NO302301B1

NO302301B1 - Fremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk aktivt HSA fra en metylotrof gjær av slekten Pichia, samt ekspresjonsvektorer og gjærstammer deri

Info

Publication number: NO302301B1
Application number: NO891716A
Authority: NO
Inventors: Farhad Marashi; Ricky Ngok-Shun Wong; Motohiro Fuke; Frances Maria Davis; William Richard Mccombie; Karen Marie Vineyard; Robert Dean Barr; Kathryn Ann Parker; Kotikanyadan Sreekrishna
Original assignee: Res Corp Technologies Inc
Priority date: 1988-04-25
Filing date: 1989-04-25
Publication date: 1998-02-16
Also published as: DK199589A; IE891348L; DK199589D0; DK175792B1; NO891716L; MX26714A; JPH02104290A; EP0344459B1; EP0344459A2; CA1328838C; KR970002914B1; EP0771871A3; EP0344459A3; EP0771871A2; IL89992A0; ATE159297T1; NO891716D0; KR890016176A; IE81153B1; AU605691B2

Description

Oppfinnelsen angår området rekombinant-DNA-bioteknologi, mer spesielt en fremgangsmåte til ekspresjon av humant serumalbumin (HSA) i metylotrofe gjærsorter, ekspresjonsvektor og gjærstammer transformert med denne.

Humant serumalbumin er det mest utbredte plasmaprotein hos voksne. Konsentrasjonen av albumin er 40 mg/ml, eller 160 g albumin som sirkulerer gjennom det menneskelige legeme for en voksen mann på 70 kg. Dette protein opprettholder osmotisk trykk og funksjonerer i bindingen og transporten av kobber, nikkel, kalsium (svakt, ved 2-3 bindingsseter), bilirubin og protoporfyrin, langkjedede fettsyrer, prostaglandiner, steroide hormoner (svak binding med disse hormoner fremmer deres overføring gjennom membranene), tyroksin, trijodotyronin, cystin og glutation. I henhold til Peters et al. blir over 10 000 kg renset albumin formidlet hvert år bare i USA til pasienter med kretsløpfeil eller for lite albumin i systemet.

For tiden er den eneste kommersielle kilde til HSA fra fraksjonalisert blod. I betraktning av de mulige farer forbundet med blodbårede forurensninger og patogener ville det være et betraktelig bidrag til den industrielle produksjon av HSA å utvikle alternative metoder til fremstilling av HSA. Med rekombinant-DNA-bioteknologi er det nå mulig å fremstille HSA ved alternative metoder.

Uheldigvis, skjønt HSA er blitt produsert i E. coli-celler, er der betydelige ulemper ved fremstilling av HSA i denne vert. For eksempel produserer E. coli endotoksiner som må fjernes ved kostbare rensetrinn.

Det ville således være et betydelig bidrag til faget å utvikle en fremgangsmåte til fremstilling av HSA.

Det er derfor en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en fremgangsmåte til forbedret produksjon av HSA.

En ytterligere hensikt med oppfinnelsen er å skaffe nye metylotrofe gjærsorter transformert med en vektor eller vektorer som kan fremme produksjonen av HSA.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det funnet en fremgangsmåte til fremstilling av HSA, som omfatter å transformere en metylotrof gjær med minst én vektor som har en forenlig ekspresjonskassett inneholdende et strukturelt gen for HSA derav og dyrking av de resulterende transformanter under betingelser som er egnet for å oppnå produksjon av HSA og en ny nukleotidsekvens som koder for

HSA.

Fig. 1 er en representasjon av plasmid pA0804 som inneholder en lineær integrativ setespesifikk vektor i fragmentet i retning med urviseren fra Bglll til Bglll. Det strukturelle gen kan innsettes i det unike EcoRI-sete av dette plasmid. Denne plasmid kan utvinnes fra plasmid-DNA av NRRL B-18114 ved en EcoRI-fordøyelse og gelelektroforese for å utvinne et lineært + 7,4 kb EcoRI-fragment svarende til fig. 1.

Fig. 2(a) viser et lineært kart av pA0804.

Fig. 2(b) viser et lineært kart av pA0807, et derivat av pA0804 inneholdende et fl-ori på tilnærmet 458 basepar. Fig. 2(c) viser et lineært kart av pA0807N som har Notl-seter innsatt istedenfor Bglll-setene av pA0807. Fig. 2(d) viser et lineært kart av pHSAl 13 som er et lineært kart av pA0807N med et HSA-gen innsatt i det unike EcoRI-sete.

Fig. 3 er en representasjon av pA0807N i sirkulær form.

Fig. 4 er en representasjon av plasmid pTHFK=}= et autonomt gjærplasmid-DNA av NRRL B-18115 ved en EcoRI-fordøyelsesgelelektroforese og utvinning av 6,2 kb EcoRI-fragmentet. Fig. 5 er en representasjon av pHSA13, som er et derivat av pTHFK4= inneholdende et HSA-gen innsatt i det unike EcoRI-sete i pTHFK=|=.

De HSA strukturelle gener er blitt sekvensert av Lawn et al. Nucl. Acids. Res. 9:6105 (1981), Dugaiczyk et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:71 (1982).

Dette gen kan fas ved reisolering av genet ved teknikken i henhold til Lawn et al., Dugaiczyk et al. eller som beskrevet i eksempel I eller syntetisert in vitro av en bestillingsgen-fabrikant såsom British Biotechnology, Ltd. En mulig fremgangsmåte til oppnåelse av HSA-genet ville være å "screene" et lever-cDNA-bibliotek med oligonukleotidprober og valgfritt med immunosorterende positive plaques for det HSA strukturelle gen. Ved utførelse av denne type isolasjonsplan ble det isolert et HSA-gen som hadde den nukleotidsekvens som vist i tabell 1.

Nukleotidsekvensen vist i tabell 1 ble oppnådd ved sekvensering av det isolerte HSA-DNA som kan utføres ved en hvilken som helst egnet teknikk såsom dideoksynukleotid-kjedeavslutningsmetoden i henhold til Sanger et al., PNAS 74, 5463 (1977), eller ved subkloning under anvendelse av M13-derivater, sekvensering slik det er beskrevet av Sanger et al., J. Mol. Biol. 142, 1617 (1980).

Denne sekvens er en ny nukleotidsekvens sammenlignet med de sekvenser som er publisert av Lawn et al. og Dugaiczyk et al. En sammenligning mellom nukleotidsekvensene er vist i tabell 2.

Kilder: 1) Lawn et al, 2) Dugaiczyk et al., cDNA, 3) Dugaiczyk et al., genomisk

DNA, 4) tksempel I. ~

Når det strukturelle gen for HSA er utvunnet, kan det først være nødvendig å innsette det strukturelle gen i en vektor og en forenlig vertscellelinje for å formere genet eller for ytterligere å skreddersy genet og lignende.

Dyrking av verten kan utføres ved hvilke som helst egnede fremgangsmåter. Generelle teknikker for dyrking av verter er allerede kjent i faget og en hvilken som helst tilpasning av disse fremgangsmåter til de spesielle behov for stammen som her benyttes, ligger godt innenfor fagfolks evner.

Utvinning av plasmid DNA fra verter kan oppnås ved forskjellige teknikker på grunn av dets kompakte størrelse og lukkede sirkulære superspiralform. For eksempel, etter høsting kan vertsceller pelleteres ved sentrifugering og deretter resuspenderes og lyseres. Lysatet bør sentrifugeres for å fjerne celleavfall og supernatanten inneholdende DNA bevares. En fenolekstraksjon kan deretter utføres for å fjerne de fleste andre forurensninger fra DNA. Det fenolekstraherte DNA kan deretter ytterligere behandles ved bruk av en densitetgradientsentrifugering eller en gelfiltreringsteknikk for å separere det plasmide DNA fra det bakterielle DNA. De teknikker for oppnåelse av separasjonen som er antydet ovenfor, er velkjente i faget, og en rekke forskjellige metoder for utførelse av disse teknikker er kjent.

Nukleasefordøyelse av plasmidene kan utføres ved valg av riktige endonukleaser som vil kutte det valgte plasmid på en slik måte at det letter utvinningen av det HSA strukturelle gen. De endonukleaser som benyttes, vil avhenge av det plasmid som HSA-genet skal kuttes fra.

Gelelektroforese av DNA kan utføres ved bruk av en rekke forskjellige teknikker. Se P. G. Sealy og E. M. Southern, Gel Electrophoresis of Nucleic Acids - A Practical Approach (D. Rickwood og B. D. Hames, eds.) p. 39 (1982). Eluering kan også utføres ved bruk av en rekke forskjellige teknikker som passer for den gel som er involvert, såsom elektroeluering, diffusjon, geloppløsning (agarosegeler) eller fysisk ekstrudering (agarosegeler). Man innser dessuten at eluering ikke behøver å være nødvendig med visse geler såsom høykvalitets-agarose som smelter ved lav temperatur.

Straks det fragment som inneholder det HSA strukturelle gen eller fragmenter derav er isolert, kan ytterligere manipuleringer være nødvendige før det innsettes i vektoren. Disse manipuleringer kan innbefatte, men er ikke begrenset til at linkere tilføyes eller at fragmentet gis butte ender.

Etter isoleringen av det HSA strukturelle gen blir genet innsatt i en egnet metylotrof gjærvektor såsom et plasmid eller lineær setespesifikk integrativ vektor. Foretrukne vektorer for utførelse av oppfinnelsen er de som er forenlige med Pichia-slekten og helst Pichia pastoris.

Plasmider har lenge vært et av de grunnleggende elementer som anvendes i rekombinant DNA-teknologi. Plasmider er sirkulært ekstrakromosomalt, dobbelttrådet DNA som finnes i mikroorganismer. Plasmider er funnet å opptre i enkelte eller flere kopier pr. celle. Innbefattet i plasmid-DNA er den informasjon som er nødvendig for plasmid reproduksjon, dvs. en autonom replikasjonssekvens såsom den som er beskrevet av Cregg i europapatentsøknad nr. 0180899. En eller flere måter til fenotypisk selektering av plasmidet i transformerte celler kan også være inkludert i den informasjon som er kodet i plasmidet. Fenotypiske eller seleksjonsmarkører såsom antibiotiske resistensgener eller gener som komplementerer defekter i vertens biokjemiske veier, tillater kloner av vertscellene som er blitt transformert å gjenkjennes, selekteres og opprettholdes.

For å uttrykke det HSA strukturelle gen i metylotrof gjær må genet være operabelt forbundet med et 5'-regulatorisk område og 3'-endesekvens som danner den ekspresjonskassett som skal innsettes i verten via en vektor.

De følgende uttrykk er her definert for klarhets skyld.

Operabelt forbundet - betegner en sammenstilling hvor komponentene er satt sammen slik at de utfører sin funksjon.

Regulatorisk område - DNA-sekvenser som reagerer på forskjellige stimulanser og virker inn på hastigheten av mRNA-transkripsjon.

3-endesekvens - sekvensene 3' til stoppkodonet som har som funksjon å stabilisere mRNA såsom sekvenser som frembringer polyadenylering.

"Pichia-forenlig" - betegner DNA-sekvenser som vil utføre deres normale funksjon i Pichia såsom regulatoriske områder og 3-endesekvenser avledet fra Pichia.

Integrative vektorer, såsom den lineære setespesifikke integrative vektor i henhold til Cregg, som beskrevet i europeisk patentsøknad nr. 86114700.7. Slike vektorer omfatter en i serie arrangert rekkefølge av minst 1) et første innsettbart DNA-fragment, 2) et selekterbart markørgen og 3) et annet innsettbart DNA-fragment kan også anvendes for utførelse av oppfinnelsen.

Det første og annet innsettbare DNA-fragment er hvert minst ca. 200 nukleotider langt og har nukleotidsekvenser som er homologe med partier av det genomiske DNA av de arter som skal transformeres. De forskjellige komponenter av den integrative vektor er arrangert i serie for dannelse av et lineært fragment av DNA slik at ekspresjonskassetten og det selekterbare markørgen er anordnet mellom 3'-enden av det første innsettbare DNA-fragment og 5-enden av det annet innsettbare DNA-fragment. De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert med hensyn til hinannen i det i rekkefølge arrangerte lineære fragment på samme måte som de er orientert i opprinnelses-genomet.

Nukleotidsekvenser som er nyttige som de første og andre innsettbare DNA-fragmenter er nukleotidsekvenser som er homologe med separate partier av det native genomiske sete hvor genomisk modifikasjon skal finne sted. For eksempel, dersom genomisk modifikasjon skal finne sted ved lokuset av alkoholoksidasegenet, vil de første og andre innsettbare DNA-fragmenter som anvendes, være homologe med separate partier av alkoholoksidasegen-lokuset. For at genomisk modifikasjon i henhold til den foreliggende oppfinnelse skal finne sted, må de to innsettbare DNA-fragmenter være orientert med hensyn til hinannen i det lineære fragment med samme relative orientering som de eksisterer i opprinnelsesgenomet. Eksempler på nukleotidsekvenser som kan anvendes som første og andre innsettbare DNA-fragmenter, er nukleotidsekvenser valgt fra gruppen bestående av alkoholoksidasegenet (AOX1), dihydroksyacetonsyntasegenet (DHAS), p40-genet og HIS4-genet. AOX1-genet, DHAS-genet, p40-genet og HIS4-genet er angitt i EP-A-0 183 071.

Det første innsettbare DNA-fragment kan inneholde et operabelt regulatorisk område som kan omfatte det regulatoriske område som anvendes i ekspresjonskassetten. Bruken av det første innsettbare DNA-fragment som det regulatoriske område for en ekspresjonskassett, er en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen. Fig. 1 viser et diagram av en vektor som anvender det første innsettbare DNA-fragment som et regulatorisk område for en kassett.

Valgfritt, som vist på fig. 1, kan et innskuddssete eller -seter og en 3'-endesekvens anordnes i umiddelbar nærhet av 3' i forhold til det første innsettbare DNA-fragment. Denne konformasjon av den lineære setespesifikke integrative vektor har den ytterligere fordel at det skaffer et ferdig sete for innsetting av et strukturelt gen uten at det nødvendiggjør tilføyelsen av en forenlig 3'-endesekvens.

Dessuten kan de ekspresjonsvektorer som anvendes ved utførelse av oppfinnelsen, inneholde et polylinkersete for å lette innsettingen av strukturelle gener eller kassetter eller lignende, mellom det første innsettbare DNA-fragment og det annet innsettbare DNA-fragment, eller det regulatoriske område og endesekvensen som vist på fig. 4.

Det er også nødvendig å innlemme minst ett selekterbart markørgen i det DNA som anvendes til å transformere vertsstammen. Dette letter seleksjonen og isolasjonen av de organismer som har innlemmet det transformerende DNA. Markørgenet meddeler den transformerte organisme et fenotypisk trekk som verten ikke hadde, f.eks. gjenopprettelse av evnen til å produsere en spesiell aminosyre hvor den utransformerte vertsstamme har en defekt i den spesielle aminosyre-biosyntetiske vei eller resistens overfor antibiotika og lignende.

Eksempler på selekterbare markørgener kan velges fra gruppen bestående av HIS4-genet og ARG4-genet fra Pichia pastoris og Saccharomyces cerevisiae, invertasegenet (SUC2) fra Saccharomyces cerevisiae, eller G418<R->kanamycinresistensgenet fra de E. coli-transposable elementer Tn601 eller Tn903.

Fagfolk vil innse at ytterligere DNA-sekvenser også kan innlemmes i de vektorer som anvendes i utførelsen av den følgende oppfinnelse, som f.eks. bakterielt plasmid-DNA, bakteriofag-DNA og lignende. Slike sekvenser tillater amplifikasjonen og opprettholdelsen av disse vektorer i bakterieverter.

Dersom det første innsettbare DNA-fragment ikke inneholder et regulatorisk område, må et egnet regulatorisk område innsettes operabelt forbundet med det strukturelle gen for å skaffe en operabel ekspresjonskassett. På lignende måte, dersom ingen 3'-endesekvens er skaffet ved innsettingssetet for å fullføre ekspresjonskassetten, må en 3'-endesekvens forbindes operabelt med det strukturelle gen som skal innsettes.

Fagfolk er klar over en rekke forskjellige regulatoriske områder som er blittkarakterisertog som kan anvendes i forbindelse med metylotrofe gjærsorter. Eksempler på regulatoriske områder omfatter, men er ikke begrenset til gjær-regulatoriske områder valgt fra gruppen bestående av sur fosfatase, galaktokinase, alkoholdehydrogenase, cytokrom c, alfaparingsfaktor og glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase regulatoriske områder isolert fra Saccharomyces cerevisiae, det primære alkoholoksidase (AOX1), dihydroksyacetonsyntase (DHAS), de p40-regulatoriske områder og det HIS4-regulatoriske område som fås fra Pichia pastoris og lignende. For tiden foretrukne regulatoriske områder som anvendes til utførelse av oppfinnelsen, er de som er kjennetegnet ved deres evne til å reagere på metanolholdige medier såsom regulatoriske områder valgt fra gruppen bestående av AOX1, DHAS, p40 og som er angitt i søknad nr. EP-A-0 183 071.

Det mest foretrukkede regulatoriske område for utførelse av oppfinnelsen er det AOX1 regulatoriske område.

3'-endesekvenser kan anvendes i ekspresjonskassetten eller være en del av vektoren som beskrevet ovenfor. 3'-endesekvenser kan tjene til å avslutte, polyadenylere og/eller stabilisere det messenger-RNA som kodes for ved det strukturelle gen når det er operabelt forbundet til et gen. Noen eksempler på illustrative kilder for 3'-

endesekvensene for utførelse av oppfinnelsen omfatter, men er ikke begrenset til Saccharomyces cerevisiae-, Hansenula polymorpha- og Pichia 3'-endesekvensene. De som fås fra Pichia pastoris foretrekkes, såsom de som er valgt fra gruppen bestående av 3-endesekvensene av AOX1 -genet, DHAS-genet, p40-genet og HIS4-genet. Særlig foretrukket er 3'-endesekvensen av AOXl-genet.

For utførelse av den foreliggende oppfinnelse kan enten lineære setespesifikke vektorer såsom Bglll-fragmentene av de konstruerte stykker vist på fig. 1 og 2 eller plasmider såsom de som er vist på fig. 4 anvendes.

Innsettingen av det HSA strukturelle gen i egnede vektorer kan oppnås ved en hvilken som helst egnet teknikk som kløyver den valgte vektor ved et passende sete eller seter og fører til at minst én operabel ekspresjonskassett inneholdende det HSA strukturelle gen foreligger i vektoren.

Ligering av HSA strukturelt gen kan oppnås ved en hvilken som helst passende ligeringsteknikk såsom anvendelse av T4 DNA-ligase.

Den opprinnelige seleksjon, formering og valgfritt amplifikasjon av ligeringsblandingen av det HSA strukturelle gen og en vektor blir fortrinnsvis utført ved transformasjon av blandingen inn i en bakterievert såsom E. coli (skjønt ligeringsblandingen kunne transformeres direkte inn i en gjærvert). Egnede transformasjonsteknikker for E. coli er velkjent i faget. Dessuten er seleksjonsmarkører og bakterielle opprinnelsessteder for replikasjon som er nødvendige for opprettholdelsen av en vektor i en bakterievert, også velkjent i faget.

Isolasjonen og/eller rensingen av det ønskede plasmid som inneholder det HSA strukturélle gen i et ekspresjonssystem, kan utføres ved en hvilken som helst egnet fremgangsmåte for separasjon av plasmid-DNA fra verts-DNA.

På samme måte kan vektorer som dannes ved ligering utprøves fortrinnsvis etter formering for å bekrefte nærværet av HSA-genet og dets operable binding til et regulatorisk område og en 3'-endesekvens. Dette kan oppnås ved en rekke forskjellige teknikker som innbefatter, men ikke er begrenset til endonukle-asefordøyelse, gelelektroforese eller endonukleasefordøyelse/Southern hybridisering.

Transformasjon av plasmider eller lineære vektorer inn i gjærverter kan utføres ved egnede transformasjonsteknikker som omfatter, men ikke er begrenset til de som er vist av Hinnen et al, Proe. Nati. Acad. Sei. 75, (1978) 1929; Ito et al, J. Bacteriol 153, (1983) 163; Cregg et al Mol. Cell Biol. 5 (1985) p. 3376 eller Sreekrishna et al, Gene. 59 (1987) p. 115. For utførelse av den foreliggende oppfinnelse foretrekkes transformasjonsteknikken i henhold til Cregg. Det er ønskelig for utførelse av oppfinnelsen å benytte et overskudd av lineære vektorer og selektere for multiple innsetninger ved Southern hybridisering.

Gjærverten for transformasjon kan være en hvilken som helst egnet metylotrof gjær. Metylotrofe gjærsorter innbefatter, men er ikke begrenset til gjær som kan vokse på metanol valgt fra slektene Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis og Rhodotorula. En liste over spesielle arter som er eksempler på denne klasse gjær, finnes i C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs. 269 (1982). For tiden foretrekkes metylotrofe gjærsorter av slekten Pichia såsom den auxotrofe Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851). Auxotrofe metylotrofe gjærsorter er også fordelaktige for utførelse av oppfinnelsen på grunn av at de lett kan selekteres. Det innses at vill type metylotrofe gjærstammer kan anvendes med like stort hell dersom et egnet transformerende markørgen velges såsom bruken av SUC2 til å transformere Pichia pastoris til en stamme som kan vokse på sakkarose, eller dersom en antibiotisk resistens-markør anvendes såsom G418.

Transformerte metylotrofe gjærceller kan selekteres for ved anvendelse av riktige

teknikker som innbefatter, men ikke er begrenset til dyrking av tidligere auxotrofe celler etter transformasjon i fravær av et biokjemisk produkt som er nødvendig (på grunn av cellens auxotrofi), seleksjon for og påvisning av en ny fenotype ("metanol langsom") eller dyrking i nærvær av et antibiotikum som er giftig for gjæren i fravær av et resistensgen som inneholdes i transformanten.

Isolerte, transformerte, metylotrofe gjærceller dyrkes ved riktige fermenteringsteknikker såsom ristekolbefermentering, høytetthets-fermentering eller den teknikk som er angitt av Cregg et al, High- Level Expression and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic Yeast. Pichia Pastoris. 5 Bio/Technology 479 (1987).

Eksempler

Generell informasjon som angår eksemplene:

Stammer

PichiaPastoris GS115 (his4) [NRRL Y-15851 ] 'Pichia pastoris

KW71 (his4 aoxl:ARG4)

E. coli YHC9 (F~ k~ endoAI hsds 17

SUPE44 thi 1)

benyttet for alle plasmid-konstruksjoner og preparater.

E. coli DH5«F'- ((F', endAl hsd Rl7 (r"k>mk<+>)

Sup E 44, thi-1, k recAl,

<\>gy£A96, rel Al', 680dlac E-AM15', A( lac2YAargF)Ul69]

E. coli JW107' . endAl, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, reJLAl, traD36 CrK". m./) A(lae proA^/F'-, proA.B, l aclq ZAH15.

£. coli ,Y1088 [ (ATCG nr.37195); Al a cU 169 supE supF hsdR~ hsdM<1>" metB trpR

* tooA21 proC::Tn5 (pHC9). pMC9=pBR322-lacIQ]

ble brukt for amplifikasjonen av biblioteket for DNA-isolasjon og fremstilling av plaque-rensede fagutgangsmaterialer.

E. coli Y1090 [ATCC njrsr 37197); AlacUl69 proA± Aloa araD139 strA supF trpC22::TrilO (pMC9)]

ble benyttet som vert for alle immunologiske plaque-sorteringer, og etterfølgende sorteringer med forskjellige oligonukleotidprober.

Buffere, oppløsninger og medier

De buffere, oppløsninger og medier som ble anvendt i de følgende eksempler, hadde de sammensetninger som er angitt nedenfor:

Media, pr. liter

LB + amp 10 g gjærekstrakt

20 g trypton lOgNaCl

juster til pH 7,5 med 5 M NaOH 100 mg ampicillin

LB 10 g gjærekstrakt

20 g trypton lOgNaCl

juster til pH 7,5 med 5 M NaOH

MGY 13,4 g YNB uten aminosyrer 400 ug biotin

10 g glukose

10 ml glycerol

MM 13,4 g YNB uten aminosyrer 400 ug biotin

5 ml metanol

LB agarplate 1-2% agar i LB

LB toppagar 0,8% agar i LB

toppagarose 0,8% agarose i LB

LBM LB + 10mMMgSO4

LBM/AMP LBM + 50 ug/ml ampicillin

H-toppagar 16 g Bacto-trypton

10 g Bacto-gjærekstrakt

5 gNaCli 1 liter H20

SM 5,8gNaCl 2gMgS04-7H20 50 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5

5 ml 2% gelatin

SDR, Hiter 13,4 g YNB

400 ug biotin

182gSorbitol

10 g dekstrose

10 g agar

50 mg hver av glutamin, metionin, lysin, leucin og isoleucin 2 g histidin-analyseblanding SDHR, 1 liter SDR + 40 mg histidin

Buffere og oppløsninger

TE- buffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)

1 mM EDTA (pH 8,0)

Buffer med høyt saltinnhold: 50 mM Tris-HCl, pH 8,0

10mMMgCl2lOOmMNaCl Restriksjonsfordøyelsesbuffere: HS-buffer: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2

100 mM NaCl og 1 mM ditiotreitol

MS-buffer: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2

50 mM NaCl og 1 mM ditiotreitol

LS-buffer: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2

og 1 mM ditiotreitol

Ligeringsbuffer:

50 mM Tris-HCl (pH 7,4)

10mMMgCl2

10 mM ditiotreitol

1 mM ATP og

100 ug/ml BSA

" Nicktranslasjons" buffer ( NT):

50 mM Tris-HCl (pH 7,2)

10mMMgSO4

0,1 mM ditiotreitol og 1 mM EDTA

Fosfatasebuffer:

50 mM Tris-HCl (pH 9,0)

1 mM MgCl2

1 mM ZnCl2og

1 mM spermidin

Kinasebuffer:

50 mM Tris-HCl (pH 7,6)

10mMMgCl2

5 mM ditiotreitol 0,1 mM EDTA og 0,1 mM spermidin

Na2C0 2/ NaHCOrbuffer:

0,015 MNa2C030,035 MNaHC03

Blottobuffer:

50 g ikke-fet tørrmelk

1 g timerosal

100 fil antiskum-A (Sigma) 0,5 ml Tween 20 i IX D-PBS (11) (Dulbeccos fosfat-buffret saline, Gibco)

TBS. IX 150 mM NaCl

10 mM Tris-HCl, pH 7,5

TB ST IX TBS

0,05% Tween 20

CaS 1 M sorbitol 10mMCaCl2

10 mM Tris-HCl, pH 7,5

filtersteriliser

Eksempel I

Isolering av HSA- cDNA

Et humant lever ngtl 1-cDNA ekspresjonsbibliotek (parti nr. 2102) ble innkjøpt fra Clontech Laboratories, Inc. Dette bibliotek hadde en titer på 9 x IO9 fag pr. ml og var sammensatt av 5,5 x IO5 uavhengige, klare plaque-fagisolater med en anslått innskuddsstørrelse i området 0,15-1,8 kilobasepar.

En porsjon som representerte 4 x 10<5>uavhengige fagisolater ble sortert for dem som inneholdt nukleotidsekvenser som var komplementære med probe nr. 1. Probe nr. 1 er et 19 bp-oligonukleotid (vist i trinn 5 nedenunder) som inkluderer kodonene for de første seks aminosyrer av den modne, sekreterte form av humant serumalbumin. Sortering ble utført som følger.

Trinn 1. E. coli-transfeksjon

E. coli Y1088, ATCC nr. 37195 ble suspendert i flytende medium LBD sammensatt av LB-næringsvæske [5,0 g/l gjærekstrakt (Difco), 10,0 g/l trypton (Difco), 5,0 g/l natriumklorid] supplert med 0,2% D-glukose. En 50 ul porsjon av denne suspensjon ble spredt over et fast vekstmedium sammensatt av 1,2% Agar Noble (Difco) i LB inneholdende 50 (ag/ml ampicillin (LB+Amp). Bakteriekolonier ble tillatt å vokse over natten ved 37°C. Noen få kolonier ble overført til 10 ml av LB-Amp medium og ble inkubert ved 30°C i en roterende ristemaskin innstilt på 250 omdr./min for å oppnå en over natten-kultur som kunne anvendes til sortering av biblioteket.

En porsjon av ngtl 1-cDNA ekspresjonsbiblioteket ble fortynnet hundre ganger i SM-buffer [(50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 8,1 mM MgS04, 0,01% (w/v) gelatin]. 4,4 (il ble blandet med 4,0 ml av over natten-kulturen av E. coli Y1088, og blandingen ble inkubert ved 30°C i 20 min. 0,2 ml porsjoner ble satt til 2,5 ml bløtt agarmedium opprettholdt på 55°C [(0,7% Agar Noble (Difco) i LB) og ble spredt jevnt over bunnagaren (LB inneholdende 1,2% Agar Noble) i en petriskål med en diameter på 90 mm. Etter 10 min ved værelsetemperatur ble platene anbragt i en inkubator innstilt på 43 °C. Fagplaquene ble tillatt å komme frem, men ikke bli sammenflytende (vanligvis 4-6 h).

Trinn 2. Filterløft

Toppagar-holdige plaques ble overdekket med S&S nitrocellulosefiltre (0,45 um porestørrelse og 82 mm i diameter). Filtrene på agaren ble stukket hull på på fem steder med en injeksjonsnål, kaliber 18, inneholdende tusj for å bidra til å orientere filtrene på et senere stadium. Etter 1 min ble filtrene overført med plaque-siden opp på 3MM Whatman filterpapir mettet med 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH. Etter 2 min ble filtrene blottet fra bunnsiden og overført til et annet 3MM Whatman filterpapir mettet med nøytraliserende oppløsning (1,0 M Tris-HCl, pH 8,0, 1,5 M NaCl). Etter 8 min nøytralisering ble filtrene renset i 6XSSC (0,9 M NaCl, 90 mM natriumcitrat, pH 7,0). Filtrene ble blottet tørre og ble bakt i 2 h ved 80°C i en vakuumovn.

Trinn 3. Prehybridisering og hybridisering med nr. 1 probe og autoradiografi

De plaques som inneholdt cDNA for humant serumalbumin, ble identifisert ved hybridisering av deres DNA med radioaktivt merkede oligonukleotider som ble selektert for deres nukleotidsekvens komplementært med humant serumalbumin-cDNA, men ikke komplementært med hverken bakterielt DNA eller transformerende vektor-DNA.

A. Fremstilling av merkede oligonukJeotid-prober

Radioaktive oligonukleotid-prober ble fremstilt ved blanding av tilnærmet 100 ng av et gitt oligonukleotid med 100 uCi av [ "<32>P]ATP i 10 ul av en buffer inneholdende 70 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 1,0 mM KC1, 5,0 mM ditiotreitol, 1,0 mM spermidin. Ti enheter av T4 polynukleotidkinase ble satt til og blandingen ble inkubert ved 37°C i 30 min. Enzymet ble inaktivert ved en 5 min's inkubasjon ved 65°C, og det merkede oligonukleotid ble satt til hybridiseringsoppløsningen uten noen rensing fra reaksjonsblandingen.

B. Prehybridisering

Filterløftene inneholdende fag-DNA ble inkubert i 3-16 h i en oppløsning sammensatt av 0,9 M NaCl, 6,0 mM Na2EDTA, 19,8 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1% Ficoll, O,l%polyvinylpyrrolidon, 0,1% bovinserumalbumin, 0,1% SDS og 10% Dextran-sulfat. Temperaturen ved inkubasjonen var 37°C. 10 ml oppløsning ble brukt pr. filter.

C. Hybridisering

De prehybridiserte filtre ble hybridisert i den samme oppløsning som prehy-bridiseringen, men inneholdende radioaktivt merket oligonukleotid nr. 1 med en konsentrasjon på 2 ng/ml. Inkubasjonen var i 20-48 h ved 37°C med anvendelse av 2 ml oppløsning pr. filter.

D. Vasking

Filtrene ble vasket fire ganger (20 min pr. vask) ved værelsetemperatur i 0,9 M NaCl, 90 mM natriumcitrat (pH 7,0) og en gang ved 45°C (1 h) i den samme buffer, men inneholdende 0,1% SDS. 10 ml volumer av oppløsninger ble benyttet for vasking av hvert filter.

E. Autoradiografi

Filtrene ble lufttørket og plassert i en røntgenfilm-eksponeringskassett i nær tilslutning til en røntgenfilm (Kodak XAR-2 eller XAR-5). Kassetter ble inkubert ved -80°C i 20-48 h.

Trinn 4. Immunosortering for HSA-protein positive plaques.

Kloningssetet i ngtl 1-vektoren var innenfor 6-galaktosidase kodingsområdene. Da IPTG (isopropyl-6-D-tiogalaktosid) induserer ekspresjon av 6-galaktosidasegenet i ngtl 1-vektoren, kan det også benyttes til å indusere ekspresjon av gener som er klonet i-ramme med hensyn til B-galaktosidase og produsere 6-galaktosidase-fusjonsproteiner. Derfor skulle hele eller partielle HSA-gener i-ramme og i den riktige orientering gi immunoreaktivt materiale. E. coli-stammen Y1090 ATCC nr. 37197 ble brukt for deteksjon av HSA ekspresjon-positive plaques. Infeksjon med fag og platedannende fremgangsmåter var som beskrevet ovenfor for E. coli-stammen Yl088. Etter at plaquene var tilnærmet 1 mm i diameter, ble nitrocellulosefiltre som tidligere var blitt bløtet i 10 mM (IPTG) og tørket, plassert på toppagaren. Plater ble inkubert ved 43°C i 4-6 h. Filtrene ble deretter fjernet fra platene og neddykket i en blokkingsoppløsning bestående av 1% gelatin, 0,05% Brij 58 i TBST. Filtrene ble inkubert ved værelsetemperatur med forsiktig vugging i 0,5-16 h. Når det var ønskelig med plaqueløft fra de samme plater for hybridisering med oligonukleotider, ble platene returnert til 43°C-inkubatoren i 2 h før overdekning av nitrocellulosefiltrene.

IPTG-filtrene ble fjernet fra blokkingsoppløsningen og plaques som uttrykte immunoreaktivt HSA ble identifisert ved bruk av en 1:1000 fortynning av gjet-anti-HSA (nefelometrisk kvalitet, Atlantic Antibodies, katalognr. 001-11, Scarborough, ME) i blokkingsoppløsning. Etter inkubasjon i 1 h ved værelsetemperatur ble filtrene vasket fem ganger i TBST i 10 min pr. vask. Alle inkubasjoner og vaskinger ble utført med forsiktig vugging. Binding av anti-HSA-antistoffer ble detektert ved inkubasjon med en 1:1000 fortynning (0,5 ug/ml) av alkalisk fosfatase-konjugert kanin-antigen IgG (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) i blokkingoppløsning i 1 h ved værelsetemperatur. Etter vasking som angitt ovenfor ble filtrene inkubert i fosfatase-substratsystemet sammensatt av nitroblå-tetrazolium og 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (Kirkegaard and Perry Laboratories) i 0,1 M Tris-buffer i 10-30 min ved værelsetemperatur. Et stabilt blåviolett bunnfall ble avsatt på reaksjonsstedet i membranen. Reaksjonen ble stanset ved vasking av filtrene i vann, og filtrene ble tørket i luft.

I noen eksperimenter ble<1>25I-protein G anvendt til identifisering av positive plaques. I dette tilfelle ble filtrene inkubert i 4 h i en oppløsning av TBS (TBST uten Tween-20) inneholdende 0,3 uCi av<125>I-protein G pr. ml, fulgt av inkubering med anti-HSA-antistoff og etterfølgende vaskinger som beskrevet ovenfor. Filtrene ble vasket to ganger i BTBS (TBS inneholdende 0,05% Brij 58) fulgt av to ytterligere vaskinger i TBS. Alle vaskinger ble utført ved 10 min's intervaller med forsiktig vugging ved værelsetemperatur. Autoradiografi ble utført som beskrevet ovenfor.

Trinn 5. Plaque-hybridisering med oligonukleotider nr. 2, nr. 3, Ml og M2

Rensede plaques ble sortert med de følgende oligonukleotider:

Nr. 1-proben hybridiserer til 19 nukleotider svarende til de første seks aminosyrer av det modne HSA-protein. Nr. 2-proben er komplementær til de nukleotider som svarer til aminosyrer nr. 281 til nr. 292 i det modne HSA-protein, og er på oppstrømsiden av et enkelt Pstl-restriksjonsendonuklease-sete innenfor HSA-cDNA-sekvensen. Nr. 3-proben kan benyttes til deteksjon av kloner som innbefatter nukleotider for aminosyrene nr. 565 til nr. 571 i det modne HSA-protein. De ovenfor angitte tre oligonukleotider ble valgt fordi der var ingen nukleotidvariasjoner i de publiserte HSA-cDNA-sekvenser innenfor disse områder.

Potensielle prober ble sortert for mangel av sekvenshomologi overfor de kjente sekvenser i ngtl 1-vektor og E. coli-DNA. Denne sortering var nødvendig for å redusere ikke-spesifikke hybridiseringsseter. Basert på denne analyse kunne man vente at proben M2 ville oppvise et lavt nivå av binding til vektorsekvenser. Da M2-proben innbefatter nukleotider som er komplementære med ti baser på oppstrømsiden av ATG-startkodonet, ville enhver klon som hybridiserer under stringente betingelser, ventes å inneholde alle eller de fleste av de ti baser og følgelig hele HSA-kodingssekvensen.

Eksempel II

Kloning av humant serumalbumin- cDNA inn i M13mpl8 for sekvensanalyse Trinn 1. Fremstilling av Ml3mp 18 kloningsvektor

M13mpl8 (New England Biolabs) replikativ form DNA (4 ug) ble fordøyd til fullstendighet med 40 enheter EcoRI i 50 ul buffer med høyt saltinnhold ved 37°C i 1 h. Den fordøyde prøve ble varmet ved 70°C i 5 min for å inaktivere enzymet. Kalvetarm alkalisk fosfatase (CIAP, én enhet) ble tilsatt og blandingen ble inkubert ved 50°C i 1 h. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 1/10 volum av 500 mM EDTA (pH 8). CIAP ble inaktivert ved oppvarming ved 65°C i 45 min. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med et like stort volum TE-mettet fenol fulgt av kloroformekstraksjon. Det lineariserte M13mpl8 i den vandige fase ble utfelt ved tilsetning av 3 volumer 3M natriumacetat og absolutt etanol-blanding (1:30, V/V). Blandingen ble inkubert ved -20° over natten. DNA ble utvunnet ved sentrifugering i 15 min ved 14 000 X g ved 4°C. Pelleten ble vakuumtørket og oppløst på nytt i 100 ul TE.

Trinn 2. Fremstilling av HSA cDNA-innskudd og ligering med M13mp 18-vektor

A. Fremstilling av høytiter platelysater

Rekombinante fager positive for antistoff- og oligonukleotid-"screeningene" som beskrevet i eksempel I ble amplifisert for fremstilling av fag-DNA. De platende celler ble fremstilt fra en overnatt-kultur av E. coli Yl 088 i 40 ml LBM+AMP. Celler ble høstet ved sentrifugering ved 3 000 X g i 15 min ved værelsetemperatur og pelleten ble resuspendert i 15-16 ml 10 mM MgS04. Individuelle plaques fra LB-plater (fremstilt som beskrevet i eksempel I) i form av agarplugger ble suspendert i 0,1 ml E. coli Yl088 platende celler. Etter å ha stått ved værelsetemperatur i 10 min ble 2,5 ml LBM og 2,5 ml LB-toppagar ved 55°C tilsatt. Blandingen ble helt på forvarmede (42°C) LB-agarplater. Etter ca. 10 min ved værelsetemperatur ble platene invertert og inkubert ved 42°C over natten. Neste dag ble fag-partiklene utvunnet ved oversvømming av platene med 3 ml SM. En dråpe kloroform ble tilsatt og røret ble svirret. Innholdet ble sentrifugert ved 4 000 X g i 10 min for å fjerne celleavfallet. Supernatanten (høytiter-lysat) ble lagret ved 4°C.

B. Titering av høytiter-Iysatet

1 ul og 10 ul porsjoner fra 10-<4->fortynningen av høytiter-Iysatet i SM ble blandet med 0,3 ml E. coli Y1088 platende celler. Etter inkubasjon ved 37°C i 10 min ble 3 ml LB-toppagar forvarmet ved 55°C tilsatt. Blandingen ble helt på LB-plater og inkubert ved 42°C over natten. Antallet plaque-dannende enheter (pfu) pr. ml lysat ble notert som titeret.

C. Fremstilling av fag-DNA ved platelysat-metoden

Ca. 10 pfu ble sådd ut som beskrevet ovenfor for titeringen med den unntagelse at 6 ml toppagarose ble anvendt i 150 mm diameter petriskålen. Etter sammenflytende lyse av de platende bakterier ble fagen ekstrahert fra toppagarose inn i SM. Fag-DNA ble deretter isolert fra supernatanten ved anvendelse av Lambdasorb Phage Adsorbant (Promega Biotec, Madison, WI) i henhold til den fremgangsmåte som var foreslått av fabrikanten.

D. Ligeringsreaksjon med M13mpl8

HSA-ngtl 1 rekombinant-DNA (4-5 ug) ble fordøyd med 20 enheter EcoPJ i 30 ul buffer med høyt saltinnhold i 3 h ved 37°C. Etter fordøyelse ble reaksjonsblandingen behandlet ytterligere som beskrevet i trinn 1. Den samlede blanding ble ligert ved anvendelse av T4-ligasen med den EcoRI-CIAP-behandlede M13mpl8. En typisk ligeringsreaksjon (sluttvolum 10 (il) inneholdt 4-5 jag samlet DNA og 0,8 ug M13mpl8 i 1 X ligasjonsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% (W/V) polyetylenglykol-8000). Ligering ble utført ved 15°C over natten ved anvendelse av 1-2 enheter T4 DNA-ligase.

Trinn 3. Transformasjon av kompetente celler

Porsjoner av ligeringsblandingen (1-5 ul) ble blandet med 300 ul E. coli JM107 kompetente celler [Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 154 (1970)] eller 100 ul E. coli DH5 a F frosne, kompetente celler (BRL) og holdt på is i 40 min. Opptak av DNA ble indusert ved varmesjokk ved 42°C i 2 min. De transformerte celler ble deretter returnert til is. En såblanding inneholdende 200 ul nylig fremstilt E. coli JM107 i eksponentiell fase, 40 ul X-gal i 2% dimetylformamid, 100 ul 10 mM IPTG og 3 ml H-toppagar ved 55°C ble tilsatt. Transformasjonsblandingen ble helt på LB-agarplater. Platene ble inkubert over natten ved 37°C for plaque-dannelse.

Trinn 4. Fremstilling av Ml3 ssDNA-templater og DNA-sekvensanalyse

Fargeløse plaques inneholdende rekombinant M13-fag ble plukket og amplifisert i E. coli JM107 i 1,5 ml 2XYT ved 37°C i 5-6 h med kraftig risting. Etter amplifikasjon ble kulturene spunnet ned ved 14 000 g i 1 min for å separere cellene fra supernatanten. Cellepelletene ble anvendt til fremstilling av den dobbelttrådede replikative form av Ml3, mens supernatantene ble anvendt for isolasjon av enkelttrådede DNA-templater. Ml3 ds RF ble isolert ved bruk av den alkaliske lysemetode i henhold til Birnboim and Doly, Nucl. Acids Research 7:1513 (1979). Ml3 ssDNA-templater ble isolert fra kultursupernatantene ved polyetylenglykol-utfelling og fenolekstraksjon. Kort fortalt ble 1 ml kultursupernatant blandet med 200 ul 20% polyetylenglykol-6000 i 2,5 M NaCl. Etter å ha etterlatt blandingen ved værelsetemperatur i 15 min, ble M13-fagpartiklene utvunnet ved sentrifugering ved 14 000 X g i 5 min. Fagpelleten ble resuspendert i 100 ul TE fulgt av ekstraksjon med buffermettet fenol. Den vandige fase inneholdende Ml3 ssDNA ble blandet med 3 volumer natriumacetat- og etanol-blanding. Etter avkjøling ved

-20°C over natten ble DNA-utfellingen utvunnet ved sentrifugering ved 14 000 X g i 10 min ved 4°C. Det tørkede DNA ble oppløst i 50 ul TE og 5 ul ble brukt til sekvenseringsreaksjonen. DNA-sekvensering ble utført ved dideoksynukleotid-kjedeavslutningsmetoden i henhold til Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 74:5463

(1977). Den fullstendige sekvens for HSA 13 er vist i tabell 1.

Eksempel III

Dannelse av pA0807N

pA0804-plasmidet er tilgjengelig i en E. coli-vert fra the Northern Regional Research Center ved De forente staters landbruksdepartement, Peoria, Illinois (aksesjonsnr. NRRL B-18114). pA0804 utvinnes ved isolering av plasmid DNA, fordøyelse med EcoRI, utførelse av gelelektroforese for å utvinne det -s- 7,5 kb fragment, som er lineært pA0804 kuttet ved sitt unike EcoRI-sete. Plasmid pA0807N ble konstruert idet man startet fra pA0804, pBR322 og bakteriofag fl DNA som følger.

Trinn 1. Fremstilling av fl-ori-DNA

fl bakteriofag-DNA (50 ug) ble fordøyd med 50 enheter Rsal og Dral ved 37°C i 4 h i 200 ul MS-buffer for å frigjøre det -s- 458 bp DNA-fragment inneholdende fl-replikasjonsorigo (ori). Den fordøyde blanding ble ekstrahert med et like stort volum fenol:kloroform (V/V) fulgt av ekstraksjon av det vandige lag med et like stort volum kloroform. Til slutt ble DNA i den vandige fase utfelt ved justering av NaCl-konsentrasjonen på 0,2 M og tilsetning av 2,5 volumer absolutt etanol. Blandingen ble tillatt å stå på is (4°C) i 10 min og DNA-utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering i 30 min ved 10 000 x g i en mikrosentrifuge ved 4°C. DNA-pelleten ble vasket to ganger med 70% vandig etanol. Den vaskede pellet ble vakuumtørket og oppløst i 25 (il TE-buffer. Dette DNA ble underkastet elektroforese på 1,5% agarosegel og den gelporsjon som inneholdt det +■ 458 bp fl-ori-fragment, ble kuttet ut og DNA i gelen ble elektroeluert inn i 500 ul 5 mM EDTA pH 8,0). DNA-oppløsningen ble fenol/kloroform ekstrahert som angitt i detalj ovenfor, og DNA-utfellingen ble oppløst i 25 (il TE-buffer (fl-ori-fragment).

Trinn 2. Kloning av fl-ori inn i Dral-seter i pBR322

pBR322 (2 ug) ble delvis fordøyd med 2 enheter Dral i 20 ul MS-buffer ved 37°C i 10 min. Reaksjonen ble avsluttet ved fenol/kloroform-ekstraksjon fulgt av utfelling av DNA som angitt i detalj i trinn 1 ovenfor. DNA-pelleten ble oppløst 20 ul TE-buffer. Ca. 100 ng av dette DNA ble ligert med 100 ng av fl-ori-fragment (trinn 1) i 20 ul ligeringsbuffer ved inkubering ved 14°C over natten med én enhet T4 DNA-ligase. Ligeringen ble avsluttet ved oppvarming ved 70°C i 10 min og deretter benyttet til å transformere E. coli-stamme YMC9 (Maniatis et al.) for oppnåelse av pBRfl-ori som inneholder fl-ori klonet inn i Dral-setene (nukleotidposisjoner 3232 og 3251) i pBR322.

Trinn 3. Dannelse av pA0807

pBRfl-ori (10 ug) ble fordøyd i 4 h ved 37°C med 10 enheter hver av Pstl og Ndel. Det fordøyde DNA ble fenol/kloroform-ekstrahert, utfelt og oppløst i 25 ul TE-buffer som angitt i detalj i trinn 1 ovenfor. Dette materiale ble underkastet elektroforese på en 1,2% agarosegel og Ndel-Pstl-fragmentet (tilnærmet 0,8 kb) inneholdende fl-ori ble isolert og oppløst i 20 ul TE-buffer som angitt i detalj i trinn 1 ovenfor. Ca. 100 ng av dette DNA ble blandet med 100 ng pA0804 som var blitt fordøyd ned Pstl og Ndel og fosfatasebehandlet. Denne blanding ble ligert i 20 (il ligeringsbuffer ved inkubering over natten ved 14°C med én enhet T4 DNA-ligase. Ligeringsreaksjonen ble avsluttet ved oppvarming ved 70°C i 10 min. Dette DNA ble benyttet til å transformere E. coli-stamme YMC9 for oppnåelse av pA0807.

Trinn 4. Omdannelse av de to Bglll-seter i pA0807 til Notl-seter for

dannelse av pA0807N

pA0807 (10 ug) ble fordøyd med 10 enheter Bglll i 4 h ved 37°C i 50 fil HS-buffer. De kohesive ender til Bglll-kuttstedet ble fylt ut ved inkubering av det Bglll-kløyvde DNA (10 ug) i 50 ul NT-buffer med 5 enheter av Klenow-fragmentet av DNA-polymerase ved værelsetemperatur i 30 min. Denne blanding ble fenol/kloroform-ekstrahert og DNA ble utvunnet som beskrevet i trinn 1 ovenfor. DNA-pelleten ble oppløst i 25 ul TE-buffer. Dette DNA ble blandet med 50 ng (1 ul) av fosforylert Notl-linker (pGCGGCCGC) skaffet fra New England Biolabs, 40 ul 5x ligeringsbuffer, 129 ul vann og 5 enheter T4 DNA-ligase. Denne blanding ble inkubert over natten ved 14°C. Ligeringsreaksjonen ble avsluttet ved oppvarming til 70°C i 10 min. Etter dette ble ligeringsblandingen fordøyd med 10 enheter Noti etter justering av oppløsningen til HS-bufferbetingelse. DNA ble utfelt etter fenol/kloroform-ekstraksjon som angitt i detalj i trinn 1 ovenfor. Utfellingen ble oppløst i 50 ul TE-buffer og underkastet elektroforese på en 0,9% agarosegel. De nedre bånd av DNA-fragmentene svarte til vandringsposisjonen av det fragment som inneholdt pBR322-partiet og fl-ori, og det øvre bånd svarte til det gjenværende parti av pA0807, dvs. 5'AOXl, 3'AOXl og HIS4 ble isolert fra gelen ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i trinn 1 ovenfor. De gel-rensede DNA-fragmenter ble oppløst i 10 ul TE-buffer. Det DNA-fragment som representerte den lineære setespesifikke integrative vektor, ble defosforylert ved inkubering i 30 min med 2 enheter CIAP ved 37°C i 200 (il fosfatasebuffer. Det defosforylerte DNA ble fenol/kloroform-ekstrahert og utfelt som beskrevet i trinn 1. Dette DNA ble blandet med det øvre bånd DNA som representerte resten av pA0807-plasmidet (se ovenfor) og ligert over natten ved 4°C med 5 enheter T4 DNA-ligase i 30 ul ligeringsbuffer. Ligeringsblandingen ble varmet opp i 10 min ved 70°C, avkjølt på is, og en 10 fil porsjon ble brukt til å transformere E. coli YMC9 for å oppnå pA0807N. Strukturen av pA0807N er vist på fig. 3.

Eksempel IV

Konstruksjon av Pichia pastoris HSA- ekspresjonsvektorer

Trinn 1. Utvinning av HSA-fragment

HSA-genet svarende til ca. 2,0 kb ble frigjort fra mpl8-HSA13

replikativ form DNA (se eksempel II) ved EcoRI-fordøyelse. Ca 1 ug av plasmid mpl8-HSA13 ble fordøyd ved 37°C i 2 h med 5 enheter EcoRI i 20 jul HS-buffer. Reaksjonen ble avsluttet ved fortynning til 50 ul med dH20, øyeblikkelig ekstrahert med fenokkloroform, og utfelt som angitt i detalj i trinn 1 i eksempel III. DNA-utfellingen ble oppløst i 10 ul vann og lagret ved -20°C for senere bruk. HSA-genet ble innsatt i vektorer pTHFKf og pA0807N ved deres EcoRI-seter for oppnåelse av Pichia pastoris HSA-ekspresjonsplasmidene pHSA13 og pHSAl 13.

Trinn 2. Vektormanipulasjoner for innsetting av HSA-gen

Ca. 10 ug hver av pTHFKf (fig. 4) og pA0807N ble fordøyd med

10 enheter EcoRI i 100 ul HS-buffer i 16 h ved 37°C. Reaksjonsblandingen ble justert til alkalisk fosfatasebuffer-betingelser og behandlet med 10 enheter CIAP i 200 (il reaksjonsvolum i 30 min ved 37°C. Fosfatasebehandling ble avsluttet ved fenol/kloroform-ekstraksjon og DNA ble utfelt og oppløst i TE-buffer ved en endelig konsentrasjon på 100 |ig/ml som angitt i detalj i trinn 1 i eksempel III.

Trinn 3. Innsetting av HSA-gen i ekspresjonsvektorer

Ca. 100 ng hver av EcoRI-kuttet og CIAP-behandlede vektorer

pTHFKf og pA0807N (trinn 2, eksempel IV) ble blandet med tilnærmet 100 ng hver av EcoRI-fordøyd mpl8-HSA13 (trinn 1, eksempel IV) i 20 ul ligeringsbuffer og ligert med 2 enheter T4 DNA-ligase ved 4°C i 16 h. Ligasjon ble avsluttet ved oppvarming til 70°C i 10 min og brukt til å transformere E. coli-stamme DG75' for oppnåelse av plasmider pHSA13 og pHSAl 13.

Eksempel V

Transformasjon av Pichia pastoris med pHSAl 13 og pHSA13

Trinn 1. pHSA113 vektorpreparering

Ca. 20 ug pHSAl 13 ble fordøyd i 18 h ved 37°C i 200 ul

HS-buffer med 50 enheter Noti. Ca. 20 (il av denne blanding ble direkte anvendt for transformasjon av Pichia pastoris GS115 (his4) deponert hos the Northern Regional Research Center ved De forente staters landbruksdepartement, aksesjonsnr. NRRL Y-15851. De resterende ca. 180 (il av det Notl-kløyvede pHSAl 13 ble fenol/kloroform-ekstrahert og utfelt som angitt i detalj i trinn 1 i eksempel III. DNA-utfellingen ble oppløst i 20 (il CaS-oppløsning og ble også brukt til transformasjon av GS115. Det Notl-kløyvede pHSAl 13 kan integrere inn i et Pichia-lokus. Fordi Notl-fragmentformen pHSAl 13 også bærer histidinoldehydrogenase-genet av Pichia kan de resulterende transformanter lett selekteres basert på His+-fenotypen.

Pichia-stamme KM71 (his4, aoxl:ARG4) ble transformert for His+ med 10 (ig pHSA 13. Foruten HIS4 bærer dette plasmid en autonomt replikerende sekvens ARSl. Det kan replikere inne i Pichia i den autonome form. Slike transformanter vil bli betegnet som "autonome transformanter". Grunnen for å anvende denne stamme er at KM71 er "metanol-langsom" på grunn av oppbrytningen av AOX1 ved ARG4 og har blitt vist å uttrykke høyere nivåer av 6-galaktosidase når lacZ er plassert under styring av AOX1-promotoren enn den metanol-normale stamme GS115. For negativ kontroll ble KM71 også transformert med pYJ30,

NRRL B-15890, et plasmid som også inneholder His4.

Trinn 2. Celledyrking

Pichia pastoris GS115 fNRRL Y-1585n ble podet inn i ca.

10 ml YPD-medium og ristedyrket ved 30°C i 12-20 h. 100 ml YPD-medium ble podet med podekultur for å gi en OD600på ca. 0,001. Mediet ble dyrket i en ristekolbe ved 30°C i 12-20 h. Kulturen ble høstet når OD600var 0,2-0,3 (etter 16-20 h) ved sentrifugering ved 1500 g i 5 min ved anvendelse av et Sorvall RC5C-apparat.

Trinn 3. Fremstilling av sfæroplaster

Cellene ble vasket en gang i 10 ml sterilt vann og deretter

sentrifugert ved 1500 g i 5 min. (Sentrifugering utføres etter hver cellevask ved 1500 g i 5 min ved anvendelse av et "Sorvall RT6000B"-apparat med mindre noe annet er angitt). Cellene ble deretter vasket en gang i 10 ml nylig fremstilt SED, en gang i 10 ml steril IM sorbitol og til slutt resuspendert i 10 ml SCE-buffer. 7,5 ul av 3 mg/ml Zymolyase (100 000 enheter pr. g skaffet fra Miles Laboratories) ble satt til celleoppløsningen. Cellene ble deretter inkubert ved 30°C i ca. 10 min. (En reduksjon på 60% i OD600kan anvendes som en korrekt tids- og konsentrasjonsmarkør). Sfæroplastene ble vasket en gang i 10 ml steril IM sorbitol ved sentrifugering ved 700 g i 5-10 min. (Tiden og hastigheten for sentrifugeringen kan variere; man bør sentrifugere tilstrekkelig til å pelletere sfæroplastene, men ikke så meget at de brytes opp av kraften). 10 ml sterilt CaS ble benyttet som en endelig cellevask, og cellene ble sentrifugert igjen ved 700 g i 5-10 min og resuspendert i 0,6 ml CaS.

Trinn 4. Transformasjon

GS115-celler ble transformert med 10 ug av de lineære

HSA-vektorer ved anvendelse av sfæroplast-transformasjonsteknikken i henhold til Sreekrishna et al. som angitt i Gene 59, 115-125 (1987). DNA-prøver ble satt til (inntil 20 ul volum) 12 x 75 mm sterile polypropylenrør. (DNA bør foreligge i en egnet buffer såsom TE-buffer). 100 ul sfæroplaster ble satt til hver DNA-prøve og inkubert ved værelsetemperatur i ca. 20 min. 1 ml PEG-oppløsning ble satt til hver prøve og inkubert ved værelsetemperatur i ca. 15 min og sentrifugert ved 700 g i 5-10 min. SOS (150 (il) ble satt til pelleten og inkubert i 30 min ved værelsetemperatur. Til slutt ble 850 ul 1 M sorbitol tilsatt.

Trinn 5. Regenerering av sfæroplaster

Et bunnagar-lag på 20 ml regenereringsagar SDR ble helt på

hver plate minst 30 min før transformasjonsprøvene var ferdige. Dessuten ble 8 ml's porsjoner av regenereringsagar fordelt på 15 ml Corning-rør med konisk bunn i et 45°C bad i løpet av den periode transformasjonsprøvene var i SOS. Porsjoner på 50, 250 eller 800 (il av den transformerte prøver ble satt til de 8 ml' porsjoner av smeltet regenereringsagar holdt på 45°C og helt på plater inneholdende det faste 20 ml bunnagar-lag. Platene ble inkubert ved 30°C i 3-5 dager.

Trinn 6. Seleksjon av transformanter

Transformanter ble selektert for ved dyrking av SDR, et

medium som mangler histidin. Kulturer som vokste i fravær av histidin, ble dessuten sortert for "metanol-langsom" fenotype (som angir seteselektiv integrasjon). De transformerte GS115-celler som viste tegn på begge fenotyper, ble deretter dyrket og analysert for produksjon av HSA.

Eksempel VI

Metanolindusert ekspresjon av HSA i

GS115/ pHSA13 autonome transformanter

KM7I-stammer transformert med plasmid pHSA13 og negativ

kontroll KM71 transformert med pYJ30 ble dyrket i 10 ml kulturer på MGY til en optisk densitet på 8,00 ved 600 nm og deretter byttet om til MM-medium. Etter inkubasjon på MM i 3 dager ble celler høstet ved sentrifugering og media-supernatant ble justert på 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og lagret i frosset tilstand for HSA-analyse (supernatant M). Cellene ble suspendert i 500 (il oppbrytningsbuffer inneholdende 1 mM PMSF og kraftig svirret med glassperler i 4 min alt i alt med intermitterende perioder på is. Etter dette ble prøvene sentrifugert i en mikrosentrifuge ved 10 000 X g i 10 min ved 4°C og den klare supernatantoppløsning ble separert fra pelleten og betegnet som supernatant I. Pelleten ble ekstrahert med 500 ul oppbrytningsbuffer inneholdende 6 M urea, og dette ekstrakt ble betegnet som supernatant II. De forskjellige supernatanter ble analysert for HSA ved PAGE immunoblott som beskrevet i Methods in Enzymology. vol. 152 (1987), "Guide to Molecular Cloning Techniques" såvel som kvantitativ HSA-ELISA. HSA-ELISA-fremgangsmåten utviklet for dette

formål er angitt i eksempel VIII. Supernatant I inneholdt det høyeste nivå av HSA sammenlignet med andre fraksjoner som bestemt ved HSA-ELISA (tabell 3) (HSA forelå stort sett i den oppløselige fraksjon som bedømt ved PAGE-elektroimmuno-blotting).

Eksempel VII

Metanolregulert ekspresjon av HSA i

GS115/ pHSAl 13 integrative transformanter

Flere tusen His+ transformanter av GS115 oppnådd ved bruk av Notl-kløyvet pHSAl 13 ble slått sammen og en porsjon ble podet inn i 10 ml MGY og dyrket til metning. På dette punkt ble celler byttet om til MM og inkubert ved 30°C på et risteapparat. Etter 2 dager på MM ble cellene høstet og supernatant I ble fremstilt og analysert for HSA-ekspresjon som beskrevet i eksempel VI. Ekspresjonsnivået av HSA var 0,1% av oppløselig protein.

His+ transformantsammenslåingen ble også sortert for "metanol langsom"-transformanter ved replikaplating av kolonier på MD-plater på MM-plater. Flere His+ metanollangsom-transformanter ble dyrket på MGY og byttet til MM. Celleekstrakter ble fremstilt og analysert for HSA-ekspresjonsnivåer som beskrevet i eksempel VI. Nivåer av HSA ble påvist inntil 20 mg/l eller 2% av samlet opplø-selig celleprotein.

Eksempel VIII

HSA ELISA

50 ul av 1:500 gjet anti-HSA antistoffer i Na2C03/NaHC03-buffer, pH 9,5, ble plassert i brønner på 96-brønn ELISA-plater (Corning) og inkubert i 1 h ved 37°C. De ble vasket to ganger med TBST, to ganger med dH20, 200 u.1 blottobuffer ble satt til hver, og de ble deretter inkubert over natten ved 37°C. Etter inkubering ble de på nytt vasket tre ganger med TBST, 2 ganger med dH20, og 50 ul prøve ble satt til hver (utgangs-HSA-oppløsning = 5xl0<7>ng/ml; standardoppløsninger = 2-14 ng/ml). Prøvene ble rotert i 2 h ved værelsetemperatur, deretter vasket 5 ganger med TBST, to ganger med dH20, og 50 ul av en 1:2000 fortynning av pepperrotperoksidase-konjugert-gjet anti-HSA-antistoffer (Cooper Biomedical, Inc.) i blottobuffer (5 ul/10 ml) ble tilsatt. Platene ble på nytt ristet i 1 h ved værelsetemperatur, deretter vasket tre ganger med TBST, tre ganger med dH20, og 100 ul ABTS (ABTS-peroksidasesubstratoppløsning, Kirkegaard and Perry Labs., Inc.), varmet til værelsetemperatur, ble tilsatt. Til slutt ble prøvene ristet i 20 min ved værelsetemperatur, 100 ul 2% oksalsyre ble satt til hver for å stanse reaksjonen, og absorbansen ved 405 nm ble avlest.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk aktivt HSA, fra en metylotrof gjær av slekten Pichia. karakterisert vedat den omfatter trinnene; a) å transformere en metylotrof gjær av slekten Pichia med én vektor valgt fra gruppen som består av autonome ekspresjonsvektorer, lineære integrative setespesifikke vektorer og plasmid integrative setespesifikke vektorer, hvori nevnte vektorer omfatter en ekspresjonskassett som inneholder en regulatorisk region av et Pichia pastoris AOXl-gen operabelt bundet til et strukturelt gen for HSA, hvor nevnte strukturelle gen koder for både sekresjonssignalsekvensen og den modne del av HSA og har nukleinsyresekvensen som angitt i tabell 1 i frem stillingen, eller et strukturelt gen som koder for både sekresjonssignalsekvensen og den modne del av HSA som har en eller flere baser av en mutasjon, så som et innskudd, delesjon eller substitusjon, mens produksjon og sekresjonsfunksjonen av nevnte strukturelle gen for HSA opprettholdes og hvor genproduktet opprettholder vesentlig samme aktivitet, samt er operabelt bundet til transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser, operabelt bundet til en Pichia pastoris HIS4 eller AOXI 3' avslutningssekvens og hvori den lineære integrative setespesifikke vektor og plasmid integrative setespesifikke vektor videre omfatter et første innsettbart DNA-fragment, minst et markør-gen valgt fra gruppen som består av HIS4 og ARG4 isolert fra Pichia pastoris og et andre innsettbart DNA-fragment, hvor det første innsettbare fragment og andre innsettbare fragment er avledet fra DNA-sekvensen til et Pichia pastoris AOXI eller HIS4-gen; b) dyrking av det resulterende transformerte Pichia gjærstamme under betingelser som er egnet for å oppnå sekresjon av nevnte HSA-protein, og c) rensing av nevnte HSA fra dyrkingsmediet.

2. Ekspresjonsvektor som koder for og er i stand til å uttrykke HSA for anvendelse i fremgangsmåten som angitt i krav 1 valgt fra gruppen som består av autonome ekspresjonsvektorer, lineære integrative setespesifikke vektorer og plasmid integrative setespesifikke vektorer, karakterisert vedat vektoren omfatter en ekspresjonskassett som inneholder en regulatorisk region av en Pichia pastoris AOXI-gen operabelt bundet til et strukturelt gen for HSA, hvor nevnte strukturelle gen koder for både sekresjonssignalsekvensen og den modne del av HSA og har nukleinsyresekvensen angitt i tabell 1 i fremstillingen, eller et strukturelt gen som koder for både sekresjonssignalsekvensen og den modne del av HSA, som har en eller flere baser av en mutasjon, så som et innskudd, delesjon eller substitusjon mens produksjons-og sekresjonsfunksjonen til nevnte strukturelle gen for HSA opprettholdes og hvor genproduktet opprettholder vesentlig samme aktivitet, samt er operabelt bundet til transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser, operabelt bundet til et Pichia pastoris HIS4 eller AOXI 3' avslutningssekvens og hvori den lineære integrative setespesifikke vektor og plasmid-integrative setespesifikke vektorer videre omfatter et første innsettbart DNA-fragment, minst et markør-gen valgt fra gruppen som består av HIS4 og ARG4 isolert fra Pichia pastoris og et andre innsettbare DNA-fragment, hvor første innsettbare fragment og andre innsettbare fragment er avledet fra DNA-sekvensen til et Pichia pastoris AOXI eller HIS4-gen.

3. Ekspresjonsvektor som angitt i krav 2, karakterisert vedat ekspresjonsvektoren er den lineære integrative setespesifikke vektor pHSA13 som angitt i figur 5.

4. Metylotrof gjær av slekten Pichia, karakterisert vedat den er transformert med en vektor som angitt i krav 2, og at gjæren er Pichia pastoris. fortrinnsvis Pichia pastoris stamme GS115 (NRRL Y-15851).