS4-genaktiviteten av fragmentet. 75 ng av BglII-fragmentet og 25 ng av BamHI-digerert, defosforylert pSL16 ble ligert ved bruk av T4-ligase som beskrevet ovenfor. Det resulterende plasmid ble betegnetPSL17 og er vist på fig. 3B.

Eksempel IX

Konstruksjon avPSL19

10 ug pYJ30 (NRRL B-15890) ble digerert med EcoRI og fylt inn med Klenow-polymerase. 20 ng av dette DNA ble deretter ligert med T4-ligase som beskrevet tidligere. Dette ble betegnetPSL18. 20 ug pSL18 ble digerert med Pstl og Hindlll. Et ca 900 bp-fragment ble isolert fra en 0,8% agarosegel. 10 ug pSL17 ble digerert med Pstl og Hindlll og defosforylert ved bruk av kalvetarm alkalisk fosfatase. 40 ng av fragmentet og 10 ng av det Pstl/Hindlll-digererte og alkalisk-fosfatase-behandlede plasmid ble ligert ved bruk av T4-ligasen som beskrevet ovenfor. Det resulterende plasmid ble betegnet pSL19. Konstruksjonen av pSL19 er vist på fig. 3B.

Eksempel X

Konstruksjon avPSL20A

pSL19-plasmidet fra eksempel IX ble brukt til å konstruere et ekspresjonsplasmid for bovinlysozym c2 med den sekvens av det EcoRI-koblede DNA som koder for bovinlysozym c2 som er angitt i tabell 3. EcoRI-fragmentet som koder for dette protein ble renset fra plasmidet pSL13, en subklon av dette fragment i pUC19-vektoren. 10 ng av pSL19-DNA ble digerert med EcoRI og behandlet ved alkalisk fosfatase. 40 ng av det 0,46 kb EcoRI-fragment som inneholdt bovinlysozym-genet ble ligert med pSL19-DNA. Det resulterende plasmid ble betegnet pSL20A (fig. 4).

DNA fra dette plasmid ble kuttet med Sali og brukt til å transformere P. pastoris GS115 i henhold til eksempel II. Disse celler ble dyrket i gjæringsapparatet i minimalt glukosemedium, og virkningen av fortynningshastighet på den spesifikke produktivitet av bovinlysozym ble målt. Ved fortynnings-hastigheter på 0,1 og 0,2 h<_1>, var de spesifikke produkti-viteter ca 1 ug pr. g celler pr h, men når fortynnings-hastigheten for den samme stamme ble øket over den maksimale spesifikke veksthastighet til 0,3 h<-1>, øket den spesifikke produktivitet tidobbelt til ca 10 pg pr. g celler pr h.

Claims

1. Isolert DNA-fragment omfattende det Pichia pastoris GAPDH 5' regulatoriske område.

2. DNA-fragment som angitt i krav 1, karakterisert ved at det nevnte DNA-fragment har det restriksjonskart som er vist på fig. 1 (B).

3. DNA-fragment som angitt i krav 2, karakterisert ved at det nevnte DNA-fragment har den nukleotidsekvens fra tilnærmet nukleotid -490 til tilnærmet nukleotid -1 som er vist i tabell 1.

4. DNA-fragment som angitt i krav 1, karakterisert ved at det nevnte DNA-fragment har det restriksjonskart som er vist på fig. 1(C).

5. DNA-fragment som angitt i krav 2 eller 4, karakterisert ved det nevnte DNA-fragment er operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for et polypeptid, særlig hvor det nevnte DNA-fragment er operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens valgt fra streptokinase, vevsplasminogen-aktivator, hepatitt-overflateantigen og bovinlysozym.

6. DNA-fragment som angitt i krav 5, karakterisert ved at det nevnte DNA-fragment er koblet til en DNA-sekvens som kan replikere i celler valgt fra prokaryote og eukaryote celler.

7. Fremgangsmåte til aktivering av det GAPDH 5' regulatoriske område for å lette høynivå-ekspresjonen av en heterolog DNA-sekvens, som koder for minst ett polypeptid, omfattende å bringe egnet vertscelle som er blitt transformert med det GAPDH 5' regulatoriske område, som er operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens, i berøring med en forbindelse valgt fra glukose, glycerol og metanol eller kombinasjoner derav på en måte som letter vertscellens inntak av den nevnte forbindelse under betingelser som er egnet for dyrking av vertscellen.

8. Isolert DNA-fragment omfattende Pichia pastoris GAPDH 3' transkripsjonsavslutningssekvensen, særlig hvor det nevnte DNA-fragment har det restriksjonskart som er vist på fig. 1(E), spesielt hvor det nevnte DNA-fragment har den nukleotidsekvens fra tilnærmet nukleotid 1005 til tilnærmet nukleotid 1380 som er vist i tabell 1, og særlig hvor det nevnte DNA-fragment er operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for minst ett polypeptid.

9. Isolert DNA-fragment omfattende det Pichia pastoris GAPDH strukturelle gen, spesielt hvor det nevnte DNA-fragment har det restriksjonskart som er vist på fig 1(D).

10. Isolert DNA-fragment omfattende Pichia pastoris GAPDH-genet .