NO891717L - Ekspresjon av hiv 24 kda gag-protein i metylotrofe gjaersorter. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår området rekombinant-DNA-bioteknologi. En side ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte tii ekspresjon av HIV 24 kDa qag-protein i metylotrofe gjærsorter. En annen side ved oppfinnelsen angår nye DNA-molekyler og nye gjærstammer transformert med disse.

Retrovirus HIV (tidligere betegnet HTLV-III eller LAV) er blitt vist å være den forårsakende faktor for tilegnet immun-defektsyndrom (acquired immune deficiency syndrome, AIDS). Virusgenomet av HIV inneholder tre store åpne leserammer svarende til gag-, pol- og env-genene. gag-genet koder for virusets kjerneproteiner, pol koder for virusets reverstran-skriptase, protease og endonuklease og env koder for virusets glykoproteiner.

gag-genet koder for en forløper som bearbeides til kjerneproteiner under virionmodning.<g>ag-forløperen er tilnærmet 56 kDa og blir proteolytisk bearbeidet til tre proteiner på

tilnærmet 24, 16 og 14 kDa. 24 kDa-formen av qag-ki ernepro-teinet av HIV-retroviruset er funnet å indusere antistoff-dannelse i en stor prosentandel av individer som tidligere er blitt eksponert for viruset.

Analyser er blitt utviklet basert på denne observasjon som måler nærværet eller fraværet av antistoffer for HIV 24 kDa gaq-proteinet og utgjør én fremgangsmåte til bedømmelse av hvorvidt et individ er blitt utsatt for HIV og kan være en kandidat for utvikling av AIDS. For å utføre denne analyse er det nødvendig med renset HIV 24 kDa qag-protein som en diagnostisk reagens. Intet lett tilgjengelig forråd av HIV 24 kDa gag eksisterer for tiden for å møte behovet for protein-reagens.

Likeledes kunne dette protein potensielt også benyttes som en vaksine alene eller i kombinasjon med andre HIV-virus-proteiner dersom proteinene kunne produseres på en sikker økonomisk måte.

Det vil således være et betydelig bidrag til faget å utvikle en effektiv prosess for produksjonen av HIV 24 kDa<q>a<g->protein.

Det er derfor en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en fremgangsmåte til fremstilling av HIV 24 kDa<g>a<g->protein.

Nok en hensikt med oppfinnelsen er å skaffe nye vektorer inneholdende DNA-sekvenser som koder for HIV 24 kDa gaq-protein.

En annen hensikt med oppfinnelsen er å skaffe nye metylotrofe gjærsorter transformert med en vektor eller vektorer som kan fremme produksjonen av HIV 24 kDa gag-proteinet.

Disse og andre hensikter med oppfinnelsen vil fremgå av be-skrivelsen og de tilhørende krav.

I henhold til oppfinnelsen er det funnet en fremgangsmåte

til fremstilling av HIV 24 kDa gag-proteinet som omfatter å transformere en metylotrof gjær med minst én vektor som er forenlig med gjærekspresjonskassetten inneholdende et strukturelt gen for HIV 24 kDa<g>a<g->proteinet og dyrking av de resulterende transformanter under betingelser som er egnet for oppnåelse av produksjon av HIV 24 kDa<g>a<g->protein.

Fig. 1 viser et restriksjonskart av EcoRI/Clal-fragmentet av HIV som inneholder 24 kDa gag-genet av HIV. Fig. 2 er et flytdiagram for konstruksjonen av plasmid pSL44A. Fig. 3 er en representasjon av plasmid pSL44A. pSL44A er et derivat av pAO804 som er blitt modifisert ved innsettingen av et Fl-ori og innsettingen av det HIV 24 kDa strukturelle gen i det unike EcoRI-sete.

pAO804 er tilgjengelig i NRRL B-18114 og kan utvinnes fra plasmid-DNA som et 7,5 kb EcoRI-fragment.

HIV-genomet er velkjent i faget og er blitt sekvensert av Råtner et al. i Comolete nucleotide seguence of the AIDS virus, HTLV- III. Nature 313:277 (1985). HIV 24 kDa<g>_ag_-protein-nukleotidsekvensen begynner ved nukleotid 7 29 og slutter ved nukleotidsetet 1421. Den nukleotidsekvens som benyttes til å kode for 24 kDa gag-proteinet, er vist i tabell I (imidlertid er ikke nukleotider mellom ca. 1010 og 1115 blitt sekvensert for å bekrefte deres samsvar med den publiserte sekvens).

Den 24 kDa gag-proteinnukleotidsekvens kan derfor fås ved reisolering av det strukturelle gen fra HIV ved in vitro DNA-syntese eller en kombinasjon av disse teknikker.

Det strukturelle gen for HIV 24 kDa gag-proteinet kan opprettholdes i et hvilket som helst egnet vertsvektorsystem for formering, opprettholdelse eller rekombinant manipulasjon. Egnede vert/vektor-systemer for utførelse av den foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til en E. coli-vert i kombinasjon med et pBR322-plasmid eller en Pichia pastoris GS115-vert i kombinasjon med pAO804 eller pAO807.

Dyrking av de vertsstammer som er angitt ovenfor kan utføres ved hvilke som helst egnede metoder. Generelle teknikker for dyrking av verter er allerede kjent i faget og en hvilken som helst tilpasning av disse metoder til de spesielle krav av stammene som her benyttes, ligger godt innenfor fagfolks evner.

Utvinning av plasmid DNA fra verter kan utføres ved forskjellige teknikker på grunn av dets kompakte størrelse og lukkede sfæriske superspiralform. For eksempel kan vertsceller etter høstingen pelleteres ved sentrifugering og deretter resuspenderes og lyseres. Lysatet bør sentrifugeres for å fjerne celleavfall og supernatanten inneholdende DNA bevares. En PEG-utfelling kan deretter utføres for å konsentrere DNA. Det utfelte DNA kan deretter ytterligere behandles ved bruk av en densitetgradientsentrifugering eller en gelfiltrer-ingsteknikk for å separere det plasmide DNA fra det bakterielle DNA. De teknikker for oppnåelse av separasjonen som er antydet ovenfor, er velkjente i faget, og en rekke forskjellige metoder for utførelse av disse teknikker er kjent.

Nukleasedigerering av plasmidene kan utføres ved valg av riktige endonukleaser som vil kutte det valgte plasmid på en slik måte at det letter utvinningen av det HIV gag strukturelle gen. De endonukleaser som benyttes, vil avhenge av det plasmid som HIV 24 kDa gag-genet skal kuttes fra.

Gelelektroforese av DNA kan utføres ved bruk av en rekke forskjellige teknikker. Se P. G. Sealy og E. M. Southern, Gel Electrophoresis of Nucleic Acids - A Practical Approach

(D. Rickwood og B. D. Hames, eds.) p. 39 (1982). Eluering kan også utføres ved bruk av en rekke forskjellige teknikker som passer for den gel som er involvert, såsom elektroeluering, diffusjon, geloppløsning (agarosegeler) eller fysisk ekstru-dering (agarosegeler). Man innser dessuten at eluering ikke behøver å være nødvendig med visse geler såsom høykvalitets-agarose som smelter ved lav temperatur.

Etter at det fragment som inneholder det HIV 24 kDa gag strukturelle gen eller fragmenter derav er isolert, kan ytterligere manipuleringer være nødvendige før det innsettes i vektoren. Disse manipuleringer kan innbefatte, men er ikke begrenset

til at linkere tilføyes eller at fragmentet gis butte ender.

Etter isoleringen av det HIV<g>a<g>strukturelle gen blir genet innsatt i en egnet metylotrof gjærvektor såsom et plasmid. Foretrukne vektorer for utførelse av oppfinnelsen er de som

er forenlige med Pichia-slekten og helst Pichia pastoris.

Plasmider har lenge vært et av de grunnleggende elementer som anvendes i rekombinant DNA-teknologi. Plasmider er sirkulært ekstrakromosomalt, dobbelttrådet DNA som finnes i mikroorga-nismer. Plasmider er funnet å opptre i enkelte eller flere kopier pr. celle. Innbefattet i plasmid-DNA er den informasjon som er nødvendig for plasmid reproduksjon, dvs. et opprin- nelsessted for replikasjon er inkludert for bakteriell replikasjon. En eller flere måter til fenotypisk selektering av plasmidet i transformerte celler kan også være inkludert i .den informasjon som er kodet i plasmidet. Fenotypiske eller seleksjonsmarkører såsom antibiotiske resistensgener eller gener som komplementerer defekter i vertens biokjemiske veier, tillater kloner av vertscellene som er blitt transformert å gjenkjennes, selekteres og opprettholdes.

For å uttrykke det HIV 24 kDa gag strukturelle gen i metylotrof gjær må genet være operabelt forbundet med et 5'-regulatorisk område og 3'-endesekvens som danner den ekspresjonskassett som skal innsettes i verten via en vektor.

De følgende uttrykk er her definert for klarhets skyld.

Operabelt forbundet - betegner en sammenstilling hvor kompo-nentene er satt sammen slik at de utfører sin funksjon.

Regulatorisk område - DNA-sekvenser som reagerer på forskjellige stimulanser og virker inn på hastigheten av mRNA-tran-skripsjon.

3<1->endesekvens - sekvensene 3' til stoppkodonet som har som funksjon å stabilisere mRNA såsom sekvenser som frembringer polyadenylering.

"Pichia-forenlig" - betegner DNA-sekvenser som vil utføre deres normale funksjon i Pichia såsom regulatoriske områder og 3'-endesekvenser avledet fra Pichia.

For utførelse av den foreliggende oppfinnelse foretrekkes integrative vektorer såsom den lineære setespesifikke integrative vektor i henhold til Cregg, som beskrevet i europeisk patentsøknad nr. 86114700.7. Slike vektorer omfatter en i serie arrangert sekvens av minst 1) et første innsettbart DNA-fragment, 2) et selekterbart markørgen og 3) et annet innsettbart DNA-fragment.

De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver minst ca. 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er . homologe med partier av det genomiske DNA av arter av slekten Pichia. De forskjellige komponenter av den integrative vektor er arrangert i serie for dannelse av et lineært fragment av DNA slik at ekspresjonskassetten og det selekterbare markør-gen er anordnet mellom 3'-enden av det første innsettbare DNA-fragment og 5'-enden av det annet innsettbare DNA-fragment.

De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert med hensyn til hinannen i det i rekkefølge arrangerte lineære fragment på samme måte som de er orientert i opprinnelsesgenomet (parent genome).

Nukleotidsekvenser som er nyttige som de første og andre innsettbare DNA-fragmenter er nukleotidsekvenser som er homologe med separate partier av det native genomiske sete hvor genomisk modifikasjon skal finne sted. For eksempel, dersom genomisk modifikasjon skal finne sted ved lokuset av alkoholoksidasegenet, vil de første og andre innsettbare DNA-fragmenter som anvendes, være sekvenser som er homologe med separate partier av alkoholoksidasegen-lokuset. For at genomisk modifikasjon i henhold til den foreliggende oppfinnelse skal finne sted,

må de to innsettbare DNA-fragmenter være orientert med hensyn til hinannen i det lineære fragment med samme relative orien-tering som de eksisterer i opprinnelsesgenomet. Eksempler på nukleotidsekvenser som kan anvendes som første og andre innsettbare DNA-fragmenter, er nukleotidsekvenser valgt fra gruppen bestående av alkoholoksidasegenet (A0X1), dihydroksy-acetonsyntasegenet (DHAS1), p40-genet og HIS4-genet. AOX1-genet, DHASl-genet, p40-genet og HIS4-genet er angitt i søknad nr. EP-A-0 183 071.

Det første innsettbare DNA-fragment kan inneholde et operabelt regulatorisk område som kan omfatte det regulatoriske område som anvendes i ekspresjonskassetten. Bruken av det første innsettbare DNA-fragment som det regulatoriske område for en ekspresjonskassett, er en foretrukket utførelsesform av opp finnelsen. Fig. 3 viser et diagram av en vektor som anvender det første innsettbare DNA-fragment som et regulatorisk område for en kassett.

Valgfritt, som vist på fig. 3, kan et innskuddssete eller -seter og en 3'-endesekvens anordnes i umiddelbar nærhet av 3' i forhold til det første innsettbare DNA-fragment. Denne konformasjon av den lineære setespesifikke integrative vektor has den ytterligere fordel at det skaffer et ferdig sete for innsetting av et strukturelt gen uten at det nødvendiggjør tilføyelsen av en forenlig 3'-endesekvens.

Det er også nødvendig å innlemme minst ett selekterbart markør-gen i det DNA som anvendes til å transformere vertsstammen. Dette letter seleksjonen og isolasjonen av de organismer som har innlemmet det transformerende DNA. Markørgenet meddeler den transformerte organisme et fenotypisk trekk som verten ikke hadde, f.eks. gjenopprettelse av evnen til å produsere en spesiell aminosyre hvor den utransformerte vertsstamme har en defekt i den spesielle aminosyre-biosyntetiske vei eller resistens overfor antibiotika og lignende.

Eksempler på selekterbare markørgener kan velges fra gruppen bestående av HIS4-genet og ARG4-genet fra Pichia pastoris og Saccharomyces cerevisiae, invertasegenet (SUC2) fra Saccharomyces cerevisiae, eller G418-fosfotransferasegenet

fra de E. coli-transposable elementer Tn601 eller Tn903.

Fagfolk vil innse at ytterligere DNA-sekvenser også kan inn-lemmes i de vektorer som anvendes i utførelsen av den følgende oppfinnelse, som f.eks. bakterielt plasmid-DNA, bakteriofag-DNA og lignende. Slike sekvenser letter amplifikasjonen og opprettholdelsen av disse vektorer i bakterieverter.

Dersom det første innsettbare DNA-fragment ikke inneholder et regulatorisk område, må et egnet regulatorisk område innsettes operabelt forbundet med det strukturelle gen for å skaffe en operabel ekspresjonskassett. På lignende måte, dersom ingen 3'-endesekvens er skaffet ved innsettingssetet for å fullfore ekspresjonskassetten, må en 3'-endesekvens forbindes operabelt med det strukturelle gen som skal innsettes.

Fagfolk er klar over en rekke forskjellige regulatoriske områder som er blittkarakterisertog som kan anvendes i forbindelse med metylotrofe gjærsorter. Eksempler på regulatoriske områder omfatter, men er ikke begrenset til gjær-regulatoriske områder valgt fra gruppen bestående av sur fosfatase, galaktokinase, alkoholdehydrogenase, cytokrom c, alfaparingsfaktor og glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase regulatoriske områder isolert fra Saccharomyces cerevisiae,

det primære alkoholoksidase (A0X1), dihydroksyacetonsyntase (DHAS1), de p40-regulatoriske områder og det HIS4-regulatoriske område som fås fra Pichia pastoris og lignende. For tiden foretrukne regulatoriske områder som anvendes til utførelse av oppfinnelsen, er de som er kjennetegnet ved deres evne til å reagere på metanolholdige medier såsom regulatoriske områder valgt fra gruppen bestående av A0X1, DHAS1, p40 som er angitt i søknad nr. EP-A-0 183 071.

Det mest foretrukkede regulatoriske område for utførelse av oppfinnelsen er det AOX1 regulatoriske område.

3<1->endesekvenser kan anvendes i ekspresjonskassetten eller være en del av vektoren som beskrevet ovenfor. 3'-endesekvenser kan tjene til å avslutte, polyadenylere og/eller stabilisere det messenger-RNA som kodes for ved det strukturelle gen når det er operabelt forbundet til et gen. Noen eksempler på illu-strative kilder for 3'-endesekvensene for utførelse av oppfinnelsen omfatter, men er ikke begrenset til Saccharomyces cerevisiae-, Hansenula polymorpha- og Pichia 3'-endesekvensene. De som fås fra Pichia pastoris foretrekkes, såsom de som er valgt fra gruppen bestående av 3<1->endesekvensene av AOXl-genet, DHAS-genet, p40-genet og HIS4-genet. Særlig foretrukket er 3<1->endesekvensen av AOXl-genet.

For utførelse av den foreliggende oppfinnelse foretrekkes det for tiden å anvende lineære transformasjonsvektorer såsom de i retning urivseren BglII-fragmenter av de konstruerte stykker vist på fig. 3.

Innsettingen av det HIV 24 kDa<g>a<g>strukturelle gen i egnede vektorer kan oppnås ved en hvilken som helst egnet teknikk som kløyver den valgte vektor ved et passende sete eller seter og fører til at minst én operabel ekspresjonskassett inneholdende det strukturelle gen foreligger i vektoren.

Ligasjon av det HIV 24 kDa<g>a<g>strukturelle gen kan oppnås ved en hvilken som helst passende ligasjonsteknikk såsom anvendelse av T4 DNA-ligase.

Den opprinnelige seleksjon, formering og valgfritt amplifika-sjon av ligasjonsblandingen av et HIV 24 kDa gag strukturelt gen og en vektor blir fortrinnsvis utført ved transformasjon av blandingen inn i en bakterievert såsom E. coli. (Skjønt ligasjonsblandingen kan transformeres direkte inn i en gjær-vert). Egnede transformasjonsteknikker for E. coli er velkjent i faget. Dessuten er seleksjonsmarkører og bakterielle opp-rinnelsessteder for replikasjon som er nødvendige for opprettholdelsen av en vektor i en bakterievert, også velkjent i faget.

Isolasjonen og/eller rensingen av det ønskede plasmid som inneholder det HIV 24 kDa<g>ag strukturelle gen i et ekspre-sjonssystem, kan utføres ved en hvilken som helst egnet fremgangsmåte for separasjon av plasmid-DNA fra verts-DNA.

På samme måte kan vektorer som dannes ved ligasjon utprøves fortrinnsvis etter formering for å bekrefte nærværet av HIV 24 kDa gag-genet og dets operable binding til et regulatorisk område og en 3<1->endesekvens. Dette kan oppnås ved en rekke forskjellige teknikker som innbefatter, men ikke er begrenset til endonukleasedigerering, gelelektroforese eller endonukleasedigerering/Southern hybridisering.

Transformasjon av plasmider eller lineære vektorer inn i gjærverter kan utføres ved egnede transformasjonsteknikker som omfatter, men ikke er begrenset til de som er vist av Hinnen et al, Proe. Nati. Acad. Sei. 75, (1978) 1929; Ito et al, J. Bacteriol 153, (1983) 163; Cregg et al Mol. Cell Biol. 5 (1985) p. 3376 eller Sreekrishna et al, Gene, 59 (1987) p. 115. For utførelse av den foreliggende oppfinnelse foretrekkes transformasjonsteknikken i henhold til Cregg.

Gjærverten for transformasjon kan være en hvilken som helst egnet metylotrof gjær. Metylotrofe gjærsorter innbefatter,

men er ikke begrenset til gjærsorter som kan vokse på metanol valgt fra slektene bestående av Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis og Rhodotorula. En liste over spesielle arter som er eksempler på denne klasse gjær, finnes i C. Anthony, The Biochemistry of Methvlotrophs, 269

(1982). For tiden foretrekkes metylotrofe gjærsorter av slekten Pichia, såsom den auxotrofe Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851). Auxotrofe metylotrofe gjærsorter er også fordelaktige for utførelse av oppfinnelsen på grunn av at de lett kan selekteres. Det innses at vill type metylotrofe gjærstammer kan anvendes med like stort hell dersom et egnet transformerende markørgen velges, såsom bruken av SUC2 til å transformere Pichia pastoris til en stamme som kan vokse på sakkarose, eller dersom en antibiotisk resistens-markør anvendes såsom G418.

Transformerte metylotrofe gjærceller kan selekteres for ved anvendelse av riktige teknikker som innbefatter, men ikke er begrenset til dyrking av tidligere auxotrofe celler etter transformasjon i fravær av et biokjemisk produkt som er nød-vendig (på grunn av cellens auxotrofi), screening ved deteksjon av en ny fenotype ("metanolanvendelse +/-, Mut<+/>~") eller dyrking i nærvær av et antibiotikum som er giftig for gjæren i fravær av et resistensgen som inneholdes i transformanten. Isolerte, transformerte, metylotrofe gjærceller dyrkes ved riktige fermenteringsteknikker såsom ristekolbefermentering, høytetthetsfermentering eller de teknikker som er angitt av Cregg et al, High- Level Expression and Efficient Assemblv of Hepatitis B Surface Antigen in the Methvlotrophic Yeast, Pichia Pastoris, 5 Bio/Technology 479 (1987).

Ekspresjon kan utføres ved fremgangsmåter som passer for det regulatoriske område som anvendes. Dersom på metanol reagerende regulatoriske områder anvendes, kan induseringen av ekspresjon fortrinnsvis utføres ved at de transformerte celler, i et næringsmedium, utsettes for en passende alkohol for det regulatoriske område som anvendes.

HIV 24 kDa<g>a<g->proteinet kan utvinnes i en rå form ved lysering av transformerte celler som er blitt indusert i en tilstrekkelig lang periode, ved bruk av standardteknikker såsom perle-mølling, fulgt av sentrifugering tilstrekkelig til å fjerne celleavfall. En foretrukket fremgangsmåte til utvinning er angitt i eksempel VI.

De følgende ikke-begrensende eksempler er angitt for ytterligere å illustrere utførelsen av oppfinnelsen.

Eksempler

Generell informasjon som angår eksemplene:

Stammer

Pichia pastoris GS115 (HIS4) [NRRL Y-15851] var den vertsgjær-stamme som ble anvendt i disse eksempler.

Buffere, oppløsninger og media

De buffere og oppløsninger som ble anvendt i de følgende eksempler, har de sammensetninger som er gitt nedenfor:

Eksempel I

Dannelse av<p>AO807

pAO804-plasmidet er tilgjengelig i en E. coli-vert fra the Northern Regional Research Center ved De forente staters landbruksdepartement, Peoria, Illinois, aksesjonsnr. B-18114. pAO804 utvinnes ved isolering av plasmid-DNA, digerering med EcoRI, gelelektroforese for utvinning av det~7,5 kb fragment som er lineært pAO804 kuttet ved sitt unike EcoRI-sete.

1. Fremstilling av fl-ori DNA

fl bakteriofag DNA (50 ug) ble digerert med 50 enheter Rsal og Dral (i henhold til fabrikantens retningslinjer) for å frigjøre det~458 bp DNA-fragment inneholdende fl opprin-nelsesstedet for replikasjon (ori). Digereringsblandingen ble ekstrahert med et like stort volum fenol:kloroform (V/V)

fulgt av ekstraksjon av det vandige lag med et like stort volum kloroform, og til slutt ble DNA i den vandige fase utfelt ved justering av NaCl-konsentrasjonen til 0,2 M og tilsetning av 2,5 volumer absolutt etanol. Blandingen fikk henstå på is (4°C) i 10 min og DNA-utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering i 30 min ved 10 000 xg i en mikrosentrifuge ved 4°C.

DNA-pelleten ble vasket to ganger med 7 0% vandig etanol. Den vaskede pellet ble vakuumtørket og oppløst i 25 ul TE-buffer. Dette DNA ble underkastet elektroforese på 1,5% agarosegel,

og den del av gelen som inneholdt det~458 bp f1-ori-fragment, ble kuttet ut og DNA i gelen ble elektroeluert på DE81-papir (Whatman) og eluert fra papiret i 1 M NaCl. DNA-oppløsningen ble utfelt som angitt i detalj ovenfor og DNA-utfellingen ble oppløst i 25 ul TE-buffer (f1-ori-fragment).

2. Kloning av fl-ori inn i Dral-seter av pBR322

pBR322 (2 ug) ble delvis digerert med 2 enheter Dral (i henhold til fabrikantens instruksjoner). Reaksjonen ble avsluttet

ved. f enol/klorof orm-ekstraks j on fulgt av utfelling av DNA

som angitt i detalj i trinn 1 ovenfor. DNA-pelleten ble oppløst i 20 ul TE-buffer. Ca. 100 ng av dette DNA ble ligatisert .med 100 ng f1-ori-fragment (trinn 1) i 20 ul ligasjonsbuffer ved inkubering ved 14°C over natten med 1 enhet T4 DNA-ligase. Ligasjonen ble avsluttet ved oppvarming til 7 0°C i 10 min og deretter brukt til å transformere E. coli-stamme JM103 for oppnåelse av pBRfl-ori som inneholder fl-ori klonet inn i Dral-setene (nukleotidposisjoner 3232 og 3251) av pBR322.

3. Dannelse av pAO807

pBRfl-ori (10 ug) ble digerert i 4 h ved 37°C med 10 enheter hver av Pstl og Ndel. Det digererte DNA ble fenol/kloroform-ekstrahert, utfelt og oppløst i 25 ul TE-buffer som angitt i detalj i trinn 1 ovenfor. Dette materiale ble underkastet elektroforese på en 1,2% agarosegel og Ndel-Pstl-fragmentet (~0,8 kb) inneholdende fl-ori ble isolert og oppløst i 20 ul TE-buffer som angitt i detalj i trinn 1 ovenfor. Ca. 100 ng

av dette DNA ble blandet med 100 ng pAO804 som var blitt digerert med Pstl og Ndel og fosfatasebehandlet. Denne blanding ble ligatisert i 20 ul ligasjonsbuffer ved inkubering over natten ved 14°C med 1 enhet T4 DNA-ligase. Ligasjonsreaksjonen ble avsluttet ved oppvarming ved 7 0°C i 10 min. Dette DNA

ble benyttet til å transformere E. coli-stamme JM10 3 for oppnåelse av pAO807.

Eksempel II

Konstruksjon av vektorPSL34A

Et EcoRI/Clal-fragment fra HIV-viruset inneholdende den 24 kDa<g>a<g->sekvens og en annen HIV-sekvens omfattende 3,85 kb ble isolert (se fig. 1). 25 ng av dette fragment ble ligatisert over natten ved 14°C ved anvendelse av 1 enhet T4-ligase (Boehringer Mannheim) med 10 ng pBR322 DNA i 20 ul ligasebuffer (Maniatis et al, 1982) som var blitt behandlet med et 4:1 overskudd av EcoRI og Clal endonuklease i henhold til fabrikantens retningslinjer (alle endonukleaser ble skaffet fra New England Biolabs eller Boehringer Mannheim), og behandlet med alkalisk fosfatase fra kalvetarm.

Kompetente celler ble fremstilt ved dyrking av 100 ml kultur av bakterier MC1061 på LB-medium til tidlig logaritmisk fase. Cellene ble deretter pelletert ved sentrifugering ved

3000 omdr. pr. min i 5 min ved 4°C i en IEC DPR-6000 sentrifuge. Cellene ble deretter resuspendert i 40 ml CG-oppløsning (50 mM CaCl2og 10% glycerol) og lagt på is i 15-20 min. Cellene ble pelletert ved sentrifugering som tidligere og resuspendert i 5 ml CG. Porsjoner på 0,45 ml pr. ror ble plassert i 1,5 ml eppendorfrør, hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -70°C. 200 ul celler ble brukt i hver transformasjon med en endelig konsentrasjon ekvivalent med 6-8 AgQQ-enheter.

Ligasjonsblandingen av pBR322 og det HIV EcoRI/Clal ble benyttet til å transformere 200 yl kompetente MC1061-celler. Cellene og ligasjonsblandingen ble blandet og anbragt på is

i 20 min og deretter inkubert ved 37°C i 2 min. Blandingen ble etterlatt ved værelsetemperatur i 10 min. Transformasjons-blandingen ble deretter platet på seleksjonsmedium (LB-medium pluss 50 ug/ml ampicillin). Platene ble inkubert over natten ved 37°C.

Ampicillinresistente kolonier ble identifisert og minipreparater ble utført på hver resistente koloni idet man fulgte teknikken i henhold til Maniatis ved anvendelse av alkalisk lyse. Det plasmid-DNA som ble utvunnet, ble digerert med et 4:1 overskudd av EcoRI og Clal. Fragmentene ble deretter kjørt på en 0,8% agarosegel i TBE-buffer. Kolonier som hadde et 3,85 kb Clal/EcoRI-fragment som kom til syne på gelen ble betegnet pSL32 og slått sammen.

En oligonukleotid-adapter ble syntetisert ved en Applied Biosystems Model 380 genmaskin som anvender cyanoetylfosforamiditt-kjemi. Adapteren var konstruert for å skaffe et EcoRI-sete for å lette innsetting av det 3,85 kb Clal/EcoRI- fragment inn i det unike EcoRI-sete av ekspresjonsvektor pAO807. Oligonukleotid-adapteren syntetisert hadde den følgende nukleotidsekvens:

Hver tråd ble syntetisert individuelt og 5 ug av begge oligonukleotider ble kombinert i en kinasereaksjon utført ved anvendelse av fremgangsmåten i henhold til Maniatis og inkubert ved 37°C i 1 h. Etter inkubasjonen ble blandingen varmet opp ved 65°C i 5 min i et vannbad som deretter ble slått av og tillatt å avkjøle langsomt til værelsetemperatur. 10 ug av pSL32 ble digerert med Clal, og endene ble fosfatasebehandlet ved fremgangsmåten i henhold til Maniatis. 10-25 ng av den fosfataserte vektor ble ligatisert ved anvendelse av ca. en enhet av T4-ligase med 15-150 ng kinaserte, sammenføyde oligonukleotid-adaptere som forelå med et molart overskudd på 1:4-1:10. Denne reaksjonsblanding ble deretter anvendt til å transformere kompetente MC1061-celler som ble platet på selek-tive medier (disse teknikker ble utført som tidligere beskrevet ovenfor). Minipreparater ble utført på de ampcillinresistente kolonier, og hver koloni ble digerert med EcoRI. De som hadde adapterne ville frigjøre et tilnærmet 3,85 kb-fragment. Én koloni som hadde det innskutte materiale, ble betegnet pSL3 3.

En fremstilling i stor skala av plasmid pSL3 3 ble utført ved dyrking av MC1061-cellen transformert med pSL33 til stasjonær fase i 100 ml selektivt medium (LB + 50 ug/ml ampicillin). Cellene ble deretter sentrifugert ved 10 000 omdr./min ved anvendelse av en GSA-rotor i en Sorvall RC-5B sentrifuge i 10 min. Pelleten ble resuspendert i 25 ml av en GET-oppløsning (omfattende 50 mM glukose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl, pH 8, pluss 0,5 ml 10% lysozym) og inkubert ved værelsetemperatur i 1-5 min. 50 ml 1% SDS-oppløsning og 0,2 N NaOH ble tilsatt og ble blandet ved inversjon for å resuspendere pelleten. Dette ble fulgt av tilsetning av 3 8 ml 3M kaliumacetat (pH 4,5) som ble blandet deri ved inversjon. Denne blanding ble avkjølt i 15 min i isvann. Den avkjølte blanding ble deretter inkubert på nytt i 10 min ved 10 000 omdr./min ved anvendelse av en GSA-rotor i en Sorvall RC-58 sentrifuge. Supernatanten ble deretter helt gjennom en trådpakke (gauze pad) inn i en ny sentrifugekolbe. 12 g PEG 8000 (polyetylenglykol) ble satt til supernatanten, og den resulterende blanding avkjølt i 30 min i isvann. Den avkjølte blanding ble deretter sentrifugert som tidligere beskrevet (10 000 omdr./min, 10 min, GSA-rotor, Sorvall RC-58). Sentrifugerøret ble deretter dekan-tert grundig og pelleten oppløst i 9 ml TE-buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA). 9 g CsCl og 0,45 ml 1% etidi-umbromid ble satt til den oppløste pellet. Denne blanding ble deretter forseglet i et rør og innsatt i en TI75-rotor og sentrifugert ved 55 000 omdr./min i 16 h ved 18°C i en Beckman L8-70 ultrasentrifuge. DNA-båndene ble fjernet fra CsCl og ekstrahert tre eller fire ganger med sec-butanol mettet med NaCl. To ganger de opprinnelige volumer av vann ble tilsatt. Tre ganger det opprinnelige volum av isopropanol ble satt

til denne blanding. Blandingen ble avkjølt ved -20°C i flere timer eller over natten eller avkjølt på tørris inntil den frøs. DNA ble deretter pelletert ved sentrifugering i 20 min ved 11 000 omdr./min i en HB-4-rotor ved anvendelse av en Sorvall RC-58 sentrifuge. Supernatanten ble helt av og pelleten resuspendert i 0,45 ml TE-buffer, deretter overført til et eppendorfrør. 0,05 ml 3M natriumacetat og 1 ml etanol ble satt til den resuspenderte pellet, og den ble avkjølt på tørris inntil den frøs. Pelleten ble deretter tinet og sentrifugert i en mikrosentrifuge i et kaldt rom (4°C). Den tinte pellet ble deretter oppløst i 200 ul TE-buffer. Konsentrasjonen av det resulterende DNA ble bestemt ved at man tok absorbans-avlesninger ved 260 nm og anslo konsentrasjonen (1 var lik 50 ug/ml).

25 ug pSL33 ble digerert med et 4:1 overskudd av EcoRI som

beskrevet ovenfor. Digereringsblandingen ble underkastet elektroforese på en 0,7% agarosegel i TBE-buffer (10X TBE består av 108 g Tris-base, 55 g borsyre, 6,72 g dinatrium-EDTA (resulterende pH 8,1-8,2)). Det 3,85 kb EcoRI-fragment

som ble dannet ved denne digerering, ble kuttet ut av gelen, anbragt i en dialysepose og elektroeluert i TBE-buffer. Det elektroeluerte fragment ble deretter utfelt med 2 volumer .etanol og fenol/kloroform-ekstrahert. 12,5-125 ng av dette 3,85 kb EcoRI-fragment ble deretter ligatisert inn i 10 ng EcoRI-kuttet og fosfatasert-behandlet plasmid pAO807. Ligasjonen ble utfort ved anvendelse av ligasebufferen i henhold til Maniatis.

Ligasjonsblandingen ble deretter transformert inn i 200 ul kompetente JM103-celler.

Kompetente JM103-celler ble fremstilt ved poding (seeding)

5 ml supplert M9-medium, Zollar and Smith, Methods in Enzymology 100:468, 490 (1983) med JM103 og dyrking ved 37°C med risting inntil cellene nådde stasjonær fase. 50 ul av stasjonær fase-JM103 ble satt til 50 ml LB-medium og dyrket ved 37°C i 2 h eller inntil OD60ovar 0,3. Cellene ble høstet og sentrifugert i en IEC DPR6000 ved 3000 omdr./min i 5 min ved 4°C. Cellene ble deretter resuspendert i 25 ml 50 mM

CaCl2og plassert på is i 15 min. Ved slutten av 15 min ble cellene på nytt sentrifugert i en IEC DPR6000 ved 3000 omdr./min i 5 min ved 4°C. Cellene ble deretter resuspendert i 2,5 ml 50 mM CaCl2og holdt på is inntil bruk (celler kan bare opprettholdes i 2-3 h før bruk).

Transformasjonsfremgangsmåten for JM103 er den samme som den som tidligesre ble benyttet for MC1061. Cellene ble platet på LB-medium inneholdende ampicillin (som tidligere beskrevet for MC1061) og kolonier resistente for ampicillin ble valgt. Miniprepareringer ble utført ved bruk av fremgangsmåten i henhold til Maniatis for alkalisk lyse. Det DNA som ble oppnådd fra minipreparatene, ble digerert med EcoRI og kjørt på en 0,7% agarosegel. En koloni som dannet et tilnærmet 3,85 kb-fragment, ble selektert og betegnet pSL34A, som er vist på fig. 2. Orienteringen av dette plasmid ble også bestemt ved Clal-digerering.

Eksempel III

Konstruksjon avOSL44A

I. Oligonukleotid-rettede mutageneser

Plasmid pSL34A ble underkastet uavhengig mutagenese for å

1) tilføye et EcoRI-sete og initial-metionin ved 5'-enden av

gag-genet og 2) tilføye et stoppkodon og et EcoRI-sete ved 3'-enden av gag-genet for å gi to derivative pSL34A-plasmider (pSL42 og pSL43, se fig. 2). Template-DNA ble fremstilt fra pSL34A-transformantene ved resuspendering av en koloni av JM103-celler transformert til ampicillinresistens (ved pSL34A-plasmidet) i 2 ml LB pluss 100 ug/ml ampicillin og dyrking ved 37°C i 4-5 h. 0,5 ial av denne mettede kultur ble podet inn i 50 ml LB + amp og dyrket til en ODg<g>o<=><0><3- Den var da klar for superinfeksjon med hjelperfag, hvis fremstilling er beskrevet nedenfor.

Fag-utgangsmateriale fra hjelperfagen R408 fremstilles ved anbringelse av 0,2 ml av en overnatt-kultur av JM103 i supplert M9-media pluss 7 x 10^ R408 plus 100 ul LB-næringsvæske i et lite, sterilt rør. Røret inkuberes ved 37°C i 15 min uten risting og deretter blir 2,5 ml 0,7% agar i LB tilsatt og blandingen helt på overflaten av en LB-plate som var fremstilt dagen før. Platene dyrkes i 6 h ved 37°C og blir deretter overdekket med 5 ml LB og tillatt å bløtes i kaldtrommet over natten eller ved værelsetemperatur med langsom risting på en roterende ristemaskin i 45 min. Supernatanten fjernes, sentrifugeres ved bruk av en Sorvall-sentrifuge og HB4- eller SS34-hode ved 80 0 0 omdr./min i 20 min, og supernatanten fra denne spinning tas ut til et nytt sterilt 50 ml konisk rør. Røret varmes i 30 min ved 65°C. Utgangsmaterialet bør lagres ved 4°C.

Titering av fagen utføres ved seriefortynning av fag-utgangsmaterialet inn i 1 ml LB ved konsentrasjoner på 10"^, io~<4>, IO-<6>,10~<8>og IO-<9>.Plener (lawns) av bakterier for titering fremstilles ved at man på en LB-plate plater 0,2 ml av en overnatt-kultur av JM103 pluss 2,5 ml 0,7% agar og lar platen

sitte på benken med lokket så vidt åpent (cracked) i 5 min.

20 ul av hver fortynning spottes på platen med glass-mikro-pipetter, og platene inkuberes ved 37°C over natten. Etter overnatt-vekst vil nærværet av 10 plaques i 20 ul av en 10~<9-> fortynning angi en titer på 5 x 10<11>. Dette er den forventede verdi for antall fag som anvendes til fremstilling av utgangsmaterialet og er en nyttig titer for superinfeksjon av plasmid-kulturer for enkeltbestandproduksjon (single-stand production). Kulturen ODgoo=0'3 ble superinfisert med hjelperfag R408 [Russel et al (1986) Gene 45:333-338] ved en infeksjonsmulti-plisitet på 10-20. Den superinfiserte kultur ble deretter sentrifugert to ganger ved 10 000 omdr./min i 10 min i 30 ml corex-rør ved anvendelse av en Sorvall RC-5B sentrifuge. Supernatanten ble overført til nye corex-rør og 7 ml 20% PEG 6000 med 2,5 M NaCl ble tilsatt. Blandingen ble inkubert over natten ved 4°C. Blandingen ble deretter sentrifugert i 10 min ved 10 000 omdr./min ved anvendelse av en Sorvall RC-5B sentrifuge og supernatanten ble kassert. Pelleten ble resuspendert i 2 ml TE og ekstrahert med fenol, fenol:kloroform og deretter eter. 1/10 volum 8M litiumklorid og 2 volumer etanol ble satt til blandingen. Blandingen ble inkubert ved -20°C over natten. Etter inkubasjon over natten ble blandingen sentrifugert i 10 min ved 10 000 omdr./min i en Sorvall RC-5B sentrifuge. Supernatanten ble kassert og pelleten renset med etanol. Pelleten ble resuspendert i 0,5 ml lOmM Tris-HCl. 5'-oligonukleotidet som ble anvendt for priming hadde sekvensen: 5' -AGC AGT CAG GTC AGC GAA TTC ATG CCT ATA GTC CAG AAC- 3'

3'-oligonukleotidet anvendt for priming hadde sekvensen:

5' -AAG GCA AGA GTT TTG TAA GAA TTC ATG AGC CAA GTA ACA- 3'

Syntetiske oligonukleotider ble på nytt fremstilt ved anvendelse av en Applied Biosystems DNA-syntetisator, modell 3 80A og cyanoetylfosforamiditt-kjemi som tidligere beskrevet. 5'-mutagenesen ble utført ved anvendelse av template-DNA fra plasmid pSL34A i henhold til den etterfølgende fremgangsmåte, hvilket gav plasmid pSL42. 3 '-mutagenesen ble utført, ved anvendelse av template-DNA fra pSL34A i henhold til den etter-følgende fremgangsmåte, hvilket gav plasmid pSL43.

En nmol mutagent oligonukleotid ble kinasert med ikke-radioaktivt ATP ved vanlige fremgangsmåter (Maniatis et al, 1982). Sekvensen for disse oligonukleotider er angitt ovenfor. Førti pmol av hvert kinaserte oligonukleotid ble separat føyet til to pmol template-DNA fra pSL34A i oppløsning A (0,2M Tris-HCl (pH 7,5), 0 , 5M NaCl, 0,IM MgCl2og 0,01M ditiotreitol (DTT) ved koking av reaksjonsblandingen i 2 min, inkubering av blandingen i 5 min ved 65°C og langsom avkjøling av reaksjonen til værelsetemperatur ved at vannbadet ble slått av. 2,5 ul av Klenow-fragmentet av E. coli DNA-polymerase I (New England Biolabs) og 25<y>l oppløsning C ble satt til hvert rør.

Rørene ble deretter inkubert på benken i 5 min og overført til 16°C over natten.

Mutagenese av 3'-sekvensen ble utført for seg ved anvendelse av den samme fremgangsmåte på separat DNA-template fra pSL34A.

II. Transformasjon inn i bakterier og kolonisortering

Neste morgen ble kompetente celler av hunn-bakteriestammen MC1061 transformert med 0,5, 2 og 5 ul av en 1:40 fortynning av forlengelsesreaksjonen ved anvendelse av de fremgangsmåter for transformasjon og for fremstilling av kompetente celler som er gitt ovenfor og 492. Fem plater av hver fortynning ble platet. Etter inkubasjon over natten ved 37°C ble DNA

fra bakteriekolonier overført til nitrocellulosefiltre ved anvendelse av fremgangsmåtene i henhold til Grunstein og Hogness, og koloniene ble hybridisert med et sorterende oligonukleotid som var blitt gjort radioaktivt ved kinase-merking i nærvær av radioaktivt gamma-ATP ved fremgangsmåten i henhold til Zollar og Smith som angitt ovenfor. Sekvensen av det oligonukleotid som ble anvendt til sortering av N-endemutagenesen var:

og sekvensen av oligonukleotidet anvendt til sortering av C-endemutagenesen var:

Begge oligonukleotider ble syntetisert som tidligere beskrevet, bortsett fra at tritylgruppen ble fjernet fra N-ende-oligoet ved maskinen og prøven ble avsaltet ved bruk av en Sephadex G-40 mediumkolonne (istedenfor HPLC).

Hybridisering av de radioaktive oligonukleotider ble utført ved 42°C i 5 x SSPE, 10 x Denhardts og 0,5% SDS. Filtrene ble prehyridisert før hybridisering i den samme oppløsning ved 65°C i 30 min, og oppløsningen ble skiftet for hybridisering. Merkede oligonukleotider ble anvendt i hybridisereingen ved 10^ cpm/ml. Filteret ble vasket ved værelsetemperatur i tre 15 min's vaskinger i 6 x SSC og en 15 min's vasking ved 42°C i 6 x SSC. Etter eksponering for røntgenfilm (Kodak, X-Omat AR) ble åtte mulige, enkle positive kolonier plukket

ut for hver mutagenese, DNA fra koloniene ble fremstilt ved anvendelse av en standard bakteriell miniprepareringsprotokoll (Maniatis) og DNA ble undersøkt for nærværet av et nytt EcoRI-sete ved digerering med dette EcoRI og kjøring av de digererte stykker på polyakrylamidgeler. Fire og to for henholdsvis N-og C-terminalendene av de bakterielle minipreparater bekreftet nærværet av det nye EcoRI-sete. En av hver av disse positive prøver ble dyrket opp for stor fremstilling av plasmid-DNA

ved anvendelse av fremgangsmåten i henhold til Maniatis og 1, 5, 10 og 20 yl av en 1:40 fortynning av minipreparat-DNA fra hver av disse samme positive prøver ble anvendt til å transformere bakteriestammen JM103 til ampicillinresistens.

III. Fremstilling av template-DNA og bekreftelse ved

sekvensering

Tre kolonier fra hver av de 20 ul fortynnings-plater ble anvendt til fremstilling av enkelttrådet template-DNA ved de ovenfor angitte fremgangsmåter (innbefattende polyetylenglykol- utfelling av supernatanten av superinfiserte JM103-celler, deretter deproteinisering med fenol og kloroform og etanol-utfelling av DNA). Sekvensen av N-endemutagenese ble bekreftet ved bruk av oligonukleotider med sekvensen:

og sekvensen av C-endemutagense ble bekreftet ved bruk av oligonukleotid med sekvensen:

5' -CGA ACC CAG ATT GTA AGA CTA- 3'

ved anvendelse av kjedeavslutningsmetoden i henhold til Sanger

(1977). Etter at pSL44 var blitt fremstilt ved ligasjon av

EcoRI-Pstl HIV-fragmenter fra pSL42 og pSL43 inn i EcoRI-setet av pAO807, ble template fremstilt fra pSL44. Sekvensen gjennom Pstl-setet av denne template ble bekreftet ved bruk av oligonukleotidet:

For å konstruere pSL44A ble 10 ug plasmid-DNA fra pSL42 og pSL43 digerert med EcoRI og Pstl i 4:1 overskudd. Det 5' p24-fragment var et~240 bp EcoRI-Pstl-fragment, det 3' p24-fragment var et~460bp Pst-EcoRI-fragment. Fragmenter ble utvunnet fra 5% polyakrylamidgeler ved diffusjon fra de DNA-holdige gelstykker. 10 ug plasmid pAO807 ble digerert med EcoRI, endene ble fosfatasebehandlet, og vektoren pluss de to p24-kodende fragmenter ble føyet sammen i en treveis-ligasjon. Ligasjonsblandingen ble transformert inn i MC1061-celler og ampr-celler ble identifisert. Plasmid-minipreparater ble utført på transformantene og det riktige plasmid ble identifisert ved digerering og elektroforese på 0,8% agarose, det ble kalt pSL44A (se fig. 3).

Eksempel IV

Transformasjon av Pichia pastoris

I. Vektorpreparering

20 ug plasmid pSL44 ble digerert fullstendig med Bglll.

Den fullstendige digerering av plasmidet ble bestemt ved

0,8% agarosegelelektroforese. Digereringsblandingen ble anvendt til å transformere Pichia pastoris stamme GS115 (his4-) depo-.nert hos the Northern Regional Research Center ved De forente staters landbruksdepartement, aksesjonsnr. NRRL Y-15851. Transformasjon med vektorer inneholdende histidinoldehydro-genasegenet vil komplementere denne defekt i histidinveien, idet det forandrer de GS115-transformerte celler til His<+>. Sortering for transformanter kan derfor lett oppnås ved dyrking av cellene etter transformasjon i et vekstmiljø som mangler histidin og utvinning av de celler som er i stand til å vokse under denne betingelse.

II. Cellevekst

Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) ble podet inn i ca.

10 ml YPD-medium og ristedyrket ved 30°C i 12-20 h. 100 ml YPD-medium ble podet med podekultur for å gi en ODggg på ca. 0,001. Mediet ble dyrket i en ristekolbe ved 30°C i 12-20 h. Kulturen ble høstet når OD60ovar 0,2-0,3 (etter 16-20 h)

ved sentrifugering ved 3000 omdr./min i 5 min ved anvendelse av en IEC DPR 6000 sentrifuge.

III. Fremstilling av sfæroplaster

Cellene ble vasket en gang i 10 ml sterilt vann og deretter sentrifugert ved 30 000 omdr./min i 5 min. (Sentrifugering utføres etter hver cellevask ved 3000 omdr./min i 5 min ved anvendelse av en IEC DPR 60 0 0 med mindre noe annet er angitt). Cellene ble deretter vasket en gang i 10 ml nylig fremstilt SED, en gang i 10 ml steril IM sorbitol og til slutt resuspendert i 10 ml SCE-buffer. 10 ul 4 mg/ml oppløsning av zymolyase (100 000 enheter pr. g skaffet fra Miles Laboratories) ble tilsatt. Cellene ble deretter inkubert ved 30°C i ca. 60 min. Sfæroplastene ble vasket to ganger i 10

ml steril IM sorbitol ved sentrifugering ved 1500 omdr./min i 10 min. 10 ml sterilt CaS ble anvendt som en endelig celle-

vask, og cellene ble sentrifugert på nytt ved 1500 omdr./min i 10 min og resuspendert i 0,6 ml CaS.

IV. Transformasjon

GS115-celler ble transformert med 0,5, 1, 5 og 10 ug av det plasmid-DNA digererte stykke. DNA-prøver ble satt til 100 ul sfæroplaster og inkubert ved værelsetemperatur i ca. 20 min. 1 ml PEG-oppløsning ble satt til hver prøve og inkubert ved værelsetemperatur i ca. 15 min.

V. Regenerering av sfæroplaster

Et bunnagar-lag på 10 ml regenereringsagar ble helt på hver plate minst 30 min før transformasjonsprøvene var ferdige. Dessuten ble porsjoner på 10 ml regenereringsagar fordelt på 50 mis corning-rør med konisk bunn i et 55°C bad. Porsjoner på 10 eller 990 ul av den transformerte prøve ble satt til porsjonene på 10 ml smeltet regenereringsagar, holdt på 5 5°C og helt på plater inneholdende det faste 10 ml bunnagarlag. Platene ble inkubert ved 30°C i 3-5 dager.

VI. Seleksjon av transformanter

Transformanter ble selektert for ved dyrking på regenerativ agar, et medium som mangler histidin. His+-kolonier ble identifisert og deretter sortert for den riktige Mut~-fenotype på følgende måte. Transformanter ble slått sammen ved at overflaten av platen ble skrapet i nærvær av sterilt destillert vann og underkastet lydbehandling (sonicated) ved lav ytelse i 15 s. De ble deretter fortynnet til en Aggg = 0,1 og platet ved fortynninger på 10<->^ og 10<-4>i duplikat på minimale plater inneholdende 0,2% glukose som karbonkilde og inkubert ved 30°C i 1,5-2 dager. De ble deretter replikaplatet på minimale plater med 0,5% metanol som en karbonkilde. Etter inkubering over natten ved 30°C var det tydelig at 18/75 (24%) av transformantene vokste langsommere på metanol enn på resten av transformantene. Mønsteret av fragmenter på et genomisk Southern blott forutsagt ved utskiftning av AOXl-genet med BglII-fragmentet fra pSL44 ble oppvist i flere av disse stammer. En av disse stammer ble betegnet G-GAG44.

Eksempel V

Giæring av G- GAG44

Et 10 liters gjæringsforsøk nr. 358 ble utført som følger.

500 ml buffret nitrogenbase (YNB)-2% glycerol i en Fernback-kolbe ble podet fra en podekultur eller en minimal glukoseplate av kulturen. Etter en dags risting ved 200 omdr./min og 30°C ble podestoffet sådd i 7 1 minimalt medium inneholdende 480 g glycerol, 40 mg biotin og 40 ml oppløsning av sporsalter. Gjæringsapparatet ble holdt på 30°C og pH 5,5 mens kulturen vokste på satsvis måte inntil glycerolen var utbrukt (c'a. 24 h). pH-verdien ble regulert ved tilsetning av NH^-gass. Glyceroluttømming ble observert ved en skarp reduksjon i C02~avgivelse og skarp økning i det oppløste oksygen (eller reduksjon i opptakshastigheten for oksygen). Et metanolmat-ningsmateriale ble startet på 9 ml/h for å bringe nivået i gjæringsapparatet på~0,5% MeOH og justert, basert på den faktiske MeOH-forbrukshastighet for opprettholdelse av dette nivå. Porsjoner på 40 ml sporsalter ble tilsatt ved intervaller på ca. to dager for å opprettholde metanolforbrukshastigheten.

Eksempel VI

Celleoppbrvtninq oa ekstraksion

Celler ble fjernet fra gjæringsvæsken og vasket i oppbryt-ningsbufferen (10 mM NaP04, pH 7,5, 15 0 mM NaCl, 5 mM EDTA,

1 mM PMSF) ved anvendelse av et Amicon filtreringsapparat. Tilnærmet 1600 g celler ble brutt opp i en perlemølle med kontinuerlig strømning (Dynomill) i 6,4 1 samlet volum buffer. Det resulterende cellelysat ble sentrifugert ved 7700 x g, supernatanten fra denne spinning ble justert til pH 5 og deretter sentrifugert ved 17 000 x g. Supernatanten fra denne spinning ble justert til pH 7 og filtrert gjennom to 0,45 um filtre inn i sterile polystyrenbeholdere. Mengden av p24 ga<g>-

i den endelige prøve ble anslått ved Western blott til å

være tilnærmet 20-30 mg/l. Den samlede proteinkonsentrasjon ble bestemt i henhold til TCA Lowry til å være 3,85 g/l. Således var den endelige konsentrasjon av p24 gag i prøven tilnærmet lik 0,5-0,7 5% av det samlede celleprotein. Det ble anslått at utbyttet ved fremgangsmåten var tilnærmet 33-50% ved sammenligning av mengden fra en ved hånd brutt opp porsjon på 100 OD av den endelige celleprøve.

Eksempel VII

Produktanalyse

Mengden av p24<g>a<g>i det endelige sterile filrat ble anslått ved Western blott ved anvendelse av et 35-kd fusjonsprotein, PG2, fra Centocor som en standard (se Ghrayeb et al (19 86)

DNA 5.: 93-99), en 1:1250 fortynning av kanin-antiserum til virusekstrakter fra Bionetics Research, Inc. (Rockville, MD) og<125>I-protein A (New England Nuclear) ble brukt til påvis-ning .

Filtratet fra det tidligere eksempel var på en 10% polyakryl-amid Laemmli-gel etter fremgangsmåten i henhold til Laemmli (UK) Nature 227:680-685 (1970). Proteinet ble deretter elektroblottet fra gelen på et 0,45 um nitrocellulosefilter ved elektroforese utført ved 300 mA konstant strøm i 1 1/2-2 h ved fremgangsmåten i henhold til Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76:4350-4354 (1979). Filteret ble deretter fjernet fra elektroblottet og inkubert i Western-buffer i 1 h. Antistoff fortynnet i Western-buffer ble deretter tilsatt og fikk henstå over natten i kaldtrommet på en ristemaskin. Filteret ble vasket fire ganger med 15 min pr. vask i Western-buf f er. Filteret ble deretter inkubert med<125>I-protein A i 45 min ved 0,5 uCi<125>I-protein A pr. bane. Filtrene ble på nytt vasket fire ganger i 15 min pr. vask i Western-buffer og eksponert for Kodak X-OMATAR-film.

Immunoreaktive bånd som vandrer ved tilnærmet 80-90 kd, 39 kd, 27 kd og 24 kd ble påvist på Western-blott til P. pastoris stamme G-GAG44. De ere største av disse materialer foreligger i celleekstrakter av utransformerte celler og representerer således tilsynelatende kryssreaksjoner for antigener andre - enn HIV gag p24. Man anslår at konsentrasjonen av p24 gag ligger mellom 0,5 og 0,7 5% av det samlede celleprotein.

Eksemplene er gitt bare for å belyse utførelsen av oppfinnelsen og skal ikke anses som begrensende for oppfinnelsens omfang eller ånd.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av HIV 24 kDa qag-proteinet, karakterisert ved at den omfatter a) å transformere en metylotrof gjær med minst én vektor som har minst én ekspresjonskassett inneholdende et strukturelt gen for HIV 24 kDa gag-protein, operabelt forbundet med et regulatorisk område og en 3'-endesekvens, og deretter b) å dyrke den resulterende transformerte gjærstamme under egnede betingelser for produksjon av det nevnte HIV 24 kDa <g> a <g-> protein.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at der anvendes en vektor valgt fra gruppen bestående av plasmider eller lineære, integrative setespesifikke vektorer, særlig en lineær integrativ setespesifikk vektor som inneholder det følgende arrangement i serie: a) et første innsettbart DNA-fragment, b) minst ett markørgen og minst én ekspresjonskassett inneholdende et strukturelt gen for HIV 24 kDa gjag-proteinet, operabelt forbundet med et regulatorisk område og en 3'-endesekvens, og c) et annet innsettbart DNA-fragment, idet rekkefølgen av markørgenet og kassetten i komponent (b) kan byttes om.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at der anvendes en lineær integrativ setespesifikk vektor hvor det første innsettbare DNA-fragment og det annet innsettbare DNA-fragment fås fra DNA-sekvensen av et gen isolert fra Pichia pastoris og valgt fra gruppen bestående av A0X1, p40, DHAS og HIS4, særlig hvor den nevnte ekspresjonskassett omfatter a) et regulatorisk område valgt fra gruppen bestående av A0X1, p40, DHAS og HIS4 isolert fra Pichia pastoris, sur fosfatase, galaktokinase, alkoholdehydrogenase, cytokrom c, alfaparingsfaktor og glyceraldehyd-S^ -fosfatdehydrogenase' isolert fra Saccharomyces cerevisiae operabelt forbundet med b) et strukturelt gen for HIV 24 kDa gag-proteinet operabelt forbundet med c) en 3'-endesekvens fra Pichia pastoris valgt fra gruppen bestående av 3'-endesekvensene isolert fra AOXl-genet, p40-genet, DHAS-genet og HIS4-genet, og særlig hvor det nevnte markørgen velges fra gruppen bestående av HIS4 og ARG4, isolert fra Pichia pastoris, SUC2 isolert fra Saccharomyces cerevisiae og G418 <R-> genet av Tn903 og Tn601.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at vektoren omfatter a) et første innsettbart DNA-fragment som er tilnærmet én kilobase av det 5'A0X1 regulatoriske område isolert fra Pichia pastoris operabelt forbundet med b) et strukturelt gen for HIV 24 kDa <g> a <g-> proteinet operabelt forbundet med c) 3'-endesekvensen av A0X1 isolert fra Pichia pastoris ligatisert til d) minst ett markørgen som er HIS4 isolert fra Pichia pastoris ligatisert til e) et annet innsettbart DNA-fragment som er tilnærmet 0,65 kilobaser av 3'AOXl-endesekvensen.

5. Lineær, integrativ setespesifikk vektor for anvendelse i fremgangsmåten som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at den omfatter det følgende arrangement i serie: a) et første innsettbart DNA-fragment, b) minst ett markørgen og minst én ekspresjonskassett inneholdende et strukturelt gen for HIV 24 kDa <g> a <g-> proteinet operabelt forbundet med et regulatorisk område og en 3'-endesekvens, og c) et annet innsettbart DNA-fragment, idet rekkefølgen av markørgenet og kassetten i komponent (b) kan byttes om, særlig hvor det første innsettbare DNA-fragment og det annet innsettbare DNA-fragment fås fra DNA-sekvenser . av et gen isolert fra Pichia pastoris og valgt fra gruppen bestående av A0X1, p40, DHAS og HIS4, den nevnte ekspresjonskassett omfatter a) et regulatorisk område valgt fra gruppen bestående av A0X1, p40, DHAS og HIS4 isolert fra Pichia pastoris, sur fosfatase, galaktokinase, alkoholdehydrogenase, cytokrom c, alfaparingsfaktor og glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase isolert fra Saccharomyces cerevisiae operabelt forbundet med b) et strukturelt gen for HIV 24 kDa gag-proteinet operabelt forbundet med c) en 3'-endesekvens valgt fra gruppen bestående av 3'-endesekvenser isolert fra AOXl-genet, p40-genet, DHAS-genet og HIS4-genet isolert fra Pichia pastoris, og det nevnte markørgen velges fra gruppen bestående av HIS4 og ARG4, isolert fra Pichia pastoris, SUC2 isolert fra Saccharomyces cerevisiae og G418 <R-> genet av bakterielt Tn903 og Tn601.

6. Vektor som angitt i krav 5, karakterisert ved at den omfatter a) et første, innsettbart DNA-fragment som er et operabelt regulatorisk område av 5'-AOXl-genet tilnærmet én kilobase langt, isolert fra Pichia pastoris operabelt forbundet med b) et strukturelt gen for HIV 24 kDa <g> a <g-> proteinet operabelt forbundet med c) 3 <1-> endesekvensen av A0X1 isolert fra Pichia pastoris ligatisert til d) minst ett markørgen som er HIS4 isolert fra Pichia pastoris ligatisert til e) et annet innsettbart DNA-fragment som er tilnærmet 0,65 kilobaser av 3'-AOXl-endesekvensen.

7. Metylotrof gjær transformert med en vektor som angitt i et av kravene 5-6.

8. Metylotrof gjær som angitt i krav 7, karakterisert ved at gjæren er Pichia pastoris, særlig hvor gjæren er Pichia pastoris stamme GS115, spesielt hvor den nevnte GS115 er transformert med minst én lineær integrativ setespesifikk vektor som er et seriearrangement av a) et første innsettbart DNA-fragment b) minst ett markørgen og minst én Pichia-forenlig ekspresjonskassett inneholdende et strukturelt gen for HIV 24 kDa <q> aa-proteinet, operabelt forbundet med c) en 3'-endesekvens valgt fra gruppen bestående av 3'-endesekvens isolert fra AOXl-gen, p40-gen, DHAS-gen og HIS4-gen isolert fra Pichia pastoris, d) et annet innsettbart DNA-fragment, idet rekkefølgen av markørgenet og kassetten i komponent (b) kan byttes om.

9. Pichia pastoris G-GAG44.

10. Pichia pastoris GS115 transformert som angitt i krav 8, karakterisert ved at GS115 er transformert med mer enn én kopi av den nevnte lineære integrative setespesifikke vektor.